PT1414828E

PT1414828E - Análogos anti-tumorais

Info

Publication number: PT1414828E
Application number: PT02753134T
Authority: PT
Inventors: Pilar Gallego; Valentin Martinez; Carmen Cuevas; Simon Munt; Ignacio Manzanares
Original assignee: Pharma Mar Sa
Priority date: 2001-08-07
Filing date: 2002-08-06
Publication date: 2007-12-27
Also published as: IL160051A; NZ530837A; KR20040032150A; DK1414828T3; IL160051A0; EP1414828B1; MXPA04001240A; RU2004106617A; ES2294151T3; EP2270018A1; CN1564822A; HUP0401174A3; NO337476B1; DE60222775D1; HK1065786A1; PL218295B1; WO2003014127A1; GB0119243D0; JP2011026331A; US20060128711A1

Description

ΡΕ1414828 1

DESCRIÇÃO "ANALOGOS ANTI-TUMORAIS" A presente invenção relaciona-se com derivados das ecteinascidinas, em particular da ecteinascidina 736 (ET-736), composições farmacêuticas contendo estas últimas e a sua utilização enquanto compostos anti-tumorais.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

As ecteinascidinas são agentes anti-tumorais extraordinariamente potentes, isolados a partir do tunicado marinho Ecteinascidia turbínata. Foram anteriormente descritas várias ecteinascidinas na literatura cientifica e de patentes. Consultar, por exemplo: A patente U.S. N° 5.256.663, que descreve composições farmacêuticas compreendendo matéria extraida do invertebrado marinho tropical, Ecteinascidia turbínata, e aí designadas por ecteinascidinas, bem como a utilização de tais composições como agentes antibacterianos, antivirais, e/ou anti-tumorais em mamíferos. A patente U.S. N° 5.089.273, a qual descreve novas composições de matéria extraída do invertebrado marinho tropical, Ecteinascidia turbínata, e aí designadas 2 ΡΕ1414828 por ecteinascidinas 729, 743, 745, 759A, 759B e 770. Estes compostos são úteis como agentes antibacterianos e/ou anti-tumorais em mamíferos. A patente U, ,S. N° 5.149.804 que descreve as Ecteinascidinas 722 e 736 (Et' s 722 e 736) isoladas do tunicado das Caraíbas, Ecteinascidia turbinata, e as suas estruturas. As Et' s 722 e 736 protegem os murganhos in vivo, em concentrações muito baixas, contra o linfoma P388, o melanoma B16, e o carcinoma pulmonar de Lewis. A patente U.S. N° 5.478.932, que descreve ecteinascidinas isoladas do tunicado das Caraíbas,

Ecteinascidia turbinata, as quais proporcionam uma protecção in vivo contra o linfoma P388, o melanoma B16, o sarcoma ovárico M5076, o carcinoma pulmonar de Lewis, e os xenoenxertos de carcinoma pulmonar humano LX-1 e mamário humano MX-1. A patente U.S. N° 5.654.426, que descreve várias ecteinascidinas isoladas do tunicado das Caraíbas,

Ecteinascidia turbinata, que proporcionam uma protecção in vivo contra o linfoma P388, o melanoma B316, o sarcoma ovárico M5076, o carcinoma pulmonar de Lewis, e os xenoenxertos de carcinoma pulmonar humano LX-1 e mamário humano MX-1. A patente U.S. N° 5.721.362 que descreve um processo sintético para a formação de compostos de 3 ΡΕ1414828 ecteinascidina e suas estruturas relacionadas. A patente U.S. N° 6.124.292 que descreve uma série de novos compostos semelhantes à ecteinascidina.

Os documentos WO 0177115, WO 0187894 e WHO 0187895, que descrevem novos compostos sintéticos da série da ecteinascidina, as suas sínteses e propriedades biológicas.

Consultar igualmente: Corey, E.J., J. Am. Chem. Soc., 1996, 118 pp. 9202-9203; Rinehart, et al., Journal of Natural Products, 1990, "Bioactive Compounds from Aquatic and Terrestrial Sources", vol. 53, pp. 771-792; Rinehart et al., Pure and Appl. Chem., 1990, "Biologically active natural products", vol 62, pp. 1277-1280; Rinehart, et al., J. Org. Chem., 1990, "Ecteinascidins 729, 743, 745, 759A, 759B, and 770: potent Antitumour Agents from the Caribbean Tunicate Ecteinascidia turninata", vol. 55, pp. 4512-4515; Wright et al., J. Org. Chem., 1990, "Antitumour

Tetrahydroisoquinoline Alkaloids from the Colonial ascidian Ecteinascidia turbinata", vol. 55, pp. 4508-4512; Sakai et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 1992, "Additional antitumor ecteinascidins from a Caribbean tunicate: Crystal structures and activities in vivo", vol. 89, 11456-11460; Science 1994, "Chemical Prospectors Scour the Seas for Promising Drugs", vol. 266, pp.1324; Koenig, K.E., "Asymmetric Synthesis", ed. Morrison, Academic Press, Inc., Orlando, FL, vol. 5, 1985, p. 71; Barton, et al., J. Chem 4 PE1414828

Soc. Perkin Trans., 1, 1982, "Synthesis and Properties of a Series of Sterically Hindered Guanidine bases", pp. 2085; Fukuyama et al., J. Am. Chem. Soc., 1982, "Stereocontrolled Total Synthesis of ( + )-Saframycin B", vol. 104, pp. 4957; Fukuyama et al., J. Am. Chem. Soc., 1990, "Total Synthesis of ( + ) - Saframycin A", vol. 112, p. 3712; Saito, et al., J. Org. Chem., 1989, "Synthesis of Saframycins. Preparation of a Key tricyclic Lactam Intermediate to Saframycin A", vol. 54, 5391; Still, et al., J Org. Chem., 1978, "Rapid Chromatographic Technique for Preparative Separations with Moderate Resolution", vol. 43, p. 2923; Kofron, W.G.; Baclawski, L.M., J. Org. Chem., 1976, vol. 41, 1879; Guan et al., J. Biomolec. Struc. & Dynam., vol. 10, pp. 793-817 (1993); Shamma et al., "Carbon-13 NMR Shift Assignments of Amines and Alkaloids", p. 206 (1979); Lown et al., Biochemistry, 21, 419-428 (1982); Zmijewski et al., Chem. Biol. Interactions, 52, 361-375 (1985); Ito, CRC Crit. Rev. Anal. Chem., 17, 65-143 (1986); Rinehart et al., "Topics in Pharmaceutical Sciences 1989", pp. 613-626, D. D. Breimer, D. J. A. Cromwelin, K. K. Midha, Ends., Amsterdam Medicai Press B.V., Noordwijk, The Netherlands (1989); Rinehart et al., "Biological Mass Spectrometry", 233-258 eds. Burlingame et al., Elsevier Amsterdam (1990); Guan et al., Jour. Biomolec. Struct. & Dynam., vol. 10 pp. 793-817 (1993); Nakagawa et al., J. Amer. Chem. Soc., 111: 2721-2722 (1989); Lichter et al., "Food and Drugs from the Sea Proceedings" (1972), Marine Technology Society, Washington, D.C. 1973, 117-127; Sakai et al., J. Amer. Chem. Soc., 1996, 118, 9017; Garcia-Rocha et al., Brit. J. Câncer, 5 PE1414828 1996, 73: 875-883; e Pommier et al., Biochemistry, 1996, 35: 13303-13309;

No ano 2000, foi descrito um processo semi-sintético para a formação de compostos de ecteinascidina e estruturas relacionadas, tal como a ftalascidina, com origem no alcaloide de bis(tetrahidroisoquinolina) natural tais como os antibióticos saframicina e safracina disponíveis a partir de diferentes caldos de cultura; Ver Manzanares et al., Org. Lett, 2000, "Synthesis of Ecteinascidin ET-743 and Phthalascidin Pt-650 from Cyanosafracin B", Vol. 2, N° 16, pp. 2545-2548; e o Pedido de Patente Internacional WO 00 69862. O artigo da Proc. Natl. Acad. Sei. EUA, vol. 96, pp 3496-3501, diz respeito à ftalascilina, um agente anti-tumoral sintético com uma potência e uma acção comparáveis às da ecteinascidina 743. A Ecteinascidina 736 foi inicialmente descoberta por Rinehart e apresenta uma unidade de tetrahidro-β-carbolina em vez da unidade de tetrahidroisoquinolina mais frequentemente encontrada nos compostos de ecteinascidina isolados a partir de fontes naturais; Ver, por exemplo, Sakai et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 1992, "Additional antitumor ecteinascidins from a Caribbean tunicate: Crystal structures and activities in vivo", vol. 89, 11456-11460. O documento WO 9209607 reivindica a 6 PE1414828 ecteinascidina 736, bem como a ecteinascidina 722, com hidrogénio em vez de metilo no azoto comum aos anéis C e D de ecteinascidina 736, e O-metilecteinascidina 736 com metoxi em vez de hidroxilo no anel C da ecteinascidina 736.

Apesar dos resultados positivos obtidos nas aplicações clinicas em quimioterapia, a pesquisa no campo dos compostos de ecteinascidina está ainda em aberto no que toca à identificação de novos compostos com caracteristicas óptimas de citotoxicidade e selectividade em relação ao tumor, assim como com uma toxicidade sistémica reduzida e propriedades farmacocinéticas melhoradas.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO A presente invenção diz respeito aos compostos da reivindicação 1. Estes compostos fazem parte de uma classe de compostos de fórmula geral I:

em que os grupos substituintes para Ri, R2, R3, R4, e R5 são, cada um, independentemente seleccionados do grupo constituído por H, OH, 0R-, SH, SR-, SOR-, S02R-, C(=0)R', 7 ΡΕ1414828 C(=0)0R', no2 nh2, nhr-, n(r-)2, nhc(0)R-, CN, halogéneo, =0, Ci-Cis alquilo substituído ou não substituído, C2-Ci8 alcenilo substituído ou não substituído, C2-Ci8 alcinilo substituído ou não substituído, arilo substituído ou não substituído, heterocíclico substituído ou não substituído; em que X é independentemente seleccionado de OR', CN, (=0), ou H. em que cada um dos grupos R- é independentemente seleccionado do grupo constituído por H, OH, N02 NH2, SH, CN, halogéneo, =0, C(=0)H, C(=0)CH3, C02H, Ci-Cis alquilo substituído ou não substituído, C2-Ci8 alcenilo substituído ou não substituído, C2-Ci8 alcinilo substituído ou não substituído, arilo substituído ou não substituído; em que m é 0, 1 ou 2; e em que néO, 1, 2, 3 ou 4.

Num outro aspecto, a invenção relaciona-se com composições farmacêuticas compreendendo um composto da reivindicação 1.

Num outro aspecto, a invenção relaciona-se com a utilização de compostos da reivindicação 1 no tratamento do cancro. Fornecemos, na presente, a informação relativa à classe de compostos de fórmula geral I. Os grupos alquilo contêm, preferencialmente, de 1 a 24 átomos de carbono. Uma classe mais preferida de grupos alquilo possui de 1 até cerca de 12 átomos de carbono, preferencialmente de 1 até cerca de 8 átomos de carbono, mais preferencialmente de 1 até cerca de 6 átomos de carbono e ainda mais ΡΕ1414828 preferencialmente 1, 2, 3 ou 4 átomos de carbono. Uma outra classe mais preferida de grupos alquilo possui de 12 até cerca de 24 átomos de carbono, mais preferencialmente de 12 até cerca de 18 átomos de carbono, e ainda mais preferencialmente 13, 15 ou 17 átomos de carbono. Metilo, etilo e propilo, incluindo isopropilo, são grupos alquilo particularmente preferidos. Tal como empregue no presente documento, o termo alquilo, salvo em caso de indicação expressa em contrário, refere-se tanto a grupos cíclicos como a grupos não cíclicos, apesar de os grupos cíclicos conterem pelo menos três membros no anel de carbono.

Os grupos alcenilo e alcinilo preferidos contêm uma ou mais ligações insaturadas e de 2 até cerca de 12 átomos de carbono, preferencialmente de 2 até cerca de 8 átomos de carbono, mais preferencialmente de 2 até cerca de 6 átomos de carbono, e ainda mais preferencialmente 1, 2, 3 ou 4 átomos de carbono. Os termos alcenilo e alcinilo, tal como empregues no presente documento, referem-se quer a grupos cíclicos quer a grupos não cíclicos, embora os grupos não cíclicos de cadeia linear ou ramificada sejam geralmente mais preferidos.

Os grupos alcoxi preferidos incluem os grupos que contêm uma ou mais ligações de oxigénio e de 1 até cerca de 12 átomos de carbono, preferencialmente de 1 até cerca de 8 átomos de carbono, mais preferencialmente de 1 até cerca de 6 átomos de carbono, e ainda mais preferencialmente 1, 2, 3 ou 4 átomos de carbono. 9 ΡΕ1414828

Os grupos alquiltio preferidos contêm uma ou mais ligações de tioéter e de 1 até cerca de 12 átomos de carbono, preferencialmente de 1 até cerca de 8 átomos de carbono, e mais preferencialmente de 1 até cerca de 6 átomos de carbono. Os grupos alquiltio que contêm 1, 2, 3 ou 4 átomos de carbono são particularmente preferidos.

Os grupos alquilsulfinilo preferidos incluem os grupos que contêm um ou mais grupos sulfóxido (SO) e de 1 até cerca de 12 átomos de carbono, mais preferencialmente de 1 até cerca de 8 átomos de carbono, e ainda mais preferencialmente de 1 até cerca de 6 átomos de carbono. Os grupos alquilsulf inilo que contêm 1, 2, 3 ou 4 átomos de carbono são particularmente preferidos.

Os grupos alquilsulfonilo preferidos incluem os grupos que contêm um ou mais grupos sulfonilo (S02) e de 1 até cerca de 12 átomos de carbono, mais preferencialmente de 1 até cerca de 8 átomos de carbono, e ainda mais preferencialmente de 1 até cerca de 6 átomos de carbono. Os grupos alquilsulf onilo que contêm 1, 2, 3 ou 4 átomos de carbono são particularmente preferidos.

Os grupos aminoalquilo preferidos incluem os grupos que contêm um ou mais grupos amina primários, secundários e/ou terciários, e de 1 até cerca de 12 átomos de carbono, preferencialmente de 1 até cerca de 8 átomos de carbono, mais preferencialmente de 1 até cerca de 6 átomos de carbono, e ainda mais preferencialmente 1, 2, 3 ou 4 10 PE1414828 átomos de carbono. Os grupos amina secundários e terciários são geralmente mais preferidos do que as fracções de amina primárias.

Os grupos heterocíclicos adequados incluem os grupos heteroaromáticos e heteroaliciclicos. Os grupos heteroaromáticos adequados contêm um, dois ou três heteroátomos seleccionados de átomos de N, O ou S e incluem, e.g., cumarinilo incluindo 8-cumarinilo, quinolinilo incluindo 8-quinolinilo, piridilo, pirazinilo, pirimidilo, furilo, pirrolilo, tienilo, tiazolilo, oxazolilo, imidazolilo, indolilo, benzofuranilo e benzotiazol. Os grupos heteroaliciclicos adequados contêm um, dois ou três heteroátomos seleccionados de entre átomos de N, O ou S e incluem, e.g., grupos tetrahidrofuranilo, tetrahidropiranilo, piperidinilo, morfolino e pirrolidinilo.

Os grupos arilo carbociclicos adequados incluem compostos de anéis simples e múltiplos, incluindo compostos de anéis múltiplos que contêm grupos arilo separados e/ou fundidos. Os grupos arilo carbociclicos típicos contêm de 1 até 3 anéis separados ou fundidos e de 6 até cerca de 18 átomos de carbono em anel. Os grupos arilo carbociclico especificamente preferidos incluem fenilo, incluindo fenilo substituído tal como fenilo 2-substituido, fenilo 3-substituido, fenilo 2,3-substituido, fenilo 2,5-substituído, fenilo 2,3,5-substituido e fenilo 2,4,5-substituído, incluindo nos casos em que um ou mais dos 11 PE1414828 substituintes fenilo são um grupo atractor de electrões tal como halogéneo, ciano, nitro, alcanoílo, sulfinilo, sulfonilo e outros semelhantes; naftilo incluindo 1-naftilo e 2-naftilo; bifenilo; fenantrilo; e antracilo.

No presente documento, as referências feitas aos grupos R' substituídos dizem respeito à fracção especifica, tipicamente de alquilo ou alcenilo, que pode ser substituída em uma ou mais posições por um ou mais grupos adequados, e.g., halogéneo tais como fluoro, cloro, bromo e iodo; ciano; hidroxilo; nitro; azido; alcanoílo tal como um grupo Ci-g alcanoílo, tal como acilo e outros semelhantes; carboxamido; grupos alquilo incluindo os grupos que contêm de 1 até cerca de 12 átomos de carbono ou de 1 até cerca de 6 átomos de carbono, e mais preferencialmente 1-3 átomos de carbono; grupos alcenilo e alcinilo incluindo grupos contendo uma ou mais ligações insaturadas e de 2 até cerca de 12 átomos de carbono ou de 2 até cerca de 6 átomos de carbono; grupos alcoxi contendo aqueles grupos que apresentam uma ou mais ligações de oxigénio e de 1 até cerca de 12 átomos de carbono ou de 1 até cerca de 6 átomos de carbono; ariloxi tal como fenoxi; grupos alquiltio incluindo aquelas fracções que contêm uma ou mais ligações de tioéter e de 1 até cerca de 12 átomos de carbono ou de 1 até cerca de 6 átomos de carbono; grupos alquilsulfinilo incluindo as fracções que contêm uma ou mais ligações de sulfinilo e de 1 até cerca de 12 átomos de carbono ou de 1 até cerca de 6 átomos de carbono; grupos alquilsulfonilo incluindo as fracções que contêm uma ou mais ligações de 12 ΡΕ1414828 sulfonilo e de 1 até cerca de 12 átomos de carbono ou de 1 até cerca de 6 átomos de carbono; grupos aminoalquilo tais como grupos contendo um ou mais átomos de N e de 1 até cerca de 12 átomos de carbono ou de 1 até cerca de 6 átomos de carbono; arilo carbocílico contendo 6 ou mais átomos de carbono, particularmente fenilo (e.g., sendo R uma fracção de bifenilo substituído ou não substituído); e aralquilo tal como benzilo; grupos heterocíclicos incluindo grupos heteroalicíclicos e heteroaromáticos, especialmente com 5 a 10 átomos no anel, dos quais 1 a 4 são heteroátomos, mais preferencialmente grupos heterocíclicos com 5 ou 6 átomos no anel e 1 ou 2 heteroátomos, ou com 10 átomos no anel e 1 a 3 heteroátomos.

Os grupos R' preferidos estão presentes em grupos de fórmula R', COR' ou OCOR' e incluem alquilo ou alcenilo, que podem ser substituídos em uma ou mais posições disponíveis por um ou mais grupos adequados, e.g.; halogéneo tal como fluoro, cloro, bromo e iodo, especialmente co-cloro ou perfluoro; grupos aminoalquilo tais como grupos contendo um ou mais átomos de N e de 1 até cerca de 12 átomos de carbono ou de 1 até cerca de 6 átomos de carbono, e especialmente incluindo aminoácidos, nomeadamente glicina, alanina, arginina, asparagina, ácido asparagínico, cisteína, glutamina, ácido glutâmico, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptofano, tirosina ou valina, especialmente as formas protegidas de tais aminoácidos; arilo carbocíclico contendo 6 ou mais 13 ΡΕ1414828 átomos de carbono, particularmente fenilo; e aralquilo tal como benzilo; grupos heterocíclicos incluindo grupos heteroaliciclicos e heteroaromáticos, especialmente com 5 a 10 átomos no anel, dos quais 1 a 4 são heteroátomos, mais preferencialmente grupos heterocíclicos com 5 ou 6 átomos no anel e 1 ou 2 heteroátomos, ou com 10 átomos no anel e 1 a 3 heteroátomos, sendo os grupos heterocíclicos opcionalmente substituídos com um ou mais dos substituintes permitidos para R', e especialmente amino, tal como dimetilamino, ou com ceto.

Os compostos em que Ri não é hidrogénio têm uma actividade superior, uma janela terapêutica mais alargada e propriedades farmacocinéticas melhoradas.

Os compostos em que R5 não é hidrogénio constituem uma outra classe de compostos preferidos. Ver, por exemplo, os compostos 37, 38 e 42. Estes compostos tendem a ser menos activos (citotóxicos) mas apresentam uma menor toxicidade e melhores propriedades farmacocinéticas. Quando Rs não é hidrogénio, gera-se um centro quiral e foi por nós constatado que existe uma diferença ao nível da actividade entre os diastereoisómeros.

Os compostos em que R2 é um éster apresentam, em geral, propriedades toxicológicas melhoradas e, por conseguinte, proporcionam uma janela terapêutica mais alargada. 14 ΡΕ1414828

Existem compostos que apresentam boas propriedades ADME (absorção-distribuição-metabolismo-excreção) que são um bom indicador em termos farmaco-cinéticos.

Tal como referido acima, os compostos da presente invenção, preferencialmente aqueles com grupos substituídos volumosos, têm uma boa janela terapêutica e a esterificação dos fenóis com diferentes ácidos e carbonatos resulta numa melhoria geral das suas propriedades farmacêuticas: verifica-se uma diminuição significativa da toxicidade ao nivel do hepatócito, bem como um perfil de interacções medicamentosas favorável, visto que estes derivados não mostram uma inibição do citocromo, tendo assim uma maior estabilidade metabólica.

Foram preparados vários compostos anti-tumorais activos e acredita-se que muitos mais compostos possam ser formados de acordo com os ensinamentos da presente descrição.

As actividades anti-tumorais destes compostos incluem leucemias, cancro do pulmão, cancro do cólon, cancro do rim, cancro da próstata, cancro do ovário, cancro da mama, sarcomas e melanomas.

Um outro modo de realização especialmente preferido da presente invenção diz respeito a composições farmacêuticas úteis enquanto agentes anti-tumorais, que 15 PE1414828 contêm como ingrediente activo um composto - ou compostos -da invenção, bem como aos processos para a sua preparação.

Exemplos de composições farmacêuticas incluem qualquer sólido (comprimidos, drageias, cápsulas, grânulos, etc) ou liquido (soluções, suspensões ou emulsões) com composições adequadas para administração oral, tópica ou parentérica. A administração dos compostos ou composições da presente invenção poderá ser efectuada através de qualquer método adequado, tal como infusão intravenosa, preparação oral, preparação intraperitoneal e intravenosa.

Os compostos e as composições da presente invenção podem ser utilizados em conjunto com outras substâncias medicamentosas para proporcionar uma terapia combinada. As outras substâncias podem ser parte integrante da mesma composição, ou ser fornecidas como uma composição independente para administração em simultâneo ou em ocasiões diferentes. A identidade da outra substância não é particularmente limitada, e os candidatos adequados incluem: a) substâncias medicamentosas com efeitos antimitóticos, especialmente aquelas que se dirigem aos elementos citoesqueléticos, incluindo os moduladores microtubulares tais como os medicamentos à base de taxanos (tais como taxol, paclitaxel, taxotere, dacetaxel), podofilotoxinas ou 16 PE1414828 alcaloides vinca (vincristina, vimblastina); b) antimetabólitos tais como 5-fluorouracilo, citarabina, gencitabina, análogos de purina tais como pentostatina, metotrexato); c) agentes alquilantes tais como mostardas de azoto (tais como ciclofosfamida ou ifosfamida); d) substâncias que têm por alvo o ADN tais como as antraciclinas adriamicina, doxorubicina, farmorubicina ou epirrubicina; e) substâncias que têm por alvo as topoisomerases tais como o etopósido; f) hormonas e agonistas ou antagonistas hormonais tais como estrogénios, anti-estrogénios (tamoxifeno e compostos relacionados) e androgénios, flutamida, leuprorrelina, goserelina, ciproterona ou octreotido; g) substâncias dirigidas à transdução de sinal em células tumorais incluindo derivados de anticorpos tais como a herceptina; h) substâncias alquilantes tais como as platinas (cis- platina, carboplatina, oxaliplatina, paraplatina) ou nitrosureias; i) substâncias que afectam potencialmente as metastases de tumores tais como os inibidores da metaloproteinase matricial; j) terapia genética e agentes "antisense"; k) terapêutica com anticorpos; l) outros compostos bioactivos de origem marinha, nomeadamente as didemninas tais como a aplidina; m) análogos esteróides, em particular a dexametasona; 17 ΡΕ1414828 n) anti-inflamatórios, em particular a dexametasona; e o) anti-heméticos, em particular a dexametasona.

Ainda um outro modo de realização da presente invenção especialmente preferido diz respeito aos intermediários sintéticos dos compostos da invenção conforme descrito pormenorizadamente em seguida.

DESCRIÇÃO PORMENORIZADA DOS MODOS DE REALIZAÇÃO PREFERIDOS

Foi descrito, no pedido de patente internacional WO 0069862, o composto 36 (um intermediário na conversão de cianosafracina B para Ecteinascidina 743).

Este intermediário semi-sintético serviu de material inicial para a síntese de ecteinascidina 736, um outro membro da família das ecteinascidinas de ocorrência natural dotado de uma potencial actividade terapêutica anti-tumoral. O método preferido de produção dos compostos relacionados com a ecteinascidina 736, com diferentes substituintes na unidade de tetrahidro-p-carbolina e na 18 PE1414828 posição 18 (-0R4) encontram-se descritos abaixo no seguinte esquema reaccional.

Esquema 1

Tal como ilustrado no Esquema 1, o intermediário 36 pode ser convertido em ET-736 (ou um derivado substituído) em dois passos. 0 primeiro passo na produção dos compostos tipo I preferidos da presente invenção a partir do composto 36 consiste na introdução da unidade de tetrahidro-p-carbolina através da reacção com a amina primária ou secundária correspondente. 0 segundo passo é a transformação do grupo CN num grupo OH através da reacção com nitrato de prata em ACN/H2O. 19 ΡΕ1414828 É igualmente possível obter novos derivados com diferentes grupos substituintes (-OR4, posição 18 e =NR5) por meio de uma reacção de acilação ou alquilação a partir dos compostos preferidos 1. Em todos estes casos, Rx e R2 no material inicial representam um átomo de hidrogénio. A partir do mesmo intermediário e através de uma reacção de alquilação com brometo de alilo, ou de uma reacção de acilação com cloroformato de vinilo, é possível obter derivados N e O-alilados e N e O-vinilo. Todos estes compostos, mediante reacção com nitrato de prata, levam à obtenção dos produtos finais em que o grupo CN é transformado num grupo OH.

Conforme poderá ser facilmente verificado pelo técnico especializado neste domínio, o esquema reaccional aqui descrito pode ser alterado pela utilização de uma vasta gama de aminas primárias substituídas para produzir uma série de derivados de ecteinascidina 736 substituídos a fim de gerar os compostos que fazem parte da presente invenção.

Em particular, as condições reaccionais podem ser variadas de modo a se adequarem a outras combinações dos grupos substituintes na unidade de tetrahidro-p-carbolina. 0 método preferido de produção de ecteinascidina 694 e de compostos relacionados, com diferentes substituintes na posição 5 e 18 (-0R6 e -OR7) encontra-se descrito abaixo no seguinte esquema reaccional. 20 PE1414828

Esquema 2

No Esquema 2, a hidrólise do grupo acetilo em C-5 em condições básicas permite preparar o intermediário com o grupo hidroxilo nesta posição. A partir deste composto, e através de uma reacção de acilação com anidridos, cloretos de ácidos ou ácidos carboxilicos, são preparados novos derivados mono-0 substituídos e mono- e di-0 substituídos (em C-5 e C-18). A reacção que visa transformar o grupo CN no OH é realizada nas condições clássicas (nitrato de prata em CH3CN/H20) . Por outro lado, a Et-694 pode ser obtida a partir da Et-736 através da hidrólise do grupo acetilo em C-5 com KOH/MeOH.

Conforme poderá ser facilmente verificado pelo técnico especializado neste domínio, o esquema reaccional aqui descrito pode ser alterado pela utilização de uma vasta gama de aminas primárias substituídas para produzir uma série de derivados de ecteinascidina 736-CN substituí- 21 PE1414828 dos a fim de gerar os compostos que fazem parte da presente invenção.

Em particular, as condições reaccionais podem ser variadas de modo a se adequarem a outras combinações dos grupos substituintes na unidade de tetrahidro-p-carbolina e nas posições C-5 e C-18. A presente invenção irá ser adicionalmente ilustrada tendo por referência os seguintes exemplos que ajudam à sua compreensão, mas que não deverão ser entendidos como limitações à mesma. A numeração dos compostos não é totalmente sequencial devido às anulações. PARTE EXPERIMENTAL Esquema 1 Método 1.- A uma solução de 1 equiv. de material inicial em ácido acético (5,33 E-5M), sob árgon e à temperatura ambiente, adicionou-se 3,5 equiv. de triptamina. A mistura reaccional foi agitada durante 24 h e 0 ácido acético foi evaporado. Adicionou-se uma solução saturada aquosa de NaHC03 e a mistura foi extraída com CH2CI2 e as camadas orgânicas foram secas sobre Na2SC>4. A cromatografia instantânea proporciona compostos puros. Método 2.- A uma solução de 1 equiv. de composto 1 em CH2CI2 (0,032M), sob árgon e à temperatura ambiente, adicionou-se 2 equiv. de Et3N e 2 equiv. do cloreto de 22 ΡΕ1414828 butirilo ou anidrido Boc (3 equiv.) ou cloroformato de vinilo. A reacção foi seguida por cromatografia de camada fina (TLC) e temperada com uma solução saturada aquosa de NaHC03, extraída com CH2C12 e as camadas orgânicas foram secas sobre Na2SC>4. A cromatograf ia instantânea proporciona 0 composto puro. Método 3.- A uma solução de 1 equiv. de composto 1 em DMF (0,032M), sob árgon e à temperatura ambiente, adicionou-se 3 equiv. de Cs2C03 e 3 equiv. do brometo de alilo. A reacção foi seguida por TLC e temperada com uma solução saturada aquosa de NaHC03, extraída com CH2C12 e as camadas orgânicas foram secas sobre Na2S04. A cromatografia instantânea proporciona uma mistura de dois compostos puros: composto 24 (ET-736-CN-A11) e composto 25 (ET-736-CN-diAll). Método 4.- A uma solução de 1 equiv. de material inicial em CH3CN/H20 3:2 (0, 009M) adicionou-se 30 equiv. de AgN03. Após decorridas 24 h, a reacção foi temperada com uma mistura de 1:1 de soluções saturadas de salmoura e NaHC03, agitada durante 10 min. e diluída e extraída com CH2C12. A camada orgânica foi seca com Na2S04. A cromatografia proporciona compostos puros. 23 ΡΕ1414828 Método 1:

Composto 1 (composto de referência): ^-NMR (300 MHz, CDCI3): δ 7 ,74 (s, 1H); 7 ,38 (d, 1H); 7 ,25 (d, 1H) ; 7 O co (t, 1H) ; 7, 00 (t, 1H); 6,66 (s , 1H) ; 6,22 (d, 1H) ; 6, 02 (d, 1H) ; 5, 79 (s, 1H) ; 5,08 (d, 1H) ; 4,55 (s, 1H) ; 4, 32 (s, 1H) ; 4, 27 (d, 1H) ; 4,21 (s, 1H) ; 4,19 (d, 1H) ; 3, 81 (s, 3H) ; 3, 44-3 S, 40 (m , 2H) ; 3,18- -2, 78 (m, 4H); 2,71- 2, 51 (m, 3H) ; 2, 37 (s, 3H) ; 2,26 (s, 3H) ; 2,21 (s, 3H) ; 2, 06 (s, 3H) • 13c- -NMR (75 MHz, CDCI3): δ 171,7, 168, 9, 148,2 r 145 ,9, 143 ,2, 141, 3, 140 ,5, 135 ,7, 130, 8 , 130 ,6, 129,5 t 127 ,0, 122 ,2, 120, 9, 120 ,8, 119 ,5, 118, 6 , 118 ,4, 113,8 r 111 ,1, 110 ,5, 102, 2, 62, 5, 61,5, , 60 ,8, 60,5, 59, 7 , 55, 9, 54 ,8, 42, 1, 41,7, 40, ,0, 39,5, 29 ,9, 24,0, 21,7, 20, 8, 16, Ί, 9, 9. ESI-MS m/z; Calculado para C41H41N5O8S: 763,3 Encontrado (M+H+) : 764,2 . ΡΕ1414828 24

fóeO

Composto 2: 1H-NMR (300 MHz, CDC13) : δ 7,64 (s, 1H) ; 7,12 (d, 1H) ; 6,81 (d, 1H) ; 6,73 ; (dd, 1H) ; 6 , 65 (s, 1H) ; 6 ,19 (s, 1H) ; 6,00 (s, 1H) ; 5,79 (s, 1H) ; 5,0 (d, 1H); 4, 54 (s, 1H) ; 4, 30 (s, 1H) ; 4, .27 (d, , 1H); 4,20 (s, 1H); 4, 18 (d, 1H) ; 3, 80 (s, 3H) ; 3, 78 (s, 3H); 3 ,43-3, 40 (m, 2H); 3, 18- 2,77 (ir i, 4H) ; 2,66-2, 49 (m, 3H); 2,37 (s, 3H); 2,34-2 ,20 (m, 1H) ; 2,26 (s, 3H) ; 2,21 (S, 3H)i : 2,05 (s, 3H) . 13C_ -NMR (75 MHz, CDC13) : δ 171,4, 168, 6, 153,7, 148 ,0, 145 , 6, 142,9, 141 .,o, 140,2, , 131,1 , 130 ,6, 130,5, 129 ,2, 127 ,0, 120,6, 120 ',5, 118,2, , 113,6 , 111 ,9, 111,6, 110 ,0, 102 ,0, 100,3, 62, 3, 61,2, 60,5, 60,2, 59, 4 :, 55,7, 54 , 6, 54, 5, 41,8, 41 ,4, 39,7 , 39,2 , 31,5, 29,6, 23, 8, 22,6, 21 ,5, 20, 5, 15,8, 14, 4, 9,7. ESI-MS m/ z : Calculado para C42H43N509S: 793 ,3 Encontrado (M+H+) : 794, 7

Composto 3: 1H-NMR (300 MHz, CDC13) : δ 7,85 (s, 1H); 7,45- 25 ΡΕ1414828 7,36 (m, 5H) ; 7, 01 (t, 1H); 6,91 (t, 1H); 6,65 -6, 63 (m, 2H) ; 5,87 (s, 1H) ; 5,77 (s, 1H) ; 5,63 (s, 1H) ; 5, 13 (s, 2H) ; 5,05 (d, 1H) ; 4,53 (s, 1H); 4,27-4,19 (m, 4H) ; 3,80 (s, 3H); 3,46-3,39 (m 2H); 3,06-2,79 (m, 4H); 2,68-2,50 (m 2H); 2, 42-2, 20 (m, 1H); 2,36 (s, 3H); 2,27 (s, 3H); 2,20 (s, 3H); 2,03 (s, 3H). ESI-MS m/z: Calculado para C48H47N5O9S: 869,3 Encontrado (M+H+) : 870,3.

Composto 5: H- -NMR (300 MHz, CDCI3) : δ 7, 63 (s, 1H); 7 ,15- 7,11 (m, 2H); 6,91 (dd, 1H) ; 6,65 (s, 1H) ; 6,21 (d, 1H) ; 6,01 ( !s, 1H); 5, 78 (s, 1H) ; 5,07 (d, 1H) ; 4,54 (s, 1H) ; 4,31 1 !s, 1H); 4,27 (d, 1H) ; 4,21-4,16 (m, 2H); 3,81 (s, 3H) ; : 5,44-3, 40 (m, 2H) ; 3,17 -2,77 (m, 4H) ; 2,66-2,46 (m, 3H) ; í 2,31 (s, 6H) ; 2,26 (s, 3H); 2,21 (s, 3H) ; 2,06 (s, 3H) . ESI-MS m/z: Calculado para C42H43N508S : 777 ',3 Encontrado (M+Na+ ) : 800, 7. 26 ΡΕ1414828

Composto 6 : -NMR (300 MHz, CDCI3 ): δ 7,66 (s, 1H) ; 6 ,95 (d, 1H); 6 ,64 (S, 2H) ; 6,56 (dd, 1H) ; 6,15 (s, 1H) ; 5 ,97 (s, 1H); 5, 81 (s, 1H); 5, 06 (d ., 1H) ; 4,53 (s, 1H) ; 4, 29 (s, 1H) ; 4,26 (d, 1H) ; 4,19 (s, 1H) ; 4,17 (d, 1H) ; 3, 80 (S, 3H) ; 4,41- 3,39 (m, 2H) ; 3,12- -2, 73 (m, 4H) ; 2,55 -2, 27 (m, 3H) ; 2,36 (s, 3H) ; 2,25 (s, 3H) ; 2,20 (s, 3H) ; 2, 04 (s, 3Η) . ESI-MS m/z: Calculado para C41H41N5O9S: 119,3 Encontrado (M+H+) : 780,3.

Composto 7: 1H-NMR (300 MHz, CDC13) : δ 7,75 (s, 1H) ; 7,26 (dd, 1H); 6,93 (dd, 1H); 6,76 (ddd, 1H); 6,65 (s, 1H); 6,22 (d, 1H); 6,01 (d, 1H); 5,79 (s, 1H); 5,08 (d, 1H); 4,55 (s, 1H) ; 4,31 (s, 1H); 4,25 (d, 1H) ; 4,20 (s, 1H) ; 4,18 (dd, 1H) ; 3,80 (s, 3H); 3,43-3,40 (m, 2H) ; 3,18-2,77 (m, 4H) ; 2, 64-2,50 (m, 3H) ; 2,36 (s, 3H) ; 2,26 (s, 3H) ; 2,21 (s, 27 ΡΕ1414828 3Η); 2,06 (s, 3H), ESI-MS m/z: Calculado para C41H40FN5O8S: 781,3 Encontrado (M+H+) : 782,3 .

HO

Composto 8: ^-NMR (300 MHz, CDCI3 ): δ ( i, 93 (d, 1H); 6,80 (s, 1H); 6,73 (s, 1H) ; 6,67 (dd, 1H); 6 S, 46 (s, 1H); 6,20 (s, 1H); 6,06 (s, 1H); 5 ,72 (s i, 1H) ; 4,96 i (d, 1H) ; 4,45 (s, 1H) ; 4,37 (d, 1H) ; 4,25 (d, 1H) ; 4,05-4 l, 01 (m, 2H) ; 3,79 (s, 3H); 3,63 (d, 1H) ; 3,39 (d, 1H); 3,03- 3,91 (m, 2H) ; 2,76-2,34 (m, 5H) ; 3,30 (s, 3H) ; 2,28 (S, 3H); 2,21 (s, 3H); 2,18 (s, 3H) ; 2, 04 (s, 3H). ESI-MS m/z: Calculado para C42H4: sNsOgS: 793 , 3 Encontrado (M+H+) : 794,3.

Composto 9: 1H-NMR (300 MHz, CDC13) : δ 7,63 (s, 1H) ; 7,24 (d, 1H); 6,75 (d, 1H) ; 6,66 (dd, 1H) ; 6,65 (s, 1H) ; 6,20 28 ΡΕ1414828 (s, 1H); 6,00 (s, 1H); 5,79 (s, 1H); 5,07 (d, 1H) ; 4,54 (s, 1H) ; 4,31 (s, 1H); 4,27 (d, 1H) ; 4,20 (d, 1H) ; 4,17 (dd, 1H); 3,80 (s, 3H); 3,71 (s, 3H); 3,43-3,40 (m, 2H); 3,16- 2,78 (m, 4H) ; 2,64-2,49 (m, 3H), 2,36 (s, 3H) ; 2,25 (s, 3H); 2,21 (s, 3H); 2,06 (s, 3H). ESI-MS m/z: Calculado para C42H43N5O9S: 793,3 Encontrado (M+H+) : 794,3 .

Composto 11: 1 H-NMR (300 MHz, CDC1 3) : δ 7, 48 (s, 1H) ; 7,22 (d, 1H) ; 6,96 -6,88 (m, 2H) ; 6,65 (s, 1H) ; 6,15 (d, 1H) ; 6,04 (d, 1H) ; 5, 78 (s, 1H) ; 5,09 (d, 1H) ; 4,55 (s, 1H) ; 4,34 (s, 1H) ; 4,28- -4,20 (m, 3H) ; 3, 81 (s, 3H) ; 3, 48 (d, 1H) ; 3,42 (d, 1H) ; 3,12 -2,78 (m, 4H) ; 2, 69 -2, 43 (m, 3H) ; 2,37 (s, 3H) ; 2, 36 (s, 3H) ; 2,28 (s, 3H) ; 2,21 (s, 3H) ; 2, 06 (s, 3H). ESI-MS m/z: Calculado para C42H43N5O8S: 777,3 Encontrado (M+H+) : 778,3 29 ΡΕ1414828

Composto 12 (primeiro isómero): 1H- -NMR (300 MHz , CDCI3 ) : δ 7,68 (s, 1H) ; 7,05 (d, 1H) ; 6,63- 6,57 (m, 3H) ; 6,22 (d, 1H) ; 6,02 (d, 1H); 5,73 (s, 1H) ; 5, 12 (d, 1H) ; 4,58 (s, 1H) ; 4,36 (s, 1H); 4,34- 4, 22 (m, 3H); 3, 80 (s, 3H); 3 ,47- 3, 42 (m, 2H) ; 3,05-2,86 (m, 2H); 2 ,67- 2,35 (m, 2H); 2 ,32- 2, 05 (m, 3H) ; 2,31 (s, 3H) ; 2,28 (s, 3H) ; 2,15 (s, 3H) ; 2,03 (s, 3H); 1,07 (d, 3H) . ESI-MS m/z: Calculado para C42H43N5O9S: 793,2 Encontrado (M+H+) : 794,2 .

Composto 13 (segundo isómero) : XH- NMR (300 MHz, CDCI3 ); δ 7,54 (s, 1H) ; 7,08 (d, 1H) ; 6,' 73 (d, 1H) ; 6,63 (dd, 1H) ; 6,57 (s, 1H) ; 6,20 (d, 1H) ; 6, 00 (d, 1H) ; 5,74 (s, 1H) ; 5, 02 (d, 1H) ; 4,60 (s, 1H) ; 4, 33 (s, 1H) ; 4,27 (d, 1H) ; 4,22 (d, 1H) ; 4,12 (dd, 1H) ; 3 , 80 (s, 3H) j ; 3,44 -3,32 (m, 3H) ; 3,05-2, 89 (m, 2H) ; 2,49- -2, 03 (m, 4H) ; 2, 32 (s, 3H) ; 2,24 (s, 3H) ; : 2,18 1 (s, 3H); 2, 07 (s , 3H); 1, 21 (d, 3H) . ESI-MS m/z: Calculado para C42H43N5O9S: 793,2 Encontrado (M+H+) : 794,2 .

Composto 17 (segundo isómero): ^-NMR (300 MHz, CDCI3) ; δ 7,65 (s, 1H) ; 7,18 (dd, 1H); 6,99 (dd, 1H); 6,83 30 ΡΕ1414828 (ddd , 1H); 6,58 (s, r 1H) ; 6, 22 (d, 1H); 6,01 (d, 1H) ; 5, 74 (s, 1H); 5, 03 (d, 1H); 4, 61 (s, 1H); 4,34 (s, 1H) ; 4,27 (d, 1H) ; 4,22 (d, 1H) ; 4, 14- 4,10 (m, 1H); 3,80 (s, 3H) ; 3,44 (d, 2H) ; 3 ,38- -3,30 (m, 1H); 3,06-2,99 (m, 2H) ; 2,50 (dd, 1H) ; 2,43 (d, 1H) ; 2,32 (s , 3H); 2,24 (s, 3H) ; 2,18 (s, 3H) ; 2,16-2 ,11 (m, 2H) ; 2 , 08 (s, 3H); 1, 20 (d , 3H) ESI-MS m/z: Calculado para C42H42FN5O8S: 795, 3 Encontrado (M+H+) : 796,2 . Método 4:

Composto 26 (Composto de Referência): ^-NMR (300 MHz, CDCI3) : δ 7,70 (s, 1H); 7,38 (d, 1H) ; 7,24 (d, 1H) ; 7,08 (t, 1H); 7,00 (t, 1H); 6,67 (s, 1H); 6,20 (d, 1H); 5,99 (d, 1H) ; 5,74 (s, 1H); 5,20 (d, 1H); 4,82 (s, 1H); 4,347-4,38 (m, 3H) ; 4,16-4,10 (m, 2H) ; 3,81 (s, 3H) ; 3,49 (d, 1H) ; 3,22-3,13 (m, 2H); 3,00 (d, 1H); 2,88-2,79 (m, 2H); 2,71- 2,52 (m, 3H) ; 2,37 (s, 3H) ; 2,28-2,24 (m, 1H) ; 2,25 (s, 3H); 2,19 (s, 3H); 2,05 (s, 3H). 13C-NMR (75 MHz, CDCI3) : δ 171, 4, 168, 7, 147, 8, 1, 45,4, 142.8, 141,0, 140,6, 135,4, 131,2, 130,9, 1,29,0, 126,8, 121.8, 121,3, 120,9, 119,1, 118,3, 118,1, 115,5, 112,8, 31 ΡΕ1414828 110.8, 110,1, 101,7, 81,9, 62,3, 61,8, 60,2,57,6, 57,4, 55.8, 54,9, 42,1, 41,2, 39,7, 39,2, 31,5, 23,5, 22,6, 21,5, 20,5, 15,8, 14,0, 9,6. ESI-MS m/z: Calculado para C40H42N4O9S: 754,3 Encontrado (M-H20+H+) : 737, 2.

Composto 27: 1 H-NMR (300 MHz, CDCI3) : δ 7,59 (s, 1H) ; 7 ,13 (d, 1H) ; 6,81 (s, 1H); 6,73 (dd, 1H); 6,67 (S, 1H) ; 6 ,19 (d, 1H) ; 5,99 (d, 1H); 5,74 (s, 1H); 5,19 (d, 1H) ; 4, 82 (s, 1H) ; 4, 49-4,47 (m, 2H); 4,16- -4,09 (m, 2H) ; 3, 81 (s , 3H); 3,79 (s , 3H); 3,50 -3,45 (m, 2H); 3, 24-3,13 (m, 2H) ; 3 , 02 (d, 1H) ; 2,88- -2,79 (m, 2H); 2,67-2, 48 (m, 3H) ; 2, 37 (s, 3H) ; 2, 30-2,24 (m, 1H); 2,25 (s, 3H); 2,19 (s, 3H) ; 2 ,04 (s, 3H) r 13C- -NMR (75 MHz, CDCI3): δ 171,6, 154,0, 148, 1, 145 ,6, 143 ,1, 141,3, 140, 9, 131,9, 131,4, 130,8, 129, 3, 127 ,4, 121 ,5, 121,2, 115, 7, 113,1, 112,1, 111,8, 110, 1, 102 ,0, 100 ,6, 82,1, 62,6, O ^O O CM ^O ,5, 57, 9, 57,6 , 56 ,1, 56 ,0, LO LO 2, 42,4, 41 ,5, 40,0, 39,4, 31,8, 29,9, 23, 8, 22,8, 21 ,8, 20, 8, 16,0, 14 ,6, 9 ,9. ESI -MS m/z: Calculado para C40H42N4O9S : 784,4 Encontrado (M- H20+H+) : : 767,2. 32 ΡΕ1414828

Composto 28: 1 H-NMR (300 MHz, CDC13 .): δ 7, 81 (s, 1H); U) 1 7,36 (m, 5H) ; 7, 01 (d, 1H) ; 6,91 (t, 1H) ; 6,66 (s , 1H); 6,63 (d, 1H); 5, 84 (s, 1H) ; 5, 75 (s, 1H) ; 5,60 (s , 1H); 5,20 -5,09 (m, 3H) ; 4,78 (s, 1H) ; 4,49 (d, 1H) ; 4, 44 (s, 1H) ; 4,16 (s, 1H) ; 4,14 -4,12 (m, 1H) ; 3, 81 (s, 3H) ; 3,52 (d, 1H); 3,47 (s, : 2H) ; 3,22- -2,80 (m, 5H) ; 2,68 ;_2, 51 (m, 2H) ; 2,36 (s, 3H) ; 2,39 -2,21 (m, 1H) ; 2,27 (s, 3H) ; 2,18 (s, 3H); 2,02 (s, 3H). 13C-NMR (75 MHz, CDC13) : δ 171, 4 , 148,0, 145, 6, 145,2, 143, 1, 141,1, 140, 8 , 137,3, 131, 1 5, 130,7, 129, 3, 128,8, 128, 5, 128,2, 128, 0 , 126,2, 121, 4, 121,3, 119, 8, 118,1, 115, 5, 113,0, 111,8, 111 ,0, 103,8, 101, 8, 82, 1, 70,6, 62,9, 61, 9 , 60,5, 58 ,0, 57 ,7, 56,1, 55,1, 42, 3, 41, 5, 40,0, 39, 5, 29, 9 , 23,9, 22 ,0, 20 ,7, 16,0, 9,8. ESI- MS m/z: Calculado para C47 H48N4O 10S: 860,3 Encontrado (M- H20+H+) : 843,3 ΡΕ1414828 33 Μ«!

Composto 30: 1 H-NMR (300 MHz, CDC13) : δ 7, 61 (s, 1H); 7, 16- 7,11 (m, 2H) ; 6, 91 (d , 1H); 6,67 (s, 1H) ; 6,20 (d , 1H); 5, 99 (d, 1H) ; 5, 75 (s , 1H); 5,20 (d, 1H) ; 4,82 (s , 1H); 4, 49 (d, 1H) ; 4, 35 (s, 1H) ; 4, 16 (d, 2H) ; 4,11 (dd , 1H); 3, 81 (s, 3H) ; 3, 48 (s, - 1H) ; 3,23- 2, 79 (m, 5H); 2,67-2 ,47 (m, 3H); 2,37 (s, 6H) ; 2,25 (s, 3H) ; 2, 19 (s , 3H); 2, 05 (s, 3H) . 13c-nmr (75 MHz, CDC1 3) : δ 174,5 , 171,6, 168,9, 148 ,1, 145,6 , 143,1, 141,3 r 140,9, 134,0, 131,2, 128,6, 127 ,3, 123,6 , 121,5, 121,2 118,3, 115, 7, : 109,9, . 102,0, 82 ,1, 62,6, 62 ,0, 60 ,5, 57 ,9, 57,7, 56,1, 56, 2, 42 ,4, 41,5, 40 ,0, 39,4, 29 , 9, 23 ,8, 21 ,7, 21,6, 20,8, 16, 0, 9, 9.

ESI-MS m/z: Calculado para C41H44N4O9S: 768,3 Encontrado (M-H20+H+) : 751,3.

HO

34 ΡΕ1414828

Composto 31: 1H-NMR (300 MHz, CDC13) : δ 7,60 (s, 1H); 7,00 (d, 1H); 6,69 (d, 1H) ; 6,66 (s, 1H) ; 6,69 (dd, 1H) ; 6,16 (S, 1H) ; 5, 96 (s, 1H) ; 5, 78 (s, 1H) ; 5,19 (d, 1H) ; 4, 82 (s, 1H) ; 4, 49 (d, 1H) ; 4,46 (s , 1H); 4,17 (d, 1H) ; 4, 10 (d, 1H) ; 3, 81 (s, 3H) ; 3,72-3,59 (m, 2H) ; 3 , 6 4 (d, 2H) ; 3 ,50 (d, 1H) ; 3 , 23 -2,76 (m, 4H) ; 2,55- -2,29 (m, 3H) ; 2, 37 (s, 3H) ; 2, 25 (s, 3H) ; 2 ,19 (s, 3H); 2, 03 (s, 3H) • 13c- -NMR (75 MHz, CDCI3): δ 171,3 , 166, 9, 149,2 r 147 ,9, 145 ,4, 142, -9, 141, 0 , 140,7, , 131,2, 130 ,7, 127,5 r 121 ,2, 120 ,9, 115, 5, 111,5, 103,1, 101,8, 81,9, 62, 3, 61, 8, 60 ,3, 57, 7, 57,4, 55 ,8, 54 ,9, 42,1 , 41,2, 39,6, 39, 1, 29, • 6, 23 ,5, 22, 6, 21,4, 20 ,5, 15 ,8, 14,1 , 9,6. ESI-MS m/z: Calculado para C40H42N4O10S: 770,3 Encontrado (M-H20+H+) : 753,3.

Composto 32: ^-NMR (300 MHz, CDC13) : δ 7,72 (s, 1H) ; 7,27 (dd, 1H); 6,94 (dd, 1H); 6,76 (ddd, 1H); 6,66 (s, 1H); 6,20 (s, 1H); 5,99 (s, 1H); 5,75 (s, 1H); 5,19 (d, 1H); 4,83 (s, 1H); 4,49 (d, 1H); 4,16-4,09 (m, 2H); 3,81 (s, 3H); 3,50-3,48 (m, 1H) ; 3,48 (s, 1H) ; 3,22-2,79 (m, 5H) ; 2,65-2,51 (m, 3H); 2,37 (s, 3H); 2,25 (s, 3H); 2,19 (s, 3H); 2,05 (s, 3H) . 35 ΡΕ1414828 13c- -NMR (75 MHz, CDC1 3) : δ 171,5, 169, o, 148,1, 145, 7, 143 ,1, 141, 3, 140 ,9, 131, 5, 129, 3 , 123, 7, 121,5, 121, 1, 119 ,3, 119, 1, 118 ,3, 115, 7, 110, 4 , 108, 2, 107,8, 102, o, 97, 8, 97,5, 82, 1/ 62,4, 62, 1/ 60,5, 57,9, 57, 6, 56,1, 55, 1/ 42, 4, 41,5, 39, 9, 39,4, 29, 9, 23,8, 21,7, 20, 8, 16,0, 9,9 . ESI-MS m/z: Calculado para C40H41FN4O9S: 772,3 Encontrado (M-H20+H+) : 755,3.

HO

Composto 33: 1 H-NMR (300 MHz, CDC1 3) : δ 6,85 (d, 1H) ; 6,80 (s r 1H) ; 6,71 -6, 64 (m, 2H) ; 6, 48 (s, 1H) ; 6 r 18 (s, 1H) ; 6, 02 (s, 1H) ; 5, 74 (s, 1H) ; 5,03 (d, 1H) ; 4 ,88 (d, 1H) ; 4, 39 (d, 1H) ; 4, 36 (s, 1H) ; 4, 16 (d, 1H) ; 3, 98 (ddm 1H) ; 3, 80 (s, 3H) ; 3, 71 (d, 1H) ; 3,48 (s, 1H) ; 3 ,22 (d, 1H) ; 2, 93- -2, 83 (m, 2h; ); 2, 73- -2,39 (m, - 4H) ; 2,29 (s , 3H) ; 2,28- 2, 05 (m, 1H) ; 2, 26 (s, 3H) ; 2,22 (s, 3H) ; 2 r 18 (s, 3H) ;

2, 03 (s, 3H) . 13C-NMR (75 MHz, CDCI3) : δ 168, 9, 149, 3, 147, 6, 145,5, 142,7, 141,6, 140,7, 131,3, 131,1, 129,3, 126,9, 121,2, 115,7, 111, 9, 111, 0, 110,7, 103,1, 102,0, 83,4, co 63,7, 60,2, 58,5, 57,7, 55,1, 54, 7, 59,5, 43,1, 41,4, 40,6, 35, 0, 29,6, 24,6, 22,6, 21,1, 20, 2, 15,5, 9,7. ESI-MS m/z: Calculado para C41H44N4O10S: 784,3 Encontrado (M- 36 ΡΕ1414828 H20+H+) 767,3.

Composto 34: 1H-NMR (300 MHz, CDC13) : δ 7,58 (s, 1H); 7,23 (d, 1H) ; 6,76 (d, 1H) f 6,67 (dd, 1H) ; 6 , 66 (s, 1H) f 6,19 (d, 1H); ! 5, 98 (d, 1H) ; 5 ,74 (s, 1H); 5, 20 (d, 1H) ; 4, 82 (s, 1H) ; 4,49 (d, 1H) ; 4, 47 (s, 1H) ; 4, 16 (d , 1H); 4,1, 0 (dd, 1H) ; 3,81 (s, 3H) ; 3, 78 (S, 3H) ; 3,51- -3, 47 (m, 1H) ; 3 , 22- 2, 80 (m, 5H) ; 2 , 1 55,2, 50 (m, , 3H); 2,36 ( :s, 3H) ; : 2, 25 (s, 3H) ; 2,19 (s, 3H) i : 2,05 (s, 3H) . 13c- -NMR (75 MHz, CDCI3): δ 171, ' 1, 168, - 9, 156,5, 148, 1, 145 ,6, 143, 1, 141 ,3, 140, 9, 136, 5, 131 ,5, 129,8, 129, 3, 121 ,6, 121, 5, 121 ,2, 119, 2, 115, 8, 113 ,1, 110,3, 109, 3, 102 ,2, 94,9 , 82,2 r 62,5, 62 ,0, 60 ,5, 57, 9 , 57,7, 56, 1, LO LO 8, 55,2, 42,3, 41, 5, 40, r 0, 39,5 1 29,9, 23, 8, 21,8 , 20, 8, 16,0, 9,9. ESI-MS m/z: Calculado para C41H44N4O10S: 784,3 Encontrado (M-H20+H+) ; 767, 3. 37 ΡΕ1414828

Composto 36: 1 H-NMR (300 MHz, CDCI3 ): δ 7, 47 (s, 1H) ; 7,22 (d, 1H) ; 6,95 -6,87 (m, 2H) ; 6,66 (s, 1H) ; 6,13 (d , 1H) ; 6,01 (d , 1H) ; 5, 76 (s, 1H); 5,20 (d, 1H) ; 4,84 (s , 1H); 4, 49 (d , 1H) ; 4,46 (s, 1H); 4,18- 4, 14 (m, 2H) ; 3, 81 (s, 3H) ; 3, 54 (d, 1H) ; 3,48 (s, 1H); 3,22 (d, 1H) ; 3,20-2,80 (m, 4H) ; 2,70- -2, 42 (m, 3H); 2,36 ( : s, 6H) ; 2,27 (s , 3H); 2,18 (s, - 3H) ; 2,05 (s, 3H) . 13c-nmr (75 MHz, CDCI3): δ 171,3, 169,0, 148, 0, 145,6, 143, 1, 141,4, 140,9 , 135,3, 131, 5 , 131,1, 130, 7, 129,4, 126, 6, 122,8, 121, 8 , 121,3, 119, 9 , 119,6, 118, 1, 116,3, 115, 8, 102,0, 82,1, 62,1, 60,5, 58,0, 57, 8 , 56 ,1, 55,1, 42, 4 , 41,5, 40 ,1, 39 ,6, 29,9, 23,9, 21,9 d 20, 7, 16,6, 16,0, 9, 9 . ESI-MS m/z: Calculado para C41H44N4O9S: 768,2 Encontrado (M-H20+H+) : 751,2.

I 38 ΡΕ1414828

Composto 37 (primeiro isómero) : 1H-NMR (300 MHz, CDC13) : δ 7, 70 ( s, 1H) ; 7, 06 (d, 1H); 6,67- -6, 61 (m, 3H) ; 6, ,20 (d 1H) ; 5 , 98 (d, 1H) ; 5, 70 (s, 1H); 5, 20 (d, 1H) ; 4 / , 86 (s 1H) ; 4 ,53 (d, 1H) ; 4, 48 (s, 1H); 4, 18 (s, 1H) ; 3, , 80 (s 3H) ; 3 ,72- -3,54 (m, 4H) ; 3,24-3,22 (m, 1H) ; 3,01- -2/ ,56 (m 5H) ; 2j , 31 (s, 3H); 2 ,27 (s, 3H); 2, 15 (s , 3H) ; 2,02 (s 3H) 1,10 (d, 3H). ESI-MS m/z: Calculado para C41H44N4O10S: 784,3 Encontrado (M-H20+H+) : 767, 3.

Composto 38 (segundo isómero): 1H-NMR (300 MHz, CDC13): δ 7, 51 (s, 1H) ; 7,10 (d, 1H) i LO r- (d, 1H); 6,64 (dd, 1H) ; 6, 59 (s, 1H) ; 6,19 (d, 1H) ; 5,97 (d, 1H); 5,71 (s, 1H) ; 5, 15 (d, 1H) ; 4,84 (s, 1H) ; 4,53 -4,50 (m, 2H) ; 4,16 (s, 1H) ; 4,04 (dd, 1H) ; 3, 80 (s, , 3H) ; 3,65-3,63 (m, 1H); 3 ,51- 3, 49 (m, 1H) ; 3, 40- -2, 36 (m, 1H) ; 3,24-3,21 (m, 1H); 3 , 03- 2, 84 (m, 2H) ; 2,50 -2,41 (m , 2H); 2,32 (s, 3H) ; 2,23 (s, 3H) ; 2,16 (s, 3H); 2,06 (s, 3H); 1, ,20 (d, 3H) ESI-MS m/z: Calculado para C41H44N4O10S: 784,3 Encontrado (M-H20+H+) : 767, 3.

Composto 42 (segundo isómero): ^-NMR (300 MHz, CDC13) : δ 39 ΡΕ1414828 7,62 ( s, 1H); 7,18 (dd, 1H); 6 ,99 (dd, 1H); 6 ,82 (ddd, 1H) ; ζΤδ LO CD (s, 1H); 6,20 (d, 1H) ; 5,98 (d, 1H) ; 5,71 (s, 1H); 5,15 (d, 1H); 4,85 (s, 1H) ; 4,52 (s, 1H) ; 4,50 (d, 1H); 4,16 (d, 1H); 4,05 (dd, 1H); 3,80 (s , 3H); 3,50- 3,48 (m, 1H) ; 3,42-3,36 (m, 1H) ; 3,23 (d, 1H) ; 3,00- -2, 81 (m, 2H); 2,50 1 (dd, 1H), ; 2,44 (d, 1H) ; 2,32 (s , 3H); 2,24 (s, 3H); 2,16 ( s, 3H); 2,07 (s, 3H); 1 ,23 (d, 3H), 13' C-NMR (75 MHz, CDCI3) : δ 171, 9, 168,7, 156,2, 147,8, 145,6, 143,3 ;, 141,8, 140,9, 132,7, 131,4, 131,1, 129,4, 129,0, 121,8 , 121,4, 115,8, 113,1, 111,9, 111,8, 110,4, 110,0, 103,7 , 103,4, 102,0, 81,9, 63,4, 61, 8, 60, •6, 58,0 , 56,2 , 55, 2, 46,6, 42,3, 41,5, 41 ,0, 32,1, 29,5, 23,9, 22 ,9, 21, 9, 20, 7, 16,1, 14,3, 9,9. ESI-MS m/z: Calculado para C41H43FN4O9S: 786,2 Encontrado (M-H20+H+) : 769,3.

BIOENSAIOS PARA ANÁLISE ANTI-TUMORAL A finalidade destes ensaios é a de interromper o crescimento de uma cultura de células tumorais "in vitro" por meio de uma contínua exposição das células à amostra a ser testada.

LINHAS CELULARES

Nome N° ATCC Tecido Características da Espécie P-388 CCL-46 ascites de Neoplasma linfóide fluido murganho ΡΕ1414828 40 Κ-562 Α-549 SK-MEL-2 8 ΗΤ-29 LoVo LoVo-Dox SW620 CCL-243 leucemia humana Eritroleucemia (efusão pleural) CCL-185 pulmão humano Carcinoma pulmonar "CPNPC" HTB-72 HTB-38 CCL-229 CCL-228 melanoma humano cólon humano cólon humano cólon humano

Melanoma maligno Adenocarcinoma do cólon Adenocarcinoma do cólon Adenocarcinoma do cólon (MDR) cólon humano DU-145 HTB-81 próstata humana

LNCaP CRL-1740 próstata humana SK-BR-3 HTB-30 mama humana

Adenocarcinoma do cólon (metástase do nódulo linfático) Carcinoma prostático, sem receptores de androgénio Carcinoma prostático, com receptores de androgénio Adenocarcinoma mamário, Her2/neu (efusão pleural) ΡΕ1414828 41 MCF-7 HTB-22 mama humana MDA-MB-231 HTB-26 mama humana IGROV-1 ovário humano

IGROV-ET ovário humano SK-OV-3 HTB-77 ovário humano OVCAR-3

HeLa

HeLa-APL HTB-161 ovário humano CCL-2 colo do útero humano CCL-3 colo do útero humano

Adenocarcinoma mamário, (efusão pleural) Adenocarcinoma mamário, Her2/neu+, (efusão pleural) Adenocarcinoma ovárico Adenocarcinoma ovárico, caracterizado por células resistentes a ET-743 Adenocarcinoma ovárico (ascites malignas) Adenocarcinoma ovárico Carcinoma epitelial do colo do útero Carcinoma epitelial do colo do útero, caracterizado por células 42 ΡΕ1414828 resistentes a aplidina A-498 HTB-44 rim humano Carcinoma renal PANC-1 CRL-1469 pâncreas humano Carcinoma epitelial pancreático HMEC1 endotélio humano

Inibição do crescimento celular por ensaio colorimétrico

Um tipo colorimétrico de ensaio, utilizando a reacção de sulforodamina B (SRB), foi adaptado a uma medição quantitativa do crescimento e viabilidade celular seguindo a técnica descrita por Philip Skehan, et al. (1990), em New colorimetric cytotoxicity assay for anticancer drug screening, J. Natl. Câncer Inst., 82:1107-1112] .

Esta forma do ensaio utiliza microplacas de cultura de 96 poços com 9 mm de diâmetro (Faircloth, 1988; Mosmann, 1983) . A maioria das linhas celulares é obtida junto da American Type Culture Collection (ATCC) e derivada de diferentes tipos de cancro humano.

As células são mantidas em RPMI 1640 com 10% de soro fetal bovino (FBS), suplementado com 0,1 g/L de penicilina e 0,1 g/L de sulfato de estreptomicina e depois incubadas a 37°C, com 5% de C02 e 98% de humidade. Para os 43 ΡΕ1414828 ensaios experimentais, as células foram colhidas de culturas subconfluentes utilizando tripsina e novamente suspensas em meio fresco antes de serem colocadas nas placas.

As células são depositadas em placas "microtiter" de 96 poços, a 5 x 103 células por poço em aliquotas de 195 μί de meio, e aguarda-se que se fixem à superfície da placa crescendo em meio isento de substâncias medicamentosas durante 18 horas. Em seguida, as amostras são adicionadas em aliquotas de 5 μί na ordem dos 10 a 10~8 μg/mL, e dissolvidas em DMSO/EtOH/PBS (0.5:0.5:99). Após uma exposição de 48 horas, os efeitos anti-tumorais são medidos pela metodologia SRB: as células são fixadas adicionando-se 50 μΕ de ácido tricloroacético (TCA) frio a 50% (p/v) e incubando-as durante 60 minutos a 4°C. As placas são lavadas com água desionizada e secas. Adiciona-se 100 μΕ de solução de SRB (0,4% p/v em 1% de ácido acético) a cada poço "microtiter" e procede-se à incubação durante 10 minutos à temperatura ambiente. A SRB não ligada é removida por lavagem com ácido acético a 1%. As placas são secas ao ar e a coloração ligada é solubilizada com tampão Tris. As densidades ópticas são lidas num leitor automático de placas espectrofotométricas num único comprimento de onda de 490 nm.

Foram calculados os valores relativos à média +/-de desvio padrão (SD) dos dados a partir dos poços em triplicado. Podem ser calculados alguns parâmetros de 44 PE1414828 respostas celulares: GI = inibição do crescimento, TGI = inibição de crescimento total (efeito citostático) e LC = morte celular (efeito citotóxico).

Os resultados obtidos podem prever a utilidade de uma determinada substância medicamentosa como um potencial tratamento para o cancro. Para esta técnica, os compostos que apresentam valores GI50 inferiores a 10 pg/mL são seleccionados para continuar com estudos adicionais. Os dados de GI50 permitem determinar não só se uma substância pode ser cistostática, mas também se ela tem potencial em termos de redução do tumor.

Dados de Actividade (Molar).

Composto 1 (Composto de Referência) A549 IC50 1,31E-09 HT29 1,31E-09

Composto 2 Composto 3 Composto 5 Composto 6 Composto 7 GI50 6,30E-10 3,45E-07 1,29E-08 5,13E-09 7,67E-07 A549 TGI 6,30E-09 3,45E-06 1,29E-07 5,13E-08 1,28E-07 LC50 6,30E-05 5,75E-05 1,29E-05 1,28E-05 1,28E-06 GIso 1,26E-09 2,30E-0 7 1,29E-08 5,13E-09 β,39E-08 HT29 TGI 1,26E-09 2,30E-07 1,29E-08 5,13E-09 6,39E-08 lc50 6,30E-05 5,75E-05 5,14E-06 5,13E-06 1,28E-06 45 ΡΕ1414828

Composto 8 Composto 9 Composto 11 Composto 12 Composto 13 GI50 2,52E-09 2 r 52E-0 8 1,89E-08 7,28E-09 6,31E-09 Α549 TGI 1,01E-08 1, 01E-07 5,00E-08 8,35E-08 6,79E-08 LCb0 1,26E-05 8,82E-06 1,29E-05 1,26E-05 1,26E-05 GI50 2,52E-09 3,78E-07 3,09E-08 1,3 7E-08 3,33E-0 7 ΗΤ29 TGI 2,52E-09 3,78E-07 1,29E-07 1,26E-07 1,26E-06 lc50 5,04E-06 1,26E-0 5 1,29E-05 1,26E-05 1,26E-0 5 gIbo H—MEC—1 TGI LCb0

Composto 17 GI50 5,39E-09 A549 TGI 4,41E-08 LCb0 6,6 7E-0 6 ^^50 2,22E-08 HT29 TGI 1,28E-08 LCb0 1,28E-05 GIbo H-MEC-I TGI LCb0 46 ΡΕ1414828

Composto 26 (Composto de Referência) Composto 27 Composto 28 Composto 30 GI50 2,65E-09 2,55E-10 3,48E-09 3,90E-11 Α549 TGI 3,97E-09 8,92E-10 4,65E-08 2,60E-10 lc50 1,32E-08 6,37E-09 3,48E-08 1,04E-09 GI50 3,97E-09 2,55E-10 1,16E-08 1,04E-10 ΗΤ29 TGI 7,95E-09 7,64E-10 6,97E-08 3,90E-10 lc50 1,32E-08 1,15E-09 1,05E-07 1,04E-09 GI50 2,65E-09 2,55E-10 6, 97E-09 2,60E-11 SW-620 TGI 7,95E-09 6,37E-10 2,32E-08 3,90E-10 lc50 7,95E-08 1,15E-09 9,29E-08 1,30E-09 50 2,65E-09 2,55E-10 2,32E-08 2,60E-11 MEL-28 TGI 5,30E-09 6,37E-10 3,48E-08 1,30E-10 lc50 1,06E-08 1,27E-09 3,13E-08 6, 50E-10 GI50 OVCAR TGI lc50 GIso 2,65E-09 2,55E-10 3,48E-09 1,30E-10 A498 TGI 6 f 62E-0 9 5,10E-10 1,16E-08 5,20E-10 LCb0 2r 65E-08 1,27E-09 5,81E-03 2,60E-09 GI50 2,65E-09 2,55E-11 2,32E-09 1,30E-11 DU14 5 TGI 3,97E-09 3,92E-11 3,48E-09 3,90E-11 lc50 1,06E-08 3,82E-09 9,29E-09 1,30E-10 47 ΡΕ1414828 GI50 2,65E-09 2,55E-10 5,81E-09 2,60E-10 MCF TGI 5,30E-09 1,27E-09 2,32E-08 3,90E-10 LCb0 1,19E-08 1,15E-08 1,16E-07 2,60E-09 GI50 2,65E-09 2,55E-10 3,48E-09 2,60E-12 MB231 TGI 5,30E-09 6,37E-09 9,29E-09 1,30E-10 lc50 1,32E-08 1,27E-08 1,16E-07 3,90E-09 GI50 H—MEC—1 TGI lc50 GI50 LNCAP TGI lc50 GI50 SK-0V3 TGI lc50 GI50 IGROV TGI lc50 GI50 IGROV-ET TGI lc50 GI50 SK-BR3 TGI LC50 GI50 K562 TGI lc50 48 ΡΕ1414828 PANC-l GI50 TGI lc50 LOVO GI50 TGI lc50 LOVO-DOX GI50 TGI lc50 HELA GI50 TGI lc50 HELA-APL GI50 TGI LC50

Composto 31 Composto 32 Composto 33 Composto 34 Composto 36 GI50 2,59E-09 3,88E-09 3,82E-10 5,10E-09 2,84E-08 A549 TGI 5,19E-09 2,59E-08 1,27E-09 2,55E-08 5,07E-08 LC50 3,89E-08 9,06E-08 5,10E-09 8,92E-08 9,09E-08 GI50 3,89E-09 7,76E-09 2,55E-10 7,64E-09 6,18E-08 HT29 TGI 7,78E-09 2,59E-08 7,64E-10 2,54E-09 1, 87E-07 lc50 1,30E-08 1,03E-07 1,15E-09 1,15E-08 1,30E-0 5 GI50 2,59E-09 5,17E-09 2,55E-10 1,02E-08 SW-620 TGI 3,89E-09 2,59E-08 1,15E-09 3,82E-08 LC50 1,17E-08 1,29E-07 1,02E-08 1,02E-07 49 ΡΕ1414828 GI50 2,59E-09 2,59E-09 2,55E-10 3,82E-09 2,16E-09 MEL-28 TGI 3,89E-09 1,03E-08 6,3 7E-10 1,27E-08 5,23E-09 LCb0 1,04E-08 2,59E-08 1,15E-09 6,37E-08 1,26E-08 GI50 OVCAR TGI lc50 GI50 2,59E-09 2,59E-09 2,55E-10 3,82E-09 A498 TGI 5,49E-09 9,06E-09 5,10E-10 1,27E-08 lc50 1,30E-08 5,17E-08 1,27E-09 6,37E-08 GI50 1,30E-09 1,29E-09 3,82E-10 2,55E-09 5,41E-09 DU145 TGI 3,89E-09 2,59E-09 8,92E-10 3,82E-09 9,39E-09 lc50 9,08E-09 3,88E-09 3,82E-09 1,02E-08 1,30E-05 GI50 2,59E-09 9,06E-09 MCF TGI 5,19E-09 2,59E-08 lc50 1,17E-08 1,29E-07 GI50 1,30E-09 2,59E-10 2,55E-10 3,82E-09 MB231 TGI 5,19E-09 9,06E-09 1,27E-09 1,02E-08 lc50 1,30E-08 9,06E-08 1,27E-08 1,27E-07 GI50 8,43E-08 H—MEC—1 TGI 7,83E-07 lc50 1,30E-05 GI50 6,14E-09 LNCAP TGI 9,48E-09 LC50 2,51E-08 GI50 5, 07E-08 SK-0V3 TGI 2,05E-07 lc50 1,30E-05 50 ΡΕ1414828 IGROV GI50 3,72E-09 7,21E-09 2,71E-08 TGI lc50 IGROV-ET GI50 5,03E-08 1, 03E-07 1,30E-07 TGI lc50 SK-BR3 GI50 1,18E-08 3,20E-08 8, 64E-08 TGI lc50 K562 GI50 6,15E-09 9,92E-09 1, 09E-07 TGI lc50 PANC-1 GI50 4,21E-08 1,04E-07 1,30E-05 TGI LC50 LOVO GI50 2,73E-08 5,46E-08 1,09E-07 TGI lc50 LOVO—DOX GI50 7,04E-08 9,77E-07 1,30E-05 TGI LCb0 HELA GI50 TGI lc50 HELA-APL GI50 TGI lc50 51 ΡΕ1414828

Composto 37 Composto 38 Composto 42 50 4,23E-09 2,38E-09 1,20E-08 Α549 TGI 2,17E-08 5,24E-09 4,09E-08 lc50 1,38E-07 1,15E-08 7,59E-08 GI50 3,71E-09 4,20E-09 3,41E-08 ΗΤ29 TGI 1,40E-08 1,69E-08 1,42E-07 lc50 1,27E-05 1,27E-05 1,27E-05 ^^50 SW-620 TGI LCb0 GI50 2,40E-09 2,73E-09 4,04E-10 MEL-28 TGI 6,82E-09 5,33E-09 9,77E-10 lc50 3,35E-08 1,04E-08 6,19E-09 ^^50 OVCAR TGI lc50 GI5o A498 TGI lc50 50 4,60E-09 2,04E-09 3,51E-09 DU145 TGI 1,06E-08 5,80E-09 7,97E-09 lc50 1,27E-05 1,27E-05 1,27E-08 GI50 MCF TGI LC50 52 ΡΕ1414828 GI50 ΜΒ231 TGI LCb0 GI50 2,22E-09 3,06E-09 4,04E-08 H—MEC—1 TGI 3,58E-08 8,93E-09 2,47E-07 lc50 1,27E-05 1,27E-05 1,2 7E-03 GI50 2,60E-10 2,00E-10 3,74E-09 LNCAP TGI 8,56E-10 7,21E-10 6,61E-09 lc50 4,75E-09 3,07E-09 1,17E-08 GI50 3,57E-09 2,55E-09 7,37E-09 SK-0V3 TGI 1,07E-08 7,13E-09 7,92E-07 lc50 1,27E-05 1,27E-05 1,27E-05 GI50 2,82E-09 7,57E-10 2,44E-09 IGROV TGI 7,06E-09 2,89E-09 5,12E-09 lc50 6,13E-07 8,40E-09 1,07E-08 GI50 3,76E-08 1,57E-08 4,32E-08 IGROV-ET TGI 1,19E-07 6,59E-08 9,42E-08 lc50 1,27E-05 6,51E-06 1,27E-05 GI50 2,96E-09 1,07E-09 6,63E-09 SK-BR3 TGI 6,80E-09 3,38E-09 2,44E-08 lc50 1,41E-07 9,54E-09 8,73E-08 GI50 4,92E-10 4,22E-10 4,77E-09 K562 TGI 1,36E-09 8,18E-10 9,15E-09 LC50 1,27E-08 3,15E-09 2,81E-06 GI50 3,12E-09 3,22E-09 1,69E-08 PANC-1 TGI 1,18E-08 8,37E-09 8,25E-08 lc50 3,02E-06 4,28E-07 1,2 7E-0 7 53 ΡΕ1414828

HELA-APL GI50

TGI lc5o CI50 2,92E-09 3,55E-09 1,35E-08 LOVO TGI 8,97E-09 1,03E-08 4,37E-08 LC50 1,27E-05 1,27E-05 1,27E-07 Gl™ 6,17E-08 5,53E-08 4,59E-08 LOVO-DOX TGI 4,10E-07 8,42E-07 2,05E-07 lc50 1,27E-05 1,27E-05 1,27E-05 GI50 HELA TGI lc50

DADOS DE TOXICIDADE A toxicidade foi avaliada pelos métodos descritos em Toxicology in Vitro, 15 (2001) 571-577, j. Luber Narod et al.:"Evaluation of the use of in vitro methodologies as tools for screening new compounds for potential in vivo toxicity". Métodos

De modo a avaliar a citotoxicidade dos medicamentos para as células normais, foram utilizadas placas de 96 poços com culturas a uma densidade de 5000 células por poço (à excepção da linha FDC-P1 que foi colocada em cultura a 54 PE1414828 12.000 células por poço) com linhas celulares normais (ATCC, Tabela 1) mantidas em conformidade com as instruções da ATCC: AML-12, células hepáticas de murganho normais; NRK-52E, células renais de rato normais; L8, células do músculo esquelético de rato normais; FDC-P1, células estaminais de medula de murganho normais; e H9c2 (2-1), células do músculo cardiaco de rato normais. As células em cada placa foram deixadas a assentar de um dia para o outro antes de se proceder à adição da substância de teste. Além disso, as culturas neuronais primárias foram preparadas a partir de massa encefálica inteira (prosencéfalo e tronco cerebral) embriónica (dia e-17) e espinal medula, utilizando os métodos estabelecidos (Federoff e Richardson, 1997). A cada poço (ΙΟΟμύ de meio) adicionou-se 10pL de medicamento em várias concentrações (1x10-10-0,Olmg/mL de concentração final) que foi depois incubado de um dia para o outro a 37°C com 5% de C02. Após decorridas 24h, realizaram-se os seguintes ensaios. Todos os ensaios experimentais foram repetidos pelo menos 3 vezes e testados em duplicado. O ensaio l.MTS (CellTiter 96 aquoso) foi levado a cabo de acordo com as instruções do fabricante (Promega) (para todos os tipos de células). A viabilidade celular (actividade mitocondrial) é determinada através da conversão enzimática do substrato de formazano. 55 PE1414828

Composto n° Fígado Coração Medula Esqueleto Rim 26 1,06E-06 6,43E-07 1,03E-07 3,71E-08 4,50E-08 27 1,48E-08 9,93E-08 1,75E-08 1,54E-08 1,01E-08 28 1,42E-07 1,84E-07 2,00E-07 1,45E-07 8,37E-08 30 2,72E-07 5,06E-07 7,58E-09 2,51E-08 4,19E-09 31 1,89E-08 6,65E-08 3,18E-08 1,35E-08 4,27E-08 32 6,00E-07 2,42E-07 5,25E-07 1,51E-08 1,45E-07 33 1,05E-08 1,27E-06 1,92E-08 1,41E-08 7,78E-09 34 2,55E-06 4,96E-07 1,15E-05 1,48E-08 2,74E-07 36 3,19E-07 8,86E-07 2,05E-07 2,71E-08 3,56E-07 37 5,46E-09 1,74E-08 4,59E-09 2,22E-08 2,92E-08 38 1,39E-10 2,96E-09 9,66E-11 1,29E-08 9,85E-08 42 1,86E-07 1,42E-07 6,41E-08 3,37E-08 1,12E-09 * - composto de referência

Avaliação in vitro dos compostos quanto ao perfil ADME-TOX

Coeficiente de Partição ("log" D) 0 coeficiente de partição de um composto químico proporciona uma medida termodinâmica do seu equilíbrio de hidrofilicidade-lipofilicidade. A lipofilicidade é um factor estrutural importante que influencia o comportamento farmacocinético e farmacodinâmico dos compostos. 0 coeficiente de partição entre a água ou o tampão e 1-octanol é a medida mais amplamente utilizada no que respeita à lipofilicidade de um composto químico. 56 ΡΕ1414828 A medição do coeficiente de partição foi avaliada com base num procedimento com um frasco de agitação miniaturizado. Utilizou-se tampão (soro fisiológico tamponado com fosfato de Dulbecco (PBS), pH 7,40) na fase aquosa. O composto testado foi dissolvido em DMSO, a uma concentração de 100 μΜ. A concentração final de DMSO (1%.) durante a divisão octanol-tampão é muito baixa para evitar influenciar a divisão. A quantidade de composto na fase de tampão foi determinada por HPLC com detecção por rede de fotodiodos após uma fase de equilibração de 60 min. A quantidade de composto na fase de octanol foi calculada subtraindo-se a quantidade de composto em tampão à quantidade total de composto, a qual é determinada a partir de uma amostra de calibração. O "log" D é calculado como o Logio da quantidade de composto na fase de octanol dividida pela quantidade de composto na fase de tampão. A gama efectiva do micro-ensaio do "log" D é de aproximadamente -0,5 a +4,5.

Ensaios de Absorção Intestinal In Vitro A impermeabilidade do epitélio intestinal é uma característica muito importante que determina a velocidade e a extensão da absorção humana e, em última análise, a biodisponibilidade de um potencial medicamento. O ensaio de permeabilidade das células Caco-2 permite uma rápida avaliação da permeabilidade membranária e ajuda, assim, a classificar/ordenar os compostos em termos do seu potencial 57 ΡΕ1414828 de absorção. A linha celular Caco-2 é uma linha de células do adenocarcinoma do cólon humano que se diferencia quando em cultura e se assemelha ao revestimento epitelial do intestino delgado humano. Foi largamente utilizada como um modelo epitelial intestinal in vitro relativamente ao transporte da substância medicamentosa e à análise da permeabilidade nos compostos da invenção. 0 coeficiente de permeabilidade aparente (Papp) foi determinado no sentido apical-para-basolateral (A-para-B) nas monocamadas celulares (sub-clone TC-7 da Caco-2) em cultura em filtros de membranas de policarbonato. Os compostos foram testados a 50 μΜ com uma concentração final de DMSO de 1%. As amostras foram analisadas por HPLC-MS ou HPLC-MS/MS. O composto de teste foi adicionado ao lado apical e o Papp foi determinado com base na taxa de aparecimento do composto de teste no lado basolateral após uma incubação de 2h. Os compostos de referência, propranolol (altamente permeável) e ranitidina (ligeiramente permeável), são testados em cada ensaio como amostras de controlo. Os resultados deste ensaio podem ser utilizados para classificar/ordenar os compostos em termos do seu potencial de absorção. Os compostos com um Papp igual ou superior a 20 x 10-6 cm/s podem ser considerados altamente permeáveis e serão provavelmente "não limitados em permeabilidade". Os 58 ΡΕ1414828 compostos com um Papp inferior a 5 x 10-6 cm/s são considerados pouco permeáveis e serão provavelmente "limitados em permeabilidade". Os compostos com um Papp superior a 5 x 10-6 mas inferior a 20 x 10-6 cm/s são considerados com tendo uma permeabilidade média.

Metabolismo O metabolismo hepático é um elemento primordial na determinação do comportamento farmacocinético e o metabolismo de primeira passagem rápido é a principal causa da fraca biodisponibilidade. Os microssomas hepáticos combinados e o citocromo recombinante P450 são utilizados para a avaliação metabólica de experiências bem sucedidas, avanços, e novos compostos farmacêuticos. Os resultados dos estudos de análise metabólica são úteis para: • Determinar a velocidade inicial a que os compostos são metabolizados • Investigar as principais vias do metabolismo do medicamento • Prever o comportamento farmacocinético in vivo • Investigar o potencial de interacções medicamentosas A estabilidade metabólica foi determinada utilizando homogenato S9 hepático humano e incluia ambas as actividades enzimáticas microssómica e citosólica. O composto de teste foi diluido em metanol (0,625%) e acetonitrilo (0,625%) a uma concentração de 1 μΜ e incubada na combinação de células hepáticas humanas (proteína = 59 ΡΕ1414828 lmg/mL) durante 60 min a 37°C. As áreas de pico correspondentes a todos os analitos (produtos metabólicos) foram determinadas por HPLC-MS/MS. As áreas foram registadas e determinaram-se as proporções entre as áreas de pico dos analitos e aquelas do padrão interno para cada analito. O rácio entre o composto precursor remanescente após 60 minutos e a quantidade existente no momento zero, expresso em percentagem, é registado como estabilidade metabólica. Valores mais elevados significam que estamos perante uma maior estabilidade metabólica.

Inibição dos citocromos P450 (CYP450)

Os citocromos P450 são um grupo de enzimas relacionadas e essencialmente localizadas no fígado, que são responsáveis pelo metabolismo dos medicamentos. A inibição destes CYP pelos medicamentos está relacionada com as interacções medicamentosas e com os níveis de toxicidade. A CYP3A4 é a forma mais comum das enzimas CYP3A encontradas em adultos e é também a forma que está implicada na maior parte das interacções medicamentosas. A CYP2D6 metaboliza mais de 25% das medicações que são clinicamente úteis.

Para o ensaio de inibição da CYP2D6, os compostos são testados a 10 μΜ em duplicado com uma concentração final de 0,25%, quer de metanol quer de acetonitrilo, na 60 ΡΕ1414828 presença do substrato fluorescente AMMC (3-[-[2-N, N-dietil-N-metilamónio)etil]-7-metoxi-4-metilcumarina) a uma concentração de 1,5 μΜ). A conversão de AMMC para AHMC (3-[2-N,N-dietil-N-metilamónio)etil]-7-hidroxi-4-metilcumarina) é determinada por espectrofluorimetria após incubação com a enzima durante 450 min a 37°C.

Para o ensaio de inibição da CYP3A4, os compostos foram testados a 10 μΜ em duplicado com uma concentração final de 0,25%, quer de metanol quer de acetonitrilo, na presença do substrato fluorescente BFC (50 μΜ). A conversão da BFC (7-benziloxi-4-trifluorometilcumarina) em HFC (7-hidroxi-4-trifluorometilcumarina) foi determinada por espectrofluorimetria após incubação com a enzima durante 30 min a 37°C.

Em ambos os ensaios, a intensidade fluorescente medida no t = 0 é subtraída à que é medida após o tempo de incubação apropriado. A relação sinal/ruído é calculada através da comparação da fluorescência em incubações contendo o composto de teste e em amostras de controlo contendo o mesmo veículo solvente. A percentagem de actividade de controlo é calculada e descrita como inibição percentual.

Avaliação da Segurança In vitro. Viabilidade Celular O potencial tóxico dos compostos foi estudado in vitro utilizando hepatócitos humanos primários (HEPG2). Os 61 ΡΕ1414828 compostos foram testados a 30 μΜ em duplicado com uma concentração final de DMSO de 1%. Após a incubação durante 24 h a 37°C, a viabilidade celular foi determinada pela conversão de "alarmarBlue" oxidado (resazurina) em "alarmarBlue" reduzido (resorufina). A clorpromazina foi utilizada como composto de referência. Os resultados são indicados como uma percentagem de inibição dos valores de controlo.

Resultados dos estudos de ADME-TOX

Área de Pico Relativa Solubilidade "Log" D Permeabilidade Composto do Pico Principal (Pureza Cromatográfica) PBS Dulbecco pH 7.4 n-Octanol-PBS Dulbecco pH 7.4 A para B Células TC 7 (%) (μΜ) Papp (10 6 cm/s) 31 97, 4 18, 28 3,61 <0,32 Composto de Referência 26 (ET-736) 62,9 < 1 est >5,0 PD 27 84, 9 2,99 >5,0 >1,18 34 98,6 17, 65 >5,0 5,00 33 82, 6 68, 94 3,50 7, 77 28 88,8 < 1 est >4,6 ND 30 100,0 2,24 >4,9 ND 62 ΡΕ1414828 32 92, 8 14, 28 >4, 3 PD 36 98, 4 26, 03 >4, 4 PD 42 96, 8 10, 37 >4, 8 PD Fígado Humano S9 63 ΡΕ1414828

Estabilidade Viabilidade Composto Metabólica CYP2D6 CYP3A4 Celular (% remanescente) (% inibição) (% inibição) (% inibição) 31 17 84 22 Composto de Referência 26 (ET-736) 3 12 45 27 7 13 63 _ 34 24 28 80 45 33 10 28 84 32 28 33 34 79 17 30 6 25 32 9 12 83 39 36 2 15 78 33 42 5 19 78 67

Lisboa, 14 de Dezembro de 2007

Claims

ΡΕ1414828 1 REIVINDICAÇÕES 1. Composto de fórmula:

Composto 2:

Composto 3

Composto 5: ΡΕ1414828 2

Composto 6:

Composto 7:

ÓSto

Composto 9

Composto 11 ΡΕ1414828 3

ΡΕ1414828 4

Composto 27

Composto 28

Composto 30

Composto 31 ΡΕ1414828 5 Qfês *<*^l,s AíΛ X ^ Μι Composto 32 i«s <0- ... U /··.. 0¾¾ WAso\ S LJ , 1(1 ) ^Sp sr + MO Cm Composto 33

Composto 34 4 Α^'Χ /-< I } 3½ * ís *çt l ΎΎwOSL***· Composto 36 ΡΕ1414828 6
2. Composto de acordo com a reivindicação 1, de fórmula (27): ΡΕ1414828 7 M®Q fórmula
3. Composto de acordo com a reivindicação 1, de (30) : m fórmula
4. Composto de acordo com a reivindicação 1, de (31) : HO

31 ΡΕ1414828 fórmula
5. Composto de acordo com a reivindicação í, de (33) : HO
6. Composto de acordo com a reivindicação 1, de fórmula:
7. Composto de acordo com a reivindicação 1, de fórmula (2): 9 ΡΕ1414828

fórmula
8. Composto de acordo com a reivindicação 1, de 5) :

fórmula
9. Composto de acordo com a reivindicação 1, de 6) : m
10. Composto de acordo com a reivindicação 1, de fórmula (8): 10 ΡΕ1414828
11. Composição farmacêutica que contém um composto de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores em conjunto com um diluente farmaceuticamente aceitável.
12. Utilização de um composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10 na preparação de um medicamento para o tratamento do cancro. Lisboa, 14 de Dezembro de 2007 1 ΡΕ1414828 REFERÊNCIAS CITADAS NA DESCRIÇÃO Esta lista de referências citadas pelo requerente é apenas para conveniência do leitor. A mesma não faz parte do documento da patente Europeia. Ainda que tenha sido tomado o devido cuidado ao compilar as referências, podem não estar excluídos erros ou omissões e o IEP declina quaisquer responsabilidades a esse respeito. Documentos de patentes citadas na Descrição US 5258883 A US 585S273 A US 514SBS4 A US 5478932 A IJS 5854426 A US 5721382 A US 612:4292 A 0177115 Ã WQ 01S7884 A. WD 0187895 A W0006S8S2A WOS2SSS07Â Literatura que não é de patentes citada na Descrição 2 PE1414828 * CQREY, EJ. J. Am. CAm. Soe.. ISSS «sf. 118. §202-9283 * RtMEHART etai. BaaítiveCairspo^síromAgLíai® srsá Terresitisl Sowees. ytoaaMoftistereiPrBáasts, ISSO, voi. SS, 775-792 * RIMEHART eíai. Bsiagjcasy aiâa^sa&BraisraíSysts. Pms «m 1m CAem., mo, «81. 52, 1277-1280 * RIHEHART et aí. E.eSsinaspidsvs 729, 743, 74S: 7584, 7593,. and770: $»oteniAn!ittamií Açeats Som frs CarfSfeesn Tumente EstehescKSa íamirsaSs. J. Ors. C1tem, ISSO, .··;; 55, 4512-4S15 * WRtGHT et af, Aniiiuniflur Tetrehydrcisw^sroiirse AÈkaísitfe íecifrs the Cdionsat ssciáian Esteiessckisa tiíffciítaís. J. Oks. Chsiv. 1990, vff. 55, 4588-4512 * SÂKAJ et ai, Aedifierea) «itooi estekiasíisBns irem a Caribbean fonícate: Cíyaiai efcusture» aíte siiivises ;n viva. Pm Meti. A,imã St,i. 1992, voí. 89,. 71455-11460 * Ctí«55scaS FraspeatotSi Sceu? the Seas te PsosníàRg Dreís . S«fe?scs, 1994, voí. 255, 1324 * KQEMSG, K.E, MyiWTffitfs Syaíhesis. Atastemis Press, hw, 1985, vcl. 5,71 * BARTGfS et si. syntfces® and Prapertte aí s Sertos sf SterieaSi' Hiftáasd Suar1»» bases. J Cisem Soe. PeMi 75JJKS.. 1982, voí, 1, 2285 * FU KUYAMA et ai. Stsfsocoíflfoíaá Tetel Synthssis oí P j-SaSasríyiin 8. 4. Am. CAem. Soe, 1982, vsl. 194,, 4957 . FUKUYAMA et st. Total SyBthewa ofH - Sefrara?-cetA. ii. Am. Citem. Sos, 1990, vei, 112,3712 * SA170 et at. SvbíHssís a? Safrsniy-EÍr®. Pseparatísn ef« Key tricvslic Lsciam fntefrasiia® » Safi-amyjsn A.Jt Of$. CAem, 165-6, voi. 54, 5391 STSLL et ai. Saç-id Chraraat^rapfiiç Teehaiqae fcr Eepaíattens wSí? fóoderate Resol-uiion. J Õiy, Cisem, 1978, voi. 43. 2923 * iKQFiRQH, W.G.; BACLAWSKi, LAS, </. CS®. Otm, 1978, vai. 41,1579 * GUAfí et ai. J. Bmtetee. Strae. 8 Dyiw-m. , 1993, vai . 70„ 793-817 » 8HAMSSA etA Cmtsm· tS msfi £i!%Assignimnie efAm&m ansASate/rfs, 1675.2DS LOWM m eL SSfCÍWflsSfty, 168.2, vai.. 21, 419428 » ZMMEMfSKf et aí. Ctiem. Sioi. OWwartfcfl», 1985, voi. 52, 361-375 * ITO, CMC Crit fiev. Ansl Otem, 1886. vsJ. 17, 85-143 * RtNEHART et ai. Tcpies fe Phaimeceutiseí Scáencee 1989. AmsSsnter- itítedissl Pie», 18^, 813-826 « RIMEHART et ai. SÉiagicai Mass 3ρεΛ<»ΐ(1%'. 51-sevier, ISSO, 2:35-258 « GU Atl et aL Jtw. Skmctec. Stosí. i: Dynsm.. 19¾ voí. 10, 793-817 * 8AKAGAWA et at, J. Átm. Ctmi Soe., 1989, vol. 1 n, 2721-2722 * LíCHTEiR ei ai. Food and Qrug» th»« the Se® Pro-ceeoSnp. Ms TeetmSosy Sos&ty, 1972.. 117-127 * SAXAI et ei. j. Amer. dum Soe., 1SSS, wi. 118, 9017 - GARC1A4ROCHA et af. Sítí, J. Csncer, 1998, vol. 73. 87S-583 - POhSMiER ei aí,. Btoctemiatty, 199S, voi. 35, 13303-13306 * MAMZAHARES el aí. 3yT:thesis ot Ecteffsssckiifi E7-743«i>d P-ithslasddfn Pt-SSOfrars Cysncsafraí-m S, Or§. Le«, 2980. vsl . 2 (185,2545-2548 * Pm,MLAs&LSa: USA,vol. 96,3495-3521 < SAXAIetei. Aec6ien^ai^mwe^MRssddâ»S»et a Caribbeaíi iunicaie: Crysíei sUíuíí-uí es srd saiv $ee in vivo. Ptoc. N»ff. Aeast. Sc>. USA, 5982, vos. 33, 11458-11460 * i, LLÍ9ER NARO0 eí aí. Eval«atie;i sf lhe im cf kl vitre iiiettsDítslQgíes as íscís for &etee«ing tate ccm-sounds $x poteftM ifi vivs foxioiiy. Tostejfcgy bt \%-#39.2031. voi. 15, S71-577 1 PHILIP SKEHAN; et aS. New saionmetósi eytetec-city ssssy ter asticanse-r SRig s&eenircg. J. ftiaíí. Câncer &kL19S8,voI.S2J 187-1152