CZ20031299A3

CZ20031299A3 - Složená vakcína

Info

Publication number: CZ20031299A3
Application number: CZ20031299A
Authority: CZ
Inventors: Jörg Fritz; Frank Mattner; Wolfgang Zauner; Eszter Nagy; Michael Buschle
Original assignee: Intercell Biomedizinische Forschungs- Und Entwickl
Priority date: 2000-10-18
Filing date: 2001-10-18
Publication date: 2003-10-15
Also published as: NO20031595D0; MXPA03002828A; HU228382B1; US20090123486A1; KR20030043993A; BR0114994A; CZ303303B6; ZA200301465B; JP4227407B2; SI1326634T1; IS6722A; CA2426490C; PL209016B1; RU2007146372A; EP1326634B1; AU1232602A; KR100598302B1; HK1055899A1; NZ524532A; US20050063978A1

Description

Oblast techniky

Tento vynález se týká vakcín obsahujících alespoň jeden antigen a jednu imunostimulující látku.

Dosavadní stav techniky

Základní obrana proti napadajícím patogenům zahrnuje buněčné a humorální efektory a je výsledkem koordinované akce jak neadaptivní (přirozené) tak adaptivní (získané) imunity. Získaná imunita je založena na specifickém imunologickém průzkumu zprostředkovaném receptory a je to poměrně nová vymoženost imunitního systému, kterou mají pouze λ obratlovci. Přirozená imunita se vyvinula dříve než imunita získaná a spočívá v široké škále buněk a molekul rozprostřených po celém organizmu s úkolem udržet potenciální patogeny pod kontrolou (Boman, H. (2000)), (Zanetti, M. (1997)).

B a T lymfocyty jsou mediátory získané, antigeny podmíněné imunity, včetně rozvoje imunologické paměti, která je hlavním cílem vytvoření úspěšné vakcíny (Schijns, V. (2000)). Antigen prezentující buňky (APCs) jsou vysoce specializované buňky, které umí zpracovat antigeny a promítnout jejich zpracované fragmenty na povrch buňky spolu s molekulami potřebnými pro aktivaci lymfocytu. To znamená, že APCs jsou velmi důležité pro iniciaci specifických imunitních reakcí. Hlavními APCs pro aktivaci T lymfocytů jsou dendritické buňky (DCs), makrofágy a B buňky, zatímco hlavními APCs pro B buňky jsou folikulární dendritické buňky. Všeobecně vzato jsou DCs nejmocnějšími APCs ve smyslu imunitních reakcí stimulujících B a T lymfocyty v klidu a paměťové B a T lymfocyty.

Přirozeným úkolem APCs na periférii (tj. DCs nebo Langerhansovy buňky) je zachytit a zpracovat antigeny. Tím jsou APCs aktivovány a • · · · • · · · začínají vysílat molekuly stimulující lymfocyty, migrují do lymfatických orgánů, vylučují cytokiny a prezentují antigeny dalším populacím lymfocytů, čímž iniciují antigeny podmíněné imunitní reakce. APCs nejenom aktivují lymfocyty, ale za určitých podmínek také přizpůsobují T buňky antigenům (Banchereau, J. (1998)).

Pro rozpoznání antigenu T lymfocyty je rozhodující vymezený komplex histokompatibility (MHC). Daný T lymfocyt rozpozná antigen pouze, pokud je peptid navázán na speciální MHC molekulu. Všeobecně, T lymfocyty jsou stimulovány pouze v přítomnosti molekul MHC a antigen je rozpoznán pouze jako peptid navázaný na molekuly MHC. Omezení MHC definuje specificitu T lymfocytů ve smyslu rozpoznání antigenu a ve smyslu molekuly MHC, která váže jeho peptidový fragment.

Vnitrobuněčné a extrabuněčné antigeny představují zcela odlišné výzvy imunitnímu systému, oba ve smyslu rozpoznání a správné reakce. Prezentace antigenů T buňkám je zprostředkována dvěma různými třídami molekul - třídou MHC I (MHC-I) a třídou MHC II (MHC-II), které využívají různé přístupy zpracování antigenu. Můžeme rozlišovat mezi dvěma hlavními přístupy zpracování antigenů, které se vyvinuly. Peptidy odvozené od vnitrobuněčných antigenů jsou prezentovány CD8⁺ T buňkám molekulami MHC-I, které jsou prakticky ve všech buňkách, zatímco peptidy odvozené od extrabuněčných antigenů se prezentují CD4⁺ T buňkám molekulami MHC-II (Monaco, J. (1992); Harding, C. (1995)). K této dichotomii však existují určité výjimky. Některé studie ukazují, že peptidy generované z částic pohlcených endocytózou nebo rozpustné proteiny jsou prezentovány na molekulách MHC-I jak uvnitř makrofágů tak v dendritických buňkách (Harding, C. (1996)); Brossart, P. (1997)). Proto jsou takové APCs, jako dendritické buňky sídlící na periférii, vykazující velkou schopnost zachytit a zpracovat extrabuněčné antigeny a prezentovat je na MHC-I molekulách T lymfocytům zajímavým cílem extrabuněčných impulsů antigenů in vitro i in vivo.

• · · · • · · ·

Důležitá a jedinečná role APCs, včetně stimulačních účinků na různé typy leukocytů, odráží jejich ústřední postavení jako cílů vhodných strategií při vývoji úspěšných vakcín. Jedním ze způsobů, jak to udělat, teoreticky je vylepšit nebo podpořit jejich přirozený úkol, příjem antigenu(ů). Jakmile zachytí impuls příslušných antigenů, proti kterým je vakcína zaměřena, měly by APCs odstartovat proces příjmu antigenů (ů) tím, že se zaktivují a začínají vysílat molekuly stimulující lymfocyty, migrují do lymfatických orgánů, vylučují cytokiny a prezentují antigeny dalším populacím lymfocytů, čímž iniciují imunitní reakce.

Aktivované T buňky obecně vylučují velmi omezené množství cytokinů efektoru, např. interleukin 2 (IL-2), IL-4, IL-5, IL-10 a interferon-γ (IFN-γ). Cytotoxické reakce T lymfocytů na specifické antigeny (např. nádorové antigeny, obecně antigeny podávané ve vakcíně) se obvykle monitorují analýzou ELISpot (enzymová místní imunoanalýza), technikou analyzující produkci cytokinů na úrovni jednotlivé buňky. V tomto vynálezu se ELISpot analýza cytokinů IFN-γ podporujících buněčnou imunitu používala k monitorování úspěšné aktivace T buněk specifických pro peptidy.

Již dříve se ukázalo, že polykationty účinně zlepšují příjem peptidů odpovídajících třídě MHC I do nádorových buněk. Tento peptidový nebo proteinový impulsní proces byl nazván „TRANSloading“ („PŘEkládání“). Nyní jsme navíc ukázali, že polykationty jsou schopny „PŘEložit“ peptidy nebo proteiny do antigenů prezentujících buněk in vivo právě tak jako in vitro. (Buschle, M. (1998)). Navíc souběžná injekce směsi polyL-argininu nebo poly-L-lysinu spolu s příslušným peptidem jako vakcíny chrání zvířata před růstem tumoru u myších modelů (Schmidt, W. (1997)). Tato chemicky definovaná vakcína je schopná indukovat velký počet T buněk specifických pro antigen/peptid. To se dá alespoň z části přičítat zlepšenému příjmu peptidů APCs zprostředkovanému polykationtem (Buschle, M. (1998)), což ukazuje, že, když APCs zachytí impuls od antigenů in vivo, může indukovat imunitu zprostředkovanou T buňkou podávanému antigenů.

• · • · · · • · · ·

Na rozdíl od získané imunity, která je charakterizována vysoce specifickou, ale relativně pomalou reakcí, je přirozená imunita založena na efektorovém mechanizmu, který se spouští rozdíly ve struktuře mikrobiálních komponent vzhledem k hostiteli. Tento mechanizmus může způsobit velice rychlou počáteční odezvu, která hlavně vede k neutralizaci škodlivých látek. Reakce přirozené imunity jsou jedinou obrannou strategií nižších živočichů a u obratlovců zůstaly první obrannou linií hostitele před tím, než se zmobilizuje adaptivní imunitní systém.

U vyšších obratlovců jsou buňkami efektorů přirozené imunity neutrofily, makrofágy, přirozeně zabíjející buňky a pravděpodobně také dendritické buňky (Mizukawa, N. (1999)), zatímco humorální komponenty jsou doplňkovou kaskádou a škálou různých vázajících se proteinů. (Boman, H. (2000)).

Rychlou a efektivní složkou přirozené imunity je produkce široké škály mikrobicidních peptidů s délkou obvykle mezi asi 12 až 100 aminokyselinových zbytků. Několik stovek různých antimikrobiálních peptidů bylo izolováno z různých organizmů, počínaje houbami, hmyzem a konče zvířaty a lidmi, což ukazuje na široké rozšíření těchto molekul. An.timikrobiální peptidy jsou rovněž produkovány baktériemi jako antagonistické látky proti konkurenčním organizmům.

Patentový dokument EP 0 905 141A1 zveřejňuje peptidový fragment anti-LPS faktoru limulu (LALF), který má antivirové účinky. Tento LALF peptid nezlepšuje specificky imunitní odezvu, ale zlepšuje nespecifickou obranu jednojaderných buněk a může se použít pro profylaxi nebo se peptid může aplikovat místně ke zraněnému místu, aby stimuloval zlepšené hojení zranění a zlepšení zdravotního stavu.

Hlavními zdroji antimikrobiálních peptidů jsou granule neutrofilů a buněk epitelu tvořících povrch dýchacího, gastrointestinálního a • · • * · · · «

I······· genitourinárního traktu. Obecně se nacházejí na těch anatomických místech, které jsou nejvíce vystaveny mikrobiálnímu napadení, vylučují se do vnitřních tělesných tekutin nebo se skladují v cytoplasmatických granulích fagocytů (neutrofilů) (Ganz, T. (1997); Ganz, T. (1998); Ganz, T. (1999); Boman, H. (2000); Gudmundsson, GH. (1999)).

Již dříve se ukázalo (patentový dokument AT 1416/2000), že přirozeně se vyskytující antimikrobiální peptidy odvozené od kathelicidinu nebo jejich deriváty mají účinky stimulující imunitní reakci, a proto tvoří vysoce účinný adjuvans.

Podstata vynálezu

Cílem tohoto vynálezu je poskytnout adjuvantní/“nosný peptid“, který je schopen výrazně zlepšit imunitní odezvu specifickou pro souběžně podávaný antigen a tím vytvoří vysoce účinný adjuvans.

Tento cíl se vyřešil vakcínou, která obsahuje alespoň jeden antigen a peptid obsahující sekvenci Ri-XZXZnXZX-R₂, kde

N je celé číslo mezi 3 a 7, výhodně 5,

- X je kladně nabitý přírodní a/nebo nepřírodní aminokyselinový zbytek,

- Zje aminokyselinový zbytek volený ze skupiny L, V, I, F a/nebo W a

- Ri a R₂ jsou voleny nezávisle na sobě ze skupiny -H, -NH₂, -COCH3, COH, peptid s až 20 aminokyselinovými zbytky nebo peptidová reakční skupina nebo peptidové spojení s nebo bez peptidu; X-R₂ může být také amid, ester nebo thioester C-zakončení aminokyselinového zbytku.

Kromě přirozeně se vyskytujících antimikrobiálních peptidů, byly připraveny a zkoumány syntetické antimikrobiální peptidy. Značnou chemoterapeutickou účinnost u myší infikovaných Stafylokokem aureus vykazoval syntetický antibakteriální peptid KLKLLLLLKLK-NH₂; aktivovaly se lidské neutrofily a produkovaly anion (O₂’) prostřednictvím buněčného povrchu kalretikulinu. Přesný počet a umístění K a L se • · ukázaly být kritickými pro antimikrobiální účinnost syntetických peptidů (Nakajima, Y. (1997); Cho, J-H. (1999)).

V průběhu práce na tomto vynálezu se překvapivě ukázalo, že peptidy podle tohoto vynálezu obsahující sekvenci Ri-XZXZnXZX-R₂, kde

- N je celé číslo mezi 3 a 7, výhodně 5,

- Zje aminokyselinový zbytek volený ze skupiny L, V, I, F a/nebo W a

- Ri a R₂ jsou voleny nezávisle na sobě ze skupiny -H, -NH₂, -COCH3, COH, peptid s až 20 aminokyselinovými zbytky nebo peptidová reakční skupina nebo peptidové spojení s nebo bez peptidu; X-R₂ může být také amid, ester (nebo i thioester) C-zakončení aminokyselinového zbytku, (v dalším označované jako „peptidy A“) “PREkládají“ antigenové peptidy nebo proteiny do APCs daleko účinněji než známé adjuvanty, včetně přirozeně se vyskytujících antimikrobiálních peptidů. Mají dále silnou účinnost stimulace imunitní reakce a proto tvoří vysoce účinný adjuvans.

Výhodné je, pokud C-konec není modifikován (COOH nebo COO'), jelikož tato forma je dokonce účinnější než amidová forma peptidu.

V rozsahu tohoto vynálezu sekvence může být na karboxylovém konci převedena v amid nebo nést další aminokyselinovou sekvenci, ale výhodné je, pokud je karboxylový konec volný.

Dále ještě v rozsahu tohoto vynálezu všechna X obsažená v peptidech A mohou představovat tentýž aminokyselinový zbytek. Výhodné však je, pokud v jednom peptidu A X představuje pouze jeden specifický aminokyselinový zbytek, např. buď K nebo R atd. To samé platí ohledně Z: všechna Z v peptidech A mohou být jeden druh aminokyselin nebo různé druhy aminokyselin: např. buď L nebo V atd. To je zejména případ Z_n části ve středu vzorce, která může být např. L5 nebo L₃ právě tak jako LVIFW, LILFLLIW, WIF, W₃L₂ a všechny další kombinace tohoto motivu, které jsou mezi 3 a 7 aminokyselinami, · · · 4

4···4444 44 4 výhodně od 4 do 6 aminokyselinových zbytků, nejvýhodněji 5 aminokyselinových zbytků, pokud se délky týče. Tyto zbytky jsou výhodné i pro části Rj a R₂ (např. více než 50 %, výhodněji více než 80 % a nejvýhodněji více než 90 % Rj a/nebo R₂ jsou L, I, F, V a/nebo W, pokud Rj a/nebo R₂ jsou peptidy). Přednostně jsou Ri a R₂ stejné, výhodně jsou oba H (tj. volné amino- nebo karboxy- zakončení).

Mimo rozsah tohoto vynálezu termín „nepřírodní“ označuje kterýkoliv aminokyselinový zbytek, který se nevyskytuje přirozeně, respektive se nevyskytuje v přírodních proteinech.

Zvláště výhodný je peptid Ri-KLKL5KLK-R₂, ale také RjKIKL₅KIK-R₂, RrKVKLjKVK-Rz, Ri-KFKL₅KVK-R₂, Ri-KLKL₆KLKR₂, R!-KWKW₅KLK-R₂, Ri-KWKWL₃WKWK-R₂, R!-KLKL₄KLK-R₂nebo permutace na pozicích I, F, V, W a L jsou výhodné.

Ovšem vakcína může obsahovat dva nebo více antigenů v závislosti na požadované imunitní reakci. Antigen(y) mohou být také modifikovány tak, aby dále zlepšovaly imunitní reakci.

Jako antigeny se výhodně používají peptidy odvozené od virových nebo bakteriálních patogenů, od plísní nebo parazitů, právě tak se používají nádorové antigeny (rakovinové vakcíny) nebo antigeny s předpokládanou rolí při autoimunní chorobě (používají se také derivatizované antigeny, např. glykosylované, lipidované, glykolipidované nebo hydroxylované antigeny). Dále se mohou jako antigeny samotné použít cukry, tuky nebo glykolipidy. Derivatizační proces může zahrnovat vyčištění specifických proteinů z patogenů, inaktivaci patogenů právě tak jako proteolytickou nebo chemickou derivatizaci nebo stabilizaci proteinu nebo peptidu. Eventuelně se může použít jako antigen patogen samotný. Antigeny jsou výhodně peptidy nebo proteiny, cukry, tuky, glycolipidy nebo jejich směsi.

• 4 · ·

4444

44 44 ••44 · · 4 4« 4 • 4444 444 • 4 444 4444

4444 4444 44 4 44 44

Podle výhodného uspořádání se používají jako antigeny epitopy T buněk. Eventuelně může být výhodná i kombinace epitopů T buněk a B buněk.

Antigeny, které se mají použít v prezentovaných směsích nejsou rozhodující. Podle tohoto vynálezu se mohou použít pochopitelně i směsi různých antigenů. Výhodně se používají proteiny nebo peptidy odvozené od virových nebo bakteriálních patogenů, od plísní nebo parazitů (včetně derivatizovaných antigenů nebo glykosylovaných nebo lipidovaných antigenů nebo polysacharidů nebo lipidů. Dalším výhodným zdrojem antigenů jsou nádorové antigeny. Výhodné patogeny se vybírají z viru lidské imunodeficience (HIV), viru hepatitidy A a B, viru hepatitidy C (HCV), viru Rousova sarkomu (RSV), Epstein Barrova chřipkového viru (EBV), rotaviru, stafylokoka aurea, chlamydie pneumonias, chlamidie trachomatis, mycobacterie tuberculosis, streptoku pneumonias, bacillu anthracis, vibria cholerae, plasmodia sp. (Pl. falciparum, Pl. vivax atd.), aspergillu sp. nebo candida albicans. Antigeny mohou být také molekuly vytlačené z rakovinových buněk (nádorové antigeny). Derivační proces může zahrnovat vyčištění specifických proteinů z patogenových/rakovinových buněk, inaktivaci patogenů jak proteolytickou nebo chemickou derivatizací tak stabilizací takového proteinu. Stejným způsobem se mohou použít ve farmaceutických směsích podle tohoto vynálezu i nádorové antigeny (rakovinové vakcíny) nebo autoimunní antigeny. Pomocí těchto směsí se může provádět vakcinace proti nádorům nebo léčba autoimunních chorob.

V případě peptidových antigenů je do tohoto vynálezu zahrnuto použití peptidových mimotopů/agonistů/superagonistů/antagonistů nebo peptidů změněných na určitých pozicích bez ovlivnění imunologických vlastností nebo nepeptidových mimotopů/agonistů/superagonistů/antagonistů. Peptidové antigeny mohou rovněž obsahovat prodloužení buď na karboxy nebo na aminovém zakončení peptidového antigenů, což usnadňuje interakci • · · · • · · · · · · ········ ·« · s polykationtovými sloučeninami nebo imunostimulujícími sloučeninami. Při léčbě autoimunních chorob se mohou aplikovat peptidoví antagonisté.

Antigeny se mohou také derivatizovat tak, aby zahrnovaly molekuly zlepšující prezentaci a cílení antigenů do buněk prezentujících antigen.

V jednom z uspořádání tohoto vynálezu farmaceutická směs slouží k udělení tolerance proteinům nebo proteinovým fragmentům a peptidům, které jsou zapojeny v autoimunních chorobách. Antigeny použité v tomto uspořádání slouží k tolerování imunitního systému nebo k regulaci imunitních reakcí proti epitopům zapojeným v autoimunních procesech směrem dolů.

Výhodně je antigen peptid obsahující 5 až 60, výhodněji 6 až 30 a zvláště 8 až 11 aminokyselinových zbytků. Antigeny o této délce se ukázaly být obzvláště vhodné pro aktivaci T buněk. Antigeny se mohou dále párovat se zbytkem např. podle patentových dokumentů AT 657/2000, patentového dokumentu US 5 736 292 nebo patentového dokumentu WO 98/01558.

Antigen se může mísit s peptidy podle tohoto vynálezu nebo jinak specificky formulovat např. jako lipozóm, formulace se zpožděným účinkem atd. Antigen se může také kovalentně nebo nekovalentně vázat na peptid podle tohoto vynálezu. Výhodně se antigeny váží kovalentně na peptid jako zbytky Ri nebo R₂ nebo na postranní řetězce aminokyselinových zbytků peptidu, zvláště na postranní řetězec K a R.

Relativní množství jednotlivých složek ve směsi podle tohoto vynálezu je vysoce závislé na nezbytných požadavcích dané směsi. Výhodně se aplikuje mezi 10 ng a 1 g antigenů a peptidu A. Výhodné množství antigenu/peptidu A leží v rozmezí od 0,1 do 1000 pg antigenů a od 0,1 do 1000 pg peptidu A na vakcinaci. Směs podle tohoto vynálezu může dále obsahovat pomocné látky, jako jsou pufry, soli, stabilizátory, ·· «φ ΦΦΦΦ φ φ • φ φ φ • ΦΦΦΦ φ φ φ φ ··«··««< ΦΦ

ΦΦ ΦΦ ΦΦ

imunostimulanty, antioxidanty, atd. nebo jiné účinné látky, jako jsou protizánětlivé nebo antinociceptivní léky.

Směsi podle tohoto vynálezu se mohou pacientovi, např. kandidátovi vakcinace, aplikovat v účinných množstvích, např. v týdenním, dvoutýdenním nebo měsíčním intervalu. Pacientovi se může směs podle tohoto vynálezu aplikovat opakovaně nebo pouze jednou. Výhodné použití podle tohoto vynálezu je aktivní imunizace, zvláště lidí nebo zvířat bez ochrany proti specifickému antigenu.

Směs podle tohoto vynálezu se může aplikovat subkutánně, intramuskulárně, rektálně, intravenózně, intradermálně, intrapinálně, transdermálně právě tak jako orálně.

Ovšem vakcína podle tohoto vynálezu může obsahovat další látky, jako například jakýkoliv další farmaceuticky přijatelný nosič atd. Vakcína podle tohoto vynálezu může být formulována známými metodami, např. jako i.v. vakcíny, DNA vakcíny, transdermální vakcíny, lokální vakcíny, intranasální vakcíny a jako kombinované vakcíny. Dávkování se může stanovit standardními postupy pro vakcíny, které jsou vylepšením známých vakcín, ale je možné stanovit nižší dávku k dosažení stejné ochrany a proto se toto nižší dávkování doporučuje.

Výhodné je, pokud se vakcína poskytuje ve stabilní skladovatelné formě, např. lyofilizovaná, případně v kombinaci s vhodným obnovovacím roztokem.

Aminokyselinové zbytky podle tohoto vynálezu mohou být D nebo L aminokyseliny. Výhodné je, pokud všechny nebo alespoň 80 % zbytků náleží pouze k jednomu druhu (D nebo L). V některých formách mohou peptidy podle tohoto vynálezu obsahovat další aminokyselinové zbytky vložené do sekvence peptidu A, ale v hydrofóbní části (Z, Zn) peptidu by neměly být obsaženy žádné zbytky A, G a T.

·« ··*4

4444 ♦ · · 4 · · 4 4 4 « • · · · 4 · 4 φ • 4 444 · 4 4 4

4444 4444 44 4 44 44

V peptidové sekvenci X je výhodně aminokyselinový zbytek vybraný ze skupiny K, R, ornithin a/nebo homoarginin. X v jednom peptidu A mohou být různé aminokyselinové zbytky vybrané opět z této skupiny, ale je výhodné, pokud je X buď K nebo R nebo ornithin nebo homoarginin v jednom peptidu A.

Podle výhodného uspořádání tohoto vynálezu X v sekvenci peptidů X je K. Peptid A obsahující tuto aminokyselinu jako X vykazuje obzvláště silnou indukci imunitní reakce.

V peptidové sekvenci Z je výhodně aminokyselinový zbytek vybraný ze skupiny L, V, I, F a nebo W. Jak bylo zmíněno pro X, také Z může představovat v jednom peptidu A různé aminokyselinové zbytky. Ale je výhodné, pokud Z v jednom peptidu A je pouze jeden aminokyselinový zbytek, např. buď L nebo V nebo I nebo F nebo W, kdy L a I zbytky jsou nejvýhodnější, následuje F, V a W (L>I>F>V>W).

Nejvýhodnější Z v sekvenci peptidu A je L (nebo I, zvláště L). V tomto případě je peptid A schopen indukovat obzvláště silnou imunitní reakci.

Nejvýhodnější peptid A je H-KLKLLLLLKLK-H. Ovšem do tohoto vzorce je třeba uvažovat také fyziologické formy tohoto peptidu (např. s protonovaným N zakončením (NH₃ ⁺) a deprotonovaným C zakončením (COO')), tak jako u všech peptidů podle tohoto vynálezu.

Podle dalšího výhodného uspořádání tohoto vynálezu představují v peptidové sekvenci Ri a/nebo R₂ 10 až 20 aminokyselinových zbytků. Tak vzniká peptid A s délkou, s kterou vykazuje obzvláště silnou indukovanou nebo zvýšenou imunitní reakci.

Podle výhodného uspořádání tohoto vynálezu jsou aminokyselinové zbytky Ri a/nebo R₂ nezáporně nabité aminokyselinové zbytky.

• 9 »9 99 ··♦· 9 · · 9_t φ • 999» 999 • · 999 9999 • ••••«*9 99 9 99 99

A opět, aminokyselinové zbytky mohou být přírodní a/nebo nepřírodní aminokyselinové zbytky. Po připojení nezáporně nabitých aminokyselinových zbytků k jednomu nebo oběma koncům peptidu A vykazuje tento peptid silnou schopnost zvýšení nebo indukce imunitní reakce.

Ri a R₂ tvoří výhodně hydrofobní konec peptidu A. Proto jsou aminokyselinové zbytky Ri a/nebo R₂ výhodně voleny ze skupiny spočívající v L, V, I, F a/nebo W.

Ještě výhodněji jsou aminokyselinové zbytky Ri a/nebo R₂ voleny ze skupiny spočívající v L, I, a/nebo F. Nej výhodnějším aminokyselinovými zbytky jsou L. Tyto peptidy A vykazují zvláště velkou schopnost indukce vyšší imunitní reakce.

Podle výhodného uspořádání podle tohoto vynálezu jsou aminokyselinové zbytky Ri a/nebo R₂ kladně nabité přirozené a/nebo nepřirozené aminokyselinové zbytky. Výhodně jsou tyto přídavné aminokyselinové zbytky voleny ze skupiny spočívající v K, R, ornithin a/nebo homoarginin. Ještě výhodněji jsou aminokyselinové zbytky Ri a/nebo R₂ K. Tyto peptidy A také vykazují obzvláště dobrou schopnost indukce vyšší imunitní reakce.

Je výhodné, pokud aminokyselinové zbytky Rj a/nebo R₂ se volí z první skupiny (L, V, I, F a/nebo W) nebo z druhé skupiny (spočívající z kladně nabitých aminokyselinových zbytků). Ale je také možné, aby aminokyselinové zbytky Ri a/nebo R₂ byly voleny z obou skupin pro jeden jednotlivý peptid A.

Peptidy se mohou spojovat do jádra peptidu A podle tohoto vynálezu normálními peptidovými vazbami nebo prostřednictvím peptidových reakčních skupin nebo peptidovými „spojovači“. Peptidové reakční skupiny jsou chemické skupiny vhodné pro vázání peptidů nebo proteinů. Proto se N- nebo C- zakončení peptidu A může chemicky modifikovat tak, aby obsahovalo chemickou modifikaci (např.

• · ·

99 iminothionan, 3-merkaptopropionyl, ....), umožňující kovalentní připojení peptidů nebo proteinu. Alternativně může peptid A obsahovat vhodný peptidový spojovač, tj. spojovací molekulu, schopnou tvořit spojení mezi jádrem peptidů A (např. peptid bez Ri a/nebo R₂) a antigenem k němu připojeným nebo připojení schopným. Peptid podle tohoto vynálezu může být přítomen s nebo bez peptidu/antigenu připojeným k peptidové reakčni skupině a/nebo peptidovému spojovači. Tyto chemické modifikace a vhodní peptidoví spojovači jsou dobře známí zkušeným pracovníků v oboru.

Vakcína výhodně obsahuje alespoň jednu další látku stimulující imunitní reakci. Jako látka stimulující imunitní reakci se může použít jakákoliv látka nebo molekula, která je známá jako adjuvans. Takové látky jsou zveřejněny v patentovém dokumentu WO 93/19768. Jinými takovými látkami mohou být např. polykationty, jako například polylysin nebo polyarginin. Jinými adjuvanty mohou být složky ve formě částic, např. silikagel nebo dextranové perličky, které jsou dostatečně malé, aby mohly vniknout do buněk. Přidání této další látky stimulující imunitní reakci učiní vakcínu ještě účinnější.

Farmaceutická směs podle tohoto vynálezu, zvláště ve formě vakcíny, dále výhodně obsahuje polykationtový peptid, zvláště polyarginin, polylysin nebo antimikrobiální peptid.

Polykationtová(é) sloučenina(y) používaná podle tohoto vynálezu může být jakákoliv polykationtová sloučenina, která vykazuje charakteristické účinky podle patentového dokumentu WO 97/30721. Výhodné polykationtové sloučeniny se volí z bazických polypeptidů, organických polykationtů, bazických polyaminokyselin nebo jejich směsí. Tyto polyaminokyseliny by měly mít délku řetězce alespoň čtyři aminokyselinové zbytky. Zvláště výhodné jsou látky obsahující peptidové vazby, jako polylysin, polyarginin a polypeptidy obsahující více než 20 %, výhodněji více než 50 % bazických aminokyselin v rozmezí více než 8, výhodněji více než 20 aminokyselinových zbytků nebo jejich směsí.

• 9 9«

9 9 9 9 9

9 9 9

9 9 9 9

9 9 9

9999 9999 99 **·· •9 999»

9 9 9 • 9 9 9

9 9 9 9 • 9 9 9 «

99 99

Další výhodné polykationty a jejich farmaceutické směsi jsou popsány v patentovém dokumentu WO 97/30721 (např. polyethylenimin) a patentovém dokumentu WO 99/38528. Tyto polypeptidy obsahují výhodně mezi 20 a 500 aminokyselinovými zbytky, výhodněji mezi 30 a 200 zbytky.

Tyto polykationtové sloučeniny se mohou připravit chemicky nebo rekombinací nebo se mohou získat z přírodních zdrojů.

Kationtové (poly)peptidy mohou být také polykationtové antibakteriální mikrobiální peptidy. Tyto (poly)peptidy mohou být prokaryotického nebo eukaryotického původu, nebo se mohou připravit chemicky nebo rekombinací. Peptidy mohou také náležet k třídě přírodně se vyskytujících antomikrobiálních peptidů. Tyto hostitelské obranné peptidy jsou také preferovanou formou polykationtového polymeru podle tohoto vynálezu. Obecně, sloučenina dovolující jako konečný produkt aktivaci (nebo naopak regulaci směrem dolů) získaného imunitního systému, výhodně zprostředkovanou APCs (včetně dendritických buněk) se používá jako polykationtový polymer.

Zvláště výhodné pro použití jako polykationtová látka v tomto vynálezu jsou antimikrobiální peptidy odvozené od kathelicidinu nebo jejich deriváty (AT 1416/2000), včleněno zde odkazem), zvláště antimikrobiální peptidy odvozené od savčích kathelicidinů, výhodně od lidských, bovinních (hovězích) nebo myších.

Jako imunostimulans lze dále použít neuroaktivní sloučeniny, jako je (lidský) růstový hormon (jak je popsáno např. v WO 01/24822).

Polykationtové sloučeniny odvozené z přírodních zdrojů zahrnují HIV-REV nebo HIV-TAT (odvozené kationtové peptidy, antennapedické peptidy, chitosan nebo jiné deriváty chitinu) nebo jiné peptidy odvozené od těchto peptidů nebo proteinů biochemickou produkcí nebo rekombinací. Dalšími výhodnými polykationtovými sloučeninami jsou •Λ 9**9 •9 ·»·«

99 « · · 9 • 9 • 9 ·♦»·999* kathelin nebo příbuzné nebo odvozené látky od kathelicidinu, zvláště myšího, bovinního nebo obzvláště lidského kathelicidinu. Příbuzné nebo odvozené kathelicidinové látky obsahují buďto celou nebo části kathelicidinové sekvence s alespoň 15-20 aminokyselinovými zbytky. Deriváty mohou být substituční nebo modifikace přírodních aminokyselin aminokyselinami, které nejsou mezi 20 standardními aminokyselinami. Navíc do těchto kathelicidinových molekul se mohou zavést další kationtové zbytky. Tyto kathelicidinové molekuly se výhodně kombinují se směsí antigen/vakcína podle tohoto vynálezu. Ale tyto kathelicidinové molekuly se překvapivě ukázaly být také účinným adjuvantem pro antigen, do kterého nebyl žádný další adjuvans přidán. Je proto možné tyto kathelicidinové molekuly používat jako účinné adjuvanty při formulacích vakcíny s nebo bez dalších imunoaktivačních látek.

Výhodnou látkou stimulující imunitní reakci je cytokin. Cytokiny hrají důležitou roli při aktivaci a stimulaci B buněk, T buněk a NK buněk, makrofágů, dendritických buněk a různých dalších buněk účastnících se indukčních imunitních reakcí. Může se použít jakýkoliv cytokin, který dále zlepší imunitní reakci na antigen(y).

Vakcína podle tohoto vynálezu dále výhodně obsahuje imunostimulující/imunogenní nukleovou kyselinu, výhodně oligodeoxynukleotid obsahující deoxyinosin, oligodeoxynukleotid obsahující deoxyuridin, oligodeoxynukleotid obsahující methylovaný nebo nemethylovaný CG motiv nebo inosin a cytidin obsahující molekulu nukleové kyseliny.

Imunogenní nukleové kyseliny používané podle tohoto vynálezu mohou být syntetického, prokaryotického nebo eukaryotického původu. V případě eukaryotického původu by DNA měla být odvozena od méně vyvinutých druhů (např. hmyzu, ale také dalších), založeno na fylogenetickém stromu. Podle výhodného uspořádání podle tohoto vynálezu je imunogenní oligodeoxynukleotid (ODN) synteticky připravená molekula DNA nebo směsi takových molekul. Sem jsou ·* ·· • · φ « •w ΦΦΦ« φφ φφφφ φφφφ ···· • * · 9 Φ Φ

Φ Φ * Φ Φ Φ • · Φ Φ V « « φ

Φ * Φ Φ · Φ φ

Φ· Φ ΦΦ ΦΦ zahrnuty také deriváty nebo modifikace ODN, jako substituované thiofosfáty (thiofosfátové zbytky substituované na fosfátu) popsané například v patentových dokumentech US 5 723 335 a US 5 663 153 a další deriváty a modofikace, které výhodně stabilizují imunostimulační směs(i), ale nemění jejich imunologické vlastnosti. Výhodným sekvenčním motivem je šestibázový DNA motiv obsahující (nemethylovaný) CpG dinukleotid chráněný po stranách dvěma 5'puriny a dvěma 3'pyrymidiny (5 '-Pur-Pur-C-G-Pyr-Pyr-3'). Tento CpG motiv obsažený v ODN podle tohoto vynálezu je obvyklejší v mikrobiální DNA než v DNA vyšších obratlovců a zobrazuje rozdíly ve vzorci methylace. Překvapivě, sekvence stimulující APCs u myší nejsou příliš účinné pro lidské buňky. Výhodné palindromatické nebo nepalindromatické ODN používané podle tohoto vynálezu jsou zveřejněny např. v patentových dokumentech AT 1973/2000, AT 805/2001, EP 0 468 520A2,

WO 96/02555, WO 98/16247, WO 98/18810, WO 98/37919, WO 98/40100, WO 98/52581, WO 98/52962, WO 99/51259, a WO 99/56755, vše včleněno odkazem. Kromě stimulace imunitního sytému některé ODNs neutralizují některé imunitní odezvy. Také tyto sekvence jsou zahrnuty v tomto vynálezu, například pro aplikaci při léčbě autoimunních chorob. ODN/DNA se mohou připravit chemicky nebo rekombinací nebo se mohou získat z přírodních zdrojů. Výhodným přírodním zdrojem je hmyz.

Alternativně se mohou výhodně použít jako imunostimulační nukleové kyseliny podle tohoto vynálezu také nukleové kyseliny založené na inosinu a cytidinu (popsáno např. v PCT/EP01/06437) nebo deoxynukleové kyseliny obsahující deoxyinosinové a/nebo deoxyuridinové zbytky (popsáno v patentovém dokumentu AT 1973/200 a AT 805/2001, včleněno odkazem).

Pochopitelně se podle tohoto vynálezu mohou využít také směsi různých imunogenních nukleových kyselin.

• · • 444 ·· 4 4 4 · • · 4 4 4 444

44444 444 4

4 444 4444

4444 4444 44 4 44 44

Dalším aspektem tohoto vynálezu je použití peptidu obsahujícího sekvenci Ri-XZXZnXZX-R₂ (peptid A) definovaného výše při přípravě adjuvantu ke zlepšení imunitní odezvy na alespoň jeden antigen.

Podle výhodného uspořádání tohoto vynálezu se adjuvans přidává do vakcíny. Je ovšem možné podávat adjuvans přímo savci, např. přednostně před vakcinací. Je ovšem snazší přidat adjuvans do vakcíny, takže poté se savci podává vše najednou.

Podle dalšího aspektu se tento vynález týká způsobu vakcinace savců včetně lidí proti specifickým antigenům nebo skupinám specifických antigenů. Tento způsob zahrnuje podávání účinného množství vakcíny podle tohoto vynálezu zmíněným savcům včetně lidí, kteří mají být předmětem vakcinace. Alternativně způsob zahrnuje podávání účinného množství adjuvantu obsahujícího peptid A, jak bylo popsáno výše a poté se aplikuje vakcína.

Tento vynález bude popsán detailněji na následujících příkladech a obrázcích, ale vynalez jimi samozřejmě není nikterak limitován.

Obrázek 1 ukazuje kapacitu PŘEkládání (syntetického antimikrobiálního) peptidu KLKLLLLLKLK (identifikační číslo sekvence (SEKV ID) 1) ve srovnání s různými výše popsanými „nosnými peptidy“.

Obrázek 2 ukazuje účinnost různých peptidů podle tohoto vynálezu ve srovnání s jinými peptidy.

Obrázek 3 ukazuje množství buněk produkujících IFN-γ u myší vakcinovaných antigenovým peptidem v kombinaci s (syntetickým antimikrobiálním) peptidem KLKLLLLLKLK.

• · ···· ···· ·· · ·® ··

PŘÍKLADY

Příklad 1

PŘEkládání myších makrofágů syntetickým antimikrobiálním peptidem jako „nosným peptidem“.

Aby se otestovalo, jestli (syntetický antimikrobiální) peptid KLKLLLLLKLK je schopen fungovat jako „nosný peptid“ pro antigeny tak, aby PŘEložil APCs in vitro, což znamená zlepšení zachycení antigenu APCs, použil se jako antigenový peptid fluorescentně značený peptid. Ten se smíchal s různými koncentracemi KLKLLLLLKLK a dalšími výše popsanými „nosnými peptidy“.

K porovnání účinnosti peptidové distribuce těchto různých „nosných peptidů“, se monitorovalo množství peptidu zachyceného APCs inkubací buněk P388D1 (linie myších buněk prezentujících antigen monocyt-makrofága; nakoupeno od ATCC (TIB-63)) po dobu jedné hodiny při teplotě 37 °C s konstantním množstvím peptidu značeného fluoresceinem buď samotného nebo v kombinaci s různými „nosnými peptidy“ v indikovaných koncentracích. Před analýzou buněk průtokovou cytometrií se buňky důkladně promyly, aby se odstranily volné peptidy. Poměrné množství fluoresceinem značeného peptidu zachyceného buňkami se měřilo průtokovou cytometrií.

Jako antigenový peptid se použil peptid vázaný na MHC třídy I (Kd) odvozený od chřipkového hemaglutininu (Buschle, M. (1997)). 2 pg tohoto antigenového peptidu (FL-LFEAIEGFI) se smísily s třemi různými množstvími testovaného „nosného peptidu“ v koncentracích představujících 101,7, 50,9 a 5,09 nmol kladného náboje. (Obrázek 1 ukazuje složený přírůstek zachycení vylepšeného peptidu ve srovnání s peptidem samotným):

• · ·· · · ·· ···· «··· ·· · ·· · • · · · · · · · · ···· ···· ·· · ·· ·· peptid FL-LFEAIEGFI smísený s (1) + poly-L-arginin (pR 60; 60 mer) (2) + myší antimikrobiální peptid odvozený od kathelicidinu (mCRAMP);

SEKV ID 2 (3) + LL-37; SEKV ID 3 (4) + L-indolicidin; SEKV ID 4 (5) + KLKLLLLLKLK (volné C zakončení); SEKV ID 1 (6) + lineární hovězí dodekapeptid; SEKV ID 5 (7) + cyklický hovězí dodekapeptid

Zatímco fluorescence v buňkách vystavených samotnému peptidu byla rozptýlená (jak bylo ukázáno výše), v buňkách „PŘEložených“ (syntetickým antimikrobiálním) peptidem KLKLLLLLKLK jako „nosným peptidem“ byla zvláště intenzivní, což indikuje, že je schopen velmi účinně vystavovat APCs impulsům antigenových peptidů.

Příklad 2

PŘEkládání myších makrofágů různými syntetickými antimikrobiálními peptidy jako „nosnými peptidy“.

Různé syntetické makrobiální peptidy se sekvencí Ri-XZXZnXZXR₂ se testovaly, zda jsou schopny fungovat jako „nosné peptidy“ pro antigeny tak, aby PŘEložily APCs in vitro, což znamená zlepšení zachycení antigenu APCs. K tomuto účelu se použil jako antigenový peptid fluorescentně značený peptid. Ten se smíchal s různými koncentracemi peptidů obsahujících sekvenci Ri-XZXZnXZX-R₂ a dalšími výše popsanými „nosnými peptidy“.

K porovnání účinnosti peptidové distribuce těchto různých „nosných peptidů“, se monitorovalo množství peptidu zachyceného APCs inkubací buněk P388D1 (linie myších buněk prezentujících antigen monocyt-makrofága; nakoupeno od ATCC (TIB-63)) po dobu jedné hodiny při teplotě 37 °C s konstantním množstvím peptidu značeného • · · · • · ··· ···· ···· ···· ·· · ·· ·· fluoresceinem buď samotného nebo v kombinaci s různými „nosnými peptidy“ v indikovaných koncentracích. Před analýzou buněk průtokovou cytometrií se buňky důkladně promyly, aby se odstranily volné peptidy. Poměrné množství fluoresceinem značeného peptidu zachyceného buňkami se měřilo průtokovou cytometrií.

Jako antigenový peptid se použil peptid vázaný na MHC třídy I (Kd) odvozený od chřipkového hemaglutininu (Buschle, M. (1997)). 3 pg tohoto antigenového peptidu (FL-LFEAIEGFI) se smísily s třemi různými množstvími testovaného „nosného peptidu“ v koncentracích představujících 101,7, 50,9 a 5,09 nmol kladného náboje. (Obrázek 2 ukazuje složený přírůstek zachycení vylepšeného peptidu ve srovnání s peptidem samotným):

peptid FL-LFEAIEGFI smísený s (1) poly-L-arginin (pR 60; 60 mer) (2) Hp (2-20), cekropinu podobný antimikrobiální peptid odvozený od ribozomálního proteinu LI Helicobacter pylori; SEKV ID 6 (3) LALF-peptid: SEKV ID 7 (4) myší antimikrobiální peptid odvozený od kathelicidinu SEKV ID 2 (5) KAKAAAAAKAK-NH₂; SEKV ID 8 (6) KGKGGGGGKGK-NH₂; SEKV ID 9 (7) KTKTTTTTKTK-NH₂; SEKV ID 10 (8) KLKLVIFWKLK-NH₂; SEKV ID 11 (9) KVKVVVVVKVK-NEG; SEKV ID 12 (10) KWKWWWWWKWK-NH₂; SEKV ID 13 (11) KFKFFFFFKFK-NH₂; SEKV ID 14 (12) RLKLLLLLKLR-NH₂; SEKV ID 15 (13) RLRLLLLLRLR-NH₂; SEKV ID 16 (14) KLKLLLLLKLK-NH₂; SEKV ID 17 (15) KLKLLLLLKLK-COOH (volné C zakončení); SEKV ID 1

Zatímco fluorescence v buňkách vystavených samotnému peptidu byla rozptýlená (jak bylo ukázáno výše), v buňkách „PREložených“ ·· ·· ·· ···· ·· ···· ···· · · · · · · ···· · · · · peptidem obsahujícím sekvenci R4-XZXZNXZX-R2 (včetně výše zmíněných výhodných uspořádání) jako „nosným peptidem“ byla zvláště intenzivní, což indikuje, že peptidy podle tohoto vynálezu jsou schopny velmi účinně vystavovat APCs impulsům antigenových peptidů.

Příklad 3

Testování schopnosti vylepšení indukce reakcí T buněk specifických pro peptidy in vivo

Pro testování schopnosti (syntetického antimikrobiálního) peptidu KLKLLLLLKLK zlepšit indukci peptidové specifických reakcí T buněk in vivo se podkožně naočkovaly skupiny 4 myší (C57BL/6, samice, 8týdenní, H-2b) do slabiny třikrát (dny: 0, 28, 56) antigenovým melanomovým peptidem (100 pg) odvozeným od TRP-2 (myší protein-2 příbuzný tyrosináze) samotným nebo v kombinaci poly-L-argininem nebo (syntetickým antimikrobiálním) peptidem KLKLLLLLKLK jako „nosným peptidem“. Použitá množství (syntetického antimikrobiálního) peptidu KLKLLLLLKLK představují čtyři různá množství při koncentracích představujících stejné množství (100 pg) poly-L-argininu v pg a stejné (168 pg), dvojnásobné (336 pg) a trojnásobné (504 pg) množství poly-Largininu ve smyslu kladných nábojů. Skupiny myší se očkovaly následovně (množství uváděné/na 1 myš).

(1) 100 pg peptidu (2) 100 pg peptidu + 100 pg poly-L-argininu (pR 60) (3) 100 pg peptidu + 100 pg KLKLLLLLKLK (4) 100 pg peptidu + 168 pg KLKLLLLLKLK (5) 100 pg peptidu + 336 pg KLKLLLLLKLK (6) 100 pg peptidu + 504 pg KLKLLLLLKLK dní po třetí vakcinaci se odstranily tříselné lymfatické uzliny a buňky lymfatické uzliny se aktivovaly ex vivo peptidem odvozeným od TRP-2 (myší protein-2 příbuzný tyrosináze), aby se stanovily buňky • · • ·· · specifické pro tvorbu IFN-γ analýzou ELISpot (počet IFN-yELISpot na milion buněk lymfatické uzliny (LU)).

Obrázek 3 ukazuje, že očkování myší peptidem plus vzrůstajícím množstvím KLKLLLLLKLK má za následek daleko více buněk produkujících IFN-γ, než očkování peptidem samotným nebo jeho kombinací s poly-L-argininem. Potvrdilo se také, že peptid KLKLLLLLKLK nevyvolává T buňky specifické pro peptidy produkující IFN-γ (potvrzeno analýzou ELISpot), tj., že při těchto pokusech se získaly pouze T buňky nespecifické pro KLKLLLLLKLK.

Tento příklad jasně demonstruje, že (syntetický antimikrobiální) peptid KLKLLLLLKLK zlepšuje indukci reakcí T buněk specifických pro peptidy in vivo.

Shrnuto, (syntetický antimikrobiální) peptid KLKLLLLLKLK vykazuje vysokou „PŘEkládací“ a imunostimulační účinnost, naznačující, že peptidy A jsou schopny jsou schopny velmi účinně vystavovat APCs impulsům antigenových peptidů in vitro a in vivo a jsou dobré adjuvanty/“nosiči peptidů“ získaných imunitních reakcích indukovaných peptidy antigenu.

• 4

4 4 4

4 444 4444

44444444 44 4 44 4·

Odkazy:

Banchereau, et al. (1998), „Dendritic cells and the control of immunity“, Nátuře 392(6673): 245-52.

Boman (2000), „Innate immunity and the normál microflora“, Immunol, Rev. 173: 5-16.

Brossart, et al. (1997), „Presentation of exogenous protein antigens on major histocompatibility complex class I molecules by dendritic cells: pathway of presentation and regulation by cytokines“, Blood 90(4): 15949.

Buschle, et al. (1998), „Chemically defined, cell-free cancer vaccines: use of tumor antigen-derived peptides or polyepitope proteins for vaccination“, Gene Therapy and molecular Biology 1: 309-21.

Buschle, et al. (1997), „Transloading of tumor antigen-derived peptides into antigen-presenting cells“, Proč. Nati. Acad. Sci., USA 94(7): 325661.

Cho, et al. (1999), „Activation of human neutrophils by a synthetic antimicrobial peptide, KLKLLLLLKLK-NH₂, via cell surface calreticulin“, Eur. J. Biochem. 266: 878-85.

Ganz, et al. (1997), „Antimicrobial peptides of leukocytes“, Curr. Opin. Hematol. 4(1): 53-8.

Ganz, et al. (1998), „Antimicrobial peptides of vertebrates“, Curr. Opin. Immunol. 10(1): 41-4.

Ganz, et al. (1999), „Antibiotic peptides from higher eukaryotes: biology and applications.“ Mol. Med. Today 5(7): 292-7.

• · ♦ · • · · · • · · · · ···· • ΑΑΑ ·ΑΑ· AA · ·· ··

Gudmundsson, et al (1999), „Neutjrophil antiacterial peptides, multifunctional effector molecules in the mammalian immune systém“, J. Immunol. Methods 232(1-2); 45-54.

Harding (1995), „Phagocytic processing of antigens for pre-sentation by MHC molecules“, Trends in Cell Biology 5(3): 105-09.

Harding (1996), „Clss I MHC presentation of exogenous antigens“, J. Clin. Immunol. 16(2): 90-6.

Mizukawa, et al. (1999), „Presence of defensin in epithelial Langerhans cells adjacent to oral carcinomas and precancerous lesions“, Anticancer Res. 19(4B): 2669-71.

Monaco (19925), „A molecular model of MHC class-I-restricted antigen processing“, Immunol. Today 13(5): 173-9.

Nakajima, et al. (1997), „Chemotherapeutic activity of synthetic antimicrobial peptides: correlation between chemotherapeutic activity and neutrophil-activating activity“, FEBS Lett. 415: 64-66.

Schijns (2000), „Immunological concepts of vaccine adjuvant activity“, Curr. Opin. Immunol. 12(4): 456-63.

Schmidt, et al. (1997), „Cell-free tumor antigen peptide-based cancer vaccines“, Proč. Nati. Acad. Sci., USA 94(7): 3262-7.

Zanetti, et al. (1997), „The cathelicidin family of antimicrobial peptide precursors: a acomponent of the oxygen-independent defense mechanisms of neutrophils“, Ann N.Y. Acad. Sloučenin. 832: 147-62.

*» £ $ — · · ··· ··· • ···.«· · · · · • · ·· · · » · · ···« ···· ·· · ·· ··

Seznam sekvencí <110» Čistem Biotechnologies GmbH <120» Vaccine. composition <130» R 38239 <140» <141» <160» 17 <17 0» Patentln Ver. 2.1 ' <210» 1 <211> 11 <212» PRT <213> Artificial Sequence <220» <223» Description of Artificial Sequence:peptide <400» 1

Lys Leu Lys Leu Leu Leu Leu Leu Lys Leu Lys 1 5 ~ 10.

<210» 2 <211» 31 <212» PRT <213> Artificial Sequence <220» <223> Description -of Artificial Sequence:peptide <400» 2

Arg Leu Ala Gly Leu Leu Arg Lys Gly Gly Glu Lys Ile Gly Glu Lys 1 5 10 15

Leu Lys Lys Ile Gly Gin Lys Ile Lys Asn Phe Phe Gin Lys Leu 20 25 30 <210» 3 <211» 37 <212> PRT <213> Artificial Sequence

0 ·* * 0 0 0 0 0 0« 0*00 0 0 '0 0 0 0' 0 0 0 '·

0 · 0· » 0 -0 0

0 0 0 0-. 0 0 0. 0 00'0 000««- 00 0 ·0 00 <22Q>

<223> Description Of Artificial Sequencerpéptide <400> 3 ·· · '

Leu Leu Gly Asp Phe Phe Arg Lys Ser Lys

Glu Lys

Ile

Gly Lys 15

Glu

·· i

5 - · ·

10

Phe

Lys

Arg

Ile Val

Gin Arg'

Ile

Lys

As.p

Phe

Leu

Arg

Asn

Leu

Val

20

25

30

Pro'

Arg

Thr

Glu Ser

<210> 4 <211> 13 <212> PRT . .

<213> Artificial Sequence <220> ’ <2.23> Description of Artificial. Sequenceipeptide<220>

<221> MOD_RES' <222> (13) <223> AMIDATI.OŇ <400> 4’

Ile Leu Pro Trp Lyá Trp Pro Trp Trp Pro Trp Arg Arg θ. . 1 5 10 <210> 5 · .

<211> .12 •<212> PRT .

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Description of ’ Artificial Sequence:peptide <400> 5

Arg Leu Cys Arg Ile Val Val Ile Arg Val Cys Arg

5 10' <210> 6 <2I1> 19 •s-z?• · 99 ’ - 99 . 99 9 9 • '99.9 « 9 ' . 9.

9 9 ’ 9 '9 9 · 9 9 · ·«««·«<« · 9 ·

9« 9999

9

9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> \ <223> Ďescription of Artif icial Sequencě:peptide ý400> 6

Ala Lys Lys Val Phe Lys Arg Leu Glu Lys Leu Phe Ser Lys Ile Gin • 1 5· 10 15

Asn Asp -Lys .

•<21Ó> 7 <211> 10 .

<212> PŘT <213> Artificial Sequehce <220>

<223> Ďescription of Artificial Sequence:peptide <400> 7

Arg Ile Lys Pro Thr Phe Árg Árg Leu; Lys 1 5- 10.

<210> 8 <211> 11· . <212> PRT <213> Artificial 'Sequence <220>

<223> Ďescription of. Artificial Sequehce .-peptide <220>

<221> MOD_RES <222> (11) <223> AMIDATION <400> 8 '

Lys Ala Lys Ala Ala Ala Ala' Ala Lys Ala Lys 1 5 10 .

<210> 9 <211> 11 <212> PRT.

9# '·«·· • · 9« . 9 9 9 • · • · • '· 99*9 ·«·»

9999 • · » 9 • ,* ·

9 > ·. « 9

9 9

<213> Artifičial Sequence <220> ' <223> Descriptionof Artifičial Sequencezpeptide <220>

<221> MOD_RES . . ·' <222> (11) <223> AMIDATION ' <400> 9 . .

Lys Gly Lys. Gly Gly Gly Glý Gly Lys Gly Lyš .' · 1 . 5 . 10

O ' . <210> 10 ·· <2ll> 11 <212> PŘT .

<213> Artifičial'.Sequence <220>

<223> Description of Artifičial Sequencezpeptide <220>

<221> MOD_RES <222> (11) <223> AMIDATION <400> 10

Lys .Thr Lys Thr Thr Thr Thr. Thr'.Lys. Thr Lys Γ) 1 ” 5 10 · <210> 11 ’ . <211> 11 <212> PRT <213> Artifičial Sequence <22Q>

<223> Description of Artifičial Sequencezpeptide <220>

<221> MOD_RES .· <222> (11) · · <223> AMIDATION <400> 11 ...

Lys Leu Lys Leu Val Ile Phe Trp Lys Leu Lys w *· ·· «» 44 4« 4» ·*«· ·».· 4 ···«<** *

4- 4.44 4 4« 4 ••4 4 4 4 4 4 4 4 • 4 4 4 4 4 4 4 4 ••••-•444 4-4 · «'» *».

t ζΆή ' ' , 1 5 10 <210> 12 <:211> 11 :

' <212> PRT <213> Artificial Sequence <220>

<223> Description of Artificial Sequence:peptide <220>

. <221> MOD_RÉS <222> (11) <223> AMIDATION o,. x · <400> '12 ·

Lys Val Lys Val Val Val Val Val Lys Val Lys ' 1 5- 10 <210> 13 <2ii> ii ··.· <212> PRT <213> Artificial Sequence ' <220> . · <223> Description of Artificial Sequence:peptide • <220>

θ <221> MOD_RES <222> (11) <223> AMIDATION <4Q0> 13'

Lys Trp Lys Trp Trp Trp Trp Trp Lys Trp Lys 1 . · 5 . 10 <21Q> 14 <211>.ll <212> PRT <213> Artificial Sequence <220>

<223> Description of Artificial Sequence:peptide.

<220>' · ·· 99 9999 99 99· • < 9 9 · β 9 · 9 • · · 99.9 9 · 9

·. .99 9 9 9 9*9

9 999 '999

9999 9999 99 9 99 99

-6<í(?

99 <221> M0D_RES <222> (11) <223> AMIDATION <400> 14 .Lyš Phe Lys Phe Phe Phe Phe Phe Lys Phe Lys 1 5 10

<210> 15' . ' <211> 11 · <212> PRT .

<213> Artificial Sequenee <2.20>..

<223> Description of Artificial Sequence.-peptide.

. <220> .

<221> M0D_RES ' <222> (11) <223> AMIDATION <400> 15 · ' Arg Leu Lys Leu Leu Leu Leu LeU Lys Leu Arg '1 '5 10 <21Ó> 16 ' .

<211> Ti <212> PRT <213> Artificial Sequenee.

<220>

<223> Description of Artificial Sequenee:peptide <220>

<221> M0D_RES <222> (11) <223> AMIDATION <400> 16 '

Arg Leu Arg Leu Leu Leu Leu Leu Arg Leu Arg 1 5 10 <210> 17 <211> 11 <212> PRT • 4 *

4444 • 4 ···· • 4 4

4 ·' • 44 · • 4 4 ·· 4

444 • 4

4 4 ·

4 4 ·· ··

44 <2l3> Artificial Sequence <220> ' <223> Description of Artificial Seguence:peptide <220>

<221-> MOD_RES <222> (11) .

<223> AMIDATION <400> 17

Lys Leu Lys Leu Leu Léu Leu Leu Lys Leu Lys 1 5 .10 •9 99 • 9*9

9 9 9 • 9

1999 9999 99 9 99 99

Claims

1. Vakcína, vyznačující se tím, že obsahuje alespoň jeden antigen a peptid obsahující sekvenci Rj-XZXZnXZX-R2, kde

- N je celé číslo mezi 3 a 7, výhodně 5,

- Zje aminokyselinový zbytek volený ze skupiny L, V, I, F a/nebo W a

- Ri a R₂ jsou voleny nezávisle na sobě ze skupiny -Η, -NH2, -COCH3, COH, peptid s až 20 aminokyselinovými zbytky nebo peptidová reakční skupina nebo peptidové spojení s nebo bez peptidu; X-R₂ může být také amid, ester nebo thioester C-zakončení aminokyselinového zbytku.

2. Vakcína podle nároku 1, vyznačující se tím, že v peptidové sekvenci X je aminokyselinový zbytek volený ze skupiny K, R, ornithin a/nebo homoarginin.

3. Vakcína podle nároku 2, vyznačující se tím, že v peptidové sekvenci X jeK.

4. Vakcína podle kteréhokoli z nároků 1 až 3, vyznačující se tím, že v peptidové sekvenci Zje aminokyselinový zbytek volený ze skupiny L, I, a/nebo F.

5. Vakcína podle nároku 4, vyznačující se tím, že v peptidové sekvenci Z je L.

6. Vakcína podle nároku 1, vyznačující se tím, že peptidová sekvence je H-KLKLLLLLKLK-H.

7. Vakcína podle kteréhokoli z nároků 1 až 6, vyznačující se tím, že v peptidové sekvenci Ri a/nebo R2 je/jsou 10 až 20 aminokyselinových zbytků.

• · · · • · · ♦

26·^

8. Vakcína podle nároku 7, vyznačující se tím, že aminokyselinové zbytky Ri a/nebo R2 jsou nezáporně nabité aminokyselinové zbytky.

9. Vakcína podle nároku 8, vyznačující se tím, že aminokyselinové zbytky Rj a/nebo R2 jsou voleny ze skupiny L, V, I, F a/nebo W.

10. Vakcína podle nároku 9, vyznačující se tím, že aminokyselinové zbytky Ri a/nebo R2 jsou voleny ze skupiny L, I, a/nebo F.

11. Vakcína podle nároku 10, vyznačující se tím, že aminokyselinové zbytky Ri a/nebo R2 jsou L.

12. Vakcína podle kteréhokoli z nároků 7 až 11, vyznačující se tím, že aminokyselinové zbytky Rj a/nebo R₂ je/jsou kladně nabité přírodní a/nebo nepřírodní aminokyselinové zbytky.

13. Vakcína podle nároku 12, vyznačující se tím, že aminokyselinové zbytky Rj a/nebo R2 jsou voleny ze skupiny K, R, ornithin a/nebo homoarginin.

14. Vakcína podle nároku 13, vyznačující se tím, že aminokyselinové zbytky Ri a/nebo R2 jsou K.

15. Vakcína podle kteréhokoli z nároků 1 až 14, vyznačující se tím, že obsahuje alespoň jednu další látku stimulující imunitní reakci.

16. Vakcína podle kteréhokoli z nároků 1 až 15, vyznačující se tím, že dále obsahuje imunostimulující nukleovou kyselinu, výhodně oligodeoxynukleotid obsahující deoxyinosin, oligodeoxynukleotid obsahující deoxyuridin, oligodeoxynukleotid obsahující CG motiv nebo inosin a cytidin obsahující molekulu nukleové kyseliny.

····

17. Vakcína podle kteréhokoli z nároků 1 až 16, vyznačující se tím, že dále obsahuje cytokin jako látku stimulující imunitní reakci.

18. Vakcína podle kteréhokoli z nároků 1 až 17, vyznačující se tím, že dále obsahuje polykationtový peptid, neuroaktivní látku nebo hormon s účinky růstového faktoru.

19. Použití peptidu obsahujícího sekvenci Ri-XZXZnXZX-R2, jak je definováno v kterémkoliv z nároků 1 až 18, k přípravě adjuvantu nebo nosného proteinu pro zlepšení imunitní reakce na alespoň jeden antigen.

20. Použití podle nároku 19, že adjuvans nebo nosný protein zlepšuje příjem alespoň jednoho antigenů v buňkách prezentujících antigen (APC).

21. Použití podle nároku 19 nebo 20, že adjuvans nebo nosný protein se přidá do vakcíny.