NO336802B1

NO336802B1 - Humane anti-IFN-gamma nøytraliserende antistoffer samt fremstilling derav, isolert polynukleotid, vektor, vertcelle og farmasøytisk sammensetning

Info

Publication number: NO336802B1
Application number: NO20051345A
Authority: NO
Inventors: Andrew A Welcher; Haichun Huang; Hilary T Chute; Yue Li
Original assignee: Amgen Inc; Squibb & Sons Llc
Priority date: 2002-10-16
Filing date: 2005-03-15
Publication date: 2015-11-02
Also published as: SG155054A1; EP2298811B8; AU2003285874A8; CN1820026A; US8906371B2; ZA200503821B; EG26731A; KR20050059213A; WO2004034988A2; CY1111812T1; HK1084689A1; KR100816124B1; ATE520416T1; US8529893B2; ES2370473T3; EP2298811A2; WO2004035747A2; US7335743B2; EP1578936B1; JP2009082133A

Abstract

Sammendrag Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer antistoffer som interagerer med eller binder til humant interferon-gamma (IFN-?) og fremgangsmåter for behandling av IFN-? medierte sykdommer ved administrering av en farmasøytisk effektiv mengde av antistoffer til IFN-?. Fremgangsmåter for å detektere mengden av IFN-? i en prøve ved anvendelse av antistoffer til IFN-? er også fremskaffet.

Description

OPPFINNELSENS OMRÅDE

Oppfinnelsen angår humane anti-IFN^ nøytraliserende antistoffer samt fremstilling derav, isolert polynukleotid, vektor, vertcelle og farmasøytisk sammensetning. De humane monoklonale antistoffene binder interferon gamma (IFN^).

BAKGRUNN

Interferoner (IFN'er) ble opprinnelig navngitt for deres evne til å interferere med viral infeksjon av vertsceller (Isaacs og Lindenman, 1957, Proe. R. Soc. 147:28-267). Etter oppdagelsen av dem er flere medlemmer av interferonfamilien identifisert med ulike biologiske roller i tillegg til antiviralt forsvar, omfattende cellevekst og celleimmunitet. Interferontypene IFN-a, IFN-p, IFN-a> og IFN-t er type l-interferoner og binder type I IFN-reseptoren, mens IFN^y er et type II-interferon og binder type II IFN-reseptoren (Pfeffer et al., 1998, Cancer Res. 58:2489-2499).

IFN^y signalering avhenger av minst fem forskjellige proteiner: IFNGR1 og IFNGR2 (subenheter av IFN^ reseptoren), Jak1, Jak2 og transkripsjonsfaktoren STAT1 (Schindler og Darnell, 1995, Annu. Rev. Biochem. 64:621-651; Bach et al., 1997, Annu. Rev. Immunol. 15:563-591). IFN^y reseptorer er funnet på de fleste celletyper, unntatt modne erytrocytter (Farrar og Schreiber, 1993, Annu. Rev. Immunol. 11:571-611). Jak1-, Jak2-og STAT1-proteiner medierer IFN^y signalering.

IFN^y regulerer mange biologiske funksjoner, så som antivirale responser, cellevekst, immunrespons og tumorsuppresjon, og IFN^y kan mediere en rekke sykdommer hos menneske. Det er derfor et behov på området for midler som kan modulere den biologiske aktiviteten til IFN^.

OPPSUMMERING AV OPPFINNELSEN

Oppfinnelsen tilveiebringer monoklonale antistoffer som binder til interferon^y (IFN-y) og polynukleotider som koder for dem. Antistoffene kan hemme eller modulere minst én av de biologiske aktivitetene til IFN^y og kan være anvendelige for å bedre effektene av IFN^ medierte sykdommer. Hybridomceller som produserer kan utskille de monoklonale antistoffene ifølge foreliggende oppfinnelse i celledyrkningsmedier. Antistoffene ifølge foreliggende oppfinnelse kan være anvendelige for behandling av sykdommer mediert av IFN^y.

I visse aspekter tilveiebringes antistoffer, eventuelt monoklonale antistoffer og/eller humane antistoffer, som kan omfatte en tung kjede og en lett kjede, der den tunge kjeden omfatter en aminosyresekvens som angitt i SEKV ID NR:2 eller et antigenbindende eller et immunologisk funksjonelt immunglobulinfragment derav.

I visse aspekter tilveiebringer oppfinnelsen antistoffer, eventuelt monoklonale antistoffer, som kan være humane antistoffer, omfattende en tung kjede og en lett kjede, der den tunge kjeden omfatter en lgG1, lgG2 eller en lgG4 tung kjede konstant region. I noen utførelsesformer omfatter et antistoff ifølge foreliggende oppfinnelse en aminosyresekvens for lgG1 tung kjede konstant region som angitt i SEKV ID NR:2 eller et antigenbindende eller et immunologisk funksjonelt immunglobulinfragment derav.

I visse aspekter omfatter antistoffer ifølge foreliggende oppfinnelse en tung kjede og en lett kjede, der den variable regionen av den tunge kjeden omfatter en aminosyresekvens som angitt i hvilken som helst av SEKV ID NR:6, SEKV ID NR:10, SEKV ID NR:14 eller SEKV ID NR:30 eller et antigenbindende eller et immunologisk funksjonelt immunglobulinfragment derav. I andre aspekter omfatter variabel region av lett kjede en aminosyresekvens som angitt i hvilken som helst av SEKV ID NR:8, SEKV ID NR:12, SEKV ID NR:16 eller SEKV ID NR:31 eller et antigenbindende eller et immunologisk funksjonelt immunglobulinfragment derav. I ytterligere aspekter omfatter tung kjede en aminosyresekvens som angitt i hvilken som helst av SEKV ID NR:17, SEKV ID NR:19, SEKV ID NR:21 eller SEKV ID NR:32 eller et antigenbindende eller et immunologisk funksjonelt immunglobulinfragment derav. I fortsatt videre aspekter omfatter lett kjede en aminosyresekvens som angitt i hvilken som helst av SEKV ID NR: 18, SEKV ID NR:20, SEKV ID NR:22 eller SEKV ID NR:33 eller et antigenbindende eller et immunologisk funksjonelt immunglobulinfragment derav.

Oppfinnelsen tilveiebringer også antistoffer som binder spesifikt til IFN-y, der den tunge kjeden omfatter en tung kjede variabel region omfattende en aminosyresekvens som angitt i SEKV ID NR:6 eller et antigenbindende eller et immunologisk funksjonelt immunglobulinfragment derav, og den lette kjeden omfatter en lett kjede variabel region omfattende en aminosyresekvens som angitt i SEKV ID NR:8 eller et antigenbindende eller et immunologisk funksjonelt immunglobulinfragment derav.

I visse aspekter tilveiebringer oppfinnelsen også antistoffer og immunologisk funksjonelle immunglobulinfragmenter derav som kan binde spesifikt til og/eller hemme eller modulere den biologiske aktiviteten til IFN-y, omfattende en tung kjede og en lett kjede, der den tunge kjeden omfatter en tung kjede variabel region, og der den variable regionen av tung kjede omfatter en sekvens som har minst 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% eller ca. 99% identitet med aminosyresekvensen som angitt i SEKV ID NR:6, og der den lette kjeden omfatter en lett kjede variabel region, der den variable regionen av lett kjede omfatter en sekvens som har minst 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% eller ca. 99% identitet med aminosyresekvensen som angitt i SEKV ID NR:8, der antistoffet interagerer med IFN-y.

Oppfinnelsen tilveiebringer videre antistoffer som kan hemme eller modulere den biologiske aktiviteten til og/eller binde spesifikt til IFN-y, der den tunge kjeden omfatter en tung kjede variabel region omfattende en aminosyresekvens som angitt i SEKV ID NR: 10 eller et antigenbindende eller et immunologisk funksjonelt immunglobulinfragment derav, og den lette kjeden omfatter en lett kjede variabel region omfattende en aminosyresekvens som angitt i SEKV ID NR: 12 eller et antigenbindende eller et immunologisk funksjonelt immunglobulinfragment derav.

I visse aspekter tilveiebringer oppfinnelsen antistoffer, som kan hemme eller modulere den biologiske aktiviteten til og/eller binde spesifikt til IFN-y, omfattende en tung kjede og en lett kjede, der den tunge kjeden omfatter en tung kjede variabel region, og der den variable regionen av tung kjede omfatter en sekvens som kan ha minst 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% eller ca. 99% identitet med aminosyresekvensen som angitt i SEKV ID NR: 10, og der den lette kjeden omfatter en lett kjede variabel region, der den variable regionen av lett kjede omfatter en sekvens som har minst 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% eller ca. 99% identitet med aminosyresekvensen som angitt i SEKV ID NR: 12, der antistoffet interagerer med IFN-y.

Oppfinnelsen tilveiebringer videre antistoffer som kan hemme eller modulere den biologiske aktiviteten til og/eller binde spesifikt til IFN-y, der den tunge kjeden omfatter en tung kjede variabel region omfattende en aminosyresekvens som angitt i SEKV ID NR:30 eller et antigenbindende eller et immunologisk funksjonelt immunglobulinfragment derav, og den lette kjeden omfatter en lett kjede variabel region omfattende en aminosyresekvens som angitt i SEKV ID NR: 12 eller et antigenbindende eller et immunologisk funksjonelt immunglobulinfragment derav.

I visse aspekter tilveiebringer oppfinnelsen antistoffer, som kan hemme eller modulere den biologiske aktiviteten til og/eller binde spesifikt til IFN-y, omfattende en tung kjede og en lett kjede, der den tunge kjeden omfatter en tung kjede variabel region, og der den variable regionen av tung kjede omfatter en sekvens som kan ha minst 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% eller ca. 99% identitet med aminosyresekvensen som angitt i hvilken som helst av SEKV ID NR:30, og der den lette kjeden omfatter en lett kjede variabel region, der den variable regionen av lett kjede omfatter en sekvens som kan ha minst 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% eller ca. 99% identitet med aminosyresekvensen som angitt i SEKV ID NR: 12, der antistoffet interagerer med IFN-y.

Oppfinnelsen tilveiebringer også antistoffer som kan hemme eller modulere den biologiske aktiviteten til og/eller binde spesifikt til IFN-y, der den tunge kjeden omfatter en tung kjede variabel region omfattende en aminosyresekvens som angitt i SEKV ID NR: 14 eller et antigenbindende eller et immunologisk funksjonelt immunglobulinfragment derav, og den lette kjeden omfatter en lett kjede variabel region omfattende en aminosyresekvens som angitt i SEKV ID NR: 16 eller et antigenbindende eller et immunologisk funksjonelt immunglobulinfragment derav.

I visse aspekter tilveiebringer oppfinnelsen antistoffer, som kan binde spesifikt til og/eller hemme eller modulere den biologiske aktiviteten til IFN-y, omfattende en tung kjede og en lett kjede, der den tunge kjeden omfatter en tung kjede variabel region, og der den variable regionen av tung kjede omfatter en sekvens som kan ha minst 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% eller ca. 99% identitet med aminosyresekvensen som angitt i SEKV ID NR:14, og der den lette kjeden omfatter en lett kjede variabel region, der den variable regionen av lett kjede omfatter en aminosyresekvens som har minst 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% eller ca. 99% identitet med aminosyresekvensen som angitt i SEKV ID NR: 16, der antistoffet interagerer med IFN-y.

Oppfinnelsen tilveiebringer også antistoffer som kan hemme eller modulere den biologiske aktiviteten til og/eller binde spesifikt til IFN-y, der den tunge kjeden omfatter en tung kjede variabel region omfattende en aminosyresekvens som angitt i SEKV ID NR: 14 eller et antigenbindende eller et immunologisk funksjonelt immunglobulinfragment derav, og den lette kjeden omfatter en lett kjede variabel region omfattende en aminosyresekvens som angitt i SEKV ID NR:31 eller et antigenbindende eller et immunologisk funksjonelt immunglobulinfragment derav.

I visse aspekter tilveiebringer oppfinnelsen antistoffer, som kan hemme eller modulere den biologiske aktiviteten til og/eller binde spesifikt til IFN-y, omfattende en tung kjede og en lett kjede, der den tunge kjeden omfatter en tung kjede variabel region, og der den variable regionen av tung kjede omfatter en sekvens som kan ha minst 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% eller ca. 99% identitet med aminosyresekvensen som angitt i SEKV ID NR: 14, og der den lette kjeden omfatter en lett kjede variabel region, der den variable regionen av lett kjede omfatter en aminosyresekvens som har minst 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% eller ca. 99% identitet med aminosyresekvensen som angitt i SEKV ID NR:31, der antistoffet interagerer med IFN-y.

Oppfinnelsen tilveiebringer også antistoffer som kan hemme eller modulere den biologiske aktiviteten til og/eller binde spesifikt til IFN-y, der den tunge kjeden omfatter en aminosyresekvens som angitt i SEKV ID NR: 17 eller et antigenbindende eller et immunologisk funksjonelt immunglobulinfragment derav, og den lette kjeden omfatter en aminosyresekvens som angitt i SEKV ID NR: 18 eller et antigenbindende eller et immunologisk funksjonelt immunglobulinfragment derav.

I visse aspekter tilveiebringer oppfinnelsen antistoffer, som kan hemme eller modulere den biologiske aktiviteten til og/eller binde spesifikt til IFN-y, omfattende en tung kjede og en lett kjede, der den tunge kjeden omfatter en tung kjede variabel region, og der den variable regionen av tung kjede omfatter en sekvens som kan ha minst 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% eller ca. 99% identitet med aminosyresekvensen som angitt i SEKV ID NR: 17, og der den lette kjeden omfatter en lett kjede variabel region, der den variable regionen av lett kjede omfatter en aminosyresekvens som har minst 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% eller ca. 99% identitet med aminosyresekvensen som angitt i SEKV ID NR: 18, der antistoffet interagerer med IFN-y.

Oppfinnelsen tilveiebringer videre antistoffer som kan hemme eller modulere den biologiske aktiviteten til og/eller binde spesifikt til IFN-y, der den tunge kjeden omfatter en aminosyresekvens som angitt i SEKV ID NR: 19 eller et antigenbindende eller et immunologisk funksjonelt immunglobulinfragment derav, og den lette kjeden omfatter en aminosyresekvens som angitt i SEKV ID NR:20 eller et antigenbindende eller et immunologisk funksjonelt immunglobulinfragment derav.

I visse aspekter tilveiebringer oppfinnelsen antistoffer, som kan hemme eller modulere den biologiske aktiviteten til og/eller binde spesifikt til IFN-y, omfattende en tung kjede og en lett kjede, der den tunge kjeden omfatter en tung kjede variabel region, og der den variable regionen av tung kjede omfatter en sekvens som kan ha minst 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% eller ca. 99% identitet med aminosyresekvensen som angitt i hvilken som helst av SEKV ID NR: 19, og der den lette kjeden omfatter en lett kjede variabel region, der den variable regionen av lett kjede omfatter en aminosyresekvens som har minst 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% eller ca. 99% identitet med aminosyresekvensen som angitt i SEKV ID NR:20, der antistoffet interagerer med IFN-y.

Oppfinnelsen tilveiebringer også antistoffer som kan hemme eller modulere den biologiske aktiviteten til og/eller binde spesifikt til IFN-y, der den tunge kjeden omfatter en aminosyresekvens som angitt i SEKV ID NR:21 eller et antigenbindende eller et immunologisk funksjonelt immunglobulinfragment derav, og den lette kjeden omfatter en aminosyresekvens som angitt i SEKV ID NR:22 eller et antigenbindende eller et immunologisk funksjonelt immunglobulinfragment derav.

I visse aspekter tilveiebringer oppfinnelsen antistoffer, som kan hemme eller modulere den biologiske aktiviteten til og/eller binde spesifikt til IFN-y, omfattende en tung kjede og en lett kjede, der den tunge kjeden omfatter en tung kjede variabel region, og der den variable regionen av tung kjede omfatter en sekvens som kan ha minst 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% eller ca. 99% identitet med aminosyresekvensen som angitt i hvilken som helst av SEKV ID NR:21, og der den lette kjeden omfatter en lett kjede variabel region, der den variable regionen av lett kjede omfatter en aminosyresekvens som kan ha minst 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% eller ca. 99% identitet med aminosyresekvensen som angitt i SEKV ID NR:22, der antistoffet interagerer med IFN-y.

Oppfinnelsen tilveiebringer også antistoffer som kan hemme eller modulere den biologiske aktiviteten til og/eller binde spesifikt til IFN-y, der den tunge kjeden omfatter en aminosyresekvens som angitt i SEKV ID NR:32 eller et antigenbindende eller et immunologisk funksjonelt immunglobulinfragment derav, og den lette kjeden omfatter en aminosyresekvens som angitt i SEKV ID NR:20 eller et antigenbindende eller et immunologisk funksjonelt immunglobulinfragment derav.

I visse aspekter tilveiebringer oppfinnelsen antistoffer, som kan hemme eller modulere den biologiske aktiviteten til og/eller binde spesifikt til IFN-y, omfattende en tung kjede og en lett kjede, der den tunge kjeden omfatter en tung kjede variabel region, og der den variable regionen av tung kjede omfatter en sekvens som kan ha minst 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% eller ca. 99% identitet med aminosyresekvensen som angitt i SEKV ID NR:32, og der den lette kjeden omfatter en lett kjede variabel region, der den variable regionen av lett kjede omfatter en aminosyresekvens som har minst 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% eller ca. 99% identitet med aminosyresekvensen som angitt i SEKV ID NR:20, der antistoffet interagerer med IFN-y.

Oppfinnelsen tilveiebringer også antistoffer som kan hemme eller modulere den biologiske aktiviteten til og/eller binde spesifikt til IFN-y, der den tunge kjeden omfatter en aminosyresekvens som angitt i SEKV ID NR:21 eller et antigenbindende eller et immunologisk funksjonelt immunglobulinfragment derav, og den lette kjeden omfatter en aminosyresekvens som angitt i SEKV ID NR:33 eller et antigenbindende eller et immunologisk funksjonelt immunglobulinfragment derav.

I visse aspekter tilveiebringer oppfinnelsen antistoffer, som kan hemme eller modulere den biologiske aktiviteten til og/eller binde spesifikt til IFN-y, omfattende en tung kjede og en lett kjede, der den tunge kjeden omfatter en tung kjede variabel region, og der den variable regionen av tung kjede omfatter en sekvens som kan ha minst 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% eller ca. 99% identitet med aminosyresekvensen som angitt i SEKV ID NR:21, og der den lette kjeden omfatter en lett kjede variabel region, der den variable regionen av lett kjede omfatter en aminosyresekvens som har minst 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% eller ca. 99% identitet med aminosyresekvensen som angitt i SEKV ID NR:33, der antistoffet interagerer med IFN-y.

Oppfinnelsen tilveiebringer også enkeltkjedede antistoffer, enkeltkjedede Fv-antistoffer, F(ab)-antistoffer, F(ab)'-antistoffer og (Fab')2-antistoffer.

I bestemte aspekter tilveiebringer oppfinnelsen en lett kjede omfattende en aminosyresekvens som angitt i hvilken som helst av SEKV ID NR:8, SEKV ID NR:12, SEKV ID NR:16, SEKV ID NR:18, SEKV ID NR:20, SEKV ID NR:22, SEKV ID NR:31 eller SEKV ID NR:33 eller et antigenbindende eller et immunologisk funksjonelt immunglobulinfragment derav.

I tillegg tilveiebringer oppfinnelsen en tung kjede omfattende en aminosyresekvens som angitt i hvilken som helst av SEKV ID NR:6, SEKV ID NR: 10, SEKV ID NR:14, SEKV ID NR:17, SEKV ID NR:19, SEKV ID NR:21, SEKV ID NR:30 eller SEKV ID NR:32 eller et antigenbindende eller et immunologisk funksjonelt immunglobulinfragment derav.

Oppfinnelsen angår også isolerte humane antistoffer som spesifikt binder IFN-y, der antistoffet omfatter: (a) humane tung kjede strukturregioner, en human tung kjede CDR1-region, en human tung kjede CDR2-region og en human tung kjede CDR3-region; og (b) humane lett kjede strukturregioner, en human lett kjede CDR1-region, en human lett kjede CDR2-region og en human lett kjede CDR3-region. I visse aspekter kan den humane tung kjede CDR1-regionen være tung kjede CDR1-regionen til monoklonale antistoffer (mAb'er) 1119, 1118, 1118<*>eller 1121 som vist i Figur 12 og SEKV ID NR:34, og den humane lett kjede CDR1-regionen kan være lett kjede CDR1-regionen til mAb'er 1119, 1118, 1121* eller 1121 som vist i Figur 13 og SEKV ID NR:38, SEKV ID NR:39 eller SEKV ID NR:40. I andre aspekter kan human tung kjede CDR2-regionen være tung kjede CDR2-regionen til mAb'er 1119, 1118, 1118<*>eller 1121 som vist i Figur 12 og SEKV ID NR:35, og human lett kjede CDR2-regionen kan være lett kjede CDR2-regionen til mAb'er 1119, 1118, 1121 * eller 1121 som vist i Figur 13 og SEKV ID NR:41 eller SEKV ID NR:42. I ytterligere andre aspekter er human tung kjede CDR3-regionen tung kjede CDR3-regionen til mAb'er 1119, 1118, 1118<*>eller 1121 som vist i Figur 12 og SEKV ID NR:36 eller SEKV ID NR:37, og human lett kjede CDR3-regionen er lett kjede CDR3-regionen til mAb'er 1119, 1118, 1121<*>eller 1121 som vist i Figur 13 og SEKV ID NR:43 eller SEKV ID NR:44.

Foreliggende oppfinnelse omfatter følgelig isolert fullstendig humant antistoff omfattende en tung kjede CDR1 omfattende aminosyresekvensen i SEQ ID NO:34; en tung kjede CDR2 omfattende aminosyresekvensen i SEQ ID NO:35; en tung kjede CDR3 omfattende aminosyresekvensen i SEQ ID NO:36 eller SEQ ID NO:37; en lett kjede CDR1 omfattende SEQ ID NO:38 eller SEQ ID NO:39;

en lett kjede CDR2 omfattende SEQ ID NO:41; og en lett kjede CDR3 omfattende SEQ ID NO:43, hvor antistoffet bindes spesifikt til human IFN-y.

Foreliggende oppfinnelse omfatter følgelig videre antistoff ifølge krav 1, omfattende en tung kjede variabel region som er minst 90% identisk med SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO:6, og/eller SEQ ID NO: 14 og en lett kjede variabel region som er minst 90% identisk med SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:12 og/eller SEQ ID NO:16.

Foreliggende oppfinnelse omfatter følgelig videre antistoff ifølge krav 2, hvor tung kjede variable region er minst 95% identisk med SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:6 og/eller SEQ ID NO: 14 og lett kjede variabel region er minst 95% identisk med SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:12 og/eller SEQ ID NO:16.

Foreliggende oppfinnelse omfatter følgelig videre isolert polynukleotid kodende for antistoffet ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 16.

Foreliggende oppfinnelse omfatter følgelig videre vektor omfattende et polynukleotide, kodende for antistoffet ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 16.

Foreliggende oppfinnelse omfatter følgelig videre vertcelle inneholdende et polynukleotid kodende for antistoffet ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 16. Foreliggende oppfinnelse omfatter følgelig videre vertcelle ifølge krav 19, hvor vertcellen er en pattedyrcelle.

Foreliggende oppfinnelse omfatter følgelig videre fremgangsmåte for å produsere et antistoff omfattende dyrking av vertcellen ifølge et hvilket som helst av kravene 19 til 21.

Foreliggende oppfinnelse omfatter følgelig videre farmasøytisk sammensetning, omfattende antistoffet ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 16.

Det er mulig å behandle en sykdom assosiert med økt produksjon av eller sensitivitet for IFN-y og/eller en sykdom mediert av IFN-y omfattende trinnet med administrering av en farmasøytisk effektiv mengde av ett eller flere monoklonale antistoffer ifølge foreliggende oppfinnelse eller et antigenbindende eller et immunologisk funksjonelt immunglobulinfragment derav til et individ med behov derav.

Deteksjon av nivået til IFN-y i en biologisk prøve er mulig, omfattende trinnet med å la prøven komme i kontakt med et monoklonalt antistoff ifølge foreliggende oppfinnelse eller antigenbindende fragment derav.

Et isolert antistoff kan binde spesifikt til og/eller hemme eller modulere den biologiske aktiviteten til IFN-y og omfatter en tung kjede CDR3 med en aminosyresekvens som er: (a) en aminosyresekvens bestående av minst 7 av aminosyrene i SEKV ID NR:36 med samme rekkefølge og innbyrdes avstand som de forekommer i SEKV ID NR:36; eller (b) en aminosyresekvens omfattende SEKV ID NR:37. Antistoffet kan videre omfatte en lett kjede CDR3 med en aminosyresekvens som er: (a) en aminosyresekvens bestående av minst 8 av aminosyrene i SEKV ID NR:43 med samme rekkefølge og innbyrdes avstand som de er i SEKV ID NR:43; eller (b) en aminosyresekvens bestående av minst 9 av aminosyrene i SEKV ID NR:44 med samme rekkefølge og innbyrdes avstand som de er i SEKV ID NR:44. Antistoffet kan videre omfatte én eller flere CDR valgt fra gruppen bestående av: SEKV ID NR:34, SEKV ID NR:35, SEKV ID NR:38, SEKV ID NR:39, SEKV ID NR:40, SEKV ID NR:41 og SEKV ID NR:42. Tung kjede CDR3 kan i hvert fall bestå av aminosyrene i SEKV ID NR:36 og lett kjede CDR3 kan i hvert fall bestå av aminosyrene i SEKV ID NR:43.

Isolerte antistoffer kan binde spesifikt til og/eller hemme eller modulere den biologiske aktiviteten til IFN-y omfattende en lett kjede CDR3 med en aminosyresekvens som er: (a) en aminosyresekvens bestående av minst 8 av aminosyrene i SEKV ID NR:43 med samme rekkefølge og innbyrdes avstand som de forekommer i SEKV ID NR:43; eller (b) en aminosyresekvens bestående av minst 9 av aminosyrene i SEKV ID NR:44 med samme rekkefølge og innbyrdes avstand som de forekommer i SEKV ID NR:44. Antistoffet kan videre omfatte en CDR som har aminosyresekvensen til SEKV ID NR:35, SEKV ID NR:38, SEKV ID NR:39, SEKV ID NR:40, SEKV ID NR:41 eller SEKV ID NR:42.

Et isolert antistoff heri kan binde spesifikt til og/eller hemme eller modulere den biologiske aktiviteten til IFN-y, kan omfatte seks CDR'er som i hvert fall har aminosyresekvensene i: (a) SEKV ID NR:34; (b) SEKV ID NR:35; (c) SEKV ID NR:36 eller SEKV ID NR:37; (d) SEKV ID NR:38, SEKV ID NR:39 eller SEKV ID NR:40; (e) SEKV ID NR:41 eller SEKV ID NR:42; og (f) SEKV ID NR:43 eller SEKV ID NR:44.

Isolerte antistoffer heri kan binde spesifikt til og/eller hemme eller modulere den biologiske aktiviteten til IFN-y, kan omfatte en aminosyresekvens minst 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% eller ca. 99% identisk med SEKV ID NR:6, SEKV ID NR:10, SEKV ID NR:14 eller SEKV ID NR:30, der sammenstillingen mellom aminosyresekvensen og SEKV ID NR:6, SEKV ID NR:10, SEKV ID NR:14 eller SEKV ID NR:30 spenner over minst 50 aminosyrer, og/eller en aminosyresekvens minst 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% eller ca. 99% identisk med SEKV ID NR:8, SEKV ID NR:12, SEKV ID NR:16 eller SEKV ID NR:31, der sammenstillingen mellom aminosyresekvensen og SEKV ID NR:8, SEKV ID NR: 12, SEKV ID NR: 16 eller SEKV ID NR:31 spenner over minst 50 aminosyrer.

Antistoffene kan binde spesifikt til og/eller hemme eller modulere den biologiske aktiviteten til IFN-y, omfatte en aminosyresekvens minst 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% eller ca. 99% identisk med SEKV ID NR:17, SEKV ID NR:19, SEKV ID NR:21 eller SEKV ID NR:32, der sammenstillingen mellom aminosyresekvensen og SEKV ID NR: 17, SEKV ID NR: 19, SEKV ID NR:21 eller SEKV ID NR:32 spenner over minst 50 aminosyrer, og/eller en aminosyresekvens minst 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% eller ca. 99% identisk med SEKV ID NR:18, SEKV ID NR:20, SEKV ID NR:22 eller SEKV ID NR:33, der sammenstillingen mellom aminosyresekvensen og SEKV ID NR: 18, SEKV ID NR:20, SEKV ID NR:22 eller SEKV ID NR:33 spenner over minst 50 aminosyrer. Én aminosyresekvens i disse antistoffene kan omfatte minst 5 av aminosyrene i SEKV ID NR:36 eller SEKV ID NR:37, med samme rekkefølge og innbyrdes avstand som de forekommer i SEKV ID NR:36 eller SEKV ID NR:37, og/eller én aminosyresekvens i disse antistoffene kan omfatte minst 6 av aminosyrene i SEKV ID NR:43 eller SEKV ID NR:44 med samme rekkefølge og innbyrdes avstand som de forekommer i SEKV ID NR:43 eller SEKV ID NR:44.

Antistoffet, kan være et isolert fullstendig humant antistoff, der antistoffet kan hemme eller modulere den biologiske aktiviteten til humant IFN-y. I et annet aspekt kan ikke et antistoff, som kan være et isolert fullstendig humant antistoff, hemme eller modulere den biologiske aktiviteten til cynomolgus-ape og murint IFN-y. I enda et annet aspekt kan et fullstendig humant antistoff hemme eller modulere den biologiske aktiviteten til humant og sjimpanse IFN-y, men kan ikke hemme eller modulere den biologiske aktiviteten til cynomolgus-ape og/eller murint IFN-y. I enda et annet aspekt hindrer eller antagoniserer substitusjon av residue 19 i humant IFN-y med asparaginsyre og/eller residue 20 med prolin hemming av den biologiske aktiviteten til humant IFN-y med antistoffet. Videre kan antistoffet hemme den biologiske aktiviteten til en mutert utgave av cynomolgus-ape IFN-y substituert i residuene 19, 20 og 65 med henholdsvis histidin, serin og serin. Isolerte antistoffer kan binde spesifikt til og/eller hemme eller modulere den biologiske aktiviteten til IFN-y, omfatte en aminosyresekvens minst 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% eller ca. 99% identisk med SEKV ID NR:17, SEKV ID NR:19, SEKV ID NR:21 eller SEKV ID NR:32, der sammenstillingen mellom aminosyresekvensen og SEKV ID NR: 17, SEKV ID NR: 19, SEKV ID NR:21 eller SEKV ID NR:32 spenner over minst 50 aminosyrer og/eller kan omfatte en aminosyresekvens minst 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% eller ca. 99% identisk med SEKV ID NR: 18, SEKV ID NR:20, SEKV ID NR:22 eller SEKV ID NR:33, der sammenstillingen mellom aminosyresekvensen og SEKV ID NR: 18, SEKV ID NR:20, SEKV ID NR:22 eller SEKV ID NR:33 spenner over minst 50 aminosyrer.

Det isolerte antistoff kan binde spesifikt til IFN-y omfattende (a) en aminosyresekvens omfattende SEKV ID NR:6, SEKV ID NR: 10, SEKV ID NR: 14 eller SEKV ID NR:30 eller et fragment av én av disse sekvensene og (b) en aminosyresekvens omfattende SEKV ID NR:8, SEKV ID NR:12, SEKV ID NR:16 eller SEKV ID NR:31 eller et fragment av én av disse sekvensene. Antistoffet kan omfatte en tung kjede og en lett kjede. Antistoffet kan omfatte (a) SEKV ID NR:6, SEKV ID NR:10, SEKV ID NR:14 eller SEKV ID NR:30 og (b) SEKV ID NR:8, SEKV ID NR:12, SEKV ID NR: 16 eller SEKV ID NR:31.

Oppfinnelsen tilveiebringer også polynukleotider, omfattende isolerte polynukleotider, som koder for hvilket som helst av antistoffene ifølge foreliggende oppfinnelse eller deler derav som beskrevet heri, omfattende CDR-regioner, tung kjede variable regioner, lett kjede variable regioner, enkeltkjedede antistoffer, enkeltkjedede Fv-antistoffer, F(ab)-antistoffer, F(ab)'-antistoffer og (Fab')2-antistoffer. Antistoffer ifølge foreliggende oppfinnelse kan produseres ved dyrkning av vertsceller.

Spesifikke foretrukne utførelsesformer ifølge foreliggende oppfinnelse vil være tydelige fra følgende mer detaljerte beskrivelse av visse foretrukne utførelsesformer og kravene.

KORT BESKRIVELSE AV FIGURENE

Figur 1A-1B viser en nukleotidsekvens til en del av et cDNA (Fig. 1A; SEKV ID NR:1) som koder for en aminosyresekvens (Fig. 1B; SEKV ID NR:2) til en tung kjede konstant region i 1118, 1118<*>, 1119, 1121 og 1121<*>anti-IFN-y antistoffer. Figur 2A-2B viser nukleotidsekvensen til en del av et cDNA (Fig. 2A; SEKV ID NR:3) som koder for en aminosyresekvens (Fig. 2B; SEKV ID NR:4) til en lett kjede konstant region i 1118, 1118<*>, 1119, 1121 og 1121<*>anti-IFN-y antistoffene. Figur 3A-3B viser nukleotidsekvensen til en del av et cDNA (Fig. 3A; SEKV ID NR:5) som koder for en aminosyresekvens (Fig. 3B; SEKV ID NR:6) til tung kjede variabel region i 1119 anti-IFN-y antistoffet. Figur 4A-4B viser nukleotidsekvensen til en del av et cDNA (Fig. 4A; SEKV ID NR:7) som koder for en aminosyresekvens (Fig. 4B; SEKV ID NR:8) til lett kjede variabel region i 1119 anti-IFN-y antistoffet. Figur 5A-5B viser nukleotidsekvensen til en del av et cDNA (Fig. 5A; SEKV ID NR:9) som koder for aminosyresekvensen (Figur 5B; SEKV ID NR: 10) til tung kjede variabel region i 1118 anti-IFN-y antistoffet. Figur 5C viser aminosyresekvensen til tung kjede variabel region (SEKV ID NR:30) i 1118<*>anti-IFN-y antistoffet. Figur 5D viser nukleotidsekvensen til tung kjede variabel region (SEKV ID NR:56) i 1118<*>anti-IFN^ antistoffet. Figur 6A-6B viser nukleotidsekvensen til en del av et cDNA (Fig. 6A; SEKV ID NR:11) som koder for aminosyresekvensen (Fig. 6B; SEKV ID NR:12) til lett kjede variabel region i 1118 eller 1118<*>anti-IFN-y antistoffet. Figur 7A-7B viser nukleotidsekvensen til en del av et cDNA (Fig. 7A; SEKV ID NR: 13) som koder for aminosyresekvensen (Fig. 7B; SEKV ID NR: 14) til tung kjede variabel region i 1121 eller 1121<*>anti-IFN-y antistoffet. Figur 8A-B viser nukleotidsekvensen til en del av et cDNA (Fig. 8A; SEKV ID NR:15) som koder for aminosyresekvensen (Fig. 8B; SEKV ID NR:16) til lett kjede variabel region i 1121 anti-IFN-y antistoffet. Figur 8C viser aminosyresekvensen (SEKV ID NR:31) til lett kjede variabel region i 1121<*>anti-IFN-y antistoffet. Figur 8D viser nukleotidsekvensen (SEKV ID NR:57) til lett kjede variabel region i 1121<*>anti-IFN-y antistoffet. Figur 9 inneholder en graf som viser nøytralisering eller hemming av den biologiske aktiviteten til IFN-y i A549-biotesten med 1119, 1118 og 1121 monoklonale antistoffer. Figur 10 inneholder en graf som viser nøytralisering eller hemming av den biologiske aktiviteten til IFN-y i THP-1/HLA DR-biotesten med 1119, 1118 og 1121 monoklonale antistoffer. Figur 11 inneholder en graf som viser nøytralisering eller hemming av den biologiske aktiviteten til IFN-y i en helblodbiotest (to donorer) med 1119 monoklonalt antistoff. Figur 12 viser en sammenstilling av en aminoterminal del (omfattende den variable regionen) av de tunge kjedene til anti-IFN-y monoklonale antistoffer kalt 1118, 1118* 1121 og 1119. Sekvensene omfatter signalsekvensen kodet for på cDNAene isolert i Eksempel 3. Signalsekvensen strekker seg fra posisjon 1 til og med 19. CDR'er er understreket. Som vist i figuren, spenner CDR1 fra aminosyre 50-54, CDR2 spenner fra 69-85 og CDR3 spenner fra 118-125. Nummereringssystemet til Kabat et al. (1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Public Health Service N.I.H., Bethesda, MD) starter på den første aminosyren i det modne antistoffet og ekskluderer signalsekvensen.

Derfor vil posisjon 20 i denne figuren svare til posisjon 1 ifølge Kabat et al. ( supra).

Figur 13 viser en sammenstilling av en aminoterminal del (omfattende den variable regionen) av de lette kjedene til anti-IFN-y monoklonale antistoffer kalt 1118, 1121, 1121<*>og 1119. Sekvensene omfatter signalsekvensen kodet for på cDNAene isolert i Eksempel 3. Signalsekvensen strekker seg fra posisjon 1 til og med 20. CDR'er er understreket. Som vist i figuren, spenner CDR1 fra aminosyre 44-55, CDR2 spenner fra 71 -77 og CDR3 spenner fra 110-118. Siden nummereringssystemet til Kabat et al. ( supra) ekskluderer signalsekvensen, svarer posisjon 21 i denne figuren til posisjon 1 ifølge Kabat et al. Figur 14 viser produksjon av IP-10 i respons til IFN-y ved helblod tatt fra en sjimpanse 2 eller 1 uke før (linjer merket "- 2" og "-1" i Figur 14) eller 2, 8, 15, 29 eller 36 dager etter (linjer merket " 2", "8", "15", "29" eller "36" i Figur 14) start av et forløp på 3 injeksjoner av anti-IFN-y antistoff, som skjedde én gang pr. uke. Figur 15 er lik Figur 14 bortsett fra at blod fra en annen sjimpanse ble anvendt.

DETALJERT BESKRIVELSE

Definisjoner

Standard teknikker kan anvendes for rekombinant DNA, oligonukleotidsyntese og vevskultur og transformasjon (f.eks. elektroporering, lipofeksjon). Enzymatiske reaksjoner og renseteknikker kan utføres i henhold til produsentens spesifiseringer eller som vanlig utført på området eller som beskrevet heri. Foregående teknikker og prosedyrer kan generelt utføres i henhold til konvensjonelle fremgangsmåter velkjent på området og som beskrevet i ulike generelle og mer spesifikke referanser som er sitert og beskrevet i foreliggende spesifisering. Se f.eks. Sambrook et al., 2001, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 3. utg., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. Hvis ikke spesifikke definisjoner er gitt, er nomenklaturen anvendt i sammenheng med, og laboratorieprosedyrer og teknikker i, analytisk kjemi, syntetisk organisk kjemi og medisinsk og farmasøytisk kjemi beskrevet heri de som er velkjent og mye anvendt på området. Standard teknikker kan anvendes for kjemiske synteser, kjemiske analyser, farmasøytisk fremstilling, formulering og levering og behandling av pasienter.

Som anvendt i henhold til foreliggende beskrivelse, skal følgende betegnelser, med mindre noe annet er angitt, forstås å ha følgende betydninger: Betegnelsen "isolert polynukleotid", slik den er anvendt heri, skal bety et polynukleotid av genomisk, cDNA eller syntetisk opprinnelse eller en kombinasjon derav, der det isolerte polynukleotidet i kraft av dets opprinnelse (1) ikke er assosiert med hele eller en del av et polynukleotid som det isolerte polynukleotidet er funnet med i naturen, (2) er bundet til et polynukleotid som det ikke er bundet til i naturen eller (3) ikke forekommer i naturen som del av en større sekvens.

Betegnelsen "isolert protein" henvist til heri betyr at et protein (1) er fri for i hvert fall noen andre proteiner som det normalt vil bli funnet sammen med i naturen, (2) i alt vesentlig er fri for andre proteiner fra den samme kilden, f.eks. fra samme art, (3) er uttrykt av en celle fra en annen art, (4) er separert fra minst ca. 50 prosent av polynukleotider, lipider, karbohydrater eller andre materialer som det er forbundet med i naturen, (5) er ikke forbundet (ved kovalent eller ikke-kovalent interaksjon) med deler av et protein som "det isolerte proteinet" er forbundet med i naturen, (6) er operabelt assosiert (ved kovalent eller ikke-kovalent interaksjon) med et polypeptid som det ikke er assosiert med i naturen eller (7) forekommer ikke i naturen. Et slikt isolert protein kan kodes for av genomisk DNA, cDNA, mRNA eller annet RNA, av syntetisk opprinnelse, eller hvilken som helst kombinasjon derav. Fortrinnsvis er det isolerte proteinet hovedsakelig fri for proteiner eller polypeptider eller andre kontaminanter som er funnet i dets naturlige miljø som vil interferere med dets anvendelse (terapeutisk, diagnostisk, profylaktisk, forskning eller på annen måte).

Betegnelsene "polypeptid" eller "protein" betyr én eller flere kjeder av aminosyrer, der hver kjede omfatter aminosyrer bundet kovalent med peptidbindinger, og der nevnte polypeptid eller protein kan omfatte et flertall av kjeder ikke-kovalent og/eller kovalent bundet sammen med peptidbindinger, som har sekvensen til native proteiner, dvs. proteiner produsert av naturlig forekommende og spesifikt ikke-rekombinante celler, eller genetisk modifiserte eller rekombinante celler, og omfatter molekyler som har aminosyresekvensen til det native proteinet eller molekyler som har delesjoner fra, addisjoner til og/eller substitusjoner av én eller flere aminosyrer i den native sekvensen. Betegnelsene "polypeptid" og "protein" omfatter spesifikt anti-IFN-y antistoffer eller sekvenser som har delesjoner fra, addisjoner til og/eller substitusjoner av én eller flere aminosyrer i et anti-IFN-y antistoff. Derfor kan "et polypeptid" eller "et protein" omfatte én (betegnet "en monomer") eller flere (betegnet "en multimer") aminosyrekjeder.

Betegnelsen "polypeptidfragment" henviser til et polypeptid, som kan være monomert eller multimert, som har en aminoterminal delesjon, en karboksylterminal delesjon og/eller en indre delesjon eller substitusjon av et naturlig forekommende eller rekombinant produsert polypeptid. I visse utførelsesformer kan et polypeptidfragment omfatte en aminosyrekjede som er minst 5 til ca. 500 aminosyrer lang. Det skal forstås at fragmenter i visse utførelsesformer er minst 5, 6, 8, 10, 14, 20, 50, 70, 100, 110, 150, 200, 250, 300, 350, 400 eller 450 aminosyrer lange. Spesielt anvendelige polypeptidfragmenter omfatter funksjonelle domener, omfattende bindingsdomener. I tilfellet av et anti-IFN-y antistoff omfatter anvendelige fragmenter, men er ikke begrenset til: en CDR-region, spesielt en CDR3-region til tung- eller lett kjede; et variabelt domene til en tung- eller lett kjede; en del av en antistoffkjede eller bare dens variable region omfattende to CDR'er; og lignende.

Betegnelsen "immunologisk funksjonelt immunglobulinfragment", slik den er anvendt heri, henviser til et polypeptidfragment som minst inneholder CDR'ene i immunglobulin tung- og lett kjede. Et immunologisk funksjonelt immunglobulinfragment ifølge foreliggende oppfinnelse kan binde til et antigen. I foretrukne utførelsesformer er antigenet en ligand som binder spesifikt til en reseptor. I disse utførelsesformene hindrer eller hemmer binding av et immunologisk funksjonelt immunglobulinfragment ifølge foreliggende oppfinnelse binding av liganden til dens reseptor og forstyrrer den biologiske responsen som følger av ligandbinding til reseptoren. Fortrinnsvis binder et immunologisk funksjonelt immunglobulinfragment ifølge foreliggende oppfinnelse spesifikt til IFN-y. Mest foretrukket binder fragmentet spesifikt til og/eller hemmer eller modulerer den biologiske aktiviteten til humant IFN-y.

Betegnelsen "naturlig forekommende", slik den er anvendt heri og gjelder for et objekt, henviser til det faktum at objektet kan finnes i naturen. For eksempel er en polypeptid- eller polynukleotidsekvens som foreligger i en organisme (omfattende virus) som kan isoleres fra en kilde i naturen og som ikke med vilje er modifisert av menneske naturlig forekommende.

Betegnelsen "operabelt bundet" betyr at komponentene som betegnelsen er anvendt for er i et forhold som tillater dem å utføre deres naturlige funksjoner under egnede betingelser. For eksempel er en transkripsjonskontrollsekvens "operabelt bundet" til en proteinkodende sekvens ligert dertil, slik at ekspresjon av den proteinkodende sekvensen blir oppnådd under betingelser kompatible med transkripsjonsaktiviteten til kontrollsekvensene.

Betegnelsen "kontrollsekvens", slik den er anvendt heri, henviser til polynukleotidsekvenser som kan affisere ekspresjon, prosessering eller intracellulær lokalisering av kodende sekvenser som de er ligert til. Egenskaper til slike kontrollsekvenser kan avhenge av vertsorganismen. I spesielle utførelsesformer kan transkripsjonskontrollsekvenser for prokaryoter omfatte en promoter, ribosombindingssete og transkripsjonsstoppsekvens. I andre spesielle utførelsesformer kan transkripsjonskontrollsekvenser for eukaryoter omfatte promotere omfattende ett eller flere gjenkjennelsesseter for transkripsjonsfaktorer, transkripsjonsenhancersekvenser, transkripsjonsstoppsekvenser og polyadenyleringssekvenser. I visse utførelsesformer kan "kontrollsekvenser" omfatte ledersekvenser og/eller fusjonspartnersekvenser.

Betegnelsen "polynukleotid", som henvist til heri, betyr enkelt- eller dobbelttrådede nukleinsyrepolymerer som er minst 10 baser lange. I visse utførelsesformer kan nukleotidene omfattende polynukleotidet være ribonukleotider eller deoksyribonukleotider eller en modifisert form av begge nukleotidtyper. Nevnte modifikasjoner omfatter basemodifikasjoner så som bromuridin, ribosemodifikasjoner så som arabinosid og 2',3'-dideoksyribose og internukleotidbindingsmodifikasjoner så som fosfortioat, fosforditioat, fosforselenoat, fosfordiselenoat, fosforanilotioat, fosforaniladat og fosforamidat.

Betegnelsen "polynukleotid" omfatter spesifikt enkelt- og dobbelttrådede former av

DNA.

Betegnelsen "oligonukleotid" henvist til heri omfatter naturlig forekommende og modifiserte nukleotider bundet sammen ved naturlig forekommende og/eller ikke-naturlig forekommende oligonukleotidbindinger. Oligonukleotider er en polynukleotidundergruppe omfattende medlemmer som generelt er enkelttrådede og har en lengde på 200 baser eller færre. I visse utførelsesformer er oligonukleotider 10 til 60 baser lange. I visse utførelsesformer er oligonukleotider 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 eller 20 til 40 baser lange. Oligonukleotider kan være enkelt- eller dobbelttrådede, f.eks. for anvendelse i konstruksjon av en genmutant. Oligonukleotider ifølge foreliggende oppfinnelse kan være sens eller antisens oligonukleotider med referanse til en proteinkodende sekvens.

Hvis ikke spesifisert på annen måte, er venstre ende av enkelttrådede polynukleotidsekvenser 5'enden; venstre retning av dobbelttrådede polynukleotidsekvenser er henvist til som 5'retningen. Retning av 5' til 3' addisjon av voksende RNA-transkripter er henvist til som transkripsjonsretningen; sekvensregioner på DNA-tråden som har samme sekvens som RNAet og som er 5' i forhold til 5'enden av RNA-transkriptet henvises til som "oppstrømssekvenser"; sekvensregioner på DNA-tråden som har samme sekvens som RNAet og som er 3' i forhold til 3'enden av RNA-transkriptet henvises til som "nedstrømssekvenser".

Betegnelsen "naturlig forekommende nukleotider" omfatter deoksyribonukleotider og ribonukleotider. Betegnelsen "modifiserte nukleotider" omfatter nukleotider med modifiserte eller substituerte sukkergrupper og lignende. Betegnelsen "oligonukleotidbindinger" omfatter oligonukleotidbindinger så som fosfortioat, fosforditioat, fosforselenoat, fosfordiselenoat, fosforanilotioat, fosforaniladat, fosforamidat og lignende. Se f.eks. LaPlanche et al., 1986, Nucl. Acids Res., 14:9081; Stecetal., 1984, J. Am. Chem. Soc, 106:6077; Stein et al., 1988, Nucl. Acids Res., 16:3209; Zon et al., 1991, Anti-Cancer Drug Design, 6:539; Zon et al.,

1991, OLIGONUCLEOTIDES AND ANALOGUES: A PRACTICAL APPROACH, s.

87-108 (F. Eckstein, red.), Oxford University Press, Oxford England; Stecet al., U.S. pat. nr. 5.151.510; Uhlmann og Peyman, 1990, Chemical Reviews, 90:543.

Et oligonukleotid kan omfatte en detekterbar markør for å muliggjøre deteksjon av oligonukleotidet eller hybridisering derav.

Betegnelsen "vektor" blir anvendt for å angi hvilket som helst molekyl (f.eks. nukleinsyre, plasmid eller virus) anvendt til overføring av kodende informasjon til en vertscelle.

Betegnelsen "ekspresjonsvektor" henviser til en vektor som er egnet for transformasjon av en vertscelle og inneholder nukleinsyresekvenser som styrer og/eller kontrollerer ekspresjon av innsatte heterologe nukleinsyresekvenser. Ekspresjon omfatter, men er ikke begrenset til, prosesser så som transkripsjon, translasjon og RNA-spleising, hvis introner foreligger.

Betegnelsen "vertscelle" blir anvendt for å angi en celle der det er innført eller som kan få innført en nukleinsyresekvens og videre uttrykker eller som kan uttrykke et valgt gen av interesse. Betegnelsen omfatter avkom av foreldercellen, uavhengig om avkommet er identisk i morfologi eller i genetisk make-up med den opprinnelige forelderen, så lenge som det valgte genet foreligger.

Betegnelsen "transduksjon" blir anvendt for å angi overføring av gener fra én bakterie til en annen, vanligvis ved en fag. "Transduksjon" henviser også til ervervelse og overføring av eukaryote cellulære sekvenser ved retrovirus.

Betegnelsen "transfeksjon" blir anvendt for å angi opptak av fremmed eller eksogent DNA av en celle, og en celle er "transfektert" når eksogent DNA er innført innenfor cellemembranen. Et antall transfeksjonsteknikker er velkjent på området og er beskrevet heri. Se f.eks. Graham et al., 1973, Virology 52:456; Sambrook et al., 2001, MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratories; Davis et al., 1986, BASIC METODS IN MOLECULAR BIOLOGY, Elsevier; og Chu et al., 1981, Gene 13:197. Slike teknikker kan anvendes for å innføre én eller flere eksogene DNA-grupper i egnede vertsceller.

Betegnelsen "transformasjon", slik den er anvendt heri, henviser til en forandring i en celles genetiske karakteristika, og en celle er transformert når den er modifisert til å inneholde nytt DNA. For eksempel er en celle transformert når den er genetisk modifisert fra dens native tilstand. Etter transfeksjon eller transduksjon kan det transformerende DNAet rekombinere med cellens eget DNA ved fysisk integrering i et kromosom i cellen, eller kan opprettholdes transient som et episomalt element uten å bli replikert eller kan replikere uavhengig som et plasmid. En celle blir betraktet som å ha blitt stabilt transformert når DNAet blir replikert med deling av cellen.

Betegnelsen "naturlig forekommende" eller "nativ", når anvendt i sammenheng med biologiske materialer så som nukleinsyremolekyler, polypeptider, vertsceller og lignende, henviser til materialer som er funnet i naturen og ikke er manipulert av menneske. Likeledes henviser "ikke-naturlig forekommende" eller "ikke-nativ", slik det er anvendt heri, til et materiale som ikke er funnet i naturen eller som er strukturelt modifisert eller syntetisert av menneske.

Betegnelsen "antigen" henviser til et molekyl eller en del av et molekyl som kan bindes av et selektivt bindende stoff, så som et antistoff, og som i tillegg kan anvendes i et dyr for å produsere antistoffer som kan binde til en epitop av antigenet. Et antigen kan ha én eller flere epitoper.

Betegnelsen "epitop" omfatter hvilken som helst determinant, fortrinnsvis en polypeptiddeterminant, som kan binde spesifikt til et immunglobulin eller T-cellereseptor. En epitop er en region av et antigen som blir bundet av et antistoff. I visse utførelsesformer omfatter epitopdeterminanter kjemisk aktive overflategrupperinger av molekyler så som aminosyrer, sukkersidekjeder, fosforyl eller sulfonyl og kan, i visse utførelsesformer, ha spesifikke tredimensjonale strukturkarakteristika og/eller spesifikke ladningskarakteristika. I visse utførelsesformer binder et antistoff et antigen spesifikt når det fortrinnsvis gjenkjenner dets målantigen i en kompleks blanding av proteiner og/eller makromolekyler. Et antistoff binder et antigen spesifikt når likevektsdissosiasjonskonstanten er< 10"<7>eller 10"<8>M. I noen utførelsesformer kan likevektsdissosiasjonskonstanten være < 10"<9>M eller < 10"<10>M.

Slik det er anvendt heri, når en første sekvens består av for eksempel 10 aminosyrer av sekvensen RASQSVSSSY (SEKV ID NR:56), har en annen sekvens 7 aminosyrer med "samme rekkefølge og innbyrdes avstand" som de forekommer i den første sekvensen hvis 7 aminosyrer er identiske med dem i sekvensen og forekommer i de samme relative posisjonene som de forekommer i sekvensen. For eksempel har en sekvens RAAAAVSSSY (SEKV ID NR:57) 7 aminosyrer med samme rekkefølge og innbyrdes avstand som de forekommer i RASQSVSSSY (SEKV ID NR:56). Dette gjelder derimot ikke for en sekvens RASSVSSSY (SEKV ID NR:58), siden den inneholder en indre delesjon i forhold til RASQSVSSSY (SEKV ID NR:56), med 3 og 6 aminosyrer på hver side av delesjonen. Derfor har den på det meste 6 aminosyrer med samme rekkefølge og innbyrdes avstand som den første sekvensen. Den kortest mulige sekvensen som kan ha 7 aminosyrer med samme rekkefølge og innbyrdes avstand som i RASQSVSSSY (SEKV ID NR:56) vil være 7 aminosyrer lang, for eksempel

SQSVSSS (SEKV ID NR:59).

Betegnelsen "identitet", som kjent på området, henviser til et slektskap mellom sekvensene til to eller flere polypeptidmolekyler eller to eller flere nukleinsyremolekyler, som bestemt ved sammenligning av sekvensene derav. På området betyr også "identitet" graden av sekvensslektskap mellom nukleinsyremolekyler eller polypeptider, som tilfellet kan være, bestemt ved match mellom tråder av to eller flere nukleotid- eller to eller flere aminosyresekvenser. "Identitet" måler prosent identiske matcher mellom den mindre av to eller flere sekvenser med gap-sammenstillinger (hvis noen) adressert ved en spesiell matematisk modell eller dataprogram (dvs. "algoritmer").

Betegnelsen "likhet" blir anvendt på området med hensyn til et beslektet konsept, men til forskjell fra "identitet", henviser "likhet" til et mål for slektskap, som omfatter både identiske matcher og konservative substitusjonsmatcher. Hvis to polypeptidsekvenser for eksempel har 10/20 identiske aminosyrer og resten er alle ikke-konservative substitusjoner, så vil både prosent identitet og likhet være 50%. Hvis det i samme eksempel er fem flere posisjoner der det er konservative substitusjoner, så forblir prosent identitet 50%, men prosent likhet vil være 75%

(15/20). Derfor, i tilfeller der det er konservative substitusjoner, vil prosent likhet mellom to polypeptider være høyere enn prosent identitet mellom de to polypeptidene.

Identitet og likhet av beslektede nukleinsyrer og polypeptider kan enkelt beregnes ved kjente fremgangsmåter. Slike fremgangsmåter omfatter for eksempel de som er beskrevet i COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY, (Lesk, A. M., red.), 1988, Oxford University Press, New York; BIOCOMPUTING: INFORMATICS AND GENOME PROJECTS, (Smith, D. W., red.), 1993, Academic Press, New York; COMPUTER ANALYSIS OF SEQUENCE DATA, Part 1, (Griffin, A. M. og Griffin, H. G., red.)., 1994, Humana Press, New Jersey; von Heinje, G., SEQUENCE ANALYSIS IN MOLECULAR BIOLOGY, 1987, Academic Press; SEQUENCE ANALYSIS PRIMER, (Gribskov, M. og Devereux, J., red.)., 1991, M. Stockton Press, New York; Carillo et al., 1988, SIAM J. Applied Math., 48:1073; og Durbin et al., 1998, BIOLOGICAL SEQUENCE ANALYSIS, Cambridge University Press.

Foretrukne fremgangsmåter for å bestemme identitet er utformet for å tilveiebringe den største matchen mellom sekvensene testet. Fremgangsmåter for å bestemme identitet er beskrevet i offentlig tilgjengelige dataprogrammer. Foretrukne

dataprogram metoder for å bestemme identitet mellom to sekvenser omfatter, men er ikke begrenset til, GCG-programvarepakken, omfattende GAP (Devereux et al., 1984, Nucl. Acid. Res., 12:387; Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, Wl), BLASTP, BLASTN og FASTA (Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol., 215:403-410). BLASTX-programmet er offentlig tilgjengelig fra National Center for Biotechnology Information (NCBI) og andre kilder (BLAST Manual, Altschul et al. NCB/NLM/NIH Bethesda, MD 20894; Altschul et al., 1990, supra). Den velkjente Smith Waterman-algoritmen kan også anvendes for å bestemme identitet.

Visse sammenstillingsskjemaer for sammenstilling av to aminosyre- eller polynukleotidsekvenser kan resultere i matching av bare en kort region av de to sekvensene, og denne lille sammenstilte regionen kan ha veldig høy sekvensidentitet, selv om det ikke er signifikant slektskap mellom de to fullengdesekvensene. Følgelig, i visse utførelsesformer, vil den valgte sammenstillingsmetoden (GAP-program) resultere i en sammenstilling som spenner over minst 50 umiddelbart påfølgende aminosyrer av målpolypeptidet. I noen utførelsesformer kan sammenstillingen omfatte minst 60, 70, 80, 90, 100, 110 eller 120 aminosyrer av målpolypeptidet. Hvis polynukleotider blir sammenstilt ved anvendelse av GAP, kan sammenstillingen spenne over minst ca. 100, 150 eller 200 nukleotider, som kan være sammenhengende.

For eksempel, ved anvendelse av computeralgoritmen GAP (Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, Wl), blir to polypeptider som prosent sekvensidentitet skal bestemmes for sammenstilt for optimal matching av deres respektive aminosyrer ("matchet spenn", som bestemt ved algoritmen). I visse utførelsesformer blir en gap-åpning-straff (som er beregnet som tre-ganger gjennomsnittsdiagonalen; der "gjennomsnittsdiagonalen" er gjennomsnittet av diagonalen til sammenligningsmatrisen som blir anvendt; "diagonalen" er score eller tall tildelt hver perfekte aminosyrematch ved den bestemte sammenligningsmatrisen) og en gap-utvidelse-straff (som vanligvis er en tiendedel av gap-åpning-straffen), så vel som en sammenligningsmatrise så som PAM250 eller BLOSUM 62 anvendt i forbindelse med algoritmen. I visse utførelsesformer blir en standard sammenligningsmatrise (se Dayhoff et al., 1978, Atlas of Protein Sequence and Structure, 5:345-352 for PAM 250-sammenligningsmatrisen; Henikoff et al., 1992, Proe. Nati. Acad. Sei USA, 89:10915-10919 for BLOSUM 62-sammenligningsmatrisen) også anvendt av algoritmen.

I visse utførelsesformer omfatter parametrene for en

polypeptidsekvenssammenligning følgende:

Algoritme: Needleman et al., 1970, J. Mol. Biol., 48:443-453; Sammenligningsmatrise: BLOSUM 62 fra Henikoff et al., 1992, supra;

Gap-straff: 12

Gap-lengde-straff: 4

Likhetsterskel: 0

GAP-programmet kan være anvendelig med parametrene ovenfor. For nukleotidsekvenser kan parametrer omfatte en gap-straff på 50 og en gap-lengde-straff på 3, som er en straff på 3 for hvert symbol i hvert gap. I visse utførelsesformer er de førnevnte parametrene de vanlige parametrene for polypeptidsammenligninger (sammen med ingen straff for endegap) ved anvendelse av GAP-algoritmen.

Slik det er anvendt heri, følger de tjue konvensjonelle aminosyrene og deres forkortelser konvensjonell bruk. Se IMMUNOLOGY-A SYNTHESIS, 2. utgave, (E. S. Golub og D. R. Gren, red.), Sinauer Associates: Sunderland, MA, 1991. Stereoisomerer (f.eks. D-aminosyrer) av de tjue konvensjonelle aminosyrene; ikke-naturlige aminosyrer så som a-, a-disubstituerte aminosyrer, N-alkylaminosyrer, melkesyre og andre ukonvensjonelle aminosyrer kan også være egnede komponenter for polypeptider ifølge foreliggende oppfinnelse. Eksempler på ukonvensjonelle aminosyrer omfatter: 4-hydroksyprolin, y-karboksyglutamat, e-N,N,N-trimetyllysin, e-N-acetyllysin, O-fosfoserin, N-acetylserin, N-formylmetionin, 3-metylhistidin, 5-hydroksylysin, a-N-metylarginin og andre lignende aminosyrer og iminosyrer (f.eks. 4-hydroksyprolin). I polypeptidnotasjonen anvendt heri er venstre retning den aminoterminale retningen og høyre retning er den karboksylterminale retningen, i henhold til standard skikk og bruk.

Naturlig forekommende residuer kan fordeles i klasser basert på vanlige sidekjedeegenskaper: 1) hydrofob: norleucin (Nor), Met, Ala, Val, Leu, Ile; 2) nøytral hydrofil: Cys, Ser, Thr, Asn, Gin; 3) sur: Asp, Glu; 4) basisk: His, Lys, Arg;

5) residuer som påvirker kjedeorientering: Gly, Pro; og

6) aromatisk: Trp, Tyr, Phe.

Konservative aminosyresubstitusjoner kan involvere utbytting av et medlem av én av disse klassene med et annet medlem av samme klasse. Konservative aminosyresubstitusjoner kan omfatte ikke-naturlig forekommende aminosyreresiduer, som normalt er inntatt ved kjemisk peptidsyntese i stedet for ved syntese i biologiske systemer. Disse omfatter peptidoetterligninger og andre reverserte eller inverterte former av aminosyregrupper.

Ikke-konservative substitusjoner kan involvere utbytting av et medlem av én av disse klassene for et medlem fra en annen klasse. Slike substituerte residuer kan innføres i regioner av det humane antistoffet som er homologe med ikke-humane antistoffer eller inn i de ikke-homologe regionene av molekylet.

Ved å gjøre slike endringer, i henhold til visse utførelsesformer, kan den hydropatiske indeksen til aminosyrer bli tatt i betraktning. Hver aminosyre er tildelt en hydropatisk indeks på grunnlag av dens hydrofobisitet og ladningskarakteristika. De er: isoleucin (+4,5); valin (+4,2); leucin (+3,8); fenylalanin (+2,8); cystein/cystin (+2,5); metionin (+1,9); alanin (+1,8); glysin (-0,4); treonin (-0,7); serin (-0,8); tryptofan (-0,9); tyrosin (-1,3); prolin (-1,6); histidin (-3,2); glutamat (-3,5); glutamin (-3,5); aspartat (-3,5); asparagin (-3,5); lysin (-3,9); og arginin (-4,5).

Viktigheten av den hydropatiske aminosyreindeksen i konferering av interaktiv biologisk funksjon til et protein er forstått på området (se for eksempel Kyte et al., 1982, J. Mol. Biol. 157:105-131). Det er kjent at visse aminosyrer kan substitueres for andre aminosyrer som har en lignende hydropatisk indeks eller score og fortsatt ha en lignende biologisk aktivitet. Ved å gjøre endringer basert på den hydropatiske indeksen, i visse utførelsesformer, er substitusjon av aminosyrer hvis hydropatiske indekser er innenfor ±2 omfattet. I visse utførelsesformer er de som er innenfor ±1 omfattet og i visse utførelsesformer er de som er innenfor ±0,5 omfattet.

Det er også forstått på området at substitusjon av lignende aminosyrer kan gjøres effektivt på grunnlag av hydrofilitet, spesielt der det biologisk funksjonelle proteinet eller peptidet dermed dannet skal anvendes i immunologiske utførelsesformer, som beskrevet heri. I visse utførelsesformer korrelerer den største lokale gjennomsnittlige hydrofiliteten til et protein, som er styrt av hydrofiliteten til dets nærliggende aminosyrer, med dets immunogenitet og antigenitet, dvs. med en biologisk egenskap hos proteinet.

Følgende hydrofilitetsverdier er tildelt disse aminosyreresiduene: arginin (+3,0); lysin (+3,0); aspartat (+3,0 ± 1); glutamat (+3,0 ± 1); serin (+0,3); asparagin (+0,2); glutamin (+0,2); glysin (0); treonin (-0,4); prolin (-0,5 ± 1); alanin (-0,5); histidin (-0,5); cystein (-1,0); metionin (-1,3); valin (-1,5); leucin (-1,8); isoleucin (-1,8); tyrosin (-2,3); fenylalanin (-2,5) og tryptofan (-3,4). Ved å gjøre endringer basert på lignende hydrofilitetsverdier er, i visse utførelsesformer, substitusjon av aminosyrer hvis hydrofilitetsverdier er innenfor+2 omfattet, i visse utførelsesformer er de som er innenfor ±1 omfattet, og i visse utførelsesformer er de innenfor ±0,5 omfattet. Man kan også identifisere epitoper fra primære aminosyresekvenser på grunnlag av hydrofilitet. Disse regionene er også henvist til som "epitope kjerneregioner".

Eksempler på aminosyresubstitusjoner er gitt i Tabell 1.

En fagperson vil være i stand til å bestemme egnede varianter av polypeptidet angitt heri ved anvendelse av velkjente teknikker. I visse utførelsesformer kan en fagperson identifisere egnede områder av molekylet som kan forandres uten å ødelegge aktivitet ved å modifisere regioner ikke antatt å være viktige for aktivitet.

I andre utførelsesformer kan fagpersonen identifisere residuer og deler av molekylene som er konservert mellom lignende polypeptider. I videre utførelsesformer kan til og med områder som kan være viktige for biologisk aktivitet eller for struktur bli utsatt for konservative aminosyresubstitusjoner uten å ødelegge den biologiske aktiviteten eller uten å affisere polypeptidstrukturen alvorlig.

I tillegg kan en fagperson vurdere struktur-funksjon-studier og identifisere residuer i lignende polypeptider som er viktige for aktivitet eller struktur. Med henblikk på en slik sammenligning kan fagpersonen predikere viktigheten av aminosyreresiduer i et protein som svarer til aminosyreresiduer viktig for aktivitet eller struktur i lignende proteiner. En fagperson på området kan velge kjemisk lignende aminosyresubstitusjoner for slike antatt viktige aminosyreresiduer.

En fagperson på området kan også analysere den tredimensjonale strukturen og aminosyresekvensen i forhold til den strukturen i lignende polypeptider. Med henblikk på slik informasjon kan en fagperson predikere sammenstillingen av aminosyreresiduer i et antistoff med hensyn til dets tredimensjonale struktur. I visse utførelsesformer kan en fagperson velge å ikke gjøre radikale endringer i forhold til aminosyreresiduer antatt å være på overflaten av proteinet, siden slike residuer kan være involvert i viktige interaksjoner med andre molekyler. Videre kan en fagperson generere testvarianter inneholdende en enkel aminosyresubstitusjon på hvert ønskede aminosyreresidue. Variantene kan deretter screenes ved anvendelse av aktivitetstester kjent for fagfolk. Slike varianter kan anvendes for å samle informasjon om egnede varianter. Hvis man for eksempel oppdaget at en forandring til et spesielt aminosyreresidue resulterte i ødelagt, uønsket redusert eller upassende aktivitet, kan varianter med en slik forandring unngås. Med andre ord, basert på informasjon samlet fra slike rutineeksperimenter, kan en fagperson lett bestemme aminosyrene der videre substitusjoner bør unngås enten alene eller i kombinasjon med andre mutasjoner.

Flere vitenskapelige publikasjoner er viet prediksjon av sekundær struktur. Se for eksempel Moult, 1996, Curr. Op. in Biotech. 7:422-427; Chou et al., 1974, Biochemistry 13:222-245; Chou et al., 1974, Biochemistry 113:211-222; Chou et al., 1978, Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol. 47:45-148; Chou et al., 1979, Ann. Rev. Biochem. 47:251-276; og Chou et al., 1979, Biophys. J. 26:367-384. Videre er dataprogrammer tilgjengelig for å bistå med prediksjon av sekundær struktur. Én fremgangsmåte for prediksjon av sekundær struktur er basert på homologimodellering. For eksempel har to polypeptider eller proteiner som har en sekvensidentitet på mer enn 30% eller likhet på mer enn 40% ofte lignende strukturell topologi. Nylig vekst av proteinstrukturdatabasen (PDB) har fremskaffet økt prediktabilitet av sekundær struktur, omfattende det mulige antall foldinger i et polypeptids- eller proteins struktur. Se Holm et al., 1999, Nucl. Acid. Res. 27:244-247. Det er indikert (Brenner et al., 1997, Curr. Op. Struct. Biol. 7:369-376) at det er et begrenset antall foldinger i et gitt polypeptid eller protein og at når et kritisk antall strukturer er bestemt, vil strukturell prediksjon bli dramatisk mer nøyaktig.

Ytterligere fremgangsmåter for å predikere sekundær struktur omfatter "tråkling"

(Jones, 1997, Curr. Opin. Struct. Biol. 7:377-87; Sippl et al., 1996, Structure 4:15-19), "profilanalyse" (Bowie et al., 1991, Science 253:164-170; Gribskov et al., 1990, Meth. Enzym. 183:146-159; Gribskov et al., 1987, Proe. Nat. Acad. Sei. 84:4355-4358) og "evolusjonsmessig kobling" (se Holm, 1999, supra; og Brenner, 1997, supra).

I henhold til visse utførelsesformer er aminosyresubstitusjoner de som: (1) reduserer mottakelighet for proteolyse, (2) reduserer mottakelighet for oksidasjon, (3) forandrer bindingsaffinitet for dannende proteinkomplekser, (4) forandrer bindingsaffiniteter og/eller (5) overbringer eller modifiserer andre fysikokjemiske eller funksjonelle egenskaper på slike polypeptider. I henhold til visse utførelsesformer kan enkle eller multiple aminosyresubstitusjoner (i visse utførelsesformer konservative aminosyresubstitusjoner) gjøres i den naturlig forekommende sekvensen (i visse utførelsesformer i delen av polypeptidet utenfor domenet/domenene som danner intermolekylære kontakter). I foretrukne utførelsesformer forandrer en konservativ aminosyresubstitusjon normalt ikke de strukturelle karakteristikaene ved foreldersekvensen vesentlig (f.eks. skal ikke den nye aminosyren ha en tendens til å ødelegge en heliks som forekommer i foreldersekvensen eller forstyrre andre typer av sekundær struktur som karakteriserer foreldersekvensen). Eksempler på sekundære og tertiære polypeptidstrukturer kjent i faget er beskrevet i PROTEINS, STRUCTURES AND MOLECULAR PRINCIPLES, (Creighton, red.), 1984, W. H. Freeman and Company, New York; INTRODUCTION TO PROTEIN STRUCTURE (C. Branden og J. Tooze, red.), 1991, Garland Publishing, New York, N.Y.; og Thornton et al., 1991, Nature 354:105.

Peptidanaloger er mye anvendt i farmasøytisk industri som ikke-peptid medikamenter med analoge egenskaper som templatpeptidet. Disse typene av ikke-peptid forbindelse er betegnet "peptidetterligninger" eller "peptidoetterligninger". Se Fauchere, 1986, Adv. Drug Res. 15:29; Veber& Freidinger, 1985, TINS s. 392; og Evans et al, 1987, J. Med. Chem. 30:1229. Slike forbindelser er ofte utviklet ved hjelp av datamaskinbasert molekylær modellering. Peptidetterligninger som ligner strukturelt på terapeutisk anvendelige peptider kan anvendes for å produsere en lignende terapeutisk eller profylaktisk effekt. Generelt ligner peptidoetterligninger strukturelt på et paradigmepolypeptid (dvs. et polypeptid som har en biokjemisk egenskap eller farmakologisk aktivitet), så som humant antistoff, men har én eller flere peptidbindinger eventuelt erstattet med en binding valgt fra: -Chb-NH-, -Chb-S-, -CH2-CH2-, -CH=CH- (c/s og trans), -COCH2-, -CH(OH)CH2- og -CH2SO-, ved fremgangsmåter velkjent på området. Systematisk substitusjon av én eller flere aminosyrer i en konsensussekvens med en D-aminosyre av samme type (f.eks. D-lysin i stedet for L-lysin) kan anvendes i visse utførelsesformer for å generere mer stabile peptider. I tillegg kan "constrained" peptider omfattende en konsensussekvens eller en vesentlig identisk konsensussekvensvariasjon genereres ved fremgangsmåter kjent på området (Rizo & Gierasch, 1992, Ann. Rev. Biochem. 61:387; for eksempel ved å tilsette indre cysteinresiduer som kan danne intramolekylære disulfidbroer som gjør peptidet syklisk.

Slik de er anvendt heri, angir betegnelsene "antistoff" eller "antistoffpeptid(er)" et monomert eller multimert protein omfattende én eller flere polypeptidkjeder. Et antistoff kan binde spesifikt til et antigen og kan være i stand til å hemme eller modulere den biologiske aktiviteten til antigenet. "Antistoffer" omfatter naturlig forekommende antistoffer, som er beskrevet nedenfor. I visse utførelsesformer blir antistoffer produsert ved rekombinante DNA-teknikker. I videre utførelsesformer blir antistoffer produsert ved enzymatisk eller kjemisk kutting av naturlig forekommende antistoffer. Antistoffer omfatter, men er ikke begrenset til, F(ab), F(ab'), F(ab')2, Fv og enkeltkjedede Fv-fragmenter, så vel som enkeltkjedede-, kimæriske-, humaniserte, fullstendig humane-, polyklonale- og monoklonale antistoffer. Et antistoff, som ment heri, omfatter minimum et polypeptid som kan binde spesifikt til et antigen omfattende hele eller en del av en lett- eller tung kjede variabel region.

En variabel region omfatter minst tre tung- eller lett kjede

komplementaritetsbestemmende regioner (CDR'er, også kjent som hypervariable regioner, kalt CDR1, CDR2 og CDR3 av Kabat et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Public Health Service N.I.H., Bethesda, MD; se også Chothia og Lesk, 1987, J. Mol. Biol. 196: 901-17; Chothia et al., 1989, Nature 342: 877-83) liggende i en strukturregion (kalt strukturregioner 1-4, FR1, FR2, FR3 og FR4, av Kabat et al., supra; se også Chothia og Lesk, supra). CDR'ene og struktursegmentene er satt inn imellom hverandre som følger, ved start på aminoterminalen til den variable regionen: FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4.

Primærsekvensene til strukturregionene i variable regioner av et antistoff har en håndfull residuer som er konservert på tvers av rekker. Mange residuer er imidlertid sterkt konservert på tvers av rekker og/eller innenfor arter og/eller rekker, og mange posisjoner i antistoffer er vanligvis okkupert av én fra en kjent gruppe med aminosyrer. Se Kabat et al., supra. Alternativt kan en sekvens gjenkjennes som et antistoff ved dens antatte tertiærstruktur. Tertiærstrukturen til de variable regionene, som omfatter 9 p-kjeder som danner en struktur kjent som en gresk nøkkel p-tønne, er ekstremt bra konservert, og posisjonene av CDR'ene i denne strukturen er også sterkt konservert. Se f.eks. Bork et al., 1994, J. Mol. Biol. 242: 309-20; Hunkapiller og Hood, 1989, Adv. Immunol. 44: 1-63; Williams og Barclay, 1988, Ann. Rev. Immunol. 6: 381-405; Chothia og Lesk, supra; Kabat et al., supra.

Tertiærstruktur kan predikeres med ulike dataprogrammer, så som for eksempel GENEFOLD® (Tripos, Inc., St. Louis, MO; Godzikog Skolnik, 1992, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 89: 12098-12102; Godziketal., 1992, J. Mol. Biol. 227: 227-38; Godzik et al., 1993, Protein Engng. 6: 801-10), et proteintråklingsprogram som tråkler en proteinsøkesekvens på strukturelle representative sekvenser i proteindatabanken (PDB) (Berman et al., 2000, Nucleic Acids Res 28: 235-242; Jaroszewski et al., 1998, Prot Sei 7: 1431-1440). For å anvende GENEFOLD® til å klassifisere en ny aminosyresekvens, blir sekvensen lagt inn i programmet, som tildeler en sannsynlighetsscore som reflekterer hvor godt den folder på tidligere kjente proteinstrukturer ("templaf-strukturer) som foreligger i GENEFOLD<®->databasen. For scoring baserer GENEFOLD® seg på primær aminosyresekvenslikhet, "burial patterns" av residuer, lokale interaksjoner og sekundærstruktursammenligninger. GENEFOLD<®->programmet folder (eller tråkler) aminosyresekvensen på alle templatstrukturene i en preeksisterende database av proteinfoldinger, som omfatter de kjente strukturene for flere antistoffer. Resultatet av GENEFOLD® er tre lister av proteiner fra databasen, der tertiærstrukturene av disse er de som er mest sannsynlige å anta for aminosyresøkesekvensen. De tre listene inneholder tre ulike beregnede scorer basert på (i) kun sekvens, (ii) sekvens pluss lokale konformasjonspreferenser pluss "burial terms" og (iii) sekvens pluss lokale konformasjonspreferenser pluss "burial terms" pluss sekundær struktur. I hvert tilfelle bestemmer programmet optimal sammenstilling, kalkulerer sannsynligheten (P-verdi) for at denne grad av sammenstilling skjedde tilfeldig, og rapporterer den inverse av P-verdien, der score med 999,9 (9,999 x10<2>) er den høyest mulige scoren. Således indikerer den høyeste scoren den laveste sannsynligheten for at sammenstillingen skjedde tilfeldig. Disse scorene reflekterer derfor i hvilken grad det nye proteinet matcher de ulike referansestrukturene og er anvendelige for å tildele et nytt protein medlemskap i en kjent familie med proteiner. For eksempel vil en sekvens med strukturen for en variabel region til et antistoff forventes å bli sammenstilt med minst én kjent antistoff variabel region med en rimelig høy P-verdi, så som minst ca. 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800 eller høyere.

Betegnelsen "tung kjede" omfatter hvilket som helst immunglobulinpolypeptid som har tilstrekkelig variabel region sekvens til å gi bindingsspesifisitet for IFN-y. Betegnelsen "lett kjede" omfatter hvilket som helst immunglobulinpolypeptid som har tilstrekkelig variabel region sekvens til å gi bindingsspesifisitet for IFN-y. En slik tung- eller lett kjede kan, men trenger ikke, binde til IFN-y i fravær av en lett kjede, hvis den er en tung kjede, eller en tung kjede, hvis den er en lett kjede. En fullengde tung kjede omfatter et variabel region domene, VH og tre konstant region-domener, Ch1, Ch2 og Ch3. VH-domenet er på aminoterminalen av polypeptidet og CH3-domenet er på karboksylterminalen. Betegnelsen "tung kjede", slik den er anvendt heri, omfatter en fullengde tung kjede og fragmenter derav. En fullengde lett kjede omfatter et variabel region domene, Vl, og et konstant region domene, Cl. Som for tung kjede, er variabel region domenet til lett kjede på aminoterminalen av polypeptidet. Betegnelsen "lett kjede", slik den er anvendt heri, omfatter en fullengde lett kjede og fragmenter derav. Et F(ab)-fragment består av én lett kjede og CHi og variable regioner til én tung kjede. Den tunge kjeden til et F(ab)-molekyl kan ikke danne en disulfidbinding med et annet tung kjede molekyl. Et F(ab')-fragment inneholder én lett kjede og én tung kjede som inneholder mer av den konstante regionen, mellom Ch1- og CH2-domenene, slik at en interkjededisulfidbinding kan dannes mellom to tunge kjeder for å danne et F(ab')2-molekyl. Fv-regionen omfatter de variable regionene til både de tunge og lette kjedene, men mangler de konstante regionene. Enkeltkjedede antistoffer er Fv-molekyler hvor de tung- og lett kjede variable regionene er forbundet med en fleksibel linker for å danne en enkel polypeptidkjede, som danner en antigenbindende region. Enkeltkjedede antistoffer er beskrevet i detalj i internasjonal patentsøknad publikasjon nr. WO 88/01649 og U.S. patent nr. 4.946.778 og 5.260.203.

Foreliggende oppfinnelse omfatter også fullstendig humane, humaniserte og kimæriske antistoffer. Som ment heri, omfatter fullstendig humane antistoffer aminosyresekvenser bare kodet for av polynukleotider som opprinnelig er av human opprinnelse eller aminosyresekvenser som er identiske med slike sekvenser. Som ment heri, er antistoffer kodet for av humant immunglobulin-kodende DNA satt inn i et musegenom produsert i en transgen mus fullstendig humane antistoffer, siden de er kodet for av DNA som opprinnelig er av human opprinnelse. I dette tilfellet kan humant immunglobulin-kodende DNA rearrangeres (til å kode for et antistoff) i musen og somatiske mutasjoner kan også forekomme. Antistoffer kodet for av opprinnelig humant DNA som har gjennomgått slike endringer i en mus er fullstendig humane antistoffer som ment heri. Anvendelse av slike transgene mus gjør det mulig å selektere fullstendig humane antistoffer mot et humant antigen. I naturen er ikke dette mulig i de fleste tilfeller, siden en human immunrespons mot et selv-antigen vanligvis ikke forekommer. En fagperson på området vil forstå at fullstendig humane antistoffer er fordelaktige for anvendelse som terapeutika, spesielt for behandling av kroniske sykdommer, siden det er usannsynlig at de fremskynder en immunrespons mot seg selv. Derimot er mange ikke-humane antistoffer kjent for å fremskynde en immunrespons mot seg selv når anvendt i mennesker, en situasjon som gjør kronisk anvendelse av slike antistoffer i mennesker utilrådelig. Fullstendig humane antistoffer løser således et langvarig problem møtt ved anvendelse av antistoffer for å behandle kroniske tilstander, omfattende sykdommer hos menneske. Se f.eks. Billiau, 1988, Immunol. Today 9:37-40; Horneff et al., 1991, Clin. Immunol. & Immunopathol. 59:89-103; Tjandra et al., 1990, Immunol & Cell Biol. 68:367-76. Derfor er fullstendig humane anti-IFN-y antistoffer spesielt godt egnet for behandling av kroniske human IFN-y medierte sykdommer, så som autoimmune sykdommer.

I et humanisert antistoff er hele antistoffet, bortsett fra CDR'ene, kodet for av et polynukleotid av human opprinnelse eller er identisk med et slikt antistoff bortsett fra i CDR'ene. CDR'ene, som kodes for av nukleinsyrer som kommer fra en ikke-human organisme, blir overført til p-lagstruktur i en human antistoff variabel region for å lage et antistoff, der spesifisiteten til dette antistoffet er bestemt av de overførte CDR'ene. Dannelse av slike antistoffer er f.eks. beskrevet i WO 92/11018, Jones et al., 1986, 321:522-25, Verhoeyen et al., 1988, Science 239:1534-36. Dette arbeidet understreker den sentrale viktigheten av CDR'ene i dannelse av et antigenbindingssete. Et kimærisk antistoff omfatter en human konstant region (som er kodet for av et polynukleotid av human opprinnelse eller er identisk med en slik human konstant region) og en ikke-human variabel region. Dannelse av slike antistoffer er beskrevet i f.eks. US patent nr. 5.681.722.

Et bivalent antistoff forskjellig fra et "multispesifikt" eller "multifunksjonelt" antistoff,

i visse utførelsesformer, er forstått å omfatte bindingsseter med identisk antigenspesifisitet.

Ved vurdering av antistoffbinding og spesifisitet i henhold til foreliggende oppfinnelse, binder et antistoff spesifikt og/eller vesentlig hemmer adhesjon av et IFN-y til dets reseptor når et overskudd av antistoff reduserer mengden av reseptor bundet til IFN-y, eller vice versa, med minst ca. 20%, 40%, 60%, 80%, 85% eller mer (som målt i en kompetitiv bindingstest in vitro). Et spesifikt bindende antistoff kan forventes å ha en likevektsdissosiasjonskonstant for binding til IFN-y på mindre enn eller lik 10-<8>molar, eventuelt mindre enn eller lik 10-<9>eller 10-<10>molar.

For terapeutisk anvendelse er en viktig karakteristisk egenskap for et anti-IFN-y antistoff hvorvidt det kan hemme eller modulere den biologiske aktiviteten til IFN-y. IFN-y har mange forskjellige biologiske effekter, som kan måles i mange ulike tester i ulike celletyper. Evnen et anti-IFN-y antistoff har til å hemme eller modulere den biologiske aktiviteten til IFN-y kan måles ved anvendelse av A549-testen beskrevet i Eksempel 6 nedenfor eller ved anvendelse av en lignende test hvor evnen et antistoff har til å reversere hemming av celleproliferasjon observert i nærvær av IFN-y blir målt. For at testen skal gi meningsfulle resultater, må proliferasjon av cellene anvendt i testen hemmes av IFN-y anvendt i testen. Humant IFN-y kan hemme proliferasjon av noen celletyper, omfattende A549- celler (Eksempel 6 og 7). Murint IFN-y kan hemme proliferasjon av RAW 264.7 celler (Eksempel 7), men ikke A549-celler. Særlig når man tester evnen et antistoff har til å hemme eller modulere den biologiske aktiviteten til et ikke-humant IFN-y, kan andre celletyper enn A549-celler anvendes, siden ikke-humant IFN-y kan eller ikke kan være i stand til å hemme proliferasjon av A549-celler. Ikke hvert antistoff som binder spesifikt til et antigen kan blokkere antigenbinding til dets normale reseptor og således hemme eller modulere de biologiske effektene av antigenet ved binding til dets reseptor. Som kjent på området, kan en slik effekt være avhengig av hvilken del av antigenet antistoffet binder til og både absolutte og relative konsentrasjoner av antigenet og antistoffet, i dette tilfellet IFN-y og anti-IFN-y antistoffet. For å bli betraktet som kapabel for hemming eller modulering av den biologiske aktiviteten til IFN-y som ment heri, må et antistoff være i stand til å reversere hemming av celleproliferasjon observert i nærvær av IFN-y, som målt ved fluorescens i A549-testen (Eksempel 6) eller en lignende test, med minst ca. 20%, 40%, 60%, 80%, 85%, 100% eller mer når IFN-y-konsentrasjonen er innenfor et område, for eksempel ved ca. ECso eller EC90, der effektene av et middel som hemmer dets biologiske aktivitet lett kan observeres. ECso, som ment heri, er mengden av IFN-y nødvendig for at 80% av den maksimale effekten av IFN-y skal observeres. Hvis IFN-y konsentrasjonen er godt over EC90, kan effekter av et hemmende middel være mindre åpenbare pga. overskuddet av IFN-y. Konsentrasjonen av et antistoff nødvendig for å hemme eller modulere den biologiske aktiviteten til IFN-y kan variere vidt og avhenge av hvor tett antistoffet binder til IFN-y. For eksempel kan ett molekyl eller mindre av et antistoff pr. IFN-y molekyl være tilstrekkelig for å hemme eller modulere biologisk aktivitet i A549-testen. I noen utførelsesformer kan et forhold av IFN-y:antistoff på ca. 2:1,1:1,1:2, 1:4, 1:6, 1:8, 1:10, 1:20, 1:40, 1:60, 1:100 eller 1:50.000 være nødvendig for å hemme eller modulere den biologiske aktiviteten til IFN-y når IFN-y konsentrasjonen er fra ca. EC50til ca. EC90. Forhold av IFN-y:antistoff mellom disse verdiene er også mulig.

I videre utførelsesformer kan antistoffvarianter omfatte antistoffer omfattende et modifisert Fc-fragment eller en modifisert tung kjede konstant region. Et Fc-fragment, som betyr "fragment som krystalliserer", eller en tung kjede konstant region kan modifiseres ved mutasjon for å gi et antistoff endrede karakteristika. Se for eksempel Burton og Woof, 1992, Advances in Immunology 51: 1-84; Ravetch og Bolland, 2001, Annu. Rev. Immunol. 19: 275-90; Shields et al., 2001, Journal of Biol. Chem. 276: 6591-6604; Telleman og Junghans, 2000, Immunology 100: 245-251; Medesan et al., 1998, Eur. J. Immunol. 28: 2092-2100; der alle er inntatt heri med referanse). Slike mutasjoner kan omfatte substitusjoner, addisjoner, delesjoner eller hvilken som helst kombinasjon derav og blir normalt dannet ved setedirigert mutagenese ved anvendelse av ett eller flere mutagene oligonukleotider i henhold til fremgangsmåter beskrevet heri, så vel som i henhold til fremgangsmåter kjent på området (se for eksempel Maniatis et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 3. utg., 2001, Cold Spring Harbor, N.Y. og Berger og Kimmel, METHODS IN ENZYMOLOGY, Volum 152, Guide to Molecular Cloning Techniques, 1987, Academic Press, Inc., San Diego,

CA.

I visse utførelsesformer omfatter antistoffvarianter glykosyleringsvarianter der antall og/eller type glykosyleringssete er endret sammenlignet med aminosyresekvensene til forelderpolypeptidet. I visse utførelsesformer omfatter proteinvarianter et større eller et mindre antall N-koblede glykosyleringsseter enn det native proteinet. Et N-koblet glykosyleringssete erkarakterisert vedsekvensen: Asn-X-Ser eller Asn-X-Thr, der aminosyreresiduet betegnet X kan være hvilket som helst aminosyreresidue unntatt prolin. Substitusjon av aminosyreresiduer for å lage denne sekvensen tilveiebringer et potensielt nytt sete for addisjon av en N-koblet karbohydratkjede. Alternativt vil substitusjoner som eliminerer denne sekvensen fjerne en eksisterende N-koblet karbohydratkjede. Også fremskaffet er en rearrangering av N-koblede karbohydratkjeder der ett eller flere N-koblede glykosyleringsseter (typisk de som er naturlig forekommende) elimineres og ett eller flere nye N-koblede seter dannes. Ytterligere foretrukne antistoffvarianter omfatter cysteinvarianter der ett eller flere cysteinresiduer er fjernet fra eller substituert for en annen aminosyre (f.eks. serin) sammenlignet med forelderaminosyresekvensen. Cysteinvarianter kan være anvendelige når antistoffer må bli foldet på nytt til en biologisk aktiv konformasjon, så som etter isolering av uløselige inklusjonslegemer. Cysteinvarianter har generelt færre cysteinresiduer enn det native proteinet og har normalt likt antall for å begrense interaksjoner som følger av uparede cysteiner.

Betegnelsen "middel" blir anvendt heri for å betegne en kjemisk forbindelse, en blanding av kjemiske forbindelser, et biologisk makromolekyl eller et ekstrakt laget fra biologiske materialer.

Slik de er anvendt heri, henviser betegnelsene "markør" eller "merket" til innføring av en detekterbar markør, f.eks. ved innføring av en radioaktivt merket aminosyre, eller feste til et polypeptid eller nukleinsyre av en fluorescerende markør, en kjemiluminescerende markør eller et enzym som har en detekterbar aktivitet, eller feste til et polypeptid av biotingrupper som kan detekteres ved merket avidin (f.eks. streptavidin fortrinnsvis omfattende en detekterbar markør så som en fluorescerende markør, en kjemiluminescerende markør eller en enzymatisk aktivitet som kan detekteres bl.a. ved optiske eller kolorimetriske fremgangsmåter). I visse utførelsesformer kan markøren også være terapeutisk. Ulike fremgangsmåter for merking av polypeptider og glykoproteiner er kjent på området og kan fordelaktig anvendes i fremgangsmåtene beskrevet heri. Eksempler på markører for polypeptider omfatter, men er ikke begrenset til, følgende: radioisotoper eller radionuklider (f.eks. 3H, 14C,15N, 35S,90Y, 99mTc,111 In,<125>l,<131>1), fluorescerende markører (f.eks. fluoresceinisotiocyanat eller FITC, rhodamin eller lantanidfosforer), enzymatiske markører (f.eks. pepperrotperoksidase, p-galaktosidase, luciferase, alkalisk fosfatase), kjemiluminescerende markører, haptenmarkører så som biotinylgrupper og predeterminerte polypeptidepitoper gjenkjent av en sekundær rapportør (f.eks. leucin-zipper-par sekvenser, bindingsseter for sekundære antistoffer, metallbindende domener eller epitopmarkører). I visse utførelsesformer er markører bundet ved forbindelsesledd (så som (Chbjn, der n < ca. 20) med ulike lengder for å redusere potensiell sterisk hindring.

Betegnelsen "biologisk prøve", slik den er anvendt heri, omfatter, men er ikke begrenset til, hvilken som helst mengde av en substans fra et levende vesen eller tidligere levende vesen. Slike levende vesener omfatter, men er ikke begrenset til, mennesker, mus, aper, rotter, kaniner og andre dyr. Slike substanser omfatter, men er ikke begrenset til, blod, serum, urin, celler, organer, vev, bein, beinmarg, lymfeknuter og hud.

Betegnelsen "farmasøytisk middel eller medikament", slik den er anvendt heri, henviser til en kjemisk forbindelse eller sammensetning som kan indusere en ønsket terapeutisk effekt når administrert på en egnet måte til en pasient.

Betegnelsen "IFN-y mediert sykdom" omfatter, men er ikke begrenset til, inflammatoriske, infeksiøse og autoimmune sykdommer. En "autoimmun sykdom", slik det er anvendt heri, henviser til sykdomstilstander og forhold der en pasients immunrespons er rettet mot pasientens egne bestanddeler. For eksempel omfatter IFN-y medierte sykdommer, men er ikke begrenset til, ervervet immunsviktsyndrom (AIDS), revmatoid artritt omfattende j uven i I revmatoid artritt, inflammatoriske tarmsykdommer omfattende ulcerøs kolitt og Crohns sykdom, multippel sklerose, Addisons sykdom, diabetes (type I), epididymitt, glomerulonefritt, Graves sykdom, Guillain-Barrés syndrom, Hashimotos sykdom, hemolytisk anemi, systemisk lupus erythematosus (SLE), lupus nefritt, myasthenia gravis, pemfigus, psoriasis, psoriasisartritt, aterosklerose, erytropoietinresistens, transplantat-mot-vert-reaksjon, transplantatrejeksjon, autoimmun hepatitt-indusert leverskade, biliær cirrhose, alkohol-indusert leverskade omfattende alkoholisk cirrhose, revmatisk feber, sarkoidose, skleroderm, Sjogrens syndrom, spondylartropatier omfattende ankyloserende spondylitt, tyreoiditt og vaskulitt. Betegnelsen "IFN-y mediert sykdom" omfatter også en hvilken som helst medisinsk tilstand assosiert med økte nivåer av IFN-y eller økt sensitivitet for IFN-Y-

Behandling av en IFN-y mediert sykdom, omfattende en autoimmun sykdom, omfatter lindring av minst ett symptom av forstyrrelsen, en reduksjon i alvorlighetsgraden av sykdommen eller forsinkelse eller forebyggelse av progresjon til en mer alvorlig sykdom som forekommer med viss hyppighet etter den behandlede tilstanden. Behandling trenger ikke å bety at sykdommen blir helt kurert. Et anvendelig terapeutisk middel behøver bare å redusere alvorlighetsgraden av en sykdom, redusere alvorlighetsgraden av et symptom eller symptomer assosiert med sykdommen eller dens behandling, eller forbedre en pasients livskvalitet, eller forsinke debuten av en mer alvorlig sykdom som kan forekomme med viss hyppighet etter den behandlede tilstanden. Hvis for eksempel sykdommen er en revmatoid artritt, kan et terapeutisk middel redusere hevelse av ledd, redusere antall ledd affisert eller forsinke eller hemme beintap. En SLE-pasient kan blant annet ha symptomer så som hudlesjoner, feber, svakhet, artritt, lymfadenopati, plevritt, perikarditt og/eller anemi. Slike symptomer kan vurderes ved hvilken som helst av flere konvensjonelle teknikker omfattende for eksempel visuell observasjon, fotografi, måling av temperatur, gripestyrke eller leddstørrelse og/eller mikroskopisk undersøkelse av blod for å bestemme konsentrasjonen av røde blodceller. Det er mulig å administrere til en pasient plaget av en IFN-y mediert sykdom et IFN-y antistoff ifølge foreliggende oppfinnelse i en mengde og for en varighet tilstrekkelig for å indusere en vedvarende forbedring i forhold til utgangsnivå av en indikator som reflekterer alvorlighetsgraden av en spesiell forstyrrelse eller alvorlighetsgraden av symptomer forårsaket ved forstyrrelsen eller for å forsinke eller forebygge debut av en mer alvorlig sykdom som følger den behandlede tilstanden i noen eller alle tilfeller. Det er mulig å anvende denne behandlingen med andre terapeutiske midler før, etter og/eller under behandling med IFN-y antistoffet.

Slik det er anvendt heri, betyr "vesentlig ren" eller "vesentlig renset" en forbindelse eller en type forbindelse som er den dominerende foreliggende forbindelsen (dvs. på et molart grunnlag er den mer rikelig enn hvilken som helst annen individuell forbindelse i sammensetningen). I visse utførelsesformer er en vesentlig renset fraksjon en sammensetning der forbindelsen omfatter minst ca. 50 prosent (på et molart grunnlag) av alle foreliggende makromolekylære forbindelser. I visse utførelsesformer vil en vesentlig ren sammensetning omfatte mer enn ca. 80%, 85%, 90%, 95% eller 99% av alle makromolare forbindelser foreliggende i sammensetningen. I visse utførelsesformer er forbindelsen renset til vesentlig homogenitet (kontaminerende forbindelser kan ikke detekteres i sammensetningen ved konvensjonelle deteksjonsmetoder), der sammensetningen består i alt vesentlig av en enkel makromolekylær forbindelse.

Betegnelsen "pasient" omfatter mennesker og dyr.

Hvis det ikke på annen måte er nødvendig ut i fra konteksten, skal entallsbetegnelser omfatte flertall.

Fordi IFN-y er et cytokin med multiple funksjoner, omfattende å beskytte kroppen fra viral infeksjon og regulere flere aspekter av immunresponsen, kan økt IFN-y aktivitet bidra til flere patologiske tilstander. I henhold til visse utførelsesformer av oppfinnelsen kan antistoffer rettet mot IFN-y bli anvendt for å behandle IFN-y medierte sykdommer, omfattende, men ikke begrenset til, de nevnt ovenfor.

Det er tilveiebrakt fullstendig humane monoklonale antistoffer fremskaffet mot og med biologisk og immunologisk spesifisitet for spesifikk binding til humant IFN-y. Variable regioner (SEKV ID NR:6, SEKV ID NR:8, SEKV ID NR:10, SEKV ID NR:12, SEKV ID NR:14, SEKV ID NR:16, SEKV ID NR:30 og SEKV ID NR:31) omfattet i slike antistoffer, fullstendig tunge og lette kjeder av slike antistoffer (SEKV ID NR:17, SEKV ID NR:18, SEKV ID NR:19, SEKV ID NR:20, SEKV ID NR:21 og SEKV ID NR:22) og antistoffer omfattende spesifikke CDR'er (tung og lett kjede CDR1, CDR2 og/eller CDR3; SEKV ID NR:34 til og med SEKV ID NR:44) er beskrevet heri. Spesielle utførelsesformer av dette aspektet er sekvenser som svarer til CDR'er, spesifikt fra CDR1 til og med CDR3, til tunge og lette kjeder fremskaffet ved oppfinnelsen. Videre omfattes antistoffer omfattende en CDR3-sekvens beskrevet heri (SEKV ID NR:36, SEKV ID NR:37, SEKV ID NR:43 og/eller SEKV ID NR:44) som også kan inneholde sekvenser minst 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% eller ca. 99% identisk med hvilken som helst av variabel region sekvensene eller fullstendig tung eller lett kjede sekvensene beskrevet heri, der antistoffet kan hemme eller modulere den biologiske aktiviteten til IFN-y.

I et annet aspekt tilveiebringer oppfinnelsen isolerte polynukleotider som koder for antistoffene ifølge foreliggende oppfinnelse. Antistoffer ifølge foreliggende oppfinnelse kan binde spesifikt til og/eller hemme eller modulere den biologiske aktiviteten til IFN-y. Polynukleotidene omfattende nukleotidsekvenser som koder foraminosyresekvensene SEKV ID NR: 17, SEKV ID NR: 18, SEKV ID NR: 19,

SEKV ID NR:20, SEKV ID NR:21, SEKV ID NR:22, SEKV ID NR:32, SEKV ID

NR:33, SEKV ID NR:5, SEKV ID NR:7, SEKV ID NR:9, SEKV ID NR:11, SEKV ID

NR: 13, SEKV ID NR: 15, SEKV ID NR:30, SEKV ID NR:31 og/eller sekvenser som kan være minst 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% eller ca. 99% identisk med disse sekvensene, der sammenstillingen mellom sekvensene ovenfor og testsekvensen spenner over minst ca. 50, 60, 70, 80, 90 eller 100 aminosyrer. Polynukleotidene kan omfatte SEKV ID NR:45, SEKV ID NR:46, SEKV ID NR:47 og/eller SEKV ID NR:48, som koder for antistoffer som kan binde spesifikt til og/eller hemme eller modulere den biologiske aktiviteten til IFN-y. Polynukleotidene er minst 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% eller ca. 99% identisk med SEKV ID NR:5, SEKV ID NR:7, SEKV ID NR:9, SEKV ID NR:11, SEKV ID NR:13, SEKV ID NR:15, SEKV ID NR:30, SEKV ID NR:31, SEKV ID NR:17, SEKV ID NR:18, SEKV ID NR:19, SEKV ID NR:20, SEKV ID NR:21, SEKV ID NR:22, SEKV ID NR:32 eller SEKV ID NR:33, der et antistoff kodet for delvis av hver av disse polynukleotidene kan hemme eller modulere den biologiske aktiviteten til og/eller binde spesifikt til IFN-y og der sammenstillingen mellom nukleotidsekvensene nevnt umiddelbart ovenfor og testsekvensen spenner over minst ca. 100, 150 eller 200 nukleotider.

Tabell 2 gir en kort beskrivelse av sekvensene etter hvordan de relaterer til deres sekvensidentifikasjonsnumre.

Hybridomceller og cellelinjer kan uttrykke immunglobulinmolekylene og antistoffene ifølge foreliggende oppfinnelse, eventuelt monoklonale antistoffer. I ytterligere et aspekt kan en hybridomcelle eller en celle fra en cellelinje som uttrykker og/eller utskiller et immunglobulinmolekyl eller antistoff ifølge foreliggende oppfinnelse implanteres i en pasient, hvorved et antistoff ifølge oppfinnelsen eller immunologisk funksjonelt immunglobulinfragment derav blir uttrykt og/eller utskilt i pasienten, som dermed hemmer eller modulerer IFN-y aktivitet.

Biologisk og immunologisk rensede fremstillinger av antistoffer kan oppnåes, fortrinnsvis monoklonale antistoffer fremskaffet mot og med biologisk og immunologisk spesifisitet for å binde spesifikt til humant IFN-y.

Evne til å klone og rekonstruere humane loki av megabase-størrelse i gjær-kunstige-kromosomer (YACer) og å innføre dem i kimbanen til mus tillater utvikling av en fordelaktig tilnærming for å forstå de funksjonelle komponentene av veldig store eller grovt kartlagte loki, så vel som generering av anvendelige modeller av human sykdom. Videre gir utnyttelse av slik teknologi for substitusjon av museloki med deres humane ekvivalenter unik innsikt i ekspresjon og regulering av humane genprodukter i løpet av utvikling, deres kommunikasjon med andre systemer og deres involvering i sykdomsinduksjon og progresjon.

En viktig praktisk applikasjon av en slik strategi er forandringen av det humorale immunsystemet hos mus ved innføring av humane immunglobulin (Ig)-loki i mus hvor de endogene lg-genene er inaktivert. Internasjonal søknad nr. WO 93/12227. Dette systemet sørger for mulighet til å studere mekanismer bak programmert ekspresjon og montering av antistoffer så vel som deres rolle i B-celleutvikling. Videre tilveiebringer en slik strategi en kilde for produksjon av fullstendig humane monoklonale antistoffer (MAb'er). Fullstendig humane MAb'er er forventet å begrense de immunogene og allergiske responsene som normalt forekommer mot mus eller musavledede MAb'er, og for dermed å øke effektiviteten og sikkerheten av de administrerte antistoffene. Fullstendig humane antistoffer kan anvendes i behandling av kroniske og tilbakevendende sykdommer hos menneske, så som osteoartritt, revmatoid artritt og andre inflammatoriske tilstander, der behandling derav krever gjentatt antistoffadministrering. Derfor er én spesiell fordel med anti-IFN-y antistoffene ifølge foreliggende oppfinnelse at antistoffene er fullstendig humane og kan administreres til pasienter på en ikke-akutt måte, mens man minimaliserer ugunstige reaksjoner mye forbundet med mus anti-humane antistoffer eller andre tidligere beskrevne ikke-fullstendig humane antistoffer eller ikke-humane antistoffer fra ikke-humane arter.

Ved å anvende fremgangsmåter angitt heri, kan en fagperson konstruere musestammer som mangler museantistoffproduksjon med store fragmenter av de humane lg-lokiene, så at slike mus produserer humane antistoffer i fravær av museantistoffer. Store humane lg-fragmenter kan bevare det store variable genmangfoldet så vel som den riktige regulering av antistoffproduksjon og ekspresjon. Ved å utnytte det cellulære maskineriet hos mus for antistoffvariasjon og seleksjon og mangel på immunologisk toleranse for humane proteiner, gir det reproduserte humane antistoffrepertoaret i disse musestammene høyaffinitetsantistoffer mot hvilket som helst antigen av interesse, omfattende humane antigener. Ved å anvende hybridomteknologien, kan antigenspesifikke humane MAb'er med ønsket spesifisitet produseres og selekteres.

I visse utførelsesformer kan fagpersonen anvende konstante regioner fra andre arter enn menneske sammen med human variabel region(er) i slike mus for å produsere kimæriske antistoffer.

Naturlig forekommende antistoffstruktur

De fleste naturlig forekommende antistoffstrukturenhetene omfatter normalt en tetramer. Hver slik tetramer er normalt sammensatt av to identiske par av polypeptidkjeder, der hvert par har én fullengde "lett" kjede (normalt med en molekylvekt på ca. 25 kDa) og én fullengde "tung" kjede (normalt med en molekylvekt på ca. 50-70 kDa). Den aminoterminale delen av hver lett og tung kjede omfatter normalt en variabel region på ca. 100 til 110 eller flere aminosyrer som normalt er ansvarlig for antigengjenkjennelse. Den karboksyterminale delen av hver kjede definerer normalt en konstant region ansvarlig for effektorfunksjon. Humane lette kjeder er normalt klassifisert som kappa og lambda lette kjeder. Tunge kjeder er normalt klassifisert som mu, delta, gamma, alfa eller epsilon og definerer antistoffets isotype som henholdsvis IgM, IgD, IgG, IgA og IgE. IgG har flere underklasser, inkludert, men ikke begrenset til, lgG1, lgG2, lgG3 og lgG4. IgM har underklasser omfattende, men ikke begrenset til, lgM1 og lgM2. IgA er på liknende måte delt inn i underklasser omfattende, men ikke begrenset til, lgA1 og lgA2. I fullengde lette og tunge kjeder er de variable og konstante regionene normalt forbundet med en "J" region på ca. 12 eller flere aminosyrer, med tung kjede også omfattende en "D" region på ca. 10 flere aminosyrer. Se f.eks. FUNDAMENTAL IMMUNOLOGY, kap. 7, 2. utg., (Paul, W., red.), 1989, Raven Press, N.Y. De variable regionene av hvert par av lett/tung kjede danner normalt antigenbindingssetet.

Noen naturlig forekommende antistoffer, som er funnet i kameler og lamaer, er dimerer bestående av to tunge kjeder og omfatter ingen lette kjeder. Muldermans et al., 2001, J. Biotechnol. 74:277-302; Desmyter et al., 2001, J. Biol. Chem. 276:26285-90. Dimeriske antistoffer kan bestå av to tunge kjeder som kan binde til og/eller hemme den biologiske aktiviteten til IFN-y. En krystallografistudie av et kamelantistoff har avslørt at tung kjede CDR3, som er 19 aminosyrer lang, danner en overflate som interagerer med antigenet og dekker de to andre hypervariable regionene. Desmyter et al., supra. Derfor er CDR3 viktig for antigenbinding i dimeriske kamelantistoffer, så vel som i de mer vanlige tetramere antistoffene.

De variable regionene har normalt den samme generelle strukturen av relativt konserverte strukturregioner (FR) forbundet ved tre hypervariable regioner, også kalt komplementaritetsbestemmende regioner eller CDR'er. CDR'ene fra de to kjedene av hvert par ligger normalt rundt strukturregionene, som kan muliggjøre binding til en spesifikk epitop. Fra N-terminal til C-terminal omfatter både lett og tung kjede variable regioner normalt domenene FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 og FR4. Anvisning av aminosyrer til hvert domene er normalt i henhold til definisjonene ifølge Kabat et al., som er forklart i mer detalj nedenfor. Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest (1991, National Institutes of Health, Bethesda, MD); se også Chothia & Lesk, 1987, J. Mol. Biol. 196:901-917; Chothia et al., 1989, Nature 342:878-883. CDR'er innehar de fleste overflatekontaktpunktene for antigenbinding. Se f.eks. Chothia og Lesk, supra. Videre kan CDR3 i lett kjede og spesielt CDR3 i tung kjede utgjøre de viktigste determinantene i antigenbinding i lett og tung kjede variable regioner. Se f.eks. Chothia og Lesk, supra; Desiderio et al. (2001), J. Mol. Biol. 310: 603-15; Xu og Davis (2000), Immunity 13(1): 37-45; Desmyter et al. (2001), J. Biol. Chem. 276(28): 26285-90; og Muyldermans (2001), J. Biotechnol. 74(4): 277-302. I noen antistoffer synes tung kjede CDR3 å utgjøre det viktigste kontaktområdet mellom antigenet og antistoffet. Desmyter et al., supra. In wfro-seleksjonsskjemaer hvor CDR3 alene blir variert kan anvendes for å variere bindingsegenskapene til et antistoff. Muyldermans, supra; Desiderio, supra.

CDR'er kan lokaliseres i en tung kjede variabel region sekvens på følgende måte. CDR1 starter på ca. residue 31 i det modne antistoffet og er vanligvis ca. 5-7 aminosyrer lang og den kommer nesten alltid etter en Cys-Xxx-Xxx-Xxx-Xxx-Xxx-Xxx-Xxx-Xxx (SEKV ID NR:48) (der "Xxx" er hvilken som helst aminosyre). Residuet som kommer etter tung kjede CDR1 er nesten alltid et tryptofan, ofte en Typ-Val, en Trp-lle eller en Trp-Ala. Fjorten aminosyrer er nesten alltid mellom det siste residuet i CDR1 og det første i CDR2, og CDR2 inneholder normalt 16 til 19 aminosyrer. CDR2 kan komme umiddelbart etter Leu-Glu-Trp-lle-Gly (SEKV ID NR:49) og kan bli umiddelbart etterfulgt av Lys/Arg-Leu/lleA/al/Phe/Thr/Ala- Thr/Ser/Ile/Ala. Andre aminosyrer kan komme før eller etter CDR2. Trettito aminosyrer er nesten alltid mellom det siste residuet i CDR2 og det første i CDR3, og CDR3 kan være fra ca. 3 til 25 residuer lang. En Cys-Xxx-Xxx kommer nesten alltid umiddelbart før CDR3 og en Trp-Gly-Xxx-Gly (SEKV ID NR:50) kommer nesten alltid etter CDR3.

Lett kjede CDR'er kan lokaliseres i en lett kjede sekvens på følgende måte. CDR1 starter på ca. residue 24 i det modne antistoffet og er vanligvis ca. 10 til 17 residuer lang. Den kommer nesten alltid etter et Cys. Det er nesten alltid 15 aminosyrer mellom det siste residuet i CDR1 og det første residuet i CDR2, og CDR2 er nesten alltid 7 residuer lang. CDR2 kommer normalt etter Ile-Tyr, Val-Tyr, Ile-Lys eller Ile-Phe. Det er nesten alltid 32 residuer mellom lett kjede CDR2 og CDR3, og CDR3 er vanligvis ca. 7 til 10 aminosyrer lang. CDR3 kommer nesten alltid etter Cys og er vanligvis etterfulgt av Phe-Gly-Xxx-Gly (SEKV ID NR:51).

En fagperson på området vil forstå at lengdene av strukturregioner som omgir CDR'ene kan inneholde insersjoner eller delesjoner som gjør at deres lengde er forskjellig fra det som er normalt. Som ment heri, kan lengden til tung kjede strukturregioner deles inn i de følgende områdene: FR1, 0 til 41 aminosyrer; FR2, 5 til 24 aminosyrer; FR3, 13 til 42 aminosyrer; og FR4, 0 til 21 aminosyrer. Videre kontemplerer oppfinnelsen at lengdene av lett kjede strukturregioner kan deles inn i de følgende områdene: FR1, 6 til 35 aminosyrer; FR2, 4 til 25 aminosyrer; FR3, 2 til 42 aminosyrer; og FR4, 0 til 23 aminosyrer.

Naturlig forekommende antistoffer omfatter normalt en signalsekvens, som styrer antistoffet til den cellulære veien for proteinsekresjon og som ikke foreligger i det modne antistoffet. Et polynukleotid som koder for et antistoff ifølge foreliggende oppfinnelse kan kode for en naturlig forekommende signalsekvens eller en heterolog signalsekvens som beskrevet nedenfor.

In wfro-modning av antistoffer

Antistoffer kan modnes in vitro for å gi antistoffer med endrede egenskaper, så som en høyere affinitet for et antigen eller en lavere dissosiasjonskonstant. Variasjon av kun residuer i CDR'ene, spesielt CDR3'ene, kan resultere i endrede antistoffer som binder til det samme antigenet, men med større affinitet. Se f.eks. Schier et al., 1996, J. Mol. Biol. 263:551-67; Yang et al., 1995, J. Mol. Biol. 254:392-403. Oppfinnelsen omfatter antistoffer dannet ved mange in vitro-seleksjonsskjemaer, så som affinitetsmodning og/eller kjedeutbytting (Kang et al., 1991, Proe. Nati. Acad. Sei. 88:11120-23) eller DNA-utbytting (Stemmer, 1994, Nature 370:389-391), som kan brukes for å selektere antistoffer med fordelaktige egenskaper. I mange skjemaer blir et kjent antistoff randomisert på visse posisjoner, ofte i CDR'ene, in vitro og utsatt for en seleksjonsprosess hvorved antistoffer med ønskede egenskaper, så som økt affinitet for et visst antigen, kan isoleres. Se f.eks. van den Beucken et al., 2001, J. Mol. Biol. 310:591-601; Desiderio et al., 2001, J. Mol. Biol. 310:603-15; Yang et al., 1995, J. Mol. Biol. 254:392-403; Schier et al., 1996, J. Mol. Biol. 263:551-67. Slike muterte antistoffer kan normalt omfatte flere endrede residuer i én eller flere CDR'er, avhengig av utformingen av mutagenese- og seleksjonstrinnene. Se f.eks. van den Beucken et al., supra.

Bispesifikke eller bifunksjonelle antistoffer

Et bispesifikt eller bifunksjonelt antistoff er typisk et kunstig hybridantistoff som har to ulike par av tung kjede/lett kjede og to ulike bindingsseter. Bispesifikke antistoffer kan produseres ved mange fremgangsmåter omfattende, men ikke begrenset til, fusjon av hybridomer eller binding av F(ab')-fragmenter. Se f.eks. Songsivilai & Lachmann, 1990, Clin. Exp. Immunol. 79:315-321; Kostelny et al., 1992, J. Immunol. 148:1547-1553.

Fremstilling av antistoffer

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer antistoffer som binder spesifikt til humant IFN-y. Disse antistoffene kan produseres ved immunisering med fullengde IFN-y eller fragmenter derav. Antistoffene ifølge foreliggende oppfinnelse kan være polyklonale eller monoklonale og/eller kan være rekombinante antistoffer. I visse utførelsesformer blir fullstendig humane antistoffer ifølge foreliggende oppfinnelse fremstilt for eksempel ved immunisering av transgene dyr som kan produsere humane antistoffer (se for eksempel internasjonal patentsøknad, publikasjon WO 93/12227).

CDR'ene i lett kjede og tung kjede variable regioner av anti-IFN-y antistoffer ifølge foreliggende oppfinnelse kan overføres til strukturregioner (FR'er) fra den samme eller en annen art. I visse utførelsesformer kan CDR'ene i lett kjede og tung kjede variable regioner av anti-IFN-y antistoff overføres til konsensus humane FR'er for å lage et "humanisert" antistoff. Slike humaniserte antistoffer er omfattet av foreliggende oppfinnelse. For å skape konsensus humane FR'er, blir FR'er fra flere humane tung kjede eller lett kjede aminosyresekvenser sammenstilt for å identifisere en konsensus aminosyresekvens. FR'ene i anti-IFN-y antistoff tung kjede eller lett kjede kan byttes ut med FR'ene fra en ulik tung kjede eller lett kjede. Sjeldne aminosyrer i FR'ene av de tunge og lette kjedene til anti-IFN-y antistoff byttes normalt ikke ut, mens resten av FR-aminosyrene kan byttes ut. Sjeldne aminosyrer er spesifikke aminosyrer som er i posisjoner hvor de vanligvis ikke er funnet i FR'er. De overførte variable regionene fra anti-IFN-y antistoffer ifølge foreliggende oppfinnelse kan anvendes med en konstant region som er forskjellig fra en opprinnelig konstant region av et anti-IFN-y antistoff. Alternativt er de overførte variable regionene del av et enkeltkjedet Fv-antistoff. CDR-overføring er beskrevet f.eks. i U.S. patent nr. 6.180.370, 5.693.762, 5.693.761, 5.585.089 og 5.530.101.

Antistoffer ifølge foreliggende oppfinnelse kan fremstilles ved anvendelse av transgene mus som har en vesentlig del av det humane antistoffproduserende lokuset satt inn i antistoffproduserende celler i musene, og som er videre modifisert for å være defekt i produksjon av endogene, murine antistoffer. Slike mus kan produsere humane immunglobulinmolekyler og antistoffer og produserer ikke eller produserer vesentlig reduserte mengder av murine immunglobulinmolekyler og antistoffer. Teknologier anvendt for å oppnå dette resultatet er beskrevet i patentene, søknadene og referansene beskrevet i spesifiseringen heri. I visse utførelsesformer kan en fagperson utnytte fremgangsmåter som beskrevet i internasjonal patentsøknad publikasjon nr. WO 98/24893, som herved er inntatt ved referanse for hvilket som helst formål. Se også Mendez et al., 1997, Nature Genetics 15:146-156.

De monoklonale antistoffene (mAb'ene) ifølge foreliggende oppfinnelse kan produseres ved mange teknikker, omfattende konvensjonell monoklonalt antistoff-metodologi, f.eks. standard somatisk celle hybridiseringsteknikk ifølge Kohler og Milstein (1975, Nature 256:495). Selv om somatisk celle hybridiseringsprosedyrer er foretrukket, kan i prinsippet andre teknikker for produksjon av monoklonale antistoffer anvendes, f.eks. viral eller onkogen transformasjon av B-lymfocytter.

Ett mulig dyresystem for å fremstille hybridomer er mus. Hybridomproduksjon i mus er veldig godt etablert, og immuniseringsprotokoller og teknikker for isolering av immuniserte splenocytter for fusjon er velkjent på området. Fusjonspartnere (f.eks. murine myelomceller) og fusjonsprosedyrer er også kjent.

I noen utførelsesformer kan fullstendig humane monoklonale antistoffer rettet mot IFN-y, eventuelt humant IFN-y, genereres ved anvendelse av transgene mus som bærer deler av det humane immunsystemet i stedet for musesystemet. Disse transgene musene, henvist til heri som "HuMab"-mus, inneholder et humant immunglobulingen-minilokus som koder for ikke-rearrangerte humane tung (n og y) og k lett kjede immunglobulinsekvenser, sammen med målstyrte mutasjoner som inaktiverer de endogene n- og K-kjedeloki (Lonberg et al., 1994, Nature 368:856-859). Følgelig oppviser musene redusert ekspresjon av mus IgM eller k, og i respons til immunisering gjennomgår de innførte humane tung kjede og lett kjede transgenene klasse-skifting og somatisk mutasjon for å generere høyaffinitets humane IgG k monoklonale antistoffer (Lonberg et al., supra. ; Lonberg og Huszar, 1995, Intern. Rev. Immunol. 13:65-93; Harding og Lonberg, 1995, Ann. N.Y. Acad. Sei. 764:536-546). Fremstilling av HuMab-mus er beskrevet i detalj i Taylor et al., 1992, Nucleic Acids Res. 20:6287-6295; Chen et al., 1993, International Immunology 5:647-656; Tuaillon et al., 1994, J. Immunol. 152:2912-2920; Lonberg et al., 1994, Nature 368:856-859; Lonberg, 1994, Handbook of Exp. Pharmacology 113:49-101; Taylor et al., 1994, International Immunology 6:579-591; Lonberg & Huszar, 1995, Intern. Rev. Immunol. 13:65-93; Harding & Lonberg, 1995, Ann. N.Y. Acad. Sei 764:536-546; Fishwild et al., 1996, Nature Biotechnology 14:845-851. Se videre U.S. patent nr. 5.545.806; 5.569.825; 5.625.126; 5.633.425; 5.789.650; 5.877.397; 5.661.016; 5.814.318; 5.874.299; og 5.770.429; alle til Lonberg og Kay, så vel som U.S. patent nr. 5.545.807 til Surani et al.; internasjonal patentsøknad publikasjon nr. WO 93/1227, publisert 24. juni, 1993; WO 92/22646, publisert 23. desember, 1992; og WO 92/03918, publisert 19. mars, 1992. Alternativt kan HCo7 og HCo12 transgene musestammer beskrevet i Eksemplene nedenfor anvendes for å generere humane anti-IFN-y antistoffer.

I disse utførelsesformene binder antistoffene ifølge foreliggende oppfinnelse spesifikt til IFN-y med en likevektsdissosiasjonskonstant (Kd) på mindre enn 10-<7>M, 10-<8>M, 10-<9>M eller 10-<10>M. I visse utførelsesformer binder antistoffene til IFN-y med en Kdpå mellom omtrent 10"<8>M og 10"<12>M.

I foretrukne utførelsesformer er antistoffene ifølge foreliggende oppfinnelse av lgG1-, lgG2- eller lgG4-isotype. Antistoffene kan være av lgG1-isotypen. I andre utførelsesformer er antistoffene ifølge foreliggende oppfinnelse av IgM-, IgA-, IgE-eller IgD-isotype. I foretrukne utførelsesformer ifølge foreliggende oppfinnelse omfatter antistoffene en human kappa lett kjede og en human lgG1 tung kjede. Ekspresjon av antistoffer ifølge foreliggende oppfinnelse omfattende en lgG1 tung kjede konstant region er beskrevet i Eksemplene nedenfor. I spesielle utførelsesformer er de variable regionene i antistoffene ligert til en konstant region forskjellig fra den konstante regionen for lgG1-isotypen. I visse utførelsesformer er antistoffene ifølge foreliggende oppfinnelse klonet for ekspresjon i mammalske celler.

I visse utførelsesformer vil konservative modifikasjoner til de tunge og lette kjedene av anti-IFN-y antistoff (og tilsvarende modifikasjoner til de kodende nukleotidene) produsere anti-IFN-y antistoffer som har lignende funksjonelle og kjemiske karakteristika som anti-IFN-y antistoff. Derimot kan vesentlige modifikasjoner i de funksjonelle og/eller kjemiske karakteristikaene av anti-IFN-y antistoff utføres ved å velge substitusjoner i aminosyresekvensen til de tunge og lette kjedene som er signifikant forskjellige i deres effekt på opprettholdelse av (a) strukturen til den molekylære ryggraden i området for substitusjon, for eksempel som et p-lag eller helisk konformasjon, (b) ladningen eller hydrofobisiteten av molekylet på målsetet eller (c) den framstikkende delen av sidekjeden.

En "konservativ aminosyresubstitusjon" kan for eksempel involvere en substitusjon av et nativt aminosyreresidue med et ikke-nativt residue, slik at det er liten eller ingen effekt på polaritet eller ladning til aminosyreresiduet på den posisjonen. Videre kan hvilket som helst nativt residue i polypeptidet også substitueres med alanin, som tidligere beskrevet for "alaninskanningmutagenese".

Ønskede aminosyresubstitusjoner (enten konservative eller ikke-konservative) kan bestemmes av fagfolk når slike substitusjoner er ønsket. I visse utførelsesformer kan aminosyresubstitusjoner anvendes for å identifisere viktige residuer i anti-IFN-y antistoff eller for å øke eller redusere affiniteten til anti-IFN-y antistoffene beskrevet heri.

I alternative utførelsesformer kan antistoffer ifølge foreliggende oppfinnelse uttrykkes i cellelinjer forskjellige fra hybridomcellelinjer. I disse utførelsesformene kan sekvenser som koder for spesielle antistoffer anvendes for transformasjon av en egnet mammalsk vertscelle. I henhold til disse utførelsesformene kan transformasjon oppnås ved anvendelse av hvilken som helst kjent fremgangsmåte for innføring av polynukleotider i en vertscelle, omfattende for eksempel pakking av polynukleotidet i et virus (eller inn i en viral vektor) og transdusere en vertscelle med viruset (eller vektoren) eller ved transfeksjonsprosedyrer kjent på området, som illustrert ved U.S. pat. nr. 4.399.216, 4.912.040, 4.740.461 og 4.959.455. Generelt kan den anvendte transformasjonsprosedyren være avhengig av verten som skal transformeres. Fremgangsmåter for innføring av heterologe polynukleotider i mammalske celler er velkjent på området og omfatter, men er ikke begrenset til, dekstranmediert transfeksjon, kalsiumfosfatpresipitering, polybrenmediert transfeksjon, protoplastfusjon, elektroporering, innkapsling av polynukleotid(er) i liposomer og direkte mikroinjeksjon av DNA'et inn i kjerner. Nukleinsyremolekyler (eller polynukleotider) som koder for aminosyresekvensen til en tung kjede konstant region, en tung kjede variabel region, en lett kjede konstant region eller en lett kjede variabel region i et anti-IFN-y antistoff ifølge foreliggende oppfinnelse er omfattet av oppfinnelsen. Slike polynukleotider kan settes inn i en passende ekspresjonsvektor ved anvendelse av standard ligeringsteknikker. I en foretrukket utførelsesform blir et polynukleotid som koder for anti-IFN-y antistoff tung kjede eller lett kjede konstant region festet til nedstrømsenden av et polynukleotid som koder for den passende variable regionen og blir ligert inn i en ekspresjonsvektor. Vektoren blir normalt valgt for å være funksjonell i den spesielle vertscellen som blir anvendt (dvs. vektoren er kompatibel med vertscellemaskineriet slik at amplifisering av genet og/eller ekspresjon av genet kan forekomme). For en oversikt over ekspresjonsvektorer, se METH. ENZ. 185 (Goeddel, red.), 1990, Academic Press.

Ekspresjonsvektorer anvendt i hvilken som helst av vertscellene vil normalt inneholde sekvenser for plasmidopprettholdelse og for kloning og ekspresjon av eksogene nukleotidsekvensen Slike sekvenser, samlet henvist til som "flankerende sekvenser" i visse utførelsesformer, vil normalt omfatte én eller flere av de følgende nukleotidsekvensene: en promoter, én eller flere enhancersekvenser, en replikasjonsorigo, en transkripsjonsstoppsekvens, en fullstendig intronsekvens inneholdende et donor- og akseptorspleissete, en sekvens som koder for en ledersekvens for polypeptidsekresjon, et ribosombindingssete, en polyadenyleringssekvens, en polylinkerregion for innsetning av nukleinsyren som koder for polypeptidet som skal uttrykkes og et selekterbart markørelement. Hver av disse sekvensene er beskrevet nedenfor.

Vektoren kan eventuelt inneholde en "markør"-kodende sekvens, dvs. et oligonukleotidmolekyl lokalisert på 5' eller 3' enden av den anti-IFN-y antistoffpolypeptidkodende sekvensen; oligonukleotidsekvensen koder for polyHis (slik som heksaHis) eller en annen "markør" så som FLAG, HA (hemaglutinin influensavirus) eller mye, som det eksisterer kommersielt tilgjengelige antistoffer for. Denne markøren blir normalt fusjonert til polypeptidet ved ekspresjon av polypeptidet og kan fungere som en måte for affinitetsrensing eller deteksjon av IFN-y antistoffet fra vertscellen. Affinitetsrensing kan for eksempel utføres ved kolonnekromatografi ved anvendelse av antistoffer mot markøren som en affinitetsmatriks. Markøren kan deretter eventuelt fjernes fra det rensede anti-IFN-y antistoffpolypeptidet ved ulike måter, så som anvendelse av visse peptidaser for kutting.

Flankerende sekvenser kan være homologe (dvs. fra samme art og/eller stamme som vertscellen), heterologe (dvs. fra en art forskjellig fra vertscellearten eller - stammen), hybrid (dvs. en kombinasjon av flankerende sekvenser fra mer enn én kilde), syntetisk eller nativt. Derfor kan kilden til en flankerende sekvens være hvilken som helst prokaryot eller eukaryot organisme, hvilken som helst vertebrat eller invertebrat organisme eller hvilken som helst plante, forutsatt at den flankerende sekvensen er funksjonell i, og kan aktiveres av, vertscellemaskineriet.

Flankerende sekvenser anvendelige i vektorene ifølge foreliggende oppfinnelse kan fremskaffes ved hvilken som helst av flere fremgangsmåter velkjent på området. Normalt vil flankerende sekvenser anvendelige heri ha blitt tidligere identifisert ved kartlegging og/eller ved restriksjonsendonukleasekutting og kan således isoleres fra den egnede vevskilden ved anvendelse av de passende restriksjonsendonukleasene. I noen tilfeller kan hele nukleotidsekvensen til en flankerende sekvens være kjent. Her kan den flankerende sekvensen syntetiseres ved anvendelse av fremgangsmåtene beskrevet heri for nukleinsyresyntese eller kloning.

Om hele eller bare en del av den flankerende sekvensen er kjent, kan den fremskaffes ved anvendelse av polymerasekjedereaksjon (PCR) og/eller ved screening av et genomisk bibliotek med en egnet probe så som et oligonukleotid og/eller flankerende sekvensfragment fra samme eller en annen art. Der den flankerende sekvensen er ukjent, kan et fragment av DNA inneholdende en flankerende sekvens isoleres fra en større bit av DNA som for eksempel kan inneholde en kodende sekvens eller til og med et annet gen eller gener. Isolering kan utføres ved restriksjonsendonukleasekutting for å produsere det riktige DNA-fragmentet etterfulgt av isolering ved anvendelse av agarosegelrensing, Qiagen® kolonnekromatografi (Chatsworth, CA) eller andre fremgangsmåter kjent for fagpersonen. Valg av egnede enzymer for å utføre dette vil være åpenbart for en fagperson.

En replikasjonsorigo er normalt en del av de prokaryote ekspresjonsvektorene kjøpt kommersielt, og origoen bidrar i amplifisering av vektoren i en vertscelle. Hvis den valgte vektoren ikke inneholder en replikasjonsorigo, kan én syntetiseres kjemisk basert på en kjent sekvens og ligeres inn i vektoren. For eksempel er replikasjonsorigoen fra plasmidet pBR322 (New England Biolabs, Beverly, MA) egnet for de fleste gramnegative bakterier, og ulike virale origoer (f.eks. SV40, polyoma, adenovirus, vesikulært stomatittvirus (VSV) eller papillomavirus så som HPV eller BPV) er anvendelige for kloningsvektorer i mammalske celler. Generelt er ikke replikasjonsorigokomponenten nødvendig for mammalske ekspresjonsvektorer (for eksempel blir SV40-origoen ofte bare anvendt fordi den også inneholder virus tidlig promoter).

En transkripsjonsstoppsekvens er normalt lokalisert 3' i forhold til enden av en polypeptidkodende region og tjener til å terminere transkripsjon. Vanligvis er en transkripsjonsstoppsekvens i prokaryote celler et G-C rikt fragment etterfulgt av en poly-T sekvens. Selv om sekvensen lett blir klonet fra et bibliotek eller til og med kjøpt kommersielt som del av en vektor, kan den også lett syntetiseres ved anvendelse av fremgangsmåter for nukleinsyresyntese slik som de beskrevet heri.

Et selekterbart markørgen koder for et protein nødvendig for overlevelse og vekst av en vertscelle dyrket i et selektivt dyrkningsmedium. Typiske seleksjonsmarkørgener koder for proteiner som (a) gir resistens til antibiotika eller andre toksiner, f.eks. ampicillin, tetrasyklin eller kanamycin for prokaryote vertsceller; (b) kompletterer auxotrofiske mangler i cellen; eller (c) supplerer kritiske næringsstoffer ikke tilgjengelig fra komplekse eller definerte medier. Foretrukne selekterbare markører er kanamycin-, ampicillin- og tetrasyklinresistensgenet. Fordelaktig kan også et neomycinresistensgen anvendes for seleksjon i både prokaryote og eukaryote vertsceller.

Andre selekterbare gener kan anvendes for å amplifisere genet som vil bli uttrykt. Amplifisering er prosessen der gener som er nødvendige for produksjon av et protein kritisk for vekst eller celleoverlevelse blir tatt opp igjen i tandem i kromosomene til suksessive generasjoner av rekombinante celler. Eksempler på egnede selekterbare markører for mammalske celler omfatter dihydrofolatreduktase (DHFR) og tymidinkinasegener uten promoter. Mammalske celletransformanter plasseres under seleksjonstrykk der bare transformantene er unikt tilpasset for å overleve i kraft av det selekterbare genet foreliggende i vektoren. Seleksjon blir utført ved dyrkning av de transformerte cellene under betingelser hvor konsentrasjonen av seleksjonsmiddel i mediet blir økt suksessivt, og dermed fører til amplifisering av både det selekterbare genet og DNAet som koder for et annet gen, så som et antistoff som binder til IFN-y polypeptid. Som et resultat blir økte mengder av et polypeptid så som et anti-IFN-y antistoff syntetisert fra det amplifiserte DNAet.

Et ribosombindingssete er vanligvis nødvendig for translasjonsstart av mRNA og erkarakterisert veden Shine-Dalgarno sekvens (prokaryoter) eller en Kozak-sekvens (eukaryoter). Elementet er normalt lokalisert 3' i forhold til promoteren og 5' i forhold til den kodende sekvensen for polypeptidet som skal uttrykkes.

I noen tilfeller, så som der glykosylering er ønsket i et eukaryot vertscelleekspresjonssystem, kan man manipulere de ulike pre- eller prosekvensene for å bedre glykosylering eller utbytte. Man kan for eksempel forandre peptidasekuttesetet til et spesielt signalpeptid eller tilsette prosekvenser, som også kan affisere glykosylering. Det endelige proteinproduktet kan ha, i -1 posisjonen (i forhold til den første aminosyren i det modne proteinet), én eller flere ekstra aminosyrer beheftet med ekspresjon, som ikke kan ha blitt totalt fjernet. For eksempel kan det endelige proteinproduktet ha ett eller to aminosyreresiduer funnet i peptidasekuttesetet, tilknyttet aminoterminalen. Alternativt kan anvendelse av noen enzymkutteseter resultere i en lett trunkert form av det ønskede polypeptidet, hvis enzymet kutter på slikt område i det modne polypeptidet.

Ekspresjons- og kloningsvektorer ifølge foreliggende oppfinnelse vil normalt inneholde en promoter som blir gjenkjent av vertsorganismen og operabelt bundet til molekylet som koder for anti-IFN-y antistoffet. Promotere er ikke-transkriberte sekvenser lokalisert oppstrøms (dvs. 5') i forhold til startkodonet for et strukturelt gen (generelt mellom ca. 100 til 1000 bp) som kontrollerer transkripsjon av det strukturelle genet. Promotere er konvensjonelt gruppert inn i én av to klasser: induserbare promotere og konstitutive promotere. Induserbare promotere igangsetter økte transkripsjonsnivåer fra DNA under deres kontroll i respons til noen endringer i kulturbetingelser, så som nærvær eller fravær av et næringsstoff eller en forandring i temperatur. Konstitutive promotere, derimot, uforanderlig transkriberer gen som de er operabelt bundet til, dvs. med liten eller ingen kontroll over genekspresjon. Et stort antall promotere, gjenkjent av mange potensielle vertsceller, er velkjente. En egnet promoter er operabelt bundet til DNAet som koder for tung kjede eller lett kjede omfattende et anti-IFN-y antistoff ifølge foreliggende oppfinnelse ved å fjerne promoteren fra kilde-DNAet ved restriksjonsenzymkutting og innsette den ønskede promotersekvensen i vektoren.

Egnede promotere for anvendelse med gjærverter er også velkjent på området. Gjærenhancere blir fordelaktig anvendt med gjærpromotere. Egnede promotere for anvendelse med mammalske vertsceller er velkjente og omfatter, men er ikke begrenset til, de fremskaffet fra genomene til virus så som polyomavirus, fowlpox-virus, adenovirus (så som Adenovirus 2), bovint papillomavirus, fuglesarkomvirus, cytomegalovirus, retrovirus, hepatitt-B virus og mest foretrukket Simian-virus 40 (SV40). Andre egnede mammalske promotere omfatter heterologe mammalske promotere, for eksempel varmesjokkpromotere og aktinpromoteren.

Ytterligere promotere som kan være av interesse omfatter, men er ikke begrenset til: SV40 tidlig promoter (Benoist og Chambon, 1981, Nature 290:304-10); CMV-promoter (Thomsen et al., 1984, Proe. Nati. Acad. USA 81:659-663); promoteren i 3' lang terminal repetisjon av Rous sarkomvirus (Yamamoto, et al., 1980, Cell 22:787-97); herpes tymidinkinase promoter (Wagner et al., 1981, Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A. 78:1444-45); promoter og regulatoriske sekvenser fra metallotioningenet (Brinster et al., 1982, Nature 296:39-42); og prokaryote promotere så som beta-laktamase promoteren (Villa-Kamaroff et al., 1978, Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A, 75:3727-31); eller tac-promoteren (DeBoeret al., 1983, Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A., 80:21-25). Også av interesse er de følgende dyretranskripsjonelle kontrollregionene, som har vevsspesifisitet og er anvendt i transgene dyr: elastase I gen kontrollregionen som er aktiv i acinære celler i pankreas (Swift et al., 1984, Cell 38:639-46; Ornitz et al., 1986, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50:399-409 (1986); MacDonald, 1987, Hepatology 7:425-515); insulingen kontrollregionen som er aktiv i betaceller i pankreas (Hanahan, 1985, Nature 315:115-22); immunglobulingen kontrollregionen som er aktiv i lymfoide celler (Grosschedl et al., 1984, Cell 38:647-58; Adames et al., 1985, Nature 318:533-38; Alexander et al., 1987, Mol. Cell. Biol., 7:1436^4); musebrysttumorvirus kontrollregionen som er aktiv i testikkel-, bryst-, lymfoide- og mastceller (Leder et al., 1986, Cell 45:485-95); albumingen kontrollregionen som er aktiv i lever (Pinkert et al., 1987, Genes and Devel. 1:268-76); alfa-feto-proteingen kontrollregionen som er aktiv i lever (Krumlauf et al., 1985, Mol. Cell. Biol., 5:1639-48; Hammer et al., 1987, Science 235:53-58); alfa 1-antitrypsingen kontrollregionen som er aktiv i lever (Kelsey et al., 1987, Genes and Devel. 1:161-71); beta-globingen kontrollregionen som er aktiv i myeloide celler (Mogram et al., 1985, Nature 315:338^0; Kollias et al., 1986, Cell 46:89-94); myelin basisk proteingen kontrollregionen som er aktiv i oligodendrocyttceller i hjernen (Readhead et al., 1987, Cell 48:703-12); myosin lett kjede-2 gen kontrollregionen som er aktiv i skjelettmuskel (Sani, 1985, Nature 314:283-86); og gonadotropinfrigjørende hormongen kontrollregionen som er aktiv i hypotalamus (Mason et al., 1986, Science 234:1372-78).

En enhancersekvens kan settes inn i vektoren for å øke transkripsjon av DNA som koder for lett kjede eller tung kjede omfattende et anti-IFN-y antistoff ifølge foreliggende oppfinnelse ved høyere eukaryoter. Enhancere er cis-virkende elementer av DNA, vanligvis ca. 10-300 bp lange, som virker på promoteren for å øke transkripsjon. Enhancere er relativt retnings- og posisjonsuavhengige, og er funnet på posisjoner både 5' og 3' i forhold til transkripsjonsenheten. Flere enhancersekvenser tilgjengelig fra mammalske gener er kjent (f.eks. globin, elastase, albumin, alfa-feto-protein og insulin). Imidlertid blir normalt en enhancer fra et virus anvendt. SV40-enhanceren, cytomegalovirus tidlig promoter enhanceren, polyomaenhanceren og adenovirusenhancere kjent på området er eksempler på enhancere for aktivering av eukaryote promotere. Mens en enhancer kan være plassert i vektoren enten 5' eller 3' i forhold til en kodende sekvens, er den normalt lokalisert på et sete 5' fra promoteren.

En sekvens som koder for en passende nativ eller heterolog signalsekvens (ledersekvens eller signalpeptid) kan føres inn i en ekspresjonsvektor, for å fremme ekstracellulær sekresjon av antistoffet. Valget av signalpeptid eller leder avhenger av type vertsceller hvor antistoffet skal produseres, og en heterolog signalsekvens kan erstatte den native signalsekvensen. Eksempler på signalpeptider som er funksjonelle i mammalske vertsceller omfatter følgende: signalsekvensen for interleukin-7 (IL-7) beskrevet i US patent nr. 4.965.195; signalsekvensen for interleukin-2 reseptor beskrevet i Cosman et al. (1984, Nature 312: 768); interleukin-4 reseptor signalpeptidet beskrevet i EP patent nr. 0 367 566; type I interleukin-1 reseptor signalpeptidet beskrevet i U.S. patent nr. 4.968.607; type II interleukin-1 reseptor signalpeptidet beskrevet i EP patent nr. 0 460 846; signalsekvensen til humant IgK (som er METDTLLLVWLLLVWPGSTG; SEKV ID NR:52); signalsekvensen til humant veksthormon (som er MATGSRTSLLLAFGLLCLPWLQEGSA; SEKV ID NR:53); og de humane signalsekvensene MGSTAILALLLAVLQGVCA (SEKV ID NR:54) og METPAQLLFLLLLWLPDTTG (SEKV ID NR:55), som ble kodet for av cDNAer som koder for de tunge og lette kjedene isolert i Eksempel 3.

Ekspresjonsvektorer ifølge foreliggende oppfinnelse kan konstrueres fra en startvektor så som en kommersielt tilgjengelig vektor. Slike vektorer kan eller kan ikke inneholde alle de ønskede flankerende sekvensene. Der én eller flere av de flankerende sekvensene beskrevet heri ikke allerede er til stede i vektoren, kan de fremskaffes individuelt og ligeres inn i vektoren. Fremgangsmåter anvendt for tilveiebringelse av hver av de flankerende sekvensene er velkjent for en fagperson.

Etter at vektoren er konstruert og et nukleinsyremolekyl som koder for lett kjede, en tung kjede eller en lett kjede og en tung kjede som utgjør et anti-IFN-y antistoff er satt inn i det egnede setet av vektoren, kan den komplette vektoren settes inn i en egnet vertscelle for amplifisering og/eller polypeptidekspresjon. Transformasjon av en ekspresjonsvektor for et anti-IFN-y antistoff inn i en valgt vertscelle kan utføres ved velkjente fremgangsmåter omfattende transfeksjon, infeksjon, kalsiumfosfat samutfelling, elektroporering, mikroinjeksjon, lipofeksjon, DEAE-dekstranmediert transfeksjon eller andre kjente teknikker. Den valgte fremgangsmåten vil delvis være en funksjon av vertscelletypen som skal anvendes. Disse fremgangsmåtene og andre egnede fremgangsmåter er velkjent for fagfolk og er for eksempel angitt i Sambrook et al., supra.

En vertscelle, når dyrket under passende betingelser, syntetiserer et anti-IFN-y antistoff som deretter kan oppsamles fra dyrkningsmediet (hvis vertscellen skiller det ut i mediet) eller direkte fra vertscellen som produserer det (hvis det ikke blir utskilt). Valg av en passende vertscelle vil avhenge av ulike faktorer, så som ønskede ekspresjonsnivåer, polypeptidmodifikasjoner som er ønskelig eller nødvendig for aktivitet (så som glykosylering eller fosforylering) og letthet for folding til et biologisk aktivt molekyl.

Mammalske cellelinjer tilgjengelig som verter for ekspresjon er velkjent på området og omfatter, men er ikke begrenset til, udødeliggjorte cellelinjer tilgjengelig fra American Type Culture Collection (ATCC), omfattende, men ikke begrenset til, kinesiske hamstereggstokk (CHO)-celler, HeLa-celler, babyhamsternyre (BHK)-celler, apenyreceller (COS), humane hepatocellulære karsinomceller (f.eks. Hep G2) og flere andre cellelinjer. I visse utførelsesformer kan cellelinjer velges ved å bestemme hvilke cellelinjer som har høye ekspresjonsnivåer og konstitutivt produserer antistoffer med IFN-y bindingsegenskaper. I en annen utførelsesform kan en cellelinje fra B-cellelinjen som ikke lager sitt eget antistoff, men har kapasitet til å lage og skille ut et heterologt antistoff, velges.

Antistoffer ifølge foreliggende oppfinnelse er anvendelige for deteksjon av IFN-y i biologiske prøver og identifisering av celler eller vev som produserer IFN-y protein. Antistoffer ifølge foreliggende oppfinnelse som binder spesifikt til IFN-y kan være anvendelige i behandling av IFN-y medierte sykdommer. Nevnte antistoffer kan anvendes i bindingstester for å detektere IFN-y og for å hemme IFN-y i å danne et kompleks med IFN-y reseptorer. Nevnte antistoffer som binder til IFN-y og blokkerer interaksjon med andre bindende forbindelser kan ha terapeutisk anvendelse i modulering av IFN-y medierte sykdommer. I foretrukne utførelsesformer kan antistoffer til IFN-y blokkere IFN-y binding til dets reseptor, som kan resultere i forstyrrelse av den IFN-y induserte

signaltransduksjonskaskaden.

I noen utførelsesformer tilveiebringer oppfinnelsen farmasøytiske sammensetninger omfattende en terapeutisk effektiv mengde av ett eller flere av antistoffene ifølge foreliggende oppfinnelse sammen med et farmasøytisk akseptabelt fortynningsmiddel, bærer, løseliggjørende middel, emulgator, konserveringsmiddel og/eller adjuvans. Fortrinnsvis er akseptable formuleringsmaterialer ikke-toksiske for mottakere ved doseringene og konsentrasjonene anvendt. I foretrukne utførelsesformer er farmasøytiske sammensetninger omfattende en terapeutisk effektiv mengde av anti-IFN-y antistoffer fremskaffet.

I visse utførelsesformer er akseptable formuleringsmaterialer fortrinnsvis ikke-toksiske for mottakere ved doseringene og konsentrasjonene anvendt.

I visse utførelsesformer kan den farmasøytiske sammensetningen inneholde formuleringsmaterialer for modifisering, opprettholdelse eller preservering av for eksempel pH, osmolaritet, viskositet, klarhet, farge, isotonitet, lukt, sterilitet, stabilitet, dissolusjonshastighet eller frigjøring, adsorpsjon eller penetrering av sammensetningen. I slike utførelsesformer omfatter egnede formuleringsmaterialer, men er ikke begrenset til, aminosyrer (så som glysin, glutamin, asparagin, arginin eller lysin); antimikrobika; antioksidanter (så som askorbinsyre, natriumsulfitt eller natriumhydrogensulfitt); buffere (så som borat, bikarbonat, Tris-HCI, citrater, fosfater eller andre organiske syrer); fyllstoffer (så som mannitol eller glysin); chelaterende midler (så som etylendiamin tetraeddiksyre (EDTA)); kompleksdannere (så som kaffein, polyvinylpyrrolidon, beta-cyklodekstrin eller hydroksypropyl-beta-cyklodekstrin); fyllstoffer; monosakkarider; disakkarider; og andre karbohydrater (så som glukose, mannose eller dekstriner); proteiner (så som serumalbumin, gelatin eller immunglobuliner); farge-, smakstilsetnings- og fortynningsstoffer; emulgatorer; hydrofile polymerer

(så som polyvinylpyrrolidon); lavmolekylære polypeptider; saltdannende mot-ioner (så som natrium); konserveringsmidler (så som benzalkoniumklorid, benzosyre, salisylsyre, thimerosal, fenetylalkohol, metylparaben, propylparaben, klorheksidin, sorbinsyre eller hydrogenperoksyd); løsningsmidler (så som glyserin, propylenglykol eller polyetylenglykol); sukkeralkoholer (så som mannitol eller sorbitol); suspensjonsmidler; overflateaktive midler eller fuktemidler (så som "pluronics", PEG, sorbitanestere, polysorbater så som polysorbat 20, polysorbat 80, triton, trometamin, lecitin, kolesterol, tyloxapal); stabilitetsøkende midler (så som sukrose eller sorbitol); tonisitetsøkende midler (så som

alkalimetallhalogenider, fortrinnsvis natrium eller kaliumklorid, mannitol sorbitol); leveringskonstituenter; fortynningsmidler; hjelpestoffer og/eller farmasøytiske adjuvantia. Se REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 18. utg., (A. R. Gennaro, red.), 1990, Mack Publishing Company.

I visse utførelsesformer vil den optimale farmasøytiske sammensetningen bli bestemt av en fagperson avhengig av for eksempel administreringsveien, leveringsformatet og ønsket dosering. Se for eksempel REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, supra. I visse utførelsesformer kan slike sammensetninger påvirke den fysiske tilstanden, stabiliteten, in vivo-frigjøringshastigheten og in wVo-clearancehastigheten av antistoffene ifølge foreliggende oppfinnelse.

I visse utførelsesformer kan den primære konstituenten eller bæreren i en farmasøytisk sammensetning enten være vandig eller ikke-vandig i naturen. For eksempel kan en egnet konstituent eller bærer være vann for injeksjon, fysiologisk saltvannsløsning eller kunstig cerebrospinalvæske, muligens supplert med andre materialer vanlig i sammensetninger for parenteral administrering. Nøytralt bufret saltvann eller saltvann blandet med serumalbumin er videre eksempler på konstituenter. I foretrukne utførelsesformer omfatter farmasøytiske sammensetninger Tris-buffer ved ca. pH 7,0-8,5 eller acetatbuffer ved ca. pH 4,0-5,5 og kan videre omfatte sorbitol eller et egnet substitutt derav. I visse utførelsesformer ifølge foreliggende oppfinnelse kan anti-IFN-y antistoffsammensetninger fremstilles for lagring ved å blande den valgte sammensetningen som har den ønskede grad av renhet med valgfrie formuleringsmidler (REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, supra) i form av en lyofilisert kake eller en vandig løsning. Videre, i visse utførelsesformer, kan anti-IFN-y antistoffproduktet formuleres som et lyofilisat ved anvendelse av passende hjelpestoffer så som sukrose.

De farmasøytiske sammensetningene ifølge foreliggende oppfinnelse kan velges for parenteral levering. Alternativt kan sammensetningene velges for inhalasjon eller for levering via fordøyelseskanalen, så som oralt. Fremstilling av slike farmasøytisk akseptable sammensetninger er innenfor fagområdet.

Formuleringskomponentene foreligger fortrinnsvis i konsentrasjoner som er akseptable for administreringssetet. I visse utførelsesformer blir buffere anvendt til å opprettholde sammensetningen ved fysiologisk pH eller ved en noe lavere pH, normalt innenfor et pH-område fra ca. 5 til ca. 8.

Når parenteral administrering er kontemplert, kan de terapeutiske sammensetningene for anvendelse i foreliggende oppfinnelse fremskaffes i form av en pyrogenfri, parenteralt akseptabel vandig løsning omfattende det ønskede anti-IFN-y antistoffet i en farmasøytisk akseptabel konstituent. En spesielt egnet konstituent for parenteral injeksjon er sterilt destillert vann hvor anti-IFN-y antistoffet er formulert som en steril, isoton løsning riktig preservert. I visse utførelsesformer kan fremstillingen involvere formulering av det ønskede molekylet med et middel, så som injiserbare mikrosfærer, bio-eroderbare partikler, polymeriske forbindelser (så som polymelkesyre eller polyglykolsyre), kuler eller liposomer, som kan gi forsinket eller langsom frisetting av produktet som kan leveres via depotinjeksjon. I visse utførelsesformer kan også hyaluronsyre anvendes, som har effekten av å fremme langvarig varighet i sirkulasjonen. I visse utførelsesformer kan implanterbare medikamentleveringsanordninger anvendes for å innføre det ønskede antistoffmolekylet.

Farmasøytiske sammensetninger ifølge foreliggende oppfinnelse kan formuleres for inhalasjon. I disse utførelsesformene blir anti-IFN-y antistoffer fordelaktig formulert som et tørt, inhalerbart pulver. I foretrukne utførelsesformer kan også anti-IFN-y antistoff inhalasjonsløsninger formuleres med et drivmiddel for aerosollevering. I visse utførelsesformer kan løsninger nebuliseres. Pulmonal administrering og formuleringsmetoder er derfor videre beskrevet i internasjonal patentsøknad nr. PCT/US94/001875, som er inntatt ved referanse og beskriver pulmonal levering av kjemisk modifiserte proteiner.

Det er også kontemplert at formuleringer kan administreres oralt. Anti-IFN-y antistoffer som blir administrert på denne måten kan formuleres med eller uten bærere sedvanlig anvendt i formuleringen av faste doseringsformer så som

tabletter og kapsler. I visse utførelsesformer kan en kapsel utformes til å frisette den aktive delen av formuleringen ved punktet i mage/tarm-kanalen når biotilgjengelighet er maksimert og pre-systemisk nedbrytning er minimert. Ytterligere midler kan inkluderes for å lette absorpsjon av anti-IFN-y antistoffet. Fortynningsmidler, smakstilsetninger, lavtsmeltende voks, vegetabilske oljer, smøremidler, suspensjonsmidler, tablettdesintegrerende midler og bindemidler kan også anvendes.

En farmasøytisk sammensetning ifølge foreliggende oppfinnelse er fortrinnsvis fremskaffet til å omfatte en effektiv mengde av ett eller flere anti-IFN-y antistoffer i en blanding med ikke-toksiske hjelpestoffer som er egnet for produksjon av tabletter. Ved å løse opp tablettene i sterilt vann, eller en annen passende konstituent, kan løsninger fremstilles i enhetsdoseform. Egnede hjelpestoffer omfatter, men er ikke begrenset til, inerte fortynningsmidler, så som kalsiumkarbonat, natrium karbonat eller bikarbonat, laktose eller kalsiumfosfat; eller bindemidler, så som stivelse, gelatin eller akasie; eller smøremidler, så som magnesiumstearat, stearinsyre eller talkum.

Ytterligere farmasøytiske sammensetninger vil være tydelig for fagfolk, omfattende formuleringer som involverer anti-IFN-y antistoffer i langsomme- eller forsinkede leveringsformuleringer. Teknikker for formulering av en rekke andre langsomme-eller forsinkede leveringsmåter, så som liposombærere, bio-eroderbare mikropartikler eller porøse kuler og depotinjeksjoner, er også kjent for fagfolk. Se for eksempel internasjonal patentsøknad nr. PCT/US93/00829, som er inntatt ved referanse og beskriver forsinket frisetting av porøse polymermikropartiklerfor levering av farmasøytiske sammensetninger. Langsomme frisettingsfremstillinger kan omfatte semipermeable polymermatrikser i form av formede artikler, f.eks. filmer eller mikrokapsler. Langsomme frisettingsmatrikser kan omfatte polyestere, hydrogeler, polylaktider (som beskrevet i U.S. patent nr. 3.773.919 og europeisk patentsøknad publikasjon nr. EP 058481), kopolymerer av L-glutaminsyre og gamma etyl-L-glutamat (Sidman et al., 1983, Biopolymers 22:547-556), poly (2-hydroksyetyl-metakrylat) (Langer et al., 1981, J. Biomed. Mater. Res. 15:167-277 og Langer, 1982, Chem. Tech. 12:98-105), etylenvinylacetat (Langer et al., supra) eller poly-D(-)-3-hydroksysmørsyre (europeisk patentsøknad publikasjon nr. EP 133.988). Langsomme frisettingssammensetninger kan også omfatte liposomer som kan fremstilles ved hvilken som helst av flere fremgangsmåter kjent på området. Se f.eks. Eppstein et al., 1985, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 82:3688-3692; europeisk patentsøknad publikasjon nr. EP 036.676; EP 088.046 og EP 143.949.

Farmasøytiske sammensetninger anvendt for in wVo-administrering blir normalt fremskaffet som sterile fremstillinger. Sterilisering kan oppnås ved filtrering gjennom sterile filtreringsmembraner. Når sammensetningen er lyofilisert, kan sterilisering ved anvendelse av denne fremgangsmåten utføres enten før eller etter lyofilisering og rekonstitusjon. Sammensetninger for parenteral administrering kan lagres i lyofilisert form eller i en løsning. Parenterale sammensetninger plasseres generelt i en beholder med en steril adgangsventil, for eksempel en intravenøs løsningsbag eller rør som har en stengeanordning gjennomtrengbar med en hypodermisk injeksjonsnål.

Når den farmasøytiske sammensetningen er formulert, kan den lagres i sterile rør som en løsning, suspensjon, gel, emulsjon, fast stoff, krystall eller som et dehydrert eller lyofilisert pulver. Slike formuleringer kan enten lagres i en klar-til-bruk form eller i en form (f.eks. lyofilisert) som blir rekonstituert før administrering.

Testsett kan dannes for å produsere en enkeltdose-administreringsenhet. Testsettene kan hver inneholde både en første beholder med et tørket protein og en andre beholder med en vandig formulering. Testsett inneholdende enkelt- og flerkamrede forhåndsfylte sprøyter (f.eks. væskesprøyter og lyosprøyter) kan fremskaffes.

Den terapeutisk effektive mengden av en anti-IFN-y antistoffinneholdende farmasøytisk sammensetning som skal anvendes vil for eksempel avhenge av den terapeutiske konteksten og målet. En fagperson på området vil forstå at de passende doseringsnivåene for behandling vil variere avhengig, delvis, av molekylet levert, indikasjonen som anti-IFN-y antistoffet anvendes for, administreringsveien og størrelsen (kroppsvekt, kroppsoverflate eller organstørrelse) og/eller tilstanden (alder og generell helse) hos pasienten. I visse utførelsesformer kan klinikeren titrere doseringen og modifisere administreringsveien for å oppnå den optimale terapeutiske effekten. En normal dosering kan variere fra ca. 0,1 ug/kg til opp til ca. 30 mg/kg eller mer, avhengig av faktorene nevnt ovenfor. I foretrukne utførelsesformer kan doseringen variere fra 0,1 ug/kg opp til ca. 30 mg/kg, eventuelt fra 1ug/kg opp til ca. 30 mg/kg eller fra 10 ug/kg opp til ca. 5 mg/kg.

Doseringsfrekvens vil avhenge av de farmakokinetiske parametrene av det spesielle anti-IFN-y antistoffet i formuleringen anvendt. En kliniker administrerer normalt sammensetningen inntil en dosering er nådd som oppnår den ønskede effekten. Sammensetningen kan derfor administreres som en enkel dose, eller som to eller flere doser (som kan eller kan ikke inneholde den samme mengden av det ønskede molekylet) over tid, eller som en kontinuerlig infusjon via en implanteringsanordning eller kateter. Videre justeringer av den passende doseringen blir rutinemessig gjort av fagfolk på området og er innenfor virkefeltet av oppgaver rutinemessig utført av dem. Passende doseringer kan bestemmes gjennom anvendelse av passende doseresponsdata. I visse utførelsesformer kan antistoffene ifølge foreliggende oppfinnelse administreres til pasienter i løpet av en lengre tidsperiode. Kronisk administrering av et antistoff ifølge foreliggende oppfinnelse minimerer den ugunstige immun- eller allergiresponsen mye forbundet med antistoffer som blir fremskaffet mot et humant antigen i et ikke-humant dyr, for eksempel et ikke-fullstendig humant antistoff eller ikke-humant antistoff produsert i en ikke-human art.

Administreringsveien for den farmasøytiske sammensetningen er ifølge kjente fremgangsmåter, f.eks. oralt, gjennom injeksjon ved intravenøs, intraperitoneal, intracerebral (intra-parenkymal), intracerebroventrikulær, intramuskulær, intra-okulær, intraarteriell, intraportal eller intralesjonal vei; ved langsomme frisettingssystemer eller ved implanteringsanordninger. I visse utførelsesformer kan sammensetningene administreres ved bolusinjeksjon eller kontinuerlig ved infusjon eller ved implanteringsanordning.

Sammensetningen kan også administreres lokalt via implantering av en membran, svamp eller et annet passende materiale som det ønskede molekylet er absorbert eller innkapslet på. I visse utførelsesformer, der en implanteringsanordning blir anvendt, kan anordningen implanteres i hvilket som helst egnet vev eller organ, og levering av det ønskede molekylet kan skje via diffusjon, "timed-release" bolus eller kontinuerlig administrering.

Det kan også være ønskelig å anvende anti-IFN-y antistoff farmasøytiske sammensetninger ifølge oppfinnelsen ex vivo. I slike tilfeller blir celler, vev eller organer som er fjernet fra pasienten eksponert for anti-IFN-y antistoff farmasøytiske sammensetninger og deretter blir cellene, vevene og/eller organene implantert tilbake i pasienten.

Spesielt kan anti-IFN-y antistoffer leveres ved implantering av visse celler som er genetisk modifisert, ved anvendelse av fremgangsmåter så som de beskrevet heri, for å uttrykke og utskille polypeptidet. I visse utførelsesformer kan slike celler være dyre- eller menneskeceller og kan være autologe, heterologe eller xenogene. I visse utførelsesformer kan cellene være udødeliggjort. I andre utførelsesformer, for å redusere muligheten for en immunologisk respons, kan cellene innkapsles for å unngå infiltrering av omkringliggende vev. I videre utførelsesformer er innkapslingsmaterialene normalt biokompatible, semi-permeable polymer-inneslutninger eller membraner som tillater frisetting av proteinprodukt(ene) men forebygger destruksjon av cellene ved pasientens immunsystem eller ved andre skadelige faktorer fra de omkringliggende vevene.

EKSEMPLER

De følgende eksemplene, inkludert eksperimentene utført og resultater oppnådd, er fremskaffet for illustrative formål.

Eksempel 1

Generering av humant IFN-y protein fra CHO-celler

Fullengde humant IFN-y cDNA ble amplifisert ved PCR (under standard betingelser) ved anvendelse av human milt Marathon-Ready cDNA (Clontech) som et templat. Sekvensen ble subklonet inn i pDSRa2-plasmidet. DH10B ( Escherichia coli) celler ble transformert med pDSRa2-plasmidet. DNA ble fremstilt ved anvendelse av standard teknikker og CHO-celler ble transfektert ved kalsiumfosfatmetoden (Speciality Media, Inc.). En cellelinjeklon med høy ekspresjon ble anvendt for å generere serumfritt kondisjonert medium.

CHO-cellekondisjonert medium inneholdende humant IFN-y (hu-IFN-y var konsentrert, dialysert og renset gjennom flere kromatografitrinn. Det første trinnet var Q-HP (Pharmacia) kromatografi ved anvendelse av en standard NaCI-gradient for å separere sterkt glykosylerte fra ikke-glykosylerte hu-IFN-y former. Oppsamlingen etter Q-HP kromatografi ble videre renset ved hvetekimagglutinin-kromatografi (EY Laboratories). Det rensede materialet ble separert ved SDS-polyakrylamid gelelektroforese (SDS-PAGE) og analysert ved Coomassie-blå og sølvfarging. Det rensede materialet var mer enn 95% rent, som bestemt ved både Coomassie-blå og sølvfarget SDS-PAGE. Materialet ble også undersøkt ved "gel-clot" metoden (Limulus Amebocyte Lysate), som antydet et lavt endotoksinnivå. Identiteten av hu-IFN-y ble bekreftet ved Western blotting ved anvendelse av anti-AF-285 NA-antistoff fra R&D Systems. Endelig proteinkonsentrasjon ble bestemt fra absorbans (A280) ved anvendelse av ekstinksjonskoeffisientmetoden, der A280avlesing/ekstinksjonskoeffisient = konsentrasjon i g/l (ekstinksjonskoeffisient = 0,66).

Eksempel 2

Produksjon av humane monoklonale antistoffer mot IFN-y

Transgene HuMab-mus

Fullstendig humane monoklonale antistoffer til IFN-y ble fremstilt ved anvendelse av HCo7, HCo12 og HCo7+HCo12 stammer av transgene mus, som hver uttrykte humane antistoffgener. I hver av disse stammene er endogent mus kappa lett kjede gen homozygotisk ødelagt som beskrevet i Chen et al. (1993, EMBO J. 12:811-820) og endogent mus tung kjede gen er homozygotisk ødelagt som beskrevet i Eksempel 1 i internasjonal patentsøknad publikasjon nr. WO 01/09187. Hver stamme hadde et humant kappa lett kjede transgen, KCo5, som beskrevet i Fishwild et al. (1996, Nature Biotechnology 14:845-851). HCo7-stammen har HCo7 humant tung kjede transgen som beskrevet i U.S. patent nr. 5.545.806, 5.625.825 og 5.545.807. HCo12-stammen hadde HCo12 humant tung kjede transgenet som beskrevet i Eksempel 2 i internasjonal patentsøknad publikasjon nr. WO 01/09187. HCo7+HCo12 stammen hadde både HCo7 og HCo12 tung kjede transgenene og var hemizygotisk for hvert transgen. Alle disse stammene henvises til heri som HuMab-mus.

HuMab-immuniseringer:

For å generere fullstendig humane monoklonale antistoffer til IFN-y, HuMab-mus ble immunisert med renset rekombinant humant IFN-y avledet fra E. coli- eller CHO-celler som antigen. Generelle immuniseringsskjemaer for HuMab-mus er beskrevet i Lonberg et al. (1994, Nature 368:856-859; Fishwild et al., supra, og internasjonal patentsøknad publikasjon nr. WO 98/24884. Mus var 6-16 uker gamle ved første antigeninfusjon. En renset rekombinant fremstilling (25-100 ug) av IFN-y antigen (f.eks. renset fra transfekterte E. coli- eller CHO-celler som uttrykker IFN-y) ble anvendt til å immunisere HuMab-musene intraperitonealt (IP) eller subkutant (Sc).

Immuniseringer av HuMab transgene mus ble utført ved anvendelse av antigen i komplett Freunds adjuvans og to injeksjoner, etterfulgt av 2-4 uker IP immunisering (opp til totalt 9 immuniseringer) med antigenet i ikke-komplett Freunds adjuvans. Flere dusin mus ble immunisert for hvert antigen (humant IFN-y produsert i enten E. coli- eller CHO-celler). Totalt 91 mus av HCo7, HCo12 og HCo7+HCo12 stammene ble immunisert med IFN-y. Immunresponsen ble monitorer! ved retroorbitale blodprøver.

For å velge HuMab-mus som produserer antistoffer som bandt IFN-y, ble sera fra immuniserte mus testet ved ELISA som beskrevet av Fishwild et al. supra. Kort fortalt ble mikrotiterplater belagt med renset rekombinant IFN-y fra CHO-celler eller E. coli ved 1-2 ul/ml i PBS og 50 ul/brønn inkubert ved 4°C natten over, deretter blokkert med 200 ul/brønn av 5% kyllingserum i PBS/Tween (0,05%). Fortynninger av plasma fra IFN-y immuniserte mus ble satt til hver brønn og inkubert i 1-2 timer ved omgivelsestemperatur. Platene ble vasket med PBS/Tween og deretter inkubert med et geit-anti-humant IgG Fc-spesifikt polyklonalt reagens konjugert til pepperrotperoksidase (HRP) i 1 time ved romtemperatur. Plater ble vasket med PBS/Tween og inkubert med et geit anti-humant IgG Fc-spesifikt polyklonalt reagens konjugert til pepperrotperoksidase (HRP) i 1 time ved romtemperatur. Etter vask ble platene utviklet med ABTS-substrat (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, katalog nr. A-1888, 0,22 mg/ml) og analysert spektrofotometrisk ved å bestemme optisk densitet (OD) ved bølgelengder fra 415-495 nm. Mus med tilfredsstillende titere av anti-IFN-y humant immunglobulin ble anvendt for å produsere monoklonale antistoffer som beskrevet nedenfor.

Generering av hybridomer som produserer humane monoklonale antistoffer til IFN-y

Mus ble fremstilt for produksjon av monoklonalt antistoff ved boostinjeksjon med antigen intravenøst 2 dager før avliving, og milter ble deretter fjernet. Musesplenocyttene ble isolert fra HuMab-musene og fusjonert med PEG til en musemyelomcellelinje ved anvendelse av standard protokoller. Typisk ble 10-20 fusjoner utført for hvert antigen.

Kort fortalt ble enkeltcellesuspensjoner av miltlymfocytter fra immuniserte mus fusjonert til en fjerdedel av antallet av P3X63-Ag8.653 ikke-utskillende musemyelomceller (ATCC, aksesjonsnummer CRL 1580) med 50% PEG (Sigma). Celler ble overført ved ca. 1x10<5>/brønn i flatbunnede mikrotiterplater, etterfulgt av ca. en to ukers inkubasjon i selektivt medium inneholdende 10% føtalt bovint serum, 10% P388D1- (ATCC, aksesjonsnummer CRL TIB-63) kondisjonert medium, 3-5% ORIGEN® hybridomkloningsfaktor (IGEN), et delvis renset hybridomvekstmediumsupplement avledet fra medium anvendt til å dyrke en murin makrofagliknende cellelinje, i DMEM (Mediatech, katalog nr. CRL 10013, ved høy glukose, L-glutamin og natriumpyruvat) pluss 5 mM HEPES, 0,055 mM 2-merkaptoetanol, 50 mg/ml gentamycin og 1x HAT (Sigma, katalog nr. CRL P-7185). Etter 1-2 uker ble celler dyrket i medium hvor HAT var byttet ut med HT.

De resulterende hybridomene ble screenet for produksjon av antigenspesifikke antistoffer. Individuelle brønner ble screenet ved ELISA (beskrevet ovenfor) for humane anti-IFN-y monoklonale IgG-antistoffer. Når omfattende hybridomvekst forekom, ble medium monitorert, vanligvis etter 10-14 dager. Antistoffutskillende hybridomer ble replatet, screenet igjen og, hvis fortsatt positive for humant IgG, ble anti-IFN-y monoklonale antistoffer subklonet minst to ganger ved seriefortynning. De stabile subklonene ble deretter dyrket in vitro for å generere små mengder av antistoff i vevsdyrkningsmedium for rensing og karakterisering.

Seleksjon av humane monoklonale antistoffer som binder til IFN-y

En ELISA-test som beskrevet ovenfor ble anvendt til å screene for hybridomer som viste positiv reaktivitet med IFN-y immunogen. Hybridomer som utskiller et monoklonalt antistoff som bandt med høy aviditet til IFN-y ble subklonet og viderekarakterisert. Én klon fra hvert hybridom, som beholdt reaktiviteten til forelderceller (som bestemt ved ELISA), ble valgt for å lage en 5-10 rørs cellebank lagret i flytende nitrogen.

En isotypespesifikk ELISA ble utført for å bestemme isotypen av de monoklonale antistoffene produsert som beskrevet heri. I disse eksperimentene ble mikrotiterplatebrønner belagt med 50ul/brønn av en løsning av 1ug/ml mus anti-human kappa lett kjede i PBS og inkubert ved 4°C natten over. Etter blokkering med 5% kyllingserum ble platene reagert med supernatant fra hvert testede monoklonale antistoff og en renset isotypekontroll. Plater ble inkubert ved omgivelsestemperatur i 1-2 timer. Brønnene ble deretter reagert med enten humant lgG1 eller lgG3-spesifikk pepperrotperoksidase-konjugert geit anti-humane polyklonale antisera, og plater ble utviklet og analysert som beskrevet ovenfor.

Monoklonale antistoffer renset fra hybridomsupernatantene som viste signifikant binding til IFN-y, som detektert ved ELISA, ble videre testet for biologisk aktivitet ved anvendelse av en rekke biotester som beskrevet nedenfor. Antistoffene valgt ble kalt 1119, 1121, 1118*, 1121<*>og 1118.

Eksempel 3

Kloning av anti-IFN-y antistoff tunge og lette kjeder

Hybridomene som uttrykker IFN-y-bindende monoklonale antistoffer 1119, 1121, 1118* 1121 * og 1118 identifisert i Eksempel 2 ovenfor ble anvendt som kilder for å isolere totalt RNA ved anvendelse av TRIzol® reagens (Invitrogen), en monofasisk løsning av fenol og guanidinisotiocyanat egnet for isolering av totalt RNA, DNA og protein. Første tråd cDNA ble syntetisert ved anvendelse av en random primer med et forlengelsesadapter (5'-GGC CGG ATA GGC CTC CAN NNN NNT-3') (SEKV ID NR:23) og en 5' RACE (rask amplifisering av cDNA-ender) preparativ test ble utført ved anvendelse av GENERACER™ testsettet (Invitrogen), et testsett for rask amplifisering av cDNA-ender (RACE) med forbedret effektivitet, i henhold til instruksjoner fra produsenten. For fremstilling av fullstendig lett kjede-kodende cDNA var fremoverprimeren GENERACER™ "nested" primer og den reverse primeren var 5'-GGG GTC AGG CTG GAA CTG AGG-3' (SEKV ID NR:24). Den reverse primeren ble utformet til å gjenkjenne en konservert region av cDNA-sekvensen funnet i den 3' ikke-translaterte regionen av humane kappa-kjeder. For å fremstille cDNA som koder for den variable regionen av de tunge kjedene, var fremoverprimeren GENERACER™ "nested" primer og den reverse primeren var 5'-TGA GGA CGC TGA CCA CAC G-3' (SEKV ID NR:25), som ble utformet til å gjenkjenne en konservert region i den kodende sekvensen i Fc-regionen til humane IgG-kjeder. RACE-produkter ble klonet inn i pCR4-T0P0 (Invitrogen) og sekvensene ble bestemt. Konsensussekvenser ble anvendt til å utforme primere for fullengde antistoffkjede PCR-amplifisering.

For å fremstille cDNA som koder for anti-IFN-y kappa lett kjede, kodet 5' PCR-primeren for aminoterminalen til signalsekvensen, etXfcal-restriksjonsenzymsete og en optimalisert Kozak-sekvens (5'- ACA ACA AAG CTT CTA GAC CAC CAT GGA AAC CCC AGC TCA GCT TCT CTT -3'; SEKV ID NR:26). 3' primeren kodet for karboksylterminalen og stoppkodonet, så vel som et Sa/l-restriksjonssete (5'-CTT GTC GAC TCA ACA CTC TCC CCT GTT GAA GCT -3'; SEKV ID NR:27). Det resulterende PCR-produktfragmentet ble renset, kuttet med Xba\ og Sa/I og deretter gelisolert og ligert inn i den mammalske ekspresjonsvektoren pDSRa19 (se internasjonal søknad, publikasjon nr. WO 90/14363).

For å fremstille cDNA som koder for anti-IFN-y tung kjede, kodet 5' PCR-primeren for aminoterminalen til signalsekvensen, et Xbal-restriksjonsenzymsete og en optimalisert Kozak-sekvens (5'- CAG CAG AAG CTT CTA GAC CAC CAT GGG GTC AAC CGC CAT CCT CG -3'; SEKV ID NR:28). 3' primeren kodet for karboksylenden av den variable regionen, omfattende et naturlig forekommende sens kjede SsmSI-sete (5'- CTT GGT GGA GGC ACT AGA GAC GGT GAC CAG GGT GCC ACG GCC -3'; SEKV ID NR:29). Det resulterende produktet ble renset, kuttet medXbal og BsmB\, gelisolert og ligert inn i pDSRa19-vektoren inneholdende humant lgG1 konstant region.

Eksempel 4

Ekspresjon av anti-IFN-y antistoffer i kinesiske hamstereggstokk (CHO)-celler

Stabil ekspresjon av 1119 anti-IFN-y mAb ble oppnådd ved samtransfeksjon av 1119-tung kjede/pDSRa19 og 1119-kappa kjede/pDSRa19 plasmider inn i dihydrofolatreduktasedefekte(DHFR-), serumfriadapterte kinesiske hamstereggstokk (CHO)-celler ved anvendelse av en kalsiumfosfatmetode. Transfekterte celler ble selektert i medium inneholdende dialysert serum, men ikke inneholdende hypoksantin-tymidin, for å sikre vekst av celler som uttrykker DH FR- enzymet. Transfekterte kloner ble screenet ved anvendelse av tester så som ELISA for å detektere ekspresjon av 1119 anti-IFN-y mAb i det kondisjonerte mediet. De 1119-uttrykkende cellelinjene ble utsatt for metotreksatamplifisering. Klonene med høyest ekspresjon etter amplifisering ble valgt for enkeltcellekloning og etablering av cellebanker.

Et hvilket som helst rekombinant anti-IFN-y antistoff ifølge foreliggende oppfinnelse kan genereres i kinesiske hamstereggstokkceller som har en defekt i DHFR ved anvendelse av samme protokoll som beskrevet ovenfor for 1119 MAb. DNA-sekvensene som koder for fullstendig tung kjede eller lett kjede av hvert anti-IFN-y antistoff ifølge foreliggende oppfinnelse blir klonet inn i ekspresjonsvektorer. CHO-celler defekt i DHFR blir samtransfektert med en ekspresjonsvektor som kan uttrykke en fullstendig tung kjede og en ekspresjonsvektor som uttrykker fullstendig lett kjede til det passende anti-IFN-y antistoffet. For eksempel, for å generere 1118-antistoffet, blir celler samtransfektert med en vektor som kan uttrykke en fullstendig tung kjede omfattende aminosyresekvensen som angitt i SEKV ID NR: 19 og en vektor som kan uttrykke en fullstendig lett kjede omfattende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR:20. For å generere 1121-antistoffet, blir celler samtransfektert med en vektor som kan uttrykke en fullstendig tung kjede omfattende aminosyresekvensen som angitt i SEKV ID NR:21 og en vektor som kan uttrykke en fullstendig lett kjede omfattende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR:22. For å generere 1118<*->antistoffet, blir celler samtransfektert med en vektor som kan uttrykke en fullstendig tung kjede omfattende aminosyresekvensen som angitt i SEKV ID NR:32 og en vektor som kan uttrykke en fullstendig lett kjede omfattende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR:20. For å generere 1121<*->antistoffet, blir celler samtransfektert med en vektor som kan uttrykke en fullstendig tung kjede omfattende aminosyresekvensen som angitt i SEKV ID NR:21 og en vektor som kan uttrykke en fullstendig lett kjede omfattende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR:33. Tabell 3 oppsummerer fullstendig tunge og fullstendig lette kjeder for de ulike IFN-y antistoffene.

Eksempel 5

Produksjon av anti-IFN-y antistoff 1119-antistoffet ble produsert ved ekspresjon i en klonal linje av CHO-celler som uttrykte det. For produksjonen ble celler fra et enkelt rør tint i serumfritt celledyrkningsmedium. Cellene ble innledningsvis dyrket i en 250 ml risteflaske, deretter i rulleflasker og til slutt i rustfrie stålreaktorer ved økende skala opp til en 2000 I bioreaktor. Produksjon ble utført i en 2000 I bioreaktor ved anvendelse av en "fed batch"-kultur, der et næringsmedium inneholdende konsentrerte mediumkomponenter er tilsatt for å opprettholde cellevekst og kulturviabilitet. Produksjon varte i ca. to uker, hvor 1119-antistoffet i løpet av denne tiden ble konstitutivt produsert av cellene og utskilt i celledyrkningsmediet.

Produksjonsreaktoren ble kontrollert ved en predeterminert pH, temperatur og nivå av oppløst oksygen. pH ble kontrollert ved karbondioksydgass- og natriumkarbonattilsetning. Oppløst oksygen ble kontrollert ved luft-, nitrogen- og oksygengassgjennomstrømninger.

På slutten av produksjonen ble cellemediet overført til en "disk stack"-sentrifuge, og kultursupernatanten ble separert fra cellene. Konsentratet blir videre klargjort gjennom et dybdefilter etterfulgt av et 0,2 nm filter. Det klargjorte kondisjonerte mediet ble deretter konsentrert ved tangential gjennomstrømningsultrafiltrering. Det kondisjonerte mediet ble konsentrert 15- til 30-ganger. Det resulterende konsentrerte kondisjonerte mediet ble deretter prosessert for å rense antistoffet det inneholder, men det kan fryses for rensing ved et senere tidspunkt. Et hvilket som helst av de andre antistoffene beskrevet heri kan produseres på en lignende måte.

Eksempel 6

Karakterisering av aktiviteten til anti-IFN-y antistoffer

Siden IFN-y har et stort antall biologiske effekter, ble flere ulike biotester anvendt for å sammenligne effekten av ulike IFN-y antistoffer. A549-testen beskrevet nedenfor ble anvendt for den primære screeningen med kandidater valgt for videre analyse basert på deres resultater i testen. Selekterte kandidater omfattet 1119-, 1118- og 1121 -antistoffene.

A549-biotest

Én av de stadfestede egenskapene til IFN-y er dets anti-proliferative effekt på mange cellepopulasjoner. Se f.eks. Aune og Pogue, 1989, J. Clin. Invest. 84:863-75. Den humane lungecellelinjen A549 er ofte anvendt i publikasjoner som beskriver bioaktiviteten til IFN-y. Se f.eks. Aune og Pogue, supra; Hill et al., 1993, Immunology 79:236-40. Generelt blir aktiviteten til en inhibitor testet ved en konsentrasjon av en stimulerende substans som faller innenfor en del av doseresponskurven der en liten forandring i dose vil resultere i en forandring i respons. En fagperson på området vil forstå at hvis en overdreven dose av den stimulerende substansen blir anvendt, kan en veldig stor dose av en inhibitor være nødvendig for å observere en forandring i respons. Vanlig anvendte konsentrasjoner for en stimulerende substans er ECso og EC90(konsentrasjonene der henholdsvis 80% eller 90% av maksimumresponsen blir oppnådd).

En IFN-y doseresponskurve ble generert for å bestemme EC90for lungeepitelkarsinomcellelinjen A549 (~30 pM). I påfølgende eksperimenter ble ulike konsentrasjoner av rensede antistoffer blandet med en bestemt dose av IFN-Y (30 pM), og antistoffenes evne til å hemme den biologiske aktiviteten av den anti-proliferative effekten til IFN-y ble bestemt. Testen ble utført i 5 dager, og proliferasjon ble målt ved å bestemme fluorescens generert ved reduksjon av ALAMARBLUE™ (AccuMed International, Inc., Chicago, Illinois), en farge anvendt for å angi cellevekst ved metabolsk aktive, dvs. prolifererende, celler. Se f.eks. de Fries og Mitsuhashi, 1995, J. Clin. Lab. Analysis 9(2):89-95; Ahmed et al., 1994, J. Immunol. Methods 170(2):211-24.

Som vist i Figur 9, var 1119-antistoffet det mest potente antistoffet med en IC50(konsentrasjon hvor 50% hemming av effekten til IFN-y ble oppnådd) på 14 pM, etterfulgt av 1121 (46 pM) og 1118 (97 pM).

HLA DR-biotest

En annen stadfestet egenskap for IFN-y er dets evne til å oppregulere ekspresjon av MHC Klasse I- og Klasse ll-gener i en rekke celletyper. Denne aktiviteten kan være spesielt relevant for lupus nefritt (Yokoyama et al., 1992, Kidney Int. 42:755-63). THP-1 human monocyttisk cellelinje er ofte anvendt i publikasjoner som beskriver denne bioaktiviteten til IFN-y. En IFN-y doseresponskurve ble generert for å bestemme ECso for den bestemte THP-1 cellelinjen anvendt i dette forsøket (-21 pM). I påfølgende eksperimenter ble ulike konsentrasjoner av rensede antistoffer blandet med en bestemt dose av IFN-y (21 pM) og antistoffenes evne til å nøytralisere eller hemme IFN-y indusert oppregulering av HLA DR-ekspresjon på celleoverflaten ble bestemt. Testen ble utført i 24 timer, og det målte endepunktet var gjennomsnittlig fluorescensintensitet som bestemt ved FACS-analyse for å detektere binding av et FITC-merket anti-HLA DR antistoff til cellene.

Som vist i Figur 10, var 1119-antistoffet det mest potente antistoffet med en ICso på 14 pM, etterfulgt av 1121 (60 pM) og 1118 (86 pM).

Helblodbiotest

En human helblodtest ble utviklet basert på publiserte observasjoner av at IFN-y oppregulerer produksjon av IP-10 kjemokinet i flere ulike cellelinjer. Denne aktiviteten kan være spesielt relevant for lupus nefritt (Narumi et al., 2000, Cytokine 12:1561-1565). Helblod fra flere normale menneskedonorer ble testet for evnen IFN-y har til å øke IP-10 produksjon. En IFN-y doseresponskurve ble generert for å bestemme ECso for individuelle donorer. Som forventet, ble noe variasjon observert mellom donorer. Generelt ble donorer anvendt som viste seg reproduserbart å ha en ECso på 50-100 pM. Helblod ble blandet med en bestemt konsentrasjon av IFN-y og ulike konsentrasjoner av antistoffer, inkubert i 18,5 time og deretter ble IP-10 nivåer bestemt ved ELISA. Representative resultater fra en helblodtest for to ulike donorer er vist i Figur 11. ICso-verdiene fra disse to donorene var 17 og 14 pM. Per dags dato er én donor identifisert med spontant forhøyede IP-10 nivåer i helblodtesten uten behov for tilsetning av eksogent IFN-y. Anti-IFN-y antistoffene kunne blokkere denne spontane produksjonen av IP-10 trolig ved å blokkere endogent produsert IFN-y.

Biokjemiske tester

Bindingskinetikker for flere av antistoffene til IFN-y ble målt ved BIAcore-analyse. Innledende resultater indikerte at antistoffene hadde av-hastigheter som nærmet seg begrensningene for troverdige målinger på BIACORE™ (Pharmacia Biosensor AB Corporation, Uppsala, Sverige), et apparat som anvender overflateplasmonresonans for å måle binding mellom molekyler. Følgelig ble en likevektsbindingstest utviklet og anvendt. En bestemt antistoff mengde ble inkubert med ulike konsentrasjoner av IFN-y i mer enn 5 timer for å nå likevekt og fikk deretter komme i kontakt med IFN-y koblede kuler for en veldig kort periode, og mengden av fritt antistoff som bandt til kulene ble målt i en KINEXA™-maskin (Sapidyne Instruments Inc., Boise, ID), et fluorescensbasert immuntestinstrument. Den laveste likevektsdissosiasjonskonstanten som ble fremskaffet, -24 pM, var med 1119-antistoffet.

Eksempel 7

Kryssreaktivitet mellom arter

Antistoffene beskrevet ovenfor ble testet for deres evne til å nøytralisere eller hemme rekombinante IFN-y proteiner fra flere ulike arter. IFN-y proteinet fra mus ble kjøpt kommersielt, mens de humane, cynomolgus-ape og sjimpanse IFN-y proteinene ble klonet og uttrykt i konvensjonelle mammalske ekspresjonssystemer så som humane 293-celler. De humane, cynomolgus og sjimpanse IFN-y proteinene var alle aktive i den tidligere beskrevne A549-testen, mens museproteinet ikke var aktivt i denne testen. Museproteinet var aktivt i en RAW 264.7 cellelinjebasert test, som i alt vesentlig var identisk med A549-testen beskrevet tidligere bortsett fra substitusjonen av musecellelinjen. RAW 264.7 er en monocyttisk makrofagcellelinje fra mus og kan for eksempel fremskaffes fra American Type Culture Collection. Som vist i Tabell 4, kunne alle tre antistoffer nøytralisere humant og sjimpanse IFN-y, mens ingen av de tre kunne nøytralisere eller hemme den biologiske aktiviteten til IFN-y fra enten cynomolgus eller mus.

Eksempel 8

Identifisering av en epitop for anti-IFN-y antistoffer

En sammenligning av aminosyresekvensene for modent humant og cynomolgus IFN-y indikerte at det var ni aminosyreforskjeller mellom dem i posisjon 19, 20, 31, 34, 65, 77, 103, 110 og 126 i den humane IFN-y sekvensen. Humane og sjimpanse IFN-y sekvenser er beskrevet i Thakur og Landolfi (1999), Molecular Immunology 36: 1107-15, cynomolgus-ape IFN-y sekvensen er beskrevet i Tatsumi og Sata (1997), Int. Arch. Allergy Immunol. 114(3): 229-36; og den murine IFN-y sekvensen er beskrevet i f.eks. National Center for Biotechnology Information (NCBI) aksesjonsnummer NP_032363. Setestyrt mutagenese ved anvendelse av et kommersielt tilgjengelig testsett ble anvendt til å individuelt substituere hver av de divergente humane aminosyrene i humant IFN-y med den tilsvarende aminosyren fra cynomolgus-proteinet. Hvert substituerte IFN-y ble kalt "hulFNy" etterfulgt av symbolet for aminosyren anvendt til å bytte ut aminosyren foreliggende i den humane IFN-y sekvensen og posisjonen i den modne humane IFN-y sekvensen der substitusjonen skjedde. For eksempel representerer "hulFNyD19" en utgave av IFN-y identisk med humant IFN-y bortsett fra i posisjon 19, der en asparaginsyre erstatter histidin som vanligvis okkuperer denne posisjonen. Lignende eksperimenter ble gjort ved å begynne med cynomolgus-ape IFN-y og substituere hver divergente aminosyre med aminosyren foreliggende i humant IFN-y. Foreksempel representerer"cynolFNyLI03" en utgave av IFN-y identisk med cynomolgus-ape IFN-y bortsett fra i posisjon 103, der et leucin erstatter serinet som vanligvis okkuperer denne posisjonen. Se Tabell 5 og 6. Disse mutante proteinene ble uttrykt i et konvensjonelt mammalsk ekspresjonssystem så som de humane 293-cellene. Alle de mutante IFN-y proteinene beholdt aktivitet, som bestemt i A549-testen. 1119-antistoffet ble testet for dets evne til å nøytralisere eller hemme den biologiske aktiviteten til de ulike mutante IFN-y proteinene, som bestemt ved anvendelse av en A549-biotest. Evnen 1119-antistoffet har til å nøytralisere eller hemme humant IFN-y anti-proliferativ aktivitet ble bestemt ved å måle fluorescens som beskrevet ovenfor, og dette ble anvendt som et referansenivå for sammenligning av evnen 1119-antistoffet har til å nøytralisere aktiviteten til hver av variantformene til IFN-y. For konstruksjonene som startet med humant IFN-y, ble hemming av IFN-y aktivitet målt som prosent, der maksimalt fluorescensnivå observert i nærvær av humant IFN-y og 1119-antistoff (pga. reduksjon av ALAMARBLUE™ ved prolifererende celler) var satt til 100%, og de maksimale nivåene målt i nærvær av hver av de endrede formene av IFN-y pluss 1119-antistoffet ble sammenlignet med dette. Alternativt, for konstruksjonene som startet med cynomolgus-ape IFN-y, ble hemming scoret kvalitativt basert på den observerte fluorescensen.

Som oppsummert i Tabell 5, kunne 1119-antistoffet nøytralisere eller hemme den biologiske aktiviteten til humant IFN-y og alle substitusjonsmutantene av humant IFN-y bortsett fra hulFNyD19 og hulFNyP20. Som i det tidligere eksemplet, ble heller ikke cynomolgus IFN-y proteinet hemmet av 1119-antistoffet. Denne analysen indikerer at residue 19 og 20 er spesielt viktige for interaksjonen mellom 1119-antistoffet og IFN-y og kan fungere som kontaktpunkter mellom 1119-antistoffet og humant IFN-y.

Tabell 6 viser at en endret utgave av cynomolgus-ape IFNy, omfattende substitusjoner som gjør at cynomolgus IFNy-sekvensen matcher den humane sekvensen i posisjon 19 og 20, ikke ble nøytralisert av 1119-antistoffet. Imidlertid ble varianter av cynomolgus-ape IFNy som har human sekvens-substitusjoner i posisjon 19, 20 og 65 eller 19, 20 og 103 nøytralisert av 1119-antistoffet, hvilket også var tilfelle for utgaver inneholdende substitusjoner i tillegg til begge disse.

Eksempel 9

Biologisk aktivitet av anti-IFN-y antistoff ved administrering til sjimpanser

1119-antistoffet ble administrert til to sjimpanser ved en dose på 20 mg/kg hver uke i tre uker. Blod ble tappet fra sjimpansene enten to (-2) eller én uke (-1) før administrering av antistoff, og videre ble blod tappet 2, 8, 15, 29 og 36 dager etter administrering av den første antistoffdosen. En sjimpansehelblodtest ble utført på det tappede blodet ved anvendelse av vesentlig den samme metoden anvendt i

den humane helblodtesten beskrevet i Eksempel 6, der hovedforskjellen er at antistoffet ikke var satt til helblodet eksogent, men ble administrert tidligere in vivo til sjimpansene. IFN-y ble satt til blodet ved ulike konsentrasjoner (0,01 ng/ml, 3,9 ng/ml eller 1^g/ml), blodet ble inkubert ved 37°C i 20-24 timer, og deretter ble IP-10 produksjon målt ved kulebasert ELISA.

Som kan observeres i Figur 14 og 15, responderte blod tappet fra dyr før antistoffdosering til IFN-y med en konsentrasjonsavhengig økning i IP-10 produksjon. Derimot responderte ikke blod tappet etter antistoffadministrering til noen av konsentrasjonene av IFN-y testet med en økning i IP-10 produksjon. Disse resultatene indikerer at antistoffet beholdt evnen til å nøytralisere IFN-y, selv etter administrering in vivo. Videre overskred mengden av IFN-y satt til disse kulturene sterkt de endogene nivåene av IFN-y i sjimpansene, hvilket indikerer at det administrerte antistoffet kan nøytralisere endogent IFN-y in vivo.

Claims

1. Isolert fullstendig humant antistoff omfattende en tung kjede CDR1 omfattende aminosyresekvensen i SEQ ID NO:34; en tung kjede CDR2 omfattende aminosyresekvensen i SEQ ID NO:35; en tung kjede CDR3 omfattende aminosyresekvensen i SEQ ID NO:36 eller SEQ ID NO:37; en lett kjede CDR1 omfattende SEQ ID NO:38 eller SEQ ID NO:39; en lett kjede CDR2 omfattende SEQ ID NO:41; og en lett kjede CDR3 omfattende SEQ ID NO:43, hvor antistoffet bindes spesifikt til human IFN-y.

2. Antistoff ifølge krav 1, omfattende en tung kjede variabel region som er minst 90% identisk med SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO:6, og/eller SEQ ID NO:14 og en lett kjede variabel region som er minst 90% identisk med SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:12 og/eller SEQ ID NO:16.

3. Antistoff ifølge krav 2, hvor tung kjede variable region er minst 95% identisk med SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:6 og/eller SEQ ID NO: 14 og lett kjede variabel region er minst 95% identisk med SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:12 og/eller SEQ ID NO: 16.

4. Antistoff ifølge krav 1, hvor den tunge kjeden omfatter aminosyresekvensen i SEQ ID NO: 10 og den lette kjeden omfatter aminosyresekvensen i SEQ ID NO: 12.

5. Antistoff ifølge krav 1, hvor den tunge kjeden omfatter aminosyresekvensen i SEQ ID NO:6 og den lette kjeden omfatter aminosyresekvensen i SEQ ID NO:8.

6. Antistoff ifølge krav 1, hvor den tunge kjeden omfatter aminosyresekvensen i SEQ ID NO:14 og den lette kjeden omfatter aminosyresekvensen i SEQ ID NO:16.

7. Antistoff ifølge krav 1, hvor den tunge kjeden omfatter aminosyresekvensen i SEQ ID NO: 19 og den lette kjeden omfatter aminosyresekvensen i SEQ ID NO:20.

8. Antistoff ifølge krav 1, hvor den tunge kjeden omfatter aminosyresekvensen i SEQ ID NO: 17 og den lette kjeden omfatter aminosyresekvensen i SEQ ID NO: 18.

9. Antistoff ifølge krav 1, hvor den tunge kjeden omfatter aminosyresekvensen i SEQ ID NO:21 og den lette kjeden omfatter aminosyresekvensen i SEQ ID NO:22.

10. Antistoff ifølge krav 1, hvor tung kjede CDR3 omfatter aminosyresekvensen i SEQ ID NO:37; og lett kjede CDR1 omfatter aminosyresekvensen i SEQ ID NO:39.

11. Antistoff ifølge krav 1, hvor tung kjede CDR3 omfatter aminosyresekvensen i SEQ ID NO:36; og lett kjede CDR1 omfatter aminosyresekvensen i SEQ ID NO:38.

12. Antistoff ifølge krav 1, hvor tung kjede CDR3 omfatter aminosyresekvensen i SEQ ID NO:37; og lett kjede CDR1 omfatter aminosyresekvensen i SEQ ID NO:38.

13. Antistoff ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 12, hvor antistoffet omfatter en tung kjede og en lett kjede, hvor den tunge kjeden omfatter en Vh region, en Ch1 region, en Ch2 region, og en Ch3 region og hvor den lette kjeden omfatter en Vlregion og en Clregion.

14. Antistoff ifølge krav 13, hvor antistoffet er et lgG1, lgG2 eller lgG4 antistoff.

15. Antistoff ifølge krav 14, hvor antistoffet er et lgG1 antistoff.

16. Antistoff ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 12 hvor antistoffet er et enkelt kjede antistoff.

17. Isolert polynukleotid kodende for antistoffet ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 16.

18. Vektor omfattende et polynukleotide, kodende for antistoffet ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 16.

19. Vertcelle inneholdende et polynukleotid kodende for antistoffet følge et hvilket som helst av kravene 1 til 16.

20. Vertcelle ifølge krav 19, hvor vertcellen er en pattedyrcelle.

21. Vertcelle ifølge krav 20, hvor vertcellen er en CHO celle.

22. Fremgangsmåte for å produsere et antistoff omfattende dyrking av vertcellen ifølge et hvilket som helst av kravene 19 til 21.

23. Farmasøytisk sammensetning, omfattende antistoffet ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 16.