NO318643B1 - Anvendelse av konsensushumanleukocyttinterferon, eventuelt i kombinasjon med ett eller flere kjemoterapeutiske midler, ved fremstillingen av et medikament for behandling av virussykdommer samtidig som bivirkninger reduseres. - Google Patents

Abstract

Fremgangsmåter for behandlingen av celleproliferasjonssykdommer, virusinfeksjoner og andre tilstander uten å forårsake betydelige bivirkninger som normalt er forbundet med interferonterapi, som omfatter administrering av en terapeutisk effektiv mengde av konsensushumanleukocyttinterferon til en pasient som trenger det. Farmasøytiske preparater av konsensushumanleukocyttinterferon er også. beskrevet.

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører anvendelse av konsensushumanleukocyttinterferon, eventuelt i kombinasjon med ett eller flere kjemoterapeutiske midler, ved fremstillingen av et medikament for behandling av virussykdommer samtidig som bivirkninger reduseres.

Oppfinnelsens bakgrunn

Interferoner er en underklasse av cytokiner som ut-viser både antiviral og antiproliferativ aktivitet. På grunnlag av biokjemiske og immunologiske egenskaper grupperes humaninterferoner i tre klasser: alfa-interferon (leukocytt), beta-interferon (fibroblast) og gamma-interferon (immun). Minst 14 alfa-interferoner (gruppert i undertypene A-H) med distinkte aminosyresekvenser er blitt identifisert ved å iso-lere og sekvensere DNA som koder for disse polypeptidene. Alfa-interferoner har fått betydelig oppmerksomhet som poten-sielle, terapeutiske midler på grunn av deres antivirus- og antitumorvekstinhibering.

Rensingen av interferon fra humanleukocytter isolert fra "buffy coat"-fraksjonen av helblod er beskrevet i US patentskrift nr. 4 503 035. Humanleukocyttinterferon fremstilt på denne måte, inneholder en blanding av forskjellige human-leukocyttinterf eronaminosyresekvenser. Det rensede materiale har en spesifikk aktivitet fra 0,9 x 10s - 4 x 10<8> enheter/mg protein når det analyseres med hensyn på MDBK-bovincellelin-jen, og fra 2 x IO<6> - 7,6 x IO<8> enheter/mg protein når det analyseres med hensyn på Ag 1732-humancellelinjen. Inhiberings-analysen av cytopatisk effekt som brukes for å bestemme interferon- ant ivirusaktivi tet , er beskrevet i US patentskrift nr. 4 241 174. Den målte interferonaktivitet ble kalibrert mot en referansestandard for humanleukocyttinterferon levert av National Institutes of Health.

Konstruksjonen av plasmider med rekombinant DNA inneholdende sekvenser som koder for minst en del av human-leukocyttinterf eron og ekspresjonen i E. coli av et polypeptid med immunologisk eller biologisk aktivitet som humanleuko-cyttinterf eron, er beskrevet i US patentskrift nr. 4 530 901.

Konstruksjonen av hybrid-alfa-interferongener som inneholder kombinasjoner av forskjellige undertypesekvenser (f.eks. A og D, A og B, og A og F), er beskrevet i US patentskrifter nr. 4 414 150, 4 456 748 og 4 678 751.

I US patentskrifter nr. 4 695 623 og 4 897 471 be-skrives nye humanleukocyttinterferonpolypeptider med aminosyresekvenser som omfatter vanlige og dominerende aminosyrer som finnes i hver stilling blant naturlig forekommende alfa-interferonundertypepolypeptider, og er henvist til som konsensushumanleukocyttinterferon (IFN-con). IFN-con-aminosyresekvensene som er beskrevet, er betegnet IFN-coni, IFN-con2 og IFN-con3. Fremstillingen av kunstige gener som koder for IFN-con og ekspresjonen av genene i E. coli er også beskrevet.

En rensing av IFN-coni fremstilt i E. coli, er beskrevet i Klein et al. (J. Chromatog. 454, 205-215 (1988)). IFN-coni renset på denne måte, er rapportert å ha en spesifikk aktivitet på 3 x IO<9> enheter/mg protein målt i inhiberingsana-lysen av cytopatisk effekt under anvendelse av T98G-humancellelinjen (Fish et al., J. Interferon Res. 9, 97-114 (1989)). Renset IFN-coni omfatter tre isoformer bestemt ved hjelp av isoelektrisk fokusering som er blitt identifisert som metion-yl-IFN-coni, des-metionyl-IFN-conx og des-metionyl-IFN-coni nied dets N-ende blokkert av en acetylgruppe. (Klein et al., Arch. Biochem. Biophys. 276, 531-537 (1990)).

Alfa-interferon er for tiden godkjent i USA og andre land for behandling av hårcelleleukemi, veneriske vorter, Kaposis sarkom (en kreft som vanligvis rammer pasienter som lider av ervervet immunsviktsyndrom (AIDS)), og kronisk ikke-A, ikke-B-hepatitt. To varianter av alfa-interferon er blitt godkjent for terapeutisk bruk: Interferon alfa-2a, markedsført under handelsnavnet "Roferon"-A, og Interferon alfa-2b, mar-kedsført under handelsnavnet "Intron" A. Aminosyresekvensene til "Roferon"-A og "Intron" A atskiller seg i en enkelt stilling, men er ellers identisk med aminosyresekvensene til alfa-interferon undertype 2 (undertype A).

I tillegg til de avmerkede indikasjoner anvendes eller evalueres alfa-interferon alene eller sammen med kjemoterapeutiske midler i mange forskjellige andre cellulære pro-liferasjonssykdommer, inkludert kronisk, myelogen leukemi, multippelmyelom, overflateblærekreft, hudkreft (basalcelle-karsinom og malignt melanom), renalt cellekarsinom, ovarie-kreft, lavgrads lymfocytt- og kutanøs T-cellelymfom og gliom. Alfa-interferon kan være effektivt i kombinasjon med andre kjemoterapimidler for behandling av faste tumorer som oppstår fra lunge-, colorektal- og brystkreft (se Rosenberg et al., "Principles and Applications of Biologic Therapy" i Cancer: Principles and Practices of Oncology, 3. utg., Devita et al., red., s. 301-547 (1989), Balmer DICP, Ann Pharmacother. 24, 761-768 (1990)) .

Alfa-interferoner er kjent for å påvirke mange forskjellige cellulære funksjoner, inkludert DNA-replikasjon og RNA- og proteinsyntese, både i normale og unormale celler. Cytotoksiske effekter av interferon er således ikke begrenset til tumor eller virusinfiserte celler, men er også manifestert i normale, friske celler. Som et resultat av dette, oppstår uønskede bivirkninger under interferonterapi, særlig når høye doser er påkrevet. Administrering av interferon kan føre til myelosuppresjon som resulterer i reduserte nivåer av røde blodlegemer, hvite blodlegemer og blodplater. Høyere doser av interferon gir vanligvis opphav til influensalignende symptomer (f.eks. feber, tretthet, hodepine og frysninger), mage-og tarmsykdommer (f.eks. anoreksi, oppkast og diaré), søvnig-het og hosting. Det ville være nyttig å redusere eller fjerne de uønskede bivirkningene av interferonbehandling uten å redusere de terapeutiske fordelene ved slik terapi.

Et formål ved denne oppfinnelsen er derfor behandlingen av tilstander som er mottakelige for behandling med et interferon, hvor de uønskede bivirkningene normalt forbundet med alfa-interferonbehandling, er betydelig redusert sammenlignet med for tiden praktiserte behandlingsregimer eller fullstendig eliminert. Et annet formål ved oppfinnelsen er å oppnå forbedret terapeutisk gevinst ved behandlingen av sykdommer med interferon sammenlignet med for tiden praktiserte regimer, med i det vesentlige ingen tilsvarende økning i hyppigheten eller alvorligheten av uønskede bivirkninger.

Oppsummering av oppfinnelsen

Oppfinnelsen omfatter anvendelse av en terapeutisk effektiv mengde av et konsensushumanleukocyttinterferon ved fremstillingen av et medikament for behandling av en pasient som har en virussykdom, mens én eller flere bivirkninger forbundet med alfa-interferonadministrering reduseres eller elimineres, hvor virussykdommen er hepatitt A, hepatitt B, hepatitt C eller hepatitt Delta. Oppfinnelsen omfatter også anvendelse av en terapeutisk effektiv mengde av et konsensushumanleukocyttinterferon ved fremstillingen av et medikament for behandling av en pasient som har Kaposis sarkom, mens én eller flere bivirkninger forbundet med alfa-interferonadministrering reduseres eller elimineres, som omfatter administrering av en terapeutisk effektiv mengde av et konsensushumanleukocyttinterferon til pasienten. IFN-con kan anvendes alene eller i kombinasjon med andre terapeutika til behandlingen av kreft og andre proliferative sykdommer. Oppfinnelsen vedrører således også anvendelse av en terapeutisk effektiv mengde av interferon i kombinasjon med ett eller flere kjemoterapeutiske midler ved fremstillingen av et medikament for behandling av en pasient som har en virussykdom, mens én eller flere bivirkninger forbundet med administrering av alfa-interferon alene reduseres eller elimineres, hvor virussykdommen er hepatitt A, hepatitt B, hepatitt C eller hepatitt Delta. Ved en foretrukket utførel-sesform anvendes IFN-con sammen med en terapeutisk effektiv mengde av én eller flere faktorer som stimulerer myeloidcel-leproliferasjon eller -differensiering, slik som granulocyttkolonistimulerende faktor (G-CSF) og erytropoietin. G-CSF er en foretrukket faktor for anvendelse med IFN-con.

Virale tilstander som lar seg behandle med IFN-con, omfatter således hepatitt A, hepatitt C, hepatitt B og hepatitt Delta.

Selv om det tidligere er blitt satt pris på at de ovenfor nevnte tilstander kan behandles med alfa-interferon, har bivirkninger som ledsager slik behandling, i alvorlig grad begrenset den totale nytte av slik behandling. I noen tilfeller, slik som Epstein-Barr-infeksjon, har bivirkninger som ledsager alfa-interferonbehandling, praktisk talt utelukket behandling under anvendelse av alfa-interferon. For formål ifølge foreliggende oppfinnelse omfatter således tilstander som kan behandles med IFN-con, de tilstandene hvor alfa-interferonbehandling oppviser en viss effektivitet, men som kanskje ikke lar seg behandle med kjente interferoner fordi de nega-tive bivirkningene oppveier fordelene ved behandlingen. Det er nå blitt oppdaget og beskrevet her at behandling med et ikke naturlig forekommende interferon, utvalgt fra konsensushuman-leukocyttinterf eroner (IFN-con), resulterer i vesentlig reduserte eller eliminerte bivirkninger sammenlignet med behandling med alfa-interferon. Reduksjonen eller elimineringen av bivirkninger forventes å bli demonstrert uansett tilstanden som behandles. Reduksjonen eller elimineringen av bivirkninger som er oppdaget for IFN-con, kunne ikke ha vært forutsagt på grunnlag av resultatene rapportert i teknikkens stand. De ak-tuelle kliniske resultatene som her er presentert, viser klart ikke bare at IFN-con forårsaker reduserte eller ikke-eksister-ende bivirkninger ved det samme dosenivå som alfa-interferon, men at 3 til 5 ganger mer IFN-con kan administreres uten å forårsake dosebegrensende bivirkninger.

I tillegg er det blitt påvist nedenunder at IFN-con har lignende eller større aktivitet enn "Intron" A ved de ovenfor beskrevne indikasjoner. Særlig oppviser IFN-con større antiproliferativ aktivitet enn "Intron" A. Behandling av en celleproliferasjonssykdom under anvendelse av IFN-con oppviser derfor forøkt virkningsfullhet og sikkerhet sammenlignet med andre for tiden praktiserte interferonbehandlinger. Administreringen av en terapeutisk effektiv mengde av IFN-con resulterer i hurtigere eller mer omfattende behandling av en cel-lulær, proliferativ sykdom sammenlignet med metoder som for tiden praktiseres, hvor det ikke inntrer noen tilsvarende økning i hyppigheten eller alvorligheten av ledsagende, uønskede bivirkninger. I tillegg kan en terapeutisk effektiv mengde av IFN-con være mindre enn mengden av et interferon som anvendes i for tiden praktiserte behandlingsopplegg. Som et resultat gir i noen tilfeller en redusert dose av IFN-con den samme terapeutiske fordel som høyere doser av andre interferoner, men med en reduksjon eller eliminering av uønskede bivirkninger forbundet med for tiden praktisert interferonterapi.

IFN-con er et ikke-naturlig forekommende polypeptid med antiproliferativ aktivitet. Fortrinnsvis er IFN-con et polypeptid med aminosyresekvensen til IFN-coni, IFN-con2 eller IFN-con3. Aller helst har IFN-con aminosyresekvensen til IFN-coni ■

Kort beskrivelse av tegningene

Figurene 1-7 viser den antiproliferative aktivitet av IFN-coni og "Intron" A, et sammenligningsmateriale, på Eskol, en hårcelleleukemicellelinje, når interferoner tilsettes til en Eskol-cellesuspensjon ved henholdsvis 0,1, 0,5, 1, 5, 10, 50 og 100 ng/ml. Figur 8 viser den første og den nåværende midlere MTD oppnådd ved hjelp av pasienter med Kaposis sarkom behandlet med "Intron"-A, IFN-Coni eller IFN-Coni og r-metGCSF.

Nærmere beskrivelse av oppfinnelsen

Slik det her er brukt, betyr konsensushumanleuko-cyttinterf eron (IFN-con) et ikke-naturlig forekommende polypeptid som hovedsakelig omfatter de aminosyrerestene som er vanlige for alle naturlig forekommende humanleukocyttinter-feronundertypesekvenser, og som omfatter, i én eller flere av de stillingene hvor det ikke er noen aminosyre felles for alle undertypene, en aminosyre som hovedsakelig inntrer i den stillingen, og som ikke i noen tilfeller omfatter noen aminosyre-rest som ikke er i behold i den stillingen i minst én naturlig forekommende undertype. IFN-con omfatter, men er ikke begrenset til, aminosyresekvensene betegnet IFN-coni, IFN-con2 og IFN-con3 som er beskrevet i US patentskrifter nr. 4 695 623 og 4 897 471. DNA-sekvenser som koder for IFN-con, kan syntetis-eres som beskrevet i de ovennevnte patentskrifter eller ved hjelp av andre standardmetoder.

IFN-con-polypeptider er fortrinnsvis produktene av ekspresjon av kunstig fremstilte DNA-sekvenser transformert eller transfektert i bakterieverter, spesielt E. coli. Det betyr at IFN-con er rekombinant IFN-con. IFN-con fremstilles fortrinnsvis i E. coli og renses ved hjelp av fremgangsmåter som er kjent for fagfolk innen teknikken, og som er generelt beskrevet i Klein et al., supra (1988) for IFN-coni. Renset IFN-con kan omfatte en blanding av isoformer, f.eks. omfatter renset IFN-con! en blanding av metionyl-IFN-coni, des-metionyl-IFN-con! og des-metionyl-IFN-coni med en blokkert N-ende (Klein et al., supra (1990)). Alternativt kan IFN-con omfatte en spesifikk, isolert isoform. Isoformer av IFN-con skilles fra hverandre ved hjelp av slike teknikker som isoelektrisk fokusering som er kjent for fagfolk innen teknikken.

Foreliggende oppfinnelse sørger for anvendelser ved fremstillingen av medikamenter for behandling av en tilstand som lar seg behandle ved hjelp av alfa-interferon samtidig som én eller flere bivirkninger som vanligvis er forbundet med al-fa-interferonbehandling, og som omfatter administrering av en terapeutisk effektiv mengde av IFN-con til en pasient, reduseres eller elimineres. En foretrukket utførelsesform av oppfinnelsen er en anvendelse hvor humanleukocyttinterferonet er valgt fra gruppen bestående av IFN-coni, IFN-con2 eller IFN-con3. Helst anvendes en terapeutisk effektiv mengde av IFN-coni ■

Uttrykket "redusere eller eliminere én eller flere bivirkninger forbundet med interferonadministrering" antas å vasre klart og forståelig for de som har vanlige kunnskaper innen den relevante teknikk. Generelt kan man anvende hvilket som helst av mange forskjellige mål for antall og alvorlig-hetsgrad av bivirkninger forbundet med interferonterapi, for å bestemme hvorvidt bivirkningsprofilen er forskjellig fra ett interferon til et annet. Ett egnet interferon for sammenlig-ningsformål med konsensusinterferon er "Intron" A, interferon alfa-2b, solgt av Schering-Plough.

En passende måte å bedømme alvorligheten av bivirkninger på er å bruke en standardskala, slik som den som er godkjent av WHO (Verdens Helseorganisasjon). Skalaen, som for tiden har utstrakt anvendelse hos leger, omfatter gradsnivåer av bivirkninger på følgende måte: grad I: mild; grad II: middels; grad III: alvorlig; grad IV: livstruende. Selv om det er en viss subjektivitet involvert i disse bedømmelsene, vil, dersom den samme lege bedømmer grupper av pasienter, en sammenligning av bivirkningsprofiler mellom to legemidler være gyldig og akseptabel for leger. For å gjøre en sammenligning vil leger ofte se på hvorvidt administrering av et bestemt legemiddel ved et bestemt dosenivå resulterer i en dosebegrensende toksisitet (DLT). En DLT inntrer når en pasient bedømmer en bivirkning som ikke tolererbar. Når dette skjer, kan en lege enten redusere dosen (vanligvis med 3 millioner enheter i tilfellet med "Intron" A eller konsensusinterferon) eller slutte å gi pasienten legemidlet i et visst tidsrom etterfulgt av gjenopptagelse av administrering med den samme eller en lavere dose. Når man støter på en DLT, kan resultatet i alle tilfeller være et underoptimalt behandlingsregime med mindre enn optimal virkning. En annen måte å uttrykke en reduksjon i bivirkninger på er således å henvise til et redusert antall DLT-er på et bestemt dosenivå. En sammenligning av DLT-er er vist for "Intron" A og konsensusinterferon i eksempel 3. Selv om andre mål for bivirkningsprofiler kan anvendes, er resultatet det samme: sammenlignet med andre interferoner, spesielt alfa-interferoner, slik som "Intron" A og "Roferon" (Hoffman La Roche), resulterer konsensusinterferon i færre DLT-er og generelt til en pasient som føler seg bedre ved alle dosenivåer som kan anvendes for å behandle sykdommer.

Tilstander som er egnet for behandling med IFN-con, omfatter mange forskjellige virussykdommer. Disse sykdommer er som nevnt hepatitt A, hepatitt B, hepatitt C og hepatitt Delta.

IFN-con kan anvendes alene eller i kombinasjon med andre terapeutika til behandlingen av indikasjonene som her er beskrevet. For eksempel kan IFN-con administreres sammen med en terapeutisk effektiv mengde av ett eller flere kjemoterapimidler, slik som busulfan, 5-fluoruracil (5-FU), zidovudin (AZT), leukovorin, melfalan, prednison, syklofosfamid, dakar-bazin, cisplatin og dipyridamol. IFN-con kan også gis sammen med cytokiner, slik som interleukin-2 (IL-2).

En terapeutisk effektiv mengde av IFN-con kan administreres sammen med en terapeutisk effektiv mengde av én eller flere faktorer som stimulerer myeloiddifferensiering slik at effektene av myelosuppresjon observert under interferonbehandlinger, overvinnes. Slike midler omfatter, men er ikke begrenset til, G-CSF, GM-CSF, IL-l, IL-3, IL-6, erytropoietin og SCF. Stamcellefaktor (SCF) stimulerer proliferasjonen av tidlige hematopoeseforløperceller og er blitt beskrevet i US patentsøknad nr. 573 616. Et foretrukket middel er G-CSF.

I eksemplene 2-3 nedenunder er det vist at IFN-coni er et effektivt henholdsvis antiproliferativt middel mot AIDS-forbundet Kaposis sarkom og antiviralt middel mot hepatitt C.

Den antiproliferative aktivitet av IFN-coni og "Intron" A analysert på Eskol-celler, en hårcelleleukemicellelinje, er vist i eksempel 1. Det er vist at IFN-coni har høyere antiproliferativ aktivitet enn "Intron" A over et bredt område av konsentrasjoner. Lignende resultater ble oppnådd når IFN-conx ble sammenlignet med "Roferon"-A. Disse resultater indikerer at IFN-coni har større terapeutisk virkningsfullhet når det administreres ved de samme konsentrasjonene som "Intron" A. Alternativt er det påkrevet med lavere konsentrasjoner av IFN-coni for å vise terapeutisk virkningsfullhet som er ekvivalent med virkningen av "Intron" A.

Eksempel 2 beskriver en sammenligningsundersøkelse av IFN-coni og "Intron" A ved behandlingen av AIDS-forbundet Kaposis sarkom. Det ble påvist at pasienter som fikk IFN-coni, oppnådde høyere enhetsdoser enn de pasientene som fikk "Intron" A. I tillegg mottok pasienter som fikk begge og IFN-coni og GCSF, høyere doser av IFN-coni enn de pasientene som fikk IFN-conx alene (se figur 8). I denne undersøkelsen mottok alle pasientene A2T som del av deres behandling av HIV-infeksjon. AZT administrert alene, er ikke effektivt på Kaposis sarkom.

IFN-coni ble påvist å være sikrere enn "Intron" A slik det ble bedømt ved hjelp av den reduserte hyppighet av toksisiteten av grad 3 når IFN-coni ble administrert. Behandling med IFN-coni viste en redusert hyppighet av neutropeni og leverdysfunksjon sammenlignet med "Intron" A-behandling, mens behandling med IFN-coni og r-metGCSF fullstendig eliminerte toksisitet av grad 3 (se tabell 2).

Eksempel 3 viser data oppnådd fra kliniske forsøk som omfattet pasienter smittet med hepatitt.

Medikamentene kan være farmasøytiske preparater som omfatter en terapeutisk effektiv mengde av IFN-con sammen med farmasøytisk akseptable bærere, adjuvanser, fortynningsmidler, preserveringsmidler og/eller oppløseliggjøringsmidler. Farma-søytiske preparater av IFN-con omfatter fortynningsmidler av forskjellige buffere (f.eks. Tris-HCl, acetat, fosfat) med et område for pH og ionestyrke, bærere (f.eks. humant serumalbu-min), oppløseliggjøringsmidler (f.eks. tween, polysorbat) og preserveringsmidler (f.eks. timerosol, benzylalkohol). Generelt kan komponenter i farmasøytiske preparater velges blant de som vanligvis anvendes med interferoner og andre antiproliferative eller antivirusmidler, og som er kjent for fagfolk innen teknikken. Et farmasøytisk preparat av IFN-con leveres som en injiserbar oppløsning eller som et lyofilisert pulver som rekondisjoneres i et passende fortynningsmiddel før injek-sjon.

En terapeutisk effektiv mengde av IFN-con kan bestem-mes av fagfolk innen teknikken idet det tas i betraktning slike variable størrelser som halveringstiden til IFN-con-preparater, administreringsvei og tilstanden som testes. Generelt vil en terapeutisk effektiv mengde av IFN-con for behandlingen av en celleproliferasjonssykdomstilstand være i området 2 x IO6 til 60 x IO<6> enheter pr. pasient administrert flere ganger pr. uke. Doser i den nedre del av området er effektive ved behandlingen av hårcelleleukemi, mens doser i den øvre del av området er egnet for behandlingen av Kaposis sarkom. Terapeutisk effektive mengder av IFN-con vil fortrinnsvis resultere i tumorremisjon på 20-80% avhengig av den bestemte tumortype, i et tidsrom på minst seks måneder. Generelt vil en terapeutisk effektiv mengde av IFN-con for behandlingen av en virustil-stand være i området 3 x IO<6> til 3 0 x IO<6> enheter, fortrinnsvis 6 x IO<6> til 15 x IO<6> enheter pr. pasient, administrert flere ganger (f.eks. 2-7, fortrinnsvis 3 ganger) pr. uke.

Administrasjonsveien vil fortrinnsvis være ved injek-sjon i blodet til et pattedyr hvor injeksjonen kan være intra-venøs, intramuskulær, subkutan eller intralesjonal. Administrering kan også være ad oral eller nasal vei. Egnetheten for et bestemt farmasøytisk preparat for en bestemt administra-sjonsvei vil være åpenbar for fagfolk innen teknikken.

De følgende eksempler gis for å illustrere oppfinnelsen mer fullstendig.

Eksempel 1

Antiproliferativ aktivitet av IFN- coni og " Intron" A

Den antiproliferative aktivitet av IFN-coni og "Intron" A ble testet på Eskol-cellelinjen, en hårcelle-leuketnicellelinje isolert av dr. E. Srour ved Indiana Univer-sity Medical School. 3 ml store kulturer av Eskol-celler ble inkubert i RPMI-medium (Gibco) ved 37°C i 5% C02 inneholdende 10% kalvefosterserum i 12 timer ved 1 x IO<5> celler/ml. IFN-coni eller "Intron" A (Interferon alfa 2b; Schering Corp.) ble tilsatt til en sluttproteinkonsentrasjon på 0,1-100 ng/ml i 100 ul medium. Proteinkonsentrasjonen av IFN-coni ble bestemt ved hjelp av en Bradford proteinanalyse (Bradford, Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976)) mens konsentrasjonen av "Intron" A ble beregnet ut fra den spesifikke aktivitet (2 x IO<8> internasjonale enheter/mg protein) og enhetskonsentrasjonen levert av produsenten. Antallet levedyktige celler ble bestemt ved 24 timers intervaller ved utelukkelse av trypan-blått (Sigma). 100 ul IFN-coni eller "Intron" A ble tilsatt til den angitte sluttkonsentrasjon ved 24 timers intervaller. Tellinger av levedyktige celler var et gjennomsnitt av fire uavhengige for-søk hvor hvert forsøk hadde prøver in duplo. Variasjon i cel-leantall strakte seg fra ca. 5% etter 24 til 48 timer, til ca. 2% etter lengre tidsrom. Resultatene vist i figurene 1-7, er forhold mellom antall levedyktige celler i nærvær og fravær av interferon på forskjellige tidspunkter uttrykt som prosentan-deler.

Antallet levedyktige celler ble bekreftet ved å måle inkorporeringen av <3>H-tymidin i Eskol-celler inkubert i nærvær av IFN-coni eller "Intron" A. Etter inkubasjonsperioden på

120 timer ble det tatt ut en 200 ul stor cellesuspensjon og inkubert ved 37°C i 3 timer i nærvær av 5 uCi/ml <3>H-tymidin (Amersham). Cellene ble innhøstet under anvendelse av en Cambridge cellehøster (Cambridge Technology), vasket syv ganger med destillert vann og to ganger med 95% etanol, og mengden av <3>H-tymidin inkorporert, ble bestemt ved hjelp av væskescintillasjonstelling. Det observerte opptak av <3>H-tymidin for Eskol-celler inkubert i 120 timer i nærvær av IFN-coni eller "Intron" A, var proporsjonalt med antallet levedyktige celler.

Eksempel 2

Sikkerhet, toleranse og virkningsfullhet for IFN- coni

administrert til pasienter med Kaposis sarkom ( KS)

En randomisert åpenmarkørundersøkelse for å evaluere sikkerheten og toleransen, og for å definere den maksimalt tolererte dose (MTD) av IFN-coni og "Intron" A, ble foretatt. IFN-coni og "Intron" A ble hver administrert i kombinasjon med zidovudin (AZT) til pasienter med AIDS-forbundet KS. I tillegg ble sikkerheten, toleransen og MTD for IFN-coni bestemt når det ble administrert sammen med AZT og E. coli-produsert, rekombinant granulocyttkolonistimulerende faktor med en metioninrest i aminoenden av polypeptidet (r-metGCSF). De tre behandlingsgruppene i undersøkelsen var:

1. "Intron" A og AZT

2 . IFN-coni og AZT

3. IFN-coni, AZT og r-metGCSF.

Minst 12 evaluerbare pasienter er inkludert i hver behandlingsgruppe.

A. Produktbeskrivelse

IFN-coni ble fremstilt i E. coli under anvendelse av metoder beskrevet i US patentskrifter nr. 4 695 623 og 4 897 471. IFN-coni ble renset ved hjelp av fremgangsmåter generelt beskrevet i Klein et al., supra (1988). For subkutan administrering i nærværende undersøkelse ble IFN-coni levert som en steril proteinoppløsning i natriumfosfatbuffer. Om nød-vendig, ble det fortynnet i steril saltoppløsning.

Zidovudin (AZT) ble levert av Burroughs-Wellcome Co. og brukt som angitt på pakningsinnlegget.

"Intron" A ble levert fra Schering Corp. som et sterilt, lyofilisert preparat som ble oppslemmet på nytt i fortynningsmiddel slik som angitt på pakningsinnlegget.

r-metGCSF ble fremstilt i E. coli under anvendelse av fremgangsmåter som er generelt beskrevet i US patentskrift nr. 4 810 643. r-metGCSF ble fremstilt som en steril proteinopp-løsning i 10 mM natriumacetat, 5% mannitol og 0,004% "Tween" 80 ved pH 4,0 og ved en konsentrasjon på 0,3 mg/ml. Om nødven-dig, ble det fortynnet i steril 5% glukose i vann (D5W) .

B. Dosering og behandlingsplaner

AZT. AZT ble administrert til alle pasientene ved en fastlagt dose på 100 mg oralt hver 4. time mens pasienten er våken, i alt fem doser, eller 500 mg daglig.

r- metGCSF. For de pasientene randomisert til behand-lingsgruppen som omfatter r-metGCSF, var doser av r-metGCSF 1 ug/kg kroppsvekt pr. dag administrert subkutant som en enkelt bolusinjeksjon. Om nødvendig ble denne doseringen trinnvis økt med 1 ug/kg/dag (overskrid ikke 6 ug/kg/dag) eller redusert trinnvis med 0,5 ug/kg/dag eller mindre, alt etter som, for å oppnå det absolutte målområde for nøytrofil-antall (ANC) på 5.000 til 15.000/mm<3>.

Interferon. Pasienter fikk enten IFN-coni eller "Intron" A i henhold til et doseopptrappingsskjema. Doseringen var basert på like enheter av hvert interferon. Ettersom de spesifikke aktivitetene til de to interferonene imidlertid er forskjellige (2 x IO<8> IU/mg for "Intron" A og minst 1 x 10<9 >IU/mg for IFN-coni bestemt ved hjelp av den cytopatiske anti-virusanalyse beskrevet i US patentskrift nr. 4 695 623), vil vektmengden av protein (i mg) ved enhver bestemt dose være forskjellig for "Intron" A og IFN-coni. Doseopptrappingsskjemaet som er brukt, er vist nedenunder i tabell 1. Dosen i mg protein som tilsvarer hvert dosenivå i internasjonale enheter, er også vist i tabell 1 for hvert interferon.

Pasienter i hver av de tre behandlingsgruppene vist ovenfor, fikk administrert IFN-coni eller "Intron" A idet man startet på dosenivå 1 daglig i én uke før opptrapping til det neste, høyere dosenivå. Doseopptrapping skjedde på dagene 8, 15, 22, 29, 36, 43, 50 og 57. Opptrappingen fortsatte inntil hver pasient fikk en MTD eller den maksimale, daglige dose på 30 x IO<6> IU interferon var oppnådd. MTD for en individuell pasient ble definert som dosenivået under det hvor dosebegrensende toksisitet inntrer. Toksisitet ble gradert på en skala fra 0 (ingen toksisitet) til 4 (akutt toksisitet) under anvendelse av kriterier fastlagt av Verdens Helseorganisasjon og nærmere beskrevet i Miller et al. (Cancer 47, 210-211 (1981)). Dosebegrensende toksisitet ble definert som en ugunstig hen-delse av tredje eller fjerde grad bedømt til å være minst mulig relatert til interferon. Feber og frysninger som varte mindre enn 24 timer, svimmelhet, hodepine eller andre grads eller lavere toksisitet ble ikke brukt for å definere MTD med mindre de ble bestemt å være ikke tolererbare for den enkelte pasient.

Ved fullførelsen av opptrappingsfasen ble pasienter fortsatt holdt på opprettholdelsesterapi bestående av daglig dosering på enten pasientens MTD eller på den maksimale dose på 30 x 10<6> IU dersom det ble oppnådd. Opprettholdelsesterapi ble fortsatt inntil sykdomsprogresjon eller andre kriterier berettiget fjerning av pasienten fra undersøkelsen.

Under opprettholdelsesterapi ble det tillatt to dosereduksjoner som et resultat av toksisitet. Etter to dosereduksjoner ble det ikke tillatt noen ytterligere interferon-doseringsmodifikasjoner, og pasienter som krevde ytterligere reduksjoner, ble fjernet fra programmet. Et unntak fra denne fremgangsmåten var når den dosebegrensende toksisitet var neutropeni (ANC < 1.000/mm<3> på to dager av den omtrent én uke lange periode). I dette tilfellet fikk pasienten forbli i undersøkelsen uten ytterligere reduksjon i interferondose, men r-metGCSF-terapi ble startet opp med 1 ug/kg kroppsvekt pr. dag administrert subkutant til pasienter som ikke fikk r-metGCSF. For pasienter som allerede var i r-metGCSF-behand-lingsgruppen, ble dosen av administrert r-metGCSF trappet opp til det neste, høyere trinn (en økning på 1 ug/kg/dag).

C. Pasientutvelgelse

I alt 49 pasienter er blitt tatt med i undersøkelsen. Et individ tas med i undersøkelsen bare etter å ha imøtekommet alle innlemmelses- og utelukkelseskriterier. De signifikante kriteriene for innlemmelse er serologisk dokumentert HIV-infeksjon, histopatologisk bekreftet Kaposis sarkom med mål-bar(e), kutanøs(e) eller oral(e) lesjon(er), akseptabel immun-funksjon (målt ved hjelp av CD4-lymfocyttnivåer) og under AZT-behandling i mindre enn ett år.

Blant grunnene for fjerning av en pasient fra under-søkelsen er en andre forekomst av tredjegrads eller høyere toksisitet under doseopptrappingsfasen, en tredje inntreden av dosebegrensende toksisitet etter at den enkelte pasients MTD er blitt bestemt og pasienten er på opprettholdelsesterapi, eller en progresjon i KS.

D. Bestemmelse av MTD- er for IFN- coni og " Intron" A

Ved å bruke doseopptrappingsskjemaet beskrevet ovenfor for ukene 1-9 av undersøkelsen, etterfulgt av opprettholdelsesterapi og dosereduksjon etter behov, ble den første og den nåværende middel-MTD for "Intron" A og IFN-Coni for de tre behandlingsgruppene bestemt og er vist i figur 8. Hver gruppe består av 15 pasienter. Gruppe I ("Intron" A og AZT) fikk en første MTD under doseoppt rapp ing på 9 x IO<6> IU og en løpende MTD på 6 x IO<6> IU; gruppe 2 (IFN-coni og AZT) fikk første og en løpende MTD på 15 x IO<6> IU; og gruppe 3 (IFN-coni, r-metGCSF og AZT) fikk første og løpende MTD-er på henholdsvis 24 x IO<6> IU og 21 x IO<6> IU.

E. Evaluering av sikkerhet ved " Intron" A- og IFN- Coni-behandling

Sikkerheten ved "Intron" A- og IFN-Con!-behandling ble bestemt ved alvorligheten av ugunstige effekter som krevde interferondosereduksjon. Resultatene er oppsummert i tabell 2.

Etter at undersøkelsen ble startet opp, er ingen pasienter blitt fjernet fra den som et resultat av toksisitet som klart skriver seg fra administreringen av "Intron" A eller IFN-Coni.

F. Bestemmelse av virkningsfullhet av IFN- conx- og " Intron" A-behandling

Antitumorrespons. Antitumorresponser ble fastslått etter fire måneders behandling under anvendelse av standard-responskriteriene til AIDS Clinical Trials Group (ACTG) Oncology Committee (Krown et al., J. Clin. Oncol. 7, 1201-1207

(1989)) .

Immunfunksjoner. CD4-lymfocytt-tellinger ble gjort hver måned i seks måneder under undersøkelsen for å evaluere pasienters immunrespons på HIV-infeksjon.

I alle tre behandlingsgruppene var lesjonsresponsene på Kaposis sarkom og CD4-lymfocyttnivåene ekvivalente.

Eksempel 3

Sikkerhet, toleranse og virkningsfullhet av IFN- coni administrert til pasienter med hepatitt C ( HCV)

Forbedret dosetolererbarhet. Behandling med interferoner av type 1 forårsaker flere bivirkninger som kan be-grense de absolutte dosene som pasientene kan gis for behandling av en bestemt sykdom. Disse bivirkningene omfatter: influensalignende symptomer, diaré, myelosuppresjon, forhøyede leverfunksjonstester og mental statusendringer. Disse toksisi-tetene bedømmes i henhold til skalaen til WHO (Verdens Helseorganisasjon) som: grad I (mild), grad II (middels), grad III (alvorlig) og grad IV (livstruende). Toksisiteter fra behandling av interferon type 1 kan variere fra grad I til grad IV. Enhver toksisitet i løpet av behandling med interferon av type 1 som ble bedømt til å være ikke-tolererbar av pasienten eller legen, vil resultere i en dosereduksjon eller modifikasjon av doseringsplan. Disse dosemodifikasjonene kan føre til under-optimale behandlingsregimer som resulterer i mindre enn optimal virkningsfullhet. Konsensusinterferon muliggjør oppnåelse av og opprettholdelse av optimal dosering over hele behand-lingsforløpet uten ledsagende, dosebegrensende toksisitet av noen grad.

Et klinisk forsøk under anvendelse av konsensusinterferon for å behandle kronisk hepatitt C-infeksjon ble startet opp for å undersøke effektene av flere doser av legemidlet. Pasientdata fra konsensusinterferonbehandlede pasienter ble sammenlignet med data fra pasienter med lignende sykdom og demografiske kjennetegn, behandlet med enten Interferon-alfa 2a ("Roferon") eller Interferon-alfa 2b ("Intron" A) av én og samme person.

Utforming av undersøkelsen. Undersøkelsen omfattet minst 30 pasienter smittet med HCV, som oppviste forhøyede

(med minst 1,5 ganger den øvre grense for det normale) nivåer av alanintransferase (ALT: et leverenzym); den øvre grense for det normale i denne undersøkelsen er 35 millienheter pr. milliliter (35 mu/ml). I tillegg ble virkningsfullhet av IFN-conx evaluert ved å måle antivirusaktivitet via PCR-analyse og ved å måle ALT-verdier under behandlingsforløpet. Endelig ble historiske data fra HCV kliniske undersøkelser av andre rekom-binante alfa-interferoner, særlig rekombinant interferon-alfa-2a ("Roferon") og alfa-2b ("Intron" A) sammenlignet med data som skrev seg fra denne undersøkelsen, med hensyn på sikkerhet og endringer i ALT-verdier.

Egnede pasienter ble tatt med i én av IFN-coni-dose-gruppene oppsummert i tabell 3.

Dosegrupper ble oppført sekvensvis med to-ukers intervaller mellom gruppene. Nærmere bestemt ble fem pasienter tatt med i den første gruppen og ble evaluert i en to-ukers sikkerhetsperiode dersom det ikke ble observert noen toksisitet av grad III eller høyere som kunne tilskrives IFN-coni, fem pasienter ble tatt med i den neste gruppen (6 MU). Dersom det imidlertid ble observert at en pasient hadde toksisitet av grad III eller høyere som kunne tilskrives IFN-coni, ble det tatt med tre ytterligere pasienter i den første gruppen, og det ble evaluert i to uker. Dersom det ikke ble observert noen ytterligere toksisitet av grad III eller høyere som kunne tilskrives IFN-coni, ble pasienter så tatt med i den neste gruppe (6 MU), men dersom det ble observert en toksisitet av grad III eller høyere som kunne tilskrives IFN-coni, ble pasienter ikke tatt med i den neste gruppe med høyere dose {6 MU). Opptrapping til gruppene med 9, 12, 15, 18 og 24 MU fortsatte i henhold til de samme reglene som er skissert ovenfor. I tillegg ble, dersom to eller flere pasienter opplevde toksisitet av grad III eller høyere som kunne tilskrives IFN-coni, ved hvilket som helst dosenivå, ingen ytterligere pasienter tatt med i den gruppen, og pasienter som allerede var på undersøk-else sbehandl ing i den gruppen eller på et høyere dosenivå, fikk redusert dose til dosenivået under det hvor to eller flere toksisiteter av grad III eller høyere inntrådte. Det kan imidlertid tas med ytterligere pasienter (opptil i alt 10 ytterligere) på dosenivået under det hvor to eller flere toksisiteter av grad III eller høyere inntrådte.

Dersom en pasient i hvilken som helst av gruppene opplevde en toksisitet av grad III som kunne tilskrives IFN-coni under eller etter to-ukers startevalueringen, ble IFN-coni opprettholdt inntil toksisiteten avtok til grad II eller mindre. Behandling ble så gjenopptatt på det neste, lavere dosenivå. Dersom pasienten fikk dosen på 3 MU på tidspunktet for toksisitet av grad III, ble behandling gjenopptatt ved 2 MU. Dersom noen pasient opplevde en toksisitet av grad IV som kunne tilskrives IFN-coni, ble pasienten fjernet fra un-dersøkelsen. Pasienter fikk gjennomgå tre dosereduksjoner under forløpet av undersøkelsesbehandlingen (men ikke dosereduse-ring under et dosenivå på 2 MU). Enhver pasient som krevde en fjerde dosereduksjon for toksisitet, ville bli fjernet fra undersøkeIsesbehandlingen. Feber og frysninger som varte i mer enn 24 timer, svimmelhet, hodepine eller toksisitet av grad II eller mindre, ble ikke betraktet som dosebegrensende toksisiteter med mindre de ble bestemt å være ikke-tolererbare for den enkelte pasient. Legemidlet ble administrert hjemme av enten pasienten eller en tredjepart (etter vellykket fullfør-else av opplæring).

Pasienter ble evaluert etter tre måneder med hensyn på respons basert på ALT-nivåendringer.

Resultater:

Pasienter ble tatt med og ført opp i gruppene beskrevet ovenfor. Ingen dosebegrensende toksisiteter ble observert hos noen pasienter under de første to ukene for dosegrup-pene med henholdsvis 3, 6, 9 og 12 MU. Én dosebegrensende toksisitet ble observert hos én pasient som fikk 15 MU i løpet av de første to ukene med dosering. Den observerte toksisitet var grad II ikke-tolererbare "influensalignende" symptomer. Pasienten ble doseredusert til 12 MU.

Dosebegrensende toksisiteter for 12-ukers behand-lingsperioden for hver av gruppene, og de historiske IFN-alfa 2-pasientene var som følger:

Som illustrert ved hjelp av tabellen ovenfor, opplevde pasienter som fikk IFN-con! ved doser mellom 3 og 15 MU tre ganger ukentlig, færre dosebegrensende toksisiteter enn pasienter som fikk IFN-alfa 2. Ettersom IFN-alfa 2 bare er godkjent opp til 3 MU for denne indikasjon, var det ikke mulig å gjøre en klinisk sammenligning ved høyere dosenivåer for IFN-alfa 2. Det forventes imidlertid at antallet av DLT-er ville være vesentlig høyere for IFN-alfa 2 ved høyere dosenivåer .

Som illustrert ved hjelp av tabellen ovenfor, hadde pasienter som fikk IFN-con! ved doser mellom 3 og 15 MU tre ganger ukentlig, ALT-responsgrader som var minst like gode som de som ble observert med 3 MU av IFN-alfa 2.

Det som fremgår ovenfor, viser at behandling med IFN-coni resulterer i en gunstig virkningsgrad med større legemid-deltolererbarhet sammenlignet med behandling med IFN-alfa 2.

Ettersom foreliggende oppfinnelse er blitt beskrevet ved hjelp av foretrukne utførelsesformer, vil det forstås at variasjoner og modifikasjoner vil oppstå for fagfolk innen teknikken. Det er derfor ment at kravene skal dekke alle slike ekvivalentvariasjoner som faller innenfor omfanget av oppfinnelsen slik den er krevet.

Claims (18)

1. Anvendelse av en terapeutisk effektiv mengde av et konsensushumanleukocyttinterferon ved fremstillingen av et medikament for behandling av en pasient som har en virussykdom, mens én eller flere bivirkninger forbundet med alfa-interferonadministrering reduseres eller elimineres, hvor virussykdommen er hepatitt A, hepatitt B, hepatitt C eller hepatitt Delta.

2 . Anvendelse av en terapeutisk effektiv mengde av et konsensushumanleukocyttinterferon ved fremstillingen av et medikament for behandling av en pasient som har Kaposis sarkom, mens én eller flere bivirkninger forbundet med alfa-interferonadministrering reduseres eller elimineres, som omfatter administrering av en terapeutisk effektiv mengde av et konsensushumanleukocyttinterferon til pasienten.

3. Anvendelse ifølge krav 1 eller 2, hvor bivirkningen er valgt fra gruppen bestående av hodepine, feber, feberfrysninger, kvalme, anoreksi, depresjon og søvnløshet.

4. Anvendelse ifølge hvilket som helst av kravene 1-3, hvor konsensushumanleukocyttinterferonet er valgt fra gruppen bestående av IFN-coni, IFN-con2 og IFN-con3.

5. Anvendelse ifølge krav 4, hvor konsensushumanleuko-cyttinterf eronet er IFN-coni.

6. Anvendelse ifølge hvilket som helst av kravene 1-5, hvor konsensushumanleukocyttinterferonet er et produkt av pro-karyotisk ekspresjon av en eksogen DNA-sekvens.

7. Anvendelse ifølge hvilket som helst av kravene 1-6, hvor den terapeutisk effektive mengde er formulert for oral, intravenøs, intramuskulær, subkutan, intranasal eller intralesjonal administrering av en terapeutisk effektiv mengde av interferonet.

8. Anvendelse ifølge krav 7, hvor den terapeutisk effektive mengde av konsensushumanleukocyttinterferon er fra 2 x IO<6> til 30 x 10<6> enheter pr. pasient.

9. Anvendelse ifølge krav l eller 2, hvor den terapeutisk effektive mengde av konsensushumanleukocyttinterferon er fra

6 x IO<6> til 15 x IO<6> enheter pr. pasient.

10. Anvendelse ifølge hvilket som helst av kravene 1-9, hvor medikamentet er formulert for administrering til en humanpasient.

11. Anvendelse ifølge hvilket som helst av kravene 1-10, hvor medikamentet videre omfatter en terapeutisk effektiv mengde av et kjemoterapeutisk middel.

12. Anvendelse ifølge krav 11, hvor det kjemoterapeutiske middel er G-CSF.

13. Anvendelse ifølge krav 11, hvor det kjemoterapeutiske middel er erytropoietin.

14. Anvendelse ifølge krav 13, hvor det kjemoterapeutiske middel er en kombinasjon av G-CSF og erytropoietin.

15. Anvendelse av en terapeutisk effektiv mengde av interferon i kombinasjon med ett eller flere kjemoterapeutiske midler ved fremstillingen av et medikament for behandling av en pasient som har en virussykdom, mens én eller flere bivirkninger forbundet med administrering av alfa-interferon alene reduseres eller elimineres, hvor virussykdommen er hepatitt A, hepatitt B, hepatitt C eller hepatitt Delta.

16. Anvendelse ifølge krav 15, hvor det kjemoterapeutiske middel er G-CSF.

17. Anvendelse ifølge krav 15, hvor det kjemoterapeutiske middel er erytropoietin.

18. Anvendelse ifølge krav 15, hvor de kjemoterapeutiske midlene er G-CSF og erytropoietin.