NO330274B1 - Vaksine som omfatter minst ett antigen og et peptid med gitt sekvens, og anvendelse av peptidet til fremstilling av en adjuvans eller et baereprotein - Google Patents

Description

Den foreliggende oppfinnelse angår vaksiner som omfatter minst ett antigen og en immunostimulerende substans.

Vertsbeskyttelse mot invaderende patogener involverer cellulære og humorale effektorer og er resultat av den samlede virkning av begge ikke-adaptive (iboende) og adaptive (ervervet) immunitet. Den siste er basert på spesifikk immunologisk gjenkjennelse mediert av reseptorer, er en nylig ervervelse av immunsystemet og er til stede bare hos vertebrater. Den første ble utviklet før utvikling av adaptiv immunitet, og består av et utvalg av celler og molekyler fordelt gjennom organismen med den oppgave å holde potensielle patogener under kontroll (Boman, H. (2000)), (Zanetti, M. (1997)).

B- og T-lymfocytter er mediatorene til ervervet antigen-spesifikk adaptiv immunitet, inkludert utvikling av immunologisk hukommelse, som er hovedmålet ved dannelse av en vellykket vaksine (Schijns, V. (2000)). Antigenpresenterende celler (APC) er meget spesialiserte celler som kan produsere antigener og presentere deres fremstilte fragmenter på celleoverflaten sammen med molekyler som er nødvendig for lymfocyttaktivering. Dette betyr at APC er meget viktig for initiering av spesifikke immunreaksjoner. De viktigste APC for T-lymfocyttaktivering er dendrittiske celler (DC), makrofager og B-celler, mens de viktigste APC for B-celler er follikulære dendrittiske celler. Generelt er DC de kraftigste APC i form av initiering av immunresponsstimulerende hvilende naive og hukommelses B- og T-lymfocytter.

Den naturlige oppgaven til APC i periferien (f.eks. DC eller Langerhans celler) er å fange og produsere antigener, derved blir de aktivert og starter med å uttrykke lymfocytt samstimulatoriske molekyler, migrere til lymfoidorganer, sekrere cytokiner og presentere antigener til forskjellige populasjoner av lymfocytter, idet det initieres antigenspesifikke immunresponser. De aktiverer ikke bare lymfocytter under visse omstendigheter, men gjør også T-celler tolerante ovenfor antigener (Banchereau, J. (1998)).

Antigengjenkjennelse av T-lymfocytter er begrenset av

hovedhistokompabilitetskomplekset (MHC). En gitt T-lymfocytt vil gjenkjenne et antigen bare når peptidet er bundet til et spesielt MHC-molekyl. Generelt blir T-lymfocytter stimulert bare i nærvær av selv-MHC-molekyler, og antigener blir gjenkjent bare som peptider bundet til selv-MHC-molekyler. MHC-restriksjon definerer T-lymfocyttspesifisitet i form av antigenet gjenkjent og i form av MHC-molekylet som binder et peptidfragment.

Intracellulære og ekstracellulære antigener presenterer helt forskjellige utfordringer for immunsystemet, både i form av gjenkjennelse og av egnet respons. Presentasjon av antigener til T-celler blir mediert av to atskilte klasser av molekyler - MHC klasse I (MHC-I) og MHC klasse II (MHC-II), som benytter atskilte antigenprosesserende ruter. I hovedsak kan man skille mellom to viktige antigenprosesserende ruter som har utviklet seg. Peptider avledet fra intracellulære antigener blir presentert til CD8+ T-celler av MHC klasse I molekyler, som blir uttrykt på i praksis alle celler, mens ekstracellulære antigenavledede peptider blir presentert for CD4+ T-celler av MHC-II molekyler (Monaco, J. (1992); Harding, C.

(1995)). Det er imidlertid visse unntak til denne dikotomien. Flere undersøkelser har vist at peptider dannet fra endocytoserte partikler eller oppløselige proteiner blir presentert på MHC-I molekyler i makrofager såvel som i dendrittiske celler (Harding, C. (1996); Brossart, P. (1997)). Derfor er APC på samme måte som dendrittiske celler som sitter i periferien, som utøver en høy styrke til å fange og prosessere ekstracellulære antigener og presentere dem på MHC-I molekyler til T-lymfocytter, interessante mål ved at de pulseres ekstracellulært med antigener in vitro og in vivo.

Den viktige og unike rollen til APC, inkludert stimulerende aktivitet på forskjellige typer leukocytter, reflekterer deres sentrale posisjon som mål for egnede strategier til å utvikle vellykkede vaksiner. Teoretisk er én måte å gjøre dette på å forsterke eller stimulere deres naturlige oppgave, opptak av antigen(er). Når de er pulset med de egnede antigenene vaksinen er rettet på, skulle APC starte å prosessere de opptatte antigen(er), derved å bli aktivert, og uttrykke lymfocytt samstimulerende molekyler som migrerer til lymfoide organer, sekrerer cytokiner og presenterer antigener til forskjellige populasjoner av lymfocytter for derved å initiere immunresponsen.

Aktiverte T-celler sekrerer generelt et antall av effektorcytokiner på en meget regulert måte, f.eks. interleukin 2 (IL-2), IL-4, IL-5, IL-10 og interferon-y (IFN-y). Den funksjonelle deteksjon av cytotoksiske T-lymfocyttresponser til spesifikke antigener (f.eks. tumorantigener, generelt antigener administrert i vaksine) blir vanligvis overvåket av et ELISpot assay (enzym-linked immunospot-assay), en teknikk som analyserer cytokinproduksjonen på enkeltcellenivå. I den foreliggende oppfinnelse ble et ELISpot-assay for det celleimmunitetspromoterende cytokin IFN-y brukt for å overvåke vellykket peptid-spesifikk T-celleaktivering.

Det har tidligere blitt vist at polykationer effektivt øker opptak av MHC klasse I-tilpassede peptider i tumorceller, en peptid eller proteinpulserende prosess som ble kalt «TRANSopplasting» (Buschle, M. (1997)). Videre har vi vist at polykationer er i stand til å «TRANSopplaste» peptider eller proteiner i antigenpresenterende celler in vivo såvel som in vitro (Buschle, M. (1998)). I tillegg beskytter saminjeksjon av en blanding av polyl-L-arginin eller poly-L-lysin sammen med et passende peptid som en vaksine, dyr fra tumorvekst i musemodeller (Schmidt, W. (1997)). Denne kjemisk definerte vaksine er i stand til å indusere et høyt antall av antigen-peptidspesifikk T-celle. Det ble vist minst delvis å kunne tilskrives et forhøyet opptak av peptider i APC mediert av polykationene (Buschle, M. (1998)) noe som angir at når APC pulses in vivo med antigener kan det indusere T-cellemediert immunitet til det administrerende antigen.

I motsetning til adaptiv immunitet som erkarakterisertav en meget spesifikk, men relativt langsom respons, er iboende immunitet basert på effektormekanismer som blir utløst av forskjeller i strukturen til mikrobielle komponenter relativt til verten. Disse mekanismer kan igangsette en rimelig hurtig initiell respons som hovedsakelig fører til nøytralisering av de skadelige midler. Reaksjoner fra den iboende immunitet er den eneste forsvarsstrategien til lavere phyla og er blitt opprettholdt hos vertebrater som et førstelinje vertsforsvar før det adaptive immunsystem blir mobilisert.

I høyere vertebrater er effektorcellene til den iboende immunitet nøytrofiler, makrofager og naturlige dreperceller og muligens også dendrittiske celler (Mizukawa, N. (1999)), mens de humorale komponentene i denne ruten er komplementkaskaden og et utvalg av forskjellige bindingsproteiner (Boman, H.

(2000)).

En hurtig og effektiv komponent i den iboende immunitet er produksjonen av en stor variasjon av mikrobicidale peptider med en lengde som vanligvis er mellom 12 og ca. 100 aminosyreresiduer. Flere hundre forskjellige antimikrobielle peptider er blitt isolert fra et utvalg av organismer som strekker seg fra svamper, insekter, til dyr og mennesker, og som peker på en utbredt distribusjon av disse molekyler. Antimikrobielle peptider er også produsert av bakterier som antagonistiske substanser mot konkurrerende organismer.

I EP 0 905 141 Al er det beskrevet et peptidfragment av en limulus anti-LPS faktor (LALF) som har antiviral virkning. Dette LALF-peptid øker ikke spesifikt immunresponsen men øker det ikke-spesifikke forsvar av mononukleære celler og kan også anvendes på en profylaktisk måte, eller ytterligere kan peptidet administreres topisk til et sårsted for å stimulere en øket sårheling og reparasjon.

Hovedkilder for antimikrobielle peptider er granuler av nøytrofiler og epitelceller som forer de respiratoriske, gastrointestinale og genitourinære trakter. Generelt er de funnet på de anatomiske steder som er mest eksponert for mikrobiell invasjon, og blir sekrert i indre kroppsvæsker eller lagret i cytoplasmatiske granuler hos profesjonelle fagocytter (nøytrofiler) (Ganz, T. (1997); Ganz, T. (1998); Ganz, T. 1999); Boman, H. (2000); Gudmundsson, GH. (1999)).

Det har nylig blitt vist (østerriksk patentsøknad A 1416/2000) at naturlig forekommende katelicidin-avledede mikrobielle peptider eller derivater derav har en immunresponsstimulerende aktivitet og utgjør derfor meget effektive adjuvanser. Teknikkens stilling er også beskrevet i Alvarez-Bravo J., et al., 1994, og i Buschle M. et al., 2000.

Hensikten med foreliggende oppfinnelse er å tilveiebringe en adjuvans/«et bærepeptid» som er i stand til sterkt å forsterke immunresponsen til et spesifikt samadministrert antigen og utgjør derfor en meget effektiv adjuvans.

Denne hensikt er oppnådd ved en vaksine som omfatter minst ett antigen og et peptid, som omfatter en sekvens Ri-XZXZnXZX-R.2, hvorved

- N er et helt tall mellom 3 og 7, fortrinnsvis 5,

- X er et positivt ladet naturlig og/eller ikke naturlig aminosyreresidu,

- Z er et aminosyreresidu valgt fra gruppen som består av L, V, I, F og/eller W, og - Ri og R2er valgt uavhengig av hverandre fra gruppen som består av -H, -NH2, -COCH3, -COH, et peptid med opptil 20 aminosyreresiduer eller en peptidreaktiv gruppe, eller en peptidkobler med eller uten et peptid; X-R2kan også være et amid, ester eller tioester på det C-terminale aminosyreresidu.

Ved siden av naturlig forekommende antimikrobielle peptider har syntetiske antimikrobielle peptider blitt produsert og undersøkt. Det syntetiske antimikrobielle peptid KLKLLLLLKLK-NH2var vist å ha signifikant kjemoterapeutisk aktivitet i Staphylococcus aureus-infiserte mus; humane nøytrofiler ble aktivert for å produsere superoksidanionet (O2-) via celleoverflatekalretikulin. Det nøyaktige tall og posisjonen til K og L ble funnet å være kritisk for den antimikrobielle aktiviteten til det syntetiske peptid (Nakajima, Y. (1997); Cho, J-H. (1999)).

Det er nå blitt overraskende vist innenfor den foreliggende oppfinnelse at peptider i henhold til foreliggende oppfinnelse omfatter en sekvens Ri-XZXZnXZX-R2, hvorved

- N er et helt tall mellom 3 og 7, fortrinnsvis 5,

- X er et positivt ladet naturlig og/eller ikke naturlig aminosyreresidu,

- Z er et aminosyreresidu valgt fra gruppen som består av L, V, I, F og/eller W, og - Ri og R2er valgt uavhengig av hverandre fra gruppen som består av -H, -NH2, -COCH3, -COH, et peptid med opptil 20 aminosyreresiduer eller en peptidreaktiv gruppe eller en peptidkobler med eller uten et peptid; X-R2kan også være et amid, ester eller tioester på det C-terminale aminosyreresidu, (i det følgende betegnet som «peptid A»). TRANSload antigeniske peptider eller proteiner i APC, mye mer effektivt enn kjente adjuvanser, inkludert naturlig forekommende antimikrobielle peptider. Det har videre en sterk immunresponsstimulerende aktivitet og utgjør derfor meget effektive adjuvanser.

Fortrinnsvis er C-terminus ikke modifisert (COOH eller COO") siden denne form er til og med bedre enn den amiderte formen av peptidet.

Innenfor området til den foreliggende oppfinnelse kan sekvensen amideres på dens karboksyende eller bære en ytterligere aminosyresekvens, imidlertid er karboksyenden fortrinnsvis fri.

Videre innenfor området til foreliggende oppfinnelse kan alle X omfattet i peptid A representere det samme aminosyreresidu. Fortrinnsvis representerer X i én peptid A bare ett spesifikt aminosyreresidu, f.eks. enten K eller R etc. Det samme kan fermholdes med hensyn på Z: alle Z i peptid A kan være en enkel aminosyretype eller forskjellige aminosyretyper: f.eks. enten L eller V etc. Dette er spesielt tilfelle for ZN-delen i midten av formelen, som kan være f.eks. L5eller L3såvel som LVIFW, LILFLLIW, WIF, W3L2, og alle andre kombinasjoner av dette motiv, som er mellom 3 og 7 aminosyrer i lengde, fortrinnsvis fra 4-6 aminosyreresiduer, særlig 5 aminosyreresiduer. Disse residuene er også foretrukket for Ri og R2delen (f.eks. at mer enn 50 %, fortrinnsvis mer enn 80 %, særlig mer enn 90 % av Ri og/eller R2er L, I, F, V og/eller W, hvis Ri og/eller R2er peptider). Fortrinnsvis er Ri og R2det samme, fordelaktig er de begge H (dvs. frie amino- eller karboksytermini).

Innenfor området til den foreliggende oppfinnelse omfatter betegnelsen «ikke naturlig» et ethvert aminosyreresidu som ikke henholdsvis forekommer naturlig eller ikke forekommer i naturlige proteiner.

Peptidet Ri-KLKL5KLK-R2er spesifikt foretrukket, imidlertid er også R1-KIKL5KIK-R2, R1-KVKL5KVK-R2, R1-KFKL5KVK-R2, Ri-KLKL6KLK-R2, R1-KWKW5-KLK-R2, R1-KWKWL3WKWK-R2, R1-KLKL4KLK-R2eller permutasjoner med hensyn på stillingene til I, F, V, W og L fordelaktige.

Selvfølgelig kan vaksinen omfatte to eller flere antigener avhengig av den ønskede immunrespons. Antigenet(ene) kan også modifiseres slik at de ytterligere styrker immunresponsen.

Fortrinnsvis er proteiner eller peptider avledet fra virale eller bakterielle patogener, fra sopp eller parasitter, såvel som tumorantigener (kreftvaksiner) eller antigener med en antatt rolle i autoimmunsykdom brukt som antigener (inkludert derivatiserte antigener såsom glykosylerte, lipiderte, glykolipiderte eller hydroksylerte antigener). Videre kan karbohydrater, lipider eller glykolipider anvendes som antigener i seg selv. Derivatiseringsprosessen kan inkludere rensing av et spesifikt protein eller peptid fra patogenet, inaktiveringen av patogenet såvel som proteolyttisk eller kjemisk derivatisering eller stabilisering av et slikt protein eller peptid. Alternativt kan også patogenet i seg selv anvendes som antigen. Antigenene er fortrinnsvis peptider eller proteiner, karbohydrater, lipider, glykolipider eller blandinger derav.

I henhold til en foretrukket utforming er T-celleepitoper brukt som antigener. Alternativt kan en kombinasjon av T-celleepitoper og B-celleepitoper også være foretrukket.

Antigenene som skal anvendes i de foreliggende vaksiner er ikke kritiske. Blandinger av forskjellige antigener er også selvfølgelig mulig å anvende i henhold til foreliggende oppfinnelse. Fortrinnsvis er proteiner eller peptider avledet fra et viralt eller et bakterielt patogen eller fra sopp eller parasitter brukt som slike antigener (inkludert derivatiserte antigener eller glykosylerte eller lipiderte antigener eller polysakkarider eller lipider). En annen foretrukket kilde for antigener er tumorantigener. Foretrukne patogener er valgt fra human immunosviktvirus (HIV), hepatitt A og B virus, hepatitt C virus (HCV), Rous sarcomvirus (RSV), Epstein Barr virus (EBV), influensavirus, rotavirus, Staphylococcus aureus, Chlamydia pneumonias, Chlamydia trachomatis, Mycobacterium tuberculosis, Streptococcus pneumonias, Bacillus anthracis, Vibrio cholerae, Plasmodium sp. (Pl. falciparum, Pl. vivax, etc), Aspergillus sp. eller Candida albicans. Antigener kan også være molekyler uttrykt ved kreftceller (tumorantigener). Derivasjonsprosessen kan inkludere rensing av et spesifikt protein fra patogene/kreftceller, inaktiveringen av patogenet så vel som den proteolytiske eller kjemiske derivatisering eller stabilisering av et slikt protein. På samme måte kan også tumorantigener (kreftvaksiner) eller autoimmunantigener anvendes.

I tilfellet av peptidantigener er anvendelse av peptid

mimotoper/agonister/superagonister/antagonister eller peptider forandret i visse stillinger uten å påvirke de immunologiske egenskaper eller ikke-peptidiske mimotoper/agonister/superagonister/antagonister inkludert i foreliggende oppfinnelse. Peptidantigenet kan også inneholde forlengelser enten i karboksyenden eller aminoenden av peptidantigenet som fremmer interaksjon med den (de) polykationiske forbindelse(r) eller immunstimulatoriske forbindelse(r). For behandling av autoimmunsykdommer kan peptidantagonister anvendes.

Antigener kan også derivatiseres for å inkludere molekyler som styrker antigenpresentasjonen og målrettingen av antigenet til antigenpresenterende celler.

I én utførelse av oppfinnelsen tjener den farmasøytiske sammensetning til å gi toleranse til proteiner eller proteinfragmenter og peptider som er involvert i autoimmunsykdommer. Antigener brukt i denne utforming tjener til å gjøre immunsystemet tolererbart eller nedregulere immunresponsen mot epitoper involvert i autoimmunprosesser.

Fortrinnsvis er antigenet et peptid som består av 5-60, fortrinnsvis 6-30, særlig 8-11 aminosyreresiduer. Antigener med denne lengden er blitt vist å være spesielt egnet for T-celleaktivering. Antigenene kan ytterligere kobles med en hale, f.eks. i henhold til A 657/2000, US 5 726 292 eller WO 98/01558.

Antigenet kan blandes med peptidene i henhold til foreliggende oppfinnelse eller på annen måte spesifikt formulert f.eks. som liposom, forsinket formulering, etc. Antigenet kan også være kovalent eller ikke-kovalent bundet til peptidet i henhold til foreliggende oppfinnelse. Fortrinnsvis er antigenet kovalent bundet til peptidet som R]- eller R2-residuer eller til sidekjeder av aminosyreresiduet i peptidet, spesielt til K og R sidekjeden.

De relative mengder av ingredienser i henhold til foreliggende vaksiner er i stor grad avhengig av nødvendigheten av den individuelle sammensetning. Fortrinnsvis blir mellom 10 ng og 1 g av antigen og peptid A anvendt. Foretrukne mengder av antigen/peptid A ligger i området fra 0,1 til 1000^g antigen pr. vaksinasjon og 0,1 til 1000^g peptid A. Vaksinen i henhold til den foreliggende oppfinnelse kan videre inneholde hjelpesubstanser, så som buffere, salter, stabilisatorer, immunostimulerende midler, antioksidanter etc. eller andre effektive substanser, så som antiinflammatorer eller antinociceptive legemidler.

De foreliggende vaksiner kan anvendes til en pasient, f.eks. en vaksinasjonskandidat, i effektive mengder, dvs. ved ukentlig, to ukers eller månedlige intervaller. Pasienten kan også vaksineres gjentatt eller bare én gang. En foretrukket anvendelse av den foreliggende oppfinnelse er den aktive immunisering, spesielt av mennesker eller dyr uten beskyttelse mot det spesifikke antigen.

Selvfølgelig kan vaksinen i henhold til foreliggende oppfinnelse omfatte ytterligere stoffer, som f.eks. en annen farmasøytisk akseptabel bærer etc. Vaksinen i henhold til den foreliggende oppfinnelse kan formuleres i henhold til kjente metoder, f.eks. som i.v. vaksiner, DNA-vaksiner, transdermale vaksiner, topiske vaksiner, intranasale vaksiner og som kombinasjonsvaksiner. Dosene kan utvelges ved standard fremgangsmåte for vaksiner som er forbedringer av kjente vaksiner, imidlertid er en lavere dose enn kjent vaksine mulig for samme beskyttelse og derfor foretrukket.

Fortrinnsvis er vaksinen tilveiebragt i en lagringsstabil form, f.eks. lyofilisert, eventuelt tilveiebragt i kombinasjon med en egnet rekonstituerende oppløsning.

Aminosyreresiduene i henhold til foreliggende oppfinnelse kan være D- eller L-aminosyrer. Fortrinnsvis tilhører alle eller minst mer enn 80 % av residuene til bare én type (D eller L). Mest foretrukket er alle aminosyrene i peptidet i henhold til foreliggende oppfinnelse av samme type (D eller L). I noen former kan peptidet i henhold til foreliggende oppfinnelse også omfatte ytterligere aminosyreresiduer innsatt i sekvensen til peptid A, ingen A, G og T residuer skal imidlertid være inneholdt i den hydrofobe delen (Z, Zn) av peptidet.

Fortrinnsvis i peptidsekvensen X er et aminosyreresidu valgt fra gruppen som består av K, R, ornitin og/eller homoarginin. Igjen kan X i peptid A være forskjellige aminosyreresiduer valgt fra denne gruppe, imidlertid er det foretrukket at X er enten K eller R eller ornitin eller homoarginin i ett peptid A.

I henhold til en foretrukket utforming av foreliggende oppfinnelse er X lik K i peptidsekvensen. Peptid A som omfatter denne aminosyre som X er blitt vist å være spesielt sterk til å indusere en immunrespons.

Fortrinnsvis i peptidsekvensen er Z valgt fra gruppen som består av L, V, I, F og/eller W. Som nevnt for X kan også Z representere i ett peptid A forskjellige aminosyreresiduer. Det er imidlertid foretrukket at Z i ett peptid A er bare ett aminosyreresidu f.eks. L eller V eller I eller F eller W, hvorved L og I residuer er de mest foretrukne, fulgt av F, fulgt av V og fulgt av W (L>I>F>V>W).

Enda mer foretrukket er peptid A sekvensen Z lik L (eller I, særlig L). Derved er peptid A i stand til å indusere en spesielt sterk immunrespons.

Mest foretrukket er peptid A H-KLKLLLLLKLK-H. Selvfølgelig skal også den fysiologiske formen til dette peptid (f.eks. med en protonert N-ende (NH3<+>) og en deprotonert C-ende (COO~)) vurderes å inkorporeres i denne formelen (som for alle peptider i henhold til foreliggende oppfinnelse).

I henhold til en ytterligere fordelaktig utforming er det i peptidsekvensen Ri og/eller R210-20 aminosyreresiduer. Derved er et peptid A tilveiebragt som har en lengde med hvilken en spesielt sterk immunrespons blir indusert eller forbedret.

I henhold til en fordelaktig utforming av den foreliggende oppfinnelse er aminosyreresiduene Ri og/eller R2ikke negativt ladede aminosyreresiduer.

Igjen kan aminosyreresiduene være naturlige og/eller ikke-naturlige aminosyreresiduer. Ved å tilsette ikke-negativt ladede aminosyreresiduer på den ene eller begge ender av peptid A viser dette peptid en sterk kapasitet til å forbedre eller indusere en immunrespons.

Fortrinnsvis danner Ri og/eller R2en hydrofob hale for peptid A. Derfor er aminosyreresiduene Ri og/eller R2fortrinnsvis valgt fra gruppen som består av L, V, I, F og/eller W. Enda mer foretrukket er aminosyreresiduene Ri og/eller R2valgt fra gruppen som består av L, I og/eller F. Mest foretrukket er det ytterligere aminosyreresiduet L. Disse peptid A viser en spesielt sterk kapasitet til å indusere en høyere immunrespons.

I henhold til en foretrukket utforming av foreliggende oppfinnelse er aminosyreresiduene Ri og/eller R2positivt ladede naturlige og/eller ikke-naturlige aminosyreresiduer. Fortrinnsvis er de ytterligere aminosyreresiduene valgt fra gruppen som består av K, R, ornitin og/eller homoarginin. Ennå mer foretrukket er aminosyreresiduene Ri og/eller R2K. Disse peptid A viser også en spesielt god kapasitet til å forbedre immunresponsen.

Det er foretrukket at aminosyreresiduene Ri og/eller R2er valgt fra den første gruppen (som består av L, V, I, F og/eller W) eller den andre gruppen (som består av positivt ladede aminosyreresiduer). Det er imidlertid også mulig at aminosyreresiduene Ri og/eller R2er valgt fra begge grupper for ett enkelt peptid A.

Peptidet kan være koblet til peptid A kjernen i henhold til foreliggende oppfinnelse ved normale peptidbindinger eller via peptidreaktive grupper eller peptidkoblere. Peptidreaktive grupper er kjemiske grupper egnet for å binde peptider eller proteiner. Derfor kan N- eller C-endene i foreliggende peptid A være kjemisk modifisert for å omfatte en kjemisk modifikasjon (f.eks. iminotioan, 3-merkaptopropionyl,...) som tillater den kovalente tilfesting av henholdsvis et peptid eller et antigen. Alternativt kan peptid A omfatte en egnet peptidkobler, dvs. et koblermolekyl som er i stand til å danne en kobling mellom kjernepeptidet A (f.eks. peptidet uten Ri og/eller R2) og f.eks. et antigen koblet eller som kan kobles dertil. Peptidet i henhold til foreliggende oppfinnelse kan være tilstede med eller uten peptid/antigen bundet til den peptidreaktive gruppe og/eller peptidkobleren. Slike kjemiske modifikasjoner og egnede peptidkoblere er godt tilgjengelig for personer med kunnskap på området.

Fortrinnsvis omfatter vaksinen minst én ytterligere immunresponsformulerende respons. Som immunresponsstimulerende substans kan enhver substans eller molekyl anvendes som er kjent for å være aktive som en adjuvans. Slike substanser er beskrevet i WO 93/19768. Andre substanser kan være f.eks. polykationer, som f.eks. polylysin eller polyarginin. Andre adjuvanser kan være komponenter i form av partikler, f.eks. silikagel eller dekstrankuler, som er tilstrekkelig små slik at de kan trenge inn i cellene. Tilsetting av denne ytterligere immunresponsstimulerende substans vil gjøre vaksinen enda mer effektiv.

Fortrinnsvis omfatter videre vaksinen i henhold til foreliggende oppfinnelse en polykationisk polymer, fortrinnsvis et polykationisk peptid, særlig polyarginin, polylysin eller et antimikrobielt peptid.

Polykationiske forbindelse(r) som skal anvendes i henhold til foreliggende oppfinnelse kan være enhver polykationisk forbindelse som viser den karakteristiske virkningen i henhold til WO 97/30721. Foretrukne polykationiske forbindelser er valgt fra basiske polypeptider, organiske polykationer, basiske polyaminosyrer eller blandinger derav. Disse polyaminosyrene burde ha en kjedelengde på aminosyreresiduer. Spesielt foretrukket er stoffer som inneholder peptidiske bindinger, såsom polylysin, polyarginin og polypeptider som inneholder mer enn 20 %, særlig mer enn 50 % av basiske aminosyrer i et område på mer enn 8, spesielt mer enn 20 aminosyreresiduer eller blandinger derav. Andre foretrukne polykationer og deres farmasøytiske sammensetning er beskrevet i WO 97/30721 (f.eks. polyetylenimin) og WO 99/38528. Fortrinnsvis inneholder disse polypeptider mellom 20 og 500 aminosyreresiduer, særlig mellom 30 og 200 residuer.

De polykationiske forbindelser kan fremstilles kjemisk eller rekombinant eller kan være avledet fra naturlige kilder.

Kationiske (poly)peptider kan også være polykationiske antibakterielle mikrobielle peptider. Disse (poly)peptidene kan være av prokaryot eller eukaryot opprinnelse eller kan produseres kjemisk eller rekombinant. Peptider kan også høre til klassen for naturlig forekommende antimikrobielle peptider. Slike vertsforsvarpeptider eller forsvarsmidler er også en foretrukket form for den polykationiske polymer i henhold til foreliggende oppfinnelse. Generelt blir en forbindelse som tillater en endeproduktaktivering (eller nedregulering) av det adaptive immunsystem, fortrinnsvis mediert av APC (inkludert dendrittiske celler) brukt som polykationisk polymer.

Særlig foretrukket for anvendelse som et polykationisk stoff i den foreliggende oppfinnelse er katelicidin avledede antimikrobielle peptider eller derivater derav (A 1416/2000), særlig antimikrobielle peptider avledet fra pattedyrkatelicidiner, fortrinnsvis fra menneske, storfe eller mus.

Videre kan også nevroaktive forbindelser, såsom (menneskelige) veksthormon (som beskrevet f.eks. i WO 01/24822) blir brukt som immunstimulerende midler.

Polykationiske forbindelser avledet fra naturlige kilder inkluderer HIV-REV eller HIV-TAT (avledede kationiske peptider, antennapediapeptider, chitosan eller andre derivater av chitin) eller andre peptider avledet fra disse peptidene eller proteiner ved biokjemisk eller rekombinant produksjon. Andre foretrukne polykationiske forbindelser er katelin eller beslektede eller avledede stoffer fra katelicidin, spesielt mus, bovine eller spesielt humane katelicidiner og/eller katelicidiner. Beslektede eller avledede katelicidinstoffer inneholder hele eller deler av katelicidinsekvensen med minst 15-20 aminosyreresiduer. Avledningen kan inkludere substitusjon eller modifikasjon av de naturlige aminosyrer ved aminosyrer som ikke er blant de 20 standard aminosyrer. Videre kan ytterligere kationiske residuer innføres i slike katelicidinmolekyler. Disse katelicidinmolekylene er foretrukket å være kombinert med vaksinen i henhold til den foreliggende oppfinnelse. Disse katelicidinmolekyler har imidlertid overraskende vist seg å være effektive som en adjuvans for et antigen uten tilsetting av ytterligere adjuvanser. Det er derfor mulig å bruke slike katelicidinmolekyler som effektive adjuvanser i vaksineformuleringer med eller uten immunaktiverende stoffer.

Fortrinnsvis er det immunresponsstimulerende stoffet et cytokin. Cytokinet spiller en viktig rolle i aktivering og stimulering av B-celler, T-celler og NK-celler, makrofager, dendrittiske celler og forskjellige andre celler som deltar i immunresponsene. Ethvert cytokin kan anvendes som vil ytterligere øke immunresponsen til antigenet(ene).

Fortrinnsvis omfatter vaksinen i henhold til foreliggende oppfinnelse ytterligere en immunostimulerende/immunogen nukleinsyre, fortrinnsvis et oligodeoksynukleotid som inneholder deoksyinosin, et oligodeoksynukleotid som inneholder deoksyuridin, et oligodeoksynukleotid som inneholder et metylert eller umetylert CG-motiv eller en inosin og cytidin som inneholder nukleinsyremolekyler.

De immunogene nukleinsyrene som anvendes i henhold til foreliggende oppfinnelse kan være av syntetisk, prokaryot og eukaryot opprinnelse. I tilfelle av eukoryot opprinnelse bør DNA være avledet fra mindre utviklede arter, slik som f.eks. insekter. I en foretrukket utforming av oppfinnelsen er det immunogene oligodeoksynukleotid (ODN) et syntetisk produsert DNA-molekyl eller blandinger av slike molekyler. Derivater eller modifikasjoner av ODN såsom tiofosfatsubstituerte analoger (tiofosfatresiduer substituerer for fosfat) som f.eks. beskrevet i US patent US 5 723 335 og US 5 663 153, og andre derivater og modifikasjoner, som fortrinnsvis stabiliserer den immunostimulerende sammensetning(ene) men forandrer ikke deres immunologiske egenskaper, er også inkludert. Et foretrukket sekvensmotiv er et seksbase DNA-motiv som inneholder et (umetylert) CpG dinukleotid flankert av to 5' puriner og to 3' pyrimidiner (5'-Pur-Pur-C-G-Pyr-Pyr-3'). CpG-motivene inneholdt i ODN i henhold til foreliggende oppfinnelse er mer vanlig i mikrobielt enn i høyere vertebrat DNA og viser forskjeller i mønsteret av metylering. Overraskende er sekvensene som stimulerer muse APC ikke meget effektive for humane celler. Foretrukne palindromiske eller ikke-palindromiske EDN som skal anvendes i henhold til foreliggende oppfinnelse er beskrevet f.eks. i Østerriksk patentsøknad A 1973/2000, A 805/2001,

EP 0 468 520 A2, WO 96/02555, WO 98/16247, WO 98/18810, WO 98/37919, WO 98/40100, WO 98/52581, WO 98/53962, WO 99/51259 og WO 99/56755. Bortsett fra stimulering av immunsystemet er visse ODN nøytraliserende av noen immunresponser. Disse sekvenser er også inkludert i foreliggende oppfinnelse, f.eks. for anvendelse for behandling av autoimmune sykdommer. ODN/DNA kan fremstilles kjemisk eller rekombinant eller kan være avledet fra naturlige kilder. Foretrakkede naturlige kilder er insekter.

Alternativt kan også nukleinsyre basert på inosin og cytidin (som f.eks. beskrevet i PCT/EP01/06437) eller deoksynukleinsyrer som inneholder deoksyinosin og/eller deoksyuridinresiduer (beskrevet i de østerrikske patentsøknader A 1973/2000 og A 805/2001) fortrinnsvis bli brukt som immunostimulerende nukleinsyrer i den foreliggende oppfinnelse.

Selvfølgelig kan også blandinger av forskjellige immunogene nukleinsyrer anvendes i henhold til foreliggende oppfinnelse.

En annen side av foreliggende oppfinnelse er anvendelse av peptidet som omfatter sekvensen Ri-XZXZNXZX-R2(peptid A) som definert ovenfor for fremstilling av en adjuvans for å forsterke immunresponsen til minst ett antigen.

I henhold til en foretrukket utforming av oppfinnelsen blir adjuvansen tilsatt en vaksine. Det er selvfølgelig mulig å administrere adjuvansen direkte til pattedyret, f.eks. fortrinnsvis før vaksinasjonen. Det er imidlertid lettere for administreringen å tilsette adjuvansen til en vaksine som deretter blir administrert til pattedyret alt i én porsjon.

Oppsummert gjelder således foreliggende oppfinnelse en vaksine som er kjennetegnet ved at den omfatter minst ett antigen og et peptid som omfatter en sekvens Ri-XZXZnXZX-R2, hvori

- N er et helt tall mellom 3 og 7, fortrinnsvis 5,

- X er et positivt ladet naturlig og/eller ikke naturlig aminosyreresidu,

- Z er et aminosyreresidu valgt fra gruppen som består av L, V, I, F og/eller W, og - Ri og R2er valgt uavhengig fra hverandre fra gruppen som består av -H, -NH2, -COCH3, -COH, et peptid med opptil 20 aminosyreresiduer eller en peptidreaktiv gruppe eller en peptidkobler med eller uten et peptid; X-R2kan også være et amid, ester eller tioester på det C-terminale aminosyreresidu.

I tillegg gjelder foreliggende oppfinnelse anvendelse av peptidet som omfatter sekvensen Ri-XZXZnXZX-R2, som definert ovenfor, til fremstilling av en adjuvans eller bæreprotein for å styrke immunresponsen til i det minste ett antigen. Adjuvansen eller bærerproteinet kan forsterke opptak av minst ett antigen i antigenpresenterende celler (APC), og adjuvansen eller bærerproteinet kan tilsettes en vaksine.

Oppfinnelsen vil beskrives mer detaljert ved følgende eksempler og figurer.

Fig. 1 viser TRANSlastings kapasitet til det (syntetiske antimikrobielle) peptid KLKLLLLLKLK (SEKV. ID. nr. 1) i sammenligning med diverse, tidligere beskrevne «bærerpeptider». Fig. 2 viser effektiviteten til peptidvarianter i henhold til foreliggende oppfinnelse sammenlignet med andre peptider. Fig. 3 viser mengden av IFN-y-produserende celler hos mus vaksinert med et antigenpeptid i kombinasjon med (syntetisk antimikrobielt) peptid

KLKLLLLLKLK.

EKSEMPLER

Eksempel 1

TRANSlasting av murine makrofager med et syntetisk antimikrobielt peptid som «bærerpeptid»

For å teste om det (syntetiske antimikrobielle) peptid KLKLLLLLKLK er i stand til å funksjonere som «bærerpeptid» for antigener for å TRANSlaste APC in vitro, som betyr å forsterke antigenopptaket i APC, ble et fluorescensmerket peptid brukt som antigenpeptid. Det ble blandet med diverse konsentrasjoner av KLKLLLLLKLK og andre tidligere beskrevne «bærerpeptider» som angitt.

For å sammenligne effektiviteten av peptidleveringen av disse forskjellige «bærerpeptider», ble mengden av peptidopptak i APC overvåket ved å inkubere P388D1 celler (murin monocytt-makrofag antigenpresenterende cellelinje; kjøpt fra ATCC (TIB-63)) i 1 time ved 37 °C med en konstant mengde av fluorescein-merket peptid alene eller i kombinasjon med forskjellige «bærerpeptider» i angitte konsentrasjoner. Før cellene ble analysert ved flow-cytometri ble cellene vasket godt for å fjerne fritt peptid. Den relative mengde av fluorescein-merket peptid tatt opp av cellene ble målt ved flow-cytometri.

Antigenpeptidet som ble brukt er et influensa-hemagglutinin-avledet MHC klasse I (Kd) bindende peptid (Buschle, M. (1997)). 2^g av dette antigenpeptidet (FL-LFEAIEGFI) ble blandet med 3 forskjellig mengder av hvert bærerpeptid testet ved konsentrasjoner som representerer 101,7, 50,9 og 50,09 nmol positive ladninger.

(Fig. 1 viser ganger økning av forsterket peptidopptak sammenlignet med peptid alene):

Mens fluorescens er kjent for å være sparsom i celler behandlet med peptid alene (som vist tidligere) ble intens fluorescens fra «TRANSlastet» celler spesielt funnet i celler som er TRANSlastet med det (syntetiske antimikrobielle) peptid KLKLLLLLKLK som «bærerpeptid», noe som angir at det er i stand til å pulsere APC meget effektivt med et antigenpeptid.

Eksempel 2

TRANSlasting av murine makrofager med forskjellige syntetiske antimikrobielle peptider som «bærerpeptider»

Forskjellige syntetiske antimikrobielle peptider med sekvensen Ri-XZXZnXZX-R.2ble testet for funksjon som «bærerpeptid» for antigener, til TRANSlasting av APC in vitro, som betyr forsterking av antigenopptaket i APC. Med den hensikt ble et fluorescensmerket peptid brukt som antigenpeptid. Det ble blandet med forskjellige konsentrasjoner av peptider som omfatter en sekvens Ri-XZXZnXZX-R2og andre tidligere beskrevne «bærerpeptider» som angitt.

For å sammenligne effektiviteten av peptidlevering av disse forskjellige «bærerpeptider», ble mengden av peptidopptak i APC overvåket ved å inkubere P388D1 celler (murin monocytt-makrofagantigenpresenterende cellelinje; kjøpt fra ATCC (TIB-63)) i 1 time ved 37 °C med en konstant mengde av flurescein-merket peptid alene eller i kombinasjon med forskjellige «bærerpeptider» ved angitte konsentrasjoner. Før analyse av cellene med flow-cytometri ble cellene vasket godt for å fjerne fritt peptid. Den relative mengde av fluorescein-merket peptid tatt opp av cellene ble målt ved flow-cytometri.

Det benyttede antigenpeptidet er et influensa-hemagglutinin-avledet MHC klasse I (Kd) bindende peptid (Buschle, M. (1997)). 3^g av dette antigenpeptidet (FL-LFEAIEGFI) ble blandet med tre forskjellige mengder av hvert bærerpeptid testet ved konsentrasjoner som representerte 101,7, 50,9 og 5,09 nmol positive ladninger.

(Fig. 2 viser ganger økning av forsterket peptidopptak sammenlignet med peptid alene):

Mens fluorescens er kjent for å være sparsom i celler behandlet med peptid alene (som vist tidligere) ble intens fluorescens fra «TRANSlastede» celler spesielt funnet i celler som ble TRANSlastet med peptidet som omfatter en sekvens Ri-XZXZnXZX-R2(inkludert de ovenfor nevnte foretrukne utforminger) som «bærerpeptid», noe som angir at peptidene i henhold til foreliggende oppfinnelse er i stand til meget effektivt å pulse APC med et antigenpeptid.

Eksempel 3

Testing av evnen til å forsterke induksjon av peptidspesifikke T-celle responser in vivo

For å teste evnen til det (syntetiske antimikrobielle) peptid KLKLLLLLKLK til å forsterke induksjon av peptidspesifikke T-celle responser in vivo ble grupper på fire mus (C57BL/6, hunn, 8 uker gamle, H-2b) injisert subkutant i flanken tre ganger (dagene 0, 28 og 56) med et antigenisk melanompeptid (100^g) avledet fra TRP-2 (muse tyrosinaserelatert protein-2) alene eller i kombinasjon med enten poly-L-arginin eller det (syntetiske antimikrobielle) peptid KLKLLLLLKLK som «bærerpeptid». Mengdene av det (syntetiske antimikrobielle) peptid KLKLLLLLKLK som ble brukt representerer fire forskjellige mengder med konsentrasjoner som representerer den like mengden (100^g) av poly-L-arginin i betegnelse^g, lik (168^g), dobbel (336^g) og trippel (504^g) mengde av poly-L-arginin i form av positive ladninger. Gruppene av mus ble injisert som følger (mengde angitt/pr. mus). 12 dager etter tredje vaksinasjon ble drenering (inguinal) av lymfeknuter fjernet og lymfeknuteceller (fig. 3) ble aktivert ex vivo med TRP-2-avledet (musetyrosinaserelatert protein-2) peptid for å bestemme IFN-y-produserende spesifikke celler i et ELISpot assay (antall IFN-y-EPISpots pr. million lymfeknuteceller).

Fig. 3 viser at injeksjon av mus med peptid pluss økende mengde av

KLKLLLLLKLK resulterte i mange flere IFN-y-produserende spesifikke celler enn injeksjon av mus med peptid alene eller i kombinasjon med poly-L-arginin. Det har også blitt konfirmert at peptidet KLKLLLLLKLK ikke utløser IFN-y-produserende peptidspesifikke T-celler (som konfirmert av ELISpot-assay), dvs. at bare ikke KLKLLLLLKLK spesifikke T-celler har blitt oppnådd i de foreliggende eksperimenter.

Dette eksemplet demonstrerer klart at det (syntetiske antimikrobielle) peptid KLKLLLLLKLK forsterker induksjon av peptidspesifikke T-celleresponser in vivo.

Som oppsummering viste det (syntetiske antimikrobielle) peptid KLKLLLLLKLK en høy «TRANSlasting» og immunostimulerende effektivitet, noe som angir at peptid A er i stand til å pulsere APC med antigenpeptider in vitro og in vivo meget effektivt og er gode adjuvanser/«bærerpeptider» for antigenpeptider ved induksjon av adaptive immunresponser.

REFERANSER

Alvarez-Bravo J., et al., 1994. Novel synthetic antimicrobial peptides effective against methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Biochemical Journal, No.302, pp.535-538.

Banchereau, et al. (1998), «Dendritic cells and the control of imunity», Nature 392

(6673): 245-52.

Boman (2000), «Innate immunity and the normal microflora», Immunol. Rev. 173: 5-16.

Brossart, et al. (1997), «Presentation of exogenous protein antigens on major histocompatibility complex class I molecules by dendritic cells: pathway of presentation and regulation by cytokines», Blood 90(4): 1594-9.

Buschle, et al. (1998), «Chemically defined, cell-free cancer vaccines: use of tumor antigen-derived peptides or polyepitope proteins for vaccination», Gene Therapy and molecular Biology 1: 309-21.

Buschle, et al. (1997), «Transloading of tumor antigen-derived peptides into antigen-presenting cells», Proe. Nati. Acad. Sei., USA 94(7): 3256-61.

Buschle M. et al., 2000. Development of defined, synthetic vaccines by in vivo charging of antigen presenting cells with antigen. Journal of Investigate Dermatology, Vol.114, No.l, p.235. The sixth international workshop on Langerhans cells.

Cho, et al. (1999), «Activation of human neutrophils by a synthetic anti-microbial peptide, KLKLLLLLKLK-NH2, via cell surface calreticulin», Eur. J. Biochem. 266: 878-85.

Ganz, et al. (1997), «Antimicrobial peptides of leukocytes», Curr. Opin. Hematol. 4(1): 53-8.

Ganz, T., (1998), «Antimicrobial peptides of vertebrates», Curr. Opin. Immunol. 10(1): 41-4.

Ganz, et al. (1999), «Antibiotic peptides from higher eukaryotes: biology and applications. «Mol. Med. Today 5(7): 292-7.

Gudmundsson, et al. (1999), «Neutrophil antibacterial peptides, multifunctional effector molecules in the mammalian immune system», J. Immunol. Methods 232 (1-2): 45-54.

Harding (1995), «Phagocytic processing of antigens for pre-sentation by MHC molecules», Trends in Cell Biology 5(3): 105-09.

Harding (1996), «Class I MHC presentation of exogenous antigens», J. Clin. Immunol. 16(2): 90-6.

Mizukawa, et al. (1999), «Presence of defensin in epithelial Langerhans cells adjacent to oral carcinomas and precancerous lesions», Anticancer Res. 19(4B): 2669-71.

Monaco (1992), «A molecular model of MHC class-I-restricted antigen processing», Immunol. Today 13(5): 173-9.

Nakajima, et al. (1997), «Chemotherapeutic activity of synthetic antimicrobial peptides: correlation between chemotherapeutic activity and neutrophil-activating activity», FEBS Lett. 415: 64-66.

Schijns (2000), «Immunological concepts of vaccine adjuvant activity», Curr. Opin. Immunol. 12(4): 456-63.

Schmidt, et al. (1997), «Cell-free tumor antigen peptide-based cancer vaccines», Proe. Nati. Acad. Sei., USA 94(7): 3262-7.

Zanetti, et al. (1997), «The cathelicidin family of antimicrobial peptide precursors: a component of the oxygen-independent defense mechanisms of neutrophils», Ann. N. Y. Acad. Sc. 832: 147-62.

Claims (21)

1. Vaksine, karakterisert vedat den omfatter minst ett antigen og et peptid som omfatter en sekvens Ri-XZXZnXZX-R.2, hvori - N er et helt tall mellom 3 og 7, fortrinnsvis 5, - X er et positivt ladet naturlig og/eller ikke naturlig aminosyreresidu, - Z er et aminosyreresidu valgt fra gruppen som består av L, V, I, F og/eller W, og - Ri og R2er valgt uavhengig fra hverandre fra gruppen som består av -H, -NH2, -COCH3, -COH, et peptid med opptil 20 aminosyreresiduer eller en peptidreaktiv gruppe eller en peptidkobler med eller uten et peptid; X-R2kan også være et amid, ester eller tioester på det C-terminale aminosyreresidu.

2. Vaksine som angitt i krav 1, karakterisert vedat i peptidsekvensen X er et aminosyreresidu valgt fra gruppen som består av K, R, ornitin og/eller homoarginin.

3. Vaksine som angitt i krav 2, karakterisert vedat aminosyreresiduet i peptidsekvensen hvor X er K.

4. Vaksine som angitt i et av kravene 1-3, karakterisert vedat et aminosyreresidu i peptidsekvensen Z er valgt fra gruppen som består av L, I og/eller F.

5. Vaksine som angitt i krav 4, karakterisert vedat aminosyreresiduet i peptidsekvensen Z er L.

6. Vaksine som angitt i krav 1, karakterisert vedat peptidsekvensen er H-KLKLLLLLKLK-H.

7. Vaksine som angitt i et av kravene 1-6, karakterisert vedat peptidsekvensen Ri og/eller R2består av 10-20 aminosyreresiduer.

8. Vaksine som angitt i krav 7, karakterisert vedat aminosyreresiduene til Ri og/eller R2er ikke-negativt ladede aminosyreresiduer.

9. Vaksine som angitt i krav 8, karakterisert vedat aminosyreresiduene til Ri og/eller til R2er valgt fra gruppen som består av L, V, I, F og/eller W.

10. Vaksine som angitt i krav 9, karakterisert vedat aminosyreresiduene til R]og/eller R2er valgt fra gruppen som består av L, I og/eller F.

11. Vaksine som angitt i krav 10, karakterisert vedat aminosyreresiduene til Ri og/eller R2er L.

12. Vaksine som angitt i et av kravene 7-11, karakterisert vedat aminosyreresiduene til R]og/eller R2er positivt ladede naturlige og/eller ikke-naturlige aminosyreresiduer.

13. Vaksine som angitt i krav 12, karakterisert vedat aminosyreresiduene i Ri og/eller R2er valgt fra gruppen som består av K, R, ornitin og/eller homoarginin.

14. Vaksine som angitt i krav 13, karakterisert vedat aminosyreresiduene i Ri og/eller R2er K.

15. Vaksine som angitt i et av kravene 1-4, karakterisert vedat det omfatter minst ytterligere immunresponsstimulerende stoff.

16. Vaksine som angitt i et av kravene 1-15, karakterisert vedat det ytterligere omfatter en immunostimulerende nukleinsyre, fortrinnsvis et oligodeoksynukleotid som inneholder deoksyinosin, et oligodeoksynukleotid som inneholder deoksyuridin, et oligodeoksynukleotid som inneholder et CG-motiv eller en inosin og cytidin som inneholder nukleinsyremolekyl.

17. Vaksine som angitt i et av kravene 1-16, karakterisert vedat det ytterligere omfatter et cytokin som immunresponsstimulerende stoff.

18. Vaksine som angitt i et av kravene 1-17, karakterisert vedat det ytterligere omfatter et polykationisk peptid, en nevroaktiv forbindelse eller et hormon med vekstfaktoraktivitet.

19. Anvendelse av peptidet som omfatter sekvensen Ri-XZXZnXZX-R2som definert i et av kravene 1-18 til fremstilling av en adjuvans eller bæreprotein for å styrke immunresponsen til i det minste ett antigen.

20. Anvendelse som angitt i krav 19, hvori adjuvansen eller bærerproteinet forsterker opptak av minst ett antigen i antigenpresenterende celler (APC).

21. Anvendelse som angitt i krav 19 eller 20, hvori adjuvansen eller bærerproteinet er tilsatt en vaksine.