KR101862459B1 - 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당(OligoM)을 유효성분으로 포함하는 운동 능력 개선용 조성물 - Google Patents
비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당(OligoM)을 유효성분으로 포함하는 운동 능력 개선용 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 (a) 만뉴론산 올리고당의 치료학적 유효량; 및 (b) 식품학적으로 허용되는 담체를 포함하는 운동 능력 개선용 조성물을 제공한다. 상기 조성물은 단시간에 운동 능력 개선 효과를 나타내며, 활성 물질의 제조가 용이하고 경제적인 이점을 갖는다.
Description
본 발명은 알긴산 올리고당(Alginate Oligosaccharide)을 유효성분으로 포함하는 운동 능력 개선용 조성물에 관한 것이다.
알긴산은 해조류인 미역, 감태, 태황, 패, 톳 등의 갈조류의 세포막 사이를 채우고 있는 해조 다당류로서 β-D-만뉴론산(β-D-mannuronic acid; M) 및 α-L-글루쿠론산(α-L-guluronic acid; G)의 2종류의 우론산(uronic acid)이 각종 비율로 1, 4 글리코시드 결합을 한 헤테로형으로 양질의 식이섬유 기능을 나타내는 다당류 이다. 알긴산은 분자 속에 우론산의 카르복시기(COOH-)가 있으므로 산의 성질을 나타내는 특징을 갖는다. 해조류별 함유량은 종류, 장소, 계절, 부위에 따라 다르지만 여름철에 수확한 갈조류의 경우 전체 건조중량의 16-34%의 알긴산이 함유되어 있고 전체 알긴산 소비량의의 약 30%가 식품첨가물로 사용되고 있다. 제약업계에서는 정제의 선형제 등으로 사용되며 아직까지 약물로써 부작용이 알려진바 없으며, 현재까지 식용 가공품으로만 이용되고 있어 부가가치가 낮은 실정임에 따라 알긴산 저분자화를 통해 고부가 의약품 원료로 개발 할 경우 그 가치를 배가 시킬 수 있다.
산업적으로 이용 가능한 알긴산 올리고당 생산을 위해서는 첫째, 고온고압 혹은 방사선으로 연화시킨 후 분리하는 방법과 둘째, 산과 알칼리 처리를 이용하는 방법, 셋째, 알긴산 분해효소를 이용한 효소적 제조방법이 있다. 알긴산 분해효소인 알지네이트 라이아제(alginate lyase)는 알긴산의 β-1,4-글리코시드 결합을 분해하여 4,5-불포화 비환원성 말단을 갖는 산물을 생산하는데, 최근에는 효소분해를 통해 생산한 알긴산 올리고당의 기능성이 우수함이 보고됨에 따라 효소적 제조에 대한 연구가 진행되고 있다.
알긴산 올리고당은 다기능성 소재로서 2015년 Yang 연구진이 HepG2 세포에 알긴산 올리고당(3 ㎎/㎖)을 처리하여 LDL-콜레스테롤이 LDLR(lipoprotein receptor)를 통해 흡수가 촉진됨을 확인하였으며(Yang et al., 2015), Bang 연구진이 Plos One에 발표한 연구 결과에 따르면 난백알부민(ovalbumin)으로 천식을 유도한 동물모델에서 면역세포와 IgE를 감소시켜 천식 억제 효과를 확인하였다(Bang et al., 2015). 최근 Xu 연구진이 2-DE 방법을 이용하여 글루론산 올리고당의 항염증 기능을 규명하고자 하였으며, 단백질체 분석 결과 NF-κB 시그널을 통해 항산화, 전염증성(pro-inflammatory) 및 항-염증 기능을 확인하였다(Xu Xu et al. 2015). Hao 연구진이 2011년 Plos One에 크롬(chromium)이 복합된 알긴산 올리고당이 근육세포(C2C12 skeletal muscle cells)에서 AMPK 인산화를 촉진하며 인슐린 감작 효과가 있음을 보고하였으며, 기능성 소재로서 알긴산 올리고당의 약물동태학(pharmacokinetics)을 관찰하기 위하여 2008년 Nishikawa 연구진이 5주령 쥐에 알긴산 올리고당을 경구투여 후 시간 경과에 따른 혈액 및 소변에서의 알긴산 올리고당을 검출 한 결과, 혈장에서는 경구투여 2시간 까지 검출되고, 소변에서는 6시간까지도 일정하게 검출됨에 따라 알긴산 올리고당이 장에서 흡수된 후 혈액순환을 통해 소변으로 배출됨을 확인하였다(Nishikawa T et al., 2008). 따라서 위와 같은 기능성을 토대로 알긴산 올리고당은 에르고제닉 에이드 이용소재로서 이용가치가 우수하다.
스포츠에서 경기력을 향상을 위하여 선수들은 경기력 향상 보조물인 에르고제닉 에이드(ergogenic aid)를 섭취하며 현재 사용되거나 알려져 있는 영양학적 에르고제닉 에이드는 주로 비타민, 카르니틴, 카페인, 항산화제제 등과 한약재 중 홍삼, 동충하초, 가시오가피, 매실 등의 성분으로 구성되어 있음. 영양학적 보조제인 에르고제닉 에이드는 선수의 경기력 측면에 도움을 줄 수 있음에도 불구하고 오남용으로 인해 다양한 부작용이 발생하며 그에 따른 성분들의 상당 부분이 금지 약물로 지정되어 있어 트레이닝 현장에서 적용하기 어려운 문제가 있다.
일반적으로 에르고제닉 에이드는 탈수 방지, 에너지 공급 보충, 에너지 대사나 체내 노폐물 제거와 관련된 생리작용을 조절해주는 기능을 갖으며, 카페인의 경우 세계적으로 널리 이용되는 약물중 하나로 커피, 홍차, 등에 함유되어 있어 섭취 시 지방대사에 관여하는 영양보조물로서 인체내에서 cAMP 분해효소인 포스포디에스터라아제(phosphodiesterase)의 활성을 억제시켜 지방세포 내 cAMP의 농도를 증가시킴에 따라 AMPK 단백질의 인산화를 통해 저장지방을 분해하여 운동 중 혈중 유리지방산의 동원을 증가시켜 간과 근육의 글라이코겐 손실을 억제하는 효과가 있다. 하지만 카페인의 경우 중추신경자극제로 작용하므로 민감한 사람에게는 두통 불안, 신경과민 등을 유발할 수 있으며, 이뇨작용으로 인해 고온에서 장시간 운동 시 체내탈수증을 유발하는 문제점이 발생한다.
PGC-1α (peroxisome proliferator-activated receptor coactivator-1 alpha)은 AMPK 인산화를 통해 활성화되는 공활성화 인자로써 포도당신생합성을 촉진하는 전자인자를 활성화 시키는 인자이다. 2015년 강윤석 연구진은 저강도, 중강도 및 고강도 지구력 트레이닝을 통하여 쥐 근육 내 AMPK 및 PGC-1α의 발현이 유도됨을 보고하였으며, 운동을 통한 PGC-1α의 발현이 ERRα와의 결합 후 체내 지방 소비를 촉진하는 BDNF를 유도하는 것으로 보고된 바 있다(Wrann, Christiane D., et al. 2013). 이와 같이, PGC-1α은 운동의 효과를 보다 향상시킬 수 있는 경기력 향상 보조물 개발에 있어 중요한 지표가 된다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
Yang JH et al. Alginate oligosaccharide enhances LDL uptake via regulation of LDLR and PCSK9 expression. J Nutr Biochem. (2015) 1393-400
MA Bang et al. Bacillus subtilis KCTC 11782BP-Produced Alginate Oligosaccharide Effectively Suppresses Asthma via T-Helper Cell Type 2-Related Cytokines. Plos One(2015) e0130510
X Xu et al. Unsaturated guluronate oligosaccharide enhances the antibacterial activities of macrophages. FASEB (2014). 2645-2654
C Hao et al. Insulin Sensitizing Effects of Oligomannuronate-Chromium (III) Complexes in C2C12 Skeletal Muscle Cells. Plos One (2011). e24598
Nishikawa T et al. Detection and pharmacokinetics of alginate oligosaccharides in mouse plasma and urine after oral administration by a liquid chromatography/tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) method. Biosci Biotechnol Biochem. (2008) 2184-90
강윤석, 희뢰, and 김재철. "지구력 트레이닝이 T2DM 흰쥐 심장근 내 p-AMPK, PGC-1α 및 irisin 발현에 미치는 영향." 한국체육과학회지 24.2 (2015): 1049-1060.
Wrann, Christiane D., et al. "Exercise induces hippocampal BDNF through a PGC-1α/FNDC5 pathway." Cell metabolism 18.5 (2013): 649-659.
본 발명자는 알긴산 분해효소의 폴리만뉴론산 분해에 의해 생성된 알긴산 올리고당(Alginate Oligosaccharide; AOS)의 효용성을 조사하고자 노력하였다. 그 결과, 상기 알긴산 올리고당이 단시간에 운동 능력을 개선시키는 효과를 가짐을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 운동 능력 개선용 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 알긴산 올리고당의 치료학적 유효량; 및 (b) 식품학적으로 허용되는 담체를 포함하는 운동 능력 개선용 조성물을 제공한다.
본 발명자는 알긴산 분해효소의 폴리만뉴론산 분해에 의해 생성된 알긴산 올리고당(Alginate Oligosaccharide; AOS)의 효용성을 조사하고자 노력하였다. 그 결과, 상기 알긴산 올리고당이 단시간에 운동 능력을 개선시키는 효과를 가짐을 확인하였다.
상기 알긴산 올리고당은 알긴산 분해효소의 분해에 의해 생성된 폴리만뉴론산, 폴리굴루로닉산, 또는 폴리만뉴론산 및 폴리글루로닉산이 혼합된 형태의 알긴산 올리고당이다.
상기 알긴산 올리고당은 다음의 일 예(3개의 당이 결합된 알긴산 올리고당)의 구조식 1을 갖는다:
[구조식 1]
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 알긴산 올리고당은 1 내지 20개의 당으로 구성된다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 알긴산 올리고당은 1 내지 18개, 1 내지 15개, 1 내지 13개, 1 내지 10개 또는 1 내지 7개의 당으로 구성된다.
상기 알긴산 올리고당은 1 당인 경우에 175, 2 당인 경우에 351, 3 당인 경우에 527, 4 당인 경우에 704, 5 당인 경우에 880, 6 당인 경우에 1056, 7 당인 경우에 1232의 Z-평균 분자량(m/z)을 갖는다(도 3).
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 알긴산 올리고당은 100-5000 Da 크기이다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 알긴산 올리고당은 100-4500 Da, 100-4000 Da, 100-3500 Da 또는 100-3000 Da이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 알긴산 올리고당은 폴리만뉴론산(poly-mannuronate) 기질로 하여 알긴산 라이아제(alginate lyase)에 의해 분해되어 제조된다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 알긴산 라이아제는 폴리굴루론산(polyguluronate) 및 폴리만뉴론산(polymannuronate)로 구성된 알긴산(alginate)를 분해하여 저분자화 하는 효소를 의미한다.
본 발명의 특정 구현예에 따르면, 상기 알긴산 라이아제는 전복 장내 균주 유래의 AlyDW11(대한민국 등록특허 10-1277706)이다.
상기 AlyDW11은 서열목록 제2서열의 아미노산 서열로 이루어진다.
상기 AlyDW11은 서열목록 제1서열의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진다.
본 발명의 상기 알긴산 올리고당은 최소 2종의 당으로 구성된다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 알긴산 올리고당은 1개 내지 10개의 만뉴론산 또는 글루론산을 포함한다. 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 1개 내지 9개의 만뉴론산 또는 글루론산을 포함한다. 본 발명의 또다른 구현예에 따르면, 1개 내지 8개의 만뉴론산 또는 글루론산을 포함한다. 본 발명의 특정 구현예에 따르면, 1개 내지 7개의 만뉴론산 또는 글루론산을 포함한다.
본 발명의 알긴산 올리고당은 비환원성 말단의 포화형 만뉴론산 올리고당과 비교하여 물 분자가 제거되어 물 분자의 질량값인 18 정도의 작은 질량값을 갖는다(도 3).
본 발명의 상기 알긴산 올리고당은 만뉴론산 및 글루론산으로 이루어져 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 알긴산 올리고당의 만뉴론산:글루론산의 비율은 1.2-5.0:1이다. 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 1.2-4.5:1이다. 본 발명의 또다른 구현예에 따르면, 1.8-4.0:1이다. 본 발명의 특정 구현예에 따르면, 2.0-3.0:1이다.
즉, 본 발명의 알긴산 올리고당은 만뉴론산을 글루론산보다 1.2-5.0, 1.2-4.5, 1.8-4.0 또는 2.0-3.0배 우세하게 포함한다(도 4).
하기 실시예에서 입증된 바와 같이, 본 발명의 알긴산 올리고당은 비환원성 말단의 공액이중결합형 만뉴론산 올리고당이다.
본 명세서에서 용어 “비환원성”은 올리고당의 구조에 있어서, 아노머[단당류의 헤미아세탈(C-1과 C-5 사이의 고리 형성), 헤미케탈(C-2와 C-5 사이의 고리 형성)을 생성하는 고리화 반응에서 한 탄소에 붙은 수소원자와 수산화기의 위치가 바뀐 부분입체 이성질체가 생기는 현상) 탄소를 갖지 못한 성질을 의미한다.
본 명세서에서 용어 “공액이중결합형”은 단일겹합과 이중결합이 반복되어 형성된 구조를 의미한다. 비환원성 만뉴론산 올리고당의 경우 효소분해로 인하여 생성된비환원성 말단이 이중결합 하나만 있는 형태이다.
상기 폴리만뉴론 알긴산의 분해는 산-알칼리 가수분해, 방사선 조사, 고온고압, 효소에 의해 실시할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 운동 능력 개선용 조성물은 무산소운동(anaerobic exercise) 또는 유산소운동(aerobic exercise)에 대한 운동 능력 개선용 조성물이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 운동은 무산소운동이다.
본 명세서에서 용어 “무산소운동”은 운동에 필요한 에너지를 산소 없이 생성하는 운동으로 근육에 축적된 글리코겐이 분해되어 에너지로 전환되는 운동을 의미한다. 무산소운동은 순간적인 에너지를 낼 수 있는 힘을 만들며, 근육을 강화시킨다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 조성물은 섭취 전/후와 비교하여 5 내지 20% 향상된 운동 속도를 나타낸다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 조성물은 섭취 전/후와 비교하여 5 내지 30% 향상된 무산소성 파워를 나타낸다.
본 명세서에서 용어 “무산소성 파워”는 유산소성 에너지 공급에 의존하지 않고 수행할 수 있는 단위 시간당 최대 작업량을 의미한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 운동은 유산소운동이다.
본 발명의 조성물은 식품 조성물로 제공될 수 있다. 본 발명의 항바이러스 조성물이 식품 조성물로 제조되는 경우, 유효성분으로서 만뉴론산 올리고당뿐 만 아니라, 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함하며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소, 조미제 및 향미제를 포함한다. 상술한 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스, 올리고당 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 사이클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 향미제로서 천연 향미제 [타우마틴, 스테비아 추출물 (예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등]) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 사용할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 식품 조성물이 드링크제로 제조되는 경우에는 본 발명의 만뉴론산 올리고당 이외에 구연산, 액상과당, 설탕, 포도당, 초산, 사과산, 과즙, 두충 추출액, 대추 추출액, 감초 추출액 등을 추가로 포함시킬 수 있다.
본 발명의 만뉴론산 올리고당을 유효성분으로 포함하는 운동 능력 개선용 조성물은 건강기능식품으로 제조될 수 있다. 상기 건강기능식품은 특별히 이에 제한되지 않으나, 건강 기능성 식품, 영양 보조제, 영양제, 파머푸드(pharmafood), 건강보조식품, 뉴트라슈티칼(nutraceutical), 디자이너 푸드, 식품 첨가제 등의 모든 형태의 식품이 될 수 있는데, 바람직하게는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 될 수 있다.
본 발명의 건강기능식품은 식품제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함하며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소, 조미제 및 향미제를 포함한다. 상술한 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스, 올리고당 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 사이클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 향미제로서 천연 향미제 [타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등]) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 사용할 수 있다. 상기 외에 본 발명의 식품은 여러 가지 영양제, 비타민류, 광물(전해질), 식이성분, 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(a) 본 발명은 운동 능력 개선용 조성물을 제공한다.
(b) 본 발명의 조성물은 단시간에 운동 능력 개선 효과를 나타낸다.
(c) 본 발명의 조성물은 활성 물질의 제조가 용이하고 경제적인 이점을 갖는다.
도 1은 알긴산분해효소를 이용하여 만뉴론산(poly mannuronate, poly M)에 대한 디폴리머리제이션 결과를 상업용 알긴산 올리고당(marker)을 표준물질로 사용하여 TLC(Thin Layer Chromatography)로 보여준다.
도 2는 비환원성 말단의 공액이중결합형 만뉴론산 올리고당의 질량분석 결과를 나타낸다.
도 3은 비환원성 말단의 공액이중결합형 만뉴론산 올리고당의 이중결합 비율을 나타낸다.
도 4는 비환원성 말단의 공액이중결합형 만뉴론산 올리고당의 당 구성을 원평광 이색성 분광 측정법(CD, circular dichorism) 방법으로 확인한 결과를 나타낸다.
도 5는 비환원성 말단의 공액이중결합형 만뉴론산 올리고당 처리에 의한 3T3-L1 지방분화전 세포에서 AMPK-ACC 인산화 증진 효과를 나타낸다.
도 6은 비환원성 말단의 공액이중결합형 만뉴론산 올리고당 처리에 따른 PGC-1α의 mRNA 발현양를 나타낸다.
도 7은 비만을 유도한 랫트 근육 단백질체 분석 결과 TCA 회로 관련 단백질의 up-regulation을 나타낸다.
도 8은 비환원성 말단의 공액이중결합형 만뉴론산 올리고당의 운동수행능력 향상 실험 설계를 나타낸다.
도 9는 비환원성 말단의 공액이중결합형 만뉴론산 올리고당 급이가 성인남성의 순간운동 스피드 향상에 미치는 결과를 나타낸다.
도 10은 비환원성 말단의 공액이중결합형 만뉴론산 올리고당 급이가 성인남성의 무산소성 파워 향상에 미치는 결과를 나타낸다.
도 2는 비환원성 말단의 공액이중결합형 만뉴론산 올리고당의 질량분석 결과를 나타낸다.
도 3은 비환원성 말단의 공액이중결합형 만뉴론산 올리고당의 이중결합 비율을 나타낸다.
도 4는 비환원성 말단의 공액이중결합형 만뉴론산 올리고당의 당 구성을 원평광 이색성 분광 측정법(CD, circular dichorism) 방법으로 확인한 결과를 나타낸다.
도 5는 비환원성 말단의 공액이중결합형 만뉴론산 올리고당 처리에 의한 3T3-L1 지방분화전 세포에서 AMPK-ACC 인산화 증진 효과를 나타낸다.
도 6은 비환원성 말단의 공액이중결합형 만뉴론산 올리고당 처리에 따른 PGC-1α의 mRNA 발현양를 나타낸다.
도 7은 비만을 유도한 랫트 근육 단백질체 분석 결과 TCA 회로 관련 단백질의 up-regulation을 나타낸다.
도 8은 비환원성 말단의 공액이중결합형 만뉴론산 올리고당의 운동수행능력 향상 실험 설계를 나타낸다.
도 9는 비환원성 말단의 공액이중결합형 만뉴론산 올리고당 급이가 성인남성의 순간운동 스피드 향상에 미치는 결과를 나타낸다.
도 10은 비환원성 말단의 공액이중결합형 만뉴론산 올리고당 급이가 성인남성의 무산소성 파워 향상에 미치는 결과를 나타낸다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 비환원성 말단의 공액이중결합형 만뉴론 알긴산 올리고당 생산
본 실시예에서는 0.3% 폴리만뉴론산 수용액에 알긴산 분해효소(대한민국 등록특허 제10-1277706호의 AlyDW11) 첨가 후 45℃에서 24시간 분해하고 TLC(Thin Layer Chromatography)를 이용하여 디폴리머리제이션(depolymerization)을 확인하였고, 알긴산 분해 올리고당 혼합물인 비환원성 말단의 공액이중결합형 만뉴론산 올리고당을 확보하였다. 상기 비환원성 말단의 공액이중결합형 만뉴론산 올리고당 혼합물을 한외여과막 시스템(VivaFlow 50, Sartorius)을 이용하여 분자량 3000 Da 이하의 분획물을 확보하였으며, 확보한 분자량 3000 Da 이하의 분획물은 동결건조를 통해 분말형태로 시험전까지 20℃에 보관하였다.
도 1에 제시한 바와 같이, 알긴산 분해효소를 이용하여 생산한 비환원성 말단의 공액이중결합형 만뉴론산 올리고당은 TLC를 통해 1-7당(DP 1-7)으로 구성되어 있음을 확인하였으며, TLC의 스팟(spot)의 세기(intensity)를 비교하였을 때, 상대적으로 2-5당이 높은 비율로 존재함을 확인하였다.
실시예 2: 비환원성 말단의 공액이중결합형 만뉴론산 올리고당 구성 및 구조적 특징 분석
상기 비환원성 말단의 공액이중결합형 만뉴론산 올리고당의 만뉴론산 비율을 측정하기 위하여 원평광 이색성 분광법(circular dichroism, CD, J-715 spectropolarimeter, JASCO)을 이용하여 원평광 이색성 분광 신호를 측정하였다. 상기 CD 신호는 상온에서 1 cm의 큐벳을 이용하여 190-250 nm 영역에서 측정하였으며, 일괄성 있는 CD 시그널을 얻기 위하여 상기 비환원성 말단의 공액이중결합형 만뉴론산 올리고당은 1 mg/mL 농도로 사용하였다. 만뉴론산:글루론산 구성비를 알아보기 위하여 피크(peak, 200 nm 흡광도 값) 및 트로프(trough, 215 nm 흡광도 값)를 측정하여 만뉴론산과 글루론산의 비율을 계산하였으며, 계산식은 다음과 같다:
(1) 피크/트로프 < 1, 만뉴론산/글루론산 = 2.0(피크/트로프)
(2) 피크/트로프 > 1, 만뉴론산/글루론산 = 27(피크/트로프) + 40
도 2에서 알 수 있듯이, 비환원성 말단의 공액이중결합형 만뉴론산 올리고당은 만뉴론산/글루론산 비율이 2.59(피크=3.82, 트로프=3.20)이며, 비환원성 말단의 공액이중결합형 형성으로 인하여 215 ㎚의 흡광도값 측정이 방해됨을 확인할 수 있었다.
비환원성 말단의 공액이중결합형 만뉴론산 올리고당의 구성당을 분석하기 위하여, 준비된 시료는 이온 교환 수지 컬럼(Hitrap DEAE Sepharose FF, GE Healthcare)을 이용하여 정제한 후 동결건조를 실시하였다. 정제된 비환원성 말단의 공액이중결합형 만뉴론산 올리고당은 물에 용해 후 UPLC/MS 시스템에 주입함으로써 구성당 분석을 수행하였다.
초고성능 액체 크로마토그래피(Ultra Performance Liquid Chromatography, UPLC, Waters) 설정은 ACQUITY UPLC BEH C18(1.7 ㎛ 1.0 ×100 ㎜, Waters) 컬럼을 이용하였으며 0.4 ㎖/분에서 12분 동안 용매 A(15 mM Amylamin, 25 mM HFIP)와 용매 B(15 mM Amylamin, 25 mM HFIP in Acetonitrile)의 선형 구배를 조절하였다. C18-UPLC로 분리되어 나온 용리액은 질량분석기 (Quadrupole-Time of Flight, Q-TOF, Waters)로 분석하였다. Q-TOF는 ESI 네거티브 모드에서 분석하였으며, 캐필러리와 샘플링콘(sampling cone)의 전압은 각각 3 kV와 40 V, 탈용매(desolvation)는 유속 600 L/h, 온도 300℃, 소스 온도는 120℃ 조건에서 실시하였다. TOF MS 데이타는 스캔시간은 0.5 초 m/z 100-1300 범위에서 분석하였다. 분석의 정확도를 위해 모든 분석에 2 ng/㎕의 로이신 엔케팔린(leucine enkephalin, ESI 네거티브 모드에서 554.2619 Da)을 락스프레이(lack spray)로 사용하였다.
도 3에서 알 수 있듯이, 비환원성 말단의 공액이중결합형 만뉴론산 올리고당의 질량분석 결과 비환원성 말단의 공액이중결합형 만뉴론산 올리고당은 1-7당으로 구성되어 있으며, 특히 기보고된 만뉴론산 올리고당 질량값 보다 18이 적은 피크들이 관찰됨에 따라 물 분자가 제거되어 비환원성 말단의 공액이중결합형이 형성된 올리고당이 형성되며 비공액이중결합형 만뉴론산 올리고당(nonconjugated carbonyl mannuronic acid oligosaccharide, NCMOS)보다 우세하게 존재함을 알 수 있었다. 비환원성 말단의 공액이중결합형 만뉴론산 올리고당(CMOS)과 비공액이중결합형 만뉴론산 올리고당(NCMOS)의 비율을 나타낸 결과는 도 4에 제시되었다.
도 4와 같이 비환원성 말단의 공액이중결합형 만뉴론산 올리고당은 비공액이중결합형 만뉴론산 올리고당 보다 평균 2배 이상의 비환원성 말단의 공액이중결합형 만뉴론산 올리고당의 단당들이 존재함을 확인하였다. 비공액이중결합형 만뉴론산 올리고당 분자량은 다음과 같다: 1당 (m/z 175), 2당 (m/z 369), 3당 (m/z 545), 4당 (m/z 722), 5당 (m/z 898) 6당 (m/z 1074), 7당 (m/z 1250).
실시예
3:
비환원성
말단의
공액이중결합형
만뉴론산
올리고당의
AMPK
-
ACC
인산화 촉진
에너지 대사에 중요한 단백질인 AMPK-ACC 인산화 촉진 여부를 확인하기 위하여 3T3-L1 지방 분화전 세포에 비환원성 말단의 공액이중결합형 만뉴론산 올리고당을 0.2 mg/mL 농도로 처리 후 단백질을 추출하여 western bolt을 실시하여 단백질 발현 패턴을 처리 시간별로 확인하였다. 도 5에 제시한 바와 같이, AMPK, phospho-AMPKα(Thr172), ACC, phospho-ACC(Ser79) 항체를 이용하여 웨스턴 블랏을 실시한 결과, 상기 비환원성 말단의 공액이중결합형 만뉴론산 올리고당 처리 시간 의존적으로 AMPK-ACC 인산화가 촉진됨을 확인하였다. 따라서, 상기 비환원성 말단의 공액이중결합형 만뉴론산 올리고당은 에너지 대사에 중요한 단백질인 AMPK 인산화를 통해 활성화하여 에너지 대사를 촉진시킬 것으로 확인되었다.
PGC-1α(peroxisome proliferator-activated receptor coactivator-1 alpha)은 AMPK 인산화를 통해 활성화되는 공활성화 인자로써 포도당신생합성을 촉진하는 전자인자를 활성화 시킨다. 비환원성 말단의 공액이중결합형 만뉴론산 올리고당이 PGC-1α의 상위조절자인 AMPK의 인산화를 촉진이 확인됨에 따라 PGC-1α의 발현을 mRNA 수준에서 확인해 보고자 하였다.
MCF-7 세포는 10%의 우태아혈청, 페니실린-스트렙토마이신 (100 U/mL) alc 1% 소 인슐린이 포함된 DMEM/F12 배지에서 37 ℃ 온도에 배양하여 PGC-1α 발현양을 측정하기 위한 세포모델로 사용하였다. MCF-7세포에 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당을 0.1 mg/mL 농도로 48시간 처리 후 GeneJET RNA 정제 키트 방법에 따라 RNA 추출 후 cDNA를 합성하여 PGC-1α의 발현양을 실-시간 PCR으로 확인하였다. 도 6에 제시한 바와 같이, 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당을 처리 시 PGC-1α의 mRNA 발현을 증가하였다.
실시예
4: 단백질체 분석기술을 활용한
비환원성
말단의
공액이중결합형
만뉴론산
올리고당의
TCA
회로 활성화 검증
비만을 유도한 랫트에서 상기 비환원성 말단의 공액이중결합형 만뉴론산 올리고당 투여에 따른 에너지 대사 활성화를 확인하기 위하여 근육 단백질체 분석을 실시하였다. 비환원성 말단의 공액이중결합형 만뉴론산 올리고당을 체중 1kg당 250 mg 용량으로 2일에 1번 9주동안 복강투여를 실시한 랫트의 뒷다리 근육을 채취한 후 lysis buffer (0 mM Tris, 2 mM EDTA, 150 mM NaCl, 10% Triton X-100 and 10% NP40, protease inhibitor and phosphatase inhibitor in H2O, pH 7.5)를 넣고 세포질 단백질을 추출하였다. 추출된 단백질은 DC protein 정량법을 이용하여 동량으로 정량 후 Tube-Gel digestion 방법을 이용하여 trypsin digestion을 수행 후 펩타이드 혼합물은 A nano-ACQUITY Ultra Performance LC ChromatographTM equipped with a SynaptTM HDMS System (Waters Corp., Milford, MA, USA) 시스템을 이용하여 단백질체 분석을 수행하였다.
단백질체 분석결과에 대하여 Ingenuity Pathway Analysis (IPA version 9.0; Ingenuity Systems Inc., Redwood City, CA, USA) 실시한 결과 도 7에 제시한 바와 같이 TCA cycle 관련 시트르산 합성효소(citrate synthase, 1.33배), 아코니타아제(aconitase, 1.39배), 옥소글루타르산(oxoglutarate, 1.47배), 숙신산 탈수소효소(succinate dehydrogenase complex, 1.35 배), 말산 탈수소효소(malate dehydrogenase, 1.47배)가 증가함을 확인하였다. 따라서 상기 공액이중결합형 만뉴론산 올리고당은 에너지 대사에 필요한 NADH를 생산하는 TCA 회로 효소의 발현을 증가하는 것을 확인하였다.
실시예 5: 운동수행능력 향상 실험 설계 및 방법
비환원성 말단의 공액이중결합형 만뉴론산 올리고당의 운동수행 향상능력에 대한 평가를 실시하였다. 본 실험의 대상은 의학적으로 이상 소견이 없고 식이 통제가 가능한 성인 남성 4명을 대상으로 하였다. 실험기간은 운동 전 단시간(30분)의 비환원성 말단의 공액이중결합형 만뉴론산 올리고당 섭취가 운동선수의 운동수행능력에 미치는 영향을 조사하였다. 30분 동안 간격을 두고 세차례 윈게이트 무산소성 능력 검사(WACT)를 실시하여 운동수행능력(평균파워)를 측정하였다. 비환원성 말단의 공액이중결합형 만뉴론산 올리고당의 섭취는 다음과 같은 방법을 통하여 두차례에 걸쳐 1인당 총 5 g을 섭취하였다(도 8). 첫 번째 테스트와 두 번째 테스트 사이 1인당 2.5 g, 두 번째 테스트와 세 번째 테스트 사이 1인당 2.5 g을 경구투여 하였고 본 실험을 위하여 실험참가자는 실험기간 중 합숙하며 동일한 식사를 하였다(도 8).
실시예
6: 무산소성 운동수행능력 측정 방법
무산소성 운동수행능력의 판단 기준으로 평균 파워를 측정하기 위해 자전거 에르고 미터를 이용한 간헐적 부하운동을 탈진(all-out)될 때까지 반복적으로 지속시켰다. 무산소성 파워 측정 (Wingate test)의 컴퓨터 모니터 상에서 페달링 운동속도가 300 rpm 이하로 5초 이상 저하될 경우 운동을 중지시키고, 이 때까지의 시간을 초단위로 계측해서 운동지속시간으로 결정하였다. 30분 동안 휴식(1세트)한 다음 같은 방법으로 반복적인 운동을 하였다. 휴식의 형태는 자전거 에르고미터의 안장에 앉아 정적인 휴식을 하였다.
도 9에 나타난 바와 같이 비환원성 말단의 공액이중결합형 만뉴론산 올리고당 경구투여 이후 실시된 두차례의 무산소성 능력테스트에서 두 번 모두 8.7% 및 13.7%의 스피드 증가가 관찰되었으며, 도 10에 나타난 바와 같이 비환원성 말단의 공액이중결합형 만뉴론산 올리고당 경구투여 이후의 무산소성 평균파워는 각각 9.2% 및 16.8% 증가하는 것으로 나타났다. 따라서 상기 결과를 토대로 본 발명자들은 본 발명의 운동보충제 조성물이 무산소성 운동수행능력 향상을 위하여 에너지 공급원을 원활하게 공급해주며, 짧은 휴식시간과 높은 에너지를 요구하는 운동 경기에서 운동보충제로 활용 될 수 있는 조성물을 신규하게 발명하였다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
Claims (11)
100-5000 Da 크기의 알긴산 올리고당(alginate oligosaccharide)를 유효성분으로 포함하는 운동능력 개선용 식품 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 알긴산 올리고당은 1 내지 20 당으로 구성되는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 알긴산 올리고당은 서열목록 제1서열의 아미노산 서열로 이루어진 알긴산 라이아제(alginate lyase)로 폴리만뉴론산을 분해하여 생성되는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 3 항에 있어서, 상기 알긴산 라이아제는 서열목록 제2서열의 뉴클레오타이드 서열로 이루어지는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 알긴산 올리고당은 비환원성 말단의 공액이중결합형 만뉴론산 올리고당(Conjugated Carbonyl Manuronic Oligosaccharide; CMOS)인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 알긴산 올리고당은 산-알칼리가수 분해에 의해 생성된 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 알긴산 올리고당은 방사선 조사에 의해 생성된 것을 특징으로 하는 조성물.
삭제
제 1 항에 있어서, 상기 알긴산 올리고당은 만뉴론산(mannuronate) 및 글루론산(guluronate)의 비율이 1.2-5.0:1 몰비인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 운동은 무산소운동(anaerobic exercise) 또는 유산소운동(aerobic exercise)인 것을 특징으로 하는 조성물.
삭제
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