KR20140145808A - 감귤류 가공부산물 유래의 면역활성다당 및 비배당체 플라보노이드의 제조방법 - Google Patents

감귤류 가공부산물 유래의 면역활성다당 및 비배당체 플라보노이드의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 감귤(citrus)속 감귤류 가공부산물을 효소처리하는 단계; 및 상기 효소처리된 감귤류 가공부산물을 원심분리하는 단계;를 포함하고, 상기 원심분리 상등액에서 면역활성다당을 제조하며, 상기 원심분리 침전물에서 비배당체 플라보노이드를 제조하는 것을 특징으로 하는 감귤류 유래 면역활성다당 및 비배당체 플라보노이드의 동시 제조방법에 관한 것이다. 본 발명에 따라 제조된 면역활성다당은 1,000 ㎍/ml 농도에서 45 % 이상의 항보체활성을 나타내고, 림프구 증식, 대식세포 사이토카인(IL-6 및 IL-12) 생산자극 및 자연살해세포를 활성화하는 능력이 우수하다.

Description

감귤류 가공부산물 유래의 면역활성다당 및 비배당체 플라보노이드의 제조방법{Preparing method of immuno-stimulating activities of polysaccharide fractions isolated and aglycon flavonoid from citrus peel}
본 발명은 감귤류 가공부산물로부터 면역증강 기능을 가지는 면역활성다당 및 비배당체 플라보노이드를 효소를 이용하여 동시에 추출하는 방법에 관한 것이다.
최근 경제발전에 따른 생활수준의 향상으로 인하여 위생환경이 개선되고, 풍요로운 식단, 서구화된 식생활과 인스턴트 식품 섭취 등에 따라 섭취 열량 또한 급속한 증가가 이루어지고 있다. 그러나 음식으로 섭취된 열량이 증가한 반면, 운동 부족 등으로 소비되는 열량이 적어 비만이 증가하는 경향을 보이고 있다. 비만은 고혈압, 당뇨, 고지혈증, 관상 동맥질환 등과 같은 성인병을 비롯하여 유방암, 자궁암 및 대장암 등을 야기하는 것으로 보고되면서 이제는 치명적인 질병의 하나로 취급되고 있다(nature, 404, 652-660).
비만은 과잉 섭취된 잉여 에너지가 중성지방 및 기타 지방 대사물의 형태로 지방조직에 저장됨으로서 일차적으로 나타나며, 이러한 에너지 대사의 불균형에 따른 종합적인 대사이상에 의해 유발되는 질병으로, 그동안 비만 치료를 위해 개발된 약물들은 효과에 비하여 부작용이 심해 항비만 효과는 높고, 부작용이 적은 새로운 치료방법에 대한 관심이 높다.
국내 다이어트 기능성 식품 시장은 2009년 1,500-2,000억원 규모이며, 공액리놀렌산(Conjugated Linoleic Acid, CLA)과 가르시니아 캄보지아 껍질 추출물(hydroxyl citric acid, HCA) 등의 수입원료가 시장의 대부분을 차지하고 있으며, 현재 이를 제외하고 시장에 영향력이 있는 다이어트용 소재가 출시되고 있지 않는 실정이다. 따라서 국내 농산물 등의 천연물을 이용한 개별인정형 건강기능식품 소재 개발이 절실한 시점이다.
한편, 한국인의 사망 원인 1위는 암으로, 전통적으로 암을 극복하기 위해서 수술, 방사선요법 및 약물요법 등을 이용하고 있으나, 전이를 일으킨 종양세포에 대하여 완벽한 치료 효과를 기대하기는 아직까지 어려운 실정이다. 현재, 항암치료의 대부분은 항암제 투여에 의존하고 있으나, 항암제의 대다수가 합성화학약품으로 조혈기능 및 면역기능 이상 등의 생체 유해성 문제가 제기되면서 천연물에서 추출한 면역반응 조절제에 대하여 많은 연구가 집중되고 있다.
우리나라에서 재배되고 있는 시트러스류(citrus)는 약 340 여종이 있으며, 그중 가장 많이 재배되는 품종은 만다린계 온주밀감으로, 연간 60만톤 가량이 생산되고 있다. 귤, 한라봉 등의 시트러스류는 우리나라 남부지방 및 제주도에서 널리 재배되고 있으며, 시트러스류는 과즙의 수율이 과실 무게의 절반에 불과하여 음료나 감귤 첨가 가공식품을 만드는 과정에서 연간 15만톤의 과피부산물이 발생하고 있다.
감귤류 가공 부산물은 펙틴 및 오일류 제조에 일부 사용되고 있으나, 대부분 산업용 폐기물로서 2차적인 이용이 없이 버려지고 있다. 최근 귤껍질 부산물에서 항산화물질인 헤스페리딘을 분리하여 돼지사료에 먹인 결과 질병저항성을 향상시킨 보고는 있으나, 감귤류에서 면역증강 기능을 가지는 다당체와 비배당체 플라보노이드를 동시에 제조할 수 있는 기술은 보고된 바 없다.
본 발명은 상술한 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로, 본 발명이 해결하고자 하는 과제는 감귤(citrus)속 감귤류 가공부산물로부터 면역 증강기능을 가지는 면역활성다당 및 비배당체 플라보노이드를 동시에 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 상기 첫 번째 과제를 달성하기 위하여,
(1) 감귤(citrus)속 감귤류 가공부산물을 펙티나아제(pectinase)를 첨가하여 효소처리하는 단계; 및 (2) 상기 효소처리된 감귤류 가공부산물을 원심분리하는 단계;를 포함하고,
상기 원심분리 상등액에서 면역활성다당을 제조하며, 상기 원심분리 침전물에서 비배당체 플라보노이드를 제조하는 것을 특징으로 하는 감귤류 유래 면역활성다당 및 비배당체 플라보노이드의 동시 제조방법을 제공한다.
본 발명의 다른 일 실시예에 의하면, 상기 효소처리는 상기 펙티나아제(pectinase) 이외에 헤스페리디나아제(hesperidinase) 및 나린지나아제(naringinase) 중에서 선택되는 1종 이상을 더 포함시켜 제조된 혼합효소로 처리될 수 있는데,
바람직하게는 상용효소를 사용하여 처리될 수 있는데, 상기 혼합효소는 상용효소인 펙티넥스(Pectinex) 또는 사이토라제(Cytolase)일 수 있으며, 상기 펙티넥스 및 사이토라제를 각각 단독 또는 혼합하여 사용하여 처리함으로써 수행될 수 있고,
상기 감귤류 가공부산물 고형분 100 중량부에 대하여 효소 0.01-1 중량부를 첨가하여 6-96 시간 동안 처리하여 수행될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 의하면 상기 면역활성다당은 상기 원심분리 상등액을 농축한 뒤, 에탄올을 첨가하고 -10-20 ℃에서 3-24 시간 정치시켜 침전을 유도하는 단계; 상기 침전이 형성된 에탄올 혼합물을 액상층과 침전물로 분리하는 단계; 및 침전물을 동결건조시켜 면역활성다당을 제조하는 단계;를 포함하여 수행함으로써 제조될 수 있으며,
상기 비배당체 플라보노이드는 a) 상기 원심분리 침전물에 에탄올을 첨가하고, 45-80 ℃에서 6-48 시간 동안 환류시켜 플라보노이드 성분을 추출하는 단계; b) 상기 에탄올 추출액을 에탄올 가용물과 에탄올 불용물로 분리하는 단계; 및 c) 상기 에탄올 가용물을 농축하고 -10-20 ℃에서 결정화시켜 비배당체 플라보노이드를 제조하는 단계;를 포함하여 수행함으로써 제조될 수 있는데,
상기 b) 단계의 에탄올 가용물에 상기 면역활성다당의 제조과정에서 발생된 액상층을 혼합하는 단계를 더 포함하여 제조함으로써 비배당체 플라보노이드의 수율을 향상시킬 수 있고,
상기 c) 단계의 결정화시켜 얻은 비배당체 플라보노이드를 0-10 ℃ 증류수로 1-3회 수세하는 과정을 더 포함함으로써 비배당체로 전환된 플라보노이드의 수율이 향상된 비배당체 플라보노이드를 얻을 수 있다.
상기 감귤류 가공부산물은 음료, 감귤 초콜렛 등의 감귤류 가공품을 만드는 과정에서 나오는 감귤류 외피 및 착즙박일 수 있는데, 상기 가공부산물을 직접 또는 건조하여 사용할 수 있다.
상기 감귤류는 감귤(citrus)속 식물이면 제한은 없으며, 한라봉(부지화), 천혜양, 밀감, 청견, 금귤 및 유자로 이루어진 군 중에서 선택되는 1종 이상일 수 있으나, 바람직하게는 한라봉(부지화)일 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 실시예에 의하면, 상기 배당체 플라보노이드에서 비배당체 플라보노이드로 전환된 전환율이 40-70 중량%일 수 있다.
본 발명에 따라 제조된 면역활성다당은 1,000 ㎍/ml 농도에서 항보체활성이 45 % 이상일 수 있고, Interleukin-6(IL-6)의 생산자극능력이 600-800 pg/mL이며, Interleukin-12(IL-12)의 생산자극능력이 550-800 pg/mL일 수 있으며,
본 발명에 따라 제조된 비배당체 플라보노이드는 나린제닌 및 히스페리틴 중에서 선택되는 어느 하나 이상이다.
본 발명의 효소처리를 이용하여 면역활성다당 및 비배당체 플라보노이드를 동시 제조할 수 있다. 본 발명에 따라 제조된 면역활성다당은 대체로 농도의존적인 항보체 활성을 나타내며, 1,000 ㎍/ml 농도에서 45 % 이상의 활성을 나타낸다. 또한, 면역활성다당은 림프구 증식, 대식세포 사이토카인(IL-6 및 IL-12) 생산자극 및 자연살해세포를 활성화하는 능력이 열수추출에 의해 획득된 감귤류 유래 면역활성다당에 비하여 우수하다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 감귤류 유래 면역활성다당 및 비배당체 플라보노이드를 동시에 제조하는 방법을 개략적으로 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예 및 비교예에 따른 감귤류 유래 비배당체 플라보노이드의 HPLC 분석결과를 나타낸 도이다. 도 2a는 에탄올을 이용한 단순추출에 의해 추출된 플라보노이드 추출물의 HPLC 그래프이며, 도 2b는 본 발명에 따라 제조된 플라보노이드 추출물의 HPLC 그래프이다.
귤, 한라봉 등의 감귤류는 우리나라 남부지방 및 제주도에서 널리 재배되고 있으며, 음료, 감귤 초콜렛 등 감귤류 가공품을 만드는 과정에서 감귤류 외피 및 착즙박 등의 가공부산물이 연간 5만톤 이상 발생되어 폐기물로 버려지고 있는데, 이러한 감귤류 가공부산물에는 플라보노이드 성분, 펙틴 및 오일 등이 풍부한 것 것으로 알려져 있다.
감귤(citrus)류에 함유된 플라보노이드는 대부분 배당체(glycoside) 형태로 존재하게 되는데, 최근 플라보노이드에 대한 생체 내 효능 연구가 활발해지면서, 배당체(glycoside) 형태보다 비배당체(aglycone) 형태의 플라보노이드가 체내 흡수율이 높아 더 우수한 생리적 효과를 나타낸다고 보고되고 있다. 따라서 최근에는 플라보노이드의 구조적 특성 파악 및 대사의 특징연구를 통하여 미생물이나 효소적 반응을 이용하여 생물전환시켜 비배당체 형태의 플라보노이드 개발이 활발하게 진행되고 있다.
또한, 펙틴은 전체 분자의 많은 부분이 homogalactouronan 구성되어 있으며, 여기에 다양한 올리고 및 폴리사카라이드로 분지된 rhamnogalactouronan I(RG-I) 및 rhamnogalactouronan Ⅱ(RG-Ⅱ)가 알려져 있다[Pharmaceutical chemistry journal Volume 46, Number 4 219-221]. RG류에는 cytolkine 생산자극, macrophade 활성화, NK 세포 자극활성 등 면역 활성과 항암활성 등을 비롯한 다양한 생리활성에 대한 연구들이 활발하게 진행되고 있다.
이에 본 발명자들은 효소를 이용한 생물전환을 통해 감귤부산물로부터 비배당체 플라보노이드와 면역활성다당을 동시에 제조할 수 있는 방법을 개발하여 본 발명을 완성하게 되었다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명의 일 측면에 따르면, (1) 감귤(citrus)속 감귤류 가공부산물을 펙티나아제(pectinase)를 첨가하여 효소처리하는 단계; 및
(2) 상기 효소처리된 감귤류 가공부산물을 원심분리하는 단계;를 포함하고,
상기 원심분리 상등액에서 면역활성다당을 제조하며, 상기 원심분리 침전물에서 비배당체 플라보노이드를 제조하는 것을 특징으로 하는 감귤류 유래 면역활성다당 및 비배당체 플라보노이드의 동시 제조방법을 제공한다.
본 발명에 의하면, 상기 효소 처리는 상기 감귤류 부산물을 재가공 없이 그대로 사용할 수 있으나 분쇄해서 사용하는 것이 바람직한데, 감귤류 부산물을 분쇄해서 사용하는 것이 표면적이 증가되어 단위 시간당 효소에 의해 처리되는 양이 많아져 효소처리시간을 단축할 수 있어 바람직하며, 장시간 효소처리에 의해 발생되는 가수분해 현상을 방지할 수 있어 바람직하다.
본 발명에 의하면, 상기 효소처리에 사용되는 효소는 감귤류 부산물에 존재하는 면역활성다당을 분리해낼 수 있는 효소와 배당체 형태의 플라보노이드를 비배당체 플라보노이드로 전환시킬 수 있는 효소라면 제한이 없으며,
상기 펙티나아제 이외에 헤스페리디나아제(hesperidinase) 및 나린지나아제(naringinase) 중에서 선택되는 1종 이상을 더 포함시켜 제조된 혼합효소로 처리될 수 있다.
바람직하게는 상용효소를 사용하여 처리될 수 있는데, 상기 혼합효소는 상용효소인 펙티넥스(Pectinex) 또는 사이토라제(Cytolase)일 수 있으며, 상기 펙티넥스 및 사이토라제를 각각 단독 또는 혼합하여 사용하는 것이 기능성이 높게 유지된 면역활성다당체을 얻을 수 있으며, 비배당체로 전환율이 높은 플라보노이드를 동시에 얻을 수 있다.
상기 감귤류 가공부산물 고형분 100 중량부에 대하여 효소 0.01-1 중량부를 첨가하여 6-96 시간 동안 처리하여 수행될 수 있는데, 상기 효소가 0.01 중량부 미만이면 효소량이 너무 적어 감귤류 부산물에 존재하는 면역활성다당을 분리하거나, 배당체 형태의 플라보노이드를 비배당체 형태로 전환시키기 어려우며, 1 중량부를 초과하면 과다한 효소 작용으로 면역활성다당의 기능기를 가수분해하여 면역활성다당의 효능을 저하시킬 수 있어 바람직하지 않다.
상기 효소처리시 반응시간은 6-96시간인 것이 바람직한데, 12-24시간이 좀 더 바람직하며, 효소처리 시 온도 및 pH는 효소별 최적조건 하에서 처리하는 것이 기능성이 높게 유지된 면역활성다당과 비배당체로 전환된 플라보노이드를 얻을 수 있어 바람직하다. 상기 효소처리 반응시간이 6시간 미만이면, 감귤류 가공부산물이 효소에 처리되는 시간이 너무 짧아 감귤류에 존재하는 면역활성다당을 분리하기 힘들며, 배당체 형태의 플라보노이드가 충분히 비배당체로 전환되기 어려우며, 효소처리 반응시간이 96시간을 초과하면 과도한 효소처리로 인하여 면역활성다당의 기능기가 가수분해되어 활성다당의 효능이 저하될 수 있어 바람직하지 않다.
상기 면역활성다당은 투석, 컬럼크로마토그래피, 막여과법을 이용하여 정제될 수 있으나, 설비 및 공정비용 면에서 보다 간편하고 저렴한 방법으로 에탄올을 이용한 침전방법을 이용하여 정제되는 것이 바람직하다.
본 발명에 의하면, 상기 면역활성다당은 상기 원심분리 상등액을 농축한 뒤, 에탄올을 첨가하고 -10-20 ℃에서 3-24 시간 정치시켜 침전을 유도하는 단계; 상기 침전이 형성된 에탄올 혼합물을 액상층과 침전물로 분리하는 단계; 및 침전물을 동결건조시켜 면역활성다당을 제조하는 단계;를 포함하여 수행함으로써 제조될 수 있는데,
상기 원심분리 상등액 원액 100 부피%에 대하여 15-25 부피%가 되도록 상등액을 농축한 뒤, 농축액 대비 3-5 배 부피의 에탄올을 가하여 면역활성다당의 침전을 유도하고, 침전물을 동결건조시켜 정제될 수 있다.
상기 에탄올의 양이 상기 범위 미만이면, 침전형성이 일어나지 않아 면역활성다당을 얻기 힘들고, 상기 범위를 초과하면 불순물이 함유량이 증가할 수 있으며, 제조비용이 증가되어 경제적이지 않고, 공정상 화재 및 폭발위험이 증가되어 바람직하지 않다.
상기 면역활성다당 침전물은 제조과정에서 사용된 에탄올과 물 등의 용매가 다량 함유되어 있으므로 건조하여야 한다. 상기 물 등의 용매는 자연건조로 제거하기 어려우며, 고온 및 감압에 의해서 제거될 수 있으나, 고온으로 가열시 면역활성다당의 기능기가 가수분해되어 면역활성다당의 효능을 저하시킬 수 있으므로 바람직하지 않으며, 바람직하게는 동결건조시켜 제조될 수 있다.
본 발명에 의하면, 상기 제조방법에 의해 제조된 면역활성다당은 마이어(Mayer)법을 이용하여 시료에 의한 보체소비(complement consumption)후 잔존하는 보체에 의한 적혈구 용혈 정도에 근거를 둔 complement fixation test 방법으로 측정된 항보체활성이 1,000 ㎍/ml의 시료농도에서 45 %이상의 ITCH50값을 가질 수 있으며,
또한, 상기 면역활성 다당은 1,000 ㎍/ml 시료농도에서 Interleukin-6(IL-6)의 생산자극능력이 600-800 pg/mL이며, Interleukin-12(IL-12)의 생산자극능력이 550-800 pg/mL일 수 있다.
본 발명에 의하면 상기 면역활성다당 결정은 분자량이 5-300 Kda일 수 있으며,
상기 면역활성다당은 2-메틸퓨코스(2-methylfucose), 2-메틸자일로스(2-methylxylose), 아피오스(apiose), 아세르산(aceric acid), 3-디옥시-D-만노-2-옥툴로손산(3-deoxy-D-manno-octulosonic acid, KDO), 3-디옥시-D-릭소-2-헵툴로사르산(3-deoxy-D-lyxo-2-heptulosaric acid, DHA), 람노오스(rhamnose), 퓨코스(fucose), 아라비노스(arabinose), 자일로스(xylose), 만노스(mannose), 갈락토스(galactose), 글루코스(glucose), 갈락투론산(Galacturonic Acid) 및 글루쿠론산(Glucuronic Acid)을 포함하는 군 중에서 선택되는 1종 이상일 수 있는데,
바람직하게는 상기 면역활성다당 전체 중량비 100%에 대하여 3-디옥시-D-만노-2-옥툴로손산(KDO) 0.1-3 %, 3-디옥시-D-릭소-2-헵툴로사르산(DHA) 0.1-3 %, 2-메틸퓨코스 0.1-5 %, 2-메틸자일로스 0.1-5 %, 아피오스 0.1-5 %, 아세르산 0.1-5 %을 포함하여 구성될 수 있으나 이에 한정되지는 않는다.
한편, 본 발명에 의하면 상기 비배당체 플라보노이드는 a) 상기 원심분리 침전물에 에탄올을 첨가하고, 45-80 ℃에서 6-48 시간 동안 환류시켜 플라보노이드 성분을 추출하는 단계; b) 상기 에탄올 추출액을 에탄올 가용물과 에탄올 불용물로 분리하는 단계; 및 c) 상기 에탄올 가용물을 농축하고 -10-20 ℃에서 결정화시켜 비배당체 플라보노이드를 제조하는 단계;를 포함하여 수행함으로써 제조될 수 있는데,
상기 원심분리 침전물 1 중량부에 대하여, 50-70 부피% 에탄올 수용액을 10-20 중량부 첨가하여 환류시킴으로써 플라보노이드 성분을 추출할 수 있다.
또한, 상기 b) 단계의 에탄올 가용물에 상기 면역활성다당의 제조과정에서 발생된 액상층을 혼합하는 단계를 더 포함하여 제조함으로써 비배당체 플라보노이드의 수율을 향상시킬 수 있으며,
상기 비배당체 플라보노이드의 결정화가 잘 이루어지게 하기 위하여 헥산 또는 에테르를 소량 첨가하여 결정핵 형성을 유도할 수도 있다.
본 발명에 의하면, 상기 c) 단계의 결정화시켜 얻은 비배당체 플라보노이드를 0-10 ℃ 증류수로 수세하거나, 아세톤, 클로로포름 등으로 처리하여 불순물을 제거하는을 더 포함할 수 있는데, 증류수를 사용하는 것이 비배당체 플라보노이드의 손실을 최소화하고, 공정이 간단하여 경제적임으로 바람직하다.
상기 증류수로 1-3회 수세하는 과정에 의해 불순물이 제거되어 최종 생성물 중의 플라보노이드 함량이 향상될 수 있는데, 수세의 횟수 따라 순도를 초기순도 대비 40-80% 증가시킬 수 있다.
본 발명에 의하면, 효소처리하지 않은 방법에 의해 제조된 플라보노이드 성분은 전체 플라보노이드 성분 100 중량%에 대하여 비배당체 프라보노이드의 함량이 0.01-0.03 중량%이나, 본 발명의 제조방법에 따라 효소처리하여 배당체(glycoside)형태의 플라보노이드를 비배당체(aglycon)형태의 플라보노이드로 전환시켜 전환율이 40-70 중량%인 비배당체 플라보노이드를 얻을 수 있다.
본 발명에 의하면, 상기 비배당체 플라보노이드는 나린제닌 및 히스페리틴 중에서 선택되는 어느 하나 이상이다.
상기 감귤류 가공부산물은 음료, 감귤 초콜렛 등의 감귤류 가공품을 만드는 과정에서 나오는 감귤류 외피 및 착즙박일 수 있는데, 상기 가공부산물을 직접 또는 건조하여 사용할 수 있다.
상기 감귤류는 감귤(citrus)속 식물이면 제한은 없으며, 한라봉(부지화), 천혜양, 밀감, 청견, 금귤 및 유자로 이루어진 군 중에서 선택되는 1종 이상일 수 있으나, 바람직하게는 한라봉(부지화)일 수 있다.
본 발명에 따른 면역활성다당 또는 비배당체 플라보노이드를 건강기능식품 또는 일반 식품의 유효성분 첨가물로 사용하는 경우 본 발명에 따른 면역활성다당을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품성분과 함께 사용할 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용할 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 예방, 건강 또는 치료 등의 각 사용 목적에 따라 적합하게 결정할 수 있다.
일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시에 본 발명에 따른 면역활성다당 또는 비배당체 플라보노이드는 원료에 대하여 15 중량부 이하, 바람직하게는 10 중량부 이하의 양으로 첨가할 수 있다. 그러나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 또한 본 발명은 천연물로부터의 추출물을 이용하는 점에서 안전성 면에서 문제가 없으므로 상기 범위 이상의 양으로도 사용할 수 있다.
상기 식품의 종류에는 특별히 제한은 없고, 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸콜렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 식품을 모두 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 건강기능식품 중 음료 식품은 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 슈크로스와 같은 디사카라이드 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜일 수 있다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명에 따른 기능성 식품 100 mL당 약 0.01 ~ 0.04 g, 바람직하게는 약 0.02 ~ 0.03 g일 수 있다.
상기 외 본 발명에 따른 면역활성다당 또는 비배당체 플라보노이드를 유효성분으로 포함하는 건강기능식품은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제를 함유될 수 있으며, 이러한 성분은 독립적으로 또는 혼합하여 사용될 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 제한되지 않으나, 본 발명의 조성물 전체 100 중량부%에 대하여 0.01-0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
이하 본 발명을 바람직한 실시예를 참고로 하여 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예
실시예 1. 한라봉의 펙티넥스처리
실시예 1.1
한라봉 과피분말 100 g에 증류수 1000 ml을 첨가하고, 상업효소인 펙티넥스를 한라봉 과피분말 건조 중량대비 0.5 % (v/w)가하고, 14 시간 동안 교반하였다. 반응 완료 후 원심분리하여 상등액과 침전물로 분리하여 상등액은 면역활성다당의 제조, 침전물은 비배당체 플라보노이드의 제조에 이용하였다.
실시예 1.2
실시예 1.1의 효소처리에 의해 얻어진 상등액을 초기 부피대비 1/5 이 되도록 농축하고, 농축액 1 부피부에 대하여 4부피부의 에탄올을 가하여 4 ℃에서 12 시간동안 방치하여 면역활성다당의 침전을 유도하였다. 침전이 형성된 주정혼합물을 원심분리하여 상등액과 침전물로 분리하였으며, 침전물을 동결건조시켜 면역활성 다당을 획득하였다.
실시예 1.3
실시예 1.1의 효소처리에 의해 얻어진 침전물 1 중량부에 60% 에탄올 수용액을 15 중량부 가하여 60 ℃에서 24 시간 동안 교반하여 유효성분을 추출하였다. 추출 완료 후, 원심분리하여 추출 상등액을 회수하였고, 침전물은 폐기하였다. 회수된 추출 상등액과 실시예 1.2에서 주정혼합물을 원심분리하여 얻은 상등액을 혼합하였으며, 혼합액 1 부피부 대시 1/15 부피부가 되도록 농축한 뒤, 4 ℃에서 12 시간동안 방치하여 비배당체 플라보노이드의 침전을 유도하였다. 침전된 결정성분을 원심분리하여 회수하고, 농축액 1부피부 대비 1/2 부피부의 4 ℃ 증류수를 가하여 1회-3회 수세하였다.
얻어진 침전물은 저온건조기를 이용하여 50 ℃ 조건으로 건조하여 비배당체 플라보노이드를 제조하였다.
실시예 2. 한라봉의 사이토라제 처리
실시예 2.1
펙티넥스 대신 사이토라제를 사용한 것을 제외하고는 실시예 1.1의 방법으로 효소처리하고 원심분리하여 상등액과 침전물을 얻었다.
실시예 2.2
실시예 1.1의 상등액 대신 실시예 2.1의 상등액을 사용한 것을 제외하고는 실시예 1.2의 방법으로 면역활성다당을 제조하였다.
실시예 2.3
실시예 1.1의 침전물 대신 실시예 2.1의 침전물을 사용한 것을 제외하고는 실시예 1.3의 방법으로 비배당체 플라보노이드를 제조하였다.
실시예 3. 천혜양의 펙티넥스 처리
실시예 3.1
한라봉 대신 천혜양을 사용한 것을 제외하고는 실시예 1.1의 방법으로 효소처리하고 원심분리하여 상등액과 침전물을 얻었다.
실시예 3.2
한라봉 대신 천혜양을 사용한 것을 제외하고는 실시예 1.2의 방법으로 면역활성다당을 제조하였다.
실시예 3.3
한라봉 대신 천혜양을 사용한 것을 제외하고는 실시예 1.3의 방법으로 비배당체 플라보노이드를 제조하였다.
실시예 4. 천혜양의 사이토라제 처리
실시예 4.1
한라봉 대신 천혜양을 사용한 것을 제외하고는 실시예 2.1의 방법으로 효소처리하고 원심분리하여 상등액과 침전물을 얻었다.
실시예 4.2
한라봉 대신 천혜양을 사용한 것을 제외하고는 실시예 2.2의 방법으로 면역활성다당을 제조하였다.
실시예 4.3
한라봉 대신 천혜양을 사용한 것을 제외하고는 실시예 2.3의 방법으로 비배당체 플라보노이드를 제조하였다.
실시예 5. 밀감의 펙티넥스 처리
실시예 5.1
한라봉 대신 밀감을 사용한 것을 제외하고는 실시예 1.1의 방법으로 효소처리하고 원심분리하여 상등액과 침전물을 얻었다.
실시예 5.2
한라봉 대신 밀감을 사용한 것을 제외하고는 실시예 1.2의 방법으로 면역활성다당을 제조하였다.
실시예 5.3
한라봉 대신 밀감을 사용한 것을 제외하고는 실시예 1.3의 방법으로 비배당체 플라보노이드를 제조하였다.
실시예 6. 밀감의 사이토라제 처리
실시예 6.1
한라봉 대신 밀감을 사용한 것을 제외하고는 실시예 2.1의 방법으로 효소처리하고 원심분리하여 상등액과 침전물을 얻었다.
실시예 6.2
한라봉 대신 밀감을 사용한 것을 제외하고는 실시예 2.2의 방법으로 면역활성다당을 제조하였다.
실시예 6.3
한라봉 대신 밀감양을 사용한 것을 제외하고는 실시예 2.3의 방법으로 비배당체 플라보노이드를 제조하였다.
비교예 1. 한라봉의 셀룰라아제 KN 처리
비교예 1.1
펙티넥스 대신 셀룰라아제 KN을 사용한 것을 제외하고는 실시예 1.1의 방법으로 효소처리하고 원심분리하여 상등액과 침전물을 얻었다.
비교예 1.2
실시예 1.1의 상등액 대신 비교예 1.1의 상등액을 사용한 것을 제외하고는 실시예 1.2의 방법으로 면역활성다당을 제조하였다.
비교예 1.3
실시예 1.1의 침전물 대신 비교예 1.1의 침전물을 사용한 것을 제외하고는 실시예 1.3의 방법으로 비배당체 플라보노이드를 제조하였다.
비교예 2. 한라봉의 에코니타제 처리
비교예 2.1
펙티넥스 대신 에코니타제를 사용한 것을 제외하고는 실시예 1.1의 방법으로 효소처리하고 원심분리하여 상등액과 침전물을 얻었다.
비교예 2.2
실시예 1.1의 상등액 대신 비교예 2.1의 상등액을 사용한 것을 제외하고는 실시예 1.2의 방법으로 면역활성다당을 제조하였다.
비교예 2.3
실시예 1.1의 침전물 대신 비교예 2.1의 침전물을 사용한 것을 제외하고는 실시예 1.3의 방법으로 비배당체 플라보노이드를 제조하였다.
비교예 3. 한라봉의 라피다제 처리
비교예 3.1
펙티넥스 대신 라피다제를 사용한 것을 제외하고는 실시예 1.1의 방법으로 효소처리하고 원심분리하여 상등액과 침전물을 얻었다.
비교예 3.2
실시예 1.1의 상등액 대신 비교예 3.1의 상등액을 사용한 것을 제외하고는 실시예 1.2의 방법으로 면역활성다당을 제조하였다.
비교예 3.3
실시예 1.1의 침전물 대신 비교예 3.1의 침전물을 사용한 것을 제외하고는 실시예 1.3의 방법으로 비배당체 플라보노이드를 제조하였다.
비교예 4. 한라봉의 비스코엔자임 처리
비교예 4.1
펙티넥스 대신 비스코엔자임을 사용한 것을 제외하고는 실시예 1.1의 방법으로 효소처리하고 원심분리하여 상등액과 침전물을 얻었다.
비교예 4.2
실시예 1.1의 상등액 대신 비교예 4.1의 상등액을 사용한 것을 제외하고는 실시예 1.2의 방법으로 면역활성다당을 제조하였다.
비교예 4.3
실시예 1.1의 침전물 대신 비교예 4.1의 침전물을 사용한 것을 제외하고는 실시예 1.3의 방법으로 비배당체 플라보노이드를 제조하였다.
비교예 5. 한라봉의 셀루클라스트 처리
비교예 5.1
펙티넥스 대신 셀루클라스트를 사용한 것을 제외하고는 실시예 1.1의 방법으로 효소처리하고 원심분리하여 상등액과 침전물을 얻었다.
비교예 5.2
실시예 1.1의 상등액 대신 비교예 5.1의 상등액을 사용한 것을 제외하고는 실시예 1.2의 방법으로 면역활성다당을 제조하였다.
비교예 5.3
실시예 1.1의 침전물 대신 비교예 5.1의 침전물을 사용한 것을 제외하고는 실시예 1.3의 방법으로 비배당체 플라보노이드를 제조하였다.
비교예 6. 한라봉의 로하멘트 처리
비교예 6.1
펙티넥스 대신 로하멘트를 사용한 것을 제외하고는 실시예 1.1의 방법으로 효소처리하고 원심분리하여 상등액과 침전물을 얻었다.
비교예 6.2
실시예 1.1의 상등액 대신 비교예 6.1의 상등액을 사용한 것을 제외하고는 실시예 1.2의 방법으로 면역활성다당을 제조하였다.
비교예 6.3
실시예 1.1의 침전물 대신 비교예 6.1의 침전물을 사용한 것을 제외하고는 실시예 1.3의 방법으로 비배당체 플라보노이드를 제조하였다.
비교예 7. 한라봉의 울트라플로 처리
비교예 7.1
펙티넥스 대신 울트라플로를 사용한 것을 제외하고는 실시예 1.1의 방법으로 효소처리하고 원심분리하여 상등액과 침전물을 얻었다.
비교예 7.2
실시예 1.1의 상등액 대신 비교예 7.1의 상등액을 사용한 것을 제외하고는 실시예 1.2의 방법으로 면역활성다당을 제조하였다.
비교예 7.3
실시예 1.1의 침전물 대신 비교예 7.1의 침전물을 사용한 것을 제외하고는 실시예 1.3의 방법으로 비배당체 플라보노이드를 제조하였다.
비교예 8. 한라봉의 펙티나제 처리
비교예 8.1
펙티넥스 대신 펙티나제를 사용한 것을 제외하고는 실시예 1.1의 방법으로 효소처리하고 원심분리하여 상등액과 침전물을 얻었다.
비교예 8.2
실시예 1.1의 상등액 대신 비교예 8.1의 상등액을 사용한 것을 제외하고는 실시예 1.2의 방법으로 면역활성다당을 제조하였다.
비교예 8.3
실시예 1.1의 침전물 대신 비교예 8.1의 침전물을 사용한 것을 제외하고는 실시예 1.3의 방법으로 비배당체 플라보노이드를 제조하였다.
비교예 9. 천혜양의 셀룰라아제 KN 처리
비교예 9.1
한라봉 대신 천혜양을 사용하고, 펙티넥스 대신 셀룰라아제 KN를 사용한 것을 제외하고는 실시예 1.1의 방법으로 효소처리하고 원심분리하여 상등액과 침전물을 얻었다.
비교예 9.2
실시예 1.1의 상등액 대신 비교예 9.1의 상등액을 사용한 것을 제외하고는 실시예 1.2의 방법으로 면역활성다당을 제조하였다.
비교예 9.3
실시예 1.1의 침전물 대신 비교예 9.1의 침전물을 사용한 것을 제외하고는 실시예 1.3의 방법으로 비배당체 플라보노이드를 제조하였다.
비교예 10. 천혜양의 에코니타아제 처리
비교예 10.1
한라봉 대신 천혜양을 사용하고, 펙티넥스 대신 에코니타아제를 사용한 것을 제외하고는 실시예 1.1의 방법으로 효소처리하고 원심분리하여 상등액과 침전물을 얻었다.
비교예 10.2
실시예 1.1의 상등액 대신 비교예 10.1의 상등액을 사용한 것을 제외하고는 실시예 1.2의 방법으로 면역활성다당을 제조하였다.
비교예 10.3
실시예 1.1의 침전물 대신 비교예 10.1의 침전물을 사용한 것을 제외하고는 실시예 1.3의 방법으로 비배당체 플라보노이드를 제조하였다.
비교예 11. 천혜양의 라피다아제 처리
비교예 11.1
한라봉 대신 천혜양을 사용하고, 펙티넥스 대신 라피다아제을 사용한 것을 제외하고는 실시예 1.1의 방법으로 효소처리하고 원심분리하여 상등액과 침전물을 얻었다.
비교예 11.2
실시예 1.1의 상등액 대신 비교예 11.1의 상등액을 사용한 것을 제외하고는 실시예 1.2의 방법으로 면역활성다당을 제조하였다.
비교예 11.3
실시예 1.1의 침전물 대신 비교예 11.1의 침전물을 사용한 것을 제외하고는 실시예 1.3의 방법으로 비배당체 플라보노이드를 제조하였다.
비교예 12. 천혜양의 비스코엔자임 처리
비교예 12.1
한라봉 대신 천혜양을 사용하고, 펙티넥스 대신 비스코엔자임를 사용한 것을 제외하고는 실시예 1.1의 방법으로 효소처리하고 원심분리하여 상등액과 침전물을 얻었다.
비교예 12.2
실시예 1.1의 상등액 대신 비교예 12.1의 상등액을 사용한 것을 제외하고는 실시예 1.2의 방법으로 면역활성다당을 제조하였다.
비교예 12.3
실시예 1.1의 침전물 대신 비교예 12.1의 침전물을 사용한 것을 제외하고는 실시예 1.3의 방법으로 비배당체 플라보노이드를 제조하였다.
비교예 13. 천혜양의 셀루클라스트 처리
비교예 13.1
한라봉 대신 천혜양을 사용하고, 펙티넥스 대신 셀루클라스트를 사용한 것을 제외하고는 실시예 1.1의 방법으로 효소처리하고 원심분리하여 상등액과 침전물을 얻었다.
비교예 13.2
실시예 1.1의 상등액 대신 비교예 13.1의 상등액을 사용한 것을 제외하고는 실시예 1.2의 방법으로 면역활성다당을 제조하였다.
비교예 13.3
실시예 1.1의 침전물 대신 비교예 13.1의 침전물을 사용한 것을 제외하고는 실시예 1.3의 방법으로 비배당체 플라보노이드를 제조하였다.
비교예 14. 천혜양의 로하멘트 처리
비교예 14.1
한라봉 대신 천혜양을 사용하고, 펙티넥스 대신 로하멘트를 사용한 것을 제외하고는 실시예 1.1의 방법으로 효소처리하고 원심분리하여 상등액과 침전물을 얻었다.
비교예 14.2
실시예 1.1의 상등액 대신 비교예 14.1의 상등액을 사용한 것을 제외하고는 실시예 1.2의 방법으로 면역활성다당을 제조하였다.
비교예 14.3
실시예 1.1의 침전물 대신 비교예 14.1의 침전물을 사용한 것을 제외하고는 실시예 1.3의 방법으로 비배당체 플라보노이드를 제조하였다.
비교예 15. 천혜양의 울트라플로 처리
비교예 15.1
한라봉 대신 천혜양을 사용하고, 펙티넥스 대신 울트라플로를 사용한 것을 제외하고는 실시예 1.1의 방법으로 효소처리하고 원심분리하여 상등액과 침전물을 얻었다.
비교예 15.2
실시예 1.1의 상등액 대신 비교예 15.1의 상등액을 사용한 것을 제외하고는 실시예 1.2의 방법으로 면역활성다당을 제조하였다.
비교예 15.3
실시예 1.1의 침전물 대신 비교예 15.1의 침전물을 사용한 것을 제외하고는 실시예 1.3의 방법으로 비배당체 플라보노이드를 제조하였다.
비교예 16. 천혜양의 로하멘트 처리
비교예 16.1
한라봉 대신 천혜양을 사용하고, 펙티넥스 대신 펙티나제를 사용한 것을 제외하고는 실시예 1.1의 방법으로 효소처리하고 원심분리하여 상등액과 침전물을 얻었다.
비교예 16.2
실시예 1.1의 상등액 대신 비교예 16.1의 상등액을 사용한 것을 제외하고는 실시예 1.2의 방법으로 면역활성다당을 제조하였다.
비교예 16.3
실시예 1.1의 침전물 대신 비교예 16.1의 침전물을 사용한 것을 제외하고는 실시예 1.3의 방법으로 비배당체 플라보노이드를 제조하였다.
비교예 17. 밀감의 셀룰라아제 KN 처리
비교예 17.1
한라봉 대신 밀감을 사용하고, 펙티넥스 대신 셀룰라아제 KN을한 것을 제외하고는 실시예 1.1의 방법으로 효소처리하고 원심분리하여 상등액과 침전물을 얻었다.
비교예 17.2
실시예 1.1의 상등액 대신 비교예 17.1의 상등액을 사용한 것을 제외하고는 실시예 1.2의 방법으로 면역활성다당을 제조하였다.
비교예 17.3
실시예 1.1의 침전물 대신 비교예 17.1의 침전물을 사용한 것을 제외하고는 실시예 1.3의 방법으로 비배당체 플라보노이드를 제조하였다.
비교예 18. 밀감의 에코니타아제 처리
비교예 18.1
한라봉 대신 밀감을 사용하고, 펙티넥스 대신 에코니타아제를 사용한 것을 제외하고는 실시예 1.1의 방법으로 효소처리하고 원심분리하여 상등액과 침전물을 얻었다.
비교예 18.2
실시예 1.1의 상등액 대신 비교예 18.1의 상등액을 사용한 것을 제외하고는 실시예 1.2의 방법으로 면역활성다당을 제조하였다.
비교예 18.3
실시예 1.1의 침전물 대신 비교예 18.1의 침전물을 사용한 것을 제외하고는 실시예 1.3의 방법으로 비배당체 플라보노이드를 제조하였다.
비교예 19. 밀감의 라피다아제 처리
비교예 19.1
한라봉 대신 밀감을 사용하고, 펙티넥스 대신 라피다아제을 사용한 것을 제외하고는 실시예 1.1의 방법으로 효소처리하고 원심분리하여 상등액과 침전물을 얻었다.
비교예 19.2
실시예 1.1의 상등액 대신 비교예 19.1의 상등액을 사용한 것을 제외하고는 실시예 1.2의 방법으로 면역활성다당을 제조하였다.
비교예 19.3
실시예 1.1의 침전물 대신 비교예 18.1의 침전물을 사용한 것을 제외하고는 실시예 1.3의 방법으로 비배당체 플라보노이드를 제조하였다.
비교예 20. 밀감의 비스코엔자임 처리
비교예 20.1
한라봉 대신 밀감을 사용하고, 펙티넥스 대신 비스코엔자임를 사용한 것을 제외하고는 실시예 1.1의 방법으로 효소처리하고 원심분리하여 상등액과 침전물을 얻었다.
비교예 20.2
실시예 1.1의 상등액 대신 비교예 20.1의 상등액을 사용한 것을 제외하고는 실시예 1.2의 방법으로 면역활성다당을 제조하였다.
비교예 20.3
실시예 1.1의 침전물 대신 비교예 20.1의 침전물을 사용한 것을 제외하고는 실시예 1.3의 방법으로 비배당체 플라보노이드를 제조하였다.
비교예 21. 밀감의 셀루클라스트 처리
비교예 21.1
한라봉 대신 밀감을 사용하고, 펙티넥스 대신 셀루클라스트를 사용한 것을 제외하고는 실시예 1.1의 방법으로 효소처리하고 원심분리하여 상등액과 침전물을 얻었다.
비교예 21.2
실시예 1.1의 상등액 대신 비교예 21.1의 상등액을 사용한 것을 제외하고는 실시예 1.2의 방법으로 면역활성다당을 제조하였다.
비교예 21.3
실시예 1.1의 침전물 대신 비교예 21.1의 침전물을 사용한 것을 제외하고는 실시예 1.3의 방법으로 비배당체 플라보노이드를 제조하였다.
비교예 22. 밀감의 로하멘트 처리
비교예 22.1
한라봉 대신 밀감을 사용하고, 펙티넥스 대신 로하멘트를 사용한 것을 제외하고는 실시예 1.1의 방법으로 효소처리하고 원심분리하여 상등액과 침전물을 얻었다.
비교예 22.2
실시예 1.1의 상등액 대신 비교예 22.1의 상등액을 사용한 것을 제외하고는 실시예 1.2의 방법으로 면역활성다당을 제조하였다.
비교예 22.3
실시예 1.1의 침전물 대신 비교예 22.1의 침전물을 사용한 것을 제외하고는 실시예 1.3의 방법으로 비배당체 플라보노이드를 제조하였다.
비교예 23. 밀감의 울트라플로 처리
비교예 23.1
한라봉 대신 밀감을 사용하고, 펙티넥스 대신 울트라플로를 사용한 것을 제외하고는 실시예 1.1의 방법으로 효소처리하고 원심분리하여 상등액과 침전물을 얻었다.
비교예 23.2
실시예 1.1의 상등액 대신 비교예 23.1의 상등액을 사용한 것을 제외하고는 실시예 1.2의 방법으로 면역활성다당을 제조하였다.
비교예 23.3
실시예 1.1의 침전물 대신 비교예 23.1의 침전물을 사용한 것을 제외하고는 실시예 1.3의 방법으로 비배당체 플라보노이드를 제조하였다.
비교예 24. 밀감의 로하멘트 처리
비교예 24.1
한라봉 대신 밀감을 사용하고, 펙티넥스 대신 펙티나제를 사용한 것을 제외하고는 실시예 1.1의 방법으로 효소처리하고 원심분리하여 상등액과 침전물을 얻었다.
비교예 24.2
실시예 1.1의 상등액 대신 비교예 24.1의 상등액을 사용한 것을 제외하고는 실시예 1.2의 방법으로 면역활성다당을 제조하였다.
비교예 24.3
실시예 1.1의 침전물 대신 비교예 24.1의 침전물을 사용한 것을 제외하고는 실시예 1.3의 방법으로 비배당체 플라보노이드를 제조하였다.
일반 대조군 1
효소처리 대신에 건조된 한라봉 과피분말 100 g을 증류수 1000ml에 넣고 95 ℃에서 6 시간 동안 추출한 것을 제외하고는 실시예 1의 방법으로 비배당체 플라보노이드 및 면역활성다당을 제조하였다.
일반 대조군 2
효소처리 대신에 건조된 천혜양 과피분말 100 g을 증류수 1000ml에 넣고 95 ℃에서 6 시간 동안 추출한 것을 제외하고는 실시예 1의 방법으로 비배당체 플라보노이드 및 면역활성다당을 제조하였다.
일반 대조군 3
효소처리 대신에 건조된 밀감 과피분말 100 g을 증류수 1000ml에 넣고 95 ℃에서 6 시간 동안 추출한 것을 제외하고는 실시예 1의 방법으로 비배당체 플라보노이드 및 면역활성다당을 제조하였다.
시험예 1. 플라보노이드 성분의 분석 및 생물전환률
감귤유래 플라보노이드 함량은 DMSO를 용매로 하여 각 시료를 완전 용해한 후 HPLC장비를 이용하여 분석을 실시하였다. 지표성분은 narirutin, naringin, hesperidin, naringenin 및 hesperitin로 하여 각 표준품을 sigma사로부터 구입하여 사용하였다. 도 2(a)는 본 발명과 대조하기 위하여 단순 추출에 의해 수득된 플라보노이드를 분석한 그래프이며, 도 2(b)는 사이토라제 효소를 이용하여 수득된 플라보노이드의 그래프이다.
제조된 플라보노이드의 conversion rate는 narirutin을 포함한 지표성분 5종의 총 함량대비 비배당체 플라보노이드(naringenin, hesperitin) 성분의 함량을 비교하여 계산하였으며 하기 표 1에 나타내었다. 계산식은 아래와 같다.
[Conversion rate (%) = (hesperitin + naringenin) x 100 / (narirutin + hesperitin + naringenin + hesperidin + naringin)]
한라봉 플라보노이드 정제물 분석 (%)
시료명 효소 Narirutin Naringin Hesperidin Naringenin Hesperitin 총계 전환율
일반대조군1 - 3.38 0.01 19.97 0.02 0.05 23.43 0.3
실시예 1.2 Pectinex 0.92 0.00 14.87 5.57 5.84 27.20 41.9
실시예 2.2 Cytolase 1.59 0.00 15.12 6.14 6.49 29.34 43.0
비교예 1.2 CellulaseKN 1.67 0.00 14.74 5.22 5.25 26.88 39.0
비교예 2.2 Econitase 2.81 0.00 21.54 0.01 0.05 24.41 0.2
비교예 3.2 Rapidase 3.13 0.00 20.33 0.02 0.06 23.54 0.3
비교예 4.2 Viscozyme 2.98 0.00 19.84 0.02 0.06 22.90 0.3
비교예 5.2 Celluclast 3.05 0.01 20.38 0.02 0.05 23.51 0.3
비교예 6.2 Rohament 2.81 0.00 21.54 0.01 0.05 24.41 0.2
비교예 7.2 UltrafloL 2.81 0.00 21.54 0.01 0.05 24.41 0.2
비교예 8.2 Pectinase 2.99 0.00 18.21 0.01 0.04 21.25 0.2
천혜양 플라노이드 정제물 분석(%)
시료명 효소 Narirutin Naringin Hesperidin Naringenin Hesperitin 총계 전환율
일반대조군2 - 2.15 0.01 18.45 0.01 0.02 20.64 0.3
실시예 3.2 Pectinex 0.88 0.00 13.54 3.84 4.68 22.94 37.1
실시예 4.2 Cytolase 0.75 0.00 12.34 6.44 5.12 24.65 46.9
비교예 9.2 CellulaseKN 0.84 0.00 13.28 4.01 4.14 22.27 36.6
비교예 10.2 Econitase 2.21 0.00 19.15 0.01 0.03 21.40 0.2
비교예 11.2 Rapidase 2.36 0.00 19.66 0.02 0.04 22.08 0.3
비교예 12.2 Viscozyme 2.56 0.00 18.98 0.01 0.03 21.58 0.2
비교예 13.2 Celluclast 2.42 0.01 18.86 0.01 0.03 21.33 0.2
비교예 14.2 Rohament 2.28 0.01 18.92 0.00 0.06 21.27 0.3
비교예 15.2 UltrafloL 2.34 0.00 18.97 0.00 0.04 21.35 0.2
비교예 16.2 Pectinase 2.99 0.00 18.21 0.01 0.04 21.25 0.2
밀감 플라노이드 정제물 분석 (%)
시료명 효소 Narirutin Naringin Hesperidin Naringenin Hesperitin 총계 전환율
일반대조군3 - 3.13 0.00 15.84 0.01 0.03 19.01 0.21
실시예 5.2 Pectinex 1.03 0.00 14.63 5.22 5.24 26.12 40.05
실시예 6.2 Cytolase 1.27 0.00 14.08 5.85 5.78 26.98 43.11
비교예 17.2 CellulaseKN 1.55 0.00 14.27 5.06 5.18 26.06 39.29
비교예 18.2 Econitase 3.21 0.00 19.89 0.01 0.04 23.15 0.22
비교예 19.2 Rapidase 3.02 0.00 20.03 0.01 0.04 23.10 0.22
비교예 20.2 Viscozyme 2.88 0.00 19.94 0.01 0.04 22.7 0.22
비교예 21.2 Celluclast 2.81 0.00 19.49 0.01 0.04 22.35 0.22
비교예 22.2 Rohament 2.95 0.00 20.32 0.01 0.04 23.32 0.21
비교예 23.2 UltrafloL 2.86 0.00 21.28 0.01 0.04 24.20 0.25
비교예 24.2 Pectinase 3.08 0.00 17.68 0.01 0.04 20.81 0.24
각 효소 처리 별 획득한 플라보노이드 정제물 시료에 대한 HPLC분석 결과 한라봉, 천혜향 및 밀감 원물 모두 Pectinex 및 Cytolase 효소처리에 의해 배당체 형태의 플라보노이드(Naringin, Hesperidin)가 감소하고 비배당체 형태의 플라보노이드(Naringenin, Hesperitin)가 증가하는 것이 확인되었으며, 비교예의 경우 비배당체로의 전환능이 없는 것으로 판단되었다.
각 실험군 별 전환율은 한라봉(실시예 1, 2), 천혜향(실시예 3, 4) 및 밀감(실시예 5,6) 원물 모두 Pectinex 및 Cytolase 효소처리에 의해 최초 0.03% 수준에서 35 지 50% 수준까지 상승되는 것이 확인되었다.
시험예 2. 플라보노이드 수세횟수 및 순도
한라봉 원물에 Pectinex 처리를 행하여 획득한 플라보노이드 성분을 정제하기 위하여, 증류수로 1-3회 세척하였으며, 결과를 하기 표 3에 나타내었다.
%
시료명 수세 횟수 Narirutin Naringin Hesperidin Naringenin Hesperitin 총계 전환율
실시예 2.2 1 1.59 0.00 15.12 6.14 6.49 29.34 43.0
3 1.84 0.00 17.54 11.76 11.82 42.96 54.9
수세횟수가 1에서 3회로 증가함에 따라 정제물의 순도가 29.34%에서 42.96%로 증가함이 확인되었다.
시험예 3. 감귤류 유래 면역활성 다당체의 항보체활성 평가
인체의 초기 감염 방어에 있어서 중요한역활을 담당하고 있는 보체계에 대한 활성화 여부를 확인하기 위하여 마이어(Mayer)법을 이용하여 시료에 의한 보체소비(complement consumption)후 잔존하는 보체에 의한 적혈구 용혈 정도에 근거를 둔 complement fixation test 방법으로 항보체활성을 측정하였으며, 양성대조군으로 시판 면역활성 다당체인 PSK(polysaccharide-K)를 이용하였다.
양성대조군으로는 운지버섯(Coriolus versicolor) 유래 면역 활성 다당체인 PSK (polysaccharide K)를 사용하였으며 음성대조군으로써 시료를 첨가하지 않은 증류수를 이용하였으며 음성대조군에서의 활성화 정도를 ITCH50 0%로 하여 각 시료의 활성화능을 확인하였으며 하기 표 5 내지 표 7에 나타내었다.
한라봉 유래 면역활성다당의 황보체 활성
구분 효소 성분 항보체활성
양성대조군 PSK - 53.4±2.9
음성대조군 - - 22.4±1.3
실시예 1.3 Pectinex pectinase 47.9±2.9
실시예 2.3 Cytolase pectinase 50.1±1.8
비교예 1.3 Cellulase KN cellulase 18.6±1.8
비교예 2.3 Econase cellulase 23.1±4.2

비교예 3.3
Rapidase		 pectinase, hemicellulase, cellulase
48.2±2.9


비교예 4.3

Viscozyme		 arabinase, cellulase,
β-glucanase, hemicellulase, xylanase

32.4±1.9
비교예 5.3 Celluclast cellulase 28.3±1.8
비교예 6.3 Rohament cellulase 19.4±2.4
비교예 7.3 Ultraflo β-glucanase 21.6±1.1
비교예 8.3 Pectinase pectinase 55.3±2.5
천혜양 유래 면역활성다당의 항보체 활성
구분 효소 주성분 항보체활성
양성대조군 PSK - 54.3±3.8
음성대조군 - - 16.8±2.3
실시예 3.3 Pectinex pectinase 21.5±2,8
실시예 4.3 Cytolase pectinase 19.3±1.3
비교예 9.3 Cellulase KN cellulase 20.5±2.2
비교예 10.3 Econase cellulase 12.8±1.0

비교예 11.3
Rapidase		 pectinase, hemicellulase, cellulase
21.4±1.8


비교예 12.3
Viscozyme		 arabinase, cellulase,
β-glucanase, hemicellulase, xylanase

13.2±2.1
비교예 13.3 Celluclast cellulase 10.1±0.8
비교예 14.3 Rohament cellulase 11.3±2.3
비교예 15.3 Ultraflo β-glucanase 5.6±3.1
비교예 16.3 Pectinase pectinase 22.5±2.5
밀감 유래 면역활성다당의 항보체 활성
구분 효소 성분 항보체활성
양성대조군 PSK - 53.4±2.9
음성대조군 - - 22.4±1.3
실시예 5.3 Pectinex pectinase 44.3±1.5
실시예 6.3 Cytolase pectinase 48.2±1.3
비교예 17.3 Cellulase KN cellulase 26.7±3.4
비교예 18.3 Econase cellulase 24.2±2.6

비교예 19.3
Rapidase		 pectinase, hemicellulase, cellulase
47.5±2.2


비교예 20.3
Viscozyme		 arabinase, cellulase,
β-glucanase, hemicellulase, xylanase

20.2±1.6
비교예 21.3 Celluclast cellulase 23.6±1.4
비교예 22.3 Rohament cellulase 21.4±1.8
비교예 23.3 Ultraflo β-glucanase 25.3±1.4
비교예 24.3 Pectinase pectinase 52.0±2.8
본 발명의 실시예 및 비교예에서 획득한 면역활성다당을 이용하여 보체계 활성화 실험을 수행한 결과 한라봉 및 밀감을 원물로하여 획득한 실험군의 경우 상용효소인 라피다아제, 펙티넥스, 사이토라아제 및 펙티나아제를 통해 획득한 면역다당들이 양성대조군인 PSK와 유사한 수준의 항보체 활성을 나타냄이 확인되었으나, 천혜향 원물의 경우 보체계 활성화능이 높은 실험군은 없는 것으로 나타났다.
그러나, 라피다아제와 펙티나아제의 경우는 시험예 1-2에서 확인할 수 있듯이 비배당체 플라보노이드를 제조하지 못했으며, 셀룰라아제 KN은 항보체 활성이 떨어지는 것으로 나타났다. 상기 결과들을 토대로 비배당체 플라보노이드와 면역활성다당을 동시에 제조할 수 있는 상용효소는 주요성분으로 펙티나아제와 헤스페리디나제 또는 나린지나아제를 모두 포함하고 있는 사이토라제 또는 펙티넥스인 것으로 확인되었다.
시험예 4. 면역활성 다당의 사이토카인 생산능력 평가
BALB/c (♀, 6주령) 마우스의 복강에서 획득한 대식세포(macrophage)를 이용 샌드위치 ELISA 법을 사용하여 사이토카인(cytokine) 생산자극을 평가하였다. 대조군(Negative control)으로 아무것도 첨가하지 않고 측정하였으며, 비교군으로 리포폴리사카라이드(lipopolysaccharide, LPS)를 첨가하여 사이토카인 생산자극을 측정하였다. 셀룰라아제 KN으로 처리된 비교예 1.3의 면역활성 다당체의 경우, Interleukin-6(IL-6) 및 Interleukin-12(IL-12) 사이토카인 생산자극 능력이 현저히 낮은 것으로 확인된 반면, 펙티넥스 및 사이토라제 상용효소로 처리하여 제조된 면역활성 다당체의 경우 IL-6 및 IL-12의 생산자극능력이 우수한 것으로 평가되었으며, 생산자극 효과도 농도 의존적으로 나타남이 확인되었다.
IL-6 (pg/ml)
농도(㎍/ml) 실시예 1.3 실시예 2.3 비교예 1.3 음성대조군 양성대조군
1000 711.20±19.17 714.42±14.34 341.12±24.50 115.66±13.99 869.01±31.01
200 621.68±9.43 609.32±14.26 119.17±31.65 - -
40 546.11±13.31 544.25±5.91 58.39±19.46 - -
8 376.14±14.38 324.49±11.15 51.09±23.11 - -
1.6 277.61±24.37 291.17±21.37 39.24±22.03 - -
IL-12(pg/ml)
농도(㎍/ml) 실시예 1.3 실시예 2.3 비교예 1.3 음성대조군 양성대조군
1000 654.15±11.25 658.12±22.05 318.28±13.25 115.12±15.24 869.71±34.21
200 554.15±11.95 547.26±22.48 209.48±14.58 - -
40 431.21±5.48 425.15±13.22 129.44±3.84 - -
8 321.12±38.12 309.08±29.15 75.86±11.23 - -
1.6 221.53±2.58 219.15±3.48 5.99±1.02 - -
상기 결과에서 확인할 수 있듯이, 본 발명에 따른 면역활성 다당체는 염증성 면역작용 및 암세포와 같은 세포성 외래물질에 대하여 유효한 활성을 가지는 IL-6 사이토카인 및 NK 세포의 활성화 및 Th1 타입의 면역 반응 유도를 통한 cytotoxic T lymphocyte(CTL)의 활성화와 같은 세포매개성 면역에 있어 유효한 활성을 가지는 IL-12 사이토카인에 대한 생산자극 능력을 가진다.
하기에 본 발명의 추출물을 함유하는 조성물의 제제예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.
제제예 1. 산제의 제조
실시예 1.2의 면역활성다당 분말 20 mg
유당 100 mg
탈크 10 mg
상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조한다.
제제예 2. 정제의 제조
실시예 1.2의 면역활성다당 분말 10 mg
옥수수전분 100 mg
유당 100 mg
스테아린산 마그네슘 2 mg
상기의 성분들을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.
제제예 3. 캅셀제의 제조
실시예 1.2의 면역활성다당 분말 10 mg
결정성 셀룰로오스 3 mg
락토오스 14.8 mg
마그네슘 스테아레이트 0.2 mg
통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조한다.
제제예 4. 주사제의 제조
실시예 1.2의 면역활성다당 분말 10 mg
만니톨 180 mg
주사용 멸균 증류수 2974 mg
Na2HPO4,12H2O 26 mg
통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플 당 상기의 성분 함량으로 제조한다.
제제예 5. 액제의 제조
실시예 1.2의 면역활성다당 분말 20 mg
이성화당 10 g
만니톨 5 g
정제수 적량
통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬향을 적량 가한 다음 상기의 성분을 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체를 정제수를 가하여 전체 100로 조절한 후 갈색병에 충진하여 멸균시켜 액제를 제조한다.
제제예 6. 건강기능식품의 제조
실시예 1.2의 면역활성다당 분말 1,000 mg
비타민 혼합물 적량
비타민 A 아세테이트 70 ㎍
비타민 E 1.0 mg
비타민 B1 0.13 mg
비타민 B2 0.15 mg
비타민 B6 0.5 mg
비타민 B12 0.2 ㎍
비타민 C 10 mg
비오틴 10 ㎍
니코틴산아미드 1.7 mg
엽산 50 ㎍
판토텐산 칼슘 0.5 mg
무기질 혼합물 적량
황산제1철 1.75 mg
산화아연 0.82 mg
탄산마그네슘 25.3 mg
제1인산칼륨 15 mg
제2인산칼슘 55 mg
구연산칼륨 90 mg
탄산칼슘 100 mg
염화마그네슘 24.8 mg
상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 건강기능식품에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 건강기능식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 건강기능식품 조성물 제조에 사용할 수 있다.
제제예 7. 기능성 음료의 제조
실시예 1.2의 면역활성다당 분말 1,000 mg
구연산 1,000 mg
올리고당 100 g
매실농축액 2 g
타우린 1 g
정제수를 가하여 전체 900 mL
통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1 시간 동안 85 ℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2 L 용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 본 발명의 기능성 음료 조성물 제조에 사용한다.
상기 실시예 1.2의 면역활성다당 분말 대신에 실시예 2.2 내지 6.2의 면역활성다당 분말 또는 실시예 1.3 내지 6.3의 비배당채 플라보노이드가 첨가되어도 무방하다.
상기 조성비는 비교적 기호음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 수요계층, 수요국가, 사용용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.

Claims (13)

  1. (1) 감귤(citrus)속 감귤류 가공부산물을 펙티나아제(pectinase)를 첨가하여 효소처리하는 단계; 및
    (2) 상기 효소처리된 감귤류 가공부산물을 원심분리하는 단계;를 포함하고,
    상기 원심분리 상등액에서 면역활성다당을 제조하며, 상기 원심분리 침전물에서 비배당체 플라보노이드를 제조하는 것을 특징으로 하는 감귤류 유래 면역활성다당 및 비배당체 플라보노이드의 동시 제조방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 효소처리는 상기 펙티나아제(pectinase) 이외에 헤스페리디나아제(hesperidinase) 및 나린지나아제(naringinase) 중에서 선택되는 1종 이상을 더 포함하는 혼합효소로 처리되는 것을 특징으로 하는 감귤류 유래 면역활성다당 및 비배당체 플라보노이드의 동시 제조방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 혼합효소는 상용효소인 펙티넥스(Pectinex) 또는 사이토라제(Cytolase)인 것을 특징으로 하는 감귤류 유래 면역활성다당 및 비배당체 플라보노이드의 동시 제조방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 효소처리는 상기 감귤류 가공부산물 고형분 100 중량부에 대하여 효소 0.01-1 중량부를 첨가하여 6-96 시간 동안 처리하여 수행되는 것을 특징으로 하는 감귤류 유래 면역활성다당 및 비배당체 플라보노이드의 동시 제조방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 면역활성다당은 상기 원심분리 상등액을 농축한 뒤, 에탄올을 첨가하고 -10-20 ℃에서 3-24 시간 정치시켜 침전을 유도하는 단계; 상기 침전이 형성된 에탄올 혼합물을 액상층과 침전물로 분리하는 단계; 및 침전물을 동결건조시켜 면역활성다당을 제조하는 단계;를 포함하여 수행함으로써 제조되는 것을 특징으로 하는 감귤류 유래 면역활성다당 및 비배당체 플라보노이드의 동시 제조방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 비배당체 플라보노이드는 a) 상기 원심분리 침전물에 에탄올을 첨가하고, 45-80 ℃에서 6-48 시간 동안 환류시켜 플라보노이드 성분을 추출하는 단계; b) 상기 에탄올 추출액을 에탄올 가용물과 에탄올 불용물로 분리하는 단계; 및 c) 상기 에탄올 가용물을 농축하고 -10-20 ℃에서 결정화시켜 비배당체 플라보노이드를 제조하는 단계;를 포함하여 수행함으로써 제조되는 것을 특징으로 하는 감귤류 유래 면역활성 다당 및 비배당체 플라보노이드의 동시 제조방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 b) 단계의 에탄올 가용물에 상기 면역활성다당의 제조과정에서 발생된 액상층을 혼합하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 감귤류 유래 면역활성 다당 및 비배당체 플라보노이드의 동시 제조방법.
  8. 제6항에 있어서, 상기 c) 단계는 결정화시킨 비배당체 플라보노이드를 0-10 ℃ 증류수로 1-3회 수세하는 과정을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 감귤류 유래 면역활성다당 및 비배당체 플라보노이드의 동시 제조방법.
  9. 제1항에 있어서, 배당체 플라보노이드에서 비배당체 플라보노이드로 전환된 전환율이 40-70 중량%인 것을 특징으로 하는 감귤류 유래 면역활성다당 및 비배당체 플라보노이드의 동시 제조방법.
  10. 제1항에 있어서, 상기 감귤류는 한라봉, 천혜양 및 밀감 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 감귤류 유래 면역활성다당 및 비배당체 플라보노이드의 동시 제조방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 제조방법에 의해 제조되고, 1,000 ㎍/ml 농도에서 항보체활성이 45 % 이상, Interleukin-6(IL-6)의 생산자극능력이 600-800 pg/mL, Interleukin-12(IL-12)의 생산자극능력이 550-800 pg/mL인 것을 특징으로 하는 면역활성다당.
  12. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 제조방법에 의해 제조되는 것을 특징으로 하는 비배당체 플라보노이드.
  13. 제12항에 있어서, 상기 비배당체 플라보노이드는 나린제닌 및 헤스페리틴 중에서 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 비배당체 플라보노이드.
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