NO337476B1 - Derivater av ecteinascidinene, farmasøytiske preparater derav, og deres anvendelse ved fremstillingen av et medikament for behandling av kreft. - Google Patents

Description

Den foreliggende oppfinnelse vedrører derivater av ecteinascidinene, særlig ecteinascidin 736 (ET-736), farmasøytiske preparater som inneholder dem, og deres anvendelse som antitumorforbindelser.

Oppfinnelsens bakgrunn

Ecteinascidinene er svært sterke antitumormidler isolert fra havkappedyret Ecteinascidia turbinata. Flere ecteinascidiner er blitt rapportert tidligere i patent- og vitenskapslitteraturen. Se f.eks.: US patentskrift nr. 5 256 663 som beskriver farmasøytiske preparater som omfatter stoff ekstrahert fra det tropiske, marine, virvelløse dyr Ecteinascidia turbinata, og der betegnet som ecteinascidiner, og anvendelse av slike preparater som antibakterielle, antivirale og/eller antitumormidler hos pattedyr.

US patentskrift nr. 5 089 273 som beskriver nye preparater av stoff ekstrahert fra det tropiske, marine, virvelløse dyr Ecteinascidia turbinata, og der betegnet som ecteinascidinene 729, 743, 745, 759A, 759B og 770. Disse forbindelsene er anvendbare som antibakterielle og/eller antitumormidler hos pattedyr.

US patentskrift nr. 5 149 804 som beskriver ecteinascidinene 722 og 736 (Et 722 og 736) isolert fra det karibiske kappedyr Ecteinascidia turbinata og deres strukturer. Et 722 og 736 beskytter mus in vivo ved svært lave konsentrasjoner mot P388-lymfom, B16-melanom og Lewis lungekarsinom.

US patentskrift nr. 5 478 932 som beskriver ecteinascidiner isolert fra det karibiske kappedyr Ecteinascidia turbinata, som gir in vivo beskyttelse mot P388-lymfom-, B16-melanom-, M5076-ovariesarkom-, Lewis lungekarsinom- og LX-1 human lunge- og MX-1 humant brystkarsinom-transplantat fra annen art.

US patentskrift nr. 5 654 426 som beskriver flere ecteinascidiner isolert fra det karibiske kappedyr Ecteinascidia turbinata som gir in vivo beskyttelse mot P388-lymfom-, B16-melanom-, M5076-ovariesarkom-, Lewis lungekarsinom- og LX-1 human lunge- og MX-1 humant brystkarsinom-transplantat fra annen art.

US patentskrift nr. 5 721 362 som beskriver en syntetisk fremgangsmåte for dannelsen av ecteinascidinforbindelser og beslektede strukturer.

US patentskrift nr. 6 124 292 som beskriver en serie av nye ecteinascidin-lignende forbindelser.

WO 0177115, WO 0187894 og WO 0187895 som beskriver nye syntetiske forbindelser i ecteinascidinserien, deres syntese og biologiske egenskaper.

Se også: Corey, E.J., J. Am. Chem. Soc, 1996, 118 s. 9202-9203; Rinehart, et al., Journal of Natural Products, 1990, "Bioactive Compounds from Aquatic and Terrestrial Sources", vol. 53, s. 771-792; Rinehart et al., Pure and Appl. Chem., 1990, "Biologically active natural products", vol. 62, s. 1277-1280; Rinehart, et al., J. Org. Chem., 1990, "Ecteinascidins 729, 743, 745, 759A, 759B, and 770: potent Antitumour Agents from the Caribbean Tunicate Ecteinascidia turninata", vol. 55, s. 4512-4515; Wright et al., J. Org. Chem., 1990, "Antitumour Tetrahydroisoquinoline Alkaloids from the Colonial ascidian Ecteinascidia turbinate", vol. 55, s. 4508-4512; Sakai et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 1992, "Additional anitumor ecteinascidins from a Caribbean tunicate: Crystal structures and activities in vivo", vol. 89, 11456-11460; Science 1994, "Chemical Prospectors Scour the Seas for Promising Drugs", vol. 266, s.1324; Koenig, K.E., "Asymmetric Synthesis", red. Morrison, Academic Press, Inc., Orlando, FL, vol. 5, 1985, s. 71; Barton, et al., J. Chem Soc. Perkin Trans., 1, 1982, "Synthesis and Properties of a Series of Sterically Hindered Guanidine bases", s. 2085; Fukuyama et al., J. Am. Chem. Soc, 1982, "Stereocontrolled Total Synthesis of (+)-Saframycin B", vol. 104, s. 4957; Fukuyama et al., J. Am. Chem. Soc, 1990, "Total Synthesis of (+) - Saframycin A", vol. 112, s. 3712; Saito, et al., J. Org. Chem., 1989, "Synthesis of Saframycins. Preparation of a Key tricyclic Lactam Intermediate to Saframycin A", vol. 54, 5391; Still, et al., J. Org. Chem., 1978, "Rapid Chromatographic Technique for Preparative Separations with Moderate Resolution", vol. 43, s. 2923; Kofron, W.G.; Baclawski, L.M., J. Org. Chem., 1976, vol. 41, 1879; Guan et al., J. Biomolec. Struc. & Dynam., vol. 10, s. 793-817 (1993); Shamma et al., "Carbon-13 NMR Shift Assignments of Amines and Alkaloids", s. 206 (1979); Lown et al., Biochemistry, 21, 419-428 (1982); Zmijewski et al., Chem. Biol. Interactions, 52, 361-375 (1985); Ito, CRC Crit. Rev. Anal. Chem., 17, 65-143 (1986); Rinehart et al., "Topics in Pharmaceutical Sciences 1989", s. 613-626, D. D. Breimer, D. J. A. Cromwelin, K. K. Midha, red., Amsterdam Medical Press B. V., Noordwijk, Nederland (1989); Rinehart et al., "Biological Mass Spectrometry", 233-258 red. Burlingame et al., Elsevier Amsterdam (1990); Guan et al., Jour. Biomolec. Struct. & Dynam., vol. 10 s. 793-817 (1993); Nakagawa et al., J. Amer. Chem. Soc, 111: 2721-2722

(1989); Lichter et al., "Food and Drugs from the Sea Proceedings" (1972), Marine Technology Society, Washington, D.C. 1973, 117-127; Sakai et al., J. Amer. Chem. Soc, 1996, 118, 9017; Garcia-Rocha et al., Brit. J. Cancer, 1996, 73: 875-883; og Pommier et al., Biochemistry, 1996, 35: 13303-13309.

I 2000 ble det rapportert en halvsyntetisk prosess for dannelsen av ecteinascidinforbindelser og beslektede strukturer, slik som ftalascidin, ved å starte fra naturlige bis(tetrahydroisokinolin)alkaloider, slik som saframycin- og safracinantibiotikaene som er tilgjengelige fra forskjellige dyrkningsvæsker. Se Manzanares et al., Org. Lett., 2000, "Synthesis of Ecteinascidin ET-743 og Phthalascidin Pt-650 from Cyanosafracin B", vol. 2, nr. 16, s. 2545-2548; og internasjonal patentsøknad WO 00 69862.

Ecteinascidin 736 ble først oppdaget av Rinehart og fremviser en tetrahydro-fJ-karbolin-enhet i stedet for tetrahydroisokinolin-enheten som mer vanlig finnes i ecteinascidinforbindelsene isolert fra naturlige kilder. Se f.eks. Sakai et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 1992, "Additional antitumor ecteinascidins from a Caribbean tunicate: Crystal structures and activities in vivo", vol. 89, 11456-11460.

I WO 9209607 kreves ecteinascidin 736 samt ecteinascidin 722 med hydrogen i stedet for metyl på nitrogenatomet som er felles for ringene C og D i ecteinascidin 736, og O-metylecteinascidin 736 med metoksy i stedet for hydroksy på ring C i ecteinascidin 736.

Til tross for de positive resultatene oppnådd ved kliniske applikasjoner i kjemoterapi, er letingen innenfor området ecteinascidinforbindelser fortsatt åpen for identifiseringen av nye forbindelser med optimale cytotoksisitets- og selektivitetsegenskaper mot tumoren, og med en redusert systemisk toksisitet og forbedrede farmakokinetikkegenskaper.

Oppsummering av oppfinnelsen

Den foreliggende oppfinnelse er rettet mot forbindelser med den generelle formel I:

hvor

Ri er OH, OR', C(=0)R', C(=0)OR', halogen, Ci-Ci2-alkyl, C2-Ci2-alkenyl, eller C2-Ci2-alkynyl; R2 og R3uavhengig av hverandre er valgt fra gruppen bestående av H, C(=0)R', C(=0)OR', Ci-Ci2-alkyl, C2-Ci2-alkenyl, C2-Ci2-alkynyl;

R4og R5uavhengig av hverandre er valgt fra gruppen bestående av H, OH, OR', C(=0)R', C(=0)OR', halogen, C^C^-alkyl, C2-C12.alkenyl og C2-C12-alkynyl;

XerOH, eller CN;

hvor hver av R'-gruppene er uavhengig valgt fra gruppen bestående av eventuelt substituert Ci-Ci2-alkyl, eventuelt substituert C2-Ci2-alkenyl, og eventuelt substituert C2-Ci2-alkynyl;

De eventuelle substituentene er valgt fra halogen, cyano, hydroksyl, nitro, azido, Ci-C6-alkanoyl, karboksamido, Ci-Ci2-alkyl, C2-Ci2-alkenyl, Ci-Ci2-alkoksy, aryloksy med fra 6 til 18 karbon ringatomer, Ci-Ci2-alkyltio, Ci-Ci2-alkylsulfinyl, Ci-Ci2-alkylsulfonyl, amino, aryl med fra 6 til 18 karbon ringatomer eller heterosyklisk gruppe inkludert heteroalisyklisk og heteroaromatiske grupper med fra 5 til 10 ringatomer av hvilke 1 til 4 er heteroatomer valgt fra N, O og S;

hvor m er 0, 1 eller 2; og

hvor n er 1, 2, 3 eller 4.

Ved et annet aspekt vedrører oppfinnelsen farmasøytiske preparater som omfatter en forbindelse ifølge kravene.

Ved et annet aspekt vedrører oppfinnelsen anvendelsen av forbindelser ifølge kravene til fremstilling av et medikament for behandling av kreft.

Vi gir herved informasjon om klassen av forbindelser med den generelle formelen I.

Egnede halogen substituenter i forbindelsene omfatter F, Cl, Br og I.

Alkylgrupper har fortrinnsvis fra 1 til 24 karbonatomer. En mer foretrukket klasse av alkylgrupper har 1 til ca. 12 karbonatomer, enda mer foretrukket 1 til ca. 8 karbonatomer, ytterligere mer foretrukket 1 til ca. 6 karbonatomer, og mest foretrukket 1, 2, 3 eller 4 karbonatomer. En annen mer foretrukket klasse av alkylgrupper har 12 til ca. 24 karbonatomer, enda mer foretrukket 12 til ca. 18 karbonatomer, og mest foretrukket 13, 15 eller 17 karbonatomer. Metyl, etyl og propyl inkludert isopropyl er særlig foretrukne alkylgrupper. Slik det her er brukt, henviser uttrykket alkyl, med mindre modifisert på annen måte, til både sykliske og ikke-sykliske grupper, selv om sykliske grupper vil omfatte minst tre karbonringmedlemmer.

Foretrukne alkenyl- og alkynylgrupper har én eller flere umettede bindinger og fra 2 til ca. 12 karbonatomer, mer foretrukket 2 til ca. 8 karbonatomer, enda mer foretrukket 2 til ca. 6 karbonatomer, ytterligere mer foretrukket 1, 2, 3 eller 4 karbonatomer. Uttrykkene alkenyl og alkynyl henviser, slik de her er brukt, til både sykliske og ikke-sykliske grupper, selv om rettkjedede og forgrenede, ikke-sykliske grupper generelt er mer foretrukket.

Foretrukne alkoksygrupper omfatter grupper som har én eller flere oksygenbindinger, og fra 1 til ca. 12 karbonatomer, mer foretrukket fra 1 til ca. 8 karbonatomer, og enda mer foretrukket 1 til ca. 6 karbonatomer, og mest foretrukket 1, 2, 3 eller 4 karbonatomer.

Foretrukne alkyltiogrupper har én eller flere tioeterbindinger og fra 1 til ca. 12 karbonatomer, mer foretrukket fra 1 til ca. 8 karbonatomer, og enda mer foretrukket 1 til ca. 6 karbonatomer. Alkyltiogrupper med 1, 2, 3 eller 4 karbonatomer er særlig foretrukket.

Foretrukne alkylsulfinylgrupper omfatter de gruppene som har én eller flere sulfoksidgrupper (SO-grupper) og fra 1 til ca. 12 karbonatomer, mer foretrukket fra 1 til ca. 8 karbonatomer, og enda mer foretrukket 1 til ca. 6 karbonatomer. Alkylsulfinylgrupper med 1, 2, 3 eller 4 karbonatomer er særlig foretrukket.

Foretrukne alkylsulfonylgrupper omfatter de gruppene som har én eller flere sulfonylgrupper (S02-grupper) og fra 1 til ca. 12 karbonatomer, mer foretrukket fra 1 til ca. 8 karbonatomer, og enda mer foretrukket 1 til ca. 6 karbonatomer. Alkylsulfonylgrupper med 1, 2, 3 eller 4 karbonatomer er særlig foretrukket.

Foretrukne aminoalkylgrupper omfatter de gruppene som har én eller flere primære, sekundære og/eller tertiære amingrupper, og fra 1 til ca. 12 karbonatomer, mer foretrukket 1 til ca. 8 karbonatomer, enda mer foretrukket 1 til ca. 6 karbonatomer, ytterligere mer foretrukket 1, 2, 3 eller 4 karbonatomer. Sekundære og tertiære amingrupper er generelt mer foretrukket enn primære aminrester.

Egnede heterosykliske grupper omfatter heteroaromatiske og heteroalisykliske grupper. Egnede heteroaromatiske grupper inneholder ett, to eller tre heteroatomer valgt fra N-, O- og S-atomer, og omfatter f.eks. kumarinyl inkludert 8-kumarinyl, kinolinyl, inkludert 8-kinolinyl, pyridyl, pyrazinyl, pyrimidyl, furyl, pyrrolyl, tienyl, tiazolyl, oksazolyl, imidazolyl, indolyl, benzofuranyl og benzotiazol. Egnede heteroalisykliske grupper inneholder ett, to eller tre heteroatomer valgt fra N-, O- og S-atomer, og omfatter f.eks. tetrahydrofuranyl-, tetrahydropyranyl-, piperidinyl-, morfolino- og pyrrolidinylgrupper.

Egnede karbosykliske arylgrupper omfatter enkelt- og multippelringforbindelser, inkludert multippelringforbindelser som inneholder separate og/eller kondenserte arylgrupper. Typiske karbosykliske arylgrupper inneholder 1 til 3 separate eller kondenserte ringer og fra 6 til ca. 18 karbonringatomer. Særlig foretrukne karbosykliske arylgrupper omfatter fenyl, inkludert substituert fenyl, slik som 2-substituert fenyl, 3-substituert fenyl, 2,3-substituert fenyl, 2,5-substituert fenyl, 2,3,5-substituert og 2,4,5-substituert fenyl, inkludert hvor én eller flere av fenylsubstituentene er en elektronfjernende gruppe, slik som halogen, cyan, nitro, alkanoyl, sulfinyl, sulfonyl og lignende; naftyl inkludert 1-naftyl og 2-naftyl; bifenyl; fenantryl og antracyl.

Henvisninger her til substituerte R'-grupper henviser til den angitte rest, vanligvis alkyl eller alkenyl, som kan være substituert i én eller flere tilgjengelige stillinger med én eller flere egnede grupper, f.eks. halogen, slik som fluor, klor, brom og jod; cyan; hydroksyl; nitro; azido; alkanoyl, slik som en Ci-6-alkanoylgruppe, slik som acyl og lignende; karboksamido; alkylgrupper inkludert de gruppene som har 1 til ca. 12 karbonatomer eller fra 1 til ca. 6 karbonatomer, og mer foretrukket 1-3 karbonatomer; alkenyl- og alkynylgrupper inkludert grupper som har én eller flere umettede bindinger, og fra 2 til ca. 12 karbonatomer eller fra 2 til ca. 6 karbonatomer; alkoksygrupper med de som har én eller flere oksygenbindinger, og fra 1 til ca. 12 karbonatomer, eller 1 til ca. 6 karbonatomer; aryloksy, slik som fenoksy; alkyltiogrupper inkludert de restene som har én eller flere tioeterbindinger og fra 1 til ca. 12 karbonatomer eller fra 1 til ca. 6 karbonatomer; alkylsulfinylgrupper inkludert de restene som har én eller flere sulfinylbindinger og fra 1 til ca. 12 karbonatomer eller fra 1 til ca. 6 karbonatomer; alkylsulfonylgrupper inkludert de restene som har én eller flere sulfonylbindinger og fra 1 til ca. 12 karbonatomer eller fra 1 til ca. 6 karbonatomer; aminoalkylgrupper, slik som grupper som har ett eller flere N-atomer og fra 1 til ca. 12 karbonatomer eller fra 1 til ca. 6 karbonatomer; karbosyklisk aryl med 6 eller flere karbonatomer, særlig fenyl (f.eks. hvor R er en substituert eller usubstituert bifenylrest); og aralkyl, slik som benzyl; heterosykliske grupper, inkludert heteroalisykliske og heteroaromatiske grupper, spesielt med 5 til 10 ringatomer hvorav 1 til 4 er heteroatomer, mer foretrukket heterosykliske grupper med 5 eller 6 ringatomer og 1 eller 2 heteroatomer, eller med 10 ringatomer og 1 til 3 heteroatomer.

Foretrukne R'-grupper er til stede i grupper med formel R', COR' eller OCOR', og omfatter alkyl eller alkenyl, som kan være substituert i én eller flere tilgjengelige stillinger med én eller flere egnede grupper, f.eks. halogen, slik som fluor, klor, brom og jod, spesielt co-klor eller perfluor; aminoalkylgrupper, slik som grupper som har ett eller flere N-atomer og fra 1 til ca. 12 karbonatomer eller fra 1 til ca. 6 karbonatomer, og spesielt inkludert aminosyre, især glysin, alanin, arginin, asparagin, asparaginsyre, cystein, glutamin, glutaminsyre, histidin, isoleucin, leucin, lysin, metionin, fenylalanin, prolin, serin, treonin, tryptofan, tyrosin eller valin, spesielt beskyttede former av slike aminosyrer; karbosyklisk aryl med 6 eller flere karbonatomer, særlig fenyl; og aralkyl, slik som benzyl; heterosykliske grupper, inkludert heteroalisykliske og heteroaromatiske grupper, spesielt med 5 til 10 ringatomer, hvorav 1-4 er heteroatomer, mer foretrukket heterosykliske grupper med 5 eller 6 ringatomer og 1 eller 2 heteroatomer, eller med 10 ringatomer og 1-3 heteroatomer, idet de heterosykliske gruppene eventuelt er substituert med én eller flere substituenter som er tillatt for R', og spesielt amino, slik som dimetylamino, eller med keto.

Foretrukne forbindelser ifølge denne oppfinnelsen har én eller flere av de følgende definisjoner: Ri er hydroksy; halogen, spesielt F, alkyloksy (alkyl med 1 til 7 karbonatomer), spesielt Ci-C3-alkyl, og benzyloksy, mest spesielt metoksy og benzyloksy. Særlig foretrukket er OH eller OMe.

R2er H; eller acetyl; alkyl-CO (alkyl med opp til 25 karbonatomer, slik som opp til 17, 19 eller 21 karbonatomer, og fortrinnsvis et oddetall av karbonatomer som tilsvarer en fettsyrekarboksylsyre med partall karbonatomer eller ellers et lavt antall karbonatomer, slik som 1-7), spesielt CH3-(CH2)„-CO-, hvor n er f.eks. 1, 2, 4, 6, 12, 14 eller 16; haloalkyl-CO-, spesielt trifluormetylkarbonyl, heptafluorbutyryl eller 3-klorpropionyl; arylalkyl-CO-; arylalkenyl-CO-, spesielt cinnamoyl; alkyl-O-CO, spesielt t-butyl-O-CO- eller alkenyl-O-CO-, spesielt allyl-O-CO- eller vinyl-O-CO.

R3er fortrinnsvis H; alkenyl, spesielt allyl; alkyl-CO- (alkyl med opp til 25 karbonatomer, slik som opp til 17, 19 eller 21 karbonatomer, og fortrinnsvis et oddetall av karbonatomer som tilsvarer en fettsyrekarboksylsyre med partall karbonatomer eller ellers et lavt antall karbonatomer, slik som 1-6), spesielt CH3-(CH2)n-CO-, hvor n er f.eks. 1, 2, 4, 6, 12, 14 eller 16; alkyl-O-CO-, spesielt t-butyl-O-CO; alkenyl-O-CO, spesielt allyl-O-CO- og vinyl-O-CO.

R4er fortrinnsvis H, alkyl (alkyl med 1-6 karbonatomer), spesielt Ci-C3-alkyl; alkenyl, spesielt allyl, alkenyl-O-CO-, spesielt vinyl-O-CO, og R4er mest spesielt H.

R5er H eller alkyl (alkyl med 1-6 karbonatomer), og R5er mest spesielt H eller Me.

X er -CN eller -OH.

m er 0 eller 1.

n er 1.

Forbindelser hvor Ri ikke er hydrogen, er én klasse av foretrukne forbindelser. Se f.eks. forbindelsene 27 til 36. Disse forbindelsene har høyere aktivitet, et bredere terapeutisk vindu og forbedrede farmakokinetikkegenskaper. Foretrukne substituenter er metoksy, metyl, hydroksy, benzyloksy og fluor.

Forbindelser hvor R3er en ester eller en eter, er blant de foretrukne forbindelser. Generelt har de forbedrede toksikologiegenskaper og gir således et bredere terapeutisk vindu. Av disse er forbindelser med en ester eller et karbonat i denne stillingen mest foretrukket, og særlig karbonater. Estere med voluminøse grupper (lange alifatiske eller aromatiske rester) gir bedre resultater. Blant karbonatene er tert.-butyloksykarbonyl (tBOC) og vinyloksykarbonyl (VOC) de mest foretrukne substituenter for disse stillingene.

Forbindelser hvor R5ikke er hydrogen, er en annen klasse av foretrukne forbindelser. Se f.eks. forbindelsene 37 til 44. Disse forbindelsene er tilbøyelige til å være mindre aktive (cytotoksiske), men har lavere toksisitet og forbedrede farmakokinetikkegenskaper. Når R5ikke er hydrogen, genereres et kiralt sentrum, og vi har funnet at det er forskjell i aktivitet mellom diastereoisomerene.

Forbindelser hvor R2er en ester eller en eter, er også foretrukne forbindelser. Generelt har de forbedrede toksikologiegenskaper og gir således et bredere terapeutisk vindu. Av disse er forbindelser med en ester eller et karbonat i denne stillingen mest foretrukket, og særlig karbonater. Estere med voluminøse grupper (lange alifatiske eller aromatiske rester) gir bedre resultater. Blant karbonatene er tert.-butyloksykarbonyl (tBOC) og vinyloksykarbonyl (VOC) de mest foretrukne substituenter for disse stillingene.

Det finnes forbindelser som har gode ADME-egenskaper (absorpsjon-fordeling-metabolisme-utskillelse), noe som er god indikasjon for farmakokinetikk.

Som nevnt ovenfor, har forbindelser ifølge foreliggende oppfinnelse, fortrinnsvis de med voluminøse substituerte grupper, et godt terapeutisk vindu, og forestringen av fenolene med forskjellige syrer og karbonater resulterer i en generell forbedring av de farmasøytiske egenskapene: det er en signifikant reduksjon i hepatocytt-toksisitet, og også en god profil for legemiddel-legemiddel-interaksjoner ettersom disse derivatene ikke oppviser cytokrominhibering og dessuten har høyere metabolsk stabilitet.

Flere aktive antitumorforbindelser er blitt fremstilt, og det antas at mange flere forbindelser kan dannes i overensstemmelse med læren i den foreliggende beskrivelse.

Antitumoraktiviteter av disse forbindelsene omfatter leukemier, lungekreft, tykktarmskreft, nyrekreft, prostatakreft, eggstokkreft, brystkreft, sarkomer og melanomer.

En annen spesielt foretrukket utførelsesform av den foreliggende oppfinnelse er farmasøytiske preparater som kan anvendes som antitumormidler, og som inneholder som aktiv bestanddel en forbindelse eller forbindelser ifølge oppfinnelsen, samt fremgangsmåtene for deres fremstilling.

Eksempler på farmasøytiske preparater omfatter ethvert fast stoff (tabletter, piller, kapsler, granulater, etc.) eller enhver væske (oppløsninger, suspensjoner eller emulsjoner) med egnede sammensetninger for oral, topisk eller parenteral administrering.

Administrering av forbindelsene eller preparatene ifølge foreliggende oppfinnelse kan skje ved hjelp av hvilken som helst egnet metode, slik som intravenøs innsprøytning, oralt preparat, intraperitonealt og intravenøst preparat.

Forbindelsene og preparatene ifølge denne oppfinnelsen kan anvendes sammen med andre legemidler for å tilveiebringe en kombinasjonsterapi. De andre legemidlene kan utgjøre en del av det samme preparat, eller kan tilveiebringes som et separat preparat for administrering samtidig eller til en annen tid. Identiteten til det andre legemidlet er ikke spesielt begrenset, og egnede kandidater omfatter: a) legemidler med antimitotiske effekter, spesielt de som angriper cytoskjelettelementer, inkludert mikrorørmodulatorer, slik som taxan-legemidler (slik som taxol, paklitaxel, taxotere, docetaxel), podofylotoksiner eller vinkaalkaloider (vinkristin, vinblastin); b) antimetabolitt-legemidler, slik som 5-fluorouracil, cytarabin, gemcitabin, slike purinanaloger som pentostatin, og metotreksat); c) alkyleringsmidler, slik som nitrogensennepsforbindelser (slik som cyklofosfamid eller ifosfamid); d) legemidler som er rettet mot DNA, slik som antrasyklin-legemidlene adriamycin, doksorubicin, farmorubicin og epirubicin; e) legemidler som er rettet mot topoisomeraser, slik som etoposid; f) hormoner og hormonagonister eller -antagonister, slik som østrogener, antiøstrogener (tamoksifen og beslektede forbindelser) og androgener, flutamid, leuprorelin, goserelin, cyprotron eller octreotid; g) legemidler som er rettet mot signaltransduksjon i tumorceller, inkludert antistoffderivater, slik som herceptin; h) alkylerings-legemidler, slik som platina-legemidler (cis-platin, karbonplatin, oksaliplatin, paraplatin) eller nitrosoureaforbindelser;

i) legemidler som potensielt påvirker metastase av tumorer, slik som matriks-metalloproteinaseinhibitorer;

j) genterapi- og antisense-midler;

k) antistoff-terapeutika;

I) andre bioaktive forbindelser av marin opprinnelse, især slike didemniner som aplidin;

m) steroid-analoger, særlig dexametason;

n) anti-inflammatoriske legemidler, særlig dexametason; og o) anti-emetiske legemidler, særlig dexametason.

Nok en annen spesielt foretrukket utførelsesform av den foreliggende oppfinnelse er de syntetiske mellomproduktene for forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse som beskrevet nærmere nedenunder.

Nærmere beskrivelse av de foretrukne utførelsesformer

Én klasse av foretrukne forbindelser ifølge denne oppfinnelsen omfatter forbindelser ifølge oppfinnelsen som har én eller flere av de følgende substituenter: Ri er hydroksy, halogen, spesielt fluor, alkoksy, spesielt metoksy, eller aralkyl, spesielt benzyl;

R2er hydrogen;

alkyl, mer foretrukket alkyl med 1-6 karbonatomer;

C(=0)R', hvor R' er alkyl, mer foretrukket alkyl med 1-24 karbonatomer, spesielt 1-8 eller 12-18 karbonatomer;

haloalkyl, mer foretrukket co-klor- eller perfluor-alkyl med 1-4 karbonatomer, spesielt co-kloretyl eller perfluormetyl, etyl eller propyl;

heterosyklisk alkyl, mer foretrukket alkyl med 1-6 karbonatomer med en co-heterosyklisk substituent som passende har 5 til 10 ringatomer og 1-4 heteroatomer, inkludert kondensert, heteroalisyklisk rest med 3 heteroatomer, slik som biotin;

aminoalkyl, mer foretrukket alkyl med 1-6 karbonatomer, spesielt 2 karbonatomer, med en cD-aminogruppe som eventuelt er beskyttet f.eks. med alkoksykarbonyl, slik som (CH3)3C-0-C=0- eller annen beskyttelsesgruppe;

arylalkylen, spesielt cinnamoyl;

alkylen, spesielt vinyl eller allyl;

aralkyl, slik som benzyl; eller

C(=0)OR', hvor R' er alkyl, mer foretrukket alkyl med 1-6 karbonatomer, spesielt forgrenet alkyl; alkenyl, mer foretrukket allyl;

R3er hydrogen;

alkyl, mer foretrukket alkyl med 1-6 karbonatomer;

(C=0)R', hvor R' er alkoksy, spesielt med en alkylgruppe med 1-6 karbonatomer;

alkyl, mer foretrukket alkyl med 1-24 karbonatomer, fortrinnsvis 1-8 eller 12-18 karbonatomer;

haloalkyl, mer foretrukket perfluoralkyl med 1-4 karbonatomer, spesielt perfluormetyl, etyl eller propyl;

arylalkylen, spesielt cinnamoyl;

heterosyklisk alkyl, mer foretrukket alkyl med 1-6 karbonatomer med en co-heterosyklisk substituent som passende har 5 til 12 ringatomer og 1-4 heteroatomer, inkludert kondensert, heterosyklisk ring med 3 ringatomer, slik som biotin;

heterosyklisk alkyl med fortrinnsvis 1 karbonatom i alkylgruppen og mer foretrukket heteroalisyklisk metyl med 5-10 ringatomer og 1-4 ringatomer, spesielt kondensert heteroring med 1-4 heteroatomer, slik som dimetylaminokumarin eller kumarin;

alkylen, spesielt allyl;

aralkyl, slik som benzyl;

(C=0)OR', hvor R' er alkyl, mer foretrukket alkyl med 1-6 karbonatomer;

alkylen, spesielt vinyl eller allyl; og

aralkyl, slik som benzyl.

R4er hydrogen;

alkyl, mer foretrukket alkyl med 1-6 karbonatomer; eller

(C=0)OR', hvor R' er alkylen, spesielt vinyl.

R5er hydrogen eller alkyl.

X er hydroksy, cyan.

m er 0 eller 1.

n er 1.

Ved et beslektet aspekt av denne oppfinnelsen har forbindelsene ett eller flere av de følgende trekk: R2er ikke acetyl. Fortrinnsvis har den minst 4, 5 eller 6 karbonatomer, f.eks. opp til 18 eller 24 karbonatomer. Egnede substituenter omfatter esterne COR', hvor R' er alkyl, alkenyl, ofte med én eller flere substituenter. Alkyl, substituert alkyl, alkenyl og arylalkenyl er foretrukket, med egnede substituenter, inkludert aryl, og heterosyklisk rest. Andre definisjoner for R2omfatter estere med formel COR' avledet fra en aminosyre, eventuelt en beskyttet aminosyre.

R3er ikke hydrogen. Fortrinnsvis er den R', COR' eller COOR', hvor R' er en substituent med et visst volum. Slike voluminøse substituenter omfatter de grupper med forgrenet kjede, umettede grupper eller sykliske grupper, inkludert aromatiske grupper. Forgrenet alkyl, sykloalkyl, forgrenet alkenyl, aryl, heteroaromatisk rest og beslektede grupper er således foretrukket for innlemmelse i strukturen til substituenten R3. Fortrinnsvis er totalantallet av karbonatomer i R32-24, mer foretrukket 6-18 karbonatomer. Typisk er R3en ester, eter eller et karbonat, og har formelen COR', R' eller COOR'.

R5er ikke hydrogen. Fortrinnsvis er den R', COR' eller COOR', hvor R' er en substituent med et visst volum. Slike voluminøse substituenter omfatter de med grupper med forgrenet kjede, umettede grupper eller sykliske grupper, inkludert aromatiske grupper. Forgrenet alkyl, sykloalkyl, forgrenet alkenyl, aryl, heteroaromatisk rest og beslektede grupper er således foretrukket for innlemmelse i strukturen til substituenten R5. Fortrinnsvis er totalantallet av karbonatomer i R52-24, mer foretrukket 6-18 karbonatomer. Typisk er R4en ester, eter eller et karbonat, og har formelen COR', R' eller COOR'.

Eksempler på beskyttelsesgrupper for amino og andre substituenter er angitt i WO 0069862.

Det vises dessuten til WO 0069862, WO 0177115, WO 0187894 og WO 0187895 med hensyn på deres omtale av substituenter som tilsvarer substituentene ifølge foreliggende oppfinnelse.

Videre kreves ikke noen av forbindelsene som er beskrevet i de tidligere søknadene, inkludert WO 9209607, og alle slike forbindelser utelukkes uttrykkelig.

Beskrevet i internasjonal patentsøknad WO 0069862 er forbindelse 36 (et mellomprodukt ved omdannelsen av cyansafracin B til ecteinascidin 743).

Dette halvsyntetiske mellomprodukt har tjent som utgangsmateriale for syntesen av ecteinascidin 736, et ytterligere medlem av den naturlig forekommende ecteinascidinfamilie med potensiell, terapeutisk antitumoraktivitet.

Den foretrukne fremgangsmåte for fremstilling av forbindelser beslektet med ecteinascidin 736 med forskjellige substituenter i tetrahydro-p-karbolin-enheten og i stilling 18 (-OR4) er beskrevet nedenunder i det etterfølgende reaksjonsskjema.

Som illustrert i reaksjonsskjema 1, kan mellomprodukt 36 omdannes til ET-736 (eller et substituert derivat) i to trinn.

Det første trinnet for fremstilling av de foretrukne forbindelsene av type I ifølge foreliggende oppfinnelse fra forbindelse 36 er innføringen av tetrahydro-p-karbolin-enheten ved omsetning med det tilsvarende primære eller sekundære amin.

Det andre trinnet er omdannelsen av CN-gruppen til en OH-gruppe ved omsetning med sølvnitrat i ACN/H20.

Det er også mulig å oppnå nye derivater med forskjellige substituentgrupper (-OR4, 18-stilling og =NR5) gjennom en acylerings- eller alkyleringsreaksjon fra de foretrukne forbindelser I. I alle disse tilfellene er Ri og R2i utgangsmaterialet et hydrogenatom. Fra det samme mellomprodukt og gjennom en alkyleringsreaksjon med allylbromid eller en acyleringsreaksjon med vinylklorformiat kan det oppnås N- og O-allylerte og N- og O-vinylderivater. Alle disse forbindelsene ved omsetning med sølvnitrat fører til sluttproduktene hvor CN-gruppen er omdannet til en OH-gruppe.

Som fagfolk innen teknikken lett vil forstå, kan reaksjonsskjemaet som er beskrevet her, modifiseres ved anvendelse av et bredt spekter av substituerte, primære aminer for å fremstille en serie av substituerte ecteinascidin 736-derivater for å danne forbindelser som er en del av denne oppfinnelsen.

Særlig kan reaksjonsbetingelsene varieres til å passe andre kombinasjoner av substituentgruppene i tetrahydro-p-karbolin-enheten.

Den foretrukne fremgangsmåte for fremstilling av ecteinascidin 694 og beslektede forbindelser med forskjellige substituenter i 5- og 18-stillingen (-OR6og -OR7) er beskrevet nedenunder i det følgende reaksjonsskjema.

I reaksjonsskjema 2 gjør hydrolysen av acetylgruppen i C-5 under basiske betingelser det mulig å fremstille mellomproduktet med hydroksylgruppen i denne stillingen. Fra denne forbindelsen og ved hjelp av en acyleringsreaksjon med anhydrider, syreklorider eller karboksylsyrer fremstilles nye derivater som er mono-O-substituerte, og mono- og di-O-substituerte (i C-5 og C-18). Reaksjonen for omdannelse av CN-gruppen til OH utføres ved de klassiske betingelsene (sølvnitrat i CH3CN/H20). På den annen side kan Et-694 fås fra Et-736 gjennom hydrolysen av acetylgruppen i C-5 med KOH/MeOH.

Som fagfolk innen teknikken lett vil forstå, kan reaksjonsskjemaet som er beskrevet her, modifiseres ved anvendelse av et bredt spekter av substituerte, primære aminer for å fremstille en serie av substituerte ecteinascidin 736-CN-derivater for å danne forbindelser som er en del av denne oppfinnelsen..

Særlig kan reaksjonsbetingelsene varieres for å passe til andre kombinasjoner av substituentgruppene i tetrahydro-p-karbolin-enheten og i C-5- og C-18-stillingene.

Den foreliggende oppfinnelse vil bli illustrert nærmere med henvisning til de etterfølgende eksempler som hjelper til i forståelsen av denne.

FORSØKSDEL

Reaksjonsskjema 1

Metode 1. Til en løsning av 1 ekvivalent utgangsmateriale i eddiksyre (5,33 E-5M) under argon ved romtemperatur tilsettes 3,5 ekvivalenter tryptamin. Reaksjonsblandingen ble omrørt i løpet av 24 timer, og eddiksyren ble avdampet. En vandig, mettet oppløsning av NaHC03ble tilsatt, og blandingen ble ekstrahert med CH2CI2, og de organiske lagene ble tørket over Na2S04. Hurtigkromatografi gir rene forbindelser.

Metode 2. Til en løsning av 1 ekvivalent av forbindelse 1 i CH2CI2(0,032 M) under argon ved romtemperatur ble det tilsatt 2 ekvivalenter Et3N og 2 ekvivalenter av buty ry I kloridet eller Boc-anhydridet (3 ekvivalenter) eller vinylklorformiat. Reaksjonen ble fulgt ved hjelp av TLC og stanset med en vandig, mettet oppløsning av NaHC03, reaksjonsblandingen ble ekstrahert med CH2CI2og de organiske lagene tørket over Na2S04. Hurtigkromatografi gir ren forbindelse.

Metode 3. Til en oppløsning av 1 ekvivalent av forbindelse 1 i DMF (0,032 M) under argon ved romtemperatur ble det tilsatt 3 ekvivalenter Cs2C03og 3 ekvivalenter av allylbromidet. Reaksjonen ble fulgt ved hjelp av TLC og stanset med en vandig, mettet oppløsning av NaHC03, reaksjonsblandingen ble ekstrahert med CH2CI2og de organiske lagene tørket over Na2S04. Hurtigkromatografi giren blanding av to rene forbindelser: forbindelse 24 (ET-736-CN-AII) og forbindelse 25 (ET-736-CN-diAII).

Metode 4. Til en oppløsning av 1 ekvivalent utgangsmateriale i CH3CN/H20 3:2 (0,009 M) ble det tilsatt 30 ekvivalenter AgN03. Etter 24 timer ble reaksjonen stanset med en blanding i forholdet 1:1 av mettede oppløsninger av koksalt og NaHC03, det ble omrørt i 10 minutter og fortynnet og ekstrahert med CH2CI2. Det organiske lag ble tørket med Na2S04. Kromatografi gir rene forbindelser.

Metode 1:

Forbindelse 1 (referanse forbindelse):<1>H-NMR (300 MHz, CDCI3): 8 7,74 (s, 1H); 7,38 (d, 1H); 7,25 (d, 1H); 7,08 (t, 1H); 7,00 (t, 1H); 6,66 (s, 1H); 6,22 (d, 1H); 6,02 (d, 1H); 5,79 (s, 1H); 5,08 (d, 1H); 4,55 (s, 1H); 4,32 (s, 1H); 4,27 (d, 1H); 4,21 (s, 1H); 4,19 (d, 1H); 3,81 (s, 3H); 3,44-3,40 (m, 2H); 3,18-2,78 (m, 4H); 2,71-2,51 (m, 3H); 2,37 (s, 3H); 2,26 (s, 3H); 2,21 (s, 3H); 2,06 (s, 3H).<13>C-NMR (75 MHz, CDCI3): 8 171,7, 168,9, 148,2, 145,9, 143,2, 141,3, 140,5, 135,7, 130,8, 130,6, 129,5, 127,0, 122,2, 120,9, 120,8, 119,5, 118,6, 118,4, 113,8, 111,1, 110,5, 102,2, 62,5, 61,5, 60,8, 60,5, 59,7, 55,9, 54,8, 42,1, 41,7, 40,0, 39,5, 29,9, 24,0, 21,7, 20,8, 16,1, 9,9. ESI-MS m/z: Beregn, for C41H41N508S: 763,3. Funnet (M+H<+>): 764,2. Forbindelse 2:<1>H-NMR (300 MHz, CDCI3): 8 7,64 (s, 1H); 7,12 (d, 1H); 6,81 (d, 1H); 6,73 (dd, 1H); 6,65 (s, 1H); 6,19 (s, 1H); 6,00 (s, 1H); 5,79 (s, 1H); 5,0 (d, 1H); 4,54 (s, 1H); 4,30 (s, 1H); 4,27 (d, 1H); 4,20 (s, 1H); 4,18 (d, 1H); 3,80 (s, 3H); 3,78 (s, 3H); 3,43-3,40 (m, 2H); 3,18-2,77 (m, 4H); 2,66-2,49 (m, 3H); 2,37 (s, 3H); 2,34-2,20 (m, 1H); 2,26 (s, 3H); 2,21 (s, 3H); 2,05 (s, 3H).<13>C-NMR (75 MHz, CDCI3): 8 171,4, 168,6, 153,7, 148,0, 145,6, 142,9, 141,0, 140,2, 131,1, 130,6, 130,5, 129,2, 127,0, 120,6, 120,5, 118,2, 113,6, 111,9, 111,6, 110,0, 102,0, 100,3, 62,3, 61,2, 60,5, 60,2, 59,4, 55,7, 54,6, 54,5, 41,8, 41,4, 39,7, 39,2, 31,5, 29,6, 23,8, 22,6, 21,5, 20,5, 15,8, 14,4, 9,7, ESI-MS m/z: Beregn, for C42H43N509S: 793,3. Funnet (M+H<+>): 794,7.

Forbindelse 3:<1>H-NMR (300 MHz, CDCI3): 8 7,85 (s, 1H);

7.45- 7,36 (m, 5H); 7,01 (t, 1H); 6,91 (t, 1H); 6,65-6,63 (m, 2H); 5,87 (s, 1H); 5,77 (s, 1H); 5,63 (s, 1H); 5,13 (s, 2H);

5,05 (d, 1H); 4,53 (s, 1H); 4,27-4,19 (m, 4H); 3,80 (s, 3H);

3.46- 3,39 (m 2H); 3,06-2,79 (m, 4H); 2,68-2,50 (m 2H);

2,42-2,20 (m, 1H); 2,36 (s, 3H); 2,27 (s, 3H); 2,20 (s, 3H);

2,03 (s, 3H).

ESI-MS m/z: Beregn, for C48H47N509S: 869,3. Funnet (M+H<+>): 870,3.

Forbindelse 4:<1>H-NMR (300 MHz, CDCI3): 8 7,36 (s, 1H);

7,44-7,25 (m 5H); 7,13 (d, 1H); 6,91 (d, 1H); 6,82 (dd, 1H);

6,65 (s, 1H); 6,21 (d, 1H); 6,01 (d, 1H); 5,80 (s, 1H); 5,08 (d, 1H); 5,03 (s, 2H); 4,55 (s, 1H); 4,31 (s, 1H); 4,27 (d, 1H);

4,20-4,10 (m, 3H); 3,81 (s, 3H); 3,44-3,40 (m 2H); 3,18-2,77 (m, 4H); 2,60-2,46 (m, 2H); 2,37 (s, 3H); 2,35-2,19 (m, 1H);

2,26 (s, 3H); 2,21 (s, 3H); 2,06 (s, 3H).

ESI-MS m/z: Beregn, for C48H47N5O9S: 869,3. Funnet (M+H<+>): 870,3.

Forbindelse 5:<1>H-NMR (300 MHz, CDCI3): 5 7,63 (s, 1H);

7,15-7,11 (m, 2H); 6,91 (dd, 1H); 6,65 (s, 1H); 6,21 (d, 1H);

6,01 (s, 1H); 5,78 (s, 1H); 5,07 (d, 1H); 4,54 (s, 1H); 4,31 (s, 1H); 4,27 (d, 1H); 4,21-4,16 (m, 2H); 3,81 (s, 3H); 3,44-3,40 (m, 2H); 3,17-2,77 (m, 4H); 2,66-2,46 (m, 3H); 2,31 (s, 6H);

2,26 (s, 3H); 2,21 (s, 3H); 2,06 (s, 3H).

ESI-MS m/z: Beregn, for C42H43N508S: 777,3. Funnet (M+Na<+>):

800,7.

Forbindelse 6:<1>H-NMR (300 MHz, CDCI3): 8 7,66 (s, 1H); 6,95 (d, 1H); 6,64 (s, 2H); 6,56 (dd, 1H); 6,15 (s, 1H); 5,97 (s, 1H);

5,81 (s, 1H); 5,06 (d, 1H); 4,53 (s, 1H); 4,29 (s, 1H); 4,26 (d, 1H); 4,19 (s, 1H); 4,17 (d, 1H); 3,80 (s, 3H); 4,41-3,39 (m, 2H); 3,12-2,73(m, 4H); 2,55-2,27(m, 3H); 2,36(s, 3H); 2,25 (s, 3H); 2,20 (s, 3H); 2,04 (s, 3H).

ESI-MS m/z: Beregn, for C4iH4iN509S: 779,3. Funnet (M+H<+>):

780,3.

Forbindelse 7:<1>H-NMR (300 MHz, CDCI3): 8 7,75 (s, 1H);

7,26 (dd, 1H); 6,93 (dd, 1H); 6,76 (ddd, 1H); 6,65 (s, 1H);

6,22 (d, 1H); 6,01 (d, 1H); 5,79 (s, 1H); 5,08 (d, 1H); 4,55 (s, 1H); 4,31 (s, 1H); 4,25 (d, 1H); 4,20 (s, 1H); 4,18 (dd, 1H); 3,80 (s, 3H); 3,43-3,40 (m, 2H); 3,18-2,77 (m, 4H);

2,64-2,50 (m, 3H); 2,36 (s, 3H); 2,26 (s, 3H); 2,21 (s, 3H);

2,06 (s, 3H).

ESI-MS m/z: Beregn, for C41H40FN5O8S: 781,3. Funnet (M+H<+>): 782,3.

Forbindelse 8:<1>H-NMR (300 MHz, CDCI3): 8 6,93 (d, 1H); 6,80 (s, 1H); 6,73 (s, 1H); 6,67 (dd, 1H); 6,46 (s, 1H); 6,20 (s, 1H); 6,06 (s, 1H); 5,72 (s, 1H); 4,96 (d, 1H); 4,45 (s, 1H); 4,37 (d, 1H); 4,25 (d, 1H); 4,05-4,01 (m, 2H); 3,79 (s, 3H); 3,63 (d, 1H); 3,39 (d, 1H); 3,03-3,91 (m, 2H); 2,76-2,34 (m, 5H); 3,30 (s, 3H); 2,28 (s, 3H); 2,21 (s, 3H); 2,18 (s, 3H); 2,04 (s, 3H). ESI-MS m/z: Beregn, for C42H43N509S: 793,3. Funnet (M+H<+>): 794,3.

Forbindelse 9:<1>H-NMR (300 MHz, CDCI3): 5 7,63 (s, 1H);

7,24 (d, 1H); 6,75 (d, 1H); 6,66 (dd, 1H); 6,65 (s, 1H);

6,20 (s, 1H); 6,00 (s, 1H); 5,79 (s, 1H); 5,07 (d, 1H); 4,54 (s, 1H); 4,31 (s, 1H); 4,27 (d, 1H); 4,20 (d, 1H); 4,17 (dd, 1H); 3,80 (s, 3H); 3,71 (s, 3H); 3,43-3,40 (m, 2H); 3,16-2,78 (m, 4H); 2,64-2,49 (m, 3H); 2,36 (s, 3H); 2,25 (s,

■3H); 2,21 (s, 3H); 2,06 (s, 3H).

ESI-MS m/z: Beregn, for C42H43N509S: 793,3. Funnet (M+H<+>): 794,3.

Forbindelse 10:<1>H-NMR (300 MHz, CDCI3): 5 7,76 (s, 1H); 7,14 (dd, 1H); 7,00 (dd, 1H); 6,81 (ddd, 1H); 6,65 (s, 1H); 6,21 (d,

1H); 6,00 (d, 1H); 5,79 (s, 1H); 5,07 (d, 1H); 4,55 (s, 1H); 4,31 (s, 1H); 4,27 (dd, 1H); 4,20 (d, 1H); 4,18 (dd, 1H); 3,80(s, 3H);

3,44-3,40 (m, 2H); 3,16-2,77 (m, 4H); 2,64-2,44 (m, 3H); 2,37 (s, 3H); 2,26 (s, -3H); 2,21 (s, 3H); 2,05 (s, 3H).

ESI-MS m/z: Beregn, for C41H40FN5O8S: 781,3. Funnet (M+H<+>):

782,1.

Forbindelse 11:<1>H-NMR (300 MHz, CDCI3): 8 7,48 (s, 1H);

7,22 (d, 1H); 6,96-6,88 (m, 2H); 6,65 (s, 1H); 6,15 (d, 1H);

6,04 (d, 1H); 5,78 (s, 1H); 5,09 (d, 1H); 4,55 (s, 1H); 4,34 (s, 1H); 4,28-4,20 (m, 3H); 3,81 (s, 3H); 3,48 (d, 1H); 3,42 (d, 1H); 3,12-2,78 (m, 4H); 2,69-2,43 (m, 3H); 2,37 (s, 3H);

2,36 (s, 3H); 2,28 (s, -3H); 2,21 (s, 3H); 2,06 (s, 3H).

ESI-MS m/z: Beregn, for C42H43N508S: 777,3. Funnet (M+H<+>):

778,3. Forbindelse 12 (første isomer):<1>H-NMR (300 MHz, CDCI3): 5 7,68 (s, 1H); 7,05 (d, 1H); 6,63-6,57 (m, 3H); 6,22 (d, 1H); 6,02 (d, 1H); 5,73 (s, 1H); 5,12 (d, 1H); 4,58 (s, 1H); 4,36 (s, 1H); 4,34-4,22 (m, 3H); 3,80 (s, 3H); 3,47-3,42 (m, 2H); 3,05-2,86 (m, 2H); 2,67-2,35 (m, 2H); 2,32-2,05 (m, 3H); 2,31 (s, 3H); 2,28 (s, 3H); 2,15 (s, 3H); 2,03 (s, 3H); 1,07 (d, 3H). ESI-MS m/z: Beregn, for C42H43N509S: 793,2. Funnet (M+H<+>): 794,2.

Forbindelse 13 (andre isomer):<1>H-NMR (300 MHz, CDCI3): 8 7,54 (s, 1H); 7,08 (d, 1H); 6,73 (d, 1H); 6,63 (dd, 1H); 6,57 (s, 1H); 6,20 (d, 1H); 6,00 (d, 1H); 5,74 (s, 1H); 5,02 (d, 1H); 4,60 (s, 1H); 4,33 (s, 1H); 4,27 (d, 1H); 4,22 (d, 1H); 4,12 (dd, 1H); 3,80 (s, 3H);

3,44-3,32 (m, 3H); 3,05-2,89 (m, 2H); 2,49-2,03 (m, 4H); 2,32 (s, 3H); 2,24 (s, 3H); 2,18 (s, -3H); 2,07 (s, 3H); 1,21 (d, 3H).

ESI-MS m/z: Beregn, for C42H43N509S: 793,2. Funnet (M+H<+>): 794,2.

Forbindelse 16 (første isomer):<1>H-NMR (300 MHz, CDCI3): 5 7,82 (s, 1H); 7,14 (dd, 1H); 6,96 (dd, 1H); 6,82 (ddd, 1H); 6,61 (s, 1H); 6,23 (d, 1H); 6,02 (d, 1H); 5,72 (s, 1H); 5,12 (d, 1H);

4,59 (s, 1H); 4,37 (s, 1H); 4,32-4,25 (m, 3H); 3,80 (s, 3H);

3,48-3,43 (m, 2H); 3,05-2,86 (m, 4H); 2,78-2,70 (m, 1H); 2,60-2,34 (m, 3H); 2,31 (s, 3H); 2,27 (s, 3H); 2,16 (s, 3H); 2,03 (s, 3H); 1,12 (d, 3H).

ESI-MS m/z: Beregn, for C42H42FN508S: 795,3. Funnet (M+H<+>): 796,2.

Forbindelse 17 (andre isomer):<1>H-NMR (300 MHz, CDCI3): 8 7,65 (s, 1H); 7,18 (dd, 1H); 6,99 (dd, 1H); 6,83 (ddd, 1H); 6,58 (s, 1H); 6,22 (d, 1H); 6,01 (d, 1H); 5,74 (s, 1H); 5,03 (d, 1H); 4,61 (s, 1H); 4,34 (s, 1H); 4,27 (d, 1H); 4,22 (d, 1H); 4,14-4,10 (m, 1H); 3,80 (s, 3H); 3,44 (d, 2H); 3,38-3,30 (m, 1H); 3,06-2,99 (m, 2H); 2,50 (dd, 1H); 2,43 (d, 1H); 2,32 (s, 3H); 2,24 (s, 3H); 2,18 (s, 3H); 2,16-2,11 (m, 2H); 2,08 (s, 3H); 1,20 (d, 3H).

ESI-MS m/z: Beregn, for C42H42FN508S: 795,3. Funnet (M+H<+>): 796,2.

Metode 4:

Forbindelse 26 (referanse eksempel):<1>H-NMR (300 MHz, CDCI3): 8 7,70 (s, 1H); 7,38 (d, 1H); 7,24 (d, 1H); 7,08 (t, 1H);

7,00 (t, 1H); 6,67 (s, 1H); 6,20 (d, 1H); 5,99 (d, 1H); 5,74 (s,

1H); 5,20 (d, 1H); 4,82 (s, 1H); 4,347-4,38 (m, 3H); 4,16-4,10 (m, 2H); 3,81 (s, 3H); 3,49 (d, 1H); 3,22-3,13 (m, 2H); 3,00 (d, 1H); 2,88-2,79 (m, 2H); 2,71-2,52 (m, 3H); 2,37 (s, 3H); 2,28-2,24 (m, 1H); 2,25 (s, 3H); 2,19 (s, 3H); 2,05 (s, 3H).

<13>C-NMR (75 MHz, CDCI3): 8 171,4, 168,7, 147,8, 145,4, 142,8,

141,0, 140,6, 135,4, 131,2, 130,9, 129,0, 126,8, 121,8, 121,3, 120,9, 119,1, 118,3, 118,1, 115,5, 112,8, 110,8, 110,1, 101,7, 81,9, 62,3, 61,8, 60,2,57,6, 57,4, 55,8, 54,9, 42,1, 41,2, 39,7, 39,2, 31,5, 23,5, 22,6, 21,5, 20,5, 15,8, 14,0, 9,6.

ESI-MS m/z: Beregn, for C40H42N4O9S: 754,3. Funnet (M-H20+H<+>): 737,2.

Forbindelse 27:<1>H-NMR (300 MHz, CDCI3): 5 7,59 (s, 1H);

7,13 (d, 1H); 6,81 (s, 1H); 6,73 (dd, 1H); 6,67 (s, 1H); 6,19 (d, 1H); 5,99 (d, 1H); 5,74 (s, 1H); 5,19 (d, 1H); 4,82 (s, 1H); 4,49-4,47 (m, 2H); 4,16-4,09 (m, 2H); 3,81 (s, 3H);

3,79 (s, 3H); 3,50-3,45 (m, 2H); 3,24-3,13 (m, 2H); 3,02 (d, 1H); 2,88-2,79 (m, 2H); 2,67-2,48 (m, 3H); 2,37 (s, 3H);

2,30-2,24 (m, 1H); 2,25 (s, 3H); 2,19 (s, 3H); 2,04 (s, 3H).

<13>C-NMR (75 MHz, CDCI3): 8 171,6, 154,0, 148,1, 145,6, 143,1, 141,3, 140,9, 131,9, 131,4, 130,8, 129,3, 127,4, 121,5, 121,2, 115,7, 113,1, 112,1, 111,8, 110,1, 102,0, 100,6, 82,1, 62,6, 62,0, 60,5, 57,9, 57,6, 56,1, 56,0, 55,2, 42,4, 41,5, 40,0, 39,4, 31,8, 29,9, 23,8, 22,8, 21,8, 20,8, 16,0, 14,6, 9,9.

ESI-MS m/z: Beregn, for C4oH42N409S: 784,4. Funnet (M-H20+H<+>): 767,2.

Forbindelse 28:<1>H-NMR (300 MHz, CDCI3): 8 7,81 (s, 1H);

7,43-7,36 (m, 5H); 7,01 (d, 1H); 6,91 (t, 1H); 6,66 (s, 1H);

6,63 (d, 1H); 5,84 (s, 1H); 5,75 (s, 1H); 5,60 (s, 1H); 5,20-5,09 (m, 3H); 4,78 (s, 1H); 4,49 (d, 1H); 4,44 (s, 1H); 4,16 (s, 1H); 4,14-4,12 (m, 1H); 3,81 (s, 3H); 3,52 (d, 1H); 3,47 (s, 2H); 3,22-2,80 (m, 5H); 2,68-2,51 (m, 2H); 2,36 (s, 3H);

2,39-2,21 (m, 1H); 2,27 (s, 3H); 2,18 (s, 3H); 2,02 (s, 3H).

<13>C-NMR (75 MHz, CDCI3): 8 171,4, 148,0, 145,6, 145,2, 143,1, 141,1, 140,8, 137,3, 131,6, 130.7, 129,3, 128,8, 128,5, 128,2, 128,0, 126,2, 121,4, 121,3, 119,8, 118,1, 115,5, 113,0, 111.8, 111,0, 103,8, 101,8, 82,1, 70,6, 62,9, 61,9, 60,5, 58,0, 57,7, 56,1, 55,1, 42,3, 41,5, 40,0, 39,5, 29,9, 23,9, 22,0, 20,7, 16,0, 9,8.

ESI-MS m/z: Beregn, for C47H48N4O10S: 860,3. Funnet (M-H20+H<+>): 843,3.

Forbindelse 29:<1>H-NMR (300 MHz, CDCI3): 8 7,59 (s, 1H);

7,44-7,25 (m, 5H); 7,13 (d, 1H); 6,91 (s, 1H); 6,82 (d, 1H);

6,66 (s, 1H); 6,19 (s, 1H); 5,98 (s, 1H); 5,75 (s, 1H); 5,19 (d, 1H); 5,03 (s, 2H); 4,82 (s, 1H); 4,49-4,47 (m, 2H); 4,17-4,09 (m, 2H); 3,81 (s, 3H); 3,49-3,47 (m, 2H); 3,24-2,80 (m, 5H);

2,64-2,50 (m, 3H); 2,37 (s, 3H); 2,25 (s, 3H); 2,19 (s, 3H);

2,05 (s, 3H).

<13>C-NMR (75 MHz, CDCI3): 8 171,4, 168,6, 153,2, 148,1,

145.7, 143,1, 141,3, 140,9, 137,9, 131,0, 129,7, 128,6, 127,9, 127,8, 127,4, 121,2, 115,7, 112.8, 111,8, 110,2, 102,3, 102,0, 82,1, 71,1, 62,5, 62,0, 60,5, 58,0, 57,6, 56,1, 55,2, 42,4, 41,5, 40,0, 39,4, 32,1, 29,9, 29,5, 23,8, 22,9, 21,8, 20,8, 16,0, 14,6, 9,9.

ESI-MS m/z: Beregn, for C47H48N4O10S: 860,3. Funnet (M-H20+H<+>): 843,3.

Forbindelse 30:<1>H-NMR (300 MHz, CDCI3): 5 7,61 (s, 1H);

7,16-7,11 (m, 2H); 6,91 (d, 1H); 6,67 (s, 1H); 6,20 (d, 1H);

5,99 (d, 1H); 5,75 (s, 1H); 5,20 (d, 1H); 4,82 (s, 1H); 4,49 (d, 1H); 4,35 (s, 1H); 4,16 (d, 2H); 4,11 (dd, 1H); 3,81 (s, 3H);

3,48 (s, 1H); 3,23-2,79 (m, 5H); 2,67-2,47 (m, 3H); 2,37 (s, 6H); 2,25 (s, 3H); 2,19 (s, 3H); 2,05 (s, 3H).

<13>C-NMR (75 MHz, CDCI3): 8 174,5, 171,6, 168,9, 148,1, 145,6,

143,1, 141,3, 140,9, 134,0, 131,2, 128,6, 127,3, 123,6, 121,5,

121,2, 118,3, 115,7, 109,9, 102,0, 82,1, 62,6, 62,0, 60,5, 57,9, 57,7, 56,1, 56,2, 42,4, 41,5, 40,0, 39,4, 29,9, 23,8, 21,7, 21,6, 20,8, 16,0, 9,9.

ESI-MS m/z: Beregn, for C41H44N409S: 768,3. Funnet (M-H20+H<+>): 751,3.

Forbindelse 31:<1>H-NMR (300 MHz, CDCI3): 8 7,60 (s, 1H);

7,00 (d, 1H); 6,69 (d, 1H); 6,66 (s, 1H); 6,69 (dd, 1H); 6,16

(s, 1H); 5,96 (s, 1H); 5,78 (s, 1H); 5,19 (d, 1H); 4,82 (s, 1H);

4,49 (d, 1H); 4,46 (s, 1H); 4,17 (d, 1H); 4,10 (d, 1H); 3,81 (s, 3H); 3,72-3,59 (m, 2H); 3,64 (d, 2H); 3,50 (d, 1H); 3,23-2,76 (m, 4H); 2,55-2,29 (m, 3H); 2,37 (s, 3H); 2,25 (s, 3H); 2,19 (s, 3H); 2,03 (s, 3H).

<13>C-NMR (75 MHz, CDCI3): 8 171,3, 166,9, 149,2, 147,9, 145,4,

142,9, 141,0, 140,7, 131,2, 130,7, 127,5, 121,2, 120,9, 115,5, 111,5, 103,1, 101,8, 81,9, 62,3, 61,8, 60,3, 57,7, 57,4, 55,8, 54,9, 42,1,41,2, 39,6, 39,1, 29,6, 23,5, 22,6, 21,4, 20,5, 15,8, 14,1, 9,6.

ESI-MS m/z: Beregn, for C4oH42N4010S: 770,3. Funnet (M-H20+H<+>): 753,3.

Forbindelse 32:<1>H-NMR (300 MHz, CDCI3): 8 7,72 (s, 1H);

7,27 (dd, 1H); 6,94 (dd, 1H); 6,76 (ddd, 1H); 6,66 (s, 1H);

6,20 (s, 1H); 5,99 (s, 1H); 5,75 (s, 1H); 5,19 (d, 1H); 4,83 (s, 1H); 4,49 (d, 1H); 4,16-4,09 (m, 2H); 3,81 (s, 3H); 3,50-3,48 (m, 1H); 3,48 (s, 1H); 3,22-2,79 (m, 5H); 2,65-2,51 (m, 3H);

2,37 (s, 3H); 2,25 (s, 3H); 2,19 (s, 3H); 2,05 (s, 3H).

<13>C-NMR (75 MHz, CDCI3): 8 171,5, 169,0, 148,1, 145,7,

143.1, 141,3, 140,9, 131,5, 129,3, 123,7, 121,5, 121,1, 119,3, 119,1, 118,3, 115,7, 110,4, 108.2, 107,8, 102,0, 97,8, 97,5, 82,1, 62,4, 62,1, 60,5, 57,9, 57,6, 56,1, 55,1, 42,4, 41,5, 39,9, 39,4, 29,9, 23,8, 21,7, 20,8, 16,0, 9,9.

ESI-MS m/z: Beregn, for C4oH4iFN409S: 772,3. Funnet (M-H20+H<+>): 755,3.

Forbindelse 33:<1>H-NMR (300 MHz, CDCI3): 8 6,85 (d, 1H);

6,80 (s, 1H); 6,71-6,64 (m, 2H); 6,48 (s, 1H); 6,18 (s, 1H);

6,02 (s, 1H); 5,74 (s, 1H); 5,03 (d, 1H); 4,88 (d, 1H); 4,39 (d, 1H); 4,36 (s, 1H); 4,16 (d, 1H); 3,98 (ddm 1H); 3,80 (s, 3H);

3,71 (d, 1H); 3,48 (s, 1H); 3,22 (d, 1H); 2,93-2,83 (m, 2H);

2,73-2,39 (m, 4H); 2,29 (s, 3H); 2,28-2,05 (m, 1H); 2,26 (s, 3H); 2,22 (s, 3H); 2,18 (s, 3H); 2,03 (s, 3H).

<13>C-NMR (75 MHz, CDCI3): 8 168,9, 149,3, 147,6, 145,5, 142,7,

141,6, 140,7, 131,3, 131,1, 129,3, 126,9, 121,2, 115,7, 111,9, 111,0, 110,7, 103,1, 102,0, 83,4, 69,8, 63,7, 60,2, 58,5, 57,7, 55,1, 54,7, 59,5, 43,1, 41,4, 40,6, 35,0, 29,6, 24,6, 22,6, 21,1, 20,2, 15,5, 9,7.

ESI-MS m/z: Beregn, for C41H44N4O10S: 784,3. Funnet (M-H20+H<+>): 767,3.

Forbindelse 34:<1>H-NMR (300 MHz, CDCI3): 8 7,58 (s, 1H);

7,23 (d, 1H); 6,76 (d, 1H); 6,67 (dd, 1H); 6,66 (s, 1H);

6,19 (d, 1H); 5,98 (d, 1H); 5,74 (s, 1H); 5,20 (d, 1H); 4,82 (s, 1H); 4,49 (d, 1H); 4,47 (s, 1H); 4,16 (d, 1H); 4,10 (dd, 1H); 3,81 (s, 3H); 3,78 (s, 3H); 3,51-3,47 (m, 1H); 3,22-2,80 (m, 5H); 2,65,2,50 (m, 3H); 2,36 (s, 3H); 2,25 (s,

3H); 2,19 (s, 3H); 2,05 (s, 3H).

<13>C-NMR (75 MHz, CDCI3): 8 171,7, 168,9, 156,5, 148,1, 145,6, 143,1, 141,3, 140,9, 136,5, 131,5, 129,8, 129,3, 121,6, 121,5, 121,2, 119,2, 115,8, 113,1, 110,3, 109,3, 102,2, 94,9, 82,2, 62,5, 62,0, 60,5, 57,9, 57,7, 56,1, 55,8, 55,2, 42,3, 41,5, 40,0, 39,5, 29,9, 23,8, 21,8, 20,8, 16,0, 9,9.

ESI-MS m/z: Beregn, for C41H44N4O10S: 784,3. Funnet (M-H20+H<+>): 767,3.

Forbindelse 35:<1>H-NMR (300 MHz, CDCI3): 8 7,73 (s, 1H); 7,15 (dd, 1H); 7,00 (dd, 1H); 6,81 (ddd, 1H); 6,67 (s, 1H); 6,20 (d, 1H); 5,99 (d, 1H); 5,76(s, 1H); 5,19 (d, 1H); 4,83 (s, 1H); 4,49 (d, 2H); 4,17 (d, 1H); 4,12 (dd, 1H); 3,81(s, 3H); 3,65-3,64 (m, 1H); 3,50 (d, 1H); 3,24-2,12 (m, 2H); 3,00 (d, 1H); 2,89-2,80 (m, 2H); 2,66-2,45 (m, 3H); 2,37 (s, 3H); 2,25 (s, 3H); 2,20 (s, 3H); 2,05 (s, 3H).

<13>C-NMR (75 MHz, CDCI3): 8 171,4, 169,0, 159,4, 156,3, 148,1,

145,7, 143,1, 141,3, 140,9, 138,0, 132,2, 129,4, 127,4, 127,3, 121,4, 121,4, 121,2, 118,2, 115,7, 113,1, 111,8, 111,7, 110,4, 110,1, 103,7, 103,4, 102,0, 82,1, 62,5, 62,1, 60,5, 57,9, 57,6, 56,1, 55,1, 42,3, 41,4, 39,9, 39,4, 29,9, 23,8, 21,7, 20,8, 16,0, 9,9.

ESI-MS m/z: Beregn, for C40H41FN4O9S: 772,2. Funnet (M-H20+H<+>): 755,2.

Forbindelse 36:<1>H-NMR (300 MHz, CDCI3): 8 7,47 (s, 1H);

7,22 (d, 1H); 6,95-6,87 (m, 2H); 6,66 (s, 1H); 6,13 (d, 1H);

6,01 (d, 1H); 5,76 (s, 1H); 5,20 (d, 1H); 4,84 (s, 1H); 4,49 (d, 1H); 4,46 (s, 1H); 4,18-4,14 (m, 2H); 3,81 (s, 3H); 3,54 (d,

1H); 3,48(s, 1H); 3,22 (d, 1H); 3,20-2,80 (m, 4H); 2,70-2,42 (m, 3H); 2,36( s, 6H); 2,27 (s, 3H); 2,18 (s, 3H); 2,05 (s, 3H).

<13>C-NMR (75 MHz, CDCI3): 8 171,3, 169,0, 148,0, 145,6, 143,1,

141,4, 140,9, 135,3, 131,5, 131,1, 130,7, 129,4, 126,6, 122,8, 121,8, 121,3, 119,9, 119,6, 118,1, 116,3, 115,8, 102,0, 82,1, 62,1, 60,5, 58,0, 57,8, 56,1, 55,1, 42,4, 41,5, 40,1, 39,6, 29,9, 23,9, 21,9, 20,7, 16,6, 16,0, 9,9.

ESI-MS m/z: Beregn, for C41H44N4O9S: 768,2. Funnet (M-H20+H<+>): 751,2.

Forbindelse 37 (første isomer):<1>H-NMR (300 MHz, CDCI3): 8 7,70 (s, 1H); 7,06 (d, 1H); 6,67-6,61 (m, 3H); 6,20 (d, 1H);

5,98 (d, 1H); 5,70 (s, 1H); 5,20 (d, 1H); 4,86 (s, 1H); 4,53 (d, 1H); 4,48 (s, 1H); 4,18(s, 1H); 3,80(s, 3H); 3,72-3,54 (m, 4H);

3,24-3,22 (m, 1H); 3,01-2,56 (m, 5H); 2,31 (s, 3H); 2,27 (s, 3H); 2,15 (s, 3H); 2,02 (s, 3H); 1,10 (d, 3H).

ESI-MS m/z: Beregn, for C41H44N4O10S: 784,3. Funnet (M-H20+H<+>): 767,3.

Forbindelse 38 (andre isomer):<1>H-NMR (300 MHz, CDCI3): 8 7,51 (s, 1H); 7,10 (d, 1H); 6,75 (d, 1H); 6,64 (dd, 1H); 6,59 (s, 1H); 6,19 (d, 1H); 5,97 (d, 1H); 5,71 (s, 1H); 5,15 (d, 1H); 4,84 (s, 1H); 4,53-4,50 (m, 2H); 4,16 (s, 1H); 4,04 (dd, 1H); 3,80 (s, 3H); 3,65-3,63 (m, 1H); 3,51-3,49 (m, 1H); 3,40-2,36 (m, 1H); 3,24-3,21 (m, 1H); 3,03-2,84 (m, 2H); 2,50-2,41 (m, 2H); 2,32 (s, 3H); 2,23 (s, 3H); 2,16 (s, 3H); 2,06 (s, 3H); 1,20 (d, 3H). ESI-MS m/z: Beregn, for C4iH44N4O10S: 784,3. Funnet (M-H20+H<+>): 767,3.

Forbindelse 41 (første isomer):<1>H-NMR (300 MHz, CDCI3): 8 7,84 (s, 1H); 7,13 (dd, 1H); 6,96 (dd, 1H); 6,81 (ddd, 1H); 6,62 (s, 1H); 6,20 (d, 1H); 5,99 (d, 1H); 5,70 (s, 1H); 5,19 (d, 1H);

4,86 (s, 1H); 4,52 (d, 1H); 4,50 (s, 1H); 4,16 (d, 1H); 3,80 (s, 3H); 3,53 (d, 1H); 3,49-3,48 (m, 1H); 3,23 (d, 1H); 3,00-2,71 (m, 3H); 2,62-2,41 (m, 2H); 2,31 (s, 3H); 2,27 (s, 3H); 2,14 (s, 3H); 2,02 (s, 3H); 1,13 (d, 3H).

<13>C-NMR (75 MHz, CDCI3): 8 170,5, 168,9, 159,4, 156,2, 147,6,

145,8, 143,0, 141,2, 133,2, 132,2, 131,7, 131,1, 129,2, 129,0, 127,3, 121,7, 115,6, 111,7, 111,6, 110,3, 109,9, 103,7, 103,4, 102,0, 81,8, 64,0, 62,0, 60,5, 58,0, 56,1, 55,3, 44,0, 42,4, 41,5, 38,1, 32,1, 29,5, 24,0, 22,9, 21,7, 20,7, 16,2, 14,3, 9,9.

ESI-MS m/z: Beregn, for C41H43FN4O9S: 786,2. Funnet (M-H20+H<+>): 769,3.

Forbindelse 42 (andre isomer)^H-NMR (300 MHz, CDCI3): 8 7,62 (s, 1H); 7,18 (dd, 1H); 6,99 (dd, 1H); 6,82 (ddd, 1H); 6,59 (s, 1H); 6,20 (d, 1H); 5,98 (d, 1H); 5,71 (s, 1H); 5,15 (d, 1H); 4,85 (s, 1H); 4,52(s, 1H); 4,50 (d, 1H); 4,16 (d, 1H); 4,05 (dd, 1H); 3,80 (s, 3H); 3,50-3,48 (m, 1H); 3,42-3,36 (m, 1H); 3,23 (d, 1H); 3,00-2,81 (m, 2H); 2,50 (dd, 1H); 2,44 (d, 1H); 2,32 (s, 3H); 2,24 (s, 3H); 2,16 (s, 3H); 2,07 (s, 3H); 1,23 (d, 3H).<13>C-NMR (75 MHz, CDCI3): 8 171,9, 168,7, 156,2, 147,8, 145,6, 143,3, 141,8, 140,9, 132,7, 131,4, 131,1, 129,4, 129,0, 121,8, 121,4, 115,8, 113,1, 111,9, 111,8, 110,4, 110,0, 103,7, 103,4, 102,0, 81,9, 63,4, 61,8, 60,6, 58,0, 56,2, 55,2, 46,6, 42,3, 41,5, 41,0, 32,1, 29,5, 23,9, 22,9, 21,9, 20,7, 16,1, 14,3, 9,9,

ESI-MS m/z: Beregn, for C41H43FN409S: 786,2. Funnet (M-H20+H<+>): 769,3.

BIOANALYSER FOR ANTITUMORSKREENING

Sluttresultatet av disse analysene er å avbryte veksten av en " in vitro" tumorcellekultur ved hjelp av en vedvarende eksponering av cellene for prøven som skal testes.

Cellelinjer

Inhibering av cellevekst ved hjelp av kolorimetrisk analyse

En kolorimetrisk analysetype under anvendelse av reaksjon med svovel-rhodamin B (SRB), er blitt tilpasset for en kvantitativ måling av cellevekst og -levedyktighet [ved å følge teknikken beskrevet av Philip Skehan et al. (1990), New colorimetric cytotoxicity assay for anticancer drug screening, J. Nati. Cancer Inst., 82:1107-1112].

Denne analyseformen gjør bruk av 96-brønners cellekulturmikroplater med 9 mm i diameter (Faircloth, 1988; Mosmann, 1983). De fleste cellelinjene erholdes fra American Type Culture Collection (ATCC), avledet fra forskjellige humankrefttyper.

Celler opprettholdes i RPMI 1640, 10% FBS, supplert med 0,1 g/l penicillin og 0,1 g/l streptomycinsulfat, og inkuberes så ved 37 °C, 5% C02og 98% fuktighet. For forsøkene ble celler innhøstet fra subsammenflytende kulturer under anvendelse av trypsin og på nytt oppslemmet i friskt medium før utplating.

Celler inokuleres i 96-brønners mikrotiterplater, ved 5 x IO3 celler pr. brønn, i aliquoter å 195 ul medium, og de får feste seg til plateoverflaten ved dyrking i legemiddel-fritt medium i 18 timer. Deretter tilsettes prøver i aliquoter å 5 ul i et område fra 10 til IO"<8>ug/ml, oppløst i DMSO/EtOH/PBS (0,5:0,5:99). Etter 48 timers eksponering måles antitumoreffekten ved hjelp av SRB-metodikken: celler festes ved å tilsette 50 ul kald 50 %

(vekt/volum) trikloreddiksyre (TCA) og inkubasjon i 60 minutter ved 4 °C. Plater vaskes med avionisert vann og tørkes. 100 ul SRB-oppløsning (0,4 % (vekt/volum) i 1% eddiksyre) tilsettes til hver mikrotiterbrønn, og det inkuberes i 10 minutter ved romtemperatur. Ubundet SRB fjernes ved vasking med 1 % eddiksyre. Plater lufttørkes, og bundet farge

oppløseliggjøres med Tris-buffer. Optiske tettheter avleses på en automatisert spektrofotometrisk plateavleser ved en eneste bølgelengde på 490 nm.

Verdiene for gjennomsnitt +/- SD av data fra brønner in triplo beregnes. Noen parametre for cellulære responser kan beregnes: GI = vekstinhibering, TGI = total vekstinhibering (cytostatisk effekt) og LC = celledreping (cytotoksisk effekt).

Erholdte resultater kan forutsi nyttigheten av et bestemt legemiddel som en potensiell kreftbehandling. For denne teknikken velges forbindelser som oppviser GI50-verdier som er lavere enn 10 ug/ml, for å fortsette med videre studier. GI50-data gjør det mulig å forutsi at et legemiddel ikke bare kan være cytostatisk, men at det også kan ha et potensial når det gjelder tumorreduksjon.

Aktivitetsdata (mol).

TOKSISITETSDATA

Toksisitet ble fastlagt ved hjelp av metodene rapportert i Toxicology in Vitro, 15 (2001) 571-577, J. Luber Narod et al.: "Evaluation of the use of in vitro methodologies as tools for screening new compounds for potential in vivo toxicity".

Metoder

For å fastlegge cytotoksisiteten til legemidlene overfor normale celler, brukte vi 96-brønners plater utplatet ved en tetthet på 5 000 celler pr. brønn (bortsett fra FDC-P1 som ble platet ut ved 12 000 celler pr. brønn) med normale cellelinjer (ATCC, tabell 1) opprettholdt ifølge retningslinjene til ATCC: AML-12, normale museleverceller; NRK-52E, normale rottenyreceller; L8, normale rotteskjelettmuskelceller; FDC-P1, normale musemyelostamceller; og H9c2 (2-1), normale rottehjertemuskelceller. Cellene i hver plate fikk bunnfelles over natten før tilsetning av testlegemidlet. I tillegg ble primære, neuronale kulturer fremstilt fra embryonal (dag e-17) helhjerne (forhjerne og hjernestamme) og ryggmarg ved å anvende etablerte metoder (Federoff og Richardson, 1997).

Til hver brønn (100 pl medium) ble det tilsatt 10 pl legemiddel i medium ved varierende konsentrasjoner (1x10-10-0,01 mg/ml sluttkonsentrasjon), og det ble inkubert videre over natten ved 37 °C med 5% C02. Etter 24 timer ble de følgende analyser utført. Alle forsøk ble gjentatt minst tre ganger og ble analysert in duplo.

1. MTS-analyse (CellTiter 96 vandig) ble utført i henhold til produsentens (Promega) retningslinjer (for alle celletyper). Cellelevedyktighet (mitokondrien aktivitet) bestemmes via enzymatisk omdannelse av formazan-substratet.

In vitro evaluering av forbindelsene med hensyn på ADME-TOX-profil Fordelinaskoeffisient (log D)

Fordelingskoeffisienten til en kjemisk forbindelse gir et termodynamisk mål for dens hydrofilisitets-lipofilisitets-balanse. Lipofilisitet er en viktig strukturell faktor som påvirker den farmakokinetiske og farmakodynamiske oppførsel til forbindelser. Fordelingskoeffisienten mellom vann eller buffer og 1-oktanol er det mest utbredt brukte mål for lipofilisitet hos kjemiske forbindelser.

Målingen av fordelingskoeffisient ble evaluert basert på en miniatyrisert risteflaskeprosedyre. Buffer (Dulbeccos PBS, pH 7,40) ble brukt som vannfasen. Den testede forbindelse ble oppløst i DMSO ved en konsentrasjon på 100 uM. Slutt-DMSO-konsentrasjonen (1%) under oktanol-buffer-fordelingen er svært lav for å unngå systemavhengig feil ved fordelingen. Mengden av forbindelse i bufferfasen ble bestemt ved hjelp av HPLC med fotodiode-grupperingspåvisning etter en ekvilibreringsfase på 60 minutter. Mengden av forbindelse i oktanolfasen beregnes ved å trekke mengden av forbindelse i buffer fra den totale mengde av forbindelse som bestemmes ut fra en kalibreringsprøve.

Log D beregnes som Logi0av mengden av forbindelse i oktanolfasen dividert med mengden av forbindelse i bufferfasen. Det effektive område for log D-mikroanalysen er omtrent -0,5 til +4,5.

In vitro tarmabsorpsionsanalvser

Tarmepitelpermeabiliteten er et kritisk kjennetegn som bestemmer hastigheten og omfanget av humanabsorpsjon og til sist biotilgjengeligheten av en legemiddelkandidat. Caco-2-permeabilitetsanalyse muliggjør en hurtig fastleggelse av membranpermeabilitet og hjelper således til å rangere forbindelser etter deres absorpsjonspotensial.

Caco-2-cellelinjen er en human tykktarmsadenokarsinomcellelinje som differensierer i kultur og setter sammen epitelforet i tynntarmen hos mennesket. Den er blitt mye brukt som en in vitro tarmepitelmodell for legemiddeltransport- og permeabilitets-skreening av oppdagede forbindelser.

De tilsynelatende permeabilitetskoeffisienter (Papp) ble bestemt i den spiss-til-basolaterale (A-til-B) retning over cellemonolagene (TC-7-underklon av Caco-2) dyrket på polykarbonatmembranfiltere. Forbindelser ble testet ved 50 uM med en slutt-DMSO-konsentrasjon på 1%. Prøver ble analysert ved hjelp av HPLC-MS eller HPLC-MS/MS.

Testforbindelsen ble tilsatt toppsiden, og Papp ble bestemt basert på hastigheten for tilsynekomst av testforbindelsen på den basolaterale side etter 2 timers inkubasjon. To referanseforbindelser, propranolol (svært permeabel) og ranitidin (lite permeabel) testes i hver analyse som kontroller. Resultater fra denne analysen kan brukes til å rangere forbindelser etter deres absorpsjonspotensial. Forbindelser med Papp som er lik eller større enn 20 x IO"<6>cm/sek, vil kunne anses som svært permeable og vil sannsynligvis være "ikke permeabilitetsbegrenset". Forbindelser med Papp som er mindre enn 5 x IO"<6>cm/sek, anses som lite permeable og vil sannsynligvis være "permeabilitetsbegrenset". Forbindelser med Papp som er større enn 5 x IO"<6>, men mindre enn 20 x IO"<6>cm/sek, anses for å ha middels permeabilitet.

Metabolisme

Hepatisk metabolisme er en primærdeterminant for farmakokinetisk oppførsel, og hurtig førstepasseringsmetabolisme er en hovedårsak til lav biotilgjengelighet. Sammenslåtte levermikrosomer og rekombinante cytokrom P450-verdier brukes til den metabolske fastleggelse av treff, spor og nye farmasøytiske forbindelser. Resultatene av de metabolske skreeningsundersøkelsene er nyttige ved: Bestemmelse av den innledende hastighet som forbindelser

metaboliseres ved

Undersøkelse av hovedreaksjonssporene for legemiddelmetabolisme Forutsigelse av in vivo farmakokinetisk oppførsel

Undersøkelse av potensialet for legemiddel-legemiddel-interaksjoner

Den metabolske stabilitet ble bestemt ved å anvende human lever S9-homogenat som inkluderer både mikrosom- og cytosolenzymaktiviteter. Testforbindelsen ble fortynnet i metanol (0,625 %) og acetonitril (0,625 %) ved konsentrasjonen 1 uM, og det ble inkubert i den humane leverblanding (protein = 1 mg/ml) i 60 minutter ved 37 °C. Topparealer som tilsvarer alle analytter (metabolske produkter), ble bestemt ved hjelp av HPLC-MS/MS. Arealer ble målt, og forhold mellom topparealer for analytter og de til intern standard for hver analytt ble bestemt. Forholdet mellom forløperforbindelse som er tilbake etter 60 minutter, og mengden som er tilbake på tid null, uttrykt som prosent, er rapportert som metabolsk stabilitet. Høyere verdier betyr høyere metabolsk stabilitet.

Inhibering av cvtokromer P450 (CYP450)

Cytokromene P450 er en gruppe av beslektede enzymer som primært befinner seg i leveren og som er ansvarlig for metabolismen av legemidler. Inhiberingen av disse CYP ved hjelp av legemidler står i forhold til legemiddel-legemiddel-interaksjoner og -toksisiteter.

CYP3A4 er den vanligste formen av CYP3A-enzymene som finnes hos voksne, og er den formen som er implisert i de fleste legemiddelinteraksjoner. CYP2D6 metaboliserer mer enn 25% av de klinisk nyttige medisineringer.

For CYP2D6-inhiberingsanalyse testes forbindelsen ved 10 uM in duplo med en 0,25% sluttkonsentrasjon av både metanol og acetonitril i nærvær av det fluorescerende substrat AMMC (3-[2-(N,N-dietyl-N-metylammonium)etyl]-7-metoksy-4-metylkumarin) ved konsentrasjonen på 1,5 uM). Omdannelsen av AMMC til AHMC (3-[2-(N,N-dietyl-N-metylammonium)etyl]-7-hydroksy-4-metylkumarin) bestemmes spektrofluorimetrisk etter inkubasjon med enzymet i 450 minutter ved 37 °C.

For CYP3A4-inhiberingsanalyse ble forbindelsen testet ved 10 uM in duplo med en 0,25% sluttkonsentrasjon av både metanol og acetonitril i nærvær av det fluorescerende substrat BFC (50 uM). Omdannelsen av BFC (7-benzyloksy-4-trifluormetylkumarin) til HFC (7-hydroksy-4-trifluormetylkumarin) ble bestemt ved spektrofluorimetri etter inkubasjon med enzymet i 30 minutter ved 37 °C.

For begge analysene trekkes fluorescensstyrken målt ved t = 0, fra den som er målt etter den passende inkubasjonstid. Forholdet mellom signal og støy beregnes ved å sammenligne fluorescensen i inkubasjoner som inneholder testforbindelsen, med kontrollprøvene som inneholder den samme oppløsningsmiddelbærer. Prosenten av kontrollaktivitet beregnes og rapporteres som prosentvis inhibering.

In vitro sikkerhetsfastleqqelse. Cellelevedyktiqhet

Det toksiske potensial til forbindelser ble undersøkt in vitro ved å anvende primære humanhepatocytter (HEPG2). Forbindelsene ble testet ved 30 uM in duplo med en slutt-DMSO-konsentrasjon på 1%. Etter inkubasjon i 24 timer ved 37 °C ble cellelevedyktigheten bestemt ved hjelp av omdannelsen av oksidert alarmarBlue (resazurin) til redusert alarmarBlue (resorufin). Klorpromazin ble brukt som referanseforbindelse. Resultatene er uttrykt som en prosent av inhibering av kontrollverdier.

Resultater av studiene ADME-TOX

Claims (23)

1. Forbindelse, karakterisert vedat den har den generelle formel I:

hvor Ri er OH, OR', C(=0)R', C(=0)OR', halogen, C^C^-alkyl, C2-C12_alkenyl, eller C2-C12-alkynyl; R2 og R3uavhengig av hverandre er valgt fra gruppen bestående av H, C(=0)R', C(=0)OR', Ci-Ci2-alkyl, C2-Ci2-alkenyl, C2-Ci2-alkynyl; R4og R5uavhengig av hverandre er valgt fra gruppen bestående av H, OH, OR', C(=0)R', C(=0)OR', halogen, C!-C12-alkyl, C2-C12.alkenyl og C2-C12-alkynyl; XerOH, eller CN; hvor hver av R'-gruppene er uavhengig valgt fra gruppen bestående av eventuelt substituert Ci-Ci2-alkyl, eventuelt substituert C2-Ci2-alkenyl, og eventuelt substituert C2-Ci2-alkynyl; De eventuelle substituentene er valgt fra halogen, cyano, hydroksyl, nitro, azido, Ci-C6-alkanoyl, karboksamido, Ci-Ci2-alkyl, C2-Ci2-alkenyl, Ci-Ci2-alkoksy, aryloksy med fra 6 til 18 karbon ringatomer, C!-C12-alkyltio, Q-C^-alkylsulfinyl, C!-C12-alkylsulfonyl, amino, aryl med fra 6 til 18 karbon ringatomer eller heterosyklisk gruppe inkludert heteroalisyklisk og heteroaromatiske grupper med fra 5 til 10 ringatomer av hvilke 1 til 4 er heteroatomer valgt fra N, O og S; hvor m er 0, 1 eller 2; og hvor n er 1, 2, 3 eller 4.

2. Forbindelse ifølge krav 1, hvor Ri er, hydroksy, halogen, OR' eller Ci-Ci2-alkyl, hvor R' er eventuelt substituert Ci-Ci2-alkyl og hvor den eventuelle substituenten er aryl med fra 6 til 18 karbon ringatomer; R2 og R3er uavhengig av hverandre valgt fra hydrogen, R', C=OR' og C(=0)OR', hvor R' er eventuelt substituert Ci-Ci2-alkyl eller C2-Ci2-alkenyl og hvor de eventuelle substituenter er valgt fra halogen, amino, aryl med fra 6 til 18 karbon ringatomer eller heterosyklisk gruppe med fra 5 til 10 ringatomer av hvilke 1 til 4 er heteroatomer valgt fra N, O, og S; FU er hydrogen, Ci-Ci2-alkyl, C2-Ci2-alkenyl eller C(=0)OR', hvor R' er C2-Ci2-alkenyl; R5er hydrogen eller Ci-Ci2-alkyl; X er hydroksy eller cyan; m er 0 eller 1; og n er 1.

3. Forbindelse ifølge krav 1 eller 2, hvor Ri er hydroksy, fluor, metyl, metoksy eller benzyloksy, og n er 1.

4. Forbindelse ifølge krav 1, 2 eller 3, hvor R2er hydrogen, acetyl, trifluormetylkarbonyl, heptafluorbutyryl, 3-klorpropionyl, cinnamoyl-, t-butyl-O-CO-, allyl-O-CO- eller vinyl-O-CO.

5. Forbindelse ifølge hvilket som helst forutgående krav, hvor R3er hydrogen, allyl, CH3-(CH2)p-CO-, hvor p er 1, 2, 4, eller 6, t-butyl-O-CO-, allyl-O-CO- eller vinyl-O-CO.

6. Forbindelse ifølge hvilket som helst forutgående krav, hvor R4er hydrogen, Ci-C3-alkyl, allyl eller vinyl-O-CO.

7. Forbindelse ifølge hvilket som helst forutgående krav, hvor R5er hydrogen eller metyl, og m er 1.

8. Forbindelse ifølge hvilket som helst forutgående krav, hvor X er hydroksy.

9. Forbindelse ifølge hvilket som helst av krav 1-7, hvor X er cyan.

10. Forbindelse ifølge hvilket som helst forutgående krav, hvor R2er acetyl.

11. Forbindelse ifølge hvilket som helst forutgående krav, hvor R3er hydrogen.

12. Forbindelse ifølge hvilket som helst forutgående krav, hvor R5er hydrogen.

13. Forbindelse ifølge krav 1 med formel:

14. Forbindelse ifølge krav 1 med formel:

15. Forbindelse ifølge krav 1 med formel:

16. Forbindelse ifølge krav 1 med formel:

17. Forbindelse ifølge krav 1 med formel:

18. Forbindelse ifølge krav 1 med formel:

19. Forbindelse ifølge krav 1 med formel:

20. Forbindelse ifølge krav 1 med formel:

21. Forbindelse ifølge krav 1 med formel:

22. Farmasøytisk preparat, karakterisert vedat det inneholder en forbindelse ifølge hvilket som helst forutgående krav sammen med en farmasøytisk akseptabel fortynner.

23. Anvendelse av en forbindelse med den generelle formel I ifølge krav 1 ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 21 ved fremstillingen av et medikament for behandling av kreft.