NO323338B1

NO323338B1 - Anvendelse av et peptid for fremstilling av et preparat for behandling av pasienter som opplever hyperglykemi pa grunn av stress.

Info

Publication number: NO323338B1
Application number: NO19990915A
Authority: NO
Inventors: Suad Efendic
Original assignee: Lilly Co Eli
Priority date: 1996-08-30
Filing date: 1999-02-25
Publication date: 2007-04-02
Also published as: NO990915L; ATE418996T1; EA003701B1; YU10799A; NO990915D0; CA2263802A1; CN1235611A; PL190991B1; EP0964873A4; BR9712084A; PL332003A1; ES2318861T3; IL128740A; KR100365606B1; AU734140B2; KR20000035895A; DK0964873T3; NZ334270A; AU4092697A; DE69739189D1

Description

1. Område for oppfinnelsen.

Foreliggende oppfinnelse vedrører anvendelsen av et peptid for fremstilling av et preparat for å forbedre rekonvalesens etter kirurgisk inngrep ved å forhindre katabolsk reaksjon og insulinresistens forårsaket av kirurgisk lesjon.

2. Bakgrunnsinformasjon.

Ca. 20 - 25.000 kirurgiske behandlinger pr. million innbyggere blir utført årlig i den vestlige verden. Kirurgi, som enhver lesjon, initierer markerte endringer i metabolismen [Shaw, J.H.F., et al., Ann. Surg., 209(1): 63 - 72 (1989); Little, R.A., et al., Prog. Clin. Biol. Res. 263A: 463 - 475 (1987); Frayn, K.N., Clin. Endocrinol. 24:577 - 599 (1986); Brandi, L„ et al., Clin. Sei. 85: 525 - 35 (1993)]. Økt syntese av glukose, det primære drivstoffet for vevsreparasjon, er en viktig metabolsk endring etter kirurgi, og oppstår på bekostning av kroppsprotein og energilagre [Gump, F.E., et al., J. Trauma, 14: 378 - 88

(1974); Black, R.B., et al., Ann. surg. 196:420 - 35 (1982)].

Disse endringene har tidligere blitt tillagt gluko-regulatoriske stresshormoner og andre katabolske faktorer, slike som cytokiner, som blir frigitt som respons til lesjoner. Jo mer markert endringen er mot katabolisme, jo større er sykeligheten og det tar lengre tid for pasienten å komme seg [Thorell, A., et al., Eur. J. Surg., 159: 593 - 99 (1993); Chernow, B., et al., Arch. Intern. Med., 147:1273-8 (1987)].

Postoperative katabolske tilstander kan bli behandlet med anabolske hormoner, spesielt veksthormoner og IGF-1 [Hammerkvist, F., et al., Ann. Surg., 216(2): 184 -190 (1991); Ziegler T., et al., Annu. Rev. Med., 45:459 - 80 (1994); Ziegler, T.R., et al. J. Parent. Ent. Nutr. 14(6): 574 - 81 (1990)]. Noen studier viser en klar fordel fra insulinbehandling i katabolske lesjonspasienter [Hinton, P., et al., Lancet, 17(April): 767-69 (1971); Shizgal, H., et al., Am. J. Clin. Nutr., 50:1355 - 63 (1989); Woolfson, A.M.J., et al., N. Clin. Nutr., 50: 1355-63 (1989); Woolfson, A.M.J., et al., N. Engl. J. Med. 300:14-17 (1979); Brooks, D., et al., J. Surg. Res. 40:395 - 405 (1986); Sakurai; Y., et al., Ann. Surg. 222:283 - 97 (1995)].

Andre studier viser imidlertid at den postoperative fordelen av insulin ofte er kompromitterende med insulinresistens. Ved insulinresistens, vil normalkonsentrasjoner av insulin utløse mindre enn normalresponsene. Insulinresistens kan skyldes en nedgang i binding i insulin til celleoverflatereseptorene, eller til endringer i intracellulær metabolisme. Den første type, karakterisert ved en nedgang i insulinsensitiviteten, kan typisk overkommes ved økt msulinkonsentrasjon. Den andre typen, karakterisert som en nedgang i insulinresponsen, kan ikke overkommes med store mengder insulin. Ihsulin-resistens etterfulgt av lesjon kan overvinnes med doser av insulin som er proporsjonale til graden av insulinresistens, og gir tilsynelatende en nedgang i insulinsensitivitet [Brandi, L.S., et al., Clin. Science 79:443 - 450 (1990); Henderson A.A., et al., Clin. Sei. 80: 25 - 32 (1990)]. Reduksjon i insulinsensitivitet etterfulgt av elektiv abdominal kirurgi varer minst 5 dager, men ikke mer enn 3 uker, og er mest inngående i den første postoperative dagen, og kan ta opp til 3 uker for å normalisere [Thorell, A., et al., (1993)].

Grunner til den observerte transient insulinresistensen som etterfølger lesjoner, er ikke godt forstått. Både kortisol og glukagon kan bidra til katabolsk respons til lesjoner [Alberti, K.G.M.M., et al., J. Parent. Ent. Nutr. 4(2): 141-46 (1980); Gelfand, R.A., et al., J. Clin. Invest. 74 (December): 2238 - 2248 (1984); Marliss, E.B., et al., J. Clin. Ihvest. 49:2256 - 70 (1970)]. Studier av postoperativ insulinresistens har vært mislykket i å vise korrelasjon mellom endringer i disse katabolske hormonene og endringer i insulinsensitivitet etter kirurgi [Thorell, A., et al. (1993); Thorell A., Karolinska Hospital and Institute, 104 01 Stockholm, Sverige (1993); Thorell, A. et al., Br. J. Surg. 81: 59-63 (1994)].

Økt tilgjengelighet av lipider etter lesjoner kan indusere insulinresistens gjennom glukosefettsyresykel [Randle, P.J. et al., Diab. Metab. Rev. 4(7): 623 - 38 (1988)]. Økt tilgjengelighet av frie fettsyrer (FFA) induserte insulinresistens og endret substratoksidasjon fra glukose til fett, selv ved tilstedeværelse av samtidige infusjoner av insulin [Ferrannini, E., et al., J. Clin. Invest. 72:1737 - 47 (1983); Bevilacqua, S., et al., Metabolism 36: 502 - 6 (1987); Bevilacqua, S., et al., Diabetes 39:383 - 89 (1990); Bonadonna, R.C., et al., Am. J. Physiol. 259: E736 - 50 (1990); Bonadonna, R.C., et al., Am. J. Physiol. 257: E49-56 (1989)].

Elektiv kirurgi blir rutinemessig utført etter en over natt faste for å redusere risken ved anestesi. Denne befestede praksisen ved å faste pasienten over natt (10-16 timer) før kirurgi, forsterker utviklingen av katabolske tilstander, og forverrer insulinresistens. Studier i rotter som gjennomgår stress, slik som blødning og endotoksemi, viser at fasting i perioder mindre enn 24 timer påvirker merkbart den katabolske responsen til lesjon [Alibegovic, A., et al., Circ. Shock, 39:1 - 6 (1993); Eshali, A. H., et al. Aur. J. Surg., 157:'85 - 89 (1991); Ljungqvist, O., et al., Am. J. Physiol., 22: E692 - 98 (1990)]. Perioder av fasting før begynnelsen til en lesjon i rotter minket markert karbohydratreservene, inngående endringer i det hormonelle miljøet, økende stressrespons, og mest viktig, økning i dødelighet [Alibergovic, A., et al., Circ. Shock, 39:1-6(1993)].

Glukoseadmimstreiing før kirurgisk inngrep, enten oralt [Nygren, J., et al., Ann. Surg. 222:728 - 34 (1995)], eller ved infusjon, reduserer insulinresistensen etter inngrepet, sammenlignet med fastende pasienter. Pasienter som mottok over natt glukoseinfusjoner (5 mg/kg/min.) før elektiv abdominal kirurgi, mistet et gjennomsnitt på 32% av insulinsensitiviteten etter operasjonen, mens pasienter som fikk kirurgisk inngrep etter en rutine over natt faste, mistet et gjennomsnitt på 55% av deres insulinsensitivitet [Ljungqvist, 0., et al., J. Am. Coll. Surg. 178:329 - 36 (1994)].

I tillegg til de uheldige effektene av faste når det gjelder å komme seg etter operasjon, immobilisering av pasient og hypokalorisk ernæring under og etter kirurgi, øker også insulinresistensen etter operasjonen. I friske mennesker, er det blitt vist at 24 timer med immobilisering og hypokalorisk ernæring induserer en 20 - 30 % økning i perifer insulinresistens i friske frivillige. Således kan postoperativ insulinsystem tidligere rapportert etter preoperativ glukoseinfusjoner [Ljungqvist, O., (1994)] for en del skyldes tilleggseffekter av postoperativ sengehvile og hypokalorisk ernæring.

Gitt utbedringen av kirurgi, er det viktig å minimalisere negative bi-effekter, slike som katabolsk respons og insulinresistens, for å forbedre leging og redusere mortaliteten. Postoperativ insulinresistens kommer i veien for behandling av den katabolske tilstanden med insulin. Den befestede medisinske praksis av pre-operativ faste forverrer den postoperative katabolske tilstanden og insulinresistens. Således er det behov for en behandling som overvinner både den katabolske tilstanden og insulinresistens.

Som beskrevet heri er en stik behandling som overvinner både den katabolske tilstanden og insulinresistens, administrering av glukose og insulin sammen før, under og etter operasjonen. Insulininfusjon danner imidlertid potensial for hypoglykemi, som blir definert som blodglukose under 0,3 mM. Hypoglykemi øker risiko for ventrikulær arytmi og er en farlig konsekvens av insulininfusjon. En algoritme for insulininfusjon for diabetikere ble utviklet for å forhindre hypoglykemi [Hendra, T.J., et al., Diabetes Res. Clin. Pract., 16:213-220 (1992)]. 21% av pasientene utviklet imidlertid hypoglykemi under denne algoritme. I en annen studie av glukosekontroll etterfulgt av myokardial infarkt, utviklet 18% av pasientene hypoglykemi når de ble infisert med insulin og glukose [Malmberg, K.A., et al., Diabetes Care, 17:1007-1014 (1994)]. msulininfusjon krever også en hyppig overvåking av blodglukosenivået slik at en start på hypoglykemi kan bli detektert og avhjulpet så raskt som mulig. I pasienter som mottar insulininfusjon i det nevnte studiet [Malmberg, 1994], ble blodglukosen målt minst hver annen time, og hyppigheten av infusjon justert deretter. Således avhenger sikkerheten og effektiviteten av insulinglukose infusjonsterapi for myokardial infarktpasienter av lett og rask tilgang til blodglukosedata. Et slikt behov for å overvåke blodglukose er en stor byrde for helsepersonell, og øker ulempen og kostnadene til behandlingen. Som et resultat bruker pre-kirurgiske kliniske pleieenheter ofte ikke ressurser for å overvåke og optimalisere blodglukosenivået før kirurgi, slik som kan bli oppnådd ved intravenøs administrering av insulin. Tatt i betraktning den risiko og byrdene iboende i insulin-infusjon, behøves en alternativ tilnærming til pre-post kirurgisk kontroll av katabolsk reaksjon til lesjonen

Inkretinhormon, glukagon-lignende peptid 1, forkortet som GLP-1, er prosessert fra proglukagon i tarmen og forsterker næringsindusert insulinfrigivelse [Krcymann B., et al., Lancet 2:1300 -1303 (1987)]. Forskjellige avkortede former av GLP-1 erkjent å stimulere insulinsekresjon (msulinotrofisk handling) og cAMP dannelse [se fleks. Mojsov, S., Int. J. Peptide Protein Research, 40: 333 - 343 (1992)]. Et forhold mellom forskjellige in vitro laboratorieeksperimenter og pattedyr, spesielt mennesker, insulinotrofiske responser til eksogen administrering av GLP-1, GLP-1 (7-36) amid og GLP-1 (7-37) syre er blitt etablert [se f.eks. Nauck, M.A., et al., Diabetologia, 36: 741-744 (1993); Gutiak, M., et al., New England J. of Medicine, 326 (20): 1316-1322

(1992); Nauck, M.A., et al., J. Clin. Invest, 91:301-307 (1993); and Thorens, B. et al., Diabetes, 42: 1219-1225 (1993)]. GLP-1 (7-36) amid anvender en uttalt antidiabetogenisk effekt i insulinavhengig diabetikere ved å stimulere insulinsensitivitet og ved å øke glukoseindusert insulinfrigivelse ved fysiologiske konsentrasjoner [Gutniak M., et al., New England J. Med. 326:1316-1322 (1992)]. Når dette administreres til ikke-insulinavhengige diabetikere, stimulerer GLP-1 (7-36) amid insulinfrigivelse, senker glykagensekresjon, inhiberer gastrisk tømming og øker glukoseutnyttelsen [Nauck, 1993; Gutniak, 1992; Nauck, 1993].

Bruk av GLP-1 molekyler for forlenget terapi har blitt hindret fordi serumhalveirngstiden av slike peptider er ganske kort. For eksempel, GLP-1 (7-37) har en sennnhalveringstid på bare 3 til 5 minutter. GLP-1 (7-36) amid har en halveringstid på omtrent 50 minutter når den blir administrert sekutant. Således må disse GLP molekylene bli administrert som en kontinuerlig infusjon for å oppnå forlenget effekt [Gutniak M., et al., Diabetes Care 17:1039-1044 (1994)]. I den foreliggende oppfinnelse er GLP-ls korte halveringstid og konsekvent behov for kontinuerlig administrasjon ikke en ulempe fordi pasienten er hospitalisert, før kirurgisk inngrep og væsker er kontinuerlig administrert parenteralt før, under og etter kirurgien.

GLP-1, samt analoger av denne er kjent fra EP 619322. Det er videre fra samme publikasjon kjent å administrere nevnte forbindelser subkutant, intramuskulært, oralt, ved nasal inhalering, gastrointestinalt eller ved infusjonspumpe. I samme publikasjon beskrives nevnte forbindelser å være velegnet ved behandling av ikke-insulinavhengig diabetes for normalisering av blodglukosenivå.

Det er videre fra American Journal of Medicine, 1995, Vol. 98, side 75-84 kjent at pasienter som har gjenomgått kirurgisk behandling opplever insulin resistens og hyperglykemi. Fra samme publikasjon er det videre kjent at lave nivåer av hyperglykemi kan være fordelaktig etter skade eller infeksjon, og at reduksjon i blodglukosenivåer til normale verdier bør unngås.

Foreliggende oppfinnelse presenterer derfor for første gang anvendelsen av et peptid valgt fra gruppen bestående av GLP-l(7-37) eller en analog derav, og derivater og farmasøytiske akseptable salter derav, for fremstilling av et preparat for behandling av pasienter som opplever hyperglykemi på grunn av kirurgisk stress.

Kort beskrivelse av tegningene

Figur 1 er en graf av prosent endring i glukoseinfusjonsrate (GIR) i den postoperative (postop) perioden relativ til pre-operativ (preop) periode for seks (6) kontrollpasienter (O ) og syv (7) pasienter som mottar en hyperinsulinsk, normoglycemisk infusjon (■) før og under elektiv kirurgi. Figur 2 er en graf som viser effekten av kontinuerlig infusjon GLP-1 (7-36) amid på gjennomsnitts blodglukosekonsentrasjon (mM) (—■—) i fem ikke-insulinavhengige diabetes mellitus (NJDDM) pasienter gjennom natten. Grafen viser også effekten av kontinuerlig insulininfusjon på gjennomsnitts blodglukosekonsentrasjon (—O —) i de samme fem NJDDM pasientene, men en annen natt. Figur 3 er én graf som viser effekten av GLP-1 (7-36) amidinfusjon på gjennomsnitts blodglukosekonsentrasjon (mM) ( —■—) i fem NIDDM pasienter når de blir tilført i løpet av dagen, i tre timer med start ved begynnelsen av hvert av de tre måltidene.

Grafen viser også effekten av subkutan injeksjon av insulin på gjennomsnitts blodglukosekonsentrasjon (--O —) i de samme fem NJDDM pasientene, men på en annen dag, og med injeksjon kort etter hvert måltid.

Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen

Med «GLP-1» menes GLP-1 (7-37). Som det er vanlig innen fagfeltet, har amino-terminalen av GLP-1 (7-37) blitt fastsatt til nr. 7 og den karboksyterminalen, til nr. 37. Arninosyresekvensen av GLP-1 (7-37) er vel kjent innen fagfeltet, men blir for letthets skyld presentert under:

En «GLP-1 analog» er definert som et molekyl som har en eller flere aminosyresubstitusjoner, delesjoner, inversjoner eller addisjoner sammenlignet med

GLP-1. GLP-1 analoger kjent innen fagfeltet inkluderer f.eks. GLP-1 (7-34) og GLP-1 (7-35), GLP-1 (7-36), GIn<9->GLP-l (7-37), D-Gm9-GLP-1 (7-37), Thr<16->Lys<18->GLP-1 (7-37) og Lys,<8->GLP-1 (7-37). Foretrukne GLP-1 analoger er GLP-1 (7-34) og GLP-1 (7-35) som er beskrevet i US patent nr. 5.118.666, og også GLP-1 (7-36) som er de biologiske prosesserte formene av GLP-1 som har insulinotropiske egenskaper. Andre GLP-1 analoger er beskrevet i US patent nr. 5.545.618.

Et «GLP-1 derivat» er definert som et molekyl som har arninosyresekvensen fra GLP-1 eller fra GLP-1 analog, men har i tillegg kjemiske modifikasjoner på en eller flere av dets aminosyre sidegrupper, a-karbonatomer, terminal aminogruppe, eller terminal karboksylsyregruppe. En kjemisk modifikasjon inkluderer, men er ikke begrenset til, tilsetting av kjemiske deler, dannelse av nye bindinger, og fjerning av kjemiske deler. Modifikasjoner på aminosyresidegrupper inkluderer, men uten begrensning, acylering av lysin e-aminogrupper, N-alkylering av arginin, histidin eller lysin, alkylering av glutamin eller asparginkarboksylsyregrupper og diaminering av glutamin eller asparagjn. Modifikasjoner av den terminale amino inkluderer, uten begrensninger, desamino, N-lavere alkyl, N-di-lavere alkyl og N-acylmodifikasjoner. Modifikasjoner av den terminale karboksygruppe inkluderer, uten begrensninger, amid, laverealkylamid, dialkylamid og lavere alkylestermodiifkasjoner. Lavere alkyl er C1-C4 alkyl. Videre kan en eller flere sidegrupper eller terminale grupper bli beskyttet ved beskyttende grupper kjent for en proteinkjemiker. a-karbon av en aminosyre kan være mono- eller dimetylert.

En foretrukket gruppe av GLP-1 analoger og derivater for bruk i den foreliggende oppfinnelse er sammensatt av molekyler med formelen:

og de farmasøytiske akseptable saltene derav, hvori Ri er selektert fra gruppen bestående av L-histidin, D-histidin, desamino-histidin, 2-amino-histidin, 6-hydroksyhistidin, homo-histidin, alfa-fluormetylhistidin og alfa-metylhistidin; X er selektert fra gruppen bestående av Ala, Gly, Val, Thr, Ile og alfa-metyl-Ala; Y er selektert fra gruppen bestående av Glu, Gin, Ala, Thr, Ser og Gly; Z er selektert fra gruppen bestående av Glu, Gin, Ala, Thr, Ser og Gly, og Rj er selektert fra gruppen bestående av NHfe og Gly-OH; forutsatt at forbindelsen har et isoelektrisk punkt i området fra omtrent 6,0 til omtrent 9,0 og ytterligere forutsatt at når Ri er His, X er Ala, Y er Glu og Z er Glu, må R2 være NH2-

Flere GLP-1 analoger og derivater som har et isoelektirskpunkt i dette området er blitt beskrevet og inkluderer f.eks.:

GLP-1 (7-36) NH2

Gry^GLP-lCMQNIfe

Gln<9->GLP-1 (7-37)

D-Gln9-GLP-1 (7-37)

acetyl-Lys<9->GLP-l (7-37)

Th^-GLP-1 (7-37)

D-Thr<9->GLP-1 (7-37)

Asn<9->GLP-1 (7-37)

D-Asn<9->GLP-1 (7-37)

Ser^-Arg^-Arg^-Gln^-GLP-1 (7-37)

Thr,<6->Lys<l8->GLP-1 (7-37)

Lys1<8->GLP-1 (7-37)

Arg"-GLP-1 (7-37)

Arg^-GLP-1 (7-37) og lignende [se f.eks. WO 91/11457].

En annen foretrukket gruppe av aktive forbindelser for bruk i den foreliggende oppfinnelse er beskrevet i WO 91/11457 og består essensielt av GLP-1 (7-34), GLP-1 (7-35), GLP-1 (7-36) eller GLP-1 (7-37) eller en amidform derav, og farmasøytisk akseptable salter derav, som har minst én modifikasjon selektert fra gruppen bestående av: (a) substitusjon av glycin, serin, cystein, threonin, asparagin, glutamin, tyrosin, alanin, valin, isoleucin, leucin, metionin, fenylalanin, arginin eller D-Iysin for lysin i posisjon 26 og/eller posisjon 34; eller substitusjon av glycin, serin, cystein, threonin, aspargin, glutamin, tyrosin, alanin, valin, isoleucin, leucin, metionin, fenylalanin, lysin eller en D-arginin for arginin i posisjon 36; (b) substitusjon av en oksydasjonsresistent aminosyre for tryptofan i posisjon 31; (c) substitusjon av minst én av tyrosin for valin i posisjon 16; lysin for serin i posisjon 18; asparginsyre for glutaminsyre i posisjon 21; serin for glycin i posisjon 22; arginin for glutamin i posisjon 23; arginin for alanin i posisjon 24; og glutamin for lysin i posisjon 26; og (d) substitusjon av minst én av: glycin, serin eller cystein for alanin i posisjon 8; asparginsyre, glycin, serin, cystein, threonin, asparagin, glutamin, tyrosin, alanin, valin, isoleucin, leucin, methionin eller fenylalanin for glutaminsyre i posisjon 9; serin, cystein, threonin, asparagin, glutamin, tyrosin, alanin, valin, isoleucin, leucin, methionin eller fenylalanin for glycin i posisjon 10 og glutaminsyre for asparaginsyre i posisjon 15; og (e) substitusjon av glycin, serin, cystein, threonin, asparagin, glutamin, tyrosin, alanin, valin, isoleucin, leucin, methionin etler fenylalanin eller D- eller N-acylert eller alkylert form av histidin for histidin i posisjon 7; hvori, i substitusjonene (a), (b), (d) og (e) de substituerte aminosyrene kan valgfritt være i en D-form og aminosyrene substituert ved posisjon 7 kan valgfritt være i en N-acylert eller N-alkylert form.

Fordi enzymet, dipeptidyl-peptidase IV (DPPIV) kan være ansvarlig for den observerte raske in vivo inaktiveringen av administrert GLP-1 [se f.eks. Mentlein, R., et al., Eur. J. Biochem., 214: 829-835 (1993)] administrering av GLP-1 analoger og derivater som er beskyttet fra aktiviteten av DPP IV er foretrukket og administrering av G1/-GLP-1 (7-36)NH2, Val<8->GLP-1 (7-37)OH, en-metyl-Ala<8->GLP-l (7-36)NH2 ogGhAGln2,-GLP-l (7-37)OH eller farmasøytiske akseptable salter derav, er mer foretrukket.

Anvendelsen av et molekyl som er krevd vernet i US patent nr. 5.188.666 til bruk ifølge foreliggende oppfinnelse er foretrukket Et slikt molekyl er selektert fra gruppen bestående av et peptid som har aminosyresekvens:

hvori X er selektert fra gruppen bestående av Lys og Lys-Gly, og et derivat av nevnte peptid, hvori nevnte peptid er selektert fra gruppen bestående av: et farmasøytisk akseptabelt syretilsattsalt av nevnte peptid; et farmasøytisk akseptabelt karboksylåtsalt av nevnte peptid; en farmasøytisk akseptabel laverealkylester av nevnte peptid; og et farmasøytisk akseptabelt amid av nevnte peptid selektert fra gruppen bestående av amid, laverealkylamid og laveredialkylamid.

En annen foretrukket gruppe av molekyler for bruk i foreliggende oppfinnelse består av forbindelser, krevd i US patent nr. 5.512.549, med den generelle formel:

og farmasøytisk akseptable salter derav, hvori R<1> er selektert fra gruppen bestående av 4-imidazopropionyl, 4-imidazoacetyl eller 4-imidazo-a,a dimetylacetyl; R<2> er selektert fra gruppen bestående av Ce-Cio ugrenet acyl eller er fraværende; R<3> er selektert fra gruppen bestående av Gly-OH eller NH2; og Xaa er Lys eller Arg, kan bli brukt i den foreliggende oppfinnelse.

Mer foretrukne forbindelser av SEQ ID NO: 4 for bruk i den foreliggende oppfinnelse er de hvori Xaa er Arg og R<2> er Cé-Cio ugrenet acyl.

Høyt foretrukne forbindelser av SEQ ID NO: 4 for bruk i den foreliggende oppfinnelse er de hvori Xaa er Arg, R<2> er C6-C10 ugrenet acyl og R<3> er Gly-OH.

Mer høyt foretrukne forbindelser av SEQ ID NO: 4 for bruk i den foreliggende oppfinnelse er de hvori Xaa er Arg, R<2> er C6-C,0 ugrenet acyl, R<3> er Gly-OH, og R<1> er 4-imidazopropionyl.

Den mest foretrukne forbindelse av SEQ ID NO: 4 for bruk i den foreliggende oppfinnelse er den hvori Xaa er Arg, R<2> er Cg ugrenet acyl, R<3> er Gly-OH og R<1> er 4-imidazopropionyl.

Anvendelsen av et molekyl krevd i US patent nr. 5.120.712 til bruk ifølge foreliggende oppfinnelse er meget foretrukket. Slikt molekyl er selektert fra gruppen bestående av peptid som har aminosyresekvens:

og et derivat av nevnte peptid, hvori nevnte peptid er selektert fra gruppen bestående av: et farmasøytisk akseptabelt syretilsatssalt av nevnte peptid; et farmasøytisk akseptabelt karboksylatsalt av nevnte peptid; en farmasøytisk akseptabel laverealkylester av nevnte peptid; og et farmasøytisk akseptabelt amid av nevnte peptid selektert fra gruppen bestående av amid, laverealkylamid og laveredialkylamid.

Bruk av GLP-1 (7-36) amid eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav, i den foreliggende oppfinnelse er svært høyt foretrukket. Aminosyresekvensen av GLP-1 (7-36) amid er:

Metoder for fremstilling av den aktive forbindelsen brukt i den foreliggende oppfinnelse, dvs. GLP-l(7-37) eller en analog derav, og derivater og farmasøytiske akseptable salter derav er vel kjente og beskrevet i US patent nr. 5.118.666,5.120.712 og 5.523.549.

Aminosyredelen av den aktive forbindelsen brukt i den foreliggende oppfinnelse eller en forløper dertil, er fremstilt enten ved 1) fastfase syntetisk kjemi; 2) rensning av GLP molekyler fra naturlige kilder; eller 3) rekombinant DNA teknologi.

Fastfase kjemisk syntese av polypeptider er vel kjent innen fagfeltet og kan bli funnet i generelle tekster innen feltet, slike som Dugas, H. og Penney, C, Bioorganic Chemistry, Springer-Verlag, New York (1981), s. 54-92, Merrifield, J.M., Chem. Soc, 85:2149

(1962) og Stewart og Young, Solid Phase Peptide Synthesis, Freeman, San Francisco

(1969) s. 24 - 66.

For eksempel kan aminosyredelen være syntetisert ved fastfase metodologi ved å bruke en 430A peptidsyntetiseringsmaskin (PE-Applied Biosystems, Inc., 850 Lincoln Center Drive, Foster City, CA 94404) og syntesesykler levert av PE-Applied Biosystems. BOC-aminosyrer og andre reagenser er kommersielt tilgjengelig fra PE-Applied Biosystems og andre firmaer innen kjemisk forsyning. Sekvensiell Boe kjemi som bruker doble koblingsprotokoller er anvendelig til start p-metylbenzhydrylaminresiner for produksjon av C-terminal karboksamider. For produksjon av C-terminale acider, brukes den korresponderende PAM resin. Asn, Gin og Arg er koblet ved å bruke hydroksybenzotriazolestere. Følgende sidekjedebeskyttende grupper kan bli brukt:

Boe deproteksjon kan bli utført med trifluoroeddiksyre i metylenklorid. Etter at syntesen er fullstendig må peptidene bli deprotektert og kuttet fra resinen med vannfritt hydrogenfluorid (HF) som inneholder 10% meta-kresol. Kutting av sidekjedebeskyttelsesgruppen(e) og av peptider fra resinen blir utført ved -5°C til 5°C, fortrinnsvis på is i 60 minutter. Etter fjerning av HF, blir peptidVresinen vasket med eter og peptidekstraktet med iseddiksyre og lyofilisert.

Teknikker vel kjent for en fagperson innen rekombinant DNA teknologi kan bli brukt for å fremstille den aktive forbindelsen som blir brukt i den foreliggende oppfinnelsen. Faktisk kan rekombinante DNA metoder være å foretrekke fordi de gir høyere utbytte. Basistrinnet i rekombinant produksjon er:

a) isolering av naturlig DNA sekvens som koder for et GLP-1 molekyl eller konstruksjon av syntetisk eller semi-syntetisk DNA kodende sekvens for et GLP-1 molekyl, b) plassere den kodende sekvensen inn i en ekspresjonsvektor på en måte som er passende for uttrykke proteinet enten alene eller som fusjonsproteiner, c) transformere en passende eukaryotisk eller prokaryotisk vertcelle med ekspresjonsvektoren, d) dyrke den transformerte vertcellen under betingelser som vil tillate ekspresjon av et GLP-1 molekyl, og

e) gjenvinning og rensing av rekombinant produsert GLP-1 molekyl.

Som tidligere konstatert, kan de kodende sekvensene være fullstendig syntetiske eller et

resultat av modifikasjoner av større, native glukagon-kodende DNA. En DNA sekvens som koder for preproglukagon er presentert i Lund et al., Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A. 79: 345-349 (1982) og kan bli brukt som et utgangsmateriale i den semisyntetiske produksjonen av forbindelsene av den foreliggende oppfinnelse ved endring av nativsekvensen for å oppnå de ønskede resultatene.

Syntetiske gener, in vitro eller in vivo transkripsjon og translasjon hvor resultatene i produksjonen av GLP-1 molekylet kan bli konstruert ved teknikker som er vel kjente innen fagfeltet. Siden den genetiske koden er degenerert, vil en fagperson gjenkjenne at en størrelse på avgrenset antall av DNA sekvenser kan bli konstruert, som koder for GLP-1 molekyler.

Metodologien av syntetisk genkonstruksjon er vel kjent innen fagfeltet. Se Brown et al.

(1979) Methods in Enzymotogy, Academic Press, N.Y., 68:109-151. DNA sekvensen er bestemt fra den ønskede aminosyresekvens ved å bruke den genetiske metode, som lett kan fastslås av en biolog. Etter konstruksjonen kan sekvensen i seg selv bli dannet ved å bruke konvensjonell DNA syntetiseringsapparater slike som Model 380A eller 380B DNA syntetiserere (PE-Applied Biosystems, Inc., 850 Lincoln Center Drive, Foster City, CA 94404). For å uttrykke aminosyredelen av en forbindelse brukt i den foreliggende oppfinnelse, så innsettes den lagde syntetiske DNA sekvensen i en av de mange passende rekombinante DNA ekspresjonsvektorene gjennom bruk av passende restriksjonsendonukleaser. See generally Maniatis et al. (1989) Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Laboratory Press, N.Y., Vol. 1-3. Restriksjonsendonukleasekutting seter er satt inn i hver ende av det GLP-1 molekylkodende DNA for å lette isolering fra, og integrering inn i, amplifisering og ekspresjonsvektorer vel kjente innen fagfeltet. De spesielle endonukleasene som utnyttes vil bli pålagt av restriksjonsendonuklease kuttemønsteret av foreldreekspresjonsvektoren som benyttes. Restriksjonsseter er valgt for å orientere riktig den kodende sekvensen med kontrollsekvenser, for derved å oppnå en korrekt leseramme og ekspresjon av det ønskede proteinet. Kodingssekvensen kan være posisjonert til en korrekt leseramme med promotor og ribosombindingssete til ekspresjonsvektoren, som begge er funksjonelle i vertcellen hvori proteinet skal bli uttrykt.

For å oppnå effektiv transkripsjon av syntetisk gen må det være operativt assosiert med en promotor-operatorregion. Derfor er promotor-operatorregionen til det syntetiske genet plassert i samme sekvensielle orientering med hensyn på ATG startkodon til det syntetiske genet.

Et uttall av nyttige ekspresjonsvektorer for transformering av prokaryote og eukaryote celler er velkjent innen fagfeltet. See The Promega Biological Research Products Catalogue (1992) (Promega Corp., 2800 Woods Hollow Road, Madison, WI, 53711-5399); og The Stratagene Cloning Systems Catalogue (1992) (Stratagene Corp., 11011 North Torrey Pines Road, La Jolla, CA, 92037). Også U.S. patent nr. 4.710.473 beskriver sirkulært DNA plasmid transformasjons vektorer nyttige for ekspresjon av eksogene gener i E. coli ved høye nivåer. Disse plasmidene er nyttige som transformasjonsvektorer i rekombinant DNA prosedyrer og

(a) pålegge plasmidet kapasiteten for autonom replikasjon i en vertcelle; (b) kontrollere autonom plasmidreplikasjon i relasjon til temperatur hvor vertcellekulturer blir bevart; (c) stabilisere bevaring av plasmidet i vertcellepopulasjoner; (d) direkte syntese av proteinprodukt indikativ av plasmidopprettholdelse i en

vertcellepopulasjon;

(e) å tilveiebringe en serie restriksjonsendonuklease-gjenkjenningsseter som er

unike for plasmidet; og

(f) terminere mRNA transkripsjon.

Disse sirkulære DNA plasmidene er nyttige som vektorer i rekombinant DNA prosedyrer for å sikre høyt nivå av ekspresjon av eksogene gener.

Når en har konstruert ekspresjonsvektor for aminosyredelen av en forbindelse brukt i den foreliggende oppfinnelse, er neste trinnet å plassere vektoren inn i en passende celle og derved konstruere en rekombinant vertcelle nyttig for uttrykk av polypeptidet. Teknikker for å transformere celler med rekombinante DNA vektorer er vel kjente innen fagfeltet og kan bli funnet i generelle referanser som Maniatis, et al. supra. Vertceller kan bli konstruert fra enten eukaryote eller prokaryote celler.

Prokaryote vertceller produserer generelt protein i en høyere rate og er lettere å dyrke. Proteiner uttrykt i høynivå-bakterielle ekspresjonssystemer aggregerer karakteristisk i granula eller inklusjonslegemer, som inneholder høye nivåer av overekspressért protein. Slike proteinaggregater må gjenvinnes, løses opp, denatureres og gjehfoldes ved å bruke teknikker som er vel kjente innen fagfeltet. Se Kreuger et al. (1990) i Protein Folding, Gierasch and King, eds. s. 136-142, American Association for the Advancement of Science Publication No. 89-18S, Washington, D.C.; og U.S. patent nr. 4.923.967.

Endringer til en forløper GLP-1 eller GLP-1 analog aminosyresekvens for å produsere en ønsket GLP-1 analog eller GLP-1 derivat kan gjøres ved vel kjente metoder: kjemisk modifisering, enzymatisk modifisering eller en kombinasjon av kjemisk og enzymatisk modifisering av GLP-1 forløpere. Teknikkene fra klassisk løsningsfasemetoder og semi-syntetiske metoder kan også være nyttige for fremstilling av GLP-1 molekyler brukt i den foreliggende oppfinnelsen. Metoder for fremstilling av GLP-1 molekyler fra den foreliggende oppfinnelse er vel kjente for en peptidkjemiker.

Tilsetning av en acylgruppe til epsilonaminogruppe Lys<34> kan bli utført ved å bruke en av mange metoder kjent innen fagfeltet. Se Bioconjugate Chem. «Chemical

Modifications of Proteins: History and Applications» pages 1,2-12 (1990) og Hashimoto et al., Pharmaceutical Res. 6 (2): 171- 176 (1989).

For eksempel kan en N-hydroksy-succinimidester fra oktanoidsyre bli tilsatt til lysyl-epsilonamin ved å bruke 50% acetonitril i boratbuffer. Peptidet kan bli acylert enten før eller etter imidazolgruppen er tilsatt. Dessuten, hvis peptidet blir fremstilt rekombinant, er acylering forut for enzymatisk kutting mulig. Også kan lysin i GLP-1 derivatet bli acylert som vist i W096-29342.

Eksistensen og fremstilling av en mengde av beskyttet, ubeskyttet og delvis beskyttet, naturlig og unaturlig, funksjonelle analoger og derivater av GLP-1 (7-36) amid og GLP-1 (7-37) molekyler har blitt beskrevet innen fagfeltet [se f.eks. U.S. patent nr. 5.120.712 og 5.118.666, og Orskov, C, et al., J. Biol. Chem., 264(22): 12826-12829 (1989) og WO 91/11457 (Buckley, D.I., et al., publisert 8. august 1991)].

Valgfritt kan amino og karboksyterminalaminosyreresidier fra GLP-1 derivater bh beskyttet eller, valgfritt, bare en av terminalene blir beskyttet. Reaksjoner for dannelsen og fjerning av slike beskyttelsesgrupper er beskrevet i standardarbeider inklusiv f.eks. «Protective Groups in Organic Chemistry», Plenum Press, London og New York (1973);

Green, T.H., «Protective Groups in Organic Synthesis», Wiley, New York (1981); og «The Peptides», Vol. L. Schrdder and Lttbke, Academic Press London and New York

(1965). Representative amino-beskyttelsesgrupper inkluderer f.eks. formyl, acetyl, isopropyt, butoksykarbonyl, fluorenylmetoksykarbonyl, karbobenzyloksy og lignende. Representative karboksy-beskyttelsesgrupper inkluderer f.eks. benzylester, metylester, etylester, t-butylester, p-nitrofenylester og dets like.

Karboksyterminal, laverealkylestere, GLP-1 derivater brukt i den foreliggende oppfinnelse blir fremstilt ved å reagere de ønskede (C1-C4) alkanoler med det ønskede polypeptidet ved tilstedeværelse av en katalytisk syre slik som saltsyre. Passende betingelser for slik alkylesterdannelse inkluderer en reaksjonstemperatur på omtrent 50°C og reaksjonstid på omtrent 1 time til omtrent 3 timer. I likhet kan alkylesterderivater fra Asp og/eller Glu residier bli dannet.

Fremstilling av et karboksamidderivat fra en forbindelse brukt i en foreliggende oppfinnelse blir dannet, fleks, som beskrevet i Stewart, J.M., et al., Solid Phase Peptide Synthesis, Pierce Chemical Company Press, 1984.

En farmasøytisk akseptabel salt form av GLP-1 (7-3 7) eller en analog derav, og derivater av disse kan bli brukt i den foreliggende oppfinnelse. Syrer som vanligvis benyttes for å danne syretilsetningssalter er inorganiske syrer slike som saltsyre, hydrobromsyre, svovelsyre, fosforsyre og dets like og organiske syrer slik som p-toluensulfonsyre, metansulfonsyre, oksalsyre p-bromfenyl-sulfonsyre, karbonsyre, succininsyre, sitronsyre, benzoensyre, eddiksyre og dets like. Eksempler på slike salter inkluderer sulfat, pyrosulfat, bisulfat, sulfitt, bisulfitt, fosfat, monohydrogenfosfat, dihydrogenfosfat, metafosfat, pyrofosfat, klorid, bromid, jodid, acetat, propionat, decanoat, kaprylat, akrylat, format, isobutyrat, kaproat, heptanoat, propiolat, oksalat, malonat, succinat, suberat, sebacat, fumarat, maleat, butyne-l,4-dioat, heksyn-l,6-dioat, benzoat, klorbenzoat, metylbenzoat, dinitrobenzoat, hydroksybenzoat, metoksybenzoat, ftalat, sulfonat, xylensulfonat, fenylacetat, fenylpropionat, fenylbutyrat, citrat, laktat, gamma-hydroksybutyrat, glykolat, tartrat, metansulfonat, propansulfonat, naftalen-1-sulfonat, naftalen-2-sulfonat, mandelat og dets like. Foretrukne syretilsetningssalter er de som er dannet ved mineralsyrer slik som saltsyrer og hydrobromsyre og spesielt saltsyre.

Basetilsetningssalter inkluderer de avledet fra inorganiske baser, slike som ammonium eller alkali eller alkaliske jordmetallhydroksider, karbonater, bjkarbonater og dets like. Slike baser som er nyttige i fremstilling av salter fra denne oppfinnelse inkluderer natriumhydroksid, kaliumhydroksid, ammoniumhydroksid, kaliumkarbonat og dets like. Saltene som dannes er spesielt foretrukket.

GLP-1 (7-37) eller en analog derav, og derivater av disse brukt i den foreliggende oppfinnelse kan bli formulert med ett eller flere bindemidler før bruk av den foreliggende oppfinnelse. For eksempel den aktive forbindelse brukt i den foreliggende oppfinnelse kan være kompleks med en divalent metallkation med vel kjente metoder. Slike metallkationer inkluderer f.eks. Zn"<*>, Mn<4>"<4>", Fe<4*>, Co<4*>, Cd<44>, Ni<44> og dets like.

Valgfritt kan den aktive forbindelsen brukt i den foreliggende oppfinnelse bli kombinert med en farmasøytisk akseptabel buffer og pH justert for å tilveiebringe akseptabel stabilitet og en pH akseptabel for parenteral administrering.

Valgfritt kan ett eller flere farmasøytisk akseptable anti-mikrobielle midler bli tilsatt. Meta-kresol og fenol er foretrukne farmasøytiske akseptable anti-mikrobielle midler. Ett eller flere farmasøytisk akseptable salter kan være tilsatt for å justere ionestyrken eller tonisiteten. Ett eller flere bindemidler kan bli tilsatt for ytterligere å justere isotonisiteten til formiileringen. Glycerin er et eksempel på et isotonjusterende bindemiddel.

Administrering kan skje via enhver vei som er kjent å være effektiv av en lege. Parenteral administrering er foretrukket. Parenteral administrering er vanligvis forstått i medisinsk litteratur som injeksjon av en dose inn i kroppen med en steril sprøyte eller sprøytespiss eller en annen mekanisk anordning slik som en infusjonspumpe. Parenterale veier inkluderer intravenøs, intramuskulær, subkutan, intraperitonal, intraspinal, intratekal, intracerebroventrikular, intraarterial, subaraknoid og epidural. Intravenøse, intramuskulære og subkutane veier for administrering av forbindelsene brukt i den foreliggende oppfinnelse er mer foretrukket. Intravenøse og subkutane veier for administrering av forbindelsene brukt i foreliggende oppfinnelse er enda mer foretrukket. For parenteral administrering er en aktiv forbindelse brukt i den foreliggende oppfinnelse fortrinnsvis kombinert med destillert vann ved en passende pH.

Ytterligere farmasøytiske metoder kan bli anvendt for å kontrollere varigheten av virkningen. Kontrollerte frigivelsesfremstillinger kan oppnås ved bruk av polymerer for å sammensette eller absorbere den aktive forbindelsen brukt i den foreliggende oppfinnelsen. Forlenget varighet kan bli oppnådd ved å velge passende makromolekyler, f. eks. polyestere, polyaminosyrer, polyvinylpyrrolidon, etylenvinylacetat, metylcellulose, karboksymetylcellulose eller protaminsulfat og ved å selektere konsentrasjonen av makromolekyler, såvel som metoder for inkorporering, for å forlenge frigivelsen. En annen mulig metode for å forlenge varigheten av virkningen ved kontrollert fngivelses-fremstillinger er å inkorporere en aktiv forbindelse brukt i den foreliggende oppfinnelse inn i partikler av et polymermateriale slik som polyestere, polyaminosyrer, hydrogeler, poly(melkesyre) eller etylenvinylacetat kopolymerer. Alternativt, i stedet for å inkorporere en forbindelse inn i disse polymere partiklene, er det mulig å innkapsle en forbindelse brukt i den foreliggende oppfinnelse inn i mikrokapsler fremstilt f.eks. ved koacervasjonteknikker eller ved interfacial polymerisering, f.eks. hydroksymetyl-cellulose eller gelatin-mikrokapsler, respektivt eller i kolloidale medikamentavleveringssystemer, f.eks. liposomer, albuminmikrosfærer, mikroemulsjoner, nanopartikler og nanokapsler eller i makroemulsjoner. Slike teorier er beskrevet i Rernington's Pharmaceutical Sciences

(1980).

Ifølge teoriene fra denne oppfinnelsen er en pasient med behov for forbindelsene brukt i den foreliggende oppfinnelse i ca. 1 til ca. 16 timer før kirurgi utført på nevnte pasient, under kirurgien på nevnte pasient og etter nevnte pasients kirurgi i en periode på ikke mer enn 5 dager.

Som nevnt over, er varigheten av tiden før kirurgi for å begynne å administrere forbindelsene brukt i den foreliggende oppfinnelse fra ca. 16 timer til ca. 1 time før det kirurgiske inngrepet begynner. Lengden av tiden før det kirurgiske inngrepet når forbindelsene brukt i den foreliggende oppfinnelse skal bli administrert for å redusere katabolske effekter og insulinresistens, vil avhenge av faktorer hvis effekter er kjent for en lege, og inkluderer, mest viktig, om pasienten er fastende eller har fått tilført glukoseinfusjon eller ikke, eller noen annen form for mat under forberedelsesperioden før det kirurgiske inngrepet og også, uten begrensning, pasientens kjønn, vekt og alder, alvorlighetsgraden av den manglende evnen til å regulere blodglukose, den underliggende grunnen for den manglende evne til å regulere blodglukose, den forventede alvorlighetsgrad av lesjonen som skyldes det kirurgiske inngrepet, måte for administrering og biotilgjengelighet, vedvarendehet i kroppen, formulering og potensiale til forbindelsen som blir administrert. Et foretrukket tidsintervall for å begynne administrering av forbindelsene brukt i den foreliggende oppfinnelse er fra omtrent 1 time til omtrent 10 timer før det kirurgiske inngrepet starter. Det mest foretrukne intervallet til å begynne administrering er mellom 2 timer og 8 timer før det kirurgiske inngrepet starter. Som forklart heri over, er insulinresistens etterfulgt av spesiell type av kirurgi, elektiv abdominal kirurgi, mest inngående på den første post-operative dagen, og varer minst 5 dager, og kan ta opp til 3 uker for å bli normalisert [Thorell, A., et al., (1993)]. Således kan den post-operative pasienten ha behov for administrering av forbindelser brukt i den foreliggende oppfinnelsen i en tidsperiode etterfulgt av lesjonen fra det kirurgiske inngrepet som vil avhenge av faktorer som legen kan forstå og bestemme. Blant disse faktorer er om enten pasienten er fastende eller supplert med en glukose-infusjon eller drikke, eller noen annen form mat etter det kirurgiske inngrepet, og også uten begrensning, pasientens kjønn, vekt og alder, alvorlighetsgrad av den manglende evne til å regulere glodglukose, de underliggende årsaker for den manglende evne til å regulere blodglukose og den aktuelle alvorlighetsgrad av lesjonen som forårsakes av inngrepet, måten for administrering og biotilgjengelighet, vedvarenhet i kroppen, formulering og potensiale til forbindelsen som administreres. Den foretrukne varighet av administrering av forbindelsene brukt i den foreliggende oppfinnelse er ikke mer enn 5 dager etter det kirurgiske inngrepet. Terminologien «post-kirurgisk katabolske forandringeD> er velkjent for kirurgen [Shaw, J.H.F., et al., Ann. Surg. (1989); Little, R.A., et al., (1987); Frayn, K.N. (1986); Brandi, L., et al., (1993)] og er definert heri som en tilstand av metabolisme forårsaket av lesjonen fra det kirurgiske inngrepet som kan bli karakterisert med én eller flere av de følgende fenomener: negativ nitrogenbalanse, med tap av kroppsnitrogen [Wernerman, J., et al., J. Parent. Enter. Nutr. 10: 578-82 (1986); Tashiro, T., et al., J. Parent. Enter. Nutr. 9:452-5 (1985)], perifer utnyttelse av fett med fortrinn til glukose med reduksjon av et respirasjonskvotient [Frayn, K.N., et al., Arch. Emerg. Med. 4:91-9 (1987); Stjernstrom, H., et al., Clin. Physol. 1:59-72 (1981)] og endogen glukoseproduksjon på bekostning av kroppsprotein og energilagre til tross for hyperglycemia [Gump, F.E., et al., (1974); Black, R.B., et al., (1982); Frayn, K.N., et al., (1987); Frayn, K.N. Br. Med. Bull. 41(3): 232-9 (1985)].

Betegnelsen <<insulinresistens>> er også velkjent for leger og blir definert heri som én fysiologisk tilstand hvori normale konsentrasjoner av insulin utløser mindre enn normale responser. Insulinresistens kan skyldes en økning i binding av insulin til celleoverflate-reseptorer, eller til endringer i intracellulær metabolisme. Den første type, karakterisert som en nedgang i insutinsensitiviteten, kan typisk bli overvunnet ved økt insulin-konsentrasjon. Den andre type, karakterisert som en nedgang i insulinrespons, kan ikke overvinnes med store kvanta av insulin. Insulinresistens etterfulgt av lesjoner kan overvinnes ved doser med insulin som er proporsjonale til graden av insulinresistens, og er tilsynelatende forårsaket ved en nedgang i insulinsensitivitet [Brandi, L.S., et al., Clin. Science 79:443-450 (1990); Henderson, A.A., et al., Clin. Sei. 80:25-32 (1990)]. Reduksjon i insulinsensitivitet etterfulgt av elektiv abdominal kirurgi varer minst 5 dager, men ikke mer enn 3 uker og er mest inngående på den første post-operative dagen og kan ta opp til 3 uker å normalisere [Thorell, A., et al., (1993)]. Grunnen til den observerte forbigående insulinresistens etterfulgt av lesjon, er ikke godt forstått.

Dose av GLP-l(7-37) eller en analog derav, og derivater av disse som er effektive for å normalisere pasientens blodglukosenivå, vil avhenge av et antall av faktorer, som inkluderer, uten begrensning, pasientens kjønn, vekt og alder, alvorlighetsgraden av den manglende evne til å regulere blodglukose, de underliggende årsakene manglende evne til å regulere blodglukose, enten glukose eller andre karbohydratkilder er administrert samtidig, måten for administrering og biotilgjengelighet, vedvarendehet i kroppen, formulering og potensialer. Der hvor administreringen er kontinuerlig, er en passende doserate mellom 0,25 og 6 pmol/kg kroppsvekt/min, fortrinnsvis fra mellom 0,5 til omtrent 1,2 pmol/kg/min. Der hvor administreringen skjer med jevne mellomrom, skal dosen pr. administrering ta med i beregningen intervallene mellom dosene, biotilgjengeligheten av GLP-l(7-37) eller en analog derav, og derivater av disse og det nivået som trengs for effektiv normal blodglukose. Det ligger innenfor området til en ordinær lege å titrere dosen og raten av administrering av GLP-1 (7-37) eller en analog derav, og derivater av disse for å oppnå det ønskede kliniske resultatet.

Den foreliggende oppfinnelse vil bli lettere forstått ved referanse for å spesifisere eksemplene, som er tilveiebrakt for å illustrere, ikke å begrense, den foreliggende oppfinnelse.

Eksempel 1

13 pasienter, planlagt for elektiv ortopedisk kirurgi (hipartroplasti), deltok i studiet Ingen av pasientene hadde historie eller tegn på metabolsk sykdom, leveraffeksjon eller diabetes mellitus. Fastende blodglukosenivåer, CRP og levertester (bilirubin, alkalisk fosfatase, AST og ALT) var normale hos alle 13 pasienter. 7 pasienter (insulingruppe, alder 56 ± 5 år; BML 25 ± 1 kg/m1) ble studert fira klokken 08:00 etter en over natts fasting. Etter en begynnende basalperiode, hvor tidsprøver ble tatt for å måle blodglukose og hormoner, og indirekte kalorimetrisk kalometri ble utført i 30 minutter, insulin (Actrapid <*>, Novo, København) ble infusert intravenøst ved en konstant rate på 0,8 mU/kg/min., mens en variabel intravenøs infusjon av glukose (200 mg/ml) ble gitt for å opprettholde blodglukose på et konstant nivå (4,5 mM). Etter en time i en likevektstilstand, gikk alle pasientene gjennom en standardisert kirurgisk behandling (hipartroplasty). Operasjonen startet 290 ± 23 minutter etter starten på insulininfusjonen. Hyperinsulinemi, normoglycemi klamp ble deretter opprettholdt gjennom inngrepet og fortsatte i ytterligere 3 til 4 timer etter inngrepet. Dataene blir presentert ifølge den følgende nomenklatur:

En annen gruppe av pasienter (kontrollgruppe, n = 6, alder 59 ± 3 år;-BML 26 ± 1 kg/m<1>) brakt i overensstemmelse med insulingruppen med hensyn til alder og BMI, mottok den samme preoperative protokollen ( basal og preop klamp) 7 dager før inngrepet. Kontrollgruppen mottok ingen basal eller preop klamp på dagen for inngrepet. Imidlertid, ved umiddelbar kirurgi, mottok hver pasient i kontrollgruppen infusjon av insulin (0,8 mU/kg/min.) og en hyperinsulinemi, normoglucemi (4,5 mM) klamp ( postop) var begynt.

Indirekte kalorimetri (Deltatrac <*>Dansj66, Sverige) [Frayn, K.H. J. Appl. Physiol. 55(2): 628-34 (1983); Takala, J., et al., Crit. Care Med. 17(10): 1041-47 (1989)] ble utført i 30 minutter i løpet av basalfasen, to ganger i løpet av det kirurgiske inngrepet ( tidlig op og sen op), og i løpet av de siste 30 minuttene av preop og postop klamp. Tidsinnsamling av urin for analyse av urin urea ekskresjon ble utført. Etter korreksjon for endringer i ureamengde [Trappy, L., et al., Diabetes 37: 1212-16 (1988)] ble ingen proteinenergi-forbruk (EE), respirasjohskvotient (RQ) og substratoksyderingsrater beregnet.

Blodprøver ble samlet inn fra en oppvarmet håndvene gjentatte ganger under basal, preop, tidlig op, sen op og postop perioder. Blodglukose ble målt umiddelbart etter innsamling ved å bruke en glukoseoksidasemetode (Yellow Springs Instruments, Yellow Springs, Ohio) [Huggt, A.S., et al., Lancet 2:368-70 (1957)]. Radio immunoanalyse (RIA) ble brukt for å måle serumkonsentrasjon av insulin [Grill, V., et al., Metabolism 39: 251-58 (1990)]; C-peptid (Novo Research, Bagsværd, Danmark); cortisol (Harris, V., et al., In Jaffe, B.M. & Behrman, H.R., eds. Methods of hormone radioimmunoassay, Academic Press, New York and London (1979) s. 643-56]; og glucagon (Euro-Diagnostica AB, Malmo, Sverige) [Faloona, G.R., et al., Glucagon radioimmunoassay technique. Vol. 1: Academic Press, New York (1974)].

Alle verdiene er individuelle verdier, eller gjennomsnitt ± SEM (standardfeil av gjennomsnittet). Statistisk signifikans er akseptert ved p< 0,05 ved å bruke «Wilcoxon<*>s signed rank test» og «Mann-Whitney U-test» for parrede og uparrede data respektivt.' Siden seruminsulinnivåene ved postop klamp har tendenser til å være lavere i kontrollgruppen sammenlignet med insulingruppen (p = 0,06), ble GLR i løpet av klamp også korrigert til gjeldende insulinnivåer ved å dele GIR og gjennomsnitts serum insulinnivå i løpet av 60 minutters likevektsperioder.

Serum insulinnivåene var like mellom de to gruppene, både ved basal og gjennom preop klamp. I insulingruppen forble omtrent 60 uU/ml gjennom operasjonen og postop klamp. I kontrollgruppen forble insulinnivåene uforandret sammenlignet med basal nivåene under operasjonen. Insulinnivåene ved postop klamp i kontrollgruppen var ikke signifikant forskjellig fra nivåene under preop klamp ei heller forskjellig fra de insulin gruppen under postop klamp. C-peptidnivåene (Tabell I) var like mellom gruppene ved basal og under preop og postop klamp. Insulingruppen utviste lavere C-peptidnivåer under det kirurgiske inngrepet sammenlignet med kontrollgruppen.

Serumglykagonnivåene minket (p< 0,05) etter inngrepet i begge grupper (Tabell I). Imidlertid var den relative endringen etter kirurgien (% vs preop) høyere i insulingruppen (p< 0,01 vs kontroll).

Serumkortisolnivåene (Tabell I) avtok etter kirurgien i insulingruppen mens nivåene i kontrollgruppen tenderte til å øke (p = 0,1). De postoperative nivåene av kortisol var lavere i insulingruppen sammenlignet med kontrollgruppen (p < 0,05). Glukagonnivåene avtok i begge grupper etter kirurgi skjønt den største reduksjonen (%) ble funnet i insulingruppen (p < 0,01 vs kontroll). Kortisolnivåene avtok etter kirurgi i insulingruppen (p < 0,05 vs preop), mens nivåene i kontrollgruppen tenderte til å øke (p=0,l). Således var kortisolnivåene signifikant lavere i insulingruppen sammenlignet med kontrollgruppen etter kirurgi (p < 0,05).

Glukoseinfusjonsratene (GIR) ble ikke signifikant forskjellig mellom insulin- og kontrollgruppene under preop klamp. Kontrollgruppen hadde et avtagende gjennomsnitt GIR som var nødvendig for å opprettholde normoglycemia under postop klamp sammenlignet med preop klamp(-39 ±5%, p< 0,05). I motsetning til insulingruppen som opprettholdt GIR under kirurgien og, i gjennomsnitt, til og med tenderte til å øke GIR i postop klamp (-16 ±20%, p = 0,2). Mest signifikant og uventet, var gjennomsnitts GIR under postop klamp i insulingruppen signifikant høyere sammenlignet med kontrollgruppen (p < 0,05) (se Figur 1). Alle endringer i GIR ved preop og postop klamp var statistisk signifikante (p< 0,05), uansett om GIR var korrigert for gjennomsnitts seniminsuhnnivåer under periodene med stabil tilstand. Glukose og fettoksideirngsrater var like mellom gruppene før det kirurgiske inngrepet. Under kirurgi, ble glukose oksideringsratene signifikant høyere, mens fettoksideirngsratene ble signifikant lavere i insulingruppen (p< 0,05 vs. kontroll). I postop klamp kunne ingen endringer i substratoksideringsratene ses i insulingruppen sammenlignet med preop klamp. Hvilende energiforbruk (EE) var ikke forskjellig mellom gruppene under og etter inngrepet, og forble det samme i begge grupper etter kirurgi sammenlignet med preop klamp.

Fastende glukosenivåer var like mellom insulin og kontrollgruppene. Ved stabil tilstand under insulininfusjon, ble normoglukemi opprettholdt, resulterende i gjennomsnitts intra-individuell koeffisienter av variasjon for glukose på 4,6% i kontrollen og 6,2% i insulingruppen.

Disse funnene demonstrerte endelig at pasientene som undergikk elektiv kirurgisk inngrep i en fastende tilstand, utviklet postoperativ insulinresistens og økt fettoksidering. Videre demonstrerte disse funnene også for første gang at katabolske endringer etter kirurgiske inngrep er fullstendig opphevet og hormonellrespons for stress fullstendig svekket, hvis pasientene går inn i kirurgisk stress i en tilstand med forhøyede insulin-nivåer som opprettholdes gjennom operasjonen..

Eksempel 2

GLP-1 (7-36) amid ble administrert med en subkutan infusjon ved en doserate på 1,2 pmol/kg/hr i 10 timer gjennom natten, til 5 pasienter som hadde ikke-insulinavhengig diabetes (NIDDM). Som en kontroll, var insulin kontinuerlig tilført i de samme 5 pasientene, men på forskjellig dag enn GLP-1 (7-36) amidinfusjon. Raten av insulin-infusjon ble justert hver annen time for å oppnå optimal kontroll og for å unngå hypoglykemi. Som demonstrert av dataene i Tabell E og i Figur 2, normaliseres subkutan infusjon av GLP-1 (7-36) amid nesten blodglukose uten å indusere hypoglykemi i noen av pasientene. Den metabolske kontrollen med GLP-1 (7-36) amid var bedre enn de som ble oppnådd ved insulin, og gjennomsnitts blodglukosenivå var lavere for GLP-1 (7-36) amidbehandling enn for kontrollen ved en statistisk signifikant mengde på 23:00,0:00 og ved 1:00.

Eksempel 3

Gjennom dagen ble GLP-1 (7-36) amid tilført i fem NIDDM pasienter i tre timer under frokost, lunsj og middag. Infusjonstidene var 7:30 - 10:30 (frokost), 10:30 - 1:30 (lunsj) og 4:30 - 7:30 (middag) som indikert i Figur 3. I et kontrolleksperiment i de samme fem NIDDM pasientene utført på en annen dag, ble insulin tilført subkutant rett før starten på måltidene, som indikert i Figur 3. Mens GLP-1 ble tilført, ble de postprandiale glukoseutslagene observert med insulininjeksjon eliminert, og normalt blodglukosenivå ble opprettholdt. Umiddelbart etter terminering av hver GLP-1 (7-36) amimnfusjon økte blodglukosenivået signifikant. Ingen uheldige bivirkninger av GLP-1 (7-36) amid ble observert. Disse data indikerer at GLP-1 (7-36) amidinfusjon mer effektivt kontrollerer postprandiale glukosenivåer enn insulininjeksjoner og at kontrollen er effektiv så lenge som GLP-1 (7-36) amidinfusjon fortsetter.

Claims

1. Anvendelse av et peptid valgt fra gruppen bestående av GLP-1 (7-37) eller en analog derav, og derivater og farmasøytiske akseptable salter derav, for fremstilling av et preparat for behandling av pasienter som opplever hyperglykemi på grunn av kirurgisk stress.

2. Anvendelse ifølge krav 1, hvor peptidet administreres før, under eller etter kirurgi.

3. Anvendelse ifølge krav 1 eller 2, hvor peptidet administreres for å normalisere blodglukosenivåer.

4. Anvendelse ifølge krav 3, hvor blodglukosenivået er i området fra 4,1 mM til 7,5 mM.

5. Anvendelse ifølge hvilket som helst av kravene 1-4, hvor nevnte analog er valgt fra GLP-l(7-34), GLP-l(7-35) og GLP-l(7-36) eller en analog derav, og derivater og farmasøytiske akseptable salter derav.

6. Anvendelse ifølge hvilket som helst av kravene 1-5, hvor nevnte analog er acetylert på epsilon-amino gruppen til et lysin residu.

7. Anvendelse ifølge hvilket som helst av kravene 1-5, hvor nevnte analog er resistent mot dipeptidyl-peptidase aktivitet

8. Anvendelse av GLP-l(7-34), GLP-l(7-35), GLP-l(7-36), GLP-l(7-37), eller amidformen derav, og farmasøytiske akseptable salter derav, som har minst én modifikasjon valgt fra gruppen bestående av: (a) substitusjon med glysin, serin, cystein, threonin, asparagin, glutamin, tyrosin, alanin, valin, isoleucin, leucin, metionin, fenylalanin, arginin eller D-lysin i stedet for lysin i posisjon 26 og/eller posisjon 34; eller substitusjon med glysin, serin, cystein, threonin, asparagin, glutamin, tyrosin, alanin, valin, isoleucin, leucin, metionin, fenylalanin, lysin eller D-arginin i stedet for arginin i posisjon 36; (b) substitusjon med en oksideringsresistent aminosyre i stedet for tryptofan i posisjon 31; (c) substitusjon med minst én tyrosin i stedet for valin i posisjon 16; lysin i stedet for serin i posisjon 18; asparaginsyre i stedet for glutaminsyre i posisjon 21; serin i stedet for glysin i posisjon 22; arginin i stedet for glutamin i posisjon 23; arginin i stedet for alanin i posisjon 24; og glutamin i stedet for lysin i posisjon 26; og (d) substitusjon omfattende minst én av: glysin, serin eller cystein i stedet for alanin i posisjon 8; asparginsyre, glycin, serin, cystein, threonin, aspargin, glutamin, tyrosin, alanin, valin, isoleucin, leucin, metionin eller fenylalanin i stedet for glutaminsyre i posisjon 9; serin, cystein, threonin, aspargin, glutamin, tyrosin, alanin, valin, isoleucin, leucin, methionin eller fenylalanin i stedet for glysin i posisjon 10; og glutaminsyre i stedet for asparginsyre i posisjon 15; og (e) substitusjon med glysin, serin, cystein, threonin, aspargin, glutamin, tyrosin, alanin, valin, isoleucin, leucin, methionin eller fenylalanin eller den D- eller N-acylerte eller -alkylerte formen av histidin i stedet for histidin i posisjon 7; hvor den substituerte aminosyren i substitusjonene i (a), (b), (c), (d) og (e) alternativt kan være i deres D-form og aminosyrene substituert i posisjon 7 kan alternativt være i deres N-acylerte eller N-alkylerte form; for fremstilling av et preparat for behandling av pasienter som opplever hyperglykemi på grunn av kirurgisk stress.

9. Anvendelse ifølge krav 8, hvor nevnte GLP-l(7-34), GLP-1 (7-35), GLP-1 (7-36), GLP-1(7-37), eller amidformen derav, og farmasøytiske akseptable salter derav, er modifisert ved substitusjon av glysin, serin, cystein, threonin, asparagin, glutamin, tyrosin, alanin, valin, isoleucin, leucin, metionin, fenylalanin, arginin eller D-lysin i stedet for lysin i posisjon 26 og/eller posisjon 34.

10. Anvendelse ifølge krav 9, hvor nevnte GLP-1 analog er et derivat.

11. Anvendelse ifølge krav 10, hvor nevnte analog er acetylert på epsilon-amino gruppen til et lysin residu.

12. Anvendelse ifølge hvilket som helst av kravene 1-4, hvor nevnte GLP-1-analoger og derivater er sammensatt av molekyler med formelen: R,-X-Glu-Gly<lD->Thr-Phe-Thr-Ser-Asp<15->Val-Ser-Ser-Tyr-Leu20-Y-Gly-Gln-Ala- Ala^-Lys-Z-Phe-Ile-Ala^-Trp-Leu-Val-Lys-Gl^^Arg-Ra og farmasøytiske akseptable salter derav, hvor: Ri velges fra L-histidin, D-histidin, desaminohistidin, 2-aminohistidin, |3-hydrok- syhistidin, homohistidin, a-fluormetylhistidin og a-metylhistidin; X velges fra Ala, Gly, Val, Thr, Ile og a-metyl-Ala; Y velges fra Glu, Gin, Ala, Thr, Ser og Gly; Z velges fra Glu, Gin, Ala, Thr, Ser og Gly; og R2 velges fra NH2 og Gly-OH.

13. Anvendelse ifølge krav 12, hvor nevnte analog omfatter en substituering av alanin i posisjon 8 med valin og videre omfatter en eller flere aminosyresubstitusjoner, delesjoner, inversjoner eller addisjoner.

14. Anvendelse ifølge krav 12, hvor nevnte molekyl velges fra Gly -GLP-1 (7-36)NH2, Var-GLP-l(7-37)OH, a-metyl-Ala<8->GLP-l(7-36)NH2 og Gly<8->Gln<21->GLP-l(7-37)OH, eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav.