CN112336876A - 用于识别阿尔茨海默病患者中的糖类药物敏感性患者的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及阿尔茨海默病患者中的糖类药物敏感性患者的识别。本发明提供了用于识别阿尔茨海默病患者中的糖类药物敏感性患者的方法。

Description

用于识别阿尔茨海默病患者中的糖类药物敏感性患者的方法
技术领域
本发明涉及阿尔茨海默病患者中的糖类药物敏感性患者的识别。更具体地，本发明涉及利用脑-肠轴关联以识别阿尔茨海默病患者中的糖类药物敏感性患者。
背景技术
阿尔茨海默病(AD)是一种起病隐匿的进行性发展的神经系统退行性疾病。临床上以记忆障碍、失语、失用、失认、视空间技能损害、执行功能障碍以及人格和行为改变等全面性痴呆表现为特征。阿尔茨海默病的两个病理特点是细胞外β-淀粉样蛋白沉积(老年斑)，和细胞内神经原纤维缠结(双螺旋丝)。β-淀粉样蛋白沉积和神经原纤维缠结导致突触和神经元的损失，这导致在大脑的受损区域的严重萎缩，典型地始于颞叶。由β-淀粉样蛋白肽和神经原纤维缠结导致这种损害的机制还没有被完全理解。
中国科学院药物创新研究院/上海药物研究所研究员耿美玉带领科研团队研发的甘露糖醛酸寡糖是具有我国自主知识产权的新型口服抗阿尔茨海默病(AD)创新药物。2018年7月17日，临床III期揭盲试验结果显示，甘露糖醛酸寡糖在认知功能改善的主要疗效指标上达到预期，具有极显著的统计学意义和临床意义，且不良反应事件发生率与安慰剂组相当，安全性好，适合长期服用。甘露糖醛酸寡糖成为16年来全球AD治疗领域首个在临床III期试验中获得成功的药物。
关于甘露糖醛酸寡糖，已经提交了多件相关中国专利。CN2017114675966描述了甘露糖醛二酸的组合物。CN2016100697039描述了低聚甘露糖醛二酸的制备方法。CN2018107134113描述了甘露糖醛二酸的组合物在治疗帕金森氏症中的应用。CN2015104243401描述了还原端1位为羧基的甘露糖醛酸寡糖及其衍生物在治疗帕金森氏症中的应用。这些专利通过引用以其全文并入本文。
Figure BDA0002157022740000021
本领域需要用于识别阿尔茨海默病患者中的糖类药物敏感性患者的方法。
发明内容
在本发明中，发明人提供了AD进展中肠道微生物区系生态失调与神经炎症之间的因果关系。具体地，肠道微生物区系组成的变化可导致菌群代谢物—如苯丙氨基酸和异亮氨酸的外周积聚，其促进AD进展中外周促炎型—1型T辅助(Th1)细胞的增殖和分化。外周免疫细胞向大脑浸润并增强神经炎症。重要的是，外周血中如苯丙氨基酸和异亮氨酸的升高在两个独立的AD导致的轻度认知障碍(MCI)患者队列中得到确认。发明人还显示，在中国的III期临床试验中表现出可靠和一致的认知改善的甘露糖醛酸寡糖重塑肠道菌群平衡，降低血液中菌群氨基酸代谢物的积聚，抑制神经炎症。总的来说，发明人的发现突出了肠道生态失调促进的神经炎症在AD进展中的作用，并提出了通过脑-肠轴识别阿尔茨海默病患者中的糖类药物敏感性患者的新策略。
在一个方面，本发明提供了用于抑制哺乳动物外周血中初始T细胞摄取氨基酸的试剂在制备用于在受试者中治疗阿尔茨海默病的药物中的用途。
在另一个方面，本发明提供了一种用于在受试者中治疗阿尔茨海默病的药物组合物，所述药物组合物包含有效量的用于抑制哺乳动物外周血中初始T细胞摄取氨基酸的试剂。
在又一个方面，本发明提供了一种用于筛选可用于治疗阿尔茨海默病的候选药物的方法，其包括：
a)向具有转运体SLC7A5的体内或体外模型施用测试试剂，和
b)选择抑制所述转运体SLC7A5的测试试剂作为所述可用于治疗阿尔茨海默病的候选药物。
在又一个方面，本发明提供了一种治疗阿尔茨海默病患者的方法，其包括：
向所述患者施用用于抑制哺乳动物外周血中初始T细胞摄取氨基酸的试剂以调节所述患者的促炎型Th1细胞占CD4+T细胞的比例以使其接近或达到相应正常群体的相应促炎型Th1细胞占CD4+T细胞的比例。
在又一个方面，本发明提供了一种治疗阿尔茨海默病患者的方法，其包括：
向所述患者施用用于抑制哺乳动物外周血中初始T细胞摄取氨基酸的试剂以调节所述患者的初始T细胞对所述氨基酸的相对摄取水平以使其接近或达到相应正常群体的相应初始T细胞对所述氨基酸的相对摄取水平。
附图说明
图1.5XFAD转基因(Tg)小鼠中疾病进展期间的肠道生态失调和免疫细胞变化。
(a)在2、3、5、7和9个月在5XFAD转基因(Tg)小鼠中，以及在2个月在野生型(WT)小鼠中，海马中突触素的相对RNA表达水平的变化(n＝5-12)数据表示为相对于肌动蛋白表达水平的平均值±平均值标准偏差(mean±sem)。*P<0.05，**P<0.01，单因素方差分析(F(5,43)＝2.952)。
(b)在评估5XFAD转基因(Tg)小鼠在2、3、5、7和9个月时以及野生型(WT)小鼠在2个月时的辨别学习能力的测试中，达到80％成功所花费的以104秒计的时间的变化(参见方法)(n＝4-8)。数据表示为平均值±平均值标准偏差(mean±sem)。*P<0.05，学生t检验。s，秒。
(c)WT和5XFAD转基因(Tg)小鼠的肠道微生物组组成在不同时间点在操作分类单位(OTU)水平上的主成分分析(PCA)(n＝4-10)。点的形状和颜色表示来自不同月份来自每个个体的样品。彩色椭圆表示每个测试组内的0.95置信区间(CI)范围。M，月。
(d)在不同月份的5XFAD转基因(Tg)小鼠的肠道微生物组中，存在于总体群体的至少10％中的操作分类单位(OTU)的相对丰度变化，在流图上在门水平上着色)(n＝4-10)。在图上标注两个最丰富的门，拟杆菌门(Bacteroidetes)和厚壁菌门(Firmicutes)。颜色表示肠道微生物区系中的不同门。
(e)IBA1免疫荧光染色的阳性密度的变化，反映5XFAD转基因(Tg)小鼠在2、3、5、7和9个月海马中的小胶质细胞激活相对于2月龄野生型(WT)小鼠的值)(n＝2-7)。数据表示为平均值±平均值标准偏差(mean±sem)；线用三次样条曲线拟合。Y轴的IBA1数值为每个时间点转基因动物的荧光染色表达量相对于同一时间点野生型动物荧光染色表达量的相对值。
(f)在2、3、5、7和9个月在5XFAD转基因(Tg)小鼠的全脑匀浆中检测到的激活的M1和M2型小胶质细胞的变化)(n＝4-8)。通过流式细胞术检测M1型小胶质细胞(CD45lowCD11b+CX3CR1+Siglec-H+F4/80+CD86+)和M2型小胶质细胞(CD45lowCD11b+CX3CR1+Siglec-H+F4/80+CD206+)，并且它们的细胞计数是相对于CD45lowCD11b+细胞的频率呈现。红点和线：M1型小胶质细胞。绿点和线：M2型小胶质细胞。数据表示为平均值±平均值标准偏差(mean±sem)；线用三次样条曲线拟合。
(g)如通过流式细胞术检测的，在不同时间点在5XFAD转基因(Tg)小鼠(红点和线)和WT小鼠(黑点和线)的全脑匀浆中检测到的浸润性细胞(CD45high)的变化。(Tg小鼠：2月龄，n＝5；3月龄，n＝4；5月龄，n＝4；7月龄，n＝7；9月龄，n＝3。WT小鼠：n＝6。)细胞计数是相对于CD45+细胞的频率呈现，并格式化为平均值±平均值标准偏差(mean±sem)。线用三次样条曲线拟合。
(h)在不同时间点在5XFAD转基因(Tg)小鼠中CD45high细胞的变化(n＝4-8)。在条形图上，细胞计数是相对于CD45high细胞的频率呈现。颜色表示CD45high细胞的不同亚型：Neu，中性粒细胞；DC，树突状细胞；NK，自然杀伤细胞；Mo/Mφ：单核细胞和巨噬细胞；B，B细胞；其他，未分类的细胞。
(i)如通过流式细胞术检测的，在2、3、5、7和9个月在5XFAD转基因(Tg)小鼠(红点和线)的全脑匀浆中检测到的浸润性CD4T细胞(CD45highCD4+)的变化(n＝4-8)。细胞计数是相对于CD45high细胞的频率呈现，并格式化为平均值±平均值标准偏差(mean±sem)。线用三次样条曲线拟合。
(j)在2、3、5、7和9个月时在5XFAD转基因(Tg)小鼠的全脑匀浆中检测到的浸润性外周Th1和Th2细胞的变化(n＝4-8)。通过流式细胞术检测Th1细胞(CD45highCD4+CXCR3+CCR6-)和Th2细胞(CD45highCD4+CXCR3-CCR6-CCR4+)，并且相对于CD45highCD4+T细胞的频率呈现。红点和线：Th1细胞。绿点和线：Th2细胞。数据表示为平均值±平均值标准偏差(mean±sem)。线用三次样条曲线拟合。
(k)在早期(2-3个月)或晚期(7-9个月)分别在Th2/M2相关阶段和Th1/M1相关阶段期间的大脑淋巴细胞与肠道微生物区系(种水平)的相关性分析(左图)(n＝4-8)。所有与5XFAD小鼠的大脑淋巴细胞计数显著相关的细菌列于右侧小图中。带有黄色星号(*)的红色(正相关)或蓝色(负相关)方块表示通过Pearson相关系数测量的P值<0.05的显著相关性。
图2.肠道微生物区系是免疫细胞浸润和小胶质细胞激活所需要的。
(a)经口强饲抗生素3个月对7月龄的5XFAD转基因(Tg)小鼠中的肠道微生物的相对丰度的影响(n＝6-7)。ABX，由氨苄青霉素(0.1mg/mL)、链霉素(0.5mg/mL)和粘菌素(0.1mg/mL)组成的混合抗生素混合物。不同属的肠道微生物用不同的颜色表示，它们相对丰度的变化在条形图上呈现。
(b-c)口服强饲抗生素3个月对7月龄的5XFAD转基因(Tg)小鼠的大脑匀浆中Th1细胞(b)和M1型小胶质细胞(c)的频率的影响。Th1细胞(CD45highCD4+CXCR3+CCR6-)的细胞计数是相对于CD45highCD4+T细胞的频率呈现(b)，而M1型小胶质细胞(CD45lowCD11b+CX3CR1+Siglec-H+F4/80+CD86+)的细胞计数是相对于CD45lowCD11b+细胞的频率呈现(c)。两者均通过流式细胞术检测。数据表示为平均值±平均值标准偏差(mean±sem)。
(d)共同居住的WT，WT和5XFAD转基因(Tg)小鼠(n＝6-7)中肠道微生物在属水平上的相对丰度。所有三组小鼠都是7月龄。不同的颜色代表不同的属。共同居住的WT：与Tg小鼠一同居住的WT小鼠。
(e-f)7月龄的共同居住的WT，WT和5XFAD转基因(Tg)小鼠(n＝6-7)在7个月时大脑匀浆中Th1细胞(e)和M1型小胶质细胞(f)的频率变化。Th1细胞(CD45highCD4+CXCR3+CCR6-)是相对于CD45highCD4+T细胞的频率呈现(e)，而M1型小胶质细胞(CD45lowCD11b+CX3CR1+Siglec-H+F4/80+CD86+)的频率是相对于CD45lowCD11b+细胞的频率呈现(f)。两者均通过流式细胞术检测。数据表示为平均值±平均值标准偏差(mean±sem)。**P<0.01，*P<0.05学生t检验。
(g)7月龄的WT，共同居住的WT和5XFAD转基因(Tg)小鼠(n＝6-7)的大脑匀浆中细胞因子蛋白的水平，如通过细胞因子抗体阵列检测的。所有三组小鼠都是7月龄。热图中的颜色表示通过Row Z-Score标准化的相对细胞因子水平；红色表示上调的细胞因子，蓝色表示下调的细胞因子。
图3.OM1对APP/PS1小鼠模型的行为变化的影响
(a)OM1的结构。OM1是酸性线性寡糖的混合物，其聚合度范围为二聚体至十聚体，平均分子量为约1kDa。
(b)Morris Water Maze(MWM)测试的逃避潜伏时间结果作为APP/PS1小鼠的空间学习和记忆的量度。将9月龄的APP/PS1小鼠用50mpk和100mpk的OM1处理3个月直至12月龄。然后，空间学习和记忆能力的MWM测试另外进行6天，在该测试期间，连续施用OM1。将逃避潜伏时间开始(秒)测量为测试的最终读出之一(参见方法)。更高的逃避潜伏时间显示这些小鼠将花费更多时间来达到目标，这指示更严重受损的空间学习和记忆能力。(n＝11-14)。数据表示为平均值±平均值标准偏差(mean±sem)。黑色星号表示WT与APP/PS1组之间的比较。蓝色星号表示OM1(100mpk)处理与APP/PS1组之间的比较。*P<0.05，***P<0.001，双因素方差分析。
(c)MWM测试的平台区域穿梭(platform-site crossover)结果的次数作为APP/PS1小鼠的空间学习和记忆的量度。将9月龄的APP/PS1小鼠用50mpk和100mpk的OM1处理3个月直至12月龄。然后，空间学习和记忆能力的MWM测试进行另外6天，在该测试期间，连续施用OM1。平台区域穿梭的次数测量为测试的其他读出(参见方法)。更多次数的平台区域穿梭指示较不严重受损的空间学习和记忆能力。(n＝11-17)。*P<0.05，***P<0.001，单因素方差分析(F(3,55)＝6.542)。
(d)APP/PS1小鼠中使用Y迷宫测试的空间工作记忆的准确度。将9月龄的APP/PS1小鼠用50mpk和100mpk的OM1处理3个月直至12月龄。然后进行Y迷宫测试，在该测试期间，连续施用OM1。Y迷宫的准确度是正确进臂次数和总进臂次数之间的比率(参见方法)。更高的准确度指示较少严重受损的工作记忆能力。(n＝17-20)。数据表示为平均值±平均值标准偏差(mean±sem)。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，单因素方差分析(F(3,71)＝12.39)。
图4.OM1通过修复肠道微生物区系来减轻神经炎症。
(a)基于7月龄的5XFAD(Tg)小鼠和经OM1处理的Tg小鼠的Bray-Curtis距离，肠道微生物组组成在操作分类单位(OTU)水平上的主坐标分析(PCoA)(n＝7)。点的形状和颜色表示来自每个个体的样品。彩色椭圆表示每个测试组内的0.95置信区间(CI)范围。PC，主成分。
(b)7月龄的5XFAD(Tg)小鼠和经OM1处理的Tg小鼠(n＝17)在种水平上的肠道微生物区系变化的热图。热图上的颜色表示通过Row Z-Score标准化的肠道微生物区系的相对丰度；红色表示上调的细菌，蓝色表示下调的细菌。
(c)在7月龄的5XFAD(Tg)小鼠口服强饲OM1之前(左)和之后(右)，肠道微生物组(以蓝色圆圈旁边的数字指定)与大脑淋巴细胞(彩色圆圈)之间的相关性联系的变化。右侧列出了每个肠道微生物组的名称。
(d)OM1处理对7月龄的5XFAD(Tg)小鼠的大脑Th1细胞的频率的影响(n＝5-7)。通过流式细胞术检测，Th1细胞计数(CD45highCD4+CXCR3+CCR6-)是相对于CD45highCD4+T细胞计数呈现。数据表示为平均值±平均值标准偏差(mean±sem)。*P<0.05，***P<0.001，学生t检验。
(e)OM1处理对7月龄的5XFAD(Tg)小鼠的海马切片中检测到的IBA1免疫荧光染色的阳性信号密度的影响，反映了小胶质细胞的激活(n＝4-6)。数据表示为平均值±平均值标准偏差(mean±sem)。*P<0.05，单因素方差分析(F(2,15)＝21.94)。
(f)如通过细胞因子抗体阵列检测的，OM1处理对7月龄的5XFAD(Tg)小鼠的大脑匀浆中细胞因子蛋白的水平的影响(n＝5-6)。热图上的颜色表示通过Row Z-Score标准化的相对细胞因子水平；红色表示上调的细胞因子，蓝色表示下调的细胞因子。
(g-h)OM1对7月龄的5XFAD(Tg)小鼠的海马中Aβ阳性区域(g)和tau阳性区域(h)的影响，在大脑切片中评估(n＝4-7)。数据表示为平均值±平均值标准偏差(mean±sem)。Aβ分析：**P<0.01，*P<0.05(F(2,14)＝22.78)。tau分析：*P<0.05，***P<0.001(F(2,15)＝13.06)，单因素方差分析。
(i)在评估7月龄的5XFAD(Tg)小鼠的辨别学习能力的测试中，OM1对于获得80％成功所花费的以104秒计的时间(参见方法)的影响(n＝10-13)。花费的时间是指达到80％表现水平的时间(秒)；花费的时间越长，认知障碍越严重(参见方法)。***P<0.001，*P<0.05，(F(2,31)＝9.751)，单因素方差分析。
图5.OM1通过约束氨基酸代谢来抑制神经炎症。
(a)使用MBROLE，经OM1处理或未处理的7月龄的5XFAD(Tg)小鼠的31种粪便代谢物的途径富集分析(n＝6-8)。富集结果列表以KEGG模块和KEGG酶相互作用呈现，并使用P<0.05的标准筛选。
(b)使用随机森林分类(树木数量：500；预测因子数量：7；随机性：开启；参见方法)，在疾病进展期间可以区分WT(n＝30)和Tg(n＝26)小鼠的血液氨基酸列表。
(c)WT，Tg和经OM1处理的Tg小鼠(n＝6-11)的粪便中组氨酸、苯丙氨酸和异亮氨酸水平的变化。红色，上调；蓝色，下调。
(d)WT，Tg和经OM1处理的Tg小鼠(n＝6-7)的血液中组氨酸、苯丙氨酸和异亮氨酸水平的变化。红色，上调；蓝色，下调。
(e)OM1对苯丙氨酸和异亮氨酸诱导的初始CD4+T细胞(Th0细胞)向Th1细胞分化的影响。在苯丙氨酸(1mM)和异亮氨酸(1mM)存在下，将初始CD4+T细胞在有/无OM1的情况下培养3天。通过流式细胞术测试Th1(CD4+IFN-γ+)细胞的频率。数据表示为平均值±平均值标准偏差(mean±sem)；每组n＝3个重复。左，**P<0.01，*P<0.05，单因素方差分析(F(2,6)＝15.64)。右，**P<0.01，*P<0.05，单因素方差分析(F(2,6)＝10.35)。
(f)OM1对苯丙氨酸和异亮氨酸诱导的Th1细胞增殖的影响。将初始CD4+T细胞用CellTrace染色，并在苯丙氨酸(1mM)和异亮氨酸(1mM)存在下，在有/无OM1的情况下培养3天。通过流式细胞术测试Th1(CD4+IFN-γ+)细胞中CellTrace荧光的密度。数据表示为平均值±平均值标准偏差(mean±sem)，n＝3。*P<0.05，***P<0.0001，单因素方差分析(F(4,9)＝28.34)。
(g)腹膜内(i.p.)注射苯丙氨酸和异亮氨酸(n＝6)4天后的血液Th1细胞变化。***P<0.0001，单因素方差分析(F(2,21)＝101.8)。
(h)健康对照(HC)和AD导致的轻度认知障碍患者(MCI)的氨基酸变化的随机森林分类(第一队列，AD导致的MCI，n＝9；HC，n＝18)。
(i)健康对照(HC)和AD导致的轻度认知障碍患者(MCI)的血液中Th1细胞的频率(第一队列，AD导致的MCI，n＝8；HC，n＝9)。*P<0.05，学生t检验。纵坐标是Th1细胞/CD4+T细胞的百分比。
(j)健康对照(HC)和AD导致的轻度认知障碍患者(MCI)的血液中的苯丙氨酸和异亮氨酸水平(第二队列，两组均为n＝22)。*P<0.05(苯丙氨酸)，*P<0.05(异亮氨酸)，学生t检验。
图6.AD进展中神经炎症的示意图和干预策略。
在AD进展期间肠道微生物区系的变化导致紊乱的氨基酸代谢，其促进在血液中初始CD4T细胞分化成Th1细胞。同时，氨基酸和Th1细胞可以通过血液循环浸润到大脑中。外周免疫细胞浸润和小胶质细胞激活导致大脑中的病理性神经炎症，导致认知障碍。口服施用OM1可以修复肠道微生物区系，抑制氨基酸异常产生，并减少外周免疫细胞向大脑浸润，最终解决神经炎症。
图7
(a-b)5XFAD转基因(Tg)小鼠(2、3、5、7和9月龄)的海马切片中Aβ阳性区域(a)和磷酸化-tau(p-TAU)阳性区域(b)相对于2月龄的野生型(WT)小鼠的变化(n＝2-7)。呈现了代表性荧光图像；比例尺代表100μm。折线图总结了来自所有个体点的相对于WT小鼠的结果，并且表示为平均值±平均值标准偏差(mean±sem)。线用三次样条曲线拟合。M，月。
(c)来自WT和5XFAD转基因(Tg)小鼠(2、3、5、7和9月龄)的肠道微生物组组成在操作分类单位(OTU)水平上的主成分分析(PCA)的主成分(PC)1(n＝4-10)。红点和线，Tg小鼠；蓝点和线，WT小鼠。自然连接成线而不拟合。使用双尾Wilcoxon秩和(ranked-sum)检验；*表示与同组中的2月龄相比的显著性差异。*P<0.05，**P<0.01。#表示与年龄匹配的WT小鼠相比的显著性差异。#P<0.05；##P<0.01；###P<0.001。
(d)5XFAD转基因(Tg)小鼠(2、3、5、7和9月龄)的肠道微生物在科水平上的相对丰度的变化(n＝4-10)。不同的颜色代表不同的科。
(e)5XFAD转基因(Tg)小鼠(2、3、5、7和9月龄)的肠道微生物组组成的线性判别分析效应量(LEfSe)分析的分枝图(n＝4-10)。在每个月具有最高判别力的细菌在图上标注。颜色表示每个月富集的细菌类群。外圆到内圆表示不同分类级别(由外向内：门，纲，目，科，属)。M，月。疣微菌门(Verrucomicrobia)；α-变形杆菌纲(alphaproteobacteria)；拟杆菌门(Bacteroidetes)；普雷沃氏菌科(Prevotellaceae)；Erysipelotrichia；厚壁菌门(Firmicutes)；Lachnoclostridium。
(f)3、6、8、9、12和14月龄的APP/PS1转基因小鼠的肠道微生物组在OTU水平上的PCA分析(n＝4-12)。颜色和形状表示来自不同月份的数据。彩色椭圆表示每个测试组内的0.95置信区间(CI)范围。PC，主成分。
(g)3、6、8、9、12和14月龄的APP/PS1转基因小鼠的肠道微生物在门水平上的相对丰度的变化(n＝4-12)。颜色表示不同的门或属。M，月。
(h)5XFAD转基因(Tg)小鼠(2、3、5、7和9月龄)相对于2月龄野生型(WT)小鼠(n＝2-7)的海马切片中IBA1阳性的变化的代表荧光图。比例尺在小框(上)中代表500μm，在大框(下)中代表250μm。M，月。
(i)如通过流式细胞术检测的，在3、6、9和14月龄的APP/PS1小鼠的全脑匀浆中检测到的浸润性细胞(CD45high)的频率的变化(n＝5-8)。细胞计数是相对于CD45+细胞的频率呈现，并格式化为平均值±平均值标准偏差(mean±sem)。线用三次样条曲线算法拟合。
(j)如通过流式细胞术检测的，在3、6、9和14月龄的APP/PS1小鼠的全脑匀浆中浸润性外周Th1细胞的频率的变化(n＝3-8)。Th1细胞(CD45highCD4+CXCR3+CCR6-)是相对于CD45highCD4+T细胞的频率呈现。数据表示为平均值±平均值标准偏差(mean±sem)。线用三次样条曲线算法拟合。
图8.来自Mouseac数据库的2、4、8和18月龄的5种动物模型和野生型(WT)小鼠的AD的标志的变化。
(a)Aβ斑块或tau神经原纤维缠结的相对密度的变化(每组为n＝4)。数据表示为平均值±平均值标准偏差(mean±sem)。颜色表示不同的模型；线使用多项式算法拟合。
(b)突触素的log2标准化表达水平的变化(每组为n＝4)。数据表示为平均值±平均值标准偏差(mean±sem)。颜色表示不同的模型；线使用多项式算法拟合。
(c-d)CD86和ARG1的log2标准化表达水平的变化，表示M1和M2细胞计数的变化(每组为n＝4)。数据表示为平均值±平均值标准偏差(mean±sem)。颜色表示不同的模型；线使用多项式算法拟合。
(e-h)TIPM、CCL3、GATA-3和MIF的log2标准化表达水平的变化，代表Th1和Th2计数的变化(每组为n＝4)。数据表示为平均值±平均值标准偏差(mean±sem)。颜色表示不同的模型；线使用多项式算法拟合。
图9.
(a)共同居住对于在7月龄时评估WT，共同居住的WT和5XFAD转基因(Tg)小鼠的辨别学习能力的试验中达到80％成功所花费的以104秒计的时间的影响(参见方法)(n＝5-8)。花费的时间是指达到80％表现水平的时间(秒)；花费的时间越长，认知障碍越严重(参见方法)。
(b)使用WT或5XFAD转基因(Tg)小鼠的粪便，进行粪便微生物区系移植(FMT)对注射有Aβ的WT受体小鼠的大脑免疫细胞(Th1和Th2)计数的影响(参见方法)。Th1细胞(CD45highCD4+CXCR3+CCR6-)和Th2细胞(CD45highCD4+CXCR3-CCR6-CCR4+)(n＝6-8)是相对于CD45highCD4+T细胞呈现；数据表示为平均值±平均值标准偏差(mean±sem)。*P<0.05，学生t检验。
(c)来自2月龄的WT小鼠的FMT对5XFAD转基因(Tg)小鼠的大脑Th1细胞的影响。(n＝6-7)。数据表示为平均值±平均值标准偏差(mean±sem)。*P<0.05，学生t检验。
图10.
(a)口服OM1处理的7月龄5XFAD转基因(Tg)小鼠(n＝5-7)的肠道微生物组组成的线性判别分析效应量(LEfSe)的分支图。具有最高判别力的细菌门在图上标注。蓝色，7月龄Tg小鼠中富集的细菌。红色，接受OM1的7月龄Tg小鼠中富集的细菌。外圆到内圆表示不同分类级别(由外向内：门，纲，目，科，属)。M，月。
(b-c)7月龄5XFAD转基因(Tg)小鼠中OM1导致的微生物种上调和下调的微生物区系与大脑免疫细胞亚型的频率之间的相关性。具有黄色星号(*)的红色(正相关)或蓝色(负相关)方块具有P值<0.05，如通过Pearson相关系数测量的。方块内的数字表示相关系数。
(d)WT、Tg和OM1处理的Tg的大脑海马中的IBA1染色、Aβ沉积和Tau磷酸化的代表性图像。比例尺代表250μm。使用显示成深棕色的底物3,3’-二氨基联苯胺(DAB)使阳性信号可视化。
(e)来自WT，Tg和OM1处理的Tg的FMT对海马注射Aβ的C57小鼠中的大脑Th1细胞的影响(n＝4-5)。数据表示为平均值±平均值标准偏差(mean±sem)。
(f)抗生素处理(氨苄青霉素(0.1mg/mL)、链霉素(0.5mg/mL)和粘菌素(0.1mg/mL))对口服OM1处理的6月龄APP/PS1转基因模型小鼠的肠道微生物在属水平上的相对丰度的影响(n＝6-8)。颜色表示不同的属。
(g)OM1对经抗生素处理的6月龄APP/PS1小鼠的大脑Th1细胞频率的影响(参见方法)。Th1细胞(CD45highCD4+CXCR3+CCR6-)是相对于CD45highCD4+T细胞呈现(n＝6-8)，并且数据表示为平均值±平均值标准偏差(mean±sem)。从左到右：*P<0.05，学生t检验。NS，无显著性。
(h)OM1对经抗生素处理的6月龄APP/PS1小鼠的海马切片中检测到的IBA1阳性免疫荧光染色的相对密度的影响(n＝4-6；参见方法)。IBA1阳性区域反映了小胶质细胞的激活。数据表示为平均值±平均值标准偏差(mean±sem)。***P<0.0001，学生t检验。NS，无显著性。
(i)在有或没有抗生素的情况下，APP/PS1和OM1处理的APP/PS1小鼠的大脑中的IBA1代表性免疫荧光染色。使用显示成绿色的FITC缀合二抗使IBA1可视化。用显示成蓝色的DAPI染色核。比例尺代表250μm。
(j)如通过细胞因子抗体阵列检测的，OM1对7月龄APP/PS1小鼠的大脑匀浆中的细胞因子水平的影响(n＝5-6)。热图中的颜色表示通过Row Z-Score标准化的相对细胞因子水平；红色表示上调的细胞因子，蓝色表示下调的细胞因子。
图11.
(a)OM1对细菌上清液刺激的初始CD4T细胞分化为Th1和Th2细胞的影响。培养初始CD4T细胞，并在有/无OM1的情况下加入来自5XFAD小鼠的微生物区系的上清液3天。通过流式细胞术计数Th1(CD4+IFN-γ+)细胞和Th2(CD4+IL-4+)细胞。数据表示为平均值±平均值标准偏差(mean±sem)；每组n＝3个重复。
(b-c)火山图描绘了原始数据中显著代谢物的分布，代表7月龄的WT和Tg小鼠(n＝6-8)(b)和7月龄的用或未用OM1处理的Tg小鼠(n＝6)(c)的肠道粪便代谢组学。红点表示显著的代谢物。显著性定义为学生t检验的p值<0.05，并且处理(T)与野生型(WT)之间的倍数变化(FC)<0.83或>1.2。x轴显示log2FC，y轴显示-log10P。
(d-e)在Tg与WT小鼠之间有区别地调节的786种代谢物(n＝6-8)(d)，以及在经OM1处理和未处理的Tg小鼠之间有区别地调节的149种代谢物的热图(e)。通过将显著峰的分子质量数据(m/z)与在线METLIN数据库匹配来识别和注释这些代谢物。
(f)维恩图显示在Tg与WT小鼠之间(T_W)以及在经OM1处理与未处理的Tg小鼠之间(Ttreat_T)(n＝6-8)通常失调的肠道粪便代谢物。124种代谢物在两个比较中具有相反的模式，即在T_W中高且在Ttreat_T中低或者在T_W中低且在Ttreat_T中高。
(g)热图显示在WT、Tg和经OM1处理的Tg组(n＝6-8)之间有区别地调节的，并且可以与所有三个数据库(人类代谢组数据库(Human Metabolites Database，HMDB)，METLIN，京都基因和基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG))匹配的31种识别的代谢物。红色，上调；蓝色，下调。
(h)使用随机森林算法计算的，疾病进展期间所有氨基酸的接受者操作特征(ROC)曲线和曲线下面积(AUC)值。
(i)粪便微生物组移植(FMT)对血液中苯丙氨酸和异亮氨酸的影响。将2月龄的WT小鼠的粪便移植到7月龄的Tg小鼠中(n＝6-7)。苯丙氨酸，***P<0.001((F(2,17)＝26.59))。异亮氨酸，**P<0.01(Tg相对于WT)，**P<0.01(Tg+FMT相对于Tg)，单因素方差分析(F(2,17)＝8.181)。
(j)不同月(M)龄的WT、共同居住的WT和Tg的血液样品中的氨基酸的水平。红色，上调；蓝色，下调。
(k)初始CD4T细胞对苯丙氨酸的摄取。将初始CD4T细胞在有/无13C标记的苯丙氨酸的情况下培养0.5小时。测试与苯丙氨酸相关的化合物的质谱。13C-苯丙氨酸以5mmol/L的浓度施用，通过L型氨基酸转运体而被摄取。
图12.JPH203 50mg/kg有效抑制大脑内Th1细胞比例。
图13.施用OM1后与对照相比肠菌OTU水平结构变化趋势-PCoA分析苯丙氨酸降解菌移植1周后对粪便中苯丙氨酸含量的影响。
图14.施用OM1后与对照相比肠菌属水平相对丰度变化趋势苯丙氨酸降解菌移植1周后对血中Th1细胞比例的影响。
图15.施用OM1后与对照相比大脑细胞因子含量变化趋势。
图16.施用用于调节肠道微生物的相对丰度的试剂：OM1或粪菌(肠道微生物复合物)前后肠道微生物分布变化。
图17.AD和HC的门水平和属水平的差异，部分具体列出。AD：AD病人；HC：Healthycontrol健康对照。
图18.AD和HC的部分显著改变菌群(属genus及种species级别)。AD：AD病人；HC：Healthy control健康对照。
图19.与AD相关的氨基酸列表。使用Multivariate ROC curve basedexploratory analysis(Explorer)分析不同月龄野生型小鼠和5XFAD小鼠的血液氨基酸，寻找潜在的氨基酸组合作为区分野生型小鼠和5XFAD小鼠的标志物。以下为按照选择频率排序的前15个氨基酸以及所有排序的列表。
图20.6.5月龄5XFAD小鼠在接受100mpk OM1治疗1个月后，具有恢复到野生小鼠趋势的血液氨基酸。
图21.6.5月龄5XFAD小鼠在接受100mpk OM1治疗1个月后，具有恢复到野生小鼠趋势的粪便氨基酸。
图22.OM1给药后逆转的细胞因子列表。6.5月龄5XFAD小鼠在接受100mpk OM1治疗1个月后，具有恢复到野生小鼠趋势的脑内细胞因子。
图23.不同月龄APP/PS1小鼠的大脑M1细胞变化趋势。
具体实施方式
现将描述某些示例性实施方式以提供对本文公开的产品、方法和用途的结构、功能、制备和应用的原理的全面理解。这些实施方式的一个或多个实施例将在后文中举例说明。本领域技术人员将理解，本文具体描述和在附图中具体举例说明的产品、方法和用途是非限制性的示例性实施方式，而本发明的范围仅由权利要求书限定。结合一个示例性实施方式举例说明或描述的特征可以与其它实施方式的特征结合。这样的修改和变化有意包括在本发明的范围内。本文引用的全部公开文献、专利和专利申请均通过引用全文并入本文。
在描述本发明的上下文中(特别是在以下权利要求的上下文中)除非本文另有说明或与上下文明显矛盾，否则术语“一个/一种(a/an)”和“该/所述(the)”以及类似指示的使用应被解释为涵盖单数和复数。除非另有说明，否则术语“包含”，“具有”，“包括”和“含有”应被解释为开放式术语(即，“包括，但不限于”)，但也包括“基本上由......组成”和“由......组成”的部分封闭或封闭式术语。除非本文另有说明，否则本文中对数值范围的记载仅旨在用作独立地提及落入该范围内的每个单独值的简写方法，并且每个单独值并入本说明书中，如同其在本文中独立地记载。除非本文另有说明或上下文明显矛盾，否则本文所述的所有方法均可以任何合适的顺序进行。除非另外声明，否则本文提供的任何和所有实例或示例性语言(例如，“如”)的使用仅旨在更好地说明本发明，而不对本发明的范围构成限制。本说明书中的任何语言都不应被解释为表示任何未要求保护的要素对于本发明的实践是必要的。所有百分比均为重量百分比，并且所有重量百分比均基于组合物的总重量(在任何任选的浓缩和/或稀释之前)。提到“一个或多个/一种或多种”包括“两个或更多个/两种或更多种”和“三个或更多/三种或更多种”等等。
本文描述了本发明的优选实施方式。在阅读前文的描述后，那些优选实施方式的变化对于本领域普通技术人员可以变得显而易见。发明人预期熟练技术人员适当地采用这样的变化，并且发明人希望本发明以不同于本文具体描述的方式实施。因此，本发明包括适用法律允许的所附权利要求中记载的主题内容的所有修改和等同方式。而且，除非本文另有说明或上下文明显矛盾，否则本发明涵盖上述要素的所有可能变化方式的任意组合。
在本申请中出现一系列列举数值的所有地方，应理解任意所列举的数值可以是数值范围的上限或下限。还应理解本发明涵盖所有这样的数值范围，即具有数值上限和数值下限的组合的一个范围，其中上限和下限各自的数值都可以是本发明中列举的任意数值。本发明提供的范围应理解为包括该范围内的所有值。例如，1-10应理解为包括值1、2、3、4、5、6、7、8、9和10中的全部，并视情况包括分数值。表达为“至多(up to)”某个值(例如至多5)的范围应理解为所有值(包括该范围的上限)，例如0、1、2、3、4和5，并视情况包括分数值。至多一周或在一周内应理解为包括0.5、1、2、3、4、5、6或7天。类似地，由“至少”限定的范围应理解为包括所提供的较低值和所有更高的值。
除非另有指出，所有百分比形式是重量/重量。
如本发明所用，“约”应理解为包括在平均值的三个标准偏差内或特定领域中的标准公差范围内。在某些实施方式中，约应理解为不超过0.5的变异。“约”修饰其后所有列举的值。例如，“约1、2、3”表示“约1”、“约2”、“约3”。
除非上下文另有明确指出，术语“或”在本发明中包含性地用以指术语“和/或”并可与其互换地使用。
术语“例如”在本发明中用以指短语“例如但不限于”并可与其互换地使用。
本领域技术人员应理解，上文在各个实施方式中记载的技术特征可以单独或组合地与本发明的各个方面的技术方案组合使用。
发明人采用由于严重的、加速的认知障碍而广泛用于AD研究的5XFAD转基因(Tg)小鼠模型。通过分析在AD进展的不同阶段中Tg小鼠和WT小鼠的肠型(enterotype)，发现Tg小鼠的肠道微生物区系是高度动态的(图1d)。在2-3月龄时，拟杆菌门(Bacteroidetes)，厚壁菌门(Firmicutes)和疣微菌门(Verrucomicrobia)是三种最丰富的细菌门(分别为46.8％，32.3％和12.6％)，而7-9个月阶段，厚壁菌门(Firmicutes)变成主要细菌，而拟杆菌门(Bacteroidetes)和疣微菌门(Verrucomicrobia)的丰度明显降低。这与WT小鼠的肠道微生物区系形成鲜明对比。
发明人还对外周免疫细胞Th1和Th1和小胶质细胞M1和M2进行了分析，发现CD4+细胞的两种主要亚型——浸润性Th1和Th2细胞——表现出与小胶质细胞的两种主要亚型——M1和M2小胶质细胞——相似的动态(图1f和图1j)。在早期，主要为Th2细胞和神经保护性M2小胶质细胞，而在晚期，主要为Th1细胞和促炎性M1小胶质细胞。发明人认为随着肠道微生物区系模式发生转变，免疫细胞群体倾向于变为Th1和M1占主导的状态。
发明人还分析了Tg小鼠中肠道微生物区系的丰度与脑免疫细胞之间的关联。注意到早期(2-3个月)的细菌组成与大脑中的M2和Th2细胞计数高度相关(图1k，上图)，而在晚期(7-9个月)，细菌模式变化与M1和Th1细胞高度相关(图1k，下图)。总体而言，这些结果表明AD进展期间，肠道细菌与外周免疫细胞浸润和神经炎症发生相关。
进一步地，发明人揭示了肠道微生物区系的生态失调是各种外周免疫细胞(包括CD4+和CD8+T细胞，B细胞，自然杀伤(NK)细胞，中性粒细胞，树突状细胞(DC)和单核细胞)向大脑浸润所需要的。其中，Th1细胞是特别值得注意的，因为在AD进展期间与M1小胶质细胞激活密切相关。鉴于大脑中Th1与M1小胶质细胞之间公认的功能性串扰60，发明人提出，肠道生态失调促进Th1细胞浸润，以允许其与M1小胶质细胞发生局部串扰，进而触发小胶质细胞分化为促炎状态。通过本研究中获得的一系列发现，这种机制洞察得到了加强。首先，AD进展期间肠道微生物区系组成的动态变化与Th1细胞浸润的升高显著相关。其次，通过抗生素处理来消融肠道微生物区系阻断了AD小鼠中的Th1细胞浸润和进而M1小胶质细胞激活(图2a-c)。第三，长期粪便细菌暴露(共同居住实验)和来自AD小鼠的粪便细菌的粪便微生物区系移植两者均明显增强WT小鼠中的Th1细胞浸润(图2e)和M1小胶质细胞激活，而WT小鼠粪便反向粪便微生物区系移植到Tg小鼠中减少了受体Tg小鼠的Th1细胞(图9c)。发明人的研究结果作为总体突出了肠道微生物区系在AD进展中作为促进Th1/M1小胶质细胞主导的神经炎症的驱动因素。
在AD中连接肠道微生物区系失调和神经炎症的因果关系仍不清楚。在本研究中，发明人检测到超过100种代谢物在AD小鼠中与WT小鼠相比显著改变。其中，最显著的变化发生在氨基酸中，特别是苯丙氨酸相关途径中的那些氨基酸。发明人能够确认苯丙氨酸和异亮氨酸的丰度在AD小鼠的粪便和血液中相对于WT小鼠增加。体外和体内功能评估两者揭示了苯丙氨酸和异亮氨酸在促进外周炎性Th1细胞的分化和增殖方面的作用。使用抗生素消融肠道微生物区系导致血液苯丙氨酸和异亮氨酸、Th1细胞浸润、和M1细胞激活的同时下降。这些发现强调了肠道微生物区系异常产生苯丙氨酸和异亮氨酸在激发Th1细胞主导的神经炎症中的作用。与此观点一致，发明人检测到AD导致的MCI患者的血液中苯丙氨酸/异亮氨酸浓度和Th1细胞计数与健康对照组相比更高。
新浮现的数据显示，多糖或寡糖具有调节肠道微生物区系的优势62。甘露糖醛酸寡糖是基于糖类的抗AD药物，在中国最近完成的III期临床试验中，已被证实改善轻度至中度AD患者的认知障碍。甘露糖醛酸寡糖具有良好的耐受性，具有与安慰剂对照类似的安全性。在本研究中，发明人发现OM1有效地修复了肠道微生物区系(图4a-b；图10a)，减少了粪便和血液中苯丙氨酸和异亮氨酸的量(图5c-d)，并减轻了Th1相关神经炎症(图4g-i)。值得注意的是，经OM1处理的Tg粪便可以很大程度上模仿OM1处理本身的治疗效果，并且抗生素处理消除了其治疗效果。这些发现提供了重要证据，表明OM1的治疗效果主要是通过肠道微生物组的修复。因此，OM1可以提供以微生物区系为中心的抗AD策略的有吸引力的方法，值得进一步研究。
所有这些发现允许发明人在理解AD发病机制方面提出概念上的进展。AD不仅仅是局部Aβ驱动的大脑疾病，而是其发展还需要肠、大脑和中间炎症因子之间的全身性相互作用(图6)。在Aβ沉积的情况下，AD进展期间改变的肠道微生物区系组成引起氨基酸(特别是苯丙氨酸和异亮氨酸)异常升高。这些氨基酸促进外周Th1细胞通过血液循环浸润到大脑中。浸润性外周Th1细胞可以与大脑中的M1小胶质细胞局部串扰，导致病理性神经炎症和认知障碍。这些对AD发病机理的机制见解可以通过修复肠道微生物区系以有利于抗神经炎症响应，提供新的治疗解决方案。
发明人的研究结果可以对AD诊断和治疗具有转化意义。特定细菌(例如，Th1/M1相关细菌)、氨基酸(例如，苯丙氨酸和异亮氨酸)和大脑浸润性免疫细胞组成(例如，Th1细胞主导)或其一种或多种的组合可以用作AD导致的MCI患者的早期诊断性生物标志物，值得在大型AD患者队列中进一步验证。
更重要的是，已确定的OM1以微生物区系为中心的抗AD效应将通过重塑肠道微生物区系为AD治疗开辟新的治疗途径，并通过探索糖类的巨大化学空间来指导未来开发有效疗法。
发明人识别的众多与脑-肠轴相关的特征肠道微生物、氨基酸、免疫细胞和细胞因子各自构成了肠道微生物谱(profile)、氨基酸谱、免疫细胞谱和细胞因子谱。这些谱(例如肠道微生物谱)中的一个或多个在正常和疾病个体之间表现出差异。本发明旨在通过检测或调节这些谱(例如肠道微生物谱)中的一个或多个而检测或调节个体的状态。在一些实施方式中，对于诊断目的而言，可以检测个体的谱(例如肠道微生物谱)以与相应正常个体的具有正常特征的谱(例如肠道微生物谱)和/或相应疾病个体的具有疾病特征的谱(例如肠道微生物谱)进行比较，从而确定个体是处于正常状态或是处于疾病状态，由此诊断个体。在一些实施方式中，对于治疗目的而言，可以使个体的具有疾病特征的谱(例如肠道微生物谱)向相应正常个体的具有正常特征的谱(例如肠道微生物谱)调节，从而使个体的疾病状态调节向正常状态调节，由此治疗个体。
因此在一个方面，本发明提供了一种用于识别阿尔茨海默病患者中的糖类药物敏感性患者的方法，其包括：
测定来自所述患者的样品中以下指标中的一个或多个并与相应的参比指标相比较：
(1)肠道微生物的相对丰度；
(2)氨基酸的水平；
(3)促炎型Th1细胞占CD4+T细胞的比例；和
(4)细胞因子的水平；和
选择所测定的指标与所述参比指标基本上一致的所述患者作为糖类药物敏感性群体。
在另一个方面，本发明提供了一种用于识别阿尔茨海默病患者中的糖类药物敏感性患者的试剂盒，其包括：
用于测定来自所述患者的样品中以下指标中的一个或多个的试剂：
(1)肠道微生物的相对丰度；
(2)氨基酸的水平；
(3)促炎型Th1细胞占CD4+T细胞的比例；和
(4)细胞因子的水平。
在又一个方面，本发明提供了用于测定来自阿尔茨海默病患者的样品中以下指标中的一个或多个的试剂：
(1)肠道微生物的相对丰度；
(2)氨基酸的水平；
(3)促炎型Th1细胞占CD4+T细胞的比例；和
(4)细胞因子的水平；
在制备用于识别所述患者中的糖类药物敏感性患者的试剂盒中的用途。
在又一个方面，本发明提供了一种用于治疗阿尔茨海默病患者的方法，其包括：
测定来自所述患者的样品中以下指标中的一个或多个并与相应的参比指标相比较：
(1)肠道微生物的相对丰度；
(2)氨基酸的水平；
(3)促炎型Th1细胞占CD4+T细胞的比例；和
(4)细胞因子的水平；和
向所测定的指标与所述参比指标基本上一致的所述患者施用包含糖类药物的药物组合物。
在又一个方面，本发明提供了一种用于识别可能患有阿尔茨海默病的个体的方法，其包括：
测定来自所述个体的样品中以下指标中的一个或多个并与相应的参比指标相比较：
(1)肠道微生物的相对丰度；
(2)氨基酸的水平；
(3)促炎型Th1细胞占CD4+T细胞的比例；和
(4)细胞因子的水平；和
将所测定的指标与所述参比指标基本上一致的所述个体识别为可能患有阿尔茨海默病的个体。
在又一个方面，本发明提供了用于测定来自个体的样品中以下指标中的一个或多个的试剂：
(1)肠道微生物的相对丰度；
(2)氨基酸的水平；
(3)促炎型Th1细胞占CD4+T细胞的比例；和
(4)细胞因子的水平；
在制备用于识别可能患有阿尔茨海默病的个体的试剂盒中的用途。
在一些实施方式中，糖类药物选自单糖、二糖、寡糖、多糖、或其衍生物、或者其和/或其衍生物的组合；优选寡糖和多糖；更优选甘露糖醛酸寡糖或包含甘露糖醛酸寡糖的组合物。
在一些实施方式中，样品是粪便或外周血。
在一些实施方式中，肠道微生物是选自厚壁菌门、拟杆菌门、变形菌门、放线菌门、梭杆菌门、蓝藻菌门、疣微菌门或其组合中的一种或多种。
在一些实施方式中，氨基酸是选自以下中的一种或多种：4-OH脯氨酸、乙酰鸟氨酸、丙氨酸、α-氨基己二酸、天冬酰胺、天冬氨酸、不对称二甲基精氨酸、β-丙氨酸、肌肽、瓜氨酸、肌酐、GABA、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、牛磺酸、异亮氨酸、犬尿氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、蛋氨酸亚砜、鸟氨酸、苯丙氨酸、哌啶酸、脯氨酸、腐胺、焦谷氨酸、丝氨酸、血清素、牛磺酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸；优选是选自苯丙氨酸、异亮氨酸、血清素、组氨酸和乙酰鸟氨酸中的一种或多种；更优选是苯丙氨酸和/或异亮氨酸；最优选是苯丙氨酸。
在一些实施方式中，选自以下中的一种或多种氨基酸的水平高于相应正常受试者的相应氨基酸水平：4-OH脯氨酸、乙酰鸟氨酸、丙氨酸、α-氨基己二酸、天冬酰胺、天冬氨酸、不对称二甲基精氨酸、β-丙氨酸、肌肽、瓜氨酸、肌酐、GABA、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、牛磺酸、异亮氨酸、犬尿氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、蛋氨酸亚砜、鸟氨酸、苯丙氨酸、哌啶酸、脯氨酸、腐胺、焦谷氨酸、丝氨酸、血清素、牛磺酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸；优选苯丙氨酸、异亮氨酸、血清素、组氨酸和乙酰鸟氨酸中的一种或多种的水平高于相应正常受试者的相应氨基酸水平；更优选苯丙氨酸和/或异亮氨酸的水平高于相应正常受试者的相应氨基酸水平；最优选苯丙氨酸的水平高于相应正常受试者的相应氨基酸水平。
在一些实施方式中，细胞因子是选自以下中的一种或多种：OPG、Resistin、TARC、VEGF、Chemerin、IL-9、MMP-2、VEGF-D、TCA-3、gp130、MMP-10、6Ckine、VEGF-B、IL-22、IL-1a、IFNg R1、Granzyme B、LIX、CT-1、CD27L、Endoglin、TRANCE、MCSF、4-1BB、Leptin R、CD36、TremL 1、VEGF R2、TGFb1、IL-3Rb、H60。
在一些实施方式中，试剂盒还包括使用说明书，所述使用说明书用于指导用户将所述样品中的所述指标的测定结果与相应的参比指标进行比较。
在一些实施方式中，使用说明书包含所述相应的参比指标。
在一些实施方式中，使用说明书用于指导用户在所述样品中的所述指标的测定结果与相应的参比指标基本上一致时将所述患者识别为糖类药物敏感性患者。
在一些实施方式中，糖类药物是OM1。
在一些实施方式中，糖类药物不是OM1。
在一些实施方式中，甘露糖醛酸寡糖是OM1。
在一些实施方式中，甘露糖醛酸寡糖不是OM1。
甘露糖醛酸寡糖的结构和制备方法已在多篇现有技术文献中阐述。在先专利CN2016100697039公开了低聚甘露糖醛二酸的制备方法，在先专利CN2017107964853公开了测定甘露糖醛酸类物质重均分子量和含量的方法，在先专利CN2017114675966公开了甘露糖醛二酸的组合物及其制备，其均通过引用全文并入本文。本文所用OM1是根据CN2018107213276(“褐藻胶寡糖二酸的组合物”)的组合物A，其通过引入并入本文。
微生物区系
本文公开了包括改变受试者的肠道中的微生物区系的方法和组合物。如本文所用，术语“微生物区系”用于指可以在生物体的肠道中发现或在其中存在(定殖)的一种或多种细菌群落，在本文中可与“微生物”或“肠道微生物”互换使用。当提及多于一种微生物区系时，微生物区系可以是相同类型(菌株)或可以是类群的混合物，如拟杆菌门、变形菌门和/或厚壁菌门，或其下级(纲、目、科、属、种)。微生物区系可以是相同水平的微生物的混合，如拟杆菌门、变形菌门和/或厚壁菌门；也可以是不同水平的微生物的混合，如拟杆菌门和变形菌纲。
在一些实施方式中，肠道微生物是选自选自表1中的门、纲、目、科、属或种或其组合中的一种或多种。
在一些实施方式中，肠道微生物是选自选自表2中的门、纲、目、科、属或种或其组合中的一种或多种。
在一些实施方式中，肠道微生物是选自厚壁菌门、拟杆菌门、变形菌门、放线菌门、梭杆菌门、蓝藻菌门、疣微菌门或其组合中的一种或多种。
在一些实施方式中，肠道微生物是选自下表中的门或其组合中的一种或多种：
Figure BDA0002157022740000261
Figure BDA0002157022740000271
在一些实施方式中，肠道微生物是选自下表中的纲或其组合中的一种或多种：
纲 Bacteroidia
纲 Clostridia
纲 Gammaproteobacteria
纲 Bacilli
纲 Negativicutes
纲 Actinobacteria
纲 Fusobacteriia
纲 Betaproteobacteria
纲 Alphaproteobacteria
在一些实施方式中，肠道微生物是选自下表中的目或其组合中的一种或多种：
目 Bacteroidales
目 Clostridiales
目 Enterobacteriales
目 Selenomonadales
目 Lactobacillales
目 Bifidobacteriales
目 Fusobacteriales
目 Burkholderiales
目 Bacillales
在一些实施方式中，肠道微生物是选自下表中的科或其组合中的一种或多种：
科 Rikenellaceae
科 Ktedonobacteraceae
科 Nannocystaceae
在一些实施方式中，肠道微生物是选自下表中的属或其组合中的一种或多种：
属 Lachnospiraceae_NK4A136_group
属 Alistipes
属 Ruminococcus_1
属 Ruminococcaceae_UCG-002
属 Ruminococcaceae_UCG-005
属 Coprococcus_2
属 Tyzzerella_4
属 Lachnospiraceae_UCG-001
属 Anaerotruncus
属 Cloacibacterium
属 norank_f__Ktedonobacteraceae
属 Nannocystis
属 norank_f__Hydrogenophilaceae
在一些实施方式中，肠道微生物是选自下表中的种或其组合中的一种或多种：
Figure BDA0002157022740000281
Figure BDA0002157022740000291
发明人发现多种肠道微生物涉及根据本发明的脑-肠轴。如实施例所示，在WT小鼠与TG小鼠之间，一些肠道微生物的水平发生变化，而在施用例如OM1后，这些肠道微生物的水平向WT小鼠方向恢复。这样的肠道微生物构成了肠道微生物谱。如前所述，这样的谱可以用于诊断和/或治疗目的。
在一些实施方式中，受试者中选自上表的门、纲、目、科、属和种的一种或多种(即1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66或67种)肠道微生物的水平相对于相应正常受试者的相应肠道微生物的水平的变化(例如，上升或下降)指示所述受试者处于患有AD的风险中或者患有AD。在一个实施方式中，受试者的由上表的门、纲、目、科、属和种的肠道微生物构成的肠道微生物谱中1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％的种类的肠道微生物的水平相对于相应正常受试者的相应肠道微生物的水平的变化(例如，上升或下降)指示所述受试者处于患有AD的风险中或者患有AD。
在一些实施方式中，患有AD的受试者中选自上表的门、纲、目、科、属和种的一种或多种(即1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66或67种)肠道微生物的水平相对于相应正常受试者的相应肠道微生物的水平朝向所述相应正常受试者的相应肠道微生物的水平的变化(例如，上升或下降)指示所述受试者得到适当的治疗。在一个实施方式中，患有AD的受试者的由上表的门、纲、目、科、属和种的肠道微生物构成的肠道微生物谱中1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％的种类的肠道微生物的水平相对于相应正常受试者的相应肠道微生物的水平朝向所述相应正常受试者的相应肠道微生物的水平的变化(例如，上升或下降)指示所述受试者得到适当的治疗。
肠道微生物的相对丰度可以采用本发明的组合物或方法通过以下方式改变：施用包含相关微生物区系的组合物，或者施用包含显著提高和/或降低相关肠道微生物的相对丰度的一种或多种化合物的组合物。
拟杆菌门包含三个大的细菌纲：拟杆菌纲(Bacteroidia)、黄杆菌纲(Flavobacteria)和鞘脂杆菌纲(Sphingobacteria)，它们分布在环境中，包括土壤中、沉积物中、海水中以及动物的肠中和皮肤上。
变形菌门是最大的细菌门。这些生物体显示了极高的代谢多样性并代表了大多数已知细菌的医学、工业和农业重要性。这在进化上、地质上和环境上都很重要。所有的变形菌门细菌都是革兰氏阴性的，其外壁由脂多糖组成。许多具有气体囊泡、鞭毛，或者能够通过滑动而移动；它们可以具有柄、其它附属物或具有形成多细胞子实体的能力。大多数成员是兼性或专性厌氧的、化能自养的和异养的，但也有例外。一些种能够实现光合作用，其它的在细胞内或细胞外存储硫。
厚壁菌门是主要为革兰氏阳性的细菌的门。但是，少许具有导致它们革兰氏染色阴性的多孔假外膜。科学家曾经将厚壁菌门分类为包括所有革兰氏阳性细菌，但是最近已经将它们定义为具有被称为低-G+C的相关形式的核心组。它们主要是圆形细胞，称为球菌类(单数球菌)，或者是杆状形式(杆菌)。许多厚壁菌门产生内生孢子，其具有抗干燥性并能够在极端条件下存活，使得它们能够在各种环境中生存。
改变微生物区系的方法还可以包括测量来自受试者的样品中的一种或多种肠道微生物的相对丰度。在二代测序中，每个sample都会测到许多序列，经过预处理后使用序列聚类算法将相似度(similarity)为97％以上的序列放在一起，组成一个OTU。于是可以得到OTU_table，一个给出每个sample中每个OTU包含多少reads数目的矩阵，即每个sample对应每个OTU中的序列reads数目。相对丰度是以每个sample(每行)为100％，计算各OTU的reads数目占一个sample中所有的reads数目的百分比。因此，相对丰度即指样品中各微生物的序列数的相对百分比。相对丰度可以通过本发明描述的方法或本领域已知可用于检测其的方法检测，如16S rRNA基因的检测。
可以通过从受试者中获得样品来测量肠道微生物的相对丰度。所述样品可以是唾液，粪便和胃、肠和/或直肠内含物；来自于消化道组织(如口腔组织、食道、胃、小肠、回肠、盲肠、结肠和/或直肠)的组织样品；胃肠组织内的腹水；以及可能被熟悉微生物区系测定的人员所使用的其它任何样品。
可以将一种或多种肠道微生物的相对丰度与相应肠道微生物的正常相对丰度相比较。正常相对丰度可以是来自具有相似年龄、性别、种族等的一个或多个受试者。正常相对丰度可以是来自响应于处理或治疗干预或显示了处理或治疗干预的有益结果的具有相似年龄、性别、种族等的健康受试者。在具体实施方式中，正常相对丰度是健康受试者的肠道微生物的相对丰度。
本发明的方法和组合物可以涉及改变一种或多种肠道微生物的相对丰度。示例性实施方式可以涉及用于通过向受试者施用肠道微生物以改变肠道微生物的相对丰度的方法或组合物。取决于期望的结果(如，代谢产物减少、淋巴细胞向大脑浸润减少、小胶质细胞激活减少、神经炎症减轻、认知改善、阿尔茨海默病症状缓解)和个体受试者，受试者中的肠道微生物的相对丰度可以被调节1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100％或更多，或者任意前述值作为端点构成的范围或其中的任意值，例如约7％至约28％等或约7％、14％、21％、28％等；和/或使得所述受试者的肠道微生物的相对丰度接近或达到相应正常受试者的相应肠道微生物的相对丰度。
如本文各处所述，本发明旨在使有别于相应正常受试者的相应指标的指标向相应正常受试者的相应指标的方向调节，以使被调节的指标接近或达到相应正常受试者的相应指标。该调节适用于本文所述待调节或已调节的各种指标。显然，达到相应正常受试者的相应指标是理想的，但接近相应正常受试者的相应指标也是期望的。因此，本发明旨在使其中一种或多种指标有待调节的个体的一种或多种指标接近或达到相应正常受试者的相应指标。如本文所用，术语“接近或达到”是指调节前的指标与相应正常受试者的相应指标之间的差异在调节后相对于该差异缩小大于或等于约0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100％，或者任意前述值作为端点构成的范围或其中的任意值，例如约7％至约28％等或约7％、14％、21％、28％等。调节前的指标与相应正常受试者的相应指标之间的差异在调节后相对于该差异缩小约100％时，调节后的指标即达到相应正常受试者的相应指标。本领域技术人员理解，具体差值将取决于，例如，调节对象、指标类型、测量方法等等。
能够使其中一种或多种指标有待调节的个体的一种或多种指标接近或达到相应正常受试者的相应指标的试剂是治疗期望的。这样的试剂的选择可以是，例如，基于与作为阳性对照的试剂(例如OM1)进行比较。优选地，选择与作为阳性对照的试剂(例如OM1)基本上一致地调节相关指标的测试试剂。
另一方面，其中一种或多种指标有待调节的个体的一种或多种指标与参比指标(例如，用于诊断阿尔茨海默病或用于识别阿尔茨海默病患者中的糖类药物敏感性患者的参比指标)基本上一致可以指示所述个体处于患有阿尔茨海默病的风险中或者患有阿尔茨海默病。
如本文所用，术语“基本上一致”是指将测试指标标准化至参比指标(即参比指标作为100％)，测试指标与参比指标相差小于或等于约0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100％，或者任意前述值作为端点构成的范围或其中的任意值，例如约7％至约28％等或约7％、14％、21％、28％等。本领域技术人员理解，具体差值将取决于，例如，调节对象、指标类型、测量方法等等。
在一些实施方式中，用于调节肠道微生物的相对丰度的试剂包含肠道微生物复合物。在一些实施方式中，所述肠道微生物复合物包含来源于粪便材料或菌库的微生物。在一些实施方式中，所述粪便材料来源于正常受试者或阿尔茨海默病患者。
菌库的定义：为了得到每个OTU对应的物种分类信息，采用RDP classifier贝叶斯算法对97％相似水平的OTU代表序列进行分类学分析，并分别在各个分类水平：domain(域)，kingdom(界)，phylum(门)，class(纲)，order(目)，family(科)，genus(属)，species(种)统计各样本的群落组成。用于菌群16S分析的物种分类数据库比对数据库使用silva132/16S:silva132/16S(http://www.arb-silva.de)。
代谢物参与
发明人发现，肠道微生物的一些代谢物如氨基酸参与本发明所研究的AD脑-肠轴。这些氨基酸可以是，例如，选自下表中的一种或多种；优选是选自苯丙氨酸、异亮氨酸、血清素、组氨酸和乙酰鸟氨酸中的一种或多种；更优选是苯丙氨酸和/或异亮氨酸；最优选是苯丙氨酸。
Figure BDA0002157022740000351
Figure BDA0002157022740000361
发明人发现多种氨基酸涉及根据本发明的脑-肠轴。如实施例所示，在WT小鼠与TG小鼠之间，一些氨基酸的水平发生变化，而在施用例如OM1后，这些氨基酸的水平向WT小鼠方向恢复。这样的氨基酸构成了氨基酸谱。如前所述，这样的谱可以用于诊断和/或治疗目的。
在一些实施方式中，受试者中选自上表的一种或多种(即1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35或36种)氨基酸的水平相对于相应正常受试者的相应氨基酸的水平的变化(例如，上升或下降)指示所述受试者处于患有AD的风险中或者患有AD。在一个实施方式中，受试者的由上表的氨基酸构成的氨基酸谱中1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％的种类的氨基酸的水平相对于相应正常受试者的相应氨基酸的水平的变化(例如，上升或下降)指示所述受试者处于患有AD的风险中或者患有AD。
在一些实施方式中，患有AD的受试者中选自上表的一种或多种(即1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35或36种)氨基酸的水平相对于相应正常受试者的相应氨基酸的水平朝向所述相应正常受试者的相应氨基酸的水平的变化(例如，上升或下降)指示所述受试者得到适当的治疗。在一个实施方式中，患有AD的受试者的由上表的氨基酸构成的氨基酸谱中1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％的种类的氨基酸的水平相对于相应正常受试者的相应氨基酸的水平朝向所述相应正常受试者的相应氨基酸的水平的变化(例如，上升或下降)指示所述受试者得到适当的治疗。
发明人发现受试者中的上表中的一种或多种氨基酸的水平与相应正常受试者的相应氨基酸水平不一致，这可以归因于受试者的疾病状态。当受试者的氨基酸水平低于相应正常受试者的相应氨基酸水平，所述氨基酸水平旨在被上调。当受试者的氨基酸水平高于相应正常受试者的相应氨基酸水平，所述氨基酸水平旨在被下调。
在一些实施方式中，上表中的一种或多种氨基酸低于相应正常受试者的相应氨基酸水平。在一些实施方式中，上表中的一种或多种氨基酸高于相应正常受试者的相应氨基酸水平。在一些实施方式中，上表中的一种或多种氨基酸低于相应正常受试者的相应氨基酸水平，同时另外的一种或多种氨基酸高于相应正常受试者的相应氨基酸水平。上调或下调在一些情况下可以取决于，例如，调节对象、指标类型、测量方法等等。
在一些实施方式中，谷氨酰胺水平低于相应正常受试者的相应氨基酸水平。在一些实施方式中，蛋氨酸水平低于相应正常受试者的相应氨基酸水平。在一些实施方式中，谷氨酰胺和蛋氨酸两者水平低于相应正常受试者的相应氨基酸水平。
在一些实施方式中，谷氨酰胺水平高于相应正常受试者的相应氨基酸水平。在一些实施方式中，蛋氨酸水平高于相应正常受试者的相应氨基酸水平。在一些实施方式中，谷氨酰胺和蛋氨酸两者水平高于相应正常受试者的相应氨基酸水平。
在一些实施方式中，苯丙氨酸、异亮氨酸、血清素、组氨酸和乙酰鸟氨酸中的一种、两种、三种、四种或五种的水平高于相应正常受试者的相应氨基酸水平。在一些实施方式中，苯丙氨酸和/或异亮氨酸的水平高于相应正常受试者的相应氨基酸水平。在一些实施方式中，苯丙氨酸的水平高于相应正常受试者的相应氨基酸水平。
在一些实施方式中，谷氨酰胺和蛋氨酸两者的水平低于相应正常受试者的相应氨基酸水平，而4-OH脯氨酸、乙酰鸟氨酸、丙氨酸、α-氨基己二酸、天冬酰胺、天冬氨酸、不对称二甲基精氨酸、β-丙氨酸、肌肽、瓜氨酸、肌酐、GABA、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、牛磺酸、异亮氨酸、犬尿氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸亚砜、鸟氨酸、苯丙氨酸、哌啶酸、脯氨酸、腐胺、焦谷氨酸、丝氨酸、血清素、牛磺酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸中的一种或多种的水平高于相应正常受试者的相应氨基酸水平。
在一些实施方式中，4-OH脯氨酸、乙酰鸟氨酸、丙氨酸、α-氨基己二酸、天冬酰胺、天冬氨酸、不对称二甲基精氨酸、β-丙氨酸、肌肽、瓜氨酸、肌酐、GABA、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、牛磺酸、异亮氨酸、犬尿氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、蛋氨酸亚砜、鸟氨酸、苯丙氨酸、哌啶酸、脯氨酸、腐胺、焦谷氨酸、丝氨酸、血清素、牛磺酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸中的一种或多种的水平高于相应正常受试者的相应氨基酸水平。
在一些实施方式中，上表中的一种或多种氨基酸被上调。在一些实施方式中，上表中的一种或多种氨基酸被下调。在一些实施方式中，上表中的一种或多种氨基酸被上调，同时另外的一种或多种氨基酸被下调。上调或下调在一些情况下可以取决于，例如，调节对象、指标类型、测量方法等等。
在一些实施方式中，谷氨酰胺被上调。在一些实施方式中，蛋氨酸被上调。在一些实施方式中，谷氨酰胺和蛋氨酸两者被上调。
在一些实施方式中，谷氨酰胺被下调。在一些实施方式中，蛋氨酸被下调。在一些实施方式中，谷氨酰胺和蛋氨酸两者被下调。
在一些实施方式中，苯丙氨酸、异亮氨酸、血清素、组氨酸和乙酰鸟氨酸中的一种、两种、三种、四种或五种被下调。在一些实施方式中，苯丙氨酸和/或异亮氨酸被下调。在一些实施方式中，苯丙氨酸被下调。
在一些实施方式中，谷氨酰胺和蛋氨酸两者被上调，而4-OH脯氨酸、乙酰鸟氨酸、丙氨酸、α-氨基己二酸、天冬酰胺、天冬氨酸、不对称二甲基精氨酸、β-丙氨酸、肌肽、瓜氨酸、肌酐、GABA、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、牛磺酸、异亮氨酸、犬尿氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸亚砜、鸟氨酸、苯丙氨酸、哌啶酸、脯氨酸、腐胺、焦谷氨酸、丝氨酸、血清素、牛磺酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸中的一种或多种被下调。
在一些实施方式中，4-OH脯氨酸、乙酰鸟氨酸、丙氨酸、α-氨基己二酸、天冬酰胺、天冬氨酸、不对称二甲基精氨酸、β-丙氨酸、肌肽、瓜氨酸、肌酐、GABA、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、牛磺酸、异亮氨酸、犬尿氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、蛋氨酸亚砜、鸟氨酸、苯丙氨酸、哌啶酸、脯氨酸、腐胺、焦谷氨酸、丝氨酸、血清素、牛磺酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸中的一种或多种被下调。发明人发现，免疫细胞如初始T细胞
Figure BDA0002157022740000391
或称未分化T细胞在一些情况下摄取氨基酸，如所示例的苯丙氨酸和异亮氨酸，例如通过某些转运体，如所示例的SLC7A5，而被驱动分化成特定类型的T细胞，如Th1细胞。发明人发现，通过各种手段阻止向Th1细胞分化导致Th1主导状态，可以治疗Th1主导相关疾病。这样的手段包括但不限于降低相关氨基酸的水平，阻止免疫细胞摄取相关氨基酸，等等。
SLC7A5被称为L型氨基酸转运蛋白1(LAT1)，属于APC超家族，形成通过保守二硫键与糖蛋白CD98(SLC3A2)相互作用的异二聚体氨基酸转运体。CD98(4F2hc，SLC3A2)是II型糖蛋白，其作为LAT1的伴侣蛋白起作用，稳定并促进其向质膜的易位。该复合物负责在关键身体区域如胎盘和血脑屏障中摄取必需氨基酸。底物包括一系列大的中性氨基酸，如酪氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，缬氨酸和苯丙氨酸，以及包括L-DOPA和加巴喷丁的药物。
可以通过用各种试剂(例如酶)降解氨基酸来降低相关氨基酸的水平，进而减少初始T细胞分化成Th1细胞。下表所示的酶可以用于降解相关氨基酸，如苯丙氨酸和异亮氨酸。所示酶可以通过各种手段递送到受试者的相关部分，例如肠道或外周循环(如外周血)，以起到降解氨基酸的作用。例如，所示酶可以通过将表达所示酶的微生物(例如，大肠杆菌)递送到相关部位以在相关部位表达所示酶而递送到相关部位。所述微生物可以表达所示酶中的一种或多种。本领域技术人员理解，任何可以经过各种递送途径(例如，经口)递送到相关部位而不丧失在相关部位表达所示酶的能力的微生物均可用于递送所示酶。例如，工程化以表达用于降解苯丙氨酸的酶的大肠杆菌被用作苯丙氨酸降解菌，通过口服施用于小鼠，降低了小鼠体内苯丙氨酸含量，如通过检测粪便中的苯丙氨酸含量所示，并且降低了Th1细胞比例，如通过检测外周血中的Th1细胞比例所示。
可用于降解苯丙氨酸的酶
Figure BDA0002157022740000401
Figure BDA0002157022740000413
可用于降解异亮氨酸的酶
Figure BDA0002157022740000412
可以通过用转运体抑制剂抑制初始T细胞借助其摄取相关氨基酸的转运体来阻止免疫细胞摄取相关氨基酸，进而减少初始T细胞分化成Th1细胞。例如，苯丙氨酸和异亮氨酸共用转运体SLC7A5。可用于抑制转运体SLC7A5的抑制剂包括但不限于本领域已知的JPH203、BCH和KMH-233。例如，如实施例4所示，向小鼠施用SLC7A5抑制剂JPH 203，明显降低小鼠大脑中Th1细胞比例。
JPH203是可获自日本J-Pharma的化学合成的低分子量化合物(http://www.j-pharma.com/b3_e.html)，选择性抑制LAT1，CAS号为1037592-40-7(https://www.medkoo.com/products/9544)。
BCH是已知的LAT1抑制剂，CAS号为20448-79-7(https://www.tocris.com/cn/products/bch_5027)。
KMH-233是已知的LAT1抑制剂，CAS号为1941174-13-5(https://www.medkoo.com/products/9545)。
本领域技术人员理解，可用于阻止初始T细胞分化成Th1细胞的手段不限于此。任何可用于阻止初始T细胞受到肠道微生物和/或其代谢物的影响而分化成Th1细胞的手段均可用于降低Th1比例，缓解或逆转如本文所述的Th1主导状态。
发明人发现多种细胞因子涉及根据本发明的脑-肠轴。如实施例所示，在WT小鼠与TG小鼠之间，一些细胞因子的水平发生变化，而在施用例如OM1后，这些细胞因子的水平向WT小鼠方向恢复。这样的细胞因子构成了细胞因子谱。如前所述，这样的谱可以用于诊断和/或治疗目的。
在一些实施方式中，受试者中选自以下的一种或多种(即1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或31种)细胞因子的水平相对于相应正常受试者的相应细胞因子的水平的变化(例如，上升或下降)指示所述受试者处于患有AD的风险中或者患有AD：OPG、Resistin、TARC、VEGF、Chemerin、IL-9、MMP-2、VEGF-D、TCA-3、gp130、MMP-10、6Ckine、VEGF-B、IL-22、IL-1a、IFNg R1、Granzyme B、LIX、CT-1、CD27L、Endoglin、TRANCE、MCSF、4-1BB、Leptin R、CD36、TremL 1、VEGF R2、TGFb1、IL-3Rb、H60。在一个实施方式中，受试者的由以下细胞因子构成的细胞因子谱中1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％的种类的细胞因子的水平相对于相应正常受试者的相应细胞因子的水平的变化(例如，上升或下降)指示所述受试者处于患有AD的风险中或者患有AD：OPG、Resistin、TARC、VEGF、Chemerin、IL-9、MMP-2、VEGF-D、TCA-3、gp130、MMP-10、6Ckine、VEGF-B、IL-22、IL-1a、IFNg R1、GranzymeB、LIX、CT-1、CD27L、Endoglin、TRANCE、MCSF、4-1BB、LeptinR、CD36、TremL 1、VEGF R2、TGFb1、IL-3Rb、H60。
在一些实施方式中，患有AD的受试者中选自以下的一种或多种(即1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或31种)细胞因子的水平相对于相应正常受试者的相应细胞因子的水平朝向所述相应正常受试者的相应细胞因子的水平的变化(例如，上升或下降)指示所述受试者得到适当的治疗：OPG、Resistin、TARC、VEGF、Chemerin、IL-9、MMP-2、VEGF-D、TCA-3、gp130、MMP-10、6Ckine、VEGF-B、IL-22、IL-1a、IFNg R1、Granzyme B、LIX、CT-1、CD27L、Endoglin、TRANCE、MCSF、4-1BB、Leptin R、CD36、TremL 1、VEGF R2、TGFb1、IL-3Rb、H60。在一个实施方式中，患有AD的受试者的由以下细胞因子构成的细胞因子谱中1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％的种类的细胞因子的水平相对于相应正常受试者的相应细胞因子的水平朝向所述相应正常受试者的相应细胞因子的水平的变化(例如，上升或下降)指示所述受试者得到适当的治疗：OPG、Resistin、TARC、VEGF、Chemerin、IL-9、MMP-2、VEGF-D、TCA-3、gp130、MMP-10、6Ckine、VEGF-B、IL-22、IL-1a、IFNg R1、GranzymeB、LIX、CT-1、CD27L、Endoglin、TRANCE、MCSF、4-1BB、LeptinR、CD36、TremL 1、VEGF R2、TGFb1、IL-3Rb、H60。
本发明提供可以直接或间接改变肠道微生物的相对丰度至预定水平(如，治疗水平)持续预定时间量(如，直到使用下一剂量)的组合物。所述预定水平可以从导致治疗响应(如，代谢产物减少、淋巴细胞向大脑浸润减少、小胶质细胞激活减少、神经炎症减轻、认知改善、阿尔茨海默病症状缓解)的所测量的微生物区系的相对丰度而获得。
在一些实施方式中，本发明的方法、试剂或组合物可以包含充分纯化或富集的肠道微生物，使得所述试剂或组合物可以包含按所述试剂或组合物的重量计至少约5重量％、10重量％、20重量％、30重量％、40重量％、50重量％、60重量％、70重量％、80重量％、85重量％、90重量％、95重量％、99重量％或更多的期望的肠道微生物，和/或少于约40重量％、30重量％、20重量％、15重量％、14重量％、13重量％、12重量％、11重量％、10重量％、9重量％、8重量％、7重量％、6重量％、5重量％、4重量％、3重量％、2重量％、1重量％或更少的非期望的肠道微生物。
根据本发明的调节肠道微生物的相对丰度的试剂和组合物可以导致改变的代谢功能。例如，改变的代谢功能可以包括微生物代谢物氨基酸水平调节。
在一些实施方式中，通过检测来自受试者的外周血样品，本发明的方法、试剂和组合物可以使氨基酸水平调节约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、205、210、215、220、225、230、235、240、245、250、255、260、265、270、275、280、285、290、295、300μM或更多，或者任意前述值作为端点构成的范围或其中的任意值；和/或使得所述氨基酸水平接近或达到相应正常受试者的相应氨基酸水平。
在一些实施方式中，通过检测来自受试者的粪便样品，本发明的方法、试剂和组合物可以使所述氨基酸水平调节约100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2100、2200、2300、2400、2500、2600、2700、2800、2900、3000μmol/g或更多，或者任意前述值作为端点构成的范围或其中的任意值；和/或使得所述氨基酸水平接近或达到相应正常受试者的相应氨基酸水平。
在一些实施方式中，本发明的方法、试剂和组合物可以导致改变的免疫细胞浸润到大脑中。例如，促炎型Th1细胞占CD4+T细胞的比例降低。在一些实施方式中，本发明的试剂和组合物可以使来自受试者的样品中促炎型Th1细胞占CD4+T细胞的比例降低约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100％或更多；和/或使得促炎型Th1细胞占CD4+T细胞的比例接近或达到相应正常受试者的相应促炎型Th1细胞占CD4+T细胞的比例。
在一些实施方式中，本发明的方法、试剂和组合物可以使初始T细胞对氨基酸的相对摄取水平降低。在一些实施方式中，本发明的试剂和组合物可以使初始T细胞对氨基酸的相对摄取水平降低约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、205、210、215、220、225、230、235、240、245、250、255、260、265、270、275、280、285、290、295、300或更多；和/或使得初始T细胞对氨基酸的相对摄取水平接近或达到相应正常受试者的相应初始T细胞对氨基酸的相对摄取水平。
在一些实施方式中，本发明的方法、试剂和组合物可以导致改变的大脑中小胶质细胞激活。例如，改变的大脑中小胶质细胞激活可以包括使大脑中小胶质细胞激活增加或减少。大脑中小胶质细胞激活可以增加或减少约1至100％，例如约1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％或100％，或者任意前述值作为端点构成的范围或其中的任意值，例如约7％至约28％等或约7％、14％、21％、28％等。
在一些实施方式中，本发明的方法、试剂和组合物可以导致改变的IBA1水平。例如，改变的IBA1水平可以包括使IBA1水平增加或减少。IBA1水平可以增加或减少约0至约3000相对水平，例如约0、50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150、1200、1250、1300、1350、1400、1450、1500、1550、1600、1650、1700、1750、1800、1850、1900、1950、2000、2050、2100、2150、2200、2250、2300、2350、2400、2450、2500、2550、2600、2650、2700、2750、2800、2850、2900、2950、3000相对水平，或者任意前述值作为端点构成的范围或其中的任意值，例如约500至约3000等或约500、1000、1500等。
制剂
本发明的试剂或药物组合物可以包含可以调节受试者中的肠道微生物的相对丰度的肠道微生物。肠道微生物可以是存活的(活的)、休眠的、无活性的或死的细菌。本发明的试剂或药物组合物可以包含可以调节受试者中的肠道微生物的相对丰度的化合物或试剂。一种或多种化合物或试剂可以用于改变受试者中的微生物区系。这样的化合物或试剂可以包括但不限于抗生素处理和/或抗菌剂，益生元，如细菌细胞壁成分、细菌核酸(如DNA和RNA)、细菌膜成分和细菌结构成分(如蛋白质、糖类、脂质和它们的组合，如脂蛋白、糖酯和糖蛋白)、有机酸、无机酸、碱、蛋白质和肽、酶和辅酶、氨基酸和核酸、糖、脂质、糖蛋白、脂蛋白、糖酯、维生素、生物活性化合物、包含无机成分的代谢产物、小分子如含氮分子或含亚硫酸的分子、抗性淀粉、马铃薯淀粉或高直链淀粉、改性淀粉(包括羧基化淀粉、乙酰化淀粉、丙酸化淀粉和丁酸化淀粉)、非消化的寡糖，如低聚果糖、低聚葡萄糖、低聚木糖、低聚半乳糖、阿拉伯糖基木聚糖、阿拉伯半乳聚糖、半乳甘露聚糖、聚葡萄糖、低聚果糖、菊糖以及这些的衍生物，但是不排除能够发挥益生元作用的其它寡糖、其它可溶纤维及其组合。糖可以选自单糖、二糖、寡糖、多糖、或其衍生物、或者其和/或其衍生物的组合；优选寡糖和多糖；更优选甘露糖醛酸寡糖。
本发明的试剂或药物组合物还可以包含例如氨基酸、氨基糖、糖醇、蛋白质、糖类、单糖、二糖、寡糖、多糖、核酸、缓冲剂、表面活性剂、脂质、脂质体、其它赋形剂以及它们的混合物。其它有用成分可以包括类固醇、消炎剂、非类固醇抗炎剂、止痛剂、细胞、抗炎剂、生长因子、生长因子片段、小分子创伤愈合刺激剂、激素、细胞因子、肽、抗体、酶、分离的细胞、血小板、免疫抑制剂、核酸、细胞类型、病毒、病毒颗粒、必需营养成分、矿物质、金属或维生素以及它们的组合。此外，本发明的试剂和组合物可以包含稀释剂，如水、盐水或缓冲液。
本发明的试剂或药物组合物可以配制为包括药学可接受的载体的药物组合物。如在本文中所使用的，“药学可接受的载体”包括生理相容的任何和所有溶剂、分散介质、涂层、抗菌剂和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂等等。在一个实施方式中，本发明的试剂或药物组合物可以并入适于递送至受试者的药物组合物中。药物组合物还可以包括药学可接受的载体。如在本文中所使用的，“药学可接受的载体”包括生理相容的任何和所有溶剂、分散介质、涂层、抗菌剂和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂等等。药学可接受的载体的例子包括以下的一种或多种：水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、葡萄糖、甘油、乙醇等等，以及它们的组合。在许多情况下，优选地所述组合物中包括等渗剂，如糖，多元醇如甘露醇、山梨醇或氯化钠。
药物组合物可以被配制成多种形式。这些包括，例如，液体、半固体和固体制剂形式，如液体溶液(如可注射和可输注溶液)、分散液或悬浮液、片剂、丸剂、粉末、脂质体、栓剂和其它制剂。药物组合物可以被配制用于高药物浓度。药物组合物进一步可以是在操作和储存条件下为无菌和稳定的。可以通过将其与上述列举的一种成分或其组合(如所需要的)并入需要量的合适溶剂中，随后进行过滤除菌来制备无菌注射溶液。
药物组合物的示例性形式可以取决于预期的递送模式和治疗应用。在一个实施方式中，药物组合物被配制用于口服递送。一些组合物可以是基于药丸的递送(如在2010年10月22日提交的、名称为“pill catcher”的美国专利申请号12/976,648中所公开的)以及延释方法的形式。在一个实施方式中，基于药丸的递送可以是使得递送发生在肠道内的精确位置的系统的一部分。在另一实施方式中，药物组合物可以被配制成延释制剂。在另一实施方式中，药物组合物可以被包封在包衣中，其直到离开病患的胃才开始降解。在另一实施方式中，药物组合物可以与保护所述组合物避免快速释放的载体一起制备，如缓释或控释制剂，包括植入物、透皮贴剂和微包封递送系统。可以使用可生物降解的、生物相容的聚合物，如乙烯-醋酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原蛋白、聚原酸酯和聚乳酸。用于制备这种制剂的许多方法已经被授予专利权或是本领域技术人员公知的。见，如，Sustained andControlled Release Drug Delivery Systems,J.R.Robinson,ed.,Marcel Dekker,Inc.,纽约，1978。“缓释”指的是相对于通过组合物的常规制剂的递送所实现的释放，所述组合物或其活性化合物在延长的时间期间内释放。
另一类型的药物组合物包括可激活的形式，如用处于休眠或非活性状态(如，冻干状态)的微生物区系配制所述组合物。在组合的组合物中，所述微生物区系可以是处于休眠或非活性状态，或者培育微生物区系的化合物或试剂可以是非活性的。在一个示例的实施方式中，药物组合物可以被配制为包含至少一种休眠或非活性微生物区系以及培育微生物区系的非活性化合物或试剂。
所公开的药物组合物和组合的药物组合物也可以被配制成食品、饮料、膳食补充剂和/或添加剂。这样的组合物是适于人和/或动物消费的那些。本领域技术人员可以容易地知道可以用在口服或可摄取制剂中并被认为适于人和/或动物施用的微生物区系的特定制剂。许多组合物被用于制造食品或食品添加剂/补充剂；因此，另一重要方面是提供包括微生物区系的人或动物食品或食品添加剂/补充剂以调节受试者的肠道微生物。
可消费的组合物可以被配制成包括甜味剂、稳定剂或粘合剂、湿润剂和/或天然和/或人工调味剂。所述组合物还可以包括天然和/或人工着色剂和防腐剂。在一种实施中，所述组合物可以包括单糖、二糖和多糖，例如但不限于，蔗糖(糖)、右旋糖、麦芽糖、糊精、木糖、核糖、葡萄糖、甘露糖、半乳糖、舒可慢(sucromalt)、果糖(左旋糖)、转化糖、玉米糖浆、麦芽糊精、低聚果糖糖浆、部分水解淀粉、玉米糖浆固形物、聚葡萄糖、可溶性纤维、不溶性纤维、天然蔗汁、明胶、柠檬酸、乳酸、天然色素、天然调味剂、分馏椰子油、巴西棕榈蜡或它们的组合。
剂量
本发明的试剂或组合物可以包含“治疗有效量”或“有效量”的成分。“治疗有效量”指在需要的剂量下及时间段内，有效实现期望的治疗结果的量。试剂或药物组合物的治疗有效量可以根据多种因素(如个体的疾病状态、年龄、性别和大脑以及所述组合物在个体中引起期望的反应的能力)而变化。治疗有效量也是其中试剂或药物组合物的治疗有益效果超越所述试剂或药物组合物的毒性或有害作用的量。在一个示例的实施方式中，试剂或药物组合物的治疗有效量是其中提高一种或多种肠道微生物的相对丰度的量。例如，治疗有效量的用于调节肠道微生物的相对丰度的试剂提高了受试者中的一种或多种肠道微生物的相对丰度。
如本文所用，术语“治疗”一般是指获得需要的药理和/或生理效应。该效应根据完全或部分地预防疾病或其症状，可以是预防性的；和/或根据部分或完全稳定或治愈疾病和/或由于疾病产生的副作用，可以是治疗性的。本文使用的“治疗”涵盖了对患者疾病的任何治疗，包括：(a)预防易感染疾病或症状但还没诊断出患病的患者所发生的疾病或症状；(b)抑制疾病的症状，如抑制疾病进展，阻止疾病发展；或(c)缓解疾病的症状，即，导致疾病或症状退化。
适应症
通过本发明的研究，发明人发现异常肠道微生物模式导致初始T细胞过度分化成Th1细胞，外周血中Th1细胞水平异常上升。上升的外周Th1细胞水平导致更多的Th1细胞浸润到大脑中，引发疾病如阿尔茨海默病。通过恢复肠道微生物区系，可以减少初始T细胞分化成Th1细胞，降低外周血中异常上升的Th1细胞水平，由此治疗疾病。因此，本发明提供了治疗受试者的高外周血Th1细胞水平相关疾病的方法，其包括在受试者中如本文所述调节肠道微生物的相对丰度、如本文所述降低外周血中的氨基酸水平或如本文所述抑制外周血中初始T细胞摄取氨基酸。
本文所述术语“Th1主导”与“Th1细胞主导”可互换使用。在一些情况下，Th1主导可以用高外周血Th1细胞水平来代表。高外周血Th1细胞水平可以是指受试者中的外周血Th1细胞水平与适合的对照(例如正常对照，如正常人类群体)相比高1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、150％、200％、250％、300％、350％、400％、450％、500％、550％、600％、650％、700％、750％、800％、850％、900％、950％、1000％或更多，或者任意前述值作为端点构成的范围或其中的任意值，例如约7％至约28％等或约7％、14％、21％、28％等。这样的疾病包括，但不限于，多发性硬化(Multiple Sclerosis)、克罗恩病(Crohn’sDisease)、I型糖尿病(Type 1Diabetes)、类风湿性关节炎(Rheumatoid Arthritis)；还包括桥本氏甲状腺炎(Hashimoto's thyroiditis)、白癜风(Vitiligo)、干燥综合征
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多囊性卵巢症候群(Polycystic ovarian syndrome，PCOS)、脂泄病(Celiac Disease)、格雷夫氏病(Graves’s disease)。
如本文所用，术语“受试者”是指任何活的生物体，包括但不限于，人，非人灵长目动物如黑猩猩和其它猿类和猴类，农畜如牛、绵羊、猪、山羊和马，驯养哺乳动物如狗和猫，实验室动物，包括啮齿类动物如小鼠、大鼠、兔子和豚鼠，等。该术语并不指明特定年龄和性别。在一个实施方式中，受试者是人。在本发明的上下文中，术语“受试者”、“个体”和“患者”可互换使用。
在一个实施方式中，受试者中的肠道微生物中的一种或多种的相对丰度高于正常受试者。在一个实施方式中，受试者中的肠道微生物中的一种或多种的相对丰度低于正常受试者。在一个实施方式中，受试者中的肠道微生物中的一种或多种的相对丰度高于正常受试者，且另外一种或多种的相对丰都低于受试者。
剂量可以取决于本发明的试剂或药物组合物中存在的微生物区系的类型。剂量还可以根据受试者中存在的一种或多种微生物区系的相对丰度决定。
在一种实施方式中，本发明的试剂或药物组合物可以有效改变一种或多种微生物区系的相对丰度。在另一种实施方式中，试剂或药物组合物可以有效提高或降低受试者中的微生物区系的相对丰度。在一种实施方式中，试剂或药物组合物可以提高或降低受试者中的微生物区系的特定微生物的相对丰度，且降低受试者中的微生物区系的另外的特定微生物的相对丰度。
在另一实施方式中，本发明的试剂或药物组合物还可以有效改变受试者中的微生物区系，以使得在施用试剂或药物组合物后，受试者中的微生物区系模拟响应于阿尔兹海默治疗过程的受试者中存在的微生物区系。试剂或药物组合物可以有效改变微生物区系以模拟具有相似大脑、年龄、性别、种族等的正常、健康受试者的微生物区系。
可以调整给药方案以提供最适宜的期望反应(如治疗反应或预防反应)。例如，可以递送单一大丸剂，可以随时间递送多个分开的剂量或者所述剂量可以如治疗情况的紧急性所指示的按比例地减少或增加。特别有利的是配制单位剂型的肠胃外组合物以便于剂量的递送和均匀性。如在本文中所使用的单位剂型指的是适于作为用于待治疗的哺乳动物受试者的单一剂量的物理离散单元；每一单元包含与需要的药学载体结合的经计算以产生期望的治疗效果的预定量的活性化合物。用于本发明的单位剂型的规格由下述内容规定或直接取决于下述内容：(a)活性化合物的独特性质和将要实现的具体治疗效果或预防效果，和(b)组合这种活性化合物用于个体治疗的领域中固有的限制。
当应用于本发明提供的方法时，本发明的试剂或药物组合物的示例剂量范围可以是每天约0.001至约100mg/kg体重，每天约0.01至约50mg/kg体重，如每天约0.05至约10mg/kg体重，以一个或多个剂量递送，如1-3个剂量。准确的剂量将取决于递送的频率和模式、被治疗的受试者的性别、年龄、体重和一般状况，被治疗的状况的性质和严重性，将治疗的任何合并症和本领域技术人员已知的其它因素。
在一个实施方式中，本发明的试剂或药物组合物包括总浓度在约0.001mg/kg至约100mg/kg的范围中的微生物区系，如疣微菌门。在另一实施方式中，试剂或药物组合物包括总浓度在约0.1mg/kg至约50mg/kg的范围中的微生物区系，如疣微菌门。在再另一实施方式中，试剂或药物组合物包括总浓度在约1mg/kg至约10mg/kg的范围中的微生物区系，如疣微菌门。
在一些方面，本文所述的试剂、组合物或试剂盒以按受试者重量计的剂量施用。在一些实施方式中，本文所述的试剂、组合物或试剂盒包含按受试者重量计的量的本文提到的一种或多种试剂。
在一些实施方式中，按受试者重量计，本文所述的试剂、组合物或试剂盒中的本文提到的一种或多种试剂各自的量在约1.0至约50.0mg/kg或更高，优选约5.0至40.0mg/kg，更优选约10.0至30.0mg/kg的范围中。在一些实施方式中，按受试者重量计，本文所述的试剂、组合物或试剂盒中的本文提到的一种或多种试剂各自量为约1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5、11.0、11.5、12.0、12.5、13.0、13.5、14.0、14.5、15.0、15.5、16.0、16.5、17.0、17.5、18.0、18.5、19.0、19.5、20.0、20.5、21.0、21.5、22.0、22.5、23.0、23.5、24.0、24.5、25.0、25.5、26.0、26.5、27.0、27.5、28.0、28.5、29.0、29.5、30.0、30.5、31.0、31.5、32.0、32.5、33.0、33.5、34.0、34.5、35.0、35.5、36.0、36.5、37.0、37.5、38.0、38.5、39.0、39.5、40.0、40.5、41.0、41.5、42.0、42.5、43.0、43.5、44.0、44.5、45.0、45.5、46.0、46.5、47.0、47.5、48.0、48.5、49.0、49.5、50.0mg/kg或更高，或者任意前述值作为端点构成的范围或其中的任意值，例如约1.1至1.4mg/kg等或约1.1、1.2、1.3、1.4mg/kg等。
在另一些方面，本文所述的试剂、组合物或试剂盒以固定剂量施用。在一些实施方式中，本文所述的试剂、组合物或试剂盒包含固定量的本文提到的一种或多种试剂。
在一些实施方式中，本文所述的试剂、组合物或试剂盒中的本文提到的一种或多种试剂的量各自独立地是约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200mg或更高，或者任意前述值作为端点构成的范围或其中的任意值，例如约1.1至1.4mg等或约1.1、1.2、1.3、1.4mg等。
在又一些方面，本文所述的试剂、组合物或试剂盒中的部分组分以如上所述的按受试者重量计的剂量施用，而其他组分以如上所述的固定剂量施用。在一些实施方式中，本文所述的试剂、组合物或试剂盒中的部分组分的量是如上所述的以受试者重量计的量，而其他组分是如上所述的固定量。
递送
可以通过本领域已知的多种方法递送或施用本发明的试剂或药物组合物。术语“递送”、“递送至”、“施用”和“施用于”在本文中可互换使用。如本领域技术人员所意识到的，递送的途径和/或模式将根据期望的结果变化。在一个实施方式中，本发明的试剂或药物组合物是经口递送。在另一实施方式中，本发明的试剂或药物组合物是口服递送。在另一实施方式中，本发明的试剂或药物组合物是经鼻递送。递送的再另一模式可以包括递送至肠的方法和组合。
本发明的试剂或药物组合物可以被递送至受试者内的靶区域和/或结构。在肠道内可以被靶向的区域可以包括但不限于，胃、胆胰支(limb)、Roux支、共用支、回肠、盲肠或结肠。可以靶向于构成具有特定pH范围、温度、湿度和代谢产物内含物的分化生态区位的结构。与改变的微生物区系谱相关的疾病或状况可以表现出新微生物的存在、正常微生物的缺乏或者微生物比例的变化。
本发明的试剂或药物组合物的递送可以被靶向于受试者中的一个或多个区域。所述区域可以包括但不限于肠道中的区域。在一个示例的实施方式中，所述递送被靶向于口腔，肠道中的胃、胆胰支、Roux支、共用支、小肠、回肠、盲肠、大肠或结肠。所述递送还可以靶向于受试者中的一个或多个组织。所述组织可以包括肠道中的任何组织，如胃、胆胰支、Roux支、共用支、小肠、回肠、盲肠、大肠或结肠。
本发明的试剂或药物组合物中的组分可以各自分开配制，或者其中的部分或全部共同配制。在一个实施方式中，本发明的试剂或药物组合物可以配制成适合于单次或多次施用的试剂或药物组合物。
本发明的试剂或药物组合物中的组分可以各自单独施用，或者其中的部分或全部共同施用。本发明的试剂或药物组合物中的组分可以基本上不同时施用，或者其中的部分或全部基本上同时施用。
本发明的试剂或药物组合物中的组分可以各自独立地以适合的各种途径施用，包括，但不限于，口服或肠胃外(通过静脉内、肌内、局部或皮下途径)。在一些实施方式中，本发明的试剂或药物组合物的组分可以各自独立地口服施用或注射施用，例如静脉注射或腹腔注射。
本发明的试剂或药物组合物中的组分可以各自独立地是适合的剂型，包括，但不限于，片剂、含片、丸剂、胶囊剂(例如硬胶囊、软胶囊、肠溶胶囊、微囊剂)、酏剂、颗粒剂、糖浆剂、注射剂(肌肉内、静脉内、腹腔内)、颗粒剂、乳剂、悬浮液、溶液、分散剂和用于口服或非口服给药的缓释制剂的剂型。
本发明的试剂或药物组合物中的组分可以各自独立地含有药学上可接受的载体和/或赋形剂。
本发明的试剂或药物组合物中的组分可以各自独立地每1天、每2天、每3天、每4天、每5天、每6天，每周、每2周、每3周或每月或以更低的频率施用。
本发明的试剂或药物组合物中的组分可以各自独立地每天施用1次、2次、3次、4次、5次、6次、7次、8次、9次或10次或更多次。
本发明的试剂或药物组合物中的组分可以各自独立地连续1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天或30天或更久施用。
本发明的试剂或药物组合物中的组分中的一种组分可以在另一种组分之前或之后1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天或10天或更多天施用。例如，在一个实施方式中，在第1天施用本发明的试剂或药物组合物中的组分1，并在2天后(即，第3天)施用本发明的试剂或药物组合物中的组分2，和在又3天后(即，第6天)施用本发明的试剂或药物组合物中的组分1。
本发明的试剂或药物组合物的递送也可以重复一次或多次本发明的试剂或药物组合物的重复递送可以是在疾病治疗之前和/或之后的一次或多次。重复递送可以是以与初始递送相似的方式。
本发明的试剂或药物组合物还可以与可以包括治疗剂、预防剂或诊断剂的药剂一起施用，所述治疗剂、预防剂或诊断剂选自小分子，核酸，蛋白质，如多肽的益生元，包括细菌成分(如细菌细胞壁成分(如肽聚糖)、细菌核酸(如DNA和RNA)、细菌膜成分以及细菌结构成分(如蛋白质、碳水化合物、脂质和这些的组合物，如脂蛋白、糖酯和糖蛋白))、细菌代谢产物、有机酸、无机酸、碱、蛋白质和肽、酶和辅酶、氨基酸和核酸、糖类、脂质、糖蛋白、脂蛋白、糖酯、维生素、生物活性化合物、包含无机成分的代谢产物、小分子(例如含氮分子或含亚硫酸的分子)、抗性淀粉、马铃薯淀粉或高直链淀粉、改性淀粉(包括羧基化淀粉、乙酰化淀粉、丙酸化淀粉和丁酸化淀粉)、非消化的寡糖如低聚果糖、低聚葡萄糖、低聚木糖、低聚半乳糖、阿拉伯糖基木聚糖、阿拉伯半乳聚糖、半乳甘露聚糖、聚葡聚糖、低聚果糖、菊糖以及这些的衍生物的益生元，但是不排除能够发挥益生元作用的其它寡糖、其它可溶纤维及其组合。在一个实施方式中，递送的药剂是递送的小分子，所述小分子具有低的口服生物利用度并对宿主肠的微生物区位起作用。低的口服生物利用度在药物中通常是不希望的，因为经肠吸收是大多数口服治疗的目标。
本发明的试剂或药物组合物还可以与上述药剂在同一组合物中施用，或者可以与在本发明的试剂或药物组合物之前、同时和/或之后施用的药剂分别施用。可以在施用药剂之前至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31天或更多天施用本发明的试剂或药物组合物。还可以在施用药剂之后至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31天或更多天施用本发明的试剂或药物组合物。可以与施用药剂同时施用本发明的试剂或药物组合物。
本发明的试剂或药物组合物还可以由至少部分可植入的系统递送。所述可植入的系统可以是本领域已知和使用的任何系统。所述系统可以包括可编程的泵(如通常用于向糖尿病患者递送胰岛素的那些)。这些部件中的一种或多种可以是模块化的并与可能包括端口、针、贴片等等的经皮递送系统连接。在一个示例的实施方式中，所述可植入的系统包括储库和端口。该储库可能包括用于容纳所述组合物的可再填充或可重装载容器。在另一实施方式中，所述系统可以包括导管。在另一实施方式中，所述可植入系统是经腔导管。所述系统还可以被配置成以规定的剂量和/或规定的间隔递送所述组合物。所述规定的剂量和/或规定的间隔可以由本领域技术人员确定。
本发明的一些实施方式通过下文的非限制性实施例说明。
实施例
材料和方法
动物。将Tg小鼠和共同居住的WT小鼠(通过交配Tg小鼠和C57小鼠产生的相应WT小鼠)在出生后在同一笼中饲养。将WT小鼠(C57)在分开的笼中饲养以避免微生物区系交叉转移。将所有小鼠保持在23℃的室内，12小时(h)光-暗循环。在处理前将小鼠随机分配到不同组。对于Tg小鼠的时程分析，在2、3、5、7和9月龄时处死雄性和雌性Tg小鼠。收集小鼠大脑并染色用于免疫细胞分析和细胞因子分析。在处死小鼠之前，收集粪便用于肠道微生物区系分析。对于OM1处理，在6.5月龄的时候，基于III期试验中的450mg b.i.d.(每天两次)，通过口服给药每天一次用100mg/kg剂量的OM1处理Tg小鼠一个月。进行行为测试以监测最后一次处理后的认知活动。然后将小鼠的大脑和粪便用于不同的分析。对于行为测试，通过辨别学习测试不同月份的Tg小鼠和WT小鼠以及处理后的小鼠，如先前报道的。在PhenoTyper(HomeCage)中发生的所有小鼠运动由计算机化跟踪系统记录，其计算达到80％表现标准所需要的进入时间和次数(Noldus，Ethovision)。对于苯丙氨酸和异亮氨酸腹膜内注射处理，用50mg/kg的苯丙氨酸或异亮氨酸处理4月龄的C57小鼠4天。对于苯丙氨酸和异亮氨酸海马注射，4月龄的C57小鼠以120mmol/L注射3μL苯丙氨酸或异亮氨酸。10天后，对这些小鼠进行使用FACS的血液样品分析和行为测试。
对于APP/PS1小鼠时间点分析，在3、9和14月龄时处死小鼠和年龄匹配的野生型小鼠。收集小鼠大脑和血液用于不同分析。在处死之前，收集小鼠粪便用于微生物区系分析。对于APP/PS1小鼠处理，通过口服强饲每天一次用50mg/kg的OM1处理用或未用抗生素处理3个月的6月龄的小鼠。进行行为测试以监测最后一次处理后的认知活动。动物实验经Shanghai SIPPR-Bk Lab Animal Co.,Ltd的伦理委员会批准(编号：2016002)。
粪便样品DNA提取和PCR扩增。在DNA提取和分析之前，将所有粪便样品在-80℃下冷冻。根据制造商方案使用
Figure BDA0002157022740000591
soil DNA Kit(Omega Biotek，Norcross，GA，U.S.)从粪便样品提取微生物DNA。通过NanoDrop 2000UV-vis分光光度计(ThermoScientific，Wilmington，USA)测定最终DNA浓度和纯化，并通过1％琼脂糖凝胶电泳检查DNA质量。通过热循环PCR系统(GeneAmp 9700，ABI，USA)用引物338F(5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3')和806R(5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3')扩增细菌16S rRNA基因的V3-V4高变区。使用以下程序进行PCR反应：95℃下变性3分钟(min)，95℃下27个30秒循环，55℃下退火30s，72℃下延伸45s，72℃下最终延伸10分钟。PCR反应在含有4μL 5×FastPfu Buffer，2μL 2.5mmol/L dNTP，0.8μL每种引物(5μmol/L)，0.4μLFastPfuPolymerase和10ng模板DNA的20μL混合物中一式三份进行。从2％琼脂糖凝胶中提取所得PCR产物，并使用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit(Axygen Biosciences，Union City，CA，USA)进一步纯化，并根据制造商方案使用QuantiFluorTM-ST(Promega，USA)定量。简并引物是指代表编码单个氨基酸所有不同碱基可能性的不同序列的混合物。为了增加特异性，可以参考密码子使用表，根据不同生物的碱基使用偏好，减少简并性。核苷酸链中除出现正常的A、T、G、C四种碱基符号外还出现如R、Y、M、K等其它字母，其中R＝A/G，Y＝C/T，M＝A/C，K＝G/T，S＝C/G，W＝A/T，H＝A/C/T，B＝C/G/T，V＝A/C/G，D＝A/G/T,N＝A/C/G/T。
Illumina MiSeq测序。根据Majorbio Bio-Pharm Technology Co.Ltd.(中国上海)的标准方案，在Illumina MiSeq平台(Illumina，SanDiego，USA)上以等摩尔和成对末端测序(2×300)合并纯化的扩增子。
处理测序数据。原始fastq文件被多路分解，通过Trimmomatic进行质量过滤，并基于以下标准通过FLASH合并：(i)读取结果是在50bp滑动窗口上接受平均质量分数<20的任何位点处截断；(ii)引物完全匹配，允许2个核苷酸的错配，并除去含有含糊碱基的读取结果；(iii)根据其重叠序列合并具有长于10bp的重叠的序列。使用UPARSE(7.1版，http://drive5.com/uparse/)对操作分类单位(OTU)进行聚类，相似性截止值为97％，并使用UCHIME识别和移除嵌合序列。通过RDP Classifier算法(http://rdp.cme.msu.edu/)针对Silva(SSU123)16S rRNA数据库，使用70％的置信度阈值，分析每个16S rRNA基因序列的生物分类。
代谢物样品制备。取出储存在-80℃的样品并在室温下解冻。将50mg样品用于实验。还加入400μL的甲醇-水(4:1，体积/体积)以使用均化器使样品均质化10秒。将溶液在冰上超声提取10分钟并在-20℃下保持30分钟，然后在4℃以13000rpm离心15分钟。200μL上清液用于LC-MS分析。
LC/MS分析参数。LC-MS在AB Sciex TripleTOF 5600TM质谱仪系统(AB SCIEX，USA)上进行。LC条件：柱：Acquity BEH C18柱(100mm×2.1mm内直径，1.7μm；Waters，Milford，USA)。溶剂：将柱保持在40℃并使用以下梯度实现分离：5％B-30％B，0-3分钟；30％B-95％B，3-9分钟；95％B-95％B，9-13.0分钟；95％B-5％B，13.0-13.1分钟；13.1-16分钟保持在5％B；流速为0.40mL/min，其中B为1:1的乙腈:异丙醇(0.1％(体积/体积)甲酸)，A是甲酸水溶液(0.1％(体积/体积)甲酸)。注射量为20μL。使用AB Sciex TripleTOF 5600TM质谱仪系统收集质谱数据，所述质谱仪系统配备有以正离子或负离子模式操作的电喷雾电离(ESI)源，毛细管电压为1.0kV，样品锥为40V，碰撞能量为6eV。源温度设定为120℃，去溶剂化气体流量为45L/h。从50到1000m/z收集质心数据，分辨率为30000。
代谢物QC样品制备。通过将所有样品的等分试样混合成合并样品来制备QC样品，然后使用与分析样品相同的方法进行分析。在整个分析过程中定期(每10个样品)注入QC，以提供可以从其评估重复性的一组数据。
小鼠粪便的上清液诱导的初始CD4向Th1和Th2的体外分化
使用初始CD4+T细胞分离试剂盒(Stem Cell，Cat No.19765)从8月龄的C57BL/6雌性小鼠的脾细胞中分离初始CD4+T细胞。如过往所述制备7月龄的小鼠粪便的上清液。将0.5mL RPMI-1640培养基中的总计0.5×106个细胞/孔接种在48孔抗CD3和抗CD38预涂板中，并向培养基中补充细胞因子和阻断抗体。Th0：20ng/mL mIL-2；Th1：20ng/mL mIL-2，10μl上清液，5000ng/mL 11B11；Th2：20ng/mL mIL-2，10μl上清液，5000ng/mL XMG1.2。将OM1加入指定孔中，最终浓度为100μg/mL。在37℃、5％CO2下培养5天后，将细胞在BD Aria III细胞计数器上采集，使用FlowJo软件分析数据。
免疫组化。对于3,30-二氨基联苯胺(DAB)显色染色，根据制造商的IHC方案，使用Leica BOND-RX Autostainer(Leica Microsystems)和Coverslipper CV5030(LeicaMicrosystems)对切片进行免疫染色。简而言之，用Epitope Retrieval solution 2(ER2，AR9640，Leica Biosystems)对切片进行20分钟的热诱导表位修复。用3-4％(体积/体积)过氧化氢(DS9800的一部分，Leica Biosystems)封闭内源过氧化物酶活性10分钟。然后，将切片与封闭缓冲液(在PBS中的10％NGS，具有0.3％Trition x-100)一起培养60分钟。最后，根据制造商的方案使用Bond Polymer Refine Detection System(DS9800，LeicaBiosystems)进行染色。一抗培养时间为30分钟。使用兔抗IBA1抗体(1:1,000，cat#019-19741，Wako)针对激活的小胶质细胞来染色切片，使用小鼠抗Abeta42抗体(1:1,000；cat#803003，Biolegend)针对淀粉样蛋白沉积来染色切片，使用小鼠抗-PHF-Tau&tangles-Thr231抗体(1:300，cat#MN1040，Thermo Fisher)针对Tau磷酸化来染色切片。通过高通量明视野扫描仪(NanoZoomer 2.0HT，Hamamatsu)自动扫描染色的切片，并通过NDP.scan 3.2软件(Hamamatsu)获得图像。对于荧光染色，将载玻片在室温下通过封闭缓冲液(在PBS中的10％NGS，具有0.3％Trition x-100)封闭1小时，然后在一抗溶液(Iba-1 1:1,000，Abeta42 1:1,000，Tau 1:300)中在4℃下培养过夜。洗涤后，将载玻片与荧光抗兔或抗小鼠二抗(1:1000，Invitrogen)在室温下培养60分钟，并在PBS中进一步洗涤3次。最后，将载玻片用DAPI(在PBS中1:10000，Sigma)在室温下复染5分钟，洗涤，密封并在4℃下储存用于图像采集。使用Zen软件(Zeiss)，通过直立荧光显微镜Zmager-m2(Zeiss，Germany)在10×物镜下获得代表性荧光图像。
神经毒性测试。将SH-SY5Y细胞(ATCC，USA)以5000个细胞/孔的密度接种到白色聚苯乙烯96孔板(Corning Inc.,USA)中，并在补充有10％胎牛血清(FBS)，100单位/mL青霉素和100μg/mL链霉素的Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)(Corning Inc.,USA)中在加湿培养箱中在37℃、5％CO2下培养。24小时后，分别用终浓度为10mM，1mM和0.1mM的L-苯丙氨酸或L-异亮氨酸(Sigma)处理细胞。24小时后使用CellTiter-Glo(Promega Inc.,USA)检测细胞活力。使用Cytation5仪器(BioTek)记录发光信号。
氨基酸检测。制备一组氨基酸标准混合物溶液，浓度范围为100-2000μmol/L。将每种标准混合物溶液或血浆样品的10μl部分移液到管的底部，然后加入70μl硼酸钠缓冲液(200mmol/L，pH8.8)。在加入20μl的6-氨基喹啉基-N-羟基琥珀酰亚胺基氨基甲酸酯(AQC)(在乙腈中4mg/mL)后，封闭管并在55℃下加热10分钟以形成AQC-氨基酸。此后，将溶液冷却至室温，并将各个溶液的2μl部分注入UPLC-ESI-MS系统用于氨基酸分析，不作进一步纯化。
人类受试者
从先导研究(pilot study)收集来自AD导致的MCI患者和健康对照的血液。AD导致的MCI在针对AD导致的MCI的NIA-AA 2011临床和研究诊断标准中定义。在本研究中，具有AD导致的MCI的患者必须符合以下标准。首先，关于认知变化的关注。第二，一个或多个认知领域的障碍。第三，保持功能能力的独立性。第四，没有痴呆(针对AD导致的MCI的NIA-AA 2011临床诊断标准)。所有参与者都接受了筛查过程，包括审查他们的病史，身体和神经系统检查，实验室测试，和MRI扫描。轻度认知障碍或痴呆的临床评估包括神经心理测试，以及由主治精神病医生进行的行为和精神病学访谈。AD患者在Hachinski缺血量表(HachinskiIschemia Scale)上记录得分<4，并且没有显示出可能影响大脑功能的显著全身或精神病症或创伤性脑损伤的病史。评估所有参与者的临床痴呆评分(Clinical Dementia Rating，CDR)和蒙特利尔认知评估(Montreal Cognitive Assessment，MoCA)。根据评估结果，发明人保留了AD导致的MCI受试者，其他被排除，例如在单个非记忆域中有障碍的那些(单个、非记忆域MCI亚型)以及在两个或更多个域中有障碍的那些(多域、轻度障碍MCI亚型)。正常对照受试者没有认知衰退，神经紊乱，或不受控制的全身性医学紊乱的历史。通过MRI流体衰减反转恢复(fluid-attenuated inversion recovery，FLAIR)序列显示，本研究中包括的所有受试者具有不超过两个腔隙缺血(直径<1cm)。
第一队列的样本量(图5h-i)是9名AD导致的MCI患者和18名健康受试者。第二队列的样本量(图5j)是22名AD导致的MCI患者和22名健康受试者。MCI的诊断是基于以下标准，其改编自Petersen的MCI诊断标准：1)记忆抱怨，优选由配偶或亲属证实；2)客观记忆障碍；3)正常的一般认知功能；4)完整的日常生活活动；5)没有痴呆症。上海市精神卫生中心机构审查委员会伦理委员会批准了本研究(编号：2016-22R1)。从受试者和受试者的监护人获得了知情同意书。下面提供了性别、年龄等信息。
第一队列：
Figure BDA0002157022740000641
Figure BDA0002157022740000651
第二队列：
Figure BDA0002157022740000652
Figure BDA0002157022740000661
Figure BDA0002157022740000671
苯丙氨酸和异亮氨酸诱导的体外分化和增殖。使用初始CD4+T细胞分离试剂盒(Stem Cell，Cat No.19765)从8月龄的C57BL/6雌性小鼠的脾细胞中分离初始CD4+T细胞，并用CellTrace(Themo，Cat No.C34557)染色。将在0.2mL RPMI-1640培养基中的总计1×105个细胞/孔铺板在96孔板中，并向培养基中补充细胞因子和封闭抗体。Th0：10ng/mLmIL-2；Th1:10ng/mL mIL-2，5000ng/mL 11B11。将苯丙氨酸(终浓度为2mmol/L)，异亮氨酸(终浓度为2mmol/L)，OM1(终浓度为100μg/mL)分别加入到指定孔中。在37℃、5％CO2下培养5天后，在BD Fortessa细胞计数器上采集细胞，使用FlowJo软件分析数据。
苯丙氨酸的摄取。使用初始CD4+T细胞分离试剂盒(Stem Cell，Cat No.19765)从8月龄的C57BL/6雌性小鼠的脾细胞中分离初始CD4+T细胞。通过20ng/mL IL-12诱导初始CD4+T细胞分化为Th1。3天后，将0.5mL RPMI-1640培养基中的总计5×105个细胞/孔的Th1细胞和Th0细胞分别铺板到48孔板中。将13C-标记的苯丙氨酸和5mm氨基转运蛋白抑制剂BCH加入指定孔中。0.5小时后，收集细胞并用冰冷D-PBS洗涤两次。加入50μl去离子水，通过在-80℃下冷冻和解冻两次来裂解细胞。将细胞裂解物以12000g离心10分钟，并通过质谱法分析上清液中的13C-标记的苯丙氨酸。
抗生素处理。通过向无菌饮用水中加入含有氨苄青霉素(0.1mg/mL，饮用水中的最终浓度)，链霉素(0.5mg/mL，饮用水中的最终浓度)和粘菌素(0.1mg/mL，饮用水中的最终浓度)(Sigma-Aldrich)的抗生素溶液(ATB)来处理小鼠。溶液和瓶子更换3次，每周分别一次。通过16S rRNA基因测序确认抗生素活性。在Tg组中删除相对丰度小于0.01的细菌类型。根据实验设置，ATB处理的持续时间略有不同。在粪便微生物移植实验的背景下，小鼠在下一天通过使用动物饲养针进行口服强饲而进行粪便微生物移植之前接受3天ATB。
粪便微生物区系移植(FMT)实验。通过解冻粪便材料进行FMT。然后，通过口服强饲将200μl悬浮液转移到每个经ATB预处理的受体中。FMT在5天进行了3次。首先用饮用水中的抗生素混合物处理12月龄的C57小鼠3天，然后通过强饲将40mg悬浮在PBS中的混合粪便注入每只小鼠中3次，中间间隔2天(n＝8)。3天后，以4.2μg Aβ1-40低聚物将Aβ注射液注入海马的两侧。3天后处死小鼠用于不同的分析。
生物信息学分析。使用Kyoto Encyclopedia of Gene Genotype(KEGG)进行途径分析和生物功能富集分析。使用R包“DOSE”，“GO.db”，“GSEABase”和“ClusterProfiler”富集数据。仅表现错误发现率(FDR)或p值<0.05的途径。使用R包“ggcorrplot”进行相关性分析。使用R包“igraph”生成相关性马戏团图。使用R包“ggalluvial”和“networkD3”进行细菌流图和Sankey图。使用R包“Mfuzz”进行趋势的聚类分析。使用Majorbio I-Sanger Cloud(www.i-sanger.com)的在线平台进行其他生物信息学分析。使用MetaboAnalyst 4.0进行ROC生物标志物分析和随机森林分类。
流式细胞仪样品制备和分析。将小鼠麻醉，将血液样品收集到含EDTA的管中，并使用1×红血液裂解缓冲液除去红细胞。在收集组织之前，用冰冷PBS灌注大脑以避免对循环血液免疫细胞进行取样，并且根据成人大脑解离试剂盒(Miltenyi，Cat No.130-107-677)的介绍，使用gentleMACS解离器(Miltenyi Biotec)，将大脑切除、切成碎片并解剖。将大脑匀浆过滤经过70-μm细胞过滤器，并在4℃下300g离心5分钟。将细胞沉淀重悬于冷PBS缓冲液中，并在4℃下300g再离心5分钟。计数所有样品并调节至2-3×106/100μl的密度，用活/死(Live/Dead)试剂盒标记30分钟，然后在4℃下500g离心3分钟。将细胞重悬于100μl PBS缓冲液中，用抗CD16/32(Biolegend，Cat No.101320)封闭10分钟，并根据制造商的方案在4℃下与抗体一起培养30分钟。以下抗体用于FACS分析：CD45(30-F11)-APC-Cy7(103116，Biolegend)，CD11b(M1/70)-FITC(101205，Biolegend)，CX3CR1(SA011F11)-PE-Dazzle 594(149014，Biolegend)，F4/80(BM8)-BV421(123132，Biolegend)，CD86(IT2.2)-PE(305438，Biolegend)，CD206(15-2)-APC(321110，Biolegend)，CD206(15-2)-BV785(321142，Biolegend)，CD11c(N418)-PE-Cy7(117318，Biolegend)，CD8(53-6.7)-Percp-Cy5.5(100734，Biolegend)，Ly-6C(HK1.4)-PE-Dazzle 594(128044，Biolegend)，Gr-1(RB6-8C5)-Percp-Cy5.5(108428，Biolegend)，B220(RA3-6B2)-BV421(103240，Biolegend)，CD19(6D5)-PE(115508，Biolegend)，CD49b(DX5)-PE-Cy7(108922，Biolegend)，CD4(GK1.5)-PE-Cy7(100422，Biolegend)，CD4(GK1.5)-FITC(100406，Biolegend)，CXCR3(CXCR3-173)-BV421(126522，Biolegend)，CCR4(L291H4)-PE-Cy7(359410，Biolegend)，CCR6(29-2L17)-APC(129814，Biolegend)，CD127(A019D5)-PE(351304，Biolegend)，CD25(3C7)-Percp-Cy5.5(101912，Biolegend)，Live/Dead(423104，Biolegend)。将细胞加入500μl PBS缓冲液中，在4℃下500g离心3分钟，并重悬于200μl运行缓冲液中。使用相关阴性对照，荧光减一(Flourescence Minus One，FMO)对照和各个荧光补偿样品来调节荧光补偿并识别感兴趣的群体。细胞在BD Aria III细胞计数器上采集，并使用FlowJo软件分析数据。
抗体阵列。用包含200种蛋白质的基于载玻片的抗体细胞因子阵列(RayBiotech，GSM-CAA-4000-1)分析大脑匀浆(来自20mg组织)。将100μl样品稀释液加入到每个孔中并在室温下培养30分钟。然后，用另外100μl样品替换缓冲液，并在室温下培养2小时。弃去样品，伴随轻轻振摇在室温下用150μl的1×洗涤缓冲液I洗涤5次(每次5分钟)并用150μl的1×洗涤缓冲液II洗涤2次(每次5分钟)。向每个孔中加入80微升的检测抗体混合物，并在室温下培养2小时。伴随轻轻振摇在室温下将载玻片用150μl的1×洗涤缓冲液I洗涤5次(每次5分钟)，然后用150μl的1×洗涤缓冲液II洗涤2次(每次5分钟)。向每个孔中加入80微升的Cy3等价染料-缀合的链霉抗生物素蛋白，并在室温下培养1小时。洗涤5次(每次5分钟)后，通过激光扫描仪显现信号。然后通过热图(www.metaboanalyst.ca)显现数据。
大脑切片制备。在用戊巴比妥(100mg/kg，腹膜内)深度麻醉后，用0.9％NaCl经心脏灌注小鼠。快速取出大脑组织，冷冻并在-70℃下储存。使用滑动冷冻切片机(LeicaMicrosystems)产生连续冠状大脑切片(12μm厚)，固定在载玻片上，并在室温下空气中干燥过夜。将组织切片储存在-70℃或立即使用。
激光显微切割和Q-PCR分析。将冷冻的小鼠大脑样品切片并在PEN膜载玻片上收集(Leica，11600288)。通过激光显微切割显微术(Leica Microsystems，LMD6)分离海马。用RNeasy Micro Kit(Qiagen，74004)提取RNA并逆转录成cDNA(Takara，PrimeScript RTMaster Mix，RR036A)。使用ABI 7500系统通过SYBR方法(Takara，SYBR Premix Ex Taq II)进行Q-PCR。使用以下引物：突触素正向：CAGTTCCGGGTGGTCAAGG；突触素反向：ACTCTCCGTCTTGTTGGCAC；肌动蛋白正向：GCTCTTTTCCAGCCTTCCTT；肌动蛋白反向：AGGTCTTTACGGATGTCAACG。
统计分析。在行为测试中，将动物随机分配到不同的组中。对于两组比较，采用非配对双尾学生t检验。对于超过两组的比较，进行单因素方差分析或双因素方差分析，然后进行Dunnett检验。所有数据均表示为mean±sem。P<0.05被认为是统计学显著的。所有数据均在GraphPad Prism中分析。对于图像量化，Iba-1阳性，Aβ42阳性和磷酸化Tau阳性细胞通过使用ImageJ v1.8.0分析，具有“area”读出。
行为测试：进行以下行为测试：Morris水迷宫(Morris water maze，MWM)，Y迷宫和高架十字迷宫(elevated plus maze，EPM)。通过使用摄像机记录所有迹线，并使用软件(Jiliang)计算相关参数。
根据过往发布的方案使用MWM测试测量空间学习和记忆。简而言之，小鼠进行6天的采集实验，每只小鼠每天进行3次试验。将动物在期望的起始位置释放到水中，计时找到平台的潜伏时间。在第7天，移除平台，让小鼠游泳60秒。使用摄像机记录平台区域穿梭的迹线和次数。
根据文献并进行一些修改，通过Y迷宫评估工作记忆。Y迷宫由三个相同的臂(A，B，C)组成，具有不同的线索。将小鼠置于起始臂(A)中并记录探查的臂的顺序(例如：ABCBA)。使用摄像机记录进臂行为的总次数。Y迷宫的准确度是正确进臂次数与总进臂次数之间的比率。
EPM测试广泛用于评估动物的焦虑，由两个张开的臂(30cm×6cm)，两个闭合的臂(30cm×6cm×22cm)和中心区域(6cm×6cm)组成。将每只小鼠置于面向闭合臂的迷宫中心，允许探索迷宫5分钟。记录迹线，并计算拜访开放臂的频率，其与小鼠的焦虑呈负相关。
实施例
实施例1.AD进展与肠道微生物区系改变和免疫细胞浸润相关
为了评估肠道微生物区系改变在AD发病机制中的作用，发明人使用5XFAD转基因(Tg)小鼠模型，该模型由于发病快，可以很好的模拟AD发病的多个病理特征和临床表型而广泛用于AD研究，在出生后第4个月表现出记忆缺陷，在出生后第7个月表现出行为变化，和在出生后第9个月表现出神经元丧失。相同品系中且在相同条件下饲养的年龄配对的野生型(WT)小鼠被用作对照。与以前的报道一致，发明人观察到Aβ斑块沉积、Tau磷酸化、突触素表达和行为等等的变化。具体地，在Tg小鼠中，从出生后第3个月开始，Aβ斑块沉积在皮质和海马中迅速积累(图7a)。大脑中的Tau磷酸化首先在第5个月发现，并且随年龄逐渐增加(图7b)；海马中的突触素表达水平在第7-9个月显著下降，指示突触变性(图1a)。Tg小鼠中的行为测试显示在9月龄时在辨别学习方面显著衰退(图1b)。注意本发明中Tg小鼠的早期(2-3月)和晚期(7-9月)与人类临床AD的早期和晚期不是相同的概念。Tg小鼠的晚期在症状上一定程度上相当于人类中AD导致的轻度认知障碍(MCI)，因此在本发明中采用具有AD导致的MCI的患者作为人类研究对象。
在一系列时间点上的进一步PCA揭示了Tg小鼠中在AD进展期间肠道微生物区系模式随时间值得注意的转变，而在WT小鼠中几乎没有观察到任何随时间的变化(图1c；图7c)。
通过研究OTU作为Tg小鼠中不同细菌门的丰度的动态的跟踪物，发明人在疾病进展期间在Tg小鼠中发现两种不同的肠道微生物区系特征(profile)。在2-3月龄时，拟杆菌门(Bacteroidetes)，厚壁菌门(Firmicutes)和疣微菌门(Verrucomicrobia)是三种最丰富的细菌门(分别为46.8％，32.3％和12.6％)。在7-9个月阶段，厚壁菌门(Firmicutes)变成主要细菌，而拟杆菌门(Bacteroidetes)和疣微菌门(Verrucomicrobia)的丰度明显降低，指示细菌类型改变(图1d)。发明人进一步探索了Tg小鼠在每个时间点的代表性细菌(图7d，图7e)。这些结果表明，Tg小鼠的肠道微生物区系是高度动态的，与WT小鼠的肠道微生物区系形成鲜明对比。类似的结果也在另一个广泛用于AD研究的模型：APP/PS1双转基因小鼠模型中获得(图7f，图7g)。
发明人假设，在AD进展期间观察到的肠道微生物区系改变可能与神经炎症相关。为了检测这一假设，发明人评估了Tg小鼠的炎症状态。小胶质细胞激活的标志——IBA1——在AD小鼠大脑切片中的免疫染色揭示了小胶质细胞激活的两个明显阶段，分别在第3个月和第7-9个月(图1e)。鉴于小胶质细胞激活可以被分类为两种相反的类型：促炎型—M1亚型和神经保护型—M2亚型，发明人还仔细表征了M1和M2表型。发现在2-3月龄的早期阶段，M1和M2小胶质细胞两者均增加。在接下来的几个月中，M1亚型继续增加，并在第7-9个月达到峰值，而M2亚型小胶质细胞从第3个月下降至第5个月，并且此后保持低水平(图1f)。可见在Tg小鼠的AD随时间进展中，大脑中的促炎性M1小胶质细胞亚型从与神经保护性M2小胶质细胞亚型相当(图1f，2-3月)，变成在小胶质细胞中占主导(图1f，5-9月)，而且导致小胶质细胞整体激活增加(图1e，5-9月)。
除小胶质细胞激活外，已知AD相关神经炎症涉及外周免疫细胞浸润。因此，发明人还分析了AD进展期间，大脑中的浸润性外周免疫细胞。观察到大脑中的CD45high细胞在Tg小鼠中显著高于在WT小鼠中，类似于IBA1染色(图1g)。在AD进展期间的一系列时间点对CD45high细胞亚型进行进一步分析，揭示了CD4+T细胞的变化，作为CD45high细胞的主要亚型，其变化趋势与IBA1很接近(图1h-i)。在发明人检查的时间段中，CD4+细胞的两种主要亚型——Th1和Th2细胞——表现出与M1和M2小胶质细胞相似的动态(图1j)。可见在Tg小鼠的AD随时间进展中，Th1从与Th2相当(图1j，2-3月)，变成在CD4+T细胞中占主导(图1j，5-9月)，而且导致CD4+T整体增加(图1i，5-9月)。
因此，在发明人看来，随着肠道微生物区系模式发生转变，免疫细胞群体变为Th1和M1占主导的状态，尤其是这些变化在时间上的相关性是引人注目的(图1d-j)。类似的结果也分别见于APP/PS1小鼠模型(图8、图7i、图7j、图23)。需要指出的是，APP/PS1小鼠模型和5XFAD转基因(Tg)小鼠模型在AD时间进展上是不同的，Tg小鼠在5月龄就有明显Aβ沉积(图7a)，而APP/PS1小鼠在5月龄还没有明显Aβ沉积(图8a)，两者的肠道微生物群随时间变化(图1d、图7g)也不完全一致，反映了种内、个体间AD进展和肠道微生物群差异，但都表现出随时间肠道微生物模式变化与免疫细胞变化之间的相关性。
发明人还分析了Tg小鼠中肠道微生物区系的丰度与大脑免疫细胞之间的关联。注意到早期(2-3个月)的细菌组成与大脑中的M2和Th2细胞计数高度相关(图1k，上图)，而在晚期(7-9个月)，细菌模式变化与M1和Th1细胞高度相关(图1k，下图)。与免疫细胞显著相关的细菌列于图1k的右侧小图中，再次验证了上文中肠道微生物区系模式与免疫细胞尤其是Th1和M1之间的相关性。
总体而言，这些结果表明AD进展期间，肠道细菌与外周免疫细胞浸润和神经炎症发生相关，这在下文中作进一步研究。
实施例2.肠道微生物区系变化导致大脑中Th1细胞过度浸润和M1小胶质细胞过度 激活
为了确定AD进展中是否需要肠道微生物区系来驱动外周免疫细胞浸润和进而神经炎症，发明人使用含有氨苄青霉素(0.1mg/mL)、链霉素(0.5mg/mL)和粘菌素(0.1mg/mL)的抗生素混合物施用于晚期(7月龄)Tg小鼠以消融肠道微生物区系。抗生素处理在晚期(7月龄)Tg小鼠中导致肠道中微生物多样性和丰度两者在属水平上明显降低(图2a)。
伴随这种变化，发明人观察到大脑中浸润的促炎型Th1细胞(图2b)和M1细胞的比例(图2c)减少。这初步证明，通过干预AD小鼠的肠道微生物分布，可以改变晚期AD小鼠中的Th1和M1占主导的状态，指示了肠道微生物变化与免疫细胞变化之间的因果关系。
这一发现进一步通过共同居住实验得到证实。WT小鼠与相同年龄的Tg小鼠在出生后共同居住7个月。共同居住的WT小鼠表现出在辨别学习方面的衰退，与Tg小鼠相似(图9a)。究其原因，对这些7月龄小鼠中的肠道微生物区系变化的分析表明，在共同居住的WT小鼠与晚期(7月龄)Tg小鼠之间的肠道微生物区系组成非常相似，而与分开居住的相同年龄的WT小鼠的肠道微生物区系组成显著不同(图2d)，指示WT小鼠长期暴露于Tg细菌(即Tg小鼠的AD肠道微生物模式)导致WT小鼠的肠道微生物区系组成朝向Tg小鼠的方向转变，同时导致认知障碍。这提出了不同于常规方案的构建AD模型的策略，即通过调控WT模型的肠道微生物模式向AD模式转变。
同时，浸润性Th1细胞计数在共同居住的WT与Tg小鼠之间也是相似的，两者都显著高于分开居住的WT小鼠的浸润性Th1细胞计数(图2e)。同时，M1细胞在共同居住的WT小鼠中升高(图2f)。与免疫细胞变化一致，大脑中细胞因子表达在共同居住的WT与Tg小鼠之间显示出明显的相似性，而不同于WT小鼠的大脑中细胞因子表达(图2g)。
因此，上述内容证实了通过使WT小鼠的肠道微生物区系向Tg小鼠的肠道微生物区系转变，导致WT小鼠的Th1和M1细胞转变成与Tg小鼠类似的状态，进而导致类似的认知障碍，再次验证了肠道微生物变化与免疫细胞变化之间，以及进而与认知之间的因果关系。
进一步地，发明人采用C57BL/6WT小鼠构建模型来展示上述路径的治疗价值。发明人使用C57BL/6WT小鼠进行粪菌移植(FMT)实验，结果如图16第6至10柱所示。
对C57BL/6WT小鼠进行抗生素处理，以为后续粪菌移植提供初始化环境，向其海马注射聚集的Aβ，然后口服施用来自7至9个月的Tg小鼠的粪菌(“受体_C57_接收TG粪菌”)，或者来自WT小鼠的粪菌(“受体_C57_接收WT粪菌”)作为对照，导致与对照相比大脑中Th1细胞明显增加，Th2细胞明显减少(图9b)，这与上文中Tg小鼠的变化一致。证明通过移植Tg的粪菌，可导致WT小鼠肠道微生物模式转变，导致免疫细胞模式也一并转变。
在另一方面，在相反方向上，向Tg小鼠移植来自WT小鼠的、含有正常肠道微生物分布模式的粪便，减少了受体Tg小鼠中的大脑Th1细胞(图9c)。证明使Tg小鼠的肠道微生物模式向WT小鼠的肠道微生物模式转变，导致免疫细胞模式也一并转变。
这些结果再次验证了AD进展中，肠道微生物区系变化与大脑免疫细胞(特别是Th1/M1)变化和进而认知之间的因果关系。提出并验证了利用该脑-肠轴来治疗AD的策略。
总的来说，这些发现证实，在AD进展中，肠道微生物区系变化驱动了外周免疫细胞浸润和神经炎症激活，而通过向肠道微生物分布表现为疾病模式的Tg小鼠施用用于调节肠道微生物的相对丰度的试剂，例如所示例的含有正常肠道微生物分布模式的WT粪便或者下文示例的OM1，使Tg小鼠的肠道微生物分布朝向早期和正常肠道微生物分布恢复，有效逆转了Tg小鼠中Th1/M1主导的免疫细胞模式，由此改善认知，治疗AD。这为进一步在人类AD患者中通过恢复肠道微生物分布，例如采用用于调节肠道微生物的相对丰度的试剂，以逆转免疫细胞模式，由此改善认知，治疗AD的策略；以及为采用肠道微生物分布和/或免疫细胞状态(例如，Th1状态(例如在总体中的占比)、M1状态(例如在总体中的占比))作为AD进展的标志物，提供了坚实的基础和确凿的证据。
实施例3.OM1通过调节肠道微生物区系而减轻神经炎症
本发明揭示的肠道微生物区系在AD进展中的关键角色启示了对肠道微生物区系进行干预的治疗意义。为了再次进行验证，发明人利用了OM1，其是从褐藻中提取的经过临床验证的抗AD药物。OM1是酸性线性寡糖的混合物，其聚合度范围为二聚体至十聚体，平均分子量为约1kDa(图3a)。
在用OM1治疗3个月的9月龄至12月龄的晚期AD模型APP/PS1小鼠中，OM1对认知障碍表现出显著的改善效果，如APP/PS1小鼠在Morris Water Maze(MWZ)任务中的训练试验(图3b)和探索试验(图3c)两者中的增强的空间学习和记忆表现所示。OM1还显著改善了小鼠在Y迷宫中的表现(图3d)。最近，在中国进行的36周多中心、随机、双盲、安慰剂对照的III期临床试验(临床实验代号：CTR20140274)中，OM1已经展示了其在改善人类AD患者的认知障碍方面的治疗效果。发明人有兴趣了解OM1是否是通过影响AD患者的肠道微生物区系而发挥认知改善作用。
有趣的是，在晚期Tg小鼠中从7月龄开始口服施用一个月OM1明显改变了肠道微生物区系组成(图4a-b；图10a)，明显恢复成向WT模式靠拢(图13-14；图16)。
与肠道微生物区系变化一致，OM1治疗在Tg小鼠中破坏了大脑淋巴细胞计数与肠道细菌变化之间的相关性(图4c；图10b和c)，减少了Th1细胞(图4d)，将小胶质细胞激活降低至与WT小鼠相似的水平(图4e)，并且降低了大脑细胞因子水平(图4f)，使得向WT模式靠拢(图15)。并行地，OM1治疗显著降低了见于Tg小鼠中的Aβ斑块沉积、tau磷酸化和辨别学习衰退(图4g-i)。再次验证了通过恢复肠道微生物分布，例如采用用于调节肠道微生物的相对丰度的试剂，以逆转免疫细胞模式，由此改善认知，治疗AD的策略。
此外，发明人从经OM1处理的Tg小鼠获得粪便，将其通过粪便微生物区系移植(FTM)而移植至心室内注射聚集的Aβ的受体C57BL/6WT小鼠。与获自未经OM1处理的Tg小鼠的粪便相比，获自经OM1处理的Tg小鼠的粪便导致受体小鼠大脑中Th1细胞减少(图10e)，可见来自经OM1处理的Tg小鼠的粪便与实施例2中验证的来自WT小鼠的粪便起到了类似的恢复肠道微生物分布，减少Th1的作用，验证了OM1对Tg小鼠的肠道微生物的恢复功效。一致地，抗生素治疗削弱了OM1对于APP/PS1小鼠模型中的Th1细胞、IBA1水平和细胞因子表达的效果(图10f-j)。所有这些数据表明，OM1可以通过调节肠道失调来减轻神经炎症和认知衰退。
总的来说，在上文的小鼠体内实验中，充分证实了肠道微生物变化及其调控——免疫细胞Th1/M1主导趋势及其逆转——认知失调及其改善这样的AD脑-肠轴调控通路及其干预治疗，并且这样的调控通路和干预在多种不同小鼠模型(5XFAD转基因(Tg)小鼠模型、APP/PS1小鼠模型、C57BL/6小鼠模型)中一致地展示，尽管在这些小鼠之间在肠道微生物初始状态和过程转变方面存在一定的种内、个体间差异，因而充分证实了这样的调控通路和干预在不同个体中的共性。因此提出了通过调节肠道微生物，使肠道微生物模式向正常、健康模式恢复，从而逆转免疫细胞疾病模式，改善认知，治疗AD的策略。
发明人采用人类AD患者和健康对照的数据，比较分析了在两者之间存在差异的AD脑-肠轴相关肠道微生物，在表1-2中列出，在图17-18中示例，以作为调控对象。在对人类应用前述AD脑-肠轴治疗策略时，除了应当充分考虑到本发明中测试的作为啮齿类动物的小鼠与作为灵长类动物的人类之间的种间肠道微生物差异之外，还应当充分考虑到AD患者之间的种内、个体间肠道微生物差异。因此在上文实验中具体展示的小鼠肠道微生物类别更多地是指导性的，而不应当僵硬地、机械地套用到人类AD患者身上。
实施例4.OM1通过调节氨基酸代谢来抑制神经炎症
本发明还探究了肠道微生物区系变化与免疫细胞变化之间的中间环节及其干预。
肠道微生物的代谢物与初始T细胞向Th1/Th2分化之间的因果性，及其干预
为了测试肠道微生物的代谢物的可能参与，来自7个月大的Tg小鼠的体外培养粪便的上清液被添加到初始CD4+T细胞培养物，其刺激初始CD4+T细胞分化成Th1细胞和Th2细胞。相比之下，来自经OM1处理的小鼠粪便培养物的上清液促进Th2细胞分化并抑制Th1分化(图11a)，指示肠道微生物代谢物影响初始T细胞分化成Th1和Th2细胞。
肠道微生物的代谢物中的氨基酸与初始T细胞向Th1/Th2分化之间的因果性，及其 干预
发明人接下来采用非靶向代谢组学技术来表征粪便代谢组。在来自WT、Tg和经OM1处理的Tg小鼠的粪便样品中鉴定总计11289种代谢产物(图11b-c)。在这些代谢物中，如通过METLIN数据库注释的，124种代谢物的丰度在Tg小鼠中相对于WT小鼠中显著改变、下调或上调，指示与AD相关。引人注目的是，所有这些代谢物的变化在很大程度上可以通过OM1处理来逆转(图11d-f)，指示对AD的治疗修复了这些AD相关代谢物的异常状态。这些改变的代谢物被进一步用人类代谢组数据库(Human Metabolites Database，HMDB)和京都基因和基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)注释(图11g)，产生在WT、Tg和经OM1处理的Tg小鼠中有区别地调节的总计31种代谢物，其可以与所有三个数据库(HMDB，METLIN，KEGG)匹配。使用MBROLE或MetaboAnalyst对这些代谢物进行途径富集分析，进一步揭示了氨基酸相关代谢途径和酶的显著变化，特别是苯丙氨酸相关途径(图5a)。
因此，发明人选择将重点放在氨基酸上作进一步研究。在WT和Tg小鼠中筛选总计36种氨基酸(表3)的血浆浓度。使用随机森林算法对这些氨基酸进行分类，部分如图19所示排序，列在表4中。苯丙氨酸被评级为最高命中，然后是异亮氨酸、血清素、组氨酸和乙酰鸟氨酸。这五种氨基酸的多变量探索分析，根据接收者操作特征(ROC)曲线在WT和Tg小鼠之间出现显著差别(图5b；图11h)，表示它们与疾病进展密切相关。然后发明人检查了经OM1处理或未处理的Tg小鼠的粪便和血液样品中，与WT小鼠相比，所选氨基酸的丰度。参见图20和图21，发明人发现多种氨基酸被OM1影响，从Tg模式朝向野生型模式恢复。尤其是，苯丙氨酸和异亮氨酸的浓度在Tg小鼠的粪便中显著高于在WT小鼠的粪便中，并且OM1处理使它们的浓度显著降低至与WT小鼠相当的水平(图5c)。在血液中检测到苯丙氨酸和异亮氨酸的丰度的相似变化模式(图5d)。注意苯丙氨酸和异亮氨酸是作为肠道微生物代谢物中随疾病进展而变化，又被OM1逆转的代表。此外，发明人还发现接受OM1后，小鼠的细胞因子具有恢复至野生型模式的趋势(图22)，这与图2g所示与Tg小鼠共同居住导致WT小鼠的细胞因子状态趋向于转变为Tg小鼠模式相呼应。
为了测试这些氨基酸的升高是否是因为肠道微生物区系变化，因而允许通过干预肠道微生物区系来干预氨基酸，发明人检测了FMT研究中的氨基酸水平。来自2月龄的WT小鼠的粪便可显著降低Tg小鼠中苯丙氨酸和异亮氨酸的水平(图11i)。类似地，在图2描述的共同居住的WT小鼠中，血液中的苯丙氨酸和异亮氨酸水平升高，与Tg小鼠的水平类似(图11j)。因此可以确定，WT小鼠在与Tg小鼠共同居住而使其自身的WT肠道微生物模式向Tg模式转变时，导致苯丙氨酸和异亮氨酸异常产生，水平上升，相反使含正常WT肠道微生物区系的WT小鼠粪便移植到Tg小鼠中导致Tg小鼠肠道微生物区系向WT模式转变，导致苯丙氨酸和异亮氨酸的异常产生得以恢复，水平降低，证实可以通过恢复Tg小鼠的肠道微生物区系而恢复肠道微生物代谢物苯丙氨酸和异亮氨酸的水平。
验证苯丙氨酸和异亮氨酸影响初始T细胞向Th1/Th2分化，及其干预
为了检查苯丙氨酸或异亮氨酸的细胞影响，将这两种化合物直接添加到初始CD4+T细胞培养物中。Th0细胞分化为Th1细胞(图5e)和Th1细胞增殖(图5f)两者均增加。反过来，OM1处理可抑制苯丙氨酸和异亮氨酸诱导的Th1分化和刺激的Th1细胞增殖，指示OM1除影响肠道微生物以外，也直接影响其代谢物氨基酸本身。此外，发明人用腹膜内注射苯丙氨酸和异亮氨酸处理WT小鼠，发现血液中的Th1细胞计数显著增加(图5g)，验证氨基酸体内促进Th0分化成Th1。这些结果表明，苯丙氨酸和异亮氨酸的积累可以增加血液中的Th1细胞计数。
通过干预初始T细胞摄取氨基酸而干预初始T细胞分化
氨基酸可通过特定转运体而被免疫细胞摄取。发明人进一步检查了SLC7A5(苯丙氨酸和异亮氨酸的转运体)在初始CD4+T细胞中的表达水平，发现SLC7A5在初始CD4+T细胞中表达。CD4+T细胞与13C标记的苯丙氨酸一起培养揭示了初始CD4+T细胞对苯丙氨酸的摄取，这可以被药理学SLC7A5抑制剂JPH 203显著阻断(图11k)，指示可以通过抑制氨基酸转运体而抑制免疫细胞摄取氨基酸。发明人进一步检测了由此导致的Th1细胞占比变化，6月龄的5XFAD小鼠，每日以腹腔注射的方式给予50mg/kg的JPH 203或溶媒对照。给药1个月后，安乐死小鼠，通过流式细胞仪分析对照组与JPH 203处理组的小鼠的大脑内促炎性Th1细胞的比例，以此为代表，反映脑内的神经炎症情况。结果如图13所示，与溶媒对照组相比，一个月的JPH203处理明显下调了小鼠脑内促炎性Th1细胞的比例，证实通过抑制氨基酸转运体而抑制免疫细胞摄取氨基酸，从而阻止氨基酸对免疫细胞分化的促进，降低了大脑内的神经炎症。
在人类AD受试者中验证苯丙氨酸和异亮氨酸的异常水平
最后，发明人在人类中进行验证，探讨了上述发现是否可以在具有AD导致的MCI的人类受试者中重现(MCI的定义参见本研究中使用的方法)。确实，来自AD导致的MCI受试者(n＝9)的血液中的苯丙氨酸和异亮氨酸浓度和Th1细胞计数高于健康对应体(n＝18)(图5h和i)。血液中增加的苯丙氨酸和异亮氨酸水平也在另一个AD导致的MCI队列中确认(图5j)，从而允许基于此来设计人类诊断和治疗策略。
综上所述，发明人发现，肠道微生物代谢物中的若干代谢物参与后续免疫细胞向Th1主导状态转变。发明人特别调查了代谢物中的氨基酸，尤其是苯丙氨酸和异亮氨酸，证实了肠道微生物区系组成变化、苯丙氨酸和异亮氨酸的异常产生、以及初始T细胞的过度Th1分化之间的因果关系。通过施用前文证实使Tg小鼠的异常肠道微生物区系向正常WT肠道微生物区系恢复的WT粪菌和OM1，苯丙氨酸和异亮氨酸的异常高水平得以降低，向正常水平恢复，进而Th0细胞向Th1细胞分化被抑制，逆转Th1主导的疾病状态，证实肠道微生物代谢物是异常肠道微生物区系组成与异常免疫细胞状态的中间桥梁，是AD脑-肠轴关系中的一环。发明人还测试了通过其他干预代谢物的手段，例如通过降低代谢物水平或者阻止免疫细胞摄取代谢物，来干预肠道微生物代谢物导致的下游异常免疫细胞状态，以及进而认知状态。
虽然上文已经结合优选实施方式描述了本发明的原理，但应当清楚地理解，该描述仅通过示例的方式进行，而非作为对本发明的范围的限制。
表1.AD病人或小鼠改变的菌群列表
Figure BDA0002157022740000831
Figure BDA0002157022740000841
表2.AD病人与健康对照(HC)肠菌相对丰度显著差异菌群列表
Figure BDA0002157022740000851
Figure BDA0002157022740000861
Figure BDA0002157022740000871
Figure BDA0002157022740000881
Figure BDA0002157022740000891
表3.下表列出了WT(2-9月)和Tg(2-9月)小鼠的血液中检测到的氨基酸的名称。涉及图5b。
Figure BDA0002157022740000892
Figure BDA0002157022740000901
表4.ROC分析WT小鼠和Tg小鼠血液氨基酸中按照选择频率排序的所有氨基酸标志物
Figure BDA0002157022740000902
Figure BDA0002157022740000911

Claims (15)

1.一种用于识别阿尔茨海默病患者中的糖类药物敏感性患者的方法，其包括：
测定来自所述患者的样品中以下指标中的一个或多个并与相应的参比指标相比较：
(1)肠道微生物的相对丰度；
(2)氨基酸的水平；
(3)促炎型Th1细胞占CD4+T细胞的比例；和
(4)细胞因子的水平；和
选择所测定的指标与所述参比指标基本上一致的所述患者作为糖类药物敏感性群体。
2.一种用于识别阿尔茨海默病患者中的糖类药物敏感性患者的试剂盒，其包括：
用于测定来自所述患者的样品中以下指标中的一个或多个的试剂：
(1)肠道微生物的相对丰度；
(2)氨基酸的水平；
(3)促炎型Th1细胞占CD4+T细胞的比例；和
(4)细胞因子的水平。
3.用于测定来自阿尔茨海默病患者的样品中以下指标中的一个或多个的试剂：
(1)肠道微生物的相对丰度；
(2)氨基酸的水平；
(3)促炎型Th1细胞占CD4+T细胞的比例；和
(4)细胞因子的水平；
在制备用于识别所述患者中的糖类药物敏感性患者的试剂盒中的用途。
4.一种用于治疗阿尔茨海默病患者的方法，其包括：
测定来自所述患者的样品中以下指标中的一个或多个并与相应的参比指标相比较：
(1)肠道微生物的相对丰度；
(2)氨基酸的水平；
(3)促炎型Th1细胞占CD4+T细胞的比例；和
(4)细胞因子的水平；和
向所测定的指标与所述参比指标基本上一致的所述患者施用包含糖类药物的药物组合物。
5.一种用于识别可能患有阿尔茨海默病的个体的方法，其包括：
测定来自所述个体的样品中以下指标中的一个或多个并与相应的参比指标相比较：
(1)肠道微生物的相对丰度；
(2)氨基酸的水平；
(3)促炎型Th1细胞占CD4+T细胞的比例；和
(4)细胞因子的水平；和
将所测定的指标与所述参比指标基本上一致的所述个体识别为可能患有阿尔茨海默病的个体。
6.用于测定来自个体的样品中以下指标中的一个或多个的试剂：
(1)肠道微生物的相对丰度；
(2)氨基酸的水平；
(3)促炎型Th1细胞占CD4+T细胞的比例；和
(4)细胞因子的水平；
在制备用于识别可能患有阿尔茨海默病的个体的试剂盒中的用途。
7.根据权利要求1至4中任一项所述的方法、试剂盒或用途，其中所述糖类药物选自单糖、二糖、寡糖、多糖、或其衍生物、或者其和/或其衍生物的组合；优选寡糖和多糖；更优选甘露糖醛酸寡糖或包含甘露糖醛酸寡糖的组合物。
8.根据权利要求1至6中任一项所述的方法、试剂盒或用途，所述样品是粪便或外周血。
9.根据权利要求1至6中任一项所述的方法、试剂盒或用途，其中所述肠道微生物是选自厚壁菌门、拟杆菌门、变形菌门、放线菌门、梭杆菌门、蓝藻菌门、疣微菌门或其组合中的一种或多种。
10.根据权利要求1至6中任一项所述的方法、试剂盒或用途，其中所述氨基酸是选自以下中的一种或多种：4-OH脯氨酸、乙酰鸟氨酸、丙氨酸、α-氨基己二酸、天冬酰胺、天冬氨酸、不对称二甲基精氨酸、β-丙氨酸、肌肽、瓜氨酸、肌酐、GABA、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、牛磺酸、异亮氨酸、犬尿氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、蛋氨酸亚砜、鸟氨酸、苯丙氨酸、哌啶酸、脯氨酸、腐胺、焦谷氨酸、丝氨酸、血清素、牛磺酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸；优选是选自苯丙氨酸、异亮氨酸、血清素、组氨酸和乙酰鸟氨酸中的一种或多种；更优选是苯丙氨酸和/或异亮氨酸；最优选是苯丙氨酸。
11.根据权利要求10所述的方法、试剂盒或用途，其中选自以下中的一种或多种氨基酸的水平高于相应正常受试者的相应氨基酸水平：4-OH脯氨酸、乙酰鸟氨酸、丙氨酸、α-氨基己二酸、天冬酰胺、天冬氨酸、不对称二甲基精氨酸、β-丙氨酸、肌肽、瓜氨酸、肌酐、GABA、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、牛磺酸、异亮氨酸、犬尿氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、蛋氨酸亚砜、鸟氨酸、苯丙氨酸、哌啶酸、脯氨酸、腐胺、焦谷氨酸、丝氨酸、血清素、牛磺酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸；优选苯丙氨酸、异亮氨酸、血清素、组氨酸和乙酰鸟氨酸中的一种或多种的水平高于相应正常受试者的相应氨基酸水平；更优选苯丙氨酸和/或异亮氨酸的水平高于相应正常受试者的相应氨基酸水平；最优选苯丙氨酸的水平高于相应正常受试者的相应氨基酸水平。
12.根据权利要求1至5中任一项所述的方法、试剂盒或用途，其中所述细胞因子是选自以下中的一种或多种：OPG、Resistin、TARC、VEGF、Chemerin、IL-9、MMP-2、VEGF-D、TCA-3、gp130、MMP-10、6Ckine、VEGF-B、IL-22、IL-1a、IFNg R1、Granzyme B、LIX、CT-1、CD27L、Endoglin、TRANCE、MCSF、4-1BB、Leptin R、CD36、TremL 1、VEGF R2、TGFb1、IL-3 Rb、H60。
13.根据权利要求2所述的试剂盒，其还包括使用说明书，所述使用说明书用于指导用户将所述样品中的所述指标的测定结果与相应的参比指标进行比较。
14.根据权利要求13所述的试剂盒，其中所述使用说明书包含所述相应的参比指标。
15.根据权利要求13或14所述的试剂盒，其中所述使用说明书用于指导用户在所述样品中的所述指标的测定结果与相应的参比指标基本上一致时将所述患者识别为糖类药物敏感性患者。
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