CN114796243B - 一种甘露糖醛酸和益母草碱的药物组合物及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种甘露糖醛酸和益母草碱的药物组合物及其应用。本发明将甘露糖醛酸和益母草碱进行科学比例的复配，进而获得了具有协同增效作用的药物组合物。所述的药物组合物经实验验证，能够改善老年痴呆小鼠的认知障碍和帕金森小鼠的学习记忆以及抑郁症和精神分裂症小鼠的行为能力，还能起到保护心肌细胞和血管内皮细胞的作用，进而达到预防和治疗神经性疾病和血管性疾病，包括老年痴呆和帕金森、抑郁症、精神分裂症、缺氧或/和炎症导致的心血管损伤、动脉粥样硬化等疾病的效果。

Description

一种甘露糖醛酸和益母草碱的药物组合物及其应用
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体涉及一种甘露糖醛酸和益母草碱的药物组合物及其应用。
背景技术
随着我国步入老龄化社会，神经退行性疾病的发病率逐年攀升，特别是老年痴呆和帕金 森。目前这两种疾病的治疗药物大都存在疗效反复，患者耐受性差以及副作用明显的问题， 很难满足日益增长的患者的需求；同时老年人心脏退化，很容易发生心肌缺血缺氧，由此造成死亡率上升；此外，慢性炎症导致心肌损伤和动脉硬化的发生率也在急剧增加。因此，急 需研发抗神经退行性疾病以及心血管系统疾病的药物。
中草药益母草唇形科植物，最早收载于《神农本草经》、《本草纲目》等古籍中，有活血 调经、利尿消肿的功效。益母草常用于月经不调、痛经、经闭、恶露不尽、水肿尿少、急性肾炎水肿等治疗。益母草碱是传统中药益母草的特异成分，大量文献及专利已报道了益母草碱能够抑制血管平滑肌收缩，对心肌和脑缺血的有效保护作用；还被发现益母草碱可降低血 脂，并有效改善血管性痴呆小鼠的认知障碍。但众所周知，血管性痴呆的发病机制和病理过 程与阿尔茨海默症(是一种长期的神经元退行衰老性疾病)具有本质性差异。但迄今，尚未见有关所述益母草碱对阿尔茨海默综合症的影响的报道；更未见益母与甘露糖醛酸结合用于 改善神经退行性疾病的报道，也未将两者复合用于心血管系统疾病的公开报道。
海藻昆布中来源的糖醛酸也被报道了具有广泛的药理活性，已被发现具有抵抗老年痴呆 的作用，但近年来未见其他疾病的新靶点新机制的研究，因此探索通过药物复配，从多环节 多靶点来联合防治神经性疾病和血管性疾病的研究方法，以达到协同治疗的目的，具有极大的可行性。
发明内容
本发明的目的在于提供了一种甘露糖醛酸和益母草碱的药物组合物及其应用，该药物组 合物中将甘露糖醛酸和益母草碱进行复配后，两者具有显著的协同增效作用，进而达到提高 老年痴呆、帕金森和抑郁症动物的行为能力，以及保护心肌细胞和血管内皮细胞的作用。
为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案予以实现：
本发明提供了一种甘露糖醛酸和益母草碱的药物组合物，所述药物组合物中益母草碱与 甘露糖醛酸的重量比为1∶15-2∶1。
进一步的，所述药物组合物中益母草碱与甘露糖醛酸的重量比为1∶10-2∶1.
进一步的，所述药物组合物中益母草碱与甘露糖醛酸的重量比为1∶10-1∶1。
进一步的，所述药物组合物中益母草碱与甘露糖醛酸的重量比为1∶10-3∶5。
进一步的，所述药物组合物中益母草碱与甘露糖醛酸的重量比为1∶3-3∶5。
进一步的，单位剂量的药物组合物中，所述益母草碱的含量为6mg-225mg。
进一步的，单位剂量的药物组合物中，所述益母草碱的含量为60mg-225mg。
进一步的，单位剂量的药物组合物中，所述益母草碱的含量为10mg-200mg。
进一步的，单位剂量的药物组合物中，所述益母草碱的含量为20mg-100mg。
进一步的，所述药物组合物为片剂、分散片、含片、口崩片、缓释片、胶囊剂、软胶囊剂、滴丸、颗粒剂、注射剂、粉针剂或气雾剂。
本发明还提供了所述的甘露糖醛酸和益母草碱的药物组合物在用于制备神经性疾病的 药物中的应用。
进一步的，神经性疾病包括老年痴呆、帕金森、脑中风、抑郁症、精神分裂症。
进一步的，所述药物组合物能够改善老年痴呆小鼠的学习记忆能力和空间探索能力。
进一步的，所述药物组合物能够降低老年痴呆小鼠脑内的Aβ蛋白的沉积，抑制Tau蛋 白的磷酸化。
进一步的，所述药物组合物能够降低老年痴呆小鼠脑内的PDE2、PDE4、PDE10A和EHMT1酶的活性。
进一步的，所述药物组合物中的益母草碱与PDE4蛋白之间具有相互结合作用。
进一步的，所述PDE4蛋白的活性口袋部位是益母草碱的作用靶点。
进一步的，所述药物组合物中的益母草碱与PDE2蛋白之间具有相互结合作用。
进一步的，所述PDE2蛋白的活性口袋部位是益母草碱的作用靶点。
进一步的，所述药物组合物中的甘露糖醛酸与EHMT1蛋白之间具有相互结合作用。
进一步的，所述EHMT1蛋白的活性口袋部位是甘露糖醛酸的作用靶点。
进一步的，所述药物组合物能够增加老年痴呆小鼠和帕金森小鼠脑内的cAMP、dopamine和BDNF的含量。
进一步的，所述药物组合物能够提高抑郁症小鼠的行为能力和脑内的多巴胺含量。
进一步的，所述药物组合物能够减少抑郁症小鼠脑内的5-HT的含量。
进一步的，所述药物组合物能够提高精神分裂症大鼠的社交互动总时间。
进一步的，所述药物组合物能够抑制精神分裂症大鼠脑内的PDE活性。
进一步的，所述药物组合物中的益母草碱与PDE10A蛋白之间具有较强的结合。
本发明还提供了所述的甘露糖醛酸和益母草碱的药物组合物在用于制备防治血管性疾 病的药物中的应用。
进一步的，所述血管性疾病包括缺氧或/和炎症导致的心血管损伤、动脉粥样硬化。
进一步的，所述药物组合物能够增加心肌细胞活力并协同上调NQQ1的活性。
进一步的，所述药物组合物能够降低心肌细胞中LDH酶活以及炎症因子TNF-α、IL-6 的含量。
进一步的，所述药物组合物能够降低血管内皮细胞中脂氧合酶LOX5和炎症因子TNF-α、IL-6的含量。
进一步的，所述药物组合物包括其可药用的盐、选择性硫酸化、磷酸化、硝酸化、丙酯 化取代类似物或者一种或者多种前述化合物的组合，还包括二者的衍生物及其衍生物在药物 上可接受的盐或者盐的溶剂化物。
本发明与现有技术相比，具有以下优点和有益效果：
本发明是首次将甘露糖醛酸和益母草碱混合制备新的药物组合物，并通过实验验证了 益母草碱可靶向抑制PDE2、PDE4、PDE10A蛋白酶的活性，增加脑内和血管内cAMP的含量，进而激活下游的PKA信号通路；同时也验证了甘露糖醛酸靶向激活EHMT转移酶的活 性，进一步促进神经元细胞修复的效用；将甘露糖醛酸和益母草碱复配后，两者可实现机制 互补，协同增效的功能，并由此产生了显著优于单独给药的协同增效的保护心肌细胞和血管内皮细胞，以及恢复老年痴呆、帕金森、抑郁症、精神分裂症小鼠行为的效果，进而能够有效的预防和治疗老年痴呆、帕金森、缺氧和炎症导致的心血管损伤和动脉硬化等疾病。
附图说明
图1：药物组合物对各组小鼠上平台的潜伏期(S)的影响。
图2：药物组合物对各组小鼠上平台的总路程的影响。
图3：药物组合物对各组动物进入C区和原平台区的次数的影响。
在图1-3中，与模型组相比较：*P＜0.05，**p＜001；与假手术组相比较：#P＜0.05；与 单独药物组相比：Δp＜0.05。
图4和图5：益母草碱与PDE4酶的分子相互作用的结果图。
图6和图7：益母草碱与PDE2酶分子结合的结果图。
图8和图9：甘露糖醛酸与EHMT1酶的分子对接的结果图。
图10：益母草碱与PDE10A的生物大分子SPR结合活性图。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明的技术方案做进一步详细的说明。
实施例1甘露糖醛酸与益母草碱的药物组合物协同改善老年痴呆小鼠学习记忆能力和空间 探索能力
将小鼠随机分为10组，每组6只，分别为(1)假手术组；(2)模型组；(3)甘露糖醛酸组 (甘露糖醛酸300mg/kg)；(4)益母草碱组(益母草碱100mg/kg)；(5)阳性药物组(多奈哌齐2 mg/kg)，(6)药物组合1组(益母草碱10mg/kg和甘露糖醛酸100mg/kg)、(7)药物组合2组(益母草碱50mg/kg和甘露糖醛酸200mg/kg)、(8)药物组合3组(益母草碱50mg/kg和甘 露糖醛酸300mg/kg)、(9)药物组合4组(益母草碱100mg/kg和甘露糖醛酸100mg/kg)、(10) 药物组合5组(益母草碱100mg/kg和甘露糖醛酸300mg/kg)。
用无菌生理盐水溶解淀粉样蛋白Aβ1-42，浓度为500μmol/L，在37℃保温箱中孵育5 天后备用。小鼠用10％水合氯醛腹腔注射麻醉，并固定在脑立体定向仪上，常规消毒后切开小鼠头顶正中间皮肤，擦净并充分暴露颅骨中线和前囟，设置颅骨表面标志点(以前囟为零点，前囟后3.5mm、中线旁2.5mm)，用牙科钻在左右标志点各钻一孔，注射针进入颅骨 表面下3.0mm，即为海马背侧部的注射点，在注射时左右两侧的海马均注射。除假手术组 外的其他组小鼠均注射2.5μL的Aβ1-42，注射后留针2min；假手术组注射等剂量的生理压 水，注射后留针2min。注射后，取出微量注射器，用牙科水泥封闭钻孔，缝合伤口、碘伏 消毒。术后给所有的小鼠均肌肉注射青霉素钠盐连续注射5天。5天后，甘露糖醛酸组小鼠 口服甘露糖醛酸300mg/kg；益母草碱组小鼠口服益母草碱100mg/kg；阳性药物组小鼠口服多奈哌齐2mg/kg；药物组合组小鼠分别口服按照上述比例混合的益母草碱和甘露糖醛酸； 模型组和假手术组等量口服生理盐水，均每日1次，连续口服3周。
给药结束后，进行Morris水迷宫实验测试小鼠空间学习记忆能力、自主与探索行为。 Morris水迷宫分为定位航行实验和空间探索实验两部分，第1-4天进行定位航行实验，第5 天进行空间探索实验。
定位航行实验主要反映动物空间记忆的能力。第二、三、四天各组小鼠上平台所经过 的潜伏期统计如表1和图1所示，各组小鼠上平台所经过的总路程统计如表2和图2所示。各组小鼠上平台的潜伏期结果显示，训练四天后，模型组与假手术组有统计学差异；同时假手术组和各给药组的潜伏期都比模型组显著缩短。训练第四天，各给药组小鼠上平台的时间 与模型组对比具有显著差异，表明其学习能力明显增强。各组小鼠上平台所经过的总路程数 据显示，训练4天后，假手术组和各给药物组动物上台前游泳的路程都缩短。训练第四天， 模型组与假手术组上平台前游泳的总路程对比具有统计学差异，各给药组显著短于模型组，阳性药物也具有统计学差异。综上所述，AD动物模型造模成功且给药物动物学习能力明显 比模型组增强。而且，5种药物组合均显示出较为明显的协同治疗效果；特别是药物组合3 和药物组合5与单独给药组都具有显著差异，以药物组合5的治疗效果最好；但是鉴于药物 组合3的剂量较小，其治疗效果也明显高于单独给药组，这表明益母草碱与甘露糖醛酸可协 同增效，显著提高AD的治疗效果。
表1药物混合物对各组小鼠上平台的潜伏期(S)的影响
注：与模型组相比较：*P＜0.05，**p＜001；与假手术组相比较：#P＜0.05；与单独药物组相 比：Δp＜0.05。
表2药物组合物对各组小鼠上平台的总路程(米)的影响
注：与模型组相比较：*P＜0.05，**p＜001；与假手术组相比较：#P＜0.05；与单独药物组相 比：Δp＜0.05。
空间探索实验作为水迷宫实验中较为敏感而精确的评价指标，显示的是动物的记忆保持 能力，进入目标象限和原平台区域的次数越多越好。C区为实验设定的目标象限。结果如表 3和图3所示，模型组进入C区和原平台的次数与对照组相比有显著性差异；给药组相比模型组进入目标象限和原平台的次数显著增加，这表明给药物组动物的记忆保持能力比模型组 要显著增强。而且，5种药物组合显示出较为明显的协同治疗效果；特别是药物组合3和药 物组合5与单独给药组具有显著差异，且药物组合5的治疗效果最好；但是鉴于药物组合3 的剂量较小，其治疗效果也明显高于单独药物组，这进一步表明益母草碱与甘露糖醛酸可协 同增效，可显著提高AD的治疗效果。
表3药物组合物对小鼠空间探索的影响
注：与模型组相比较：*P＜0.05，**p＜001；与假手术组相比较：#P＜0.05；与单独药物组相 比：Δp＜0.05。
实施例2甘露糖醛酸与益母草碱的药物组合物对老年痴呆小鼠皮层和海马区沉积的老年斑 沉积的影响
鉴于前期的行为学实验，我们选择了各单独给药组和药物组合3组，因为药物组合3 在行为学实验评价中能够实现剂量减低的同时保持协同增效的作用。
采用实施例1中所述的老年痴呆小鼠模型，小鼠给药结束后断头处死，快速取出脑组 织，将脑组织在冰冷的生理盐水中漂洗，滤纸拭干后称重，加入10倍组织重量的蛋白裂解 液(含PMSF)，在冰上用匀浆机充分裂解。裂解30min后移至离心管中，在4℃、12000rpm离心5min，取上清液分于1.5ml离心管中。用蛋白质定量仪测定蛋白浓度，将其浓度用RIPA 裂解液全部调平至20μg/μL。按照每4μL蛋白样品加入1μL蛋白上样缓冲液(5X)的比例将 两者混合，100℃或沸水浴加热3-5分钟，-20℃冰箱保存。蛋白变性后于仪器上进行蛋白 Aβ表达含量和Tau蛋白磷酸化的检测。
实验结果如表4和表5所示，模型动物的脑组织内Aβ的沉积和Tau蛋白231位磷酸化水平显著增加，与实际相符。单独给药组和药物组合3组都可有效抑制Aβ蛋白的表达量， 同时减少Tau蛋白231位磷酸化水平，这表明各组药物均具有较好的治疗效果，其中以药物 组合3组的效果最好，能够实现剂量减低但疗效明显增强的协同治疗效果。
表4药物组合物对动物脑组织内Aβ表达水平的影响
注：与模型组相比较：*P＜0.05，**p＜001；与假手术组相比较：#P＜0.05；与单独药物组相 比：Δp＜0.05。
表5药物组合物对动物脑组织内Tau蛋白磷酸化水平的影响
注：与模型组相比较：*P＜0.05，**p＜001；与假手术组相比较：#P＜0.05；与单独药物组相 比：Δp＜0.05。
实施例3甘露糖醛酸与益母草碱的药物组合物协同增加小鼠脑源性神经生长因子(BDNF)
鉴于前期的行为学实验，我们选择了各单独给药物和药物组合3组，因为药物组合3 在行为学实验中能够实现在剂量减低的同时保持协同增效的作用。
采用实施例1中所述的老年痴呆小鼠模型，小鼠给药结束后断头处死，快速取出脑组 织，将脑组织在冰冷的生理盐水中漂洗，滤纸拭干后称重，加入10倍组织重量的蛋白裂解 液(含PMSF)，在冰上用匀浆机充分裂解；裂解30min后移至离心管中，在4℃、12000rpm离心5min，取上清液分于1.5ml离心管中。采用ELISA试剂盒检测BDNF的含量。
结果如表6所示，与假手术组相比，模型组小鼠脑内的BDNF的含量显著减少，而给药组均可有效增加BDNF的含量，表明各给药物可以改善老年痴呆动物模型的胆碱能神经的功能，显著增加脑源神经营养因子的水平，进而有效改善小鼠的学习记忆功能障碍和神经 元缺失，并可能修复已损伤的神经元，增加突触的可塑性，并增强神经内在生长能力。其中以药物组合3组的效果最好，能够实现剂量减低但疗效明显增强的协同治疗效果。
表6药物组合物对小鼠脑内脑源性神经生长因子(BDNF)的影响
注：与模型组相比较：*P＜0.05，**p＜001；与假手术组相比较：#P＜0.05；与单独药物组相 比：Δp＜0.05。
实施例4甘露糖醛酸与益母草碱的药物组合物对小鼠脑内的磷酸二酯酶PDE2和PDE4的影 响。
鉴于前期的行为学实验，我们选择了各单独给药物和药物组合3组，因为药物组合3 在行为学实验中能够实现在剂量减低的同时保持协同增效的作用。
采用实施例1中所述的老年痴呆小鼠模型，小鼠给药结束后断头处死，快速取出脑组 织，将脑组织在冰冷的生理盐水中漂洗，滤纸拭干后称重，加入10倍组织重量的蛋白裂解 液(含PMSF)，在冰上用匀浆机充分裂解；裂解30min后移至离心管中，在4℃下12000rpm离心5min，取上清液分于1.5ml离心管中。采用PDE4和PDE2酶活检测试剂评价各给药 物对小鼠脑内的磷酸二酯酶的影响。
磷酸二酯酶(PDE)是第二信使环磷酸腺苷(cAMP)和环磷酸鸟苷(cGMP)的特异 性水解酶，对细胞内环核苷酸信号具有重要的调控作用。由于cAMP和cGMP信号与神经 元的发生、存活、信息传递及突触可塑性等密切相关，PDE现已成为包括神经退行性疾病 在内的多个疾病的重要靶点。在阿尔茨海默病、亨廷顿病和帕金森病等常见神经退行性疾病 的临床前研究中，已有多个PDE选择性抑制剂被证实具有神经元保护作用，有的甚至已进 入了临床研究阶段；同时PDE选择性抑制剂还与心脏功能损伤密切相关。
结果如表7所示，与假手术组相比，模型组小鼠脑组织内的PDE4和PDE2的活性均明显增强，而给药组均能有效抑制PDE4和PDE2的活性，其中以药物组合3组的效果最好， 表明药物组合和单独给药能够起到PDF抑制剂的作用，可通过PDE/cAMP途径强化长时程 突触易化及长时程增强(longtermpotentiation，LTP)影响小鼠模型的学习记忆过程，即通过 升高cAMP水平和增强PKA活性来诱导晚期LTP，从而有效改善老年痴呆的认知功能和 学习记忆缺陷，因此本发明发现了益母草碱能够作为PDE抑制剂的潜在功能；同时药物组 合组能够协同抑制PDE的酶活性，从而实现剂量减低但疗效明显增强的协同治疗效果。
表7药物组合物对小鼠脑内PDE4和PDE2酶活性的影响
注：与模型组相比较：*P＜0.05，**p＜001；与假手术组相比较：#P＜0.05；与单独药物组相 比：Δp＜0.05。
本发明还分别利用生物大分子相互作用仪和分子对接软件来验证益母草碱与PDE4、 PDE2蛋白的作用靶点。益母草碱与PDE4的结果如图4和5所示，益母草碱与PDE4的相互作用为-8.90kcal/mol，且PDE4蛋白的活性口袋部位是益母草碱的作用靶点；益母草碱与PDE2的结果如图6和7所示，益母草碱与PDE2的相互作用为-8.96kcal/mol，且PDE2蛋白 的活性口袋部位是益母草碱的作用靶点。
实施例5甘露糖醛酸与益母草碱的药物组合物对小鼠脑内cAMP和dopamine含量以及 PKA激酶的影响。
鉴于前期的行为学实验，我们选择了各单独给药物和药物组合3组，因为药物组合3 在行为学实验中能够实现在剂量减低的同时保持协同增效的作用。
采用实施例1中所述的老年痴呆小鼠模型，小鼠给药结束后断头处死，快速取出脑组 织，将脑组织在冰冷的生理盐水中漂洗，滤纸拭干后称重，加入10倍组织重量的蛋白裂解 液(含PMSF)，在冰上用匀浆机充分裂解；裂解30min后移至离心管中，在4℃下12000rpm离心5min，取上清液分于1.5ml离心管中。采用ELISA试剂盒检测cAMP和dopamine的 含量，并采用生化方法检测PKA激酶的活性。
结果如表8所示，与假手术组相比，模型组小鼠脑内的cAMP和dopamine含量、PKA激酶活性显著减少，各给药组能够增加cAMP和dopamine含量、PKA激酶活性，说明药物 组合组可以协同增加小鼠脑内的cAMP和dopamine的水平，cAMP的增加可增强神经内在 生长能力和加强营养因子的作用的关键因素；同时dopamine水平的提高可以显著改善动物的学习记忆功能障碍。此外，药物组合组还可有效增加cAMP下游PKA激酶的活性，表明 益母草碱和甘露糖醛酸的协同组合可通过PDE-cAMP-PKA信号通路来发挥抗神经退行性疾 病的疗效；而且，药物组合组可实现在剂量减低的前提下疗效明显增强的协同治疗效果。
表8药物组合物对小鼠脑内cAMP、dopamine和PKA激酶的影响
注：与模型组相比较：*P＜0.05，**p＜0.01；与假手术组相比较：#P＜0.05；与单独药物组相 比：Δp＜0.05。
实施例6甘露糖醛酸与益母草碱的药物组合物对小鼠脑内EHMTI转移酶的影响
鉴于前期的行为学实验，我们选择了各单独给药物和药物组合3组，因为药物组合3 在行为学实验中能够实现在剂量减低的同时保持协同增效的作用。
采用实施例1中所述的老年痴呆小鼠模型，小鼠给药结束后断头处死，快速取出脑组 织，将脑组织在冰冷的生理盐水中漂洗，滤纸拭干后称重，加入10倍组织重量的蛋白裂解 液(含PMSF)，在冰上用匀浆机充分裂解；裂解30min后移至离心管中，在4℃下12000rpm离心5min，取上清液分于1.5ml离心管中。采用生化方法检测EHMT1甲基转移酶的活性。
EHMT1，即蛋白赖氨酸N甲基转移酶，是近年来新发现的抗神经衰老的关键蛋白，与神经退行性疾病密切相关。研究已表明其抑制剂可有效改善AD和PD的症状。
实验结果如表9所示，与假手术相比，模型组小鼠脑内EHMT1转移酶的活性显著增高， 而给药组小鼠脑内EHMT1转移酶的活性被药物抑制，且药物组合3组的效果最好。本发明 首次披露了甘露糖醛酸可明显抑制EHMT1的转移酶活性这一性质，表明甘露糖醛酸能够成 为EHMT1抑制剂。同时药物组合3组显示出明显的协同增效的治疗效果，能够实现剂量降低、疗效增强的作用.
表9药物组合物对小鼠脑内EHMT1转移酶的影响
注：与模型组相比较：*P＜0.05，**p＜0.01；与假手术组相比较：#P＜0.05；与单独药物组相 比：Δp＜0.05。
本发明还分别利用生物大分子相互作用仪和分子对接软件来验证甘露糖醛酸与EHMT1 组蛋白甲基转移酶的作用靶点，结果如图8和9所示，甘露糖醛酸与EHMT1的相互作用为 -8.21kcal/mol，且EHMT1甲基转移酶的活性口袋部位是甘露糖醛酸的作用靶点。
实施例7甘露糖醛酸与益母草碱的药物组合物对帕金森小鼠行为学的影响
选取健康雄性小鼠54只(体重21±5g)，随机分成9组，每组6只，分别为(1)对照组；(2)模型组；(3)甘露糖醛酸组(甘露糖醛酸300mg/kg)；(4)益母草碱组(益母草碱60mg/kg)；(5) 阳性药物组(美多巴100mg/kg)，(6)药物组合1组(益母草碱6mg/kg和甘露糖醛酸100mg/kg)、(7)药物组合2组(益母草碱60mg/kg和甘露糖醛酸300mg/kg)、(8)药物组合 3组(益母草碱200mg/kg和甘露糖醛酸100mg/kg)、(9)药物组合4组(益母草碱225mg/kg 和甘露糖醛酸225mg/kg)。
MPTP使用前用生理盐水稀释至0.3％浓度，模型组和给药组小鼠以30mg/kg/d腹腔注 射0.3％MPTP，对照组腹腔注射等量的生理盐水，均每日1次，连续3周。在腹腔注射MPTP的同时，甘露糖醛酸组小鼠给予甘露糖醛酸300mg/kg的灌胃处理；益母草碱组小鼠给予益母草碱60mg/kg的灌胃处理；阳性药物组小鼠给予美多巴100mg/kg的灌胃处理；药物组合组分别按照上述比例混合的益母草碱和甘露糖醛酸后给予小鼠灌胃处理；模型组和对照组给 予同等体积的生理盐水的灌胃处理，每日1次，连续给药4周。所有小鼠均以相同条件进行 常规饲养。
于注射后第14天观察动物的震颤、活动迟缓、抓握、嗅探等异常行为，观察帕金森动 物模型的建立情况。
于注射的第21天进行模型组小鼠爬杆行为实验。具体操作如下：将一直径为2.5cm的 塑料小球固定于一根长60cm、直径为1cm的木杆顶端，木杆上缠绕3层纱布。将小鼠放到球顶，记录以下三个时间：(1)小鼠爬完杆长的上半部分所需时间；(2)小鼠爬完杆长的下半部分所需的时间；(3)小鼠爬完杆长的全长所需时间。按以下标准打分：3秒内完成上述某一动作记3分，6秒内完成记2分，超过6秒记1分。三个时间分数总和为被测小鼠爬杆 实验分数，最后统计各组小鼠得分情况。
然后在第28天进行模型组小鼠的悬挂实验。具体操作如下：将小鼠双前肢放悬挂于一 根水平电线上，如小鼠用双后肢抓住电线记3分，仅用一只后肢抓住电线记2分；两只后肢均抓不住记1分；小鼠跌落记为0分。最后统计各组小鼠得分情况。
结果发现，MPTP注射14天后，模型组小鼠出现步态蹒跚、活动减少、动作变慢等症状，对照组未出现上述行为学变化，且各给药组与模型组相比较，上述的行为学症状明显减轻。爬杆实验和悬挂实验结果如表10所示，模型组小鼠的爬杆行为和悬挂行为，与对照组相比具有显著性差异，表明采用MPTP注射法造模成功；各组药物处理可提高肢体运动协 调能力，对诱导所致的模型小鼠运动体征具有明显的改善作用。而且4种药物组合物均显示出较为明显的协同治疗效果；特别是药物组合2、药物组合3和药物组合4与单独给药组都具有显著差异，表明益母草碱与甘露糖醛酸可联合用药，增加治疗的效果；其中药物组合4的治疗效果最好，其次是药物组合3组，但是这两组的组合剂量较大；鉴于药物组合2的剂量较小，其治疗效果也明显高于单独药物组，这进一步表明益母草碱与甘露糖醛酸具有协同 增效，可显著提高帕金森的治疗效果。
表10药物组合物对帕金森小鼠行为学的影响
注：与模型组相比较：*P＜0.05，**p＜0.01；与对照组相比较：#P＜0.05；与单独药物组相比： Δp＜0.05。
实施例8甘露糖醛酸与益母草碱的药物组合物对帕金森小鼠脑内BDNF以及PDE的影响
由于药物组合2更符合剂量减低，疗效增加的原则。下述的的实验选择了对照组、模型 组、甘露糖醛酸组(300mg)、益母草碱组(60mg)、药物组合2组(益母草60mg/kg和甘露糖醛酸寡糖300mg/kg)检测进一步的指标。
采用实施例7中所述的帕金森小鼠模型，动物死亡后，快速取出脑组织，将脑组织在冰 冷的生理盐水中漂洗，滤纸拭干后称重，加入10倍组织重量的蛋白裂解液(含PMSF)，在冰上用匀浆机充分裂解；裂解30min后移至离心管中，在4℃下、12000rpm离心5min，取上清液分于1.5ml离心管中。采用ELISA试剂盒检测BDNF的含量，采用生化试剂盒检 测PDE4和PDE2的酶活性。
结果如表11所示，与对照组相比，模型组小鼠脑内的BDNF水平显著下降，PDE4和PDE2活性明显增加，而各给药组均能提高BDNF水平并降低PDE4、PDE2活性，表明各 给药物可以显著增加脑源神经营养因子的水平，修复已损伤的神经元，增加突触的可塑性。 其中以药物组合2组的效果最好，能够实现剂量减低但疗效明显增强的协同治疗效果。目前 PDE现已成为包括神经退行性疾病在内的多个疾病的重要靶点。本发明中，益母草碱单独给药和组合2组药物均可显著抑制PDE的活性；同时药物组合能够发挥协同抑制PDE的作 用，从而实现剂量减低但疗效明显增强的协同治疗效果。
表11药物组合物对小鼠脑内BDNF水平和PDE4、PDE2酶活性的影响
注：与模型组相比较：*P＜0.05，**p＜0.01；与对照组相比较：#P＜0.05；与单独药物组相比： Δp＜0.05。
实施例9甘露糖醛酸与益母草碱的药物组合物对帕金森小鼠脑内cAMP和dopamine释放的 影响
由于药物组合2更符合剂量减低，疗效增加的原则。下述的的实验选择了对照组、模型 组、甘露糖醛酸组(300mg)、益母草碱组(60mg)、药物组合2组(益母草60mg/kg和甘露糖醛酸寡糖300mg/kg)检测进一步的指标。
采用实施例7中所述的帕金森小鼠模型，动物死亡后，快速取出脑组织，将脑组织在冰 冷的生理盐水中漂洗，滤纸拭干后称重，加入10倍组织重量的蛋白裂解液(含PMSF)，在冰上用匀浆机充分裂解；裂解30min后移至离心管中，在4℃下、12000rpm离心5min，取上清液分于1.5ml离心管中。采用ELISA试剂盒检测cAMP和dopamine的含量。
结果如表12所示，与对照组相比，模型组小鼠脑内的cAMP和dopamine含量显著减少，而各给药组能够明显增加cAMP和dopamine含量，说明各药物都可以显著增加脑内的cAMP和dopamine的水平，cAMP的增加可增强神经内在生长能力和加强营养因子的作用 的关键因素；同时dopamine水平的提高可以显著改善PD动物的行为功能障碍。此外，药物组合组有效增加cAMP的水平，表明其可通过PDE-cAMP-PKA信号通路来发挥抗帕金森 疾病的疗效；而且，药物组合组可实现在剂量减低的前提下疗效明显增强的协同治疗效果。
表12药物组合物对小鼠脑内cAMP和dopamine含量的影响
注：与模型组相比较：*P＜0.05，**p＜0.01；与对照组相比较：#P＜0.05；与单独药物组相比： Δp＜0.05。
实施例10甘露糖醛酸与益母草碱的药物组合物对缺氧诱导心肌细胞活力和LDH释放的影 响
以未加CoCl2诱导损伤的细胞作为空白组，以添加CoCl2诱导损伤的心肌细胞作为模型组， 观察益母草碱与甘露糖醛酸联合应用对CoCl2诱导产生缺氧损伤的保护作用。具体如下：将 心肌细胞H9C2接种于MEM完全培养液中(含有100U/mL青霉素、100U/mL链霉素和10％ FBS)，置于37℃、5％CO2培养箱中恒温培养24h，以每孔5000个细胞种植于96孔板中，然 后加入提前溶解好的含CoCl2的损伤液，2h后，益母草碱组每孔细胞中加入10μM的益母草碱， 甘露糖醛酸组每孔加入100μM的甘露糖醛酸，药物组合组每孔加入5μM益母草碱和50μM甘 露糖醛酸，模型组和空白组加入等量的生理盐水处理细胞。细胞处理结束后，采用MTT法 测定细胞存活率，以乳酸脱氢酶试剂盒检测培养基中LDH的酶活力。每次三个平行，实验重复三次。
结果如表13，与空白组相比，模型组细胞的细胞活力明显降低而LDH酶活明显增加， 各药物组显著抑制了CoCl2诱导导致的细胞活力的减少和LDH酶活的增加，其中以药物组合 组效果最佳，表明各药物组均对CoCl2诱导的心肌细胞损伤具有保护作用，药物组合物的细 胞活力组显著高于单独的益母草碱或者甘露糖醛酸组，同时，联合药物组具有协同增效的显 著效果，相较于模型组以及单独给药组的49％、67％、73％的存活率，联合组在益母草碱： 甘露糖醛酸(5：50μM)时细胞存活率高达91％。同时，各个药物处理组也可显著抑制乳酸脱氢酶LDH的释放，且联合药物组具有协同增效的显著效果，相较于模型组以及单独给药组 的157％、131％、139％的LDH含量，联合药物组在益母草碱：甘露糖醛酸(5∶50μM)时细 胞LDH下降到115％，进一步证实了药物组合组可实现在剂量减低的前提下疗效明显增强的 协同治疗效果。
表13药物组合物对缺氧心肌细胞的保护作用
注：与模型组相比较：*P＜0.05，**p＜0.01；与空白组相比较：#P＜0.05；与单独药物组相比： Δp＜0.05。
实施例11甘露糖醛酸与益母草碱的药物组合物对缺氧诱导心肌细胞中NQQ1和TNF-α、 IL-6炎症因子的影响
采用实施例10中所述的缺氧诱导心肌细胞模型，细胞处理结束后，采用生化检测每组 NQO1的活力，并采用ELISA检测炎症因子TNF-α和IL-6的含量。每次三个平行，实验重复三次。
结果如表14，与空白组相比，模型组细胞的NQO1活性明显降低，且TNF-αα和IL-6的含量显著增加，而各药物组显著抑制了CoCl2诱导导致的NQO1活性的减少和TNF-αα和IL-6的含量的增加，其中以药物组合组效果最佳，表明各个药物处理组也可显著增加NQO1的活性，同时，联合药物组具有协同增效的显著效果，相较于模型组以及单独给药组的57％、 71％、82％的活力(对照组为100％)，组合药物组在益母草碱∶甘露糖醛酸为5∶50μM时细 胞NQO1活性上升到95％；同时，药物组合组的TNF-α和IL-6含量最低(1020ng/l；932ng/ml)， 进一步证实了药物组合物可实现在剂量减低的前提下疗效明显增强的协同治疗效果。
表14药物组合物对缺氧心肌细胞NQO1和TNF-α释放的影响
注：与模型组相比较：*P＜0.05，**p＜0.01；与对照组相比较：#P＜0.05；与单独药物组相比： Δp＜0.05。
实施例12甘露糖醛酸与益母草碱的药物组合物对氧化性低密度脂蛋白诱导血管内皮细胞 损伤的影响
以未添加氧化性低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导损伤的细胞作为空白组，以添加ox-LDL 诱导损伤的血管内皮细胞作为模型组，观察益母草碱与甘露糖醛酸联合应用对ox-LDL诱导 产生血管内皮类粥样损伤的保护作用。具体如下：将血管内皮细胞HUVEC接种于MEM完全培养液中(含有100U/mL青霉素、100U/mL链霉素和10％FBS)，置于37℃、5％CO2培 养箱中培养恒温培养24h，以每孔6000个细胞种植于96孔板中，然后加入提前溶解好含 ox-LDL的诱导液，2h后，益母草碱组每孔细胞中加入10μM的益母草碱，甘露糖醛酸组每孔加入100μM的甘露糖醛酸，药物组合组每孔加入5μM益母草碱和50μM甘露糖醛酸，模 型组和空白组加入等量的生理盐水处理细胞。细胞处理结束后，采用ELISA检测脂氧合酶 LOX5和炎症因子TNF-α、IL-6的含量。每次三个平行，实验重复三次。
结果如表15，与空白组相比，模型组细胞的LOX5、TNF-α和IL-6的含量显著增加，而各药物组显著抑制了ox-LDL诱导导致的LOX5、TNF-a和IL-6的含量的增加，其中以药 物组合组效果最佳。由此说明各个药物处理组可显著降低LOX5的表达量，同时，联合药 物组具有协同增效的显著效果，相较于模型组以及单独给药组的457、327、314pg/L的表 达量(对照组为231)，组合药物组在益母草碱：甘露糖醛酸为5∶50μM时细胞LOX蛋白酶得表达量下降到274pg/L；同时，组合药物组的TNF-α和IL-6含量最低(1269ng/1；763ng/1)， 进一步证实了药物组合组可实现在剂量减低的前提下疗效明显增强的协同治疗效果。
表15药物组合物对ox-LDL诱导内皮细胞粥样损伤的影响
注：与模型组相比较：*P＜0.05，**p＜0.01；与对照组相比较：#P＜0.05；与单独药物组相比： Δp＜0.05。
实施例13甘露糖醛酸与益母草碱的药物组合物对抑郁症小鼠的影响
选取雄性小鼠，体重18-22克，适应性饲养1周后，对照组小鼠正常摄食饮水，不给予 任何刺激，造模组小鼠每天进行三种随机、温和不可预测的刺激，即从如下操作中任选3种进行刺激，注意同种刺激不能连续给予：夹尾、昼夜颠倒、斜笼、束缚、湿笼、空笼、食 水剥夺、配对、更换垫料、频闪照明，直至出现抑郁样症状。将模型组小鼠随机分为6组， 每组6只，因此小鼠的分组分别为(1)对照组；(2)模型组；(3)甘露糖醛酸组(300mg/kg)；(4)益母草碱组(100mg/kg)；(5)阳性药物组(氟西汀1.5mg/kg)，(6)药物组合1组(益母草30mg/kg和甘露糖醛酸180mg/kg)、(7)药物组合2组(益母草50mg/kg和甘露糖醛酸150mg/kg)。小 鼠进行慢性温和刺激至第5周，甘露糖醛酸组小鼠给予甘露糖醛酸300mg/kg的灌胃处理；益母草碱组小鼠给予益母草碱100mg/kg的灌胃处理；阳性药物组小鼠给予氟西汀1.5mg/kg 的灌胃处理；药物组合组分别按照上述比例混合的益母草碱和甘露糖醛酸后给予小鼠灌胃处理；模型组和对照组给予同等体积的生理盐水的灌胃处理，每日1次，持续5周。于末次给 药结束后1小时，进行强迫游泳和悬尾实验评价各组药物处理对抑郁症小鼠行为学的影响。
小鼠强迫游泳和悬尾试验结果如表16所示，给予造模刺激后，模型小鼠的不动时间显 著增加，表明模型成功建立。单独给予甘露糖醛酸的小鼠的行为有所改善，但不具有显著性 差异，可能是实验动物的数量有限。但是益母草碱组在100mg/kg的剂量下可显著改善小鼠 的抑郁症状。而且，药物组合1组在益母草碱剂量降低70％的情况下仍然能显著改善小鼠 的行为学；其中以药物组合2组的效果最为明显，这进一步表明益母草碱与甘露糖醛酸具有协同增效，可显著提高抗抑郁的治疗效果。
表16药物组合物对抑郁症小鼠的影响
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注：与模型组相比较：*P＜0.05，**p＜0.01；与对照组相比较：#P＜0.05；与单独药物组相比： Δp＜0.05。
实施例14甘露糖醛酸与益母草碱的药物组合物对抑郁症小鼠脑内5-HT和多巴胺的影响
采用实施例13中所述的抑郁症小鼠模型，在检测完小鼠的行为学影响后，将小鼠断头 处死，快速取出脑组织，将脑组织在冰冷的生理盐水中漂洗，滤纸拭干后称重，加入10倍 组织重量的蛋白裂解液(含PMSF)，在冰上用匀浆机充分裂解；裂解30min后移至离心管中，在4℃、12000rpm离心5min，取上清液分于1.5ml离心管中。采用ELISA试剂盒检 测小鼠脑组织中5-HT和多巴胺的含量。
结果如表17所示，与对照组相比，模型组小鼠脑组织中的5-HT含量显著上升，而多巴胺含量显著下降，单独给予甘露糖醛酸的小鼠对5-HT含量有所降低，但却继续降低多巴胺的含量。但是益母草碱组在100mg/kg的剂量下可显著改善小鼠脑内神经递质的分泌紊乱状态，明显降低由抑郁症引起的5-HT含量的上升和多巴胺含量的减少。而且，药物组合1 组在益母草碱剂量降低70％的情况下仍然能显著降低小鼠脑内的5-HT水平；其中以药物组合2组的效果最为明显，这进一步表明益母草碱与甘露糖醛酸具有协同增效，可显著提高抗抑郁的治疗效果，且从多巴胺水平来看，依然是药物组合2组的效果最好，能够实现剂量减低但疗效明显增强的协同治疗效果。
表17药物组合物对抑郁症小鼠神经递质分泌的影响
注：与模型组相比较：*P＜0.05，**p＜0.01；与对照组相比较：#P＜0.05；与单独药物组相比： Δp＜0.05。
实施例15甘露糖醛酸与益母草碱的药物组合物对精神分裂症大鼠的行为学改变
购买雄性大鼠(Wistar，4周龄)，在动物繁殖室中分成两组，并在单独的架子上适应1 周以上。根据实验动物护理标准，在12小时的明暗循环，22-25℃的温度，40-60％的相对 湿度，自由获取食物和水的情况下，安放和供养实验动物。稳定一周后，以其重量差不超过 20克的成对大鼠的方式，将大鼠用于社交互动动物行为测试。
本发明通过地佐西平处理所诱发的精神分裂症样症状的动物模型来评价甘露糖醛酸与 益母草碱的药物组合物的治疗效果：给药N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体抑制剂引起的症 状与起因与精神分裂症的症状是相似的。因此，可以通过地佐环平((NMDA受体抑制剂)的 处理来诱发精神分裂症样症状。将地佐环平溶解在生理盐水中，并在实验前4小时以每只 0.1mg/kg剂量给大鼠皮下给药地佐环平造模；对照组大鼠则皮下注射等量的生理盐水。造 模后将大鼠随机分为7组，每组6只，分别为(1)对照组；(2)模型组；(3)甘露糖醛酸组(每 日口服300mg/kg甘露糖醛酸)；(4)益母草碱组(每日口服100mg/kg益母草碱)；(5)药物组 合1组(每日口服益母草碱30mg/kg和甘露糖醛酸180mg/kg)、(6)药物组合2组(每日口服益母草碱50mg/kg和甘露糖醛酸150mg/kg)、(7)阳性药物组阿立哌唑(每日口服阿立哌唑0.35mg/kg)。
将雄性大鼠成对放置在同一观察箱中，允许1∶1的互动，然后测量可被认为是积极社交 互动的在另一只鼠的下方或上方进行嗅、拭、舔、骑和爬的总时间达5分钟，并据此评估社 交互动.
结果如表18所示，观察到佐环平处理的模型组的积极的社交互动的总时间平均值明显 低于对照组，阳性药物阿立哌唑0.35mg/kg可观察到到积极的社交互动时间的增加；各组测 试药物均显示出社交互动时间延长的效果，本发明也首次验证到益母草碱对精神分裂症的良好治疗效果；当甘露糖醛酸与益母草碱的药物组合物之后，可具有协同增敏的治疗效果，其 中以药物组合2组为最优。这进一步表明益母草碱与甘露糖醛酸具有协同增效，可显著提高 抗精神分裂症的治疗效果。
表18药物组合物对精神分裂症大鼠行为学的影响
注：与模型组相比较：*P＜0.05，**p＜001；与对照组相比较：#P＜0.05。
实施例16甘露糖醛酸与益母草碱的药物组合物对精神分裂症大鼠的脑内PDE酶活性的影 响
采用实施例15中所述的精神分裂症大鼠模型，使用对照组、模型组、甘露糖醛酸组、 益母草碱组、药物组合2组。给药后，将大鼠断头处死，快速取出脑组织，将脑组织在冰冷 的生理盐水中漂洗，滤纸拭干后称重，加入10倍组织重量的蛋白裂解液(含PMSF)，在冰上用匀浆机充分裂解，裂解30min后移至离心管中，在4℃下、12000rpm离心5min， 取上清液分于1.5ml离心管中。采用生化检测PDE的酶活性。
结果如表19所示，与对照组相比，模型组小鼠脑内的PD4酶活性明显增加，而各给药 组均能降低PDE酶活性，提示各给药物可以显著增加脑内cAMP信号分子的水平，修复已损伤的神经元，增加突触的可塑性。其中以药物组合2组的效果最好，能够实现剂量减低但疗效明显增强的协同治疗效果。目前PDE现已成为包括神经性疾病在内的多个疾病的重要靶点。本发明中，益母草碱单独给药和组合2组药物均可显著抑制PDE的活性；同时药物 组合能够发挥协同抑制PDE的作用，从而实现剂量减低但疗效明显增强的协同治疗效果。
表19药物组合物对大鼠脑内PDE酶活性的影响
注：与模型组相比较：*P＜0.05，**p＜001；与假手术组相比较：#P＜0.05；与单独药物组相 比：Δp＜0.05。
进一步我们采用PDE10A重组蛋白检测了益母草碱与PDE10A的相互结合作用力，因为PDE10A是近年作为精神分裂症治疗的新兴靶点，多项研究表明对它的抑制可实现对精神分裂症的治疗，同时也能实现对心脏重构以及为纤维化的改善功效。
因此，我们首次采用生物大分子仪检测了益母草碱与PDE的相互结合。通过Biacore T200，固定蛋白的芯片为CM5芯片。将蛋白用pH 4.5，5.0，5.5的醋酸钠分别稀释到10 μg·mL-1，通过预富集实验确定pH 5.0为最佳偶联条件。接下来芯片用0.4mol·L-1EDC和 0.1mol·L-1NHS按体积比1∶1混合活化，用pH5.0的醋酸钠将PDE蛋白稀释至10μg·mL-1进行偶联，以1mol·L-1乙醇胺(pH 8.5)封闭活化的芯片表面。受试化合物用PBST缓冲 液稀释到6.25、3.125、1.5625μmol·L-1后放入仪器。实验结果用自带数据分析软件BiacoreT200 Evaluation Software分析。
本实验成功将PDE10A重组蛋白在最适pH5.0的条件下固定到CM5芯片上，实验检测1.5625、3.1250、6.250μmol·L-1的益母草碱与PDE10A的结合曲线，实验结果如图10显示，不同浓度的益母草碱均和PDE有较强的结合，经软件分析，亲和力常数KD值为187.2×10- 9mol·L-1，具有纳摩尔级的亲和力，因此认为益母草碱与PDE10A有较强的结合。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对 本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载 的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。

Claims (7)

1.一种甘露糖醛酸和益母草碱的药物组合物，其特征在于，所述甘露糖醛酸和益母草碱的重量比为300:50，所述药物组合物用于老年痴呆。
2.一种甘露糖醛酸和益母草碱的药物组合物，其特征在于，所述甘露糖醛酸和益母草碱的重量比为300:60，所述药物组合物用于帕金森。
3.一种甘露糖醛酸和益母草碱的药物组合物，其特征在于，所述甘露糖醛酸和益母草碱的重量比为150:50，所述药物组合物用于抑郁症或精神分裂症。
4.根据权利要求1所述的药物组合物在用于制备防治神经性疾病的药物中的应用，其特征在于，所述神经性疾病为老年痴呆。
5.根据权利要求2所述的药物组合物在用于制备防治神经性疾病的药物中的应用，其特征在于，所述神经性疾病为帕金森。
6.根据权利要求3所述的药物组合物在用于制备防治神经性疾病的药物中的应用，其特征在于，所述神经性疾病为抑郁症。
7.根据权利要求3所述的药物组合物在用于制备防治神经性疾病的药物中的应用，其特征在于，所述神经性疾病为精神分裂症。
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