CN104473159A - 一种葛枣猕猴桃泡腾剂及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种葛枣猕猴桃泡腾剂及其制备方法与应用。将提取到的活性多糖混合物、碳酸氢钠、柠檬酸、粘合剂、木糖醇、葛枣猕猴桃多糖提取后的滤液冻干粉和海藻酸钠按(3-5份)：(24-30份)：(15-20份)：(1-3份)：(10-14份)：(4-6份)：(2-5份)混合、制软材、制粒，烘干，整粒后，再加入30-50份果汁包合物、即可得到泡腾颗粒剂。该方法工艺简单，产品活性成分明确，天然V_C保持率在70％以上，采用木糖醇配方体系、口感良好，适于糖尿病病人服用；实验证明葛枣猕猴桃活性多糖及泡腾颗粒剂对于Ⅱ型糖尿病均有一定治疗功效；能广泛应用到制备抗氧化、抗疲劳和降血糖的食品和/或保健品中。

Description

一种葛枣猕猴桃泡腾剂及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及食品加工领域，具体涉及一种葛枣猕猴桃泡腾剂及其制备方法与应用。

背景技术

野生猕猴桃由于具有独特的风味和好的保健功效受到了国内外越来越多学者的研究和关注。常见的有葛枣和狗枣，本研究以研究相对较少的葛枣为材料。葛枣猕猴桃是猕猴桃科猕猴桃属的植物，果实扁圆、有棱、主要分布于东三省、俄罗斯等地。黑龙江地区所产成熟后具有淡黄色果皮，与狗枣外观有一定差异。同时所含多糖、总黄酮、萜、维生素C(Vc)等在含量或成分种类上均有一定差异。现阶段研究成果表明：其标志成分有猕猴桃碱(actinidine)，草苁蓉醛(boschniakine)，并富含Ca，K，Mg，P，Na，Fe，Sr，Mn，Zn，Cu等人体必需的无机元素，而含Pb，Cd，Be，Hg甚微，值得一提的是果实含维生素C 0.53％～1.43％，基本上均高于中华猕猴桃含量(100～300mg/100g)，开发潜力很大，糖类4.2％～9.8％，其中活性多糖更具有好的生理活性，有机酸0.78％～2.48％，果胶质，鞣质和蛋白质，此外还含有大量黄酮苷、山奈酚、β-谷甾醇等。所以具有潜在的抗肿瘤作用、抗病毒、抗炎作用；抗氧化作用；增强免疫作用，抗畸变、抗突变作用；降血脂、降血糖作用。具有很好保健功能，但是其储藏时间短，口感酸涩，不能很好地作为水果供应市场。此外，要发挥葛枣猕猴桃保健作用，需要一定的食用量，活性成分达到一定剂量才有保健价值。由于现代人生活紧张、快速，有很多人处于亚健康状态，为此这就需要开发一种既能保持其特有的风味，又能发挥保健功能，且携带方便，老少皆宜，又符合现代人快节奏生活习惯的产品。

发明内容

本发明的目的之一在于提供葛枣猕猴桃中的三种活性多糖及其提取方法。

本发明所提供的葛枣猕猴桃中的活性多糖是按照如下方法提取得到的：

1)粗多糖提取：将葛枣猕猴桃榨汁后所得果渣与乙醇水溶液混合，并加入纤维素酶进行酶解；酶解结束后，使酶灭活，并对灭活后的酶解液进行超声提取，得到提取液；然后将所述提取液进行浓缩，并向浓缩液中加入乙醇进行静置沉淀，离心得到沉淀物，即为固体粗多糖；

2)粗多糖中活性多糖的提取：

a)将步骤1)中所得粗多糖配制成5-10mg/mL的粗多糖水溶液，对所述粗多糖水溶液除蛋白，并向除蛋白后的粗多糖水溶液中加入体积浓度为80-95％的乙醇水溶液，使粗多糖沉淀，离心得到沉淀物，并将所述沉淀物配制成浓度为1-2g/L多糖水溶液；

b)以乙醇和水的体积比为(20:1)-(100:1)的乙醇水溶液为洗脱剂，将步骤a)中的所述1-2g/L多糖水溶液，采用液体上样法，经D101大孔树脂和MCI反相树脂组成的混合柱进行梯度洗脱(梯度洗脱的过程中，也起到对所述粗多糖脱色的作用)，收集乙醇和水的体积比为(20:1)-(50:1)的馏分、浓缩、并向浓缩液中加入体积浓度为80-95％的乙醇水溶液进行静置沉淀，离心得到沉淀物，并对沉淀物干燥，将所得到的干燥物配制成0.5-1g/L多糖水溶液；

c)将步骤b)中所述的0.5-1g/L多糖水溶液上Sepharose CL-4B阴离子交换柱进行梯度洗脱，以质量浓度为0.05％-5％的NaCl的三羟甲基氨基甲烷缓冲溶液(Tris缓冲液)为洗脱剂，分别收集NaCl质量浓度为0.1％、0.2％和0.5％处的馏分，对所收集到的三种馏分分别进行透析除盐离子(钠离子和氯离子)、冷冻干燥，得到干燥物，经过冷融离心法确定多糖均一性，分别得到葛枣猕猴桃中三种活性多糖Rz₁和Rz₂和Rz₃，通过红外光谱及TLC鉴别为三种新的杂多糖。

上述葛枣猕猴桃中多糖提取方法中，步骤1)中，所述果渣和乙醇水溶液的固液比为1g：(5-10)ml，具体为1g：5ml，所述乙醇水溶液中乙醇的体积分数为40％-60％，具体为50％。

所述果渣具体可按照下述方法制备得到：取已清洗的葛枣猕猴桃，用适量液氮搅拌处理后，柠檬酸浸泡，用LE-2螺旋榨汁机榨汁后收集果渣，即得。其中，所述液氮的使用量为所述葛枣猕猴桃质量的1％-3％，具体为2％；所述柠檬酸的加入量为所述葛枣猕猴桃质量的0.2％-0.3％，所述柠檬酸浸泡的时间为5min-10min，柠檬酸在此起软化葛枣猕猴桃的作用。

所述纤维素酶加入量为每克所述果渣中加入(20U-45U)的纤维素酶，具体为30U。

纤维素酶的酶活定义为1g固体酶(1ml液体酶)在50℃、pH＝4.8条件下，1h水解底物CMC-Na产生1mg葡萄糖的还原糖量为1个酶活单位，以u/g(u/ml)表示。

所述酶解的pH为4-5.5，具体为5.5；所述酶解的温度为37℃-45℃，具体为37℃；所述酶解的时间为1h-2h，具体为2h。

所述酶灭活的方式是采用微波使酶灭活，所述微波的功率为300W-400W，所述微波将酶灭活的时间为1min-5min。

所述超声提取可按如下步骤进行：常温下，在30-40kw的超声波提取器中超声处理30min-60min，如此重复提取2-3次，合并提取液。

所述浓缩为将所述提取液减压浓缩至原体积1/12-1/8，具体为1/10。

所述提取液在浓缩之前，还包括向提取液加入1-2％活性炭脱色的步骤。

上述葛枣猕猴桃中多糖提取方法中，步骤2)中，

所述除蛋白是采用sevage法对所述粗多糖水溶液除蛋白，所述sevage法为将步骤1)中所得固体粗多糖用热水溶解成粗多糖溶液，并将粗多糖溶液与Sevage试剂[氯仿：正丁醇＝5：1(V/V)]按体积比5：1混合，振荡，离心，变性后的蛋白质介于粗多糖溶液与Sevage试剂交界处。此法的优点是条件温和，不会引起多糖的变性。

所述D101大孔树脂和MCI反相树脂组成的混合柱中D101大孔树脂和MCI反相树脂的质量比为(10-30):(0.5-1)，具体为20：1，其中，所述MCI反相树脂的商品型号为CHP20P。

所述以乙醇和水的体积比为(20:1)-(100:1)的乙醇的水溶液为洗脱剂进行梯度洗脱具体可按如下步骤进行：依次用乙醇和水的体积比为20:1、30:1、50:1和100:1的乙醇的水溶液进行梯度洗脱，并实时用硫酸-苯酚法检测，分别收集乙醇和水的体积比为20:1、30:1和50:1处的馏分，并将所述馏分合并。

所述质量浓度为0.05％-5％的NaCl的三羟甲基氨基甲烷缓冲溶液的pH值为8.3-9.5，此处NaCl起增加离子强度，实现多糖交换的作用。

本发明的目的在于提供一种葛枣猕猴桃泡腾剂，该葛枣猕猴桃泡腾剂活性成分明确，绿色健康。

本发明所提供的葛枣猕猴桃泡腾剂包括如下质量份数的组份：

上述葛枣猕猴桃泡腾剂中，所述葛枣猕猴桃果汁包合物可通过如下方法制备得到：取已清洗的葛枣猕猴桃，用适量液氮搅拌处理后，柠檬酸浸泡，榨汁，得到果汁；向果汁中加入吐温80和亚硫酸钠，并通入氮气(避免Vc被氧气氧化)，再向其中加入果胶酶进行酶解；加入澄清剂，快速离心，取上清液与β-环糊精与麦芽糊精混合(此混合物作为吸附剂，对浓缩果汁快速包合吸附)，超声波处理，冷冻干燥或喷雾干燥(最大程度保留保健食品中浓缩果汁原风味及易氧化成分)得到冻干粉，即为果汁包合物。

其中，所述液氮的使用量为所述葛枣猕猴桃质量的1％-3％，具体为2％。

所述柠檬酸的加入量为所述葛枣猕猴桃质量的0.2％-0.3％，所述柠檬酸浸泡的时间为5min-10min，柠檬酸在此起软化葛枣猕猴桃的作用。

所述吐温80和亚硫酸钠在所述果汁中的浓度均为0.02-0.04mg/ml。

所述氮气的通入速率为10-20ml/min，具体为15ml/min。

所述果胶酶加入量为每克所述果汁中加入(20U-30U)的果胶酶，所述酶解的温度为30℃-40℃，所述酶解的时间为1h-2h。

所述澄清剂为壳聚糖，所述壳聚糖的加入量为所述果汁总质量的1-2％。

所述β-环糊精与麦芽糊精混合物中β-环糊精和麦芽糊精的质量比为1：5-1：10。

所述上清液和所述β-环糊精与麦芽糊精混合物的质量比为10：(2-3)。

所述超声波处理的功率为30W-40W，时间为2-10min。

所述活性多糖混合物为所述葛枣猕猴桃中多糖提取方法提取得到的多糖Rz₁、Rz₂和Rz₃的混合物，其中，所述多糖Rz₁和Rz₂和Rz₃的质量比为(1-2):(1-4):(1-4)。

所述葛枣猕猴桃多糖提取后的滤液冻干粉为：将制备活性多糖中步骤2)中b)所述离心后所得的上清液合并，并将其浓缩至原体积1/10-1/20，向其中加入活性炭脱色，使活性炭的质量分数为1-2％，再向已脱色后的残液中加入麦芽糊精，使麦芽糊精的质量分数为20-40％，并冷冻干燥得到冻干粉(此处的冻干粉中主要含有黄酮和皂苷类成分)。

所述粘合剂为聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和聚乙二醇4000(PEG4000)按质量比1:1的混合物。此外，还可采用常用的MC、EC、HPC等粘合剂。

所述葛枣猕猴桃泡腾剂中还可以加入适量的食用香精，可以改变葛枣猕猴桃泡腾剂的口味。

所述葛枣猕猴桃泡腾剂中还可以加入适量的高浓度乙醇(≥80％)和水作为润湿剂。

所述葛枣猕猴桃泡腾剂中总黄酮≥2％，总多糖≥1.5％，多糖Rz₁≥0.1％，多糖Rz₂≥0.2％，多糖Rz₃≥0.2％。

所述葛枣猕猴桃泡腾剂的剂型可为颗粒剂、片剂、胶囊剂或口含片等。

所述葛枣猕猴桃泡腾剂的剂型为片剂和口含片时，还需加入1-3％的聚乙二醇6000(PEG6000)作为润滑剂，混合均匀、压片真空包装即可得泡腾片和口含片。

本发明所述葛枣猕猴桃泡腾剂的服用方法：每日2次，早晚各一片(每片Vc含量50mg,总黄酮含量20mg，Rz₁5mg，Rz₂10mg，Rz₃10mg)，置于200-300ml水中，50s左右就可直接服用。

本发明的另一个目的在于提供一种葛枣猕猴桃泡腾剂的制备方法，所述制备方法可以达到一步制粒的效果。

本发明所提供的葛枣猕猴桃泡腾剂的制备方法包括如下步骤：将所述葛枣猕猴桃中活性多糖混合物、碳酸氢钠、柠檬酸、粘合剂、木糖醇、所述葛枣猕猴桃多糖提取后的滤液冻干粉和海藻酸钠按所述质量份数混合、制软材、制粒，烘干，整粒后，再加入所述质量份数的葛枣猕猴桃果汁包合物，即可得到泡腾颗粒剂。

上述制备方法中，所述制软材之前还包括加入高浓度乙醇(80％-100％)为润湿剂，可以防止酸碱相发生反应。

所述制粒为制粒机湿法一步制粒。

所述烘干的温度为40℃-45℃；

所述整粒的目数为16目-18目。

本发明由所述葛枣猕猴桃中多糖提取方法所提取得到的三种活性多糖也属于本发明保护的范围。

其中，三种活性多糖Rz1、Rz2和Rz3均含有半乳糖醛酸，半乳糖，葡萄糖和甘露糖。Rz3含有葡萄糖醛酸结构，Rz2含有阿拉伯糖结构，Rz1不含有鼠李糖结构，Rz3可能含有核糖。以上结果结合Smith降解和过(高)碘酸氧化对比研究发现，Rz1，Rz2为1→2位键型，Rz3为1→4位键型。

本发明所提取得到的三种活性多糖和所制备得到的葛枣猕猴桃泡腾剂在制备抗氧化、抗疲劳和/或降血糖食品和/或保健品方面的应用。

本发明采用超声波和微波结合工艺快速提取功效成分，即活性多糖(纯化多糖)，保证了有效成分尽可能的萃出，同时用液氮、β-环糊精、麦芽糊精等综合抗氧化技术尽可能避免Vc及活性成分易氧化而造成的损失问题，纯化工艺相对简单，不采用常见DEAE-52系列树脂处理，采用Sepharose CL-4B树脂，具备高流速、高分辨率和纯化产品均一性好等优点，此外本工艺先对粗产品进行D101+MCI混合法脱色素处理，脱色快、树脂柱易恢复。有利于降低纯化材料的负担，加快流速，可以缩短加工时间，提高了产品收率。

本发明所开发的泡腾剂，既有固体制剂方便携带的优点，同时冲泡方便，所得产品在感官、口味上保持了葛枣猕猴桃特有风味，同时，葛枣猕猴桃中的果汁包合物既可以吸附保存Vc，可以对易氧化成分起到保护作用(环糊精包合)，又可加快冷冻速率，用质量浓度为0.05％-5％的NaCl的三羟甲基氨基甲烷缓冲溶液(Tris缓冲液)为洗脱剂进行梯度洗脱可使多糖均一度好，无需再上通用Sephadex G系列凝胶色谱柱进行进一步纯化。此外，对于提取所得活性多糖(本研究多糖与刘延吉研究葛枣猕猴桃以木糖和葡萄糖为组分组成的葛枣多糖存在明显差异，本研究多糖为杂多糖)进行保健功能研究，与已经发表文献及相关专利相比，本发明所制备的葛枣猕猴桃泡腾剂的保健功能成分明确，本发明所制备的葛枣猕猴桃泡腾剂属于葛枣猕猴桃产品深加工，不属于初级加工，同时综合利用葛枣猕猴桃多种活性成分。

通过研究本发明所纯化得到的活性多糖和所制备得到的葛枣猕猴桃泡腾剂在抗氧化、抗疲劳和降血糖方面的功效实验，可以发现其在抗氧化、抗疲劳和降血糖方面具有明显的功效，能广泛应用到用于制备抗氧化、抗疲劳和降血糖的食品和/或保健品中。

附图说明

图1为实施例1中葛枣猕猴桃中多糖纯化的工艺流程图。

图2为实施例1中活性多糖Rz₁的红外光谱图。

图3为实施例1中活性多糖Rz₂的红外光谱图。

图4为实施例1中活性多糖Rz₃的红外光谱图。

图5为实施例1中活性多糖薄层层析测定结果。

图6为实施例1中葛枣猕猴桃泡腾剂的制备工艺图。

图7为实施例3中活性多糖浓度对小鼠体重变化的影响。

图8为实施例3中活性多糖浓度对小鼠血糖水平的影响。

图9为实施例3中活性多糖浓度对小鼠甘油三酯值变化的影响。

图10为实施例3中活性多糖浓度对小鼠胆固醇值变化的影响。

图11为实施例3中活性多糖浓度对小鼠血浆中胰岛素分泌量的影响。

图12为实施例4中葛枣猕猴桃泡腾剂活性成分对超氧阴离子自由基的清除作用。

图13为实施例4中葛枣猕猴桃泡腾剂活性成分对羟基离子自由基的清除作用。

具体实施方式

下面结合附图通过具体实施例对本发明的方法进行说明，但本发明并不局限于此，凡在本发明的精神和原则之内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

下述实施例中所述葛枣猕猴桃产自黑龙江省；所述柠檬酸，NaHCO₃，β-环糊精、麦芽糊精，PVP，PEG4000(6000)，乙醇，木糖醇等辅料均为食用级。

下述实施例中的纤维素酶购于山东省泰安市信德利生物工程有限公司。下述实施例中的纤维素酶酶活力单位(U)定义为1g固体酶(1ml液体酶)在50℃、pH＝4.8条件下，1h水解底物CMC-Na产生1mg葡萄糖的还原糖量为1个酶活单位，以u/g(u/ml)表示。

纤维素酶酶活力的具体测定方法为：将0.625g CMC-Na溶解在100ml纯水中作为底物，取底物溶液9ml，加纤维素酶酶液1ml，50℃下，测定底物粘度减至一半时所需时间，以奥氏粘度计测定。以10min能使底物粘度降低一半的酶活作为一个单位。

下述实施例中的果胶酶购于山东省泰安市信德利生物工程有限公司。下述实施例中的果胶酶酶活力单位(U)定义为1U果胶活力单位指在50℃，PH＝3.5条件下，一分钟分解果胶产生1微摩尔葡萄糖等量物，所需要的酶量为1个国际单位。

果胶酶酶活力的具体测定方法为：果胶酶水解果胶,生成半乳糖醛酸。半乳糖醛酸具有还原性糖醛基,可用次亚碘酸法定量测定,以此来表示果胶酶的活性。取3只比色管中,分别加入10g/L果胶溶液5ml,在50±0.1℃水浴中预热10min；空白管中加pH＝3.5缓冲液(柠檬酸-柠檬酸钠)5mL；样品管加稀释酶液1mL、pH＝3.5缓冲液4mL,立刻摇匀,计时。保温、反应0.5h,立即取出,微波处理1min,冷却；取上述3支管反应液各5ml放入碘量瓶中,准确加入1mol/L碳酸钠溶液1ml、0.1mol/L碘液5ml,摇匀,于暗处放置20min；取出,加入2mol/L硫酸溶液2ml,用0.05mol/L硫代硫酸钠标准溶液滴定至浅黄色,加淀粉指示液3滴,继续滴定至蓝色刚好消失为其终点,记录空白、样品反应液消耗硫代硫酸钠标准溶液的体积,计算。

下述实施例中检测方法：2，4-二硝基苯肼比色法测定Vc含量；采用硝酸铝-亚硝酸钠比色法测定总黄酮；采用硫酸-苯酚法测定可溶性多糖含量；抗氧化方面：对超氧阴离子自由基的清除作用，采用邻苯三酚自氧化速率测定法，邻二氮菲分光光度法测定抗氧化剂的抗羟基自由基性能；采用小鼠(昆明种)负重模型以游泳时间、全血乳酸的含量为指标研究抗疲劳活性；采用四氧嘧啶诱导构建Ⅱ型糖尿病小鼠模型，研究降血糖活性。

下述实施例所用的主要仪器：JP600超声波提取器，武汉嘉鹏电子有限公司；NJL07—3型实验专用微波炉，南京杰全微波设备有限公司；FD-1冷冻真空干燥机，北京博医康技术公司；恒温水浴锅；真空干燥箱；ZP120单冲压片机，丹东制药机械有限公司；LE-2螺旋榨汁机，诸城市众发机械；紫外可见分光光度计，日立2010；PHS-3C型酸度计，上海雷磁；电子天平，德国赛多利斯等。

实施例1果汁包合物的制备、果渣中活性成分的提取以及泡腾剂、胶囊剂和泡腾片制备

1)果汁包合物制备：将葛枣猕猴桃清洗挑选，并向所述葛枣猕猴桃中加入柠檬酸进行浸泡处理，浸泡时间为8min，柠檬酸的加入量为所述葛枣猕猴桃质量的0.25％，加入所述葛枣猕猴桃质量的2％液氮、利用LE-2螺旋榨汁机快速榨汁，收集果汁，依次向果汁中加入吐温80和亚硫酸钠(目的是防止维生素C降解)，使其浓度均为0.02mg/ml，通入氮气，氮气速率为15ml/min，每克所述果汁中加入25U的果胶酶，在36℃下酶解1.5h，检测控制Vc降解。并向所述果汁中加入壳聚糖作为澄清剂，使壳聚糖的质量分数为2％，快速离心，取上清液，并将上清液和β-环糊精与麦芽糊精混合物(其中，β-环糊精和麦芽糊精的质量比为1:6)混合，使上清液和β-环糊精与麦芽糊精混合物的比例为10：3，在30W下，超声波处理2min，冷冻干燥或喷雾干燥得到冻干粉，即为果汁包合物。

2)提取果渣中活性成分：将步骤1)中用LE-2螺旋榨汁机快速榨汁后所剩的果渣，依据固液比1g：5ml，加入50％乙醇水溶液，并且每克所述果渣中加入30U的纤维素酶进行酶解，酶解时的pH为5.5，温度37℃，酶解时间为2h；酶解结束后，在300W功率下，用微波处理酶解液5min，将纤维素酶灭活；将灭活后的酶解液置于超声波提取器中，在30kw功率下，常温超声40min，如此重复提取2～3次，合并提取液(此时，可向提取液中加入2％活性炭脱色)，并将提取液减压浓缩至原体积1/10时，加入乙醇促使提取液中的粗多糖沉淀，静置过夜，离心获得粗多糖；

将离心获得粗多糖用热水溶解成粗多糖溶液，并将粗多糖溶液与Sevage试剂[氯仿：正丁醇＝5：1(V/V)]按体积比5：1混合，振荡，离心，变性后的蛋白质介于粗多糖溶液与Sevage试剂交界处，并向分离出的已除蛋白后的粗多糖溶液中加入浓度为90％的乙醇，促使粗多糖沉淀，离心得到沉淀物，并将所述沉淀物用热水溶解形成浓度为1-2g/L多糖溶液，然后以乙醇和水的体积比为(20:1)-(100:1)的乙醇的水溶液为洗脱剂，采用液体上样法，经D101大孔树脂和MCI反相树脂组成的混合柱进行梯度洗脱，用硫酸-苯酚法检测，收集合并乙醇和水的体积比为(20:1)、(30:1)和(50:1)处的馏分，浓缩、加入90％乙醇、多糖出现沉淀，静置10h后，4000r/min下离心15min，得到沉淀物，并对沉淀物低温干燥，得到干燥物，备用。

制备葛枣猕猴桃多糖提取后的滤液冻干粉：将上述离心后所得的上清液合并，并将其至原体积1/15，向其中加入活性炭脱色，使活性炭的质量分数为2％，再向已脱色后的残液中加入麦芽糊精，使麦芽糊精的质量分数为30％，并冷冻干燥得到冻干粉(此处的冻干粉中主要含有黄酮和皂苷类成分)，即制备得到了葛枣猕猴桃多糖提取后的滤液冻干粉。

将上述得到的干燥物用热水溶解配制成1g/L多糖溶液，以质量浓度为0.05％-5％的NaCl的三羟甲基氨基甲烷缓冲溶液(Tris缓冲液)为洗脱剂，采用液体上样法，上Sepharose CL-4B阴离子交换柱进行梯度洗脱，用硫酸-苯酚法检测收集NaCl的质量浓度为0.05％、0.1％、0.2％、0.5％处的馏分，并对所收集到的馏分进行透析除盐离子、冷冻干燥得到干燥物，即为三种葛枣猕猴桃中活性多糖Rz₁和Rz₂和Rz₃。经过冷融离心法(将冷冻干燥后的干燥物溶解成多糖溶液，-20℃下冷冻30min，室温融化，15℃下，在10000r/min下离心15min，无沉淀说明纯度好)确定多糖均一性，通过红外光谱及TLC鉴别多糖，其相应的流程图如图1所示。

活性多糖Rz₁的红外光谱图如图2所示，从图1可得知：3360-3431cm^－1为羟基(-OH)的缔合峰，1634cm^－1为羰基(CO)吸收，表明存在乙酰基。1106、988cm^－1的三个峰表示分子中存在β-型糖苷键。872cm^－1为β-型-D-吡喃甘露糖，而880cm^－1则示为β-型-D-吡喃葡萄糖型，可能为杂多糖。

活性多糖Rz₂的红外光谱图如图3所示，从图2可得知：在3320-3500cm^－1处示为羟基(O-H)的缔合峰，环上碳—氧(C-O)吸收峰在1020-1180cm^－1为一较强吸收峰，且有裂分。在880-900cm^－1间有特征吸收，这表示为β-型糖苷键。

活性多糖Rz₃的红外光谱图如图4所示，从图3可得知：3460-3480cm^-1出现宽峰，并分裂2重峰，可能是O-H的伸缩振动峰，表明多糖存在分子内和分子间的氢键；1600cm^-1左右的吸收峰是-CHO的C-O的伸缩振动峰，1000-1200cm^-1间比较大的吸收峰是由两种C-O伸缩振动所引起的，其中一种是属于C-O-H的，另种是糖环的C-O-C；860cm^-1处有一吸收峰，可能为呋喃糖型C-H变角振动的特征吸收峰。

通过薄层色谱法(TLC)，对活性多糖Rz₁-Rz₃进行了成分分析，薄层色谱法是一种微量而快速的分析方法。它兼备了柱层析和纸层析两者的优点并且操作方便，设备简单，容易掌握、便宜、灵活的特点，具体的过程如下：

对照品溶液的制备：葡萄糖0.5mg，甘露糖0.5mg，阿拉伯糖1.0mg，L-木糖1.5mg，L-半乳糖0.5mg，L-鼠李糖0.5mg，D-半乳糖醛酸1.0mg，D-葡萄糖醛酸1.0mg，D-核糖0.5mg等，精确称定，超声溶解于2ml 60％乙醇水溶液制成混合对照品溶液。

供试品溶液的制备：分别取Rz₁-Rz₃20mg溶于10mL硫酸中，置于氮气保护密封试管内100℃下水解3h。水解液低压旋干，残渣溶于1mL 60％乙醇水溶液中得供试品溶液。

展开剂和显色剂：以正丁醇：吡啶：乙酸：水＝12.5:4.5:2:2(v/v)为展开剂进行展开，苯胺-二苯胺溶液(二苯胺4g、苯胺4mL、85％磷酸20mL混合溶解于200mL丙酮溶液中)为显色剂。

薄层层析(TLC)：硅胶G(5cm×10cm)，点样量2μL，混合对照品点样1μL，置于展开槽中，取出吹干，喷显色剂苯胺-二苯胺显色后，置于烘箱中130℃加热显色至斑点清晰，其相应的测试结果图如图5所示，其中，Rz₁水解；Rz₂水解；Rz₃水解；B－混合对照品溶液；(1，半乳糖醛酸；2，葡萄糖醛酸；3，半乳糖；4，葡萄糖；5，甘露糖；6，阿拉伯糖；7，木糖；8，鼠李糖；9，核糖)，从附图5可知：Rz₁、Rz₂和Rz₃均含有半乳糖醛酸、半乳糖、葡萄糖和甘露糖。Rz₃含有葡萄糖醛酸结构，Rz₂含有阿拉伯糖结构，Rz₁不含有鼠李糖结构，Rz₃可能含有核糖。以上结果结合Smith降解和过(高)碘酸氧化对比研究发现，Rz1，Rz2为1→2位键型，Rz3为1→4位键型。

上述过(高)碘酸氧化原理：可选择性断裂糖分子中连二羟基或连三羟基，生成相应的多糖醛、甲醛或甲酸。

上述Smith降解是将氧化产物还原后进行酸水解。

3)泡腾剂、胶囊剂和泡腾片制备：向12g果渣中提取的活性多糖Rz₁、Rz₂和Rz₃的混合物(其中，Rz₁、Rz₂和Rz₃的质量比为1:2:3)中加入木糖醇(56g)、碳酸氢钠(96g)、柠檬酸(80g)、海藻酸钠(20g)、葛枣猕猴桃多糖提取后的滤液冻干粉(18g)和粘合剂(12g，其由质量比为1:1的PVP与PEG4000组成)，此外还可加入适量香精适量、适量无水乙醇和水(在制备的过程中可以加入适当高浓度乙醇(90％)为润湿剂，便于制备泡腾颗粒剂，制备结束后，高浓度乙醇(90％)也挥发完全)，在制粒机上湿法一步制粒，45℃下烘干，以18目筛子整粒后，加入120g果汁包合物，则可制备得到泡腾颗粒剂；装入胶囊则可制备得到胶囊剂；加入1％润滑剂(PEG6000)，混合均匀、压片可得100片，真空包装可得泡腾片，其相应的制备工艺图如图6所示。

测量上述泡腾剂中总黄酮含量和总多糖含量的方法如下：

总黄酮测定采用如下方法：精密称取在120℃干燥至恒重的芦丁对照品50mg，置50ml容量瓶中定容，取10ml定容100ml容量瓶中，配制每1ml中含无水芦丁0.1mg，作为母液。精密量取对照品溶液0ml、1ml、2ml、3ml、4ml、5ml、6ml分别置25ml比色管中，各加水至5ml，加5％亚硝酸钠溶液1ml，摇匀，放置6分钟，加10％硝酸铝溶液1ml，摇匀，放置6分钟，加4％氢氧化钠试液4ml，加50％乙醇至刻度，摇匀，放置10-15分钟，以相应试剂为空白，在510nm的波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线得方程回归Y＝0.573X+0.0168。

样品处理：精密称量研碎泡腾剂0.2-0.5g，加入20-30ml甲醇超声提取5min，抽虑定容50ml，移取2-3ml样品，测其吸光度，依据标准曲线方法检测计算，得到葛枣猕猴桃泡腾剂中总黄酮≥2％。

总多糖采测定采用如下方法：精密称定葡萄糖0.100g，置于1000mL容量瓶中，用水定容。取0.5、1、1.5、2、2.5和3mL于25mL比色管中，分别加入5％的苯酚1mL，快速加5mL浓硫酸混匀，静止10min，40℃水浴30min，在490nm波长下测吸光度，得回归方程y＝0.0175x+0.0176。

样品处理：精密称量研碎泡腾剂0.1-0.2g，加入20-40％乙醇20-30ml，超声提取5-10min，抽虑，上清液加入90％乙醇使乙醇浓度达到70％以上，出现沉淀后，静止10-18h，4000r/min离心10min，纯水溶解，定容50ml容量瓶作为检测样品，测其吸光度，依据标准曲线方法检测计算，得到葛枣猕猴桃泡腾剂中总多糖≥1.5％。

实施例2：葛枣猕猴桃制剂及活性多糖成分Rz_1-3降血糖和抗疲劳研究

采用小鼠(昆明种)负重模型进行研究，以游泳时间和全血乳酸的含量为指标研究抗疲劳活性；采用STZ诱导二型糖尿病小鼠为模型，研究其降血糖效果。其结果如表1和表2所示：

表1活性多糖及其制剂对昆明小鼠游泳时间的影响

组别	动物只数(只)	给药剂量(mg·kg-1d-1)	游泳时间(min)
				NC(空白)	10	0	152.2
Rz1	10	100	161.1
				Rz1	10	200	178.5
Rz1	10	300	192.6
				Rz2	10	100	172.4
Rz2	10	200	199
				Rz2	10	300	201.7
Rz3	10	100	156.3
				Rz3	10	200	168.9
Rz3	10	300	188.2
				葛枣猕猴桃制剂	10	150	208.4

注：Rz_1-3为活性多糖。

表2活性多糖及其制剂对昆明小鼠血乳酸水平的影响

注：Rz_1-3为活性多糖。

从表1、表2可知：明显增加昆明小鼠游泳时间，改善血乳酸代谢水平，具有抗疲劳活性。

实施例3：活性多糖成分Rz_1-3及葛枣猕猴桃制剂对二型糖尿病小鼠降血糖效果的影响

对照组小鼠：选取体重约为20g健康的昆明小鼠100只，适应性饲养一周后，每日上午给予腹腔注射浓度为5mg/ml柠檬酸钠缓冲液，按体重每天注射35mg/kg，连续注射3天，小鼠饮用自来水，饲以小鼠常规饲料。

试验组小鼠：选取体重约为20g健康的昆明小鼠100只，适应性饲养一周后，每日上午给予腹腔注射浓度为5mg/ml的STZ溶液(链脲佐菌素溶液)，按体重每天注射35mg/kg，连续注射3天，小鼠饮用自来水，饲以小鼠高脂高糖饲料。

每天观察饮水进食情况，造模后每天检测一次体重，造模每周检测一次血糖，当小鼠血糖值达到11.1mmol/L时即建模成功。建模成功后的二型糖尿病小鼠根据其体重和血糖值进行随机分组，按照小鼠的分组分别进行葛枣猕猴桃制剂及活性多糖成分R_Z1-3或生理盐水进行灌胃(正常组和模型组灌胃生理盐水)，灌胃给药量为：低浓度给药量为100mg·kg^-1d^-1，中浓度给药量为200mg·kg^-1d^-1，高浓度给药量为300mg·kg^-1d^-1，葛枣猕猴桃制剂给药量为150mg·kg^-1d^-1。每天下午同一时间按照同样的顺序进行灌胃。每日灌胃前给小鼠称重，以观察小鼠体重的变化。共持续8周，每天观察进食、饮水、以及排尿量的变化情况。其间小鼠正常进食饮水。

(1)葛枣猕猴桃制剂和活性多糖对小鼠体重变化的影响：小鼠基础水平下体重平均值为27.6g，适应一周后，通过腹腔注射STZ的方式，诱导建立二型糖尿病小鼠模型。总体来看，成膜后的体重平均值为33.92g，连续灌胃给药8周后，模型组的小鼠体重下降到28.3g，而正常组小鼠体重由建模后的33.3g持续上升到41.5g，二型糖尿病小鼠的体重在第2周时明显下降，给药第3周开始体重稍有上升，给药8周后体重与正常组相差不大，而模型组小鼠的体重持续下降，如表3所示，其相应的柱状图如图7所示。

表3葛枣猕猴桃制剂和活性多糖对小鼠体重的影响(g)

注：Rz_1-3为活性多糖

(2)葛枣猕猴桃制剂和活性多糖对小鼠血糖浓度变化的影响：2型糖尿病小鼠模型建立成功后，对小鼠进行连续8周灌胃给药，从灌胃给药第一天起，每周进行一次空腹血糖浓度的测定。小鼠基础水平下血糖浓度平均值为6.35mmol/L，适应一周后，腹腔注射STZ，诱导2型糖尿病小鼠模型，成膜后的血糖浓度平均值为23.55mmol/L，连续灌胃给药8周后，模型组的小鼠血糖浓度为28.9mmol/L，灌胃给药后，各给药组小鼠血糖浓度与灌胃前血糖浓度有明显下降，其中高浓度多糖Rz₁组和葛枣猕猴桃制剂给药组下降最多，如表4所示，其相应的柱状图如图8所示。

表4葛枣猕猴桃制剂和活性多糖对小鼠血糖水平的影响(mmol/L)

注：Rz_1-3为活性多糖

(3)葛枣猕猴桃制剂和活性多糖对小鼠甘油三酯值变化的影响：小鼠适应环境一周后通过试剂盒检测每只小鼠的甘油三酯平均值为0.33mmol/L，成膜后的小鼠甘油三酯的平均值为0.32mmol/L，连续灌胃给药8周后，小鼠甘油三酯值无明显变化为0.33mmol/L，灌胃给药前后差异不显著，如表5所示，其相应的柱状图如图9所示。

表5葛枣猕猴桃制剂和活性多糖对小鼠甘油三酯的影响(mmol/L)

(4)对小鼠胆固醇值变化的影响：成膜后小鼠总胆固醇的平均值为5.55mmol/L，连续灌胃给药8周后，小鼠总胆固醇值稍有上升为5.70mmol/L，但不显著，如表6所示，其相应的柱状图如图10所示。

表6葛枣猕猴桃制剂和活性多糖对小鼠胆固醇的影响(mmol/L)

(5)对小鼠胰岛素分泌量的影响：小鼠禁食不禁水8h后，每只小鼠分别灌胃2g/kg的葡萄糖溶液，通过ELISA试剂盒方法检测灌胃葡萄糖30min后小鼠胰岛素的分泌量。结果显示，正常组小鼠体内的胰岛素浓度最高达到7.73mIU/L(N＝10)，与模型组相比，不同浓度给药组小鼠体内胰岛素分泌量明显增多(P<0.01)，其中高浓度多糖Rz₁组和葛枣猕猴桃制剂给药组小鼠体内的胰岛素浓度分别为7.53mIU/L和7.61mIU/L与模型组相比差异极显著(P<0.001)，其相应的柱状图如图11所示。

实施例4：葛枣猕猴桃制剂在抗氧化方面的研究

抗氧化活性测定：对超氧阴离子自由基的清除作用，采用邻苯三酚自氧化速率测定法，邻二氮菲分光光度法测定抗氧化剂的抗羟基自由基性能。前处理：精密称取实施例1中研碎后泡腾剂2.000g，用20mL 40％乙醇水溶液溶解，在常温下超声提取10min，过滤后，滤渣再提取一次，合并滤液，弃去滤渣。将所得滤液，加40％的乙醇水溶液定容至25mL备用。其相应的测定结果如图12和图13所示，可以得知：具有明显超氧阴离子自由基及羟基自由基的清除作用，显示明显抗氧化作用。

实施例5：临床应用研究报告

1)研究对象：

保健食品组：亚健康人群(表现为易感冒、易疲劳、睡眠质量差、血糖血脂高、精力差、记忆力差)，共30例，平均年龄44岁，其中女性15例，平均年龄42岁。

安慰剂对照组：10例，年龄28-52岁，平均年龄43.3岁。

2)研究方法：

观察对象确定：中医科诊断以上病例，符合慢性疲劳亚健康综合征特征。

保健食品组使用实施例1中所制备的葛枣猕猴桃制剂(泡腾片)，服药周期为2周，为消除心理因素，采用随机抽取10例为安慰剂对照组(可溶淀粉替代泡腾片主要成分)。

3)使用方法：两周为一个疗程，每日2次，早晚各一片(每片Vc含量为50mg，总黄酮含量为20mg，Rz₁含量为5mg，Rz₂含量为10mg，Rz₃含量为10mg，果汁包合物含量为2g)，置于200-300ml水中，50s左右就可直接服用。安慰剂对照组同样片剂大小，可溶淀粉替代泡腾片主要成分。

4)临床功效判断标准：

(1)显著：主要症状明显改善或消失，或主要症状2项，次要症状3项明显改善。

(2)有效：主要症状改善，或好转一级(由重变轻或消失)，主要症状改善，次要症状1-2项改善。

(3)无效：主要症状无改善。

5)功效结果：保健食品组和安慰剂对照组测试结果分别如下表7和8所示，临床总功效结果见表9：由表7可知保健食品组总的有效率在80％，主要症状改善较为明显；由表8可见，安慰剂对照组明显不如保健食品组的测试结果；由表9可见，其保健食品组总有效率达到83.3％，说明与安慰剂对照组差异明显，有明确的疗效。通过对30例亚健康人群的临床研究，表明保健食品组总有效率在83.3％，服用2周后病例出现精神旺盛，食欲改善，记忆力增强，同时没有不良反应出现。所以本品有抗疲劳辅助治疗功能，对亚健康状态有明显改善作用。

表7.保健食品对照组功效结果

表8.安慰剂对照组功效结果

表9.临床总功效结果

分组	显著	有效	无效	总有效率
					保健食品组(30例)	12(40.00％)	13(43.3％)	5(16.7％)	25(83.3％)
安慰剂组(10例)	0(0％)	1(10％)	9(90％)	1(10％)

6)典型病例：

(1)赵XX，女，43岁，药企高管，平时压力大，服用前有明显畏寒、夜尿频繁、易感冒、便秘、神疲乏力等症状，服用3周后畏寒、神疲乏力等症状消失，疲劳、腰膝酸软有明显改善。

(2)田XX，男，34岁，高校教师，工作忙，野外调查，服用前有明显畏寒、入睡难，血糖处于临界，食欲不振，少言，神疲乏力。服用20天后畏寒、神疲乏力等症状消失，血糖回归正常，食欲改善，精力充沛。

(3)杨XX，男，50岁，销售大区经理，服用前食欲不振、畏寒、夜尿频繁、口干、血糖处于临界等，服用15天后畏寒、神疲乏力等症状消失，血糖回复正常，精力明显好转。

Claims (10)

1.一种提取葛枣猕猴桃中三种活性多糖的方法，包括如下步骤：

1)粗多糖提取：将葛枣猕猴桃榨汁后所得果渣与乙醇水溶液混合，并加入纤维素酶进行酶解；酶解结束后，使酶灭活，并对灭活后的酶解液进行超声提取，得到提取液；然后将所述提取液进行浓缩，并向浓缩液中加入乙醇进行静置沉淀，离心得到沉淀物，即为固体粗多糖；

2)粗多糖中活性多糖的提取：

a)将步骤1)中所得粗多糖配制成5-10mg/mL粗多糖水溶液，对所述粗多糖水溶液除蛋白，并向除蛋白后的粗多糖水溶液中加入体积浓度为80-95％的乙醇水溶液，使粗多糖沉淀，离心得到沉淀物，并将所述沉淀物配制成浓度为1-2g/L多糖水溶液；

b)以乙醇和水的体积比为(20:1)-(100:1)的乙醇水溶液为洗脱剂，将步骤a)中的所述1-2g/L多糖水溶液，采用液体上样法，经D101大孔树脂和MCI反相树脂组成的混合柱进行梯度洗脱，收集乙醇和水的体积比为(20:1)-(50:1)的馏分、浓缩、并向浓缩液中加入体积浓度为80-95％的乙醇水溶液进行静置沉淀，离心得到沉淀物，并对沉淀物低温干燥，将所得到的干燥物配制成0.5-1g/L多糖水溶液；

c)将步骤b)中所述的0.5-1g/L多糖水溶液上Sepharose CL-4B阴离子交换柱进行梯度洗脱，以质量浓度为0.05％-5％的NaCl的三羟甲基氨基甲烷缓冲溶液为洗脱剂，分别收集NaCl质量浓度为0.1％、0.2％和0.5％处的馏分，对所收集到的三种馏分分别进行透析除去盐离子、冷冻干燥，得到干燥物，即为葛枣猕猴桃中三种活性多糖Rz₁、Rz₂和Rz₃。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤1)中，所述果渣和乙醇水溶液的固液比为1g：(5-10)ml，所述乙醇水溶液中乙醇的体积分数为40％-60％；

所述纤维素酶加入量为每克所述果渣中加入20U-45U的纤维素酶；

所述酶解的pH为4-5.5，所述酶解的温度为37℃-45℃，所述酶解的时间为1h-2h；

所述酶灭活的方式是采用微波使酶灭活，所述微波的功率为300W-400W，所述微波将酶灭活的时间为1min-5min；

所述超声提取可按如下步骤进行：常温下，在30-40kw的超声波提取器中超声处理30min-60min，如此重复提取2-3次，合并提取液；

所述提取液在浓缩之前，还包括向提取液加入1-2％活性炭脱色的步骤；

所述浓缩为将所述提取液减压浓缩至原体积1/12-1/8。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：步骤2)中，所述D101大孔树脂和MCI反相树脂组成的混合柱中D101大孔树脂和MCI反相树脂的质量比为(10-30):(0.5-1)；

所述以乙醇和水的体积比为(20:1)-(100:1)的乙醇的水溶液为洗脱剂进行梯度洗脱可按如下步骤进行：依次用乙醇和水的体积比为20:1、30:1、50:1和100:1的乙醇的水溶液进行梯度洗脱，并实时用硫酸-苯酚法检测，收集乙醇和水的体积比为20:1、30:1和50:1处的馏分，并将所述馏分合并；

所述质量浓度为0.05％-5％的NaCl的三羟甲基氨基甲烷缓冲溶液的pH值为8.3-9.5。

4.权利要求1-3中任一项所述方法所提取得到的三种活性多糖，其中，所述三种活性多糖为多糖Rz₁、Rz₂和Rz₃。

5.一种葛枣猕猴桃泡腾剂，包括如下质量份数的组份：

其中，所述葛枣猕猴桃果汁包合物通过如下方法制备得到：取已清洗的葛枣猕猴桃，柠檬酸浸泡，用液氮搅拌处理后，榨汁，得到果汁；向果汁中加入吐温80和亚硫酸钠，并通入氮气，再向其中加入果胶酶进行酶解；加入澄清剂，离心，取上清液与β-环糊精与麦芽糊精混合，超声波处理，冷冻干燥或喷雾干燥得到冻干粉，即为果汁包合物；

所述液氮的使用量为所述葛枣猕猴桃质量的1％-3％；

所述柠檬酸的加入量为所述葛枣猕猴桃质量的0.2％-0.3％，所述柠檬酸浸泡的时间为5min-10min；

所述吐温80和亚硫酸钠在所述果汁中的浓度均为0.02-0.04mg/ml；

所述氮气的通入速率为10-20ml/min；

所述果胶酶加入量为每克所述果汁中加入(20U-30U)的果胶酶，所述酶解的温度为30℃-40℃，所述酶解的时间为1h-2h；

所述澄清剂为壳聚糖，所述壳聚糖的加入量为所述果汁总质量的1-2％；

所述β-环糊精与麦芽糊精混合物中β-环糊精和麦芽糊精的质量比为1：5-1：10；

所述上清液和所述β-环糊精与麦芽糊精混合物的质量比为10：(2-3)；

所述超声波处理的功率为30W-40W，时间为2-10min；

所述活性多糖混合物为权利要求4中所述多糖Rz₁、Rz₂和Rz₃的混合物，其中，所述多糖Rz₁和Rz₂和Rz₃的质量比为(1-2):(1-4):(1-4)；

所述葛枣猕猴桃多糖提取后的滤液冻干粉为将权利要求1所述步骤2)中b)所述离心后所得的上清液合并浓缩至原体积1/10-1/20，向其中加入活性炭脱色，使活性炭的质量分数为1-2％，再向已脱色后的残液中加入麦芽糊精，使麦芽糊精的质量分数为20-40％，并冷冻干燥得到冻干粉。

6.根据权利要求5所述的葛枣猕猴桃泡腾剂，其特征在于：所述粘合剂为聚乙烯吡咯烷酮和聚乙二醇4000按质量比1:1的混合物；

所述葛枣猕猴桃泡腾剂的剂型为颗粒剂、片剂、胶囊剂或口含片；

所述葛枣猕猴桃泡腾剂的剂型为泡腾片或口含片，还需向中加入1-3％的聚乙二醇6000作为润滑剂，混合均匀、压片真空包装即可得泡腾片或口含片。

7.权利要求5或6所述的葛枣猕猴桃泡腾剂的制备方法，包括如下步骤：将所述葛枣猕猴桃中活性多糖混合物、碳酸氢钠、柠檬酸、粘合剂、木糖醇、所述葛枣猕猴桃多糖提取后的滤液冻干粉和海藻酸钠按所述质量份数混合、制软材、制粒，烘干，整粒后，再加入所述质量份数的葛枣猕猴桃果汁包合物，即可得到葛枣猕猴桃泡腾剂。

8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于：所述制软材之前还包括加入高浓度乙醇为润湿剂的步骤，其中，所述高浓度乙醇的浓度为80-100％；

所述制粒为制粒机湿法一步制粒；

所述烘干的温度为40℃-45℃；

所述整粒的目数为16目-18目。

9.权利要求4所述的三种活性多糖在制备抗氧化、抗疲劳和/或降血糖食品和/或保健品方面的应用。

10.权利要求5或6所述的葛枣猕猴桃泡腾剂在制备抗氧化、抗疲劳和/或降血糖食品和/或保健品方面的应用。