CN110698522A - 一种软骨素奇数寡糖单体及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种软骨素奇数寡糖单体及其制备方法和应用，其制备方法包括：将硫酸软骨素脱去硫酸基后再用稀酸溶液或氢型阳离子交换树脂降解，沉淀浓缩后得到干燥软骨素寡糖混合物，最后用凝胶色谱柱分离制备得到不同聚合度的奇数寡糖单体。本发明一次分离可制备高纯度聚合度为3～17的软骨素奇数寡糖单体，为软骨素奇数寡糖的制备填补了空白，且产品，结构新颖，性质稳定，生产成本低，无污染，制备工艺简单，极大的简化了工艺操作，提高了寡糖单体制备的效率，易于产业化。本发明的软骨素奇数寡糖单体可用于制备寡糖标准试剂，或作为中间体进一步制备成各种衍生物，用作寡糖保健品或寡糖药物，使其功能和活性得到广泛的开发利用。单，极大的简化了工艺操作，提高了寡糖单体制备的效率，易于产业化。本发明的软骨素奇数寡糖单体可用于制备寡糖标准试剂，或作为中间体进一步制备成各种衍生物，用作寡糖保健品或寡糖药物，使其功能和活性得到广泛的开发利用。

Description

一种软骨素奇数寡糖单体及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种软骨素奇数寡糖单体及其制备方法和应用。
背景技术
硫酸软骨素是一类广泛存在于细胞外基质中的蛋白聚糖，在动物软骨、腱、韧带和主动脉中含量丰富，其二糖重复单元主要由糖醛酸(葡萄糖醛酸GlcA或艾杜糖醛酸IdoA)和N-乙酰氨基半乳糖(GalNAc)通过β(1→3)和β(1→4)糖苷键连接构成，同时含有不同位置取代和含量的硫酸基。根据硫酸软骨素的结构特点，通常将天然硫酸软骨素分为硫酸软骨素A、B、C、D、E、F、H、K和L等。在GalNAc中的C-4或C-6位常发生硫酸化取代，生成4-硫酸软骨素(软骨素A，CSA)和6-硫酸软骨素(软骨素C，CSC)。不同或相同生物的不同组织中硫酸软骨素的种类和数量均存在差异，因此使得生物活性复杂多样，其中陆生动物组织主要含有CSA与CSC，而海洋生物中除了CSA与CSC外，还有CSD与CSE等。硫酸软骨素具有明显的降血脂、抗病毒、抗肿瘤、抗凝、抗动脉粥样硬化和抗病毒性肝炎等生物活性，目前临床上将其用于防治肾炎、神经痛、关节炎及偏头痛等疾病，并作为安全有效的保健食品和药品在世界范围内得到广泛使用。
研究发现，大分子量硫酸软骨素具有分子结构复杂，组织吸收受限，构效关系研究难度较大的特点，因此，近年来低分子量硫酸软骨素及硫酸软骨素寡糖的研究备受关注。研究者发展了不同制备硫酸软骨素寡糖的方法，最主要的制备方法为酶解法，即使用不同的硫酸软骨素酶或透明质酸酶降解大分子硫酸软骨素，其所得产物多为饱和或者非还原端含有双键的偶数寡糖。例如，中国专利申请(公布号：CN102676613A)公开了通过透明质酸酶制备硫酸软骨素二、四、六糖的方法；中国专利申请(公布号：CN108070627A)公开了通过硫酸软骨AC酶降解制备硫酸软骨素四糖的方法，上述通过酶解制备的硫酸软骨素寡糖均为均为硫酸化的软骨素寡糖，并且这些报道制备的寡糖聚合度均较小。也有使用化学合成的方法来制备硫酸软骨素寡糖的，比如中国专利申请(公布号：CN110041383A)就公开了一种通过化学合成法制备出的硫酸软骨素偶数寡糖，但该制备过程涉及多步操作，过程复杂且成本较高。至今，通过简单的化学降解工艺来大量制备结构明确、非硫酸化的奇数软骨素寡糖的方法仍未见报道。
另有研究表明，寡糖聚合度的大小、末端结构对于活性蛋白等分子的结合非常重要，且寡糖分子中是否含有硫酸基以及硫酸基取代度大小、取代位置对分子活性的影响也很大。因此，制备结构新颖、聚合度明确的非硫酸化软骨素寡糖对于硫酸软骨素寡糖的结构与活性关系的相关研究具有重要的意义。
发明内容
针对目前非硫酸化软骨素寡糖单体制备中存在的问题，本发明的目的在于提供一种软骨素奇数寡糖单体及其制备方法和应用。本发明采用稀酸或固相酸水解，结合低压凝胶色谱制备出非硫酸化的奇数聚合度的新软骨素寡糖，所得产品结构明确、无杂质残留，制备工艺简单，适宜于产业化生产。
为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案予以实现：
本发明提供了一种软骨素奇数寡糖单体，其结构式如下所示：
Figure BDA0002207131070000021
其中所述n＝0～7，所述R为氢离子、铵根离子或金属离子。
本发明还提供了所述软骨素奇数寡糖单体的制备方法，其包含以下步骤：
(1)软骨素的制备：将硫酸软骨素溶解在体积比为8～10∶1的无水二甲基亚砜和无水吡啶中，再加入体积比为1∶1苯丙四甲酸和三氧化二锑，在氮气保护下100～130℃反应2～3h，冷却后加入碳酸氢钠水溶液终止反应，反应物经透析，减压浓缩后冷冻干燥获得脱去硫酸基团的大分子量软骨素；
(2)酸降解：取步骤(1)的大分子量软骨素完全溶解在水中，再加入稀酸溶液进行水解反应或加入氢型阳离子交换树脂进行水浴反应，反应液冷却至室温后用碱性溶液调节pH值至6.5～7.5，再加入有机溶剂进行沉淀，离心后的上清液进行减压浓缩后得到干燥软骨素寡糖混合物；
(3)凝胶柱分离：取步骤(2)的干燥软骨素寡糖混合物完全溶解在水中，用凝胶色谱柱进行分离，用盐溶液洗脱，示差检测器在线检测，按照洗脱峰收集浓缩后冷冻干燥，获得所述软骨素奇数寡糖单体。
进一步的，所述步骤(1)中无水二甲基亚砜和无水吡啶的体积比为8～10∶1。
进一步的，所述步骤(1)中苯丙四甲酸和三氧化二锑的体积比为1∶1。
进一步的，所述步骤(2)中加入的稀酸溶液的体积用量为软骨素质量的5～20倍(本发明中稀酸溶液的体积单位为mL，软骨素的质量单位为g)；所述稀酸溶液为盐酸、硫酸、硝酸、醋酸、甲酸、草酸、柠檬酸和三氟乙酸中的至少一种。
进一步的，所述步骤(2)中加入的氢型阳离子交换树脂与软骨素的质量比为1～20∶1；所述氢型阳离子交换树脂为732、717、734、D001、D002和D61型强阳离子交换树脂中的至少一种。
进一步的，所述步骤(2)中的稀酸溶液的水解反应温度为40℃～100℃，水解反应时间为0.5h～5h。
进一步的，所述步骤(2)中的氢型阳离子交换树脂的水浴反应温度为50℃～90℃，水浴反应时间为1h～8h。
进一步的，所述步骤(2)中的碱性溶液为氨水、氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠和碳酸氢钠中的至少一种；所述有机溶剂为甲醇、无水乙醇、丙酮和异丙醇中的至少一种；所述有机溶剂与反应液的体积比为3～7∶1。
进一步的，所述步骤(3)中的凝胶色谱柱为Bio Gel P4、Superdex 30，Bio GelP10、Bio Gel P6和Bio Gel P2中的至少一种；所述盐溶液为乙酸铵、水和碳酸氢铵中的至少一种。
本发明还提供了所述的软骨素奇数寡糖单体在用于制备寡糖标准试剂中的应用。
本发明还提供了所述的软骨素奇数寡糖单体在制备用于寡糖保健品中的添加剂的应用。
与现有技术相比，本发明的优点和积极效果是：
(1)本发明制备的软骨素寡糖聚合度均为奇数，填补了软骨素奇数寡糖制备的空白，所制备的寡糖还原端与非还原端均为GlcA，对软骨素寡糖及硫酸软骨素寡糖构效关系的研究具有明显的优势。
(2)本发明制备的软骨素奇数寡糖单体结构新颖，性质稳定，可用于制备寡糖标准试剂，或作为中间体进一步制备成各种衍生物，用作寡糖保健品或寡糖药物，用途广泛。
(3)本发明采用凝胶柱色谱分离制备软骨素寡糖单体，一次分离即可获得聚合度3～17的软骨素奇数寡糖单体，极大的简化了工艺操作，提高了寡糖单体制备的效率。
(4)本发明采用碳酸氢铵、醋酸铵等盐溶液为洗脱液分离制备软骨素奇数寡糖单体，所获寡糖单体经过反复减压浓缩或冷冻干燥即可除去流动相中的挥发盐，克服了寡糖单体脱盐困难的问题，提高了产品的品质。
(5)本发明提供的软骨素奇数寡糖单体具有制备工艺简单，无害，无污染，容易产业化的特点。
附图说明
图1为本发明制备软骨素奇数寡糖单体的低压凝胶柱色谱分离图。
图2为本发明制备软骨素三糖的ESI/MS质谱图和结构式。
图3为本发明制备软骨素五糖的ESI/MS质谱图和结构式。
图4为本发明制备软骨素七糖的ESI/MS质谱图和结构式。
图5为本发明制备软骨素九糖的ESI/MS质谱图和结构式。
图6为本发明制备软骨素十一糖的ESI/MS质谱图和结构式。
图7为本发明制备软骨素十三糖的ESI/MS质谱图和结构式。
图8为本发明制备软骨素十五糖的ESI/MS质谱图和结构式。
图9为本发明制备软骨素十七糖的ESI/MS质谱图和结构式。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明的技术方案进一步的详细说明。
本发明通过对硫酸软骨素采用稀酸或固相酸降解的方法，结合低压凝胶色谱一次分离制备获得系列非硫酸化软骨素奇数寡糖单体，其结构式如下所示：
Figure BDA0002207131070000041
其中所述n＝0～7，所述R为氢离子、铵根离子或钠、钾等金属离子。
实施例1：软骨素奇数寡糖单体的稀酸降解制备
本实施例所述软骨素奇数寡糖单体的稀酸降解制备方法包括以下步骤：
1、将5g硫酸软骨素A加入干燥的圆底烧瓶中，加入4.5L无水二甲基亚砜和500mL无水吡啶，磁力搅拌器搅拌溶解，再加入5g苯丙四甲酸和5g三氧化二锑，氮气保护下在120℃反应3h，冷却后加入碳酸氢钠水溶液终止反应，反应物经透析，减压浓缩后冷冻干燥获得脱去硫酸基团的大分子量软骨素。
2、取步骤(1)的大分子量软骨素2g加入100mL蒸馏水，加热搅拌使其完全溶解，加盐酸使其终浓度达到0.01mol/L～2mol/L，于40℃～100℃水浴搅拌水解0.5h～5h，反应结束后将反应液冷却至室温，用氨水调节溶液pH值至6.5～7.5，加入5倍体积甲醇，静置后5000转离心10分钟，上清液减压真空浓缩，冷冻干燥后得软骨素寡糖混合物。
3、取步骤(2)软骨素寡糖混合物加水溶解，用Bio Gel P4凝胶色谱柱分离，以0.1mol/L乙酸铵为洗脱液，以0.2mL/min洗脱，示差检测器在线检测，根据洗脱峰合并收集组分，减压浓缩后冷冻干燥，获得不同聚合度软骨素寡糖单体。
本实施例所述的盐酸可改用硫酸、硝酸、醋酸、甲酸、草酸、柠檬酸或三氟乙酸等；所述的氨水可改用氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠或碳酸氢钠；所述的甲醇可改用乙醇、丙酮或异丙醇；所述的Bio Gel P4填料可改用Superdex 30，Bio Gel P10、Bio Gel P6或BioGel P2；所述的0.1mol/L乙酸铵洗脱液可改用水或0.05mol/L～0.5mol/L碳酸氢铵；所述方法中选用酸的浓度、反应温度和时间会影响产品的分子量分布及得率。
实施例2：软骨素奇数寡糖单体的固相酸降解制备
本实施例所述软骨素奇数寡糖单体的固相酸降解制备方法包括以下步骤：
1、将10g硫酸软骨素C加入干燥的圆底烧瓶中，加入9L无水二甲基亚砜和1L无水吡啶，磁力搅拌器搅拌溶解，再加入10g苯丙四甲酸和10g三氧化二锑，氮气保护下在120℃反应3h，冷却后加入碳酸氢钠水溶液终止反应，反应物经透析，减压浓缩后冷冻干燥获得脱去硫酸基团的大分子量软骨素。
2、将5g步骤上述的大分子量软骨素加入100mL蒸馏水中完全溶解，再加入100g732型强阳离子交换树脂，于50℃～90℃水浴反应1h～8h，减压抽滤，滤液冷却后用氢氧化钠调节溶液pH值至6.5～7.5，加入5倍体积无水乙醇后过夜，4000转离心10分钟，上清液减压真空浓缩，冷冻干燥软骨素寡糖混合物。
3、取所述干燥软骨素寡糖混合物加水溶解后用Superdex 30凝胶色谱柱进行分离，以0.2mol/L碳酸氢铵为洗脱液，示差检测器在线检测，根据洗脱峰合并收集相同组分，分别减压浓缩后冷冻干燥获得不同聚合度软骨素寡糖单体。
本实施例中所述的732型强阳离子交换树脂可改用717、734、D001、D002或D61型阳离子交换树脂；所述的氢氧化钠可改用氢氧化钾、碳酸钠、碳酸氢钠或氢氧化铵；所述的无水乙醇可改用甲醇、丙酮或异丙醇；所述的Superdex 30凝胶填料可改用Bio Gel P10、BioGel P6、Bio Gel P4或Bio Gel P2；所述的洗脱液0.2mol/L碳酸氢铵可改用水或0.05mol/L-0.5mol/L乙酸铵；方法中加入强阳离子交换树脂的量、反应温度及时间会影响产品的分子量分布及得率。
如图1所示，采用Superdex 30填料可以将聚合度为3～17的所有奇数软骨素寡糖进行良好分离，Bio Gel P10、Bio Gel P6、Bio Gel P4或Bio Gel P2可以得到类似的分离结果。
如图2所示，质荷比(m/z)572.15处为[M-H]-峰，594.13处为[M-H+Na]-峰，经计算分子量(Mw)＝573.15，为软骨素三糖实测分子量，与其理论分子量573.15道尔顿一致，是由2个GlcA和1个N-乙酰氨基半乳糖(GalNAc)组成，其结构序列为GlcAβ1-3GalNAcβ1-4GlcA。
如图3所示，质荷比475.13处为[M-2H]2-峰，486.11处为[M-2H+Na]2-峰，经计算Mr＝952.26，为软骨素五糖实测分子量，与其理论分子量952.26道尔顿一致，是由3个GlcA和2个GalNAc组成，其结构序列为GlcAβ1-3GalNAcβ1-4GlcAβ1-3GalNAcβ1-4GlcA。
如图4所示，质荷比664.68处为[M-2H]2-峰，675.67处为[M-2H+Na]2-峰，442.79处为[M-3H]3-峰，经计算Mr＝1331.36，为软骨素七糖实测分子量，与其理论分子量1331.37道尔顿一致，是由4个GlcA和3个GalNAc组成，其结构序列为GlcAβ1-3GalNAcβ1-[4GlcAβ1-3GalNAcβ1]2-4GlcA。
如图5所示，质荷比854.24处为[M-2H]2-峰，569.16处为[M-3H]3-峰，426.61处为[M-4H]4-峰，经计算Mr＝1710.48，为软骨素九糖实测分子量，与其理论分子量1710.49道尔顿相符，是由5个GlcA和4个GalNAc组成，其结构序列为GlcAβ1-3GalNAcβ1-[4GlcAβ1-3GalNAcβ4]3-4GlcA。
如图6所示，质荷比1043.79处为[M-2H]2-峰，695.53处为[M-3H]3-峰，521.39处为[M-4H]4-峰，经计算Mr＝2089.58，为软骨素十一糖实测分子量，与其理论分子量2089.60道尔顿相符，是由6个GlcA和5个GalNAc组成，其结构序列为GlcAβ1-3GalNAcβ1-[4GlcAβ1-3GalNAcβ1]4-4GlcA。
如图7所示，质荷比822.23处为[M-3H]3-峰，616.17处为[M-4H]4-峰，经计算Mr＝2468.69，为软骨素十三糖实测分子量，与其理论分子量2468.71道尔顿相符，是由7个GlcA和6个GalNAc组成，其结构序列为GlcAβ1-3GalNAcβ1-[4GlcAβ1-3GalNAcβ1]5-4GlcA。
如图8所示，质荷比948.60处为[M-3H]3-峰，568.76处为[M-5H]5-峰，经计算Mr＝2848.80，为软骨素十五糖实测分子量，与其理论分子量2847.82道尔顿相符，是由8个GlcA和7个GalNAc组成，其结构序列为GlcAβ1-3GalNAcβ1-[4GlcAβ1-3GalNAcβ1]6-4GlcA。
如图9所示，质荷比1074.97处为[M-3H]3-峰，805.98处为[M-4H]4-峰，经计算Mr＝3227.91，为软骨素十七糖实测分子量，与其理论分子量3226.93道尔顿相符，是由9个GlcA和8个GalNAc组成，其结构序列为GlcAβ1-3GalNAcβ1-[4GlcAβ1-4GalNAcβ1]7-4GlcA。
本发明利用酸降解大分子量软骨素并结合凝胶柱色谱分离获得了系列软骨素奇数寡糖单体，结构新颖，性质稳定，可用于制备寡糖标准试剂，或作为中间体进一步制备成各种衍生物，用作寡糖保健品或寡糖药物；其制备方法工艺简单，绿色环保，成本低，容易产业化生产。
本发明所制备的软骨素奇数寡糖单体由N-乙酰氨基半乳糖和葡萄糖醛酸组成，还原端和非还原端均为饱和的葡萄糖醛酸(GIcA)或其金属盐，即所有寡糖单体均具有[GlcAβ1-3GalNAcβ1]n-4GlcA的重复结构特点，其结构与软骨素酶或透明质酸酶降解制备的偶数软骨素寡糖结构([GlcAβ1-3GalNAc4S/6S]n)，或采用软骨素酶或透明质酸酶制备的软骨素偶数寡糖结构(ΔGlcAβ1-[3GalNAc4S/6Sβ1-4GlcAβ1]n-3GalNAc4S/6S，其中ΔGlcA为不饱和葡萄糖醛酸)明显不同，这些结构新颖的寡糖化合物，不仅丰富了寡糖结构的多样性，而且对于开展不同结构类型软骨素寡糖与疾病的发生、发展的关系等具有十分重要的意义。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；或者利用本寡糖进行硫酸化、乙酰化、甲基化、磷酸化等修饰，而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。

Claims (10)

1.一种软骨素奇数寡糖单体，其特征在于，所述软骨素奇数寡糖单体的结构式如下所示：
Figure FDA0002207131060000011
其中所述n＝0～7，所述R为氢离子、铵根离子或金属离子。
2.权利要求1所述的软骨素奇数寡糖单体的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
(1)软骨素的制备：将硫酸软骨素溶解在无水二甲基亚砜和无水吡啶中，再加入苯丙四甲酸和三氧化二锑，在氮气保护下100～130℃反应2～3h，冷却后加入碳酸氢钠水溶液终止反应，反应物经透析，减压浓缩后冷冻干燥获得脱去硫酸基团的大分子量软骨素；
(2)酸降解：取步骤(1)的大分子量软骨素完全溶解在水中，再加入稀酸溶液进行水解反应或加入氢型阳离子交换树脂进行水浴反应，反应液冷却至室温后用碱性溶液调节pH值至6.5～7.5，再加入有机溶剂进行沉淀，离心后的上清液进行减压浓缩后得到干燥软骨素寡糖混合物；
(3)凝胶柱分离：取步骤(2)的干燥软骨素寡糖混合物完全溶解在水中，用凝胶色谱柱进行分离，用盐溶液洗脱，示差检测器在线检测，按照洗脱峰收集浓缩后冷冻干燥，获得所述软骨素奇数寡糖单体。
3.根据权利要求2所述的软骨素奇数寡糖单体的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中加入的稀酸溶液的体积用量为软骨素质量的5～20倍；所述稀酸溶液为盐酸、硫酸、硝酸、醋酸、甲酸、草酸、柠檬酸和三氟乙酸中的至少一种。
4.根据权利要求2所述的软骨素奇数寡糖单体的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中加入的氢型阳离子交换树脂与软骨素的质量比为1～20∶1；所述氢型阳离子交换树脂为732、717、734、D001、D002和D61型强阳离子交换树脂中的至少一种。
5.根据权利要求2所述的软骨素奇数寡糖单体的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中的稀酸溶液的水解反应温度为40℃～100℃，水解反应时间为0.5h～5h。
6.根据权利要求2所述的软骨素奇数寡糖单体的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中的氢型阳离子交换树脂的水浴反应温度为50℃～90℃，水浴反应时间为1h～8h。
7.根据权利要求2所述的软骨素奇数寡糖单体的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中的碱性溶液为氨水、氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠和碳酸氢钠中的至少一种；所述有机溶剂为甲醇、无水乙醇、丙酮和异丙醇中的至少一种；所述有机溶剂与反应液的体积比为3～7∶1。
8.根据权利要求2所述的软骨素奇数寡糖单体的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中的凝胶色谱柱为Bio Gel P4、Superdex 30，Bio Gel P10、Bio Gel P6和Bio Gel P2中的至少一种；所述盐溶液为乙酸铵、水和碳酸氢铵中的至少一种。
9.权利要求1所述的软骨素奇数寡糖单体在用于制备寡糖标准试剂中的应用。
10.权利要求1所述的软骨素奇数寡糖单体在制备用于寡糖保健品中的添加剂的应用。
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