CN100508985C - 褐藻胶寡糖及其衍生物及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供聚合度为2-22的褐藻胶寡糖及其衍生物，所述褐藻胶寡糖由β-D-甘露糖醛酸通过α-1，4糖苷键连接而成。将其氧解，可以得到还原端1位为羧基的衍生物。本发明还提供所述褐藻胶寡糖及其衍生物的制造方法，它包括将褐藻酸盐水溶液在高压釜中于pH 2-6、温度100-120℃的条件下反应2-6小时，反应中止后，调节pH值至7。将所得寡糖在氧化剂存在下氧解，制得氧解产物。本发明的褐藻胶寡糖及其衍生物可用于制备老年性痴呆症和糖尿病防治药物。

Description

褐藻胶寡糖及其衍生物及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及一种褐藻胶寡糖及其衍生物和它们的制造方法和在治疗老年性痴呆、治疗糖尿病方面的应用。

背景技术

老年性痴呆和糖尿病是目前严重危害人类健康的多发病和常见病，尤其是随着世界老年人口的日益增多，其发病率有逐年升高的趋势，因此老年性痴呆和糖尿病的防治显得越来越重要。

目前用于老年性痴呆的防治药物包括中枢兴奋剂、改善胆碱能的物质、脑血液循环改善剂、中草药及吡咯烷酮类化合物等，多存在疗效不确切、特异性不强，或毒副作用大、口服吸收差、不易透过血脑屏障，特别是治标不治本的缺点，限制了他们的广泛应用。临床常用的糖尿病防治药物主要包括胰岛素和口服降糖药物，多存在使用不便及毒副作用大等缺点，尤其是缺乏合适的用于II型糖尿病的有效药物。研究发现，老年性痴呆及II型糖尿病的发病过程与淀粉样蛋白(β—amyloid，简称Aβ，及amylin)沉积，继而形成纤维缠结及其引发的自由基氧化损伤有关。因此通过拮抗淀粉样蛋白纤丝的形成及其毒性是防治老年性痴呆及II型糖尿病的有效途径。

褐藻胶是褐藻细胞壁的主要组成成分，是由β-D-甘露糖醛酸和α-L-古罗糖醛酸通过1，4糖苷键连接形成的线形阴离子多糖。褐藻胶是一种高分子化合物，分子量较大，一般在几万至几百万道尔顿之间。褐藻胶来源丰富，并已广泛应用于食品、化工和医药业等。近年来的研究发现褐藻胶具有多种生物活性，但由于其分子量较大，使其在药物应用方面受到一定的限制。因此通过各种降解方法制备的褐藻胶寡糖，在糖化学、糖生物学、糖工程以及糖类药物研究等领域具有重要的研究价值。多糖可以用很多方法进行降解，包括酶解法、化学降解法和物理降解法。酶解法由于需要特异性降解褐藻胶的酶，使其应用受到限制。物理降解法一般与其他降解方法一起使用，降解产物的极限分子量为50,000Da左右，不易制得寡糖。用于糖类降解的化学降解法主要有酸水解法和氧化降解法，但常规的酸解法由于是在常温常压下进行，因此不易获得分子量在4000以下的寡糖，使其应用受到限制。

发明内容

鉴于上述情况，本发明者进行了深入的研究，结果发现，在高温高压下进行酸水解，可以得到分子量在4000以下的褐藻胶寡糖，并在氧化剂存在下制备了其还原端1位为羧基的衍生物，在此基础上完成了本发明。

即，本发明提供一种低分子量的褐藻胶寡糖及其衍生物或它们的药用盐以及这些化合物的制造方法。本发明还提供包含上述低分子量褐藻胶寡糖或其衍生物或它们的药用盐的老年性痴呆症及糖尿病防治药物。

本发明涉及下列结构式(1)表示的褐藻胶寡糖及其衍生物或它们的药用盐，所述褐藻胶寡糖由β-D-甘露糖醛酸通过α-1，4糖苷键连接而成，

式中，n表示0或1—19的整数。

在本发明中，所述褐藻胶寡糖衍生物的一个例子是由下列结构式(II)表示的化合物，其还原端1位为羧基。

式中，n表示0或1—19的整数。

上述式(I)和(II)中，以n＝2—10为佳，n＝4—8尤佳。四糖至十二糖(更好的是六糖至十糖)的生物效果较佳的原因尚不清楚，但可能是它们较易被机体细胞识别和接受。

所述褐藻胶寡糖衍生物例如还包括甘露糖醛酸中的一部分羟基被硫酸酯化了的衍生物。

所述褐藻胶寡糖或其衍生物的药用盐例如可以是这些化合物的钠盐、钾盐、钙盐、镁盐等，其中优选钠盐。所述药用盐可用常规方法制得。

本发明还涉及上述褐藻胶寡糖及其衍生物的制造方法，其特征是，将褐藻酸盐水溶液在高压釜中于pH2-6、反应温度约100-120℃的条件下反应约2-6小时；反应结束后，调节pH值至7左右。其氧解产物是在褐藻胶寡糖溶液中加入氧化剂反应获得。

在本发明的一个较佳实施方式中，将0.5-5％褐藻酸钠水溶液在高压釜中于pH4、反应温度110℃的条件下加热反应4小时。反应结束后，将反应液吸出，自然冷却，用NaOH溶液调节pH值为7。边搅拌，边将滤液缓缓倒入4倍于滤液体积的工业酒精中，静止醇沉过夜。将醇沉物质抽滤至干燥，并用无水乙醇洗涤脱水，得到的白色滤饼于60℃烘箱中干燥，得褐藻胶寡糖粗品。将褐藻胶寡糖粗品配成10％的溶液，用95％的乙醇溶液进行沉淀，将沉淀用无水乙醇洗涤，干燥后，配成5％溶液，用3μm膜过滤除杂质，在Bio-Gel-P6凝胶柱(1.6×180cm)上进行脱盐，流动相为0.2mol·L^-1NH₄HCO₃，分步收集，洗脱液用硫酸-咔唑法检测，合并含糖组分，减压浓缩并除盐，冷冻干燥，即得。

结构式(II)所示的衍生物的制备方法是，在上述将褐藻酸盐水溶液在高压釜中于pH2-6、反应温度约100-120℃的条件下反应时间约2-6小时的步骤之后，再加入氧化剂，在反应温度100-120℃的条件下反应15分钟至2小时。在一个具体实施方式中，向10％氢氧化钠溶液50ml中加入5％的硫酸铜溶液25ml，立即混匀，并立即加入5％的褐藻胶寡糖溶液40ml，沸水浴中加热，至不再有砖红色沉淀产生。取出离心，去除沉淀，取上清液少许，按上述比例加入到10％氢氧化钠溶液和5％的硫酸铜溶液中，检查是否还有砖红色沉淀产生。若无，上清液加入4倍体积的95％乙醇醇沉，过夜，将沉淀抽滤压干，并用无水乙醇反复脱水。烘箱中60℃烘干。按上述结构式(1)的褐藻胶寡糖的制备中相同分离方法分离。

本发明还提供一种药学组合物，它包含有效量的上述褐藻胶寡糖或其衍生物或它们的药用盐和药用载体。

所述药学组合物可以是老年性痴呆防治药物。

此外，所述药学组合物可以是β—淀粉样蛋白纤丝形成抑制剂及纤丝解聚促进剂。

所述药学组合物还可以是糖尿病防治药物。

此外，所述药学组合物可用作胰岛淀粉样蛋白纤丝形成抑制剂、胰岛淀粉样蛋白多肽抑制剂。将本发明的褐藻胶寡糖用于制备老年性痴呆症和糖尿病的防治药物，对于解决当前老年性痴呆和糖尿病缺乏有效防治药物的困难，具有特别重要的意义。

附图说明

图1是酸法降解后用Bio-gel P6柱分离的本发明的褐藻胶寡糖的流出曲线

图2是本发明的褐藻胶寡糖的MALDI-TOF图

图3褐藻胶寡糖氧解产物用Bio-gel P6柱分离的流出曲线

图4褐藻胶寡糖氧解产物的MALDI-TOF图(Positive mode)

图5示出本发明的褐藻胶寡糖对Aβ_1-40所致学习记忆障碍小鼠避暗潜伏期的影响

图6示出本发明的褐藻胶寡糖对Aβ_1-40所致学习记忆障碍小鼠避暗错误次数的影响

图7示出本发明的褐藻胶寡糖对Aβ_25-35损伤神经母细胞瘤SH-SY5Y的保护作用

图8示出本发明的褐藻胶寡糖对Aβ_1-40损伤神经母细胞瘤SH-SY5Y的保护作用

图9示出本发明的褐藻胶寡糖对正常及肝素促Aβ_1-40纤丝形成的抑制作用

图10示出本发明的褐藻胶寡糖对Aβ_1-40纤丝解聚的影响

图11示出本发明的褐藻胶寡糖对溶液中250μg/ml Aβ_1-40构象变化的影响

图12示出本发明的褐藻胶寡糖对IAAP引起NIT细胞损伤的保护作用

图13示出本发明的褐藻胶寡糖氧解产物混合物对Aβ1-40脑内注射所致痴呆小鼠Morris水迷宫寻找平台潜伏期的影响

图14示出本发明的褐藻胶寡糖氧解产物混合物对Aβ1-40脑内注射所致痴呆小鼠Morris水迷宫游泳距离的影响

图15示出本发明的褐藻胶寡糖氧解产物混合物对Aβ1-40脑内注射所致痴呆小鼠Morris水迷宫第一次到达平台时间的影响

图16示出本发明的褐藻胶寡糖氧解产物混合物对Aβ1-40脑内注射所致痴呆小鼠Morris水迷宫穿越平台次数的影响

图17示出本发明的褐藻胶寡糖氧解产物混合物对IAAP引起NIT细胞损伤的保护作用

具体实施方式

(一)褐藻胶寡糖的制备：

称取1g多聚甘露糖醛酸钠盐(重均分子量8,235Da，中国海洋大学兰太药业有限公司提供)，加入蒸馏水配成1％溶液，用盐酸调节pH值为4，置于高压釜中，在110℃加热4小时。取出冷却后，用NaOH溶液调节pH值为7，边搅拌，边将滤液缓缓倒入4倍于滤液体积的工业酒精中，静止、醇沉过夜。将醇沉物质抽滤至干燥，并用无水乙醇洗涤脱水，得到的白色滤饼于60℃烘箱中干燥，得褐藻胶寡糖粗品。

取褐藻胶寡糖粗品，配成10％的溶液，用95％的乙醇溶液进行沉淀，将沉淀用无水乙醇洗涤，干燥后，配成5％溶液，用3μm膜过滤除杂质，在Bio-Gel-P6凝胶柱(1.6×180cm)上进行脱盐分离，流动相为0.2mol·L^-1NH₄HCO₃，分步收集，洗脱液用硫酸-咔唑法检测，收集各含糖组分，减压浓缩，上G-10柱进行脱盐，外水体积组分继续上Bio-Gel-P10凝胶柱(1.6×180cm)分离，冷冻干燥，得系列褐藻胶寡糖(图1)。

(二)褐藻胶寡糖氧解产物的制备

取5g上述制备的褐藻胶寡糖配成5％的溶液。向10％氢氧化钠溶液50ml中加入5％的硫酸铜溶液25ml，立即混匀，并立即加入5％的褐藻胶寡糖溶液40ml，沸水浴中加热，至不再有砖红色沉淀产生。取出离心，去除沉淀，取上清液少许，按上述比例加入到10％氢氧化钠溶液和5％的硫酸铜溶液中，检查是否还有砖红色沉淀产生。若无，上清液加入4倍体积的95％乙醇醇沉，过夜，将沉淀抽滤压干，并用无水乙醇反复脱水。烘箱中60oC烘干。得褐藻胶寡糖氧解产物粗品。

取褐藻胶寡糖氧解产物粗品，配成10％的溶液，用95％的乙醇溶液进行沉淀，将沉淀用无水乙醇洗涤，干燥后，配成5％溶液，用3μm膜过滤除杂质，在Bio-Gel-P6凝胶柱(1.6×180cm)上进行脱盐分离，流动相为0.2mol·L^-1NH₄HCO₃，分步收集，洗脱液用硫酸-咔唑法检测，收集各含糖组分，减压浓缩，上G-10柱进行脱盐，外水体积组分继续上Bio-Gel-P10凝胶柱(1.6×180cm)分离，冷冻干燥，得系列褐藻胶寡糖氧解产物(图2)。

(三)褐藻胶寡糖的结构鉴定

对上述褐藻胶寡糖的制备中得到的流分所含寡糖进行结构鉴定，确定该系列寡糖是由β-D-甘露糖醛酸经α-1，4糖苷键连接而成的褐藻胶寡糖。其结构式为：

式中，n表示0或1—19的整数。

下面以含流出液第292mL处前后的流分(图1中以“6”标出的流分，以下称组分6)为例，说明对上述寡糖的结构解析。

1.紫外吸收图谱

将上述流出液292mL处前后的流分中所含寡糖稀释至合适浓度，用UV-2102紫外可见分光光度计在190nm-400nm间扫描，发现该流分在紫外区无特异性吸收峰，说明结构中无共轭双键结构。但是在190-200nm处有非特异性吸收，因此该系列寡糖在脱盐时可采用该区段紫外光进行在线检测。

2.红外光谱测定

取0.5mg上述流分的寡糖，用KBr压片，通过NEXUS-470智能型红外光谱仪进行红外光谱测定。结果发现，在3420.79、3214.64、2924.61cm^-1处有羟基的对称伸缩振动，1600.25cm^-1为羧酸盐的羰基对称伸缩振动，1406.54cm^-1为羟基的剪式振动，1146.42cm^-1为羧基碳氧键的对称伸缩振动，1045.77cm-¹为环内醚的反对称伸缩振动，804.02cm^-1为甘露糖醛酸环骨架的反对称伸缩振动。表明该化合物含有羧基、羟基和甘露糖醛酸环的骨架结构。

3.质谱分析

质谱分析中所用仪器为Bruker Daltonics公司BIFLEXII型MALDI-TOF质谱仪，由质谱图(图2，其数据列于表1中)。可知，m/z为1073.9的峰为分子离子峰[M-H]^-1，m/z为1096.6的峰为[M+Na-2H]^-1，m/z为1028.0的峰为[M-H2O-CO-H]^-1，m/z为821.2的峰为[M-ManA-CH2O-2H2O-H]^-1，m/z为704.3的峰为[M-2ManA-H2O-H]^-1，m/z为634.4的峰为[M-2ManA-2(CH2O)-CO-H]^-1，m/z为536.5的峰为[M-2H]^2-，m/z为357.4的峰为[M-3H]^3-。上述流分所含寡糖的ESI-MS图中分子离子峰为m/z为1073.9，说明其分子量为1074。

表1.褐藻胶寡糖(组分6)的质谱解析

4.褐藻胶寡糖核磁共振波谱测定

取式(I)表示的褐藻胶寡糖(n＝4)，使用JNM-ECP600核磁共振波谱仪测定其¹HNMR、¹³CNMR，结果见表2和表3。

表2.褐藻胶寡糖(组分6)的¹H-NMR解析

表3.褐藻胶寡糖(组分6)的¹³C-NMR解析

综合以上检测结果，确定上述流分所含褐藻胶寡糖为甘露糖醛酸6糖，具有下列化学结构式(Ia)：

5.褐藻胶寡糖样品中甘露糖醛酸含量的测定(¹H-NMR光谱法)

采用高分辨率¹H-NMR研究褐藻胶寡糖的组成，根据异头碳质子的信号强度来定量分析褐藻胶寡糖样品中的甘露糖醛酸与古洛糖醛酸之比(M/G)。取干燥样品3-5mg，在中性pD下溶于D₂O中，加入0.3mg EDTA，在Bruker DPX-300型核磁共振谱仪上测定，谱图在70℃下记录，以使D₂O峰远离异头质子共振区，信号相对强度用峰面积积分值来表示。结果显示，M残基的H-1信号为4.64和4.66ppm(分别为MM、MG，序列中的M残基H-1信号)。G残基的H-1信号均在5.05ppm处(二重峰)，样品中的M和G的相对含量可以用两者的H-1峰强度来表示，公式如下：

$M\%=\frac{I_{4.64}+I_{4.66}}{I_{4.64}+I_{4.66}+I_{5.05}}\×100\%$

其中I代表峰强度，用峰面积积分值来表示。

用此方法测得褐藻胶寡糖样品中的D-甘露糖醛酸相对含量为98.07％，说明褐藻胶寡糖样品主要由甘露糖醛酸组成。

(四)褐藻胶寡糖氧解产物的结构鉴定

对上述褐藻胶寡糖氧解产物的制备中得到的流分所含寡糖氧解产物进行结构鉴定，确定该系列寡糖氧解产物是由β-D-甘露糖醛酸经α-1，4糖苷键连接而成的褐藻胶寡糖的衍生物，其还原端1位为羧基。其结构式为：

式中，n表示0或1—19的整数。

下面以组分6为例，说明对上述寡糖氧解产物的结构解析。

1.紫外光谱分析

取褐藻胶寡糖氧解产物适量，用蒸馏水配制成一定浓度，以蒸馏水作为空白，在岛津UV-260型紫外分光光度计(190nm～700nm)紫外可见分光光度计上进行全波长扫描。经测定，褐藻胶寡糖氧解产物在紫外和可见光区无特征吸收峰。

2.红外光谱分析

采用NICOLE NEXUS-470智能型红外光谱仪，测定了褐藻胶寡糖氧解产物的红外光谱，解析结果见表4。

表4.褐藻胶寡糖氧解产物IR谱图的解析结果

3.核磁共振氢谱1H-NMR分析

采用Bruker Auance DPX—300型核磁共振波谱仪测定了褐藻胶寡糖氧解产物核磁共振氢谱及碳谱，核磁共振氢谱(¹H-NMR)发现，谱图主要由β-D-甘露糖醛酸的六个氢原子的信号组成，对各信号的裂分进行归属后可知，褐藻胶寡糖氧解产物分子主要由甘露糖醛酸组成。若还原端1位若为醛基，则H-1α和β的化学位移分别为5.11和4.81ppm。因为褐藻胶寡糖还原端1位由醛基氧化成羧基，H-1消失，其在5.11和4.81ppm的信号消失。核磁共振碳谱13C-NMR分析结果表明，样品谱图主要由β-D-甘露糖醛酸的六个碳原子的信号组成，对各信号的裂分进行归属后可知，中间体分子主要由甘露糖醛酸组成。经与中间体谱图对照，甘露糖醛酸固有的还原端C-1信号(94ppm)消失了。还原端C-1信号移动到了低场了175.81ppm。这是因为褐藻胶寡糖还原端1位由醛基氧化成羧基，其C-1的化学位移由醛基的94ppm左右变为羧基碳的175.81ppm。

4.质谱分析

质谱测定所用仪器为Bruker Daltonics公司BIFLEX III型MALDI-TOF质谱仪，结果如图4所示。由图可以得出，m/z为1113.7的峰为[M+Na]⁺¹，m/z为1113.7的峰为[M-O+Na]⁺¹，m/z为1083.7的峰为[M-CH₂O+Na]⁺¹，m/z为1067.6的峰为[M-CH₂O-O+Na]⁺¹。m/z为1053.6的峰为[M-2(CH₂O)+Na]⁺¹，m/z为979.6的峰为[M-3(CH₂O)-CO₂+Na]⁺¹。m/z为921.6的峰为[M-4(CH₂O)-CO₂-CO+Na]⁺¹。褐藻胶寡糖氧解产物质谱解析见表5。

表5.褐藻胶寡糖氧解产物质谱解析

褐藻胶寡糖氧解产物的MALDI-TOF图中m/z为1113.7的峰为[M+Na]⁺¹，说明褐藻胶寡糖氧解产物的分子量为1090.7。与酸降解褐藻胶寡糖(分子量1075)相比多16，即分子中多了一个氧，可以认为褐藻胶寡糖在制备过程中被氧化。

综合以上检测结果，该褐藻胶寡糖氧解产物的化学结构式为(IIa)：

(五)褐藻胶寡糖对老年性痴呆症(AD)的疗效评价

在下述实验中，所用的褐藻胶寡糖是用Bio-Gel-P6凝胶柱分离后的6糖。

1.褐藻胶寡糖体内对Aβ_1-40致动物痴呆模型的影响

取18-22g雄性Balb/c小鼠(由山东大学实验动物中心提供)称重并随机分为6组，即对照组、模型组、褐藻胶寡糖低、中、高(15、30、60mg/kg)三个剂量组、阳性对照药哈伯因(HBY，河南竹林众生制药公司豫中制药厂生产)0.2mg/kg组。动物于分组后第三天开始给予相应药物，给药量0.5ml/20g，对照组、模型组灌服等量生理盐水，每日1次，连续至实验结束。

于给药后第8天，除对照组外，参照Jhoo JH等，β-amyloid(1-42)-induced learning andmemory deficits in mice：involvement of oxidative burdens in the hippocampus and cerebral cortex.Behavioural Brain Research(2004)155：185-196中记载的方法，向所有小鼠单侧脑室内注射Aβ_1-40，制造小鼠学习记忆功能障碍模型，并采用Morris水迷宫及避暗实验和脑组织生化指标的测定评价药物对小鼠学习记忆功能的影响。结果发现(表6)，模型组与对照组相比，寻找平台潜伏期显示出明显或极明显差异(P<0.05，P<0.01)，说明Aβ_1-40单侧脑室注射致小鼠痴呆模型已经建立。各处理组中，第1天除褐藻胶寡糖15mg/kg组外其余各组较模型组有缩短趋势，其中褐藻胶寡糖60mg/kg组与模型组相比潜伏期显著缩短(P<0.05)。第2、3天，各给药组潜伏期均比模型组缩短，其中褐藻胶寡糖60mg/kg和HBY达统计学意义(P<0.05)。

表6.褐藻胶寡糖对Aβ_1-40致痴呆模型小鼠Morris水迷宫寻找平台潜伏期的影响(x±SE)

^#P<0.05，^##p<0.01，与对照组比；^*P<0.05，与模型组比

水迷宫测试第4天，撤去实台，动物在规定60秒内留经原实台所在象限时间百分数的测定结果显示，模型组显著地低于对照组(P<0.05)，而褐藻胶寡糖60mg/kg组动物停留时间明显高于模型组(P<0.05)。结果见表7。

表7.褐藻胶寡糖对Aβ_1-40致痴呆模型小鼠Morris水迷宫测试学习记忆能力的影响(x±SE)

#P<0.05，与对照组比；^*P<0.05，与模型组比；

自Aβ造模后25天开始进行避暗实验。训练时，将通向暗室的门打开，暗室内底部栅板通电(36v)。分别取各组动物，头部向外放入避暗实验盒中，动物四足进入暗室后将受到电击。24小时后同法测试，记录小鼠进入暗室遭受刺激所需时间(潜伏期)和设定时间内(3min)遭受电击次数(错误次数)。

图5、6显示了避暗实验测试结果，每组的实验个数为8，数值用均数±标准误表示，#表示与对照组比较有统计学差异(p<0.05)，^*表示与模型组比较有统计学差异(p<0.05)。可以看出，Aβ_1-40单侧脑室注射模型组与对照组相比，小鼠潜伏期明显缩短(P<0.01)，且错误次数明显增加(P<0.05)，表明Aβ_1-40单侧脑室注射致小鼠痴呆模型建立成功。然而30、60mg/kg褐藻胶寡糖给药组及阳性药哈伯因组小鼠潜伏期明显延长，且褐藻胶寡糖三个剂量给药组及阳性药组小鼠错误次数也明显减少，表明褐藻胶寡糖具有明显改善Aβ_1-40所致动物学习记忆功能障碍的功能。

褐藻胶寡糖对Aβ致痴呆动物生化指标的影响

动物于游泳实验结束后断头处死，立即于冰上分离皮层和海马，经液氮速冻1小时后放-80摄氏度冰箱保存。实验时将皮层和海马分别用生理盐水制成10％和5％匀浆，3600转/分离心，上清液进行MDA、CuZn-SOD、GSH-PX、Na⁺K⁺-ATPase、AchE和CHAT活性测定。CHAT采用同位素标记合成法，其余指标和总蛋白检测均采用南京建成生物工程研究所生产的试剂盒测定。

(1)胆碱乙酰化转移酶(ChAT)活性

Aβ造模组大脑皮层ChAT活性显著低子对照组(P<0.05)。经褐藻胶寡糖和哈伯因术前及术后给药均可提高ChAT活性，其中褐藻胶寡糖30、60mg/kg及哈伯因的疗效，在大脑皮层有明显统计学意义。结果见表8。

表8.褐藻胶寡糖对Aβ致痴呆模型小鼠皮层ChAT活性的影响(n＝10，x±SE)

#P<0.05，与对照组相比；^*P<0.05，^**P<0.01，与模型组相比

(2)超氧化物歧化酶(SOD)活性

模型组小鼠脑内SOD活性低于对照组，提示其抗氧化活性降低，但尚不具统计学意义。经60mg/kg的褐藻胶寡糖预防与治疗组可显著升高大脑皮层和海马两部位SOD的活性，提示褐藻胶寡糖的抗痴呆机理与提高脑的抗氧化活性有关。结果见表9。

表9.褐藻胶寡糖对Aβ致痴呆模型小鼠皮层和海马SOD活性的影响(n＝10，x±SE)

^*P<0.05，与模型组相比

(3)丙二醛(MDA)含量

模型组小鼠皮层和海马的MDA含量与对照组相比无显著差异。提前给予褐藻胶寡糖并继续治疗的小鼠脑内MDA含量下降，其中30、60mg/kg组和哈伯因组均可显著降低MDA，提示两种药物均可改善脑内氧化应激和自由基损害，有利于保护脑组织免受氧化损伤。结果见表10。

表10.褐藻胶寡糖对Aβ致痴呆模型小鼠皮层和海马MDA的影响(n＝10，x±SE)

^*P<0.05，^**P<0.01，与模型组比

(4)谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)活性

模型组小鼠皮层和海马部位的GSH-PX活性低于对照组，其中海马部位达到显著性差异(P<0.05)。经给予褐藻胶寡糖后有所升高，其中褐藻胶寡糖60mg/kg组的皮层、哈伯因组海马的酶活性与模型相比达显著差异(p<0.05)。结果见表11。

表11.褐藻胶寡糖对Aβ致痴呆小鼠皮层和海马GSH-PX活性的影响(n＝10，x±SE)

#P<0.05，与对照组比；^*P<0.05，与模型组比

(5)Na⁺，K⁺-ATPase活性

模型组小鼠皮层和海马的Na⁺，K⁺-ATP酶活性显著低于对照组，提示Aβ对脑内神经细胞的能量代谢有明显影响。提前给予褐藻胶寡糖并继续治疗的小鼠脑内该酶活性有显著升高，三个剂量组均可显著提高大脑皮层Na⁺，K⁺-ATP酶活性，高剂量组可明显提高海马部位Na⁺，K⁺-ATP酶活性，该治疗效果强于哈伯因，提示提高脑内能量代谢水平可能是褐藻胶寡糖保护脑功能并抗痴呆的作用机理之一。结果见表12。

表12.褐藻胶寡糖对Aβ致痴呆小鼠皮层和海马Na⁺，K⁺-ATP酶活性的影响(n＝10，x±SE)

^#P<0.05，与对照组相比；^*P<0.05，与模型组相比

2.褐藻胶寡糖体外对Aβ引起神经细胞损伤的保护作用

参照Banker GA等，Rat hippocampal neurons in dispersed cell culture.Brain Res，1977，126：397-425中记载的方法培养原代大鼠皮层神经细胞，在开始培养后一周开始进行实验。即在第8天将细胞换液，并向细胞中加入终浓度为0、10、50、100μg/ml的褐藻胶寡糖，37℃孵育24小时后，加入老化的Aβ_25-35(Aβ_25-35溶解于灭菌的双蒸水中，使其终浓度为1mg/ml，在37℃放置7天进行老化，老化的Aβ分装后于-20℃冻存)，终浓度为30μM，继续培养24小时，加10μl5mg/ml的MTT，37℃孵育4小时后，去除上清，加入150μl DMSO于酶联免疫测定仪上以测定波长570nm，参比波长630nm测定吸光值。

结果发现，30μM老化的Aβ_25-35与原代神经细胞孵育24小时后，细胞MTT还原明显降低，细胞存活率降低到54.5±8.9％(p<0.001)，而用10、50、100μg/ml的褐藻胶寡糖预处理24小时可以明显改善Aβ_25-35对细胞的毒性损伤，并且随着药物剂量的增加，这种改善作用越明显，其中100μg/ml的褐藻胶寡糖作用最显著(细胞存活率分别为72.0±11.2％、77.1±8.1％和82.3±11.6％)。

褐藻胶寡糖对神经母细胞瘤SH-SY5Y也得到与原代神经细胞相似的结果。30μM老化的Aβ_25-35(如图7所示)及2μM老化的Aβ_1-40(如图8所示)与SH-SY5Y细胞作用48小时均可明显引起细胞的损伤，细胞数目减少，部分细胞变圆，可以看见部分悬浮细胞，细胞存活率分别降到73.3±9.4％、64.1±2.5％，然而50、100μg/ml的褐藻胶寡糖对其具有明显抑制作用，细胞悬浮减少，存活率增加。

由以上实验结果可以看出，褐藻胶寡糖体内可明显缩短Aβ_1-40侧脑室注射所致AD小鼠的逃避潜伏期，增加Aβ_1-40侧脑室注射所致AD小鼠穿越原平台的次数，缩短第一次达到原平台所在位置的时间，对Aβ_1-40侧脑室注射所致AD动物的学习记忆功能有明显改善作用；同时，褐藻胶寡糖体外可明显抑制Aβ对原代培养及神经细胞株的损伤。提示褐藻胶寡糖对AD具有一定的防治作用。

(四)褐藻胶寡糖抗AD作用机制的研究

1.褐藻胶寡糖对Aβ_25-35引起SH-SY5Y细胞凋亡的影响

SH-SY5Y细胞以2×10⁵个/孔接种于6孔板，细胞融合后加入0、50、100μg/ml的褐藻胶寡糖作用24小时，再加入终浓度为30μM老化的Aβ_25-35(Sigma公司产品)，继续培养48小时，消化、收集细胞，1200转离心5min，去上清，用pH7.2的磷酸盐缓冲液(PBS)漂洗细胞2次，加入100u/ml RNase(Hyclone公司产品)和5μg/ml PI(Hyclone公司产品)混合液200μl，4℃孵育30分钟，用流式细胞仪(美国BD公司产品)进行测定，每个样品计数8000个细胞。

结果发现，30μM老化的Aβ_25-35刺激SH-SY5Y细胞48小时后，明显引起细胞凋亡，凋亡率为24.8±1.9％，然而用50、100μg/ml的褐藻胶寡糖预处理24小时可明显抑制Aβ_{25- 35}诱导的细胞凋亡，凋亡率分别为10.2±1.3％和5.1±0.7％。

深入探讨褐藻胶寡糖抗Aβ所致神经细胞凋亡的作用机制发现，褐藻胶寡糖可明显抑制Aβ诱导的神经细胞内游离钙离子浓度的升高、自由基的产生、细胞脂质过氧化产物含量的增加，线粒体膜电位的降低以及凋亡促进蛋白P53和Caspase-3蛋白表达的升高，并促进凋亡抑制蛋白Bcl-2表达的上调，提示褐藻胶寡糖拮抗Aβ细胞毒性损伤是通过其抗氧化、抑制胞内游离钙浓度的升高而增加凋亡抑制蛋白的表达、阻断下游凋亡促进蛋白的表达，从而最终抑制细胞的凋亡。

2.在分子水平上探讨褐藻胶寡糖抗Aβ神经毒性的作用机制

(1)褐藻胶寡糖对Aβ_1-40纤丝形成的影响

将新配制的Aβ_1-40与0、10、50、100μg/ml的褐藻胶寡糖混合于TBS缓冲液中(100mMTris，50mM NaCl，pH7.4)，37℃孵育24小时，然后加入Th-T，用荧光分光光度计在激发波长λex为450nm，发射波长λem为480nm下测定Th-T荧光强度。

结果发现10、50、100μg/ml的褐藻胶寡糖均可抑制Aβ_1-40聚集，且100μg/ml的褐藻胶寡糖抑制作用最强，其荧光强度分别为10.46±0.94、9.18±1.32和7.81±1.38(p值分别<0.05、0.05和0.001)。同时采用电镜技术观察了褐藻胶寡糖对Aβ_1-40纤丝形成的影响，结果见图9，同样表明褐藻胶寡糖可明显抑制Aβ_1-40纤丝的形成。采用相同的技术研究发现，褐藻胶寡糖对肝素促Aβ_1-40纤丝形成具有明显的抑制作用。结果见图9，A为Aβ_1-40孵育24小时结果，B为Aβ_1-40和肝素混合孵育24小时结果，C表示Aβ_1-40和褐藻胶寡糖共同孵育24小时结果，D为Aβ_1-40和肝素及褐藻胶寡糖共同孵育24小时结果，E为Aβ_1-40孵育48小时结果，F为Aβ_1-40和肝素混合孵育48小时结果，G为Aβ_1-40和褐藻胶寡糖共同孵育48小时结果，H为Aβ_1-40和肝素及褐藻胶寡糖混合孵育48小时结果。

(2)褐藻胶寡糖对纤丝化Aβ_1-40解聚的影响

Aβ_1-40用无菌去离子双蒸水溶解，配成1mg/ml，然后用Eppendorf管分装，置于37℃老化7天。取1mg/ml老化Aβ_1-40与褐藻胶寡糖混合，37℃孵育3天，样品用2％醋酸铀负染，Aβ_1-40纤丝形态采用JEM-1200EX透射电镜观察。结果表明，Aβ_1-40老化7天后形成相互交错、相互聚集的纤丝，然而在纤丝化Aβ_1-40中加入褐藻胶寡糖孵育3天后，Aβ纤丝量明显减少，纤丝断裂、变短。结果如图10，A为Aβ，B为肝素和Aβ，C为褐藻胶寡糖和Aβ共同孵育的结果。

(3)褐藻胶寡糖对Aβ构象改变的影响

用无菌TBS(pH7.4，100mM Tris，50mM NaCl)将Aβ_1-40配制成250μg/ml浓度，将其以350μl/管分装到Eppendorf管中，分别向其中加入终浓度为100μg/ml的无菌褐藻胶寡糖，混匀后于37℃放置12小时，用J-500A型CD仪(日本JASCO公司生产)检测构象变化。

结果如图11所示，A为Aβ_1-40，B为老化的Aβ_1-40和肝素混合物，C为Aβ_1-40和褐藻胶寡糖混合物的测定图。结果发现，Aβ_1-40在37℃放置12小时基本完全呈β-折叠构象，而HSH-971明显抑制Aβ_1-40由α-螺旋转变为β-折叠。

(4)褐藻胶寡糖与Aβ相互作用的研究

以SPR技术(BIAcore X，瑞典Uppsala)在25℃下，以5μl/min的流速流经缓冲液HBS-EP缓冲液(0.01M HEPES，150mmol/L NaCl，3.4mmol/L EDTA-Na₂，0.005％(V/V)吐温-20，pH7.4)。将Aβ_1-40用HBS-EP缓冲液配制成1mg/ml的储备液，分装后置于37℃。分别于0、0.5、1、2、4、6天这几个时间点取出Aβ_1-40，将其倍比稀释成5个浓度梯度，在25℃下，以5μl/min的流速流经褐藻胶寡糖芯片(注射体积为10μl)，记录Aβ与褐藻胶寡糖的结合曲线，用2M NaCl再生芯片。

结果表明，褐藻胶寡糖与不同聚集程度Aβ_1-40均有结合，褐藻胶寡糖与新鲜的Aβ_1-40结合能力最弱，其结合K_D值为6.85E-07M，但随着Aβ老化时间的延长，褐藻胶寡糖与之结合能力逐渐增加(K_D值分别为1.07E-07、9.06E-08、5.43E-08、2.15E-08、1.45E-08M)，2天以后增加幅度减小，基本达到稳定。

进一步研究发现，褐藻胶寡糖是通过His13～Lys16与Aβ全长分子相互作用的；通过Ser26～Lys28与Aβ_25-35结合。褐藻胶寡糖与新鲜Aβ相互结合是其抑制Aβ构象转变、进而抑制纤丝形成的重要原因；褐藻胶寡糖与老化Aβ相互结合是其促进纤丝态Aβ解聚的重要原因。

以上作用机制研究发现褐藻胶寡糖通过与Aβ分子结合而抑制Aβ纤丝形成，促进Aβ纤丝解聚，进而抑制Aβ引起的神经细胞钙离子超载，清除其自由基形成，而抑制神经细胞凋亡，保护神经细胞免受损伤，从而发挥抗老年性痴呆的作用。

(五)褐藻胶寡糖抗糖尿病作用研究

1.褐藻胶寡糖体外对胰淀素损伤胰岛β细胞的保护作用

人胰岛β细胞NIT株用含10％ FBS的DMEM培养基培养，以1×10⁴个/孔接种于96孔板，细胞融合后，加入0、10、50、100μg/ml褐藻胶寡糖作用24小时，加入终浓度为30μM老化的胰淀素(amylin，又称胰岛淀粉样蛋白多肽，简称IAPP)，继续培养48小时后，以MTT法测定细胞的存活。结果发现，褐藻胶寡糖预处理24小时可以明显改善IAPP对细胞的毒性作用，增强细胞的存活，并且随着药物剂量的增加，这种改善作用越明显。结果见图12，每组的实验个数为6，数值用均数±标准差表示，##表示与对照组比较有统计学差异(p<0.01)，*及**表示与IAPP组比较有统计学差异(p<0.05及p<0.01)。表明褐藻胶寡糖具有拮抗IAPP对胰岛β细胞损伤的作用。

2.褐藻胶寡糖体内对链脲霉素致糖尿病小鼠模型的影响

体重18-22g雄性NIH小鼠60只，随机分为正常组、模型组、褐藻胶寡糖50、150、450mg/kg组及优降糖5mg/kg组。试验当天，除正常组外，其余动物均腹腔注射链脲霉素150mg/kg。连续给予相应药物10天，第11天摘眼球取血，测血糖浓度。结果发现，各给药组小鼠血糖浓度明显低于模型组，说明褐藻胶寡糖对链脲霉素所致糖尿病模型小鼠具有一定的治疗作用(表13)。

表13.褐藻胶寡糖对链脲霉素致糖尿病小鼠血糖的影响(x±SD)

^###P<0.05，与对照组比；^*P<0.05，^**p<0.01与模型组比；

以聚合度为2-22的褐藻胶寡糖及其氧解产物或混和物进行体内外抗老年痴呆和抗糖尿病的实验，也得到了类似的实验结果。附图13-16是褐藻胶寡糖氧解产物混合物对Aβ1-40脑内注射所致痴呆小鼠行为学测定的结果，每组的实验个数为8，数值用均数±标准误表示，#及##表示与对照组比较有统计学差异(p<0.05，p<0.01)，*及**表示与模型组比较有统计学差异(p<0.05，p<0.01)。可以看出，褐藻胶寡糖氧解产物混合物可明显增强痴呆动物的学习记忆能力。附图17是褐藻胶寡糖氧解产物混合物对IAAP(amylin)损伤胰岛β细胞株NIT保护作用的测定结果，每组的实验个数为6，数值用均数±标准差表示，##表示与对照组比较有统计学差异(p<0.01)，*及**表示与IAPP组比较有统计学差异(p<0.05，p<0.01)。可以看出，褐藻胶寡糖氧解产物混合物对糖尿病具有明显防治作用。

(六)统计学处理

以上数据应用Statview统计处理软件进行统计分析，结果以“均值±标准误”(Meanvalues±SE)表示，采用方差分析(ANOVA)进行比较。

根据上述药理结果，用常规的制剂手段将有效量的本发明的褐藻胶寡糖与药用载体混合，可以制备药学组合物。所述药学组合物包括β—淀粉样蛋白纤丝形成抑制剂、胰岛淀粉样蛋白纤丝形成抑制剂。本发明的褐藻胶寡糖在制备老年性痴呆症和糖尿病防治药物中的应用具有特别重要的意义。

Claims (10)

1.褐藻胶寡糖衍生物或它们的药用盐，其特征在于，所述褐藻胶寡糖衍生物由β—D-甘露糖醛酸经1，4—糖苷键连接而成，其还原端1位为羧基，由下列结构式(II)表示：

式中，n表示2-10的整数。

2.根据权利要求1所述的褐藻胶寡糖衍生物或它们的药用盐，其特征在于，n表示4—8的整数。

3.权利要求1所述的褐藻胶寡糖衍生物或它们的药用盐的制造方法，它依次包括以下步骤：

酸水解步骤：将褐藻酸盐水溶液在高压釜中于pH2-6、反应温度约100-120℃的条件下反应时间约2-6小时；

调节pH步骤：反应中止后，调节pH值至7；

氧解步骤：加入氧化剂，在反应温度100-120℃的条件下反应15分钟至2小时。

4.根据权利要求3所述的制造方法，其特征在于，所述褐藻酸盐是褐藻酸钠；酸水解在pH4、110℃的条件下反应4小时。

5.根据权利要求3所述的制造方法，其特征在于，调节pH值至7后，醇沉，将醇沉物质抽滤，脱水，干燥，脱盐。

6.根据权利要求3所述的制造方法，其特征在于，所述氧化剂是氢氧化铜；氧解在100℃的条件下反应30分钟。

7.下式(1)所示的甘露糖醛酸寡糖在制备老年性痴呆症防治药物、β—淀粉样蛋白纤丝形成抑制剂、糖尿病防治药物、胰岛淀粉样蛋白纤丝形成抑制剂、纤丝解聚促进剂中的任一种的应用，

式中，n表示0或1—19的整数。

8.药学组合物，其特征在于，它包含有效量的权利要求1—2中任一项所述的褐藻胶寡糖衍生物或它们的药用盐和药用载体。

9.根据权利要求8所述的药学组合物，其特征在于，它是老年性痴呆症防治药物、β—淀粉样蛋白纤丝形成抑制剂、糖尿病防治药物、胰岛淀粉样蛋白纤丝形成抑制剂、纤丝解聚促进剂中的任一种。

10.权利要求1—2中任一项所述的褐藻胶寡糖衍生物或它们的药用盐在制备老年性痴呆症防治药物、β—淀粉样蛋白纤丝形成抑制剂、糖尿病防治药物、胰岛淀粉样蛋白纤丝形成抑制剂、纤丝解聚促进剂中的任一种中的用途。

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