CN109937208B - 低聚甘露糖醛二酸的制备方法 - Google Patents

低聚甘露糖醛二酸的制备方法 Download PDF

Info

Publication number
CN109937208B
CN109937208B CN201680088455.0A CN201680088455A CN109937208B CN 109937208 B CN109937208 B CN 109937208B CN 201680088455 A CN201680088455 A CN 201680088455A CN 109937208 B CN109937208 B CN 109937208B
Authority
CN
China
Prior art keywords
acid
bromine
reaction
oligomannuronic
mannuronic acid
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201680088455.0A
Other languages
English (en)
Other versions
CN109937208A (zh
Inventor
肖中平
张真庆
耿美玉
丁健
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shanghai Green Valley Pharmaceutical Co Ltd
Original Assignee
Shanghai Green Valley Pharmaceutical Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shanghai Green Valley Pharmaceutical Co Ltd filed Critical Shanghai Green Valley Pharmaceutical Co Ltd
Publication of CN109937208A publication Critical patent/CN109937208A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN109937208B publication Critical patent/CN109937208B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H1/00—Processes for the preparation of sugar derivatives
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
    • C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
    • C08B37/006—Heteroglycans, i.e. polysaccharides having more than one sugar residue in the main chain in either alternating or less regular sequence; Gellans; Succinoglycans; Arabinogalactans; Tragacanth or gum tragacanth or traganth from Astragalus; Gum Karaya from Sterculia urens; Gum Ghatti from Anogeissus latifolia; Derivatives thereof
    • C08B37/0084—Guluromannuronans, e.g. alginic acid, i.e. D-mannuronic acid and D-guluronic acid units linked with alternating alpha- and beta-1,4-glycosidic bonds; Derivatives thereof, e.g. alginates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H7/00—Compounds containing non-saccharide radicals linked to saccharide radicals by a carbon-to-carbon bond
    • C07H7/02—Acyclic radicals
    • C07H7/033—Uronic acids

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Materials Engineering (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Low-Molecular Organic Synthesis Reactions Using Catalysts (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)

Abstract

一种重要的生物活性物质低聚甘露糖醛二酸的新制备方法，该方法使用低聚甘露糖醛酸作为起始原料，通过酸降解、活性次溴酸氧化步骤得到目标物质。本发明的低聚甘露糖醛二酸的制备方法采用了温和的反应条件，副反应少，不需要进一步纯化，收率可达90％以上，甚至达95％以上，并且适合用在线连续反应装置生产，反应过程易于实现自动化控制。

Description

低聚甘露糖醛二酸的制备方法
技术领域
本发明涉及一种重要的生物活性物质低聚甘露糖醛二酸的新制备方法，该方法使用M-段中间体作为起始原料，通过酸降解、活性次溴酸氧化步骤得到目标物质。
背景技术
低聚甘露糖醛二酸由于其潜在的药用价值已经受到广泛的重视。低聚甘露糖醛二酸通常以海藻酸为原料经过多步骤制得。
在原料海藻酸的多糖分子中，有由甘露糖醛酸(D-mannuronic acid) 通过β-1，4-糖苷键连接形成的M段、古罗糖醛酸(L-guluronic acid) 通过α-1，4-糖苷键连接形成的G段，以及由这两种糖杂合形成的MG 段。它们的结构式如下所示：
Figure GPA0000263009790000033
(M；β-D-甘露糖醛酸)
Figure GPA0000263009790000032
(G；α-L-古罗糖醛酸)。
M段和G段可以从原料海藻酸中分离。通常的方法可以简单描述为：将海藻酸初步降解后可得到聚甘露糖醛酸和聚古罗糖醛酸的混合多糖，混合多糖再经酸法沉淀后，可以除去其中的聚古罗糖醛酸，进一步精制可以得到纯度在90％以上的均聚甘露糖醛酸(下文中也称“M段中间体”)。例如，可参见中国专利申请No.98806637.8以及 CN02823707.2所披露的方法。
耿美玉等人的中国专利申请200580009396.5及美国专利US 8835403B2披露了低聚甘露糖醛的衍生物——甘露糖醛二酸具有重要药用价值，该甘露糖醛二酸的反应过程可通过如下反应方程式(I) 表示，即低聚甘露糖醛酸多糖还原端的甘露糖醛酸C1-位醛基氧化成羧基。
Figure GPA0000263009790000041
在上述氧化转化过程中，常用的氧化剂有碱性硫酸铜溶液，即菲林试剂，美国专利US8835403即采用了该氧化方法，具体为：在碱性条件下，将反应底物低聚甘露糖醛酸加入硫酸铜溶液中，在沸水浴中反应15分钟至2小时。该法是以Cu2+离子为氧化剂氧化醛基，反应中产生砖红色的氧化亚铜沉淀，这个反应常用于鉴定还原性糖。
葡萄糖氧化生成葡萄糖酸的反应与之类似，这类反应可以分成三类。第一类为生物发酵或者酶催化氧化：发酵法例如中国专利 96119169.4采用黑曲霉发酵；美国专利5,962,286、5,017,485和 5,190,869均采用微生物发酵法生产葡萄糖酸；葡萄糖氧化酶法例如美国专利6,942,997、5,897,995和3,935,071。第二类为重金属催化氧化：美国专利5,132,452和4,843,173均采用钯催化氧化制备葡萄糖酸。第三类为化学试剂：双氧水氧化葡萄糖制备葡萄糖酸，中国专利号 2011103384029。
以上的这些方法都存在不足：生物发酵和酶催化生产周期长，成本高；重金属催化剂容易失活，且容易引入重金属残留；氢氧化铜或双氧水反应均需100℃左右的高温，副反应较多，产率低(＜50％)。
发明内容
本发明人发现，通过使用特定的氧化剂，大大地提高了反应收率，并且使得生成低聚甘露糖醛二酸的反应速度快，副反应少，反应以后的产物可以通过加入足量的甲醇或乙醇使反应终止并得到油状沉淀，由分液漏斗将油状物分离出来，干燥，即得。如需精制以除去单糖、盐和有机酸杂质，可以进一步通过透析或者柱层析的方法实现，操作简单。
本发明具体涉及一种氧化制备低聚甘露糖醛二酸的方法，通过采用M-段中间体作为原料，首先将M-段中间体进一步降解，形成M段寡糖(本文中也称为“低聚甘露糖醛酸”)，然后以该M段寡糖为原料，溴水或活性次溴酸盐等能够通过次溴酸起作用的含溴物质为本发明中使用的氧化剂，反应生成低聚甘露糖醛二酸。
本发明第一个方面提供一种低聚甘露糖醛二酸的制备方法，包括使低聚甘露糖醛酸与含溴氧化剂接触的氧化反应步骤。特别地，可用于本发明的含溴氧化剂选自溴水、液溴、次溴酸、次溴酸盐、溴离子源与次氯酸盐的组合、或者溴与次氯酸盐的组合。这些氧化剂通过溴离子或次溴酸根离子起作用。在本发明的一个实施方案中，以次溴酸计的含溴氧化剂和/或次氯酸盐的摩尔用量为反应原料低聚甘露糖醛酸的1.0-2.0倍。
本发明的另一个方面提供了通过溴离子或次溴酸根离子(BrO-) 起作用的氧化剂在用于氧化还原性寡糖或者多糖中的用途。
本发明的低聚甘露糖醛二酸的制备方法可以采用温和的反应条件实现，副反应少，不需要进一步纯化，收率可达90％以上，甚至达 95％以上。本发明的氧化反应速度快产率高，室温下即可反应，适合用在线连续反应装置生产，反应过程易于实现自动化控制。所选氧化剂价格便宜，操作简单，适合大规模制备。
附图说明
图1是本发明的原料M段中间体的核磁共振氢谱(1H-NMR)。
图2是溴水氧化得到低聚甘露糖醛二酸的SEC-HPLC图。
图3是液溴氧化得到低聚甘露糖醛二酸的SEC-HPLC图。
图4是NaBrO氧化得到低聚甘露糖醛二酸的SEC-HPLC图。
图5是溴化钠催化-次氯酸钠氧化得到低聚甘露糖醛二酸的SEC-HPLC图。
图6是溴-次氯酸钠氧化得到低聚甘露糖醛二酸的SEC-HPLC图。
图7A和7B分别是甘露糖醛酸六糖组份氧化前后的LC-MS图(被溴水-次氯酸钠氧化)。
具体实施方式
本文中使用的术语“约”是指在所修饰数值的±5％范围内，在优选实施方案中，是指在所修饰数值的±3％范围内，在更优选的实施方案中，是指在所修饰数值的±1％范围内。
M段中间体的制备
本发明中采用的原料M段中间体可以通过现有技术中已知的方法制备。例如中国专利申请No.98806637.8以及CN02823707.2所披露的方法。这些方法可以简单描述为：将海藻酸初步降解后得到聚甘露糖醛酸和聚古罗糖醛酸的混合多糖，混合多糖再经酸法沉淀后除去其中的聚古罗糖醛酸，进一步精制可以得到纯度在90％以上的均聚甘露糖醛酸。
根据该方法制备的M-段中间体具有约10KDa左右的分子量，结构经核磁共振氢谱(1H-NMR)确证，见图1。在一个具体的方案中，核磁共振氢谱中化学位移值4.5ppm附近只有一个端基质子信号，归属为甘露糖醛酸C1-位的1H，3.5ppm～3.9ppm之间，有4个氢信号，归属为C2-C5四个1H信号。由此获得的M段中间体可以直接用于下一步反应。
在一个优选的实施方案中，适合用于发明的M段中间体的纯度为60％以上，优选70％以上，更优选80％以上。分子量范围为1-15KDa，优选2-12KDa，更优选4-10KDa。
M段寡糖的制备
采用M段中间体作为原料，将其进行酸降解，可以获得待氧化的M段寡糖。将M段中间体溶于水中，配制成浓度为15％(w/v) 以上的浓溶液，然而进行酸降解。优选地，配制的溶液浓度为20％(w/v) 以上，更优选25％(w/v)以上。
随后，将溶液的pH调节至酸性，优选5以下，更优选4以下，最优选3.5以下，于高温高压下进行降解，自然冷却至室温。
酸降解在高温高压条件下进行。温度为95-150℃，优选100-130℃，更优选105-120℃。压力为0.10-0.50MPa，优选0.10-0.28MPa，更优选0.15-0.20MPa。
降解后的溶液进行浓缩，蒸发和干燥，以获得干燥的固体。
M段寡糖包含二糖至十三糖的混合物。其中，基于二糖至十三糖的混合物的重量计，二-四聚糖为约40-60％，优选约50％，五至十聚糖为约30-50％，优选40％，十一至十三聚糖为约5-15％，优选约10％。
活性次溴酸盐氧化步骤
将由前述步骤制得的干燥的M段寡糖氧化，制成本发明的低聚甘露糖醛二酸。此步骤中所用的氧化剂为含溴氧化剂。特别地，这些含溴氧化剂选自溴水、液溴、次溴酸、次溴酸盐、溴离子源与次氯酸盐的组合、或者溴与次氯酸盐的组合。由于次溴酸盐或次溴酸根离子不稳定，本发明的方法中所采用的次溴酸盐可以在反应体系中原位生成，或者在加入反应液之前现场制备。
在本发明的一个实施方案中，使用溴水或液溴作为氧化剂。溴水作为市售产品，可以由供应商处获得，通常市售的溴水浓度为3％。
RCHO+Br2+3OH-＝RCOO-+2Br-+2H2O
在本发明的一个实施方案中，使用次溴酸盐作为氧化剂。次溴酸盐可以是次溴酸钠和/或次溴酸钾。次溴酸盐通过在反应介质中加入液溴和碱原位制备。例如，采用液溴与NaOH或KOH的混合物制备。
以次溴酸钠为例，如此进行的氧化反应化学方式程如下：
Br2+2NaOH＝NaBrO+NaBr+H2O (1)
RCHO+NaBrO＝RCOOH+NaBr (2)
在本发明的另一个实施方案中，次溴酸盐可以通过金属溴化物与次氯酸钠或次氯酸钾随反应的进行原位制备。反应过程中，反应溶液先褪色，之后逐渐出现红棕色(表明有Br2生成)，随着反应的进行，颜色褪去。以次氯酸钠为例，所进行的氧化反应化学方式程如下：
Figure GPA0000263009790000081
或者，在另一个实施方案中，可以使用溴水与次氯酸钠或次氯酸钾反应，原位生成次溴酸盐。同样以次氯酸钠为例，反应式如下：
RCHO+Br2+3OH-＝RCOO-+2Br-+2H2O (1)
Figure GPA0000263009790000082
该方案中，加入的溴氧化了部分的反应原料低聚甘露糖醛酸，并且产生溴离子；溴离子又可以继续催化次氯酸钠与未反应的原料继续反应，直到反应完成。
本发明的氧化步骤进行的pH值为6-10，优选6.5-9.6，更优选 7.5-9.5。本发明的氧化步骤进行的温度优选为0-70℃，更优选10-45℃。
由此制备的低聚甘露糖醛二酸可以进行纯化。例如，可以使用醇，诸如乙醇、甲醇等进行沉淀，然后将沉淀复溶，二次醇沉，分液漏斗分离油状沉淀，将该油状沉淀物干燥，获得期望的低聚甘露糖醛二酸。如需精制以进一步除去产品中残留的单糖、有机酸杂质和无机盐，可以通过透析膜透析或者柱层析的方法实现。这些操作是本领域技术人员所已知的，实例可参见本发明说明书下文中给出的实施例。
本发明的另一个方面提供了通过溴离子或次溴酸根离子(BrO-) 起作用的氧化剂在用于氧化还原性寡糖或者多糖中的用途，其中所述氧化剂选自溴水、液溴、原位生成次溴酸盐的混合物、金属溴化物与次氯酸盐的组合、以及溴-次氯酸钠的组合。
在一个实施方案中，其中所述还原性寡糖或者多糖的还原端糖环上的C1-位醛基或者半缩醛被氧化成羧基，生成相应的糖酸或者糖二酸。在一个实施方案中，其中所述还原性寡糖或者多糖选自聚甘露糖醛酸或聚古罗糖醛酸，优选聚甘露糖醛酸。
本发明的优点在以下非限制性的实施例中进一步进行说明。但实施例中采用的具体材料及其用量，以及其他实验条件并不应理解为对本发明的限制。除非特别指明，本发明中份数、比例、百分比等均以质量计。
实施例
实施例1：
步骤1)：M段寡糖的制备
称取1500g M-段中间体，加蒸馏水溶解后，配成7500ml体积的溶液，用浓盐酸调pH至3.5，分成若干份，放入高压灭菌锅内加热 110℃，保持3.5hr，冷却，取出，旋转蒸发仪中浓缩，60℃真空干燥箱烘干，即得M-段寡糖1515g。
采用高效液相色谱-质谱联用仪(HPLC-MS)对M-段寡糖进行定性分析。HPLC条件：色谱柱Waters ACQUITY UPLC BEH125 SEC 1.7um，4.6×300mm；流动相：50mM NH4Ac溶于20％甲醇-水，流速 0.1ml/min；样品浓度：1mg/ml；进样体积：8ul；柱温箱温度：30℃；检测器：DAD检测器，210nm。质谱条件：Agilent 6540 QTOF；离子源：ESI碎裂电压120V；负离子模式。
酸降解得到的M-段寡糖产物均为低聚甘露糖醛酸，以二糖到十三糖为主。二糖到十三糖的质谱分析见下表1的左半部分。
步骤2)：低聚糖醛二酸的制备
取100g上述干燥的M-段寡糖，放入5L的玻璃烧杯中，加1L蒸馏水溶解，加入1MNa2HPO41L，用浓盐酸调pH至8.0。室温(20℃) 搅拌下，缓慢加入3％浓度的商品化溴水3.3L。10分钟内加入完以后，继续搅拌2小时即反应完全。
将反应后的溶液倾入装有4L 95％乙醇的塑料桶中，稍微搅拌后静置1hr。静置分层后，倾出上清，下层加入适量95％乙醇脱水，收集下层黄褐色油状物，真空干燥箱减压干燥(60℃)12小时，即得干燥后的氧化产物——低聚甘露糖醛二酸125g。取出少量干燥的低聚甘露糖醛二酸，准确称量为5.0g，加水溶解，配成10％的溶液后，用截留分子量为1000Da的透析袋透析脱盐，同时除去单糖。脱盐后浓缩干燥，称得3.8g。从氧化反应的原料100g M-段寡糖开始计算，脱盐干燥后的低聚甘露糖二酸的得率为95.0％。
采用高效液相色谱-质谱联用仪(HPLC-MS)对上述脱盐干燥后的产物进行定性分析。HPLC条件：色谱柱Waters ACQUITY UPLC BEH125 SEC 1.7um，4.6×300mm；流动相：50mMNH4Ac溶于20％甲醇-水，流速0.1ml/min；样品浓度：1mg/ml；进样体积：8ul；柱温箱温度：30℃；检测器：DAD检测器，210nm。质谱条件：Agilent 6540 QTOF；离子源：ESI碎裂电压120V；负离子模式。氧化反应完成度大于95％，且无其他副反应发生。脱盐操作除去了大部分的一糖和少量的二糖。氧化产物低聚甘露糖醛二酸的二糖至十三糖的质谱解析见下表1右部。
表1低聚甘露糖醛酸及其氧化产物的质谱解析
Figure GPA0000263009790000111
实施例2：
取100g实施例1中制备的M-段寡糖，放入5L的玻璃烧杯中，加1L蒸馏水溶解，加入1M Na2HPO41L，用浓盐酸调pH至6.5。水浴锅加热至40℃，搅拌，缓慢加入3％浓度的商品化溴水1.7L。10 分钟内加入完以后，继续搅拌3小时后，加2倍体积的95％乙醇中止反应，并使产物沉淀。沉淀用适量水溶解后，重复一次醇沉操作。沉淀最后在真空干燥箱中干燥，得褐色块状固体96g，得率约为96％。 HPLC-MS分析该固体物质的组成，实验条件同实施例1，SEC-HPLC 分析结果见图2中的 A。
实施例3：
取100g实施例1中制备的M-段寡糖，放入5L的玻璃烧杯中，加1L蒸馏水溶解，加入1M Na2HPO41L，用浓盐酸调pH至9.5。在水浴锅中加适量冰块冷却至10℃，搅拌，缓慢加入3％浓度的商品化溴水4.7L。10分钟内加入完以后，继续搅拌1小时后，加2倍体积的95％乙醇中止反应，并使产物沉淀。沉淀用适量水溶解后，重复一次醇沉操作。沉淀最后在真空干燥箱中干燥，得褐色块状固体94g，得率约为94％。HPLC-MS分析该固体物质的组成，实验条件同实施例1，SEC-HPLC分析结果见图2中的 B。
实施例4：
将实施例1中制备的M-段寡糖取出100g，溶于500ml 1M Na2HPO4缓冲液中，加盐酸调pH至8.0，在冰水浴中搅拌使冷却，然后缓慢滴入100g(约35ml)液溴(市售，含量＞99％)。在滴入液溴的同时，补加6M NaOH适量，用pH试纸检测，控制反应液的pH在 7-9之间。待液溴滴加完以后，移除冰水浴，室温(23℃)搅拌1.5hr 后，加2倍体积的95％乙醇中止反应，并使产物沉淀。沉淀用适量水溶解后，重复一次醇沉操作。沉淀最后在真空干燥箱中干燥，得褐色块状固体97g，得率约为97％。HPLC-MS分析该固体物质的组成，实验条件同实施例1，SEC-HPLC分析结果见图3中的 A。
实施例5：
将实施例1中制备的M-段寡糖取出100g，溶于500ml 1M Na2HPO4缓冲液中，加盐酸调pH至6.5，在冰水浴中搅拌使冷却，然后缓慢滴入60g(约20ml)液溴(市售，含量＞99％)。在滴入液溴的同时，补加6M NaOH适量，用pH试纸检测，控制反应液的pH在 7-9之间。待液溴滴加完以后，移除冰水浴，水浴锅加热至40℃，搅拌3hr后，加2倍体积的95％乙醇中止反应，并使产物沉淀。沉淀用适量水溶解后，重复一次醇沉操作。沉淀最后在真空干燥箱中干燥，得褐色块状固体94g，得率约为94％。HPLC-MS分析该固体物质的组成，实验条件同实施例1，SEC-HPLC分析结果见图3中的 B。
实施例6：
将实施例1中制备的M-段寡糖取出100g，溶于500ml 1M Na2HPO4缓冲液中，加盐酸调pH至9.5，在冰水浴中搅拌使冷却，然后缓慢滴入150g(约50ml)液溴(市售，含量＞99％)。在滴入液溴的同时，补加6M NaOH适量，用pH试纸检测，控制反应液的pH在7-9之间。待液溴滴加完以后，移除冰水浴，在水浴锅中加入适量冰块使之溶解后温度达到10℃，并随时补充冰块，使温度控制在10℃，搅拌1hr后，加2倍体积的95％乙醇中止反应，并使产物沉淀。沉淀用适量水溶解后，重复一次醇沉操作。沉淀最后在真空干燥箱中干燥，得褐色块状固体93g，得率约为93％。HPLC-MS分析该固体物质的组成，实验条件同实施例1，SEC-HPLC分析结果见图3中的 C。
实施例7：
将实施例1中制备的M-段寡糖取出100g，溶于500ml 1M Na2HPO4缓冲液中，加盐酸调pH至8.0，获得M段寡糖溶液。配置 6M NaOH溶液100ml，在冰水浴中冷却。液溴也在冰水浴中预冷。反应时，先把NaOH溶液和液溴预先反应生成次溴酸钠，次溴酸钠再与 M-段寡糖反应。
因次溴酸钠不稳定，需要临时制备，立即使用，故采用在线连续反应装置：该反应装置包含带有冷却部件的混合反应器A和混合反应器B，体积分别为50ml和100ml，并预先充满蒸馏水；NaOH溶液和液溴分别通过塑料针筒手动匀速、持续泵入，流速分别为5ml/min和1ml/min，同时在反应器A的冷凝管中通入-10℃的冷却液；NaOH溶液和液溴在混合反应器A中反应一段时间后，生成的NaBrO离开反应器A进入反应器B中，在反应器B中与泵入的M-段寡糖溶液(流速为10ml/min)反应，反应在室温下进行。产物低聚甘露糖醛二酸从混合反应器B中的流出流速为16ml/min。流出液收集在装有800ml 95％乙醇的烧杯中。
反应完成后，将烧杯中下层黄褐色油状沉淀收集，加适量水溶解后，重复一次醇沉操作，真空干燥箱中减压干燥(60℃，12hr)，得 90g褐色固体，得率约为90％。干燥产品取少量用HPLC-MS分析， SEC-HPLC分析结果见图4中的 A。
实施例8：
将实施例1中制备的M-段寡糖取出100g，溶于500ml 1M Na2HPO4缓冲液中，加盐酸调pH至6.5。配置6M NaOH溶液100ml，在冰水浴中冷却。液溴也在冰水浴中预冷。反应时，先把NaOH溶液和液溴预先反应生成次溴酸钠，次溴酸钠再与M-段寡糖反应。
反应装置同实施例7。NaOH溶液和液溴进入反应器A的流速分别为3ml/min和0.6ml/min；反应器B中的M-段寡糖溶液流速为 10ml/min，该反应由水浴锅控制温度为40℃。产物低聚甘露糖醛二酸从混合反应器B中的流出流速为14ml/min。流出液收集在装有800ml 95％乙醇的烧杯中。反应完成后，将烧杯中下层黄褐色油状沉淀收集，加适量水溶解后，重复一次醇沉操作，沉淀最后在真空干燥箱中减压干燥(60℃，12hr)，得93g褐色固体，得率约为93％。干燥产品取少量用HPLC-MS分析，SEC-HPLC分析结果见图4中的 B。
实施例9：
将实施例1中制备的M-段寡糖取出100g，溶于500ml 1M Na2HPO4缓冲液中，加盐酸调pH至9.5，得到M-段寡糖液。配置6M NaOH溶液100ml，在冰水浴中冷却。液溴也在冰水浴中预冷。反应时，先使NaOH溶液和液溴预先反应生成次溴酸钠，次溴酸钠再与 M-段寡糖反应。
反应装置同实施例7。反应器A中NaOH溶液和液溴流速分别为 7.5ml/min和1.5ml/min；反应器B中M-段寡糖溶液流速为10ml/min，该反应在10℃控温下进行。产物低聚甘露糖醛二酸从混合反应器B 中的流出流速为19ml/min。流出液收集在装有800ml 95％乙醇的烧杯中。反应完成后，将烧杯中下层黄褐色油状沉淀收集，加适量水溶解后，重复一次醇沉操作，沉淀最后在真空干燥箱中减压干燥(60℃， 12hr)，得94g褐色固体，得率约为94％。干燥产品取少量用HPLC-MS 分析，SEC-HPLC分析结果见图4中的 C。
实施例10：
将实施例1中制备的M-段寡糖取出100g，溶于500ml 1M Na2HPO4缓冲液中，加盐酸调pH至7.5，加入溴化钠20g，搅拌溶解后，在室温(18℃)下，滴加次氯酸钠(市售13％溶液)50ml。反应液先褪色，逐渐出现红棕色，反应一段时间后，颜色褪去。反应3小时以后，颜色变橙黄色。
将反应液倒入装有600ml 95％乙醇的烧杯中，混匀，静置分层。下层液加适量水溶解后，用2倍体积的95％乙醇重复沉淀一次，60℃真空干燥箱中减压干燥12hr。干燥后得褐色固体97g，得率约为97％。取少量用HPLC-MS分析，SEC-HPLC分析结果见图5中的 A。
实施例11：
将实施例1中制备的M-段寡糖取出100g，溶于500ml 1M Na2HPO4缓冲液中，加盐酸调pH至6.5，加入溴化钠20g，搅拌溶解后，在40℃下，滴加次氯酸钠(市售13％溶液)25ml。反应液先褪色，逐渐出现红棕色，反应一段时间后，颜色褪去。反应3小时以后，颜色变橙黄色。将反应液倒入装有600ml 95％乙醇的烧杯中，混匀，静置分层。下层液加适量水溶解后，用2倍体积的95％乙醇重复沉淀一次，60℃真空干燥箱中减压干燥12hr。干燥后得褐色固体90g，得率约为90％。取少量用HPLC-MS分析，SEC-HPLC分析结果见图5中的 B。
实施例12：
将实施例1中制备的M-段寡糖取出100g，溶于500ml 1M Na2HPO4缓冲液中，加盐酸调pH至9.5，加入溴化钠20g，搅拌溶解后，在40℃下，滴加次氯酸钠(市售13％溶液)75ml。反应液先褪色，逐渐出现红棕色，反应一段时间后，颜色褪去。反应1小时以后，颜色变橙黄色。将反应液倒入装有600ml 95％乙醇的烧杯中，混匀，静置分层。下层液加适量水溶解后，用2倍体积的95％乙醇重复沉淀一次，60℃真空干燥箱中减压干燥12hr。干燥后得褐色固体96g，得率约为96％。取少量用HPLC-MS分析，SEC-HPLC分析结果见图5中的 C。
实施例13：
将实施例1中制备的M-段寡糖取出100g，溶于500ml 1M Na2HPO4缓冲液中，加盐酸调pH至8.5，在室温搅拌下滴入10ml液溴，待滴加完成以后，继续滴加35ml次氯酸钠溶液(市售，13％浓度)，反应1hr。反应完成后，加2倍体积的95％乙醇中止反应，静置分层，下层黄褐色油状沉淀加适量水溶解后，重复一次醇沉操作，沉淀最后在真空干燥箱中减压干燥得91g，得率约为91％。取少量样品用HPLC-MS分析，SEC-HPLC分析结果见图6中的 A。
实施例14：
将实施例1中制备的M-段寡糖取出100g，溶于500ml 1M Na2HPO4缓冲液中，加盐酸调pH至6.5，水浴锅加热至40℃，搅拌下滴入8ml液溴，待滴加完成以后，继续滴加20ml次氯酸钠溶液(市售，13％浓度)，反应3hr。反应过程如实施例13中的式(V)所示。加入的溴氧化了部分的反应原料低聚甘露糖醛酸，并且产生溴离子；溴离子又可以继续催化次氯酸钠与未反应的原料继续反应，直到反应完成。反应完成后，加2倍体积的95％乙醇中止反应，静置分层，下层黄褐色油状沉淀加适量水溶解后，重复一次醇沉操作，沉淀最后在真空干燥箱中减压干燥得96g，得率约为96％。取少量样品用 HPLC-MS分析，SEC-HPLC分析结果见图6中的B。
实施例15：
将实施例1中制备的M-段寡糖取出100g，溶于500ml 1M Na2HPO4缓冲液中，加盐酸调pH至9.5，水浴锅中加入冰块控制温度为10℃，搅拌下滴入15ml液溴，待滴加完成以后，继续滴加50ml 次氯酸钠溶液(市售，13％浓度)，反应0.5hr。反应过程如实施例13 中的式(V)所示。加入的溴氧化了部分的反应原料低聚甘露糖醛酸，并且产生溴离子；溴离子又可以继续催化次氯酸钠与未反应的原料继续反应，直到反应完成。反应完成后，加2倍体积的95％乙醇中止反应，静置分层，下层黄褐色油状沉淀加适量水溶解后，重复一次醇沉操作，沉淀最后在真空干燥箱中减压干燥得94g，得率约为94％。取少量样品用HPLC-MS分析，SEC-HPLC分析结果见图6中的 C。
实施例16：
将实施例1中制备的M-段寡糖取出10g，溶于水中，配成0.1g/ml，采用Bio-Gel P6凝胶色谱柱分离，0.02M的NaCl洗脱，紫外210nm 检测，自动收集器收集，合并相同组份，Bio-Gel P10凝胶色谱柱脱盐，干燥，得到10个寡糖组份。将其中的一个寡糖组份标记为HexaM。 HexaM经HPLC-MS分析显示其中以寡聚甘露糖醛酸六糖为主，还含有少量五糖和七糖，具体见附图7A。
称取上述HexaM 0.5g，溶于5ml水并转移至50ml圆底烧瓶中，加1M Na2HPO45ml，用6M HCl调pH至7.9，室温20℃，磁力搅拌器搅拌，滴加1.0ml市售3％浓度的溴水，搅拌30min后，滴入0.5ml 次氯酸钠(市售13％浓度)，继续搅拌1hr后，加入10ml 95％乙醇，终止反应，并生成沉淀，加10ml水复溶后，加乙醇二次沉淀，吸管移除上清，取出沉淀，真空干燥箱中60℃干燥，得0.48g固体。取该固体适量，采用HPLC-MS分析，分析方法同实施例1，分析结果显示，反应原料中的主成分甘露糖醛酸六糖已经被氧化成甘露糖醛二酸六糖，反应完成度＞98％。LC-MS分析结果见图7B。

Claims (18)

1.一种低聚甘露糖醛二酸的制备方法，包括使低聚甘露糖醛酸与含溴氧化剂接触的氧化反应步骤，其中，
所述含溴氧化剂选自溴水、液溴、次溴酸、次溴酸盐、溴离子源与次氯酸盐的组合、或者溴与次氯酸盐的组合；氧化反应的温度为10℃-40℃；且氧化反应的pH值控制在6.5-9.5之间。
2.如权利要求1所述的方法，其中以次溴酸计的含溴氧化剂和/或次氯酸盐的摩尔用量为反应原料低聚甘露糖醛酸的1.0-2.0倍。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述次溴酸或次溴酸盐是原位生成的。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于所述原位生成是通过溴与碱性水性溶液的反应完成的。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于所述碱性水性溶液是碱金属氢氧化物或碱金属磷酸盐或碱金属碳酸盐的水溶液。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于所述碱性水性溶液是氢氧化钠或磷酸钠或碳酸钠的水溶液。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于次溴酸盐或次氯酸盐是碱金属盐。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于所述碱金属盐为钠盐或钾盐。
9.如权利要求1-8任一项所述的方法，其特征在于所述低聚甘露糖醛酸起始物含有2-20个甘露糖醛酸单元。
10.权利要求9的方法，其中所述低聚甘露糖醛酸起始物含有2-15个甘露糖醛酸单元。
11.权利要求9的方法，其中所述低聚甘露糖醛酸起始物含有2-13个甘露糖醛酸单元。
12.权利要求9的方法，其中所述低聚甘露糖醛酸起始物含有3-12个甘露糖醛酸单元。
13.权利要求9的方法，其中所述低聚甘露糖醛酸起始物含有4-10个甘露糖醛酸单元。
14.权利要求9的方法，其中所述低聚甘露糖醛酸起始物含有4-8个甘露醛酸单元。
15.如权利要求9所述的方法，其特征在于所述低聚甘露糖醛酸是从具有更高聚合度的聚甘露糖醛酸降解获得的。
16.如权利要求9所述的方法，其特征在于所述降解是在酸性条件下的降解。
17.如权利要求16所述的方法，其特征在于将聚甘露糖醛酸配制成浓度为15%重量/体积以上的浓溶液，调节至pH为5.0以下，使聚甘露糖醛酸降解。
18.如权利要求15所述的方法，其特征在于所述聚甘露糖醛酸的聚合度为20以上。
CN201680088455.0A 2016-08-15 2016-08-15 低聚甘露糖醛二酸的制备方法 Active CN109937208B (zh)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/CN2016/095368 WO2018032272A1 (zh) 2016-08-15 2016-08-15 低聚甘露糖醛二酸的制备方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN109937208A CN109937208A (zh) 2019-06-25
CN109937208B true CN109937208B (zh) 2022-08-12

Family

ID=61196062

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201680088455.0A Active CN109937208B (zh) 2016-08-15 2016-08-15 低聚甘露糖醛二酸的制备方法

Country Status (16)

Country Link
US (1) US10927137B2 (zh)
EP (1) EP3498722B1 (zh)
JP (1) JP6846509B2 (zh)
KR (1) KR20190046871A (zh)
CN (1) CN109937208B (zh)
AU (1) AU2016420064B2 (zh)
BR (1) BR112019003058A2 (zh)
CA (1) CA3033919C (zh)
EA (1) EA039078B1 (zh)
ES (1) ES2866101T3 (zh)
PL (1) PL3498722T3 (zh)
PT (1) PT3498722T (zh)
SG (1) SG11201901318RA (zh)
UA (1) UA122032C2 (zh)
WO (1) WO2018032272A1 (zh)
ZA (1) ZA201901121B (zh)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110652517A (zh) * 2018-06-29 2020-01-07 上海绿谷制药有限公司 褐藻胶寡糖二酸的组合物
CN110652526A (zh) 2018-06-29 2020-01-07 上海绿谷制药有限公司 甘露糖醛二酸的组合物在治疗糖尿病中的应用
CN110652524A (zh) * 2018-06-29 2020-01-07 上海绿谷制药有限公司 甘露糖醛二酸的组合物在治疗疼痛中的应用
CN110652525A (zh) * 2018-06-29 2020-01-07 上海绿谷制药有限公司 甘露糖醛二酸的组合物在治疗炎症中的应用

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB289280A (en) * 1927-06-17 1928-04-26 Chem Fab Vormals Sandoz Process for the oxidation of aldoses
WO2002032913A1 (en) * 2000-10-17 2002-04-25 University Of Connecticut Method for the oxidation of aldehydes, hemiacetals and primary alcohols
CN1562050A (zh) * 2004-03-24 2005-01-12 中国海洋大学 褐藻酸寡糖在抗痴呆、抗糖尿病中的应用
CN100508985C (zh) * 2004-03-24 2009-07-08 中国海洋大学 褐藻胶寡糖及其衍生物及其制备方法和用途

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP4897310B2 (ja) * 2006-02-28 2012-03-14 理研食品株式会社 Ｌ−グルロン酸金属塩又はｄ−マンヌロン酸金属塩の製造方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB289280A (en) * 1927-06-17 1928-04-26 Chem Fab Vormals Sandoz Process for the oxidation of aldoses
WO2002032913A1 (en) * 2000-10-17 2002-04-25 University Of Connecticut Method for the oxidation of aldehydes, hemiacetals and primary alcohols
CN1562050A (zh) * 2004-03-24 2005-01-12 中国海洋大学 褐藻酸寡糖在抗痴呆、抗糖尿病中的应用
CN100508985C (zh) * 2004-03-24 2009-07-08 中国海洋大学 褐藻胶寡糖及其衍生物及其制备方法和用途

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
A kinetic study of D-glucose oxidation by bromine in aqueous solutions;Branimir N. Grgur,等;《Carbohydrate Research》;20060511;第341卷;第1779-1787页 *
OXIDATIVE REACTIONS AND DEGRADATIONS OF SUGARS AND POLYSACCHARIDES;OSCAR VARELA;《ADVANCES IN CARBOHYDRATE CHEMISTRY AND BIOCHEMISTRY》;20030101;第58卷;第316-321页 *
TEMPO-mediated oxidation of maltodextrins and D-glucose: effect of pH on the selectivity and sequestering ability of the resulting polycarboxylates;Jean-Francois Thaburet,等;《Carbohydrate Research》;20011231;第330卷;第21-29页 *

Also Published As

Publication number Publication date
EP3498722A4 (en) 2020-04-08
CN109937208A (zh) 2019-06-25
UA122032C2 (uk) 2020-08-25
KR20190046871A (ko) 2019-05-07
ZA201901121B (en) 2019-12-18
EP3498722B1 (en) 2021-03-17
AU2016420064B2 (en) 2021-08-19
EA201990502A1 (ru) 2019-08-30
JP6846509B2 (ja) 2021-03-24
SG11201901318RA (en) 2019-04-29
BR112019003058A2 (pt) 2019-05-21
US10927137B2 (en) 2021-02-23
EA039078B1 (ru) 2021-11-30
ES2866101T3 (es) 2021-10-19
PL3498722T3 (pl) 2021-09-20
WO2018032272A1 (zh) 2018-02-22
CA3033919A1 (en) 2018-02-22
AU2016420064A1 (en) 2019-03-21
JP2019527726A (ja) 2019-10-03
CA3033919C (en) 2022-11-29
US20200055888A1 (en) 2020-02-20
PT3498722T (pt) 2021-04-28
EP3498722A1 (en) 2019-06-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN109937208B (zh) 低聚甘露糖醛二酸的制备方法
US3873614A (en) Process for preparing oxidized carbohydrates and products
CA2083576A1 (en) High molecular mass n,o-sulphated heparosans, process for their preparation and the pharmaceutical compositions which contain them
US20120214986A1 (en) Process for the preparation of iron (iii) carboxymaltose complex
WO2011054174A1 (zh) 低聚岩藻糖化糖胺聚糖及其制备方法
JP7220670B2 (ja) オゾンを用いた多糖類の分解方法
Elyakova et al. A study of the laminarins of some Far-Eastern, brown seaweeds
JPH07501684A (ja) 抗凝固剤およびその調製方法
JP7006275B2 (ja) グルコサミン残基の３－ｏ－硫酸化率が高いヘパラン硫酸
JPH10101705A (ja) フラボノイド可溶化法、その糖転移法及び高濃度フラボノイド溶液
JP4186460B2 (ja) 精製された、ヘパリン、その塩もしくはヘパリン誘導体の製造方法および精製された、低分子ヘパリン、その塩もしくはヘパリン誘導体の製造方法
CN112626058B (zh) 一种外切型肝素酶及其应用
CN1219784C (zh) 利用芬顿反应制备甘露糖醛酸寡糖的方法
CN1219786C (zh) 利用芬顿反应制备古罗糖醛酸寡糖的方法
CN100345868C (zh) 一种低分子硫酸皮肤素及其制备方法
JP2006291102A (ja) 精製オリゴ糖画分
CN1473836A (zh) 还原端1位为羧基的古罗糖醛酸寡糖及其衍生物
CN109535217B (zh) 一种奥贝胆酸的精制方法
CN101353653B (zh) 一种酵母蔗糖酶的化学修饰方法
CN1544445A (zh) 利用芬顿反应制备甘古糖醛酸寡糖的方法
JP4221946B2 (ja) 低平均重合度ポリガラクツロン酸の製造方法
Srivastava et al. Studies on Tamarind Kernel Polysaccharide Part III. Structure of a Dextrin
JPS61111302A (ja) エ−テル化サイクロデキストリンの製造方法
JPH08127580A (ja) 新規な環状イヌロオリゴ糖誘導体及びその製造法
CN110698522A (zh) 一种软骨素奇数寡糖单体及其制备方法和应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
TA01 Transfer of patent application right
TA01 Transfer of patent application right

Effective date of registration: 20210817

Address after: 201203 Room 203, part 102, building 6, No. 393421 Newton Road, China (Shanghai) pilot Free Trade Zone, Pudong New Area, Shanghai

Applicant after: Green Valley (Shanghai) Pharmaceutical Technology Co.,Ltd.

Address before: 201203, 421, Newton Road, Zhangjiang hi tech park, Shanghai, Pudong New Area

Applicant before: SHANGHAI GREEN VALLEY PHARMACEUTICAL Co.,Ltd.

GR01 Patent grant
GR01 Patent grant