NO318441B1

NO318441B1 - Benzamider og preparater som inbefatter slike for behandling av neurodegenerative forstyrrelser

Info

Publication number: NO318441B1
Application number: NO19974569A
Authority: NO
Inventors: William David Flitter; William A Garland; Allan L Wilcox; Richard E Paylor
Original assignee: Renovis Inc
Priority date: 1995-04-03
Filing date: 1997-10-02
Publication date: 2005-03-21
Also published as: CZ309897A3; BG63384B1; AU721045B2; HRP960156A2; PL184121B1; CZ295852B6; KR100429120B1; AR002978A1; KR19980703562A; EP0819113B1; ES2160240T3; JPH11501319A; IL117629A0; YU21096A; DE69613567D1; SI0819113T1; EP0819113A1; NZ306204A; AU5440496A; HK1016964A1

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører benzamidforbindelser, farmasøytiske preparater inneholdende disse forbindelsene, og deres og anvendelse til fremstilling av medikamenter for behandling av neurodegenerative tilstander.

Neurodegenerativ sykdom omfatter en rekke alvorlige svekkende tilstander inkludert Parkinsons sykdom, amyotrofisk lateral sklerose (ALS, "Lou Gehrigs sykdom"),

multipel sklerose, Huntingtons sykdom, Alzheimers sykdom, diabetisk retinopati, multiinfarkt demente, makuløs degenerasjon og lignende. Disse tilstandene er kjennetegnet ved en gradvis, men nådeløs forverring av pasientens tilstand over tid. Mekanismene som forårsaker disse sykdommene blir stadig bedre forstått og det har blitt foreslått en rekke forskjellige behandlinger. En av disse neurodegenerative tilstandene, Parkinsons sykdom, er forbundet med abnormal dopaminutarming i spesielle områder i hjernen.

Senere oversikter over situasjonen når det gjelder forståelse av Parkinsons sykdom er

gitt av Marsden, CD. i "Review Article - Parkinsons Disease", Lancet (21 april 1990) 948-952 og Calne D.B. i 'Treatment of Parkinson's Disease" NEJM (30 september 1993) 329:1021-1027. Som påpekt i disse oversiktene identifiseres dopaminmangel som et karakteristisk nøkkeltrekk ved Parkinsons sykdom og ødeleggelsen av den dopami-nergiske nigrostriatale bane sammenlignes med dopaminutarming hos Parkinsons pasienter.

Hurtig utvikling av Parkinsons lignende symptomer i en liten populasjon av brukere av ulovlige legemidler i San Jose, California-området ble knyttet til spormengder av en toksisk urenhet i hjemmesyntetiserte legemidler. Etterfølgende studier i dyremodeller, inkludert aper, viste at l-metyl-4-fenyl-l,2,5)6-tetrahydropyridin (MPTP) var årsaken til de Parkinsonslignende symptomene som utviklet seg hos brukere av ulovlige legemidler, som rapportert av J.W. Langston et al i "Chronic Parkinsonsim in Humans Due to a Product of Meperidine-Analog Synthesis", Science (25 februar 1983) 219,979-980. Disse tidlige funn og de mange studiene som de stimulerte ledet til utviklingen av pålitelige modeller for Parkinsons sykdom, som rapporert av Heikkila, R.E. et al i "Dopaminergic Neurotoxicity of l-Metyl-4-Phenyl-1,2,5,6-Tetrahydropyridine in Mice" Science (29 juni 1984) 224: 1451-1453; Burns, R.S. et al i "A Primate Model of Parkinsonism..." Proe. Nati. Acad. Sei USA (1983) 80:4546-4550; Singer, T.P. et al "Biochemical Events in the Development of Parkinsnism..." J. Neurochem. (1987) 1-8; og Gerlach, M. et al, "MPTP Mechanisms of Neurotoxicity and the Implications for Parkinson's Disease" European Journal of Pharmacology (1991) 208:273-286. Disse referansene og andre beskriver studier for å hjelpe å forklare mekanismen for hvordan administrasjonen av MPTP til dyr gir opphav til motoriske defekter som er karakte-ristiske for Parkinsons sykom. De angir klart at MPTP var årsaken til de Parkinsonslignende symptomene som utviklet seg i mennesker som hadde brukt de bedervede ulovlige legemidlene og at motoriske mangler ble funnet hos andre primater og andre testdyr som direkte hadde fått en dose av MPTP. De påpeker videre at administrasjonen av MPTP induserer en markert reduksjon i konsentrasjonen av dopamin hos test-indi videne.

Disse funn har ledet til utviklingen av en analyse for midler som er effektive i behandlingen av dopamin-forbundete neurodegenerative forstyrrelser, slik som Parkinsons sykdom. I denne analysen gis testdyr en mengde av MPTP som er tilstrekkelig til å gi sterk senking av deres dopaminnivåer. Testforbindelser administreres for å bestemme om de er i stand til å forhindre tap av dopamin i testdyrene. I den grad at dopaminnivåer bibeholdes kan en forbindelse anses som et effektivt middel for hemming eller for-sinkelse av forløpet for neurodegenerativ sykdom, f.eks Parkinsons sykdom.

Det har blitt utviklet en annen ananlyse for midler som er effektive med hensyn til behandling av dopamin-tilknyttede neurodegenerative sykdommer. I denne analysen blir striatum hos testdyr injisert med det neurotoksiske midlet 6-hydroksydopamin. 6-hydroksydopamin har en dopamin-utarmende virkning og er utbredt akseptert som en modell for disse tilstandene. Testforbindelser administreres for å bestemme om de er i stand til å hindre eller redusere tapet av dopamin i testdyrene. i den grad dopaminnivåer bibeholdes kan også her en forbindelse anses for å være et effektivt middel.

Mitokondrien funksjon er forbundet med mange neurodegenerative sykdommer slik som ALS, Huntingtons sykdom, Alzheimers sykdom, cerebellar degenerasjon, og aldring i seg selv (Beal, M.F. i Mitochondrial Dysfunction and Oxidative Damage in Neurodegerative Diseases, R.G. Landes Publications, Austin, TX, 1995 ved f.eks sider 53-61 og 73-99). Mitokondrien skade er den mekanisme ved hvilken MPTP reduserer dopaminkonsentrasjoner i striatum (Mizuno, Y., Mori, H., Kondo, T. i "Potential of Neuroprotective Therapy in Parkinsons Disease" CNS Drugs (1994) 1:45-46). Et middel som beskytter overfor mitokondrien dysfunksjon forårsaket av MPTP kunne således være nyttig i behandlingen av sykdommer i sentralnervesystemet hvor den underliggende årsak er mitokondrien dysfunksjon.

Det er også tilgjengelig modeller for bestemmelse av effektiviteten til materialer i behandlingen av andre neurodegenerative tilstander. For eksempel kan effektiviteten til forbindelser mot Alzheimers sykdom bestemmes i cellekulturtester. I to slike tester evalueres forbindelser med henblikk på deres evne til å beskytte overfor det amyloid fi (25-35)- eller glutamatinduserte neuronale celletap i hippokampale neuronal/astrocytt-embryokulturer fra rotte. I en annen test evalueres forbindelser med henblikk på deres evne til å gripe inn i amyloid B (1-40) beta-foldet arkdannelse. Forbindelser som har denne effekten kan anses som kandidater for behandling av Alzheimers sykdom.

Mens det er kjent andre benzamidforbindelser, så har deres nytte hittil generelt vært som mellomprodukter i kjemiske synteser eller på områder som ikke er relatert til foreliggende oppfinnelse. Små strukturelle endringer ga store forskjeller i effektivitet og toksisitet. De langt fleste av benzamidforbindelser har liten eller ingen aktivitet i under-søkelser foretatt i foreliggende sammenheng. Det finnes imidlertid rapporter om bio-logisk aktivitet for andre strukturelt forskjellige benzamider. Disse rapportene inkluderer: El Tayar et al, "Interaction of neuroleptic drugs with rat striatal D-l and D-2 dopamine receptors; a quantitative structure - affinity relationship study" Eur. J. Med. Chem.

(1988) 23:173-182;

Monkovic et al, "Potential non-dopaminergic gastrointestinal prokinetic agents in the series of substituted benzamides" Eur. J. Med. Chem. (1989) 24:233-240;

Banasik et al, "Specific inhibitors of poly(ADP-Ribose) synthetase and mono(ADP-ribosyl)transferase" J. Biol. Chem. (1992) 267:1569-1575;

Bishop et al, "Synthesis and in vitro evaluation of 2,3-dimetoxy-5-(fluoralkyl)-substituted benzamides: high-affinity ligands for CNS dopamine D2 receptors" J. Med. Chem. (1991) 34: 1612-1624;

Hogberg et al, "Potential antipsychotic agents, 9. Synthesis and stereoselective dopamine D-2 receptor blockade of a potent class of substituted (R)-N-[benzyl-2-pyrrolidinyl)methyl]benzamides. Relations to other side chain congeners" J. Med. Chem. (1991 34:948-955;

Katopodis et al, "Novel substrates and inhibitors of peptidylglycine a-amidating monooxygenase" Biochemistry (1990) 29:4541-4548; og

Rainnie et al, "Adenosine inhibition of mesopontine cholinergjc neurons: implications for EEG arousal" Science (1994) 263:689-690.

Andre benzamidholdige farmasøytiske preparater og deres anvendelse for behandling eller beskyttelse overfor neurodegerative tilstander er beskrevet i US patent 5.472.983.

Det er nå funnet benzamidbaserte farmasøytiske preparater som har aktivitet overfor neurodegenerative sykdommer. Disse preparatene inkluderer en benzamidforbindelse av formel I som aktiv bestanddel i en farmasøytisk akseptabel bærer.

I formel I er hvor R' en mettet alkyl med 3-5 karbonatomer, hver R er uavhengig -NO2 eller -NH2, eller NH-CO-CH3, og n er 1 eller 2, forutsatt at: 1) når n er 1 og R er -N02 ved 4-stillingen i ringen så er R' ikke tert-butyl, iso-butyl eller propyl; 2) når n er 1 og R er -NO2 ved 2-stillingen i ringen så er R' ikke iso-butyl eller propyl; og 3) når n er 2 og R' er tert-butyl og begge R-grupper er -NO2 så er R-gruppene ikke ved 3- og 5-stillingene i ringen. Bæreren er fortrinnsvis en oral bærer, men kan også være en injiserbar bærer. Disse farmasøytiske preparatene kan være i bulkform, men presenteres mer typisk i enhetdoseringsform.

I en foretrukket utførelse inkluderer de farmasøytiske preparatene en eller flere acetamidobenzamidforbindelser av formel II som aktiv bestanddel. Disse preparatene utviser aktivitet mot Parkinsons sykdom målt ved deres evne til å hindre MPTP-indusert og 6-hydroksydopaminindusert reduksjon av dopaminnivåer.

I formel U er R' rett, forgrenet eller cyklisk mettet alkyl med fra 3 til 5 karbonatomer og n er 1 eller 2.

Noen av benzamidforbindelsene som er benyttet i disse preparatene er kjente forbindelser mens andre er nye. Disse nye forbindelsene samt noen ytterligere nye nitrobenzamider og aminobenzamider som er nyttige som kjemiske mellomprodukter i fremstillingen av de aktive materialene utgjør ytterligere aspekter ved foreliggende oppfinnelse.

De acetamidobenzamider av formel II hvor R' er rett, forgrenet eller cyklisk mettet alkyl med 3-5 karbonatomer og n er 1 eller 2, men under den forutsetning at når n er 1 og R' er enten n-butyl eller n-propyl så er acetamidogruppen ikke ved 2-stillingen i ringen, når n er 1 så er acetamidogruppen ikke ved 3-stillingen i ringen, og når n er 2 så er aceatamidogruppene ikke i 3- og 5-stillingene i ringen, som forbindelser, utgjør et aspekt ved foreliggende oppfinnelse.

Følgende nitro- og aminobenzamider utgjør, som forbindelser, et annet aspekt ved foreliggende oppfinnelse: N-tert-amyl-4-nitrobenzamid (CPI1033), N-l,2-dimetyl-propyl-4-nitrobenzamid (CPI1085), N-n-butyl-3-nitrobenzamid (CPU 135), N-n-pentyl-4-nitrobenzamid (CPU 140), N-2-metylbutyl-4-nitrobenzamid (CPU 146), N-n-butyl-3,5-dinitrobenzamid (CPU 147), N-metylcyklopropyl-4-nitrobenzamid (CPI1164), N-n-butyl-2-nitrobenzamid (CPU 173), N-n-pentyl-2-nitrobenzamid (CPU 174) og N-metyl-cykIopropyl-4-aminobenzamid (CPU240). ("CPI..." -numrene etter disse forbindelses-navnene og som benyttet i det nedenstående er interne identifikasjonsnummere. De er benyttet i foreliggende sammenheng for å forenkle datapresentasjonen i eksemplene).

Ifølge et annet aspekt tilveiebringer foreliggende oppfinnelse anvendelse av et farmasøytisk preparat eller forbindelse ifølge foreliggende oppfinnelse for fremstilling av et medikament for behandling av en neurodegenerativ tilstand og spesielt en dopamin-forbundet neurodegenerativ tilstand.

Ifølge et annet aspekt ifølge foreliggende oppfinnelse kan den neurodegenerative tilstanden være kjennetegnet ved progressivt tap av sentralnervesystemfunksjon.

Ifølge et særdeles viktig aspekt ved foreliggende oppfinnelse kan det progressive tap av sentralnervesystemfunksjon være forbundet med Parkinsons sykdom.

Ifølge et annet aspekt ved foreliggende oppfinnelse kan den neurodegenerative tilstanden være kjennetegnet ved progressivt tap av nervesystemfunksjon på grunn av mitokondrien dysfunksjon.

Fremgangsmåtene for fremstilling av forbindelsene med formel I og II innebærer generelt kondensasjon av et alkylamin som har 3-5 karbonatomer, med et mono- eller dinitrobenzoylhalogenid som har nitrokonfigurasjonen tilsvarende den nitro-, amin-eller acetamidsubstitusjon som er ønsket i sluttforbindelsen, eventuelt redusering av nitrogruppene, og eventuelt omdannelse av aminobenzamidene til acetamidobenzamider ved omsetning med et acetylhalogenid.

Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen.

Benzamidene

Foreliggende oppfinnelse benytter visse acetamidobenzamider, aminobenzamider og nitrobenzamider som aktive farmasøytiske midler. Acetamidobenzamidene beskrives ved formel I når R er en acetamidogruppe og ved formel II. I disse formlene er R' en mettet alkyl med 3-5 karbonatomer og n er 1 eller 2.

Acetamidogruppen (eller -gruppene) kan befinne seg hvor som helst på ringen. Foretrukne utførelser inkluderer når n er 1 og acetamidogruppen er ved 2-, 3- eller 4-stillingen i ringen og når n er 2 og acetamidogruppene er ved 2-, 3-, 2- og 4-, 2- og 5-, 2-og 6-, 3- og 4-, eller 3- og 5-stillingene i ringen.

Med hensyn til alkylsubstituentene, R', så foretrekkes forbindelser hvor R' er en alkyl som ikke har et hydrogen på alfa-karbonet, dvs det karbon som er bundet til nitrogenet i ringen. Eksempler p disse foretrukne R'-gruppene er tert-butyl og tert-amyl.

Acetamidobenzamider av formel I av spesiell interesse er: N-tert-butyl-4-acetamidobenzamid (CPU 189),

N-iso-propyl-4-acetamidobenzamid (CPI1232),

N-tert-amyl-4-acetamidobenzamid (CPU 233),

N-tert-butyl-3-acetamidobenzamid (CPI1234), og

N-metylcyklopropyl-4-acetamidobenzamid (CPU 241).

N-tert-butyl-4-acetamidobenzamid (CPU 189) er det mest foretrukne acetamidobenz-amidet.

Det er tallrike nye forbindelser i denne familien av acetamidobenzamider. Mer spesielt er disse acetamidobenzamidene av formel I (når R er acetamido) og formel U når n er 1 eller 2 og R' er en mettet alkyl med 3-5 karbonatomer forutsatt at når n er 1 og R' er enten n-butyl eller n-propyl så er acetamidogruppen ikke ved 2-stillingen i ringen, når n er 1 så er acetamidogruppen ikke ved 3-stillingen i ringen, og når n er 2 så er acetamidogruppen ikke ved 3- og 5-stillingene i ringen. De fem acetamidobenzamidene som er spesielt angitt som foretrukne aktive midler er foretrukne nye forbindelser, idet CPU 189 er den mest foretrukne.

Aminobenzamidene og nitrobenzamidene som anvendes som aktive midler er beskrevet ved formel I når R er en amino- eller nitrogruppe. I disse formlene er R' en mettet alkyl med 3-5 karbonatomer og n er 1 eller 2 innbefattende de samme forutsetninger for substituenter og deres stillinger som er angitt ved henvisning til acetamidobenzamidene og ytterligere forutsatt at 1) når n er 1 og R er er -NO2 ved 4-stillingen i ringen så er R' ikke tert-butyl, iso-butyl eller propyl; 2) når n er 1 og R er -NO2 ved 2-stillingen i ringen så er R' ikke iso-butyl eller propyl; og 3) når n er 2 og R' er tert-butyl og begge R-grupper er -NO2 så er R-gruppene ikke ved 3- og 4-stillingene i ringen.

Aminobenzamider og nitrobenzamider av formel I av spesiell intersse som aktive midler er:

N-iso-propyl-4-nitrobenzamid (CPU 026),

N-tert-butyl-3-nitrobenzamid(CPI1034),

N-tert-butyl-2-nitrobenzamid (CPU 035),

N-n-butyl-4-nitrobenzamid (CPI1045),

N-n-propyl-4-nitrobenzamid (CPI1047),

N-tert-butyl-3,5-dinitrobenzamid (CPI1049)

N-l -metylpropyl-4-nitrobenzamid (CPU 084),

N-tert-butyl-4-aminobenzamid (CPU 160) og

N-tert-butyl-3-aminobenzamid (CPU 248).

Det finnes nye forbindelser i denne familien av aminobenzamider og nitrobenzamider og det finnes ytterligere nye forbindelser som tjener som mellomprodukter for disse materialene og de ovenfor beskrevne acetamidobenzamidene. Mer spesielt er disse nye aminobenzamidene og nitrobenzamidene:

N-tert-amyl-4-nitrobenzamid (CPU 033),

N-1,2-dimetylpropyl-4-nitrobenzamid (CPI1085),

N-n-butyl-3-nitrobenzamid (CPU 135),

N-n-pentyl-4-nitrobenzamid (CPU 140),

N-2-metylbutyl-4-nitrobenzamid (CPI 1146),

N-n-butyl-3,5-dinitrobenzamid (CPU 147),

N-metylcyklopropyl-4-nitrobenzamid (CPU 164),

N-n-butyl-2-nitrobenzamid (CPU 173),

N-n-pentyl-2-nitrobenzamid (CPU 174) og

N-metylcyklopropyl-4-aminobenzamid (CPI 1240).

Når benzamidforbindelsen inneholder en aminogruppe slik som tilfellet er med CPI1240, så kan aminfunksjonaliteten være tilstede som sådan eller som et salt. I saltformen er aminogruppen protonert til kationformen i kombinasjon med et farmasøytisk akseptabelt anion, slik som klorid, bromid, iodid, hydroksyl, nitrat, sulfonat, metansulfonat, acetat, tartrat oksalat, suksinat eller palmoat. Når disse aminobenzamidene er referert til så skal det forstås at disse saltene også er innbefattet.

Ovennevnte US patent 5.472.983 beskriver flere benzamider som er nyttige i behandling av neurodegenerative sykdommer basert på deres beskyttende virkning i MPTP-muse-modellen av Parkinsons sykdom. Forbindelsen N-tert-butyl-4-acetamidobenzamid (CPU 189) ifølge foreliggende oppfinnelse er et in vivo-bioomdannelsesprodukt av ett av disse benzamidene (N-tert-butyl-4-nirrobenzamid (CPU 020) som har blitt funnet i blodet hos rotter og mus til hvilke CPU 020 har blitt administrert oralt. Denne forbindelsen dannes sannsynligvis i kroppen ved reduksjon av ringnitrogruppen i CPU 020 til en aminogruppe (CPU 160) fulgt av acetylering av aminofunksjonen.

Foreliggende forbindelser, som eksemplifisert ved CPU 189, er mye mer potente enn CPU 020 (omkring 10 ganger så potente) når det gjelder beskyttelse av mus overfor dopaminreduksjon i striatum indusert ved s.c. behandling med MPTP. Basert på strukturelt lignende molekyler slik som acetaminofen som inneholder en acetamido-funksjonalitet, så skulle de også være sikrere enn CPI1020 fordi de ikke vil bli metabolisert i kroppen og resultere i metabolitter inneholdende hydroksylaminer (som sannsynligvis er Ames positive) og heller ikke er det sannsynlig at de vil resultere i aminometabolitter som kan ha kardiovaskulære og/eller anorexiske effekter.

Farmasøytiske preparater

Benzamidforbindelsene med formler I og II angitt ovenfor, formuleres til farmasøytiske preparater egnet for oral administrasjon eller andre passende administrasjonsveier slik som parenteral administrasjon ved injeksjon eller intravenøs avlevering.

Farmasøytiske preparater som benytter forbindelsene N-tert-butyl-4-acetamidobenzamid (CPU 189), N-tert-butyl-3-acetamidobenzamid (CPI2134), N-tert-amyl-4-acetamidobenzamid (CPI1233), N-tert-butyl-4-aminobenzamid (CPU 160), N-tert-butyl-3-nitrobenzamid (CPU 034) og N-tert-butyl-3-aminobenzamid (CPU 248), er foretrukne, og preparater basert på CPI1189 er i øyeblikket de mest foretrukne.

Preparatene for oral administrasjon kan ha form av flytende bulkoppløsninger eller -suspensjoner, eller bulkpulvere. Mer vanlig presenteres imidlertid preparatene i enhetdoseringsform for å lette nøyaktig dosering. Typiske enhetdoseringsformer inkluderer på forhånd fylte, på forhånd tilmålte ampuller eller sprøyter med de flytende preparatene eller piller, tabletter, kapsler eller lignende i tilfelle for faste preparater. I slike preparater er benzamidforbindelsen vanligvis en mindre komponent (fra 0,1 til f.eks 50 vekt-% eller fortrinnsvis fra ca 1 til ca 40 vekt-%) i det resten er forskjellige vehikler eller bærere og prosesseringshjelpemidler som er nyttige for dannelse av den ønskede doseringsformen. En flytende form kan innbefatte en egnet vandig eller ikke-vandig vehikkel med buffere, suspensjons- og dispenseringsmidler, fargestoffer, smaksstoffer og lignende.

En fast form kan f.eks innbefatte hvilke som helst av følgende bestanddeler, eller forbindelser av en lignende beskaffenhet: et bindemiddel slik som mikrokrystallinsk cellulose, tragantgummi eller gelatin; en eksipient slik som stivelse eller laktose, et desintegreirngsmiddel slik som alginsyre, primogel, eller maisstivelse; et smøremiddel slik som magnesiumstearat; et glidemiddel slik som kolloidalt silisiumdioskyd; et søtningsstoff slik som sukrose eller sakkarin; et smaksstoff slik som peppermynte, metylsalicylat eller appelsinsmakstoff.

I tilfelle av injiserbare preparater så er de vanligvis basert på injiserbar steril saltopp-løsning eller fosfatbuffret saltoppløsning eller andre injiserbare bærere som er kjent innen teknikken. Også her er den aktive benzamidforbindelsen typisk en mindre komponent, ofte i en mengde fra ca 0,05 til 10 vekt-% hvor resten er den injiserbare bæreren og lignende. De flytende materialene kan være oppløsninger eller suspensjoner. Disse komponentene for oralt administrerbare eller injiserbare preparater er kun representative. Andre materialer samt prosesseringsteknikker og lignende er angitt i del 8 i Remington's Pharmaceutical Sciences, 17. utgave, 1985, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania.

Forbindelsene ifølge oppfinnelsen kan også administreres i former med langvarig frigjørings virkning eller fra legemiddelavleveringssystemer med langvarig frigivningsvirkning. En beskrivelse av representative materialer med langvarig frigivningsvirkning finnes i Remington's Pharmaceutical Sciences.

Behandlede tilstander og behandlingskurer

Tilstandene som behandles med de benzamidholdige farmasøytiske preparatene kan generelt klassifiseres som neurodegenerative tilstander. Disse inkluderer tilstander som er kjennetegnet ved langvarig "low grade" stress på sentralnervesystemet og gradvis progressivt tap av sentralnervesystemfunksjon. Disse tilstandene inkluderer Parkinsons sykdom, amyotrofisk lateral sklerose (ALS, "Lou Gehrig's sykdom"), multipel sklerose, Huntingtons sykdom, Alzheimers sykdom, diabetisk retinopati, multiinfarkt demente, makular degenerasjon og lignende. Hver av disse tilstandene er kjennetegnet ved et progressivt funksjonstap. De benzamidforbindelseholdige farmasøytiske preparatene ifølge oppfinnelsen kan, når de administreres oralt eller ved injeksjon slik som intravenøs injeksjon, nedsette og forsinke og muligens endog i en viss grad reversere funksjonstapet.

Injeksjonsdosenivåene for behandling av disse tilstandene varierer fra ca 0,1 mg/kg/time til minst 10 mg/kg/time, for alle i fra ca 1 til ca 120 timer og spesielt fra 24 til 96 timer. En forladningsbolus fra ca 0,1 mg/kg til ca 10 mg/kg eller mer kan også administreres for oppnåelse av tilstrekkelig stabile tilstandsnivåer. Den maksimale totale dosen for-ventes ikke å overskride ca 2 g/dag hos personer med en pasientvekt fra 40 til 80 kg.

Med disse neurodegenerative tilstandene strekker behandlingskuren seg vanligvis over mange måneder eller år slik at oral dosering er foretrukket for pasientenes bekvemmelighet og toleranse. Med oral dosering er fra 1 til 5 og spesielt fra 2 til 4 og typisk 3 orale doser pr dag representative kurer. Ved bruk av disse doseringsmønstrene gir hver dose fra ca 1 til ca 20 mg/kg benzamid, hvor foretrukne doser hver gir fra ca 1 til ca 10 mg/kg og spesielt fra ca 1 til ca 5 mg/kg.

Benzamidforbindelsen kan naturligvis administreres som det eneste aktive midlet eller den kan administreres i kombinasjon med andre midler, inkludert andre aktive benzamidforbindelser.

Fremgangsmåter for fremstilling av forbindelser

Foreliggende benzamidforbindelser kan fremstilles ved bruk av vanlig tilgjengelig utgangsmaterialer og lett gjennomførlige reaksjoner.

En representativ fremstillingsvei, som illustreres med tert-butylamin, men som kan anvendes med et hvilket som helst alkylamin, innebærer følgende reaksjoner: hvor X er halogen slik som I, Br eller Cl.

I trinn (A) dannes N-tert-butylnitrobenzamidene (Hl). Denne reaksjonen bør utføres ved temperaturer under 10°C.

Dette trinn (A) gir som benzamider (JU) de forbindelser ifølge oppfinnelsen hvor R er -N02.

I trinn (B) blir nitrogruppene i mono- eller dinitrobenzamidet III underkastet reduksjon. Denne utføres vanligvis med et reduksjonsmiddel slik som hydrazin og en passende

katalysator slik som en heterogen platina-, jernoksydhydroksyd-, palladium- eller

; nikkelkatalysator, typisk på en bærer, eller med hydrogengass og en katalysator.

Dette trinn (B) gir som benzamider IV de forbindelser ifølge oppfinnelsen hvor R er NH2.

> I trinn (C) omdannes aminobenzamidene IV til acetamidobenzamider V ved omsetning med et acetylhalogenid slik som acetylklorid. Denne reaksjonen utføres i nærvær av en mild base og ved fra lave til omgivelsestemperaturer slik som fra -20 til +20°C. Dette gir forbindelsene ifølge oppfinnelsen hvor R er acetamido.

Alternative syntetiske reaksjonsveier kan også benyttes for fremstilling av foreliggende forbindelser. Eksempler på disse alternative veiene er angitt nedenfor under anvendelse av CPU 189 som representativ forbindelse. Andre forbindelser kan fremstilles ved bruk av disse alternative fremgangsmåtene ved å starte med passende utgangsmaterialer, slik som 2- eller 3-amino- eller nitrobenzonitril eller 2,3-, 2,4-, 2,5-, 2,6-, 3,4- eller 3,5-diamino- eller dinitrobenzonitril og den passende alkoholen (alternativ fremgangsmåte 1) eller lignende substituerte toluenforbindelser og det passende alkylaminet (alternativ fremgangsmåte 3).

Alternativ fremgangsmåte 1

Denne fremgangsmåten begynner med acetylering av f.eks 4-aminobenzonitril (A) til forbindelse (B) ved bruk av standard metoder. Syrehydrolyse av tert-butanol i nærvær av 4-acetamidobenzonitril (B) tilveiebringer en gjennomførbar syntetisk vei til CPU 189.

Alternativ fremgangsmåte 2

Acetylering ved bruk av standard metoder av det billige utgangsmaterialet PABA (C) representerer en billig fremgangsmåte for fremstilling av 4-acetamidobenzosyre (D). Omdannelse av (D) til syrekloridet (E) ved bruk av standard metoder (f.eks SOCI2) og etterfølgende amidering ved bruk av standard metoder slik som de som er beskrevet tidligere, gir CPU 189 fra billige råmaterialer.

Alternativ fremgangsmåte 3

En annen fremgangsmåte for fremstilling av foreliggende forbindelser begynner med acetylering, ved bruk av standard metoder, av f.eks paratoluidin (F) til 4-acetamido-toluen (G). Det syntetiske mellomproduktet (G) kan omdannes til 4-acetamidobenzosyre

(D) med vanlige oksydasjonsmidler (f.eks KMnOO og ettefølgende omdannelse til CPU 189 som beskrevet i alternativ fremgangsmåte 2.

Eksempler

Foreliggende oppfinnelse vil bli ytterligere beskrevet i følgende eksempler. Disse er gitt for å illustrere flere foretrukne utførelser av oppfinnelsen, men skal ikke anses som begrensende for oppfinnelsens omfang som derimot er definert i de medfølgende krav. Eksempler 1-19 illustrerer fremstilling av acetamidobenzamider samt nitro- og aminobenzamider, som er representative for benzamidforbindelsene som benyttes i foreliggende preparater og fremgangsmåter. Eksempler 20-24 illustrerer fremstilling av farmasøytiske preparater basert på forbindelsene. Deretter er det angitt biologiske test-resultater som illustrerer aktiviteten til foreliggende preparater.

Eksempel 1

Fremstilling av N-tert-butyl-4-aminobenzamid (CPU 160)

tert-burylamin (14,6 g, 0,200 mol) ble omrørt i etylacetat (150 ml,, renset ved vasking med 5 % natriumkarbonatoppløsning, mettet natriumkloridoppløsning, tørking over vannfritt magnesiumsulfat, og filtrering gjennom riflet filtrerpapir) og avkjølt til 5°C med et isbad. 4-nitrobenzoylklorid (18,6 g, 0,10 mol) i renset etylacetat (75 ml) ble tilsatt dråpevis ved en slik hastighet at temperaturen ble holdt under 10°C. Isbadet ble fjernet da tilsetningen av benzoylkloridoppløsningen var fullført og reaksjonsblandingen ble omrørt i 4 timer. Reaksjonsblandingen ble deretter filtrert på en Biichner-trakt, filtratet ble vasket tre ganger med 5 % HC1, en gang med mettet natriumklorid, tørket over vannfritt magnesiumsulfat, filtrert gjennom et riflet filterpapir, og oppløsnings-midlet ble avdrevet hvilket etterlot et hvitt krystallinsk produkt. Produktet ble tørket i en vakuumovn ved 24 mm og 45°C i 14 timer. Denne prosedyren ga 17,13 g krystaller av

N-tert-butyl-4-nitrobenzamid (CPI1020) (77 % utbytte), smp 162-163°C. Protonkjerne-magnetisk resonans (89,55 MHz i CDCb) viste absorbsjoner ved 8,257 ppm (d, 8,8 Hz, 2H, 3,5-aryl H); 7,878 ppm (d, 8,8 Hz, 2H; 2,6-aryl H), 6,097 ppm (bs, 1H, N-H); 1.500 ppm (s, 9H; tert-butyl H).

Palladium på karbon (5 %, 75 mg) ble tilsatt til CPU020 (5 g, 22,5 mmol) i 95 % etanol ved 55°C. En oppløsning av hydrazin (1,2 ml) i 95 % etanol (10 ml) ble tilsatt dråpevis i løpet av 30 min og mer Pd/C ble tilsatt (75 mg). Reaksjonsblandingen ble tilbakeløps-kokt i 3 timer, hydrazin (0,5 g) i 95 % etanol (5 ml) ble tilsatt og reaksjonsblandingen ble tilbakeløpskokt i ytterligere 1 time. Reaksjonsblandingen ble filtrert på en Bttchner-trakt, oppløsningsmidlets volum ble redusert under vakuum, og det ble foretatt ekstrak-sjon med diklormetan. De kombinerte ekstraktene ble tørket over magnesiumsulfat og oppløsningsmidlet avdrevet hvilket etterlot 3,90 g N-tert-butyl-4-aminobenzamid (CPU 160) (90 % utbytte), smeltepunkt 125-127°C. 90 MHz proton-NMR (i CDC13) viste absorptanser ved 7,290 ppm (2H, d, 8,8 Hz; 2,6 aryl H); 6,368 ppm (2H, d, 8,8 Hz; 3,5 aryl H); 5,45 ppm (1H, bs; NHC=0); 3,727 ppm (2H, bs; aryl-NH2); 1,186 pmm (9 H, s; t-butyl H).

Eksempel 2

Fremstilling av N-tert-butyl-4-acetamidobenzamid (CPI1189)

Acetylklorid (0,45 g, 5,7 mmol) i etylacetat (25 ml) ble tilsatt dråpevis til CPI-1160 (1,0 g, 5,2 mmol) og trietylamin (0,58 g, 5,7 mmol) i etylacetat ved 3°C ble tilsatt ved en slik hastighet at temperaturen ble holdt under 10°C. Reaksjonsblandingen fikk oppvarmes til romtemperatur, ble omrørt i 1 time og vasket med 5 % HC1. Omkrystallisering fra aceton ga 1,08 g N-tert-butyl-4-acetamidobenzamid (CPU 189) (89 % utbytte), smeltepunkt 119-121°C. 90 MHz-proton-NMR (i DMSO-d6) viste absorptanser ved 9,726 ppm (1H, bs, N-H); 7,715 ppm (4H, dd, 4,4 Hz; aryl H); 7,295 ppm (1H, bs; NH); 2,844 ppm (3H, s; CH3CO); 1,448 ppm (9 H, s; t-butyl H).

Eksempel 3

Fremstilling av N-tert-buryl-3-nitrobenzamid (CPI1034)

N-tert-butyl-3-aminobenzamid (CPU 248) og N-tert-buty I-3-acetamidobenzamid (CPU 234)

Amideringsprosedyrene i eksempel 1 ble fulgt ved bruk av 3-nitrobenzoylklorid i steden for 4-nitrobenzoylklorid. Dette ga N-tert-butyl-3-nitrobenzamid (CPU 034) i 92 % utbytte, smeltepunkt 123-125°C. Proton-NMR (i CDC13) viste absorbsjoner ved 8,517 ppm (2-aryl H, s, 1H); 8,337 ppm (4-aryl H, d, 8,8 Hz, 1H), 8,212 ppm (6-aryl H, d, 6,4 Hz, IH); 7,618 ppm (5-aryl H, m, 1H); 6,032 ppm (N-H, bs, 1H); 1,484 ppm (t-butyl H, s,9H).

Jern (UT) oksydhydroksyd-katalysert hydrazinreduksjon ga N-tert-butyl-3-aminobenz-amid (CPU 248) i 53 % utbytte, smeltepunkt 118-120°C. Proton-NMR (i CDCI3) viste absorptanser ved 7,088 ppm (4-6-aryl H, m, 3H); 6,794 ppm (2-aryl H, s, 1H); 5,902 ppm (N-H, bs, 1H); 3,145 ppm (aryl N-H, bs, 2H); 1,458 ppm (t-butyl H, s, 9H).

Acetylering av CPI1248 som beskrevet i eksempel 2 ga N-tert-butyl-3-acetamidobenzamid (CPI1234) i 75 % utbytte, smeltepunkt 194-195°C. Proton-NMR (i CDCI3) viste absorptanser ved 7,778 ppm (4-6-aryl H, m, 3H); 7,392 ppm (2-aryl H, s, 1H); 6,08 ppm (N-H, bs, 1H), 2,174 ppm (acetyl CH3, s, 9H); 1,500 ppm (t-butyl H, s, 9H).

Eksempel 4

Fremstilling av N-tert-butyl-2-nirrobenzamid (CPI 1035) og

N-tert-butyI-2-acetamidobenzamid

Fremgangsmåten i eksempel 3 gjentas ved anvendelse av 2-nitrobenzoylklorid i amideringstrinnet. Dette gir N-tert-butyl-2-nitrobenzamid (CPU 035).

Reduksjon av nitrobenzamid med hydrazin gir N-tert-butyl-2-aminobenzamid.

Acetylering av aminobenzamidet gir N-tert-butyl-2-acetamidobenzamid.

Eksempel 5

Fremstilling av N-iso-propyl-4-nitrobenzamid (CPI1026) og

N-iso-propyl-4-acetamidobenzamid (CPU 232)

Fremgangsmåten i eksempel 3 gjentas ved bruk av 4-nitrobenzoylklorid og iso-propylamin i amideringstrinnet. Dette gir N-iso-propyl-4-nitrobenzamid (CPI1026).

Reduksjon av nitrobenzamidet med hydrazin gir N-iso-propyl-4-aminobenzamid.

Acetylering av aminobenzamidet gir N-iso-propyl-4-acetamidobenzamid (CPU 232).

Eksempel 6

Fremstilling av N-tert-amyl-4-nitrobenzamid (CPI1033) og

N-tert-amyl-4-acetamidobenzamid (CPI1233)

Fremgangsmåten i eksempel 3 gjentas ved bruk av 4-nitrobenzoylklorid og tert-amyl-amin i amideringstrinnet. Dette gir N-tert-amyl-4-nitrobenzamid (CPI1033).

Reduksjon av nitrobenzamidet med hydrazin gir N-tert-amyl-4-aminobenzamid.

Acetylering av aminobenzamidet gir N-tert-amyl-4-acetamidobenzamid (CPI1233).

Eksempel 7

Fremstilling av N-iso-butyl-4-acetamidobenzamid

Fremgangsmåten i eksempel 3 gjentas ved bruk av 4-nitrobenzoylklorid og iso-butylamin i armderingstrinnet. Dette gir N-iso-butyl-4-nitrobenzamid (CPI 1044).

Reduksjon av nitrobenzamid med hydrazin gir N-iso-butyl-4-aminobenzamid.

Acetylering av aminobenzamidet gir N-iso-butyl-4-acetamidobenzamid.

Eksempel 8

Fremstilling av N-n-butyl-4-nitrobenzamid (CPU 045) og

N-n-butyl-4-acetamidobenzamid

Fremgangsmåten i eksempel 3 gjentas ved bruk av 4-nitrobenzylklorid og n-butylamin i amideringstrinnet. Dette gir N-n-butyl-4-nitrobenzamid (CPU 045).

Reduksjon av nitrobenzamidet med hydrazin gir N-n-butyl-4-aminobenzamid.

Acetylering av aminobenzamidet gir N-n-butyl-4-acetamidobenzamid.

Eksempel 9

Fremstilling av N-n-propyl-4-nitrobenzamid (CPI1047) og

N-n-propyl-4-acetamidobenzamid

Fremgangsmåten i eksempel 3 gjentas ved bruk av 4-nitrobenzoylklorid og n-propyl-amin i amideringstrinnet. Dette gir N-n-propyl-4-nitrobenzamid (CPU 047).

Reduksjon av nitrobenzamidet med hydrazin gir N-n-propyl-4-aminobenzamid.

Acetylering av aminobenzamidet gir N-n-propyl-4-acetamidobenzamid.

Eksempel 10

Fremstilling av N-l,2-dimetylpropyl-4-nitrobenzamid (CPI1085) og

N-l,2-dimetylpropyl-4-acetamidobenzamid

Fremgangsmåten i eksempel 3 gjentas ved bruk av 4-nitrobenzoylklorid og 1,2-dimetylpropylamin i amideringstrinnet. Dette gir N-l,2-dimetylpropyl-4-nitrobenzamid (CPU 085).

Reduksjon av nitrobenzamidet med hydrazin gir N-l,2-dimetylpropyl-4-amino-benzamid.

Acetylering av aminobenzamidet gir N-l,2-dimetylpropyl-4-acetamidobenzamid.

Eksempel 11

Fremstilling av N-n-pentyl-4-nitrobenzamid (CPU 040) og

N-n-pentyl-4-acetamidobenzamid

Fremgangsmåten i eksempel 3 gjentas ved bruk av 4-nitrobenzoylklorid og n-pentyl-amin i amideringstrinnet. Dette gir N-n-pentyl-4-nitrobenzamid (CPU 040).

Reduksjon av nitrobenzamidet med hydrazin gir N-n-pentyl-4-aminobenzamid.

Acetylering av aminobenzamidet gir N-n-pentyl-4-acetamidobenzamid.

Eksempel 12

Fremstilling av N-2-metylbutyl-4-nitrobenzamid (CPI1046) og

N-2-metylbutyI-4-acetamidobenzamid

Fremgangsmåten i eksempel 3 gjentas ved bruk av 4-nitrobenzoylklorid og 2-metylbutylamin i amideringstrinnet. Dette gir N-2-metylbutyl-4-nitrobenzamid (CPU 046).

Reduksjon av nitrobenzamidet med hydrazin gir N-2-metylbutyl-4-aminobenzamid.

Acetylering av aminobenzamidet gir N-2-metylbutyl-4-acetamidobenzamid.

Eksempel 13

Fremstilling av N-n-pentyl-2-nitrobenzamid (CPU 174) og

N-n-pentyl-2-acetamidobenzamid

Fremgangsmåten i eksempel 3 gjentas ved bruk av 2-nitrobenzoylklorid og n-pentyl-amin i amideringstrinnet. Dette gir N-n-pentyl-2-nitrobenzamid (CPU 174).

Reduksjon av nitrobenzamidet med hydrazin gir N-n-pentyl-2-aminobenzamid.

Acetylering av aminobenzamidet gir N-n-pentyl-2-acetamidobenzamid.

Eksempel 14

Fremstilling av N-tert-butyl-2,3-diacetamidobenzamid

Fremgangsmåten i eksempel 3 gjentas ved bruk av 2,3-dinitrobenzoylklorid i amideringstrinnet. Dette gir N-tert-butyl-2,3-dinitrobenzamid.

Reduksjon av nitrobenzamidet med hydrazin gir N-tert-butyl-2,3-diaminobenzamid.

Acetylering av aminobenzamidet gir N-tert-butyl-2,3-diacetamidobenzamid.

Eksempel 15

Fremstilling av N-tert-amyl-2,4-diacetamidobenzamid

Fremgangsmåten i eksempel 3 gjentas ved bruk av 2,4-dinitrobenzoylklorid og tert-amylamin i amideringstrinnet. Dette gir N-tert-amyl-2,4-dinitrobenzamid.

Reduksjon av nitrobenzamidet med hydrazin gir N-tert-amyl-2,4-diaminobenzamid.

Acetylering av aminobenzamidet gir N-tert-amyl-2,4-diacetamidobenzamid.

Eksempel 16

Fremstilling av N-tert-butyl-2,5-diacetamidobenzamid

Fremgangsmåten i eksempel 3 gjentas ved bruk av 2,5-dinitrobenzoylklorid i amideringstrinnet. Dette gir N-tert-butyl-2,5-dinitrobenzamid.

Reduksjon av nitrobenzamidet med hydrazin gir N-tert-butyl-2,5-diaminobenzamid.

Acetylering av aminobenzamidet gir N-tert-butyl^S-diacetamidobenzamid.

Eksempel 17

Fremstilling av N-tert-butyl-2,6-diacetamidobenzamid

Fremgangsmåten i eksempel 3 gjentas ved bruk av 2,6-dinitrobenzoylklorid i amideringstrinnet. Dette gir N-tert-butyl-2,6-dinitrobenzamid.

Reduksjon av nitrobenzamidet med hydrazin gir N-tert-butyl-2,6-diaminobenzamid.

Acetylering av aminobenzamidet gir N-tert-butyl-2,6-diacetamidobenzamid.

Eksempel 18

Fremstilling av N-tert-butyl-3,4-diacetamidobenzamid

Fremgangsmåten i eksempel 3 gjentas ved bruk av 3,4-dinitrobenzoylklorid i amideringstrinnet. Dette gir N-tert-butyl-3,4-dinitrobenzamid.

Reduksjon av nitrobenzamidet med hydrazin girN-tert-butyl-3,4-diaminobenzamid.

Acetylering av aminobenzamidet gir N-tert-butyl-3,4-diacetamidobenzamid.

Eksempel 19

Fremstilling av N-tert-butyl-3,5-diacetamidobenzamid

Fremgangsmåten i eksempel 3 gjentas ved bruk av 3,5-dinitrobenzoylklorid i amideringstrinnet. Dette gir N-tert-butyl-3,5-dinitrobenzamid.

Reduksjon av nitrobenzamidet med hydrazin gir N-tert-butyl-3,5-diaminobenzamid.

Acetylering av aminobenzamidet gir N-tert-butyl-3,5-diacetamidobenzamid.

Fremstilling av farmasøytiske preparater

Eksempel 20

Forbindelsen i eksempel 1 blandes som et tørt pulver med et tørt gelatinbindemiddel i et vektforhold på ca 1:2. En mindre mengde av magnesiumstearat tilsettes som et smøre-middel. Blandingen formes til 240-270 mg tabletter (80-90 mg aktivt benzamid) i en

tablettpresse. Dersom disse tablettene administreres til en pasient som lider av en dopamin-forbundet neurodegenerativ tilstand i en daglig, to ganger daglig eller tre ganger daglig kur så vil de forsinke forløpet for pasientens sykdom.

Eksempel 21

Forbindelsen i eksempel 2 blandes som et tørt pulver med et stivelsefortynningsmiddel i et vektforhold på ca 1:1. Blandingen fylles i 250 mg kapsler (125 mg aktivt benzamid). Dersom disse kapslene administreres til en pasient som lider av en dopamin-forbundet neurodegenerativ tilstand i en daglig, to ganger daglig eller tre ganger daglig kur så vil de forsinke forløpet for pasientens sykdom.

Eksempel 22

Forbindelsen i eksempel 3 suspenderes i et søtet, smakstilsatt vandig medium til en konsentasjon på ca 50 mg/ml. Dersom 5 ml av dette flytende materialet administreres til en pasient som lider av en dopamin-forbundet neurodegenerativ tilstand i en daglig, to ganger daglig eller tre ganger daglig kur så vil de forsinke forløpet for pasientens sykdom.

Eksempel 23

Forbindelsen i eksempel 4 blandes som et tørt pulver med et tørt gelatinbindemiddel i en vektforhold på ca 1:2. En mindre mengde magnesiumstearat tilsettes som et smøre-middel. Blandingen formes til 450-900 mg tabletter (150-300 mg aktivt benzamid) i en

Eksempel 24

Forbindelsen i eksempel 14 oppløses i et buffret, sterilt, injiserbart vandig saltopp-løsningsmedium til en konsentrasjon på ca 5 mg/ml. Dersom 50 ml av dette flytende materialet administreres til en pasient som lider av en dopamin-forbundet neruo-degenerativ tilstand slik som Parkinsons sykdom i en daglig, to ganger daglig eller tre ganger daglig kur så vil denne dosen forsinke forløpet for pasientens sykdom.

Det vil forstås at hvilke som helst av forbindelsene av formel I kan anvendes i hvilke som helst av disse representative formuleringene, og at hvilke som helst av disse formuleringene kan administreres på hvilke som helst av disse måter for derved å behandle hvilke som helst av de neurodegenerative tilstandende som er beskrevet i foreliggende sammenheng.

Screeningmetoder for Parkinsons sykdom

Dopamin-utarmingsstudier (MPTP-modell)

C57BL/6J-mus ble forbehandlet med enten vehikkel (1 % metylcellulose) eller et legemiddel (p.o.) 30 min før MPTP. MPTP ble oppløst i isotonisk saltoppløsning (0,9 %) og gitt subkutant som en enkelt dose på 15 mg fri base/kg kroppsvekt for å frembringe en reduksjon i striatal-dopamin til ca 0,5 nanomol/mg protein. Grupper av 5 mus (n=8-10 pr gruppe) mottok enten vehikkel pluss saltoppløsning, vehikkel pluss MPTP, eller legemiddel pluss MPTP. 72 timer etter mottakelse av MPTP ble mus avlivet ved cervical dislokasjon og striata ble utskåret. Vevet ble homogenisert i 0,4 N perklorsyre, sentrifugert, og supematanten analysert ved høyytelse-væskekromatografi/elektro-kjemisk deteksjon (HPLC/ED) for dopaminnivåer. Supematanter ble lagret i en -90°C fryser mellom tiden for innsamling og analyse.

Legemidlene ble kombinert med metylcellulose og ble homogenisert i vann før dosering. Doseringsmengden varierete fra 10 til 50 mg/kg for CPU 160, CPU 189 og CPI1234, og fra 50 til 100 mg/kg for CPI1020.

Resultatene for representative forsøk er angitt i tabeller 1 og 2. Resultatene i tabell 1 viser at foreliggende preparater som eksemplifisert ved CPU 160, CPU 189 og CPI1234 var effektive med hensyn til hindring av dopamin-utarming eller MPTP-challenge.

For sammenligningsformål ble de samme testene foretatt på preparater basert på CPI1020, en nær beslektet benzamidforbindelse. Resultatene er vist i tabell 2. Ved 50 mg/kg ga CPU 189 fullstendig beskyttelse overfor den neurotoksiske virkningen til MPTP (105 % av kontroll) mens CPU 020 ikke var så effektiv (56 % av kontroll). Denne testprosedyren ble gjentatt på en rekke andre materialer ifølge oppfinnelsen. Resultatene er angitt i tabell 3 og viser at andre benzamider ifølge oppfinnelsen utviser beskyttende egenskaper:

Test for langvarig beskyttelseseffekt

Ytterligere studier ble utført for å bestemme langtidseffekten til forbindelsene ifølge oppfinnelsen på dopamin-utarming. Ved bruk av den generelle testmetoden som er beskrevet ovenfor ble C57BL/6J-mus forbehandlet med enten vehikkel eller test-forbindelse og MPTP og deretter avlivet enten 3 eller 14 dager etter dosering. Resultatene er angitt i tabell 4.

Resultatene fra dette forsøket viser at CPI-1189 er i stand til å beskytte mot MPTP-inudsert dopamin-utarming i dyr avlivet ved både 3 dager etter MPTP og 14 dager etter MPTP. Dette antyder at beskyttelseseffekten til CPI-1189 skyldes neurobeskyttelse snarere enn en forbigående effekt på dopamin-metabolisme.

Dopamin-utarmingsstudier (6-hydroksydopamin-modeIl)

Tester ble utført for å bestemme evnen til CPI-1189 med hensyn til beskyttelse mot 6-hydroksydopamm-indusert skade. Dette er en utbredt akseptert modell for Parkinsons sykdom hvor 6-hydroksydopamin antas å produsere dens toksiske effekter ved å indusere oksydativ stress. 6-hydroksydopamin har vært utbredt benyttet siden 1960 årene som et neurotoksisk middel. På grunn av at 6-hydroksydopamin hovedsakelig påvirker katekolaminerge neuroner så har den hovedsakelig vært benyttet for det eksperimentelle studiet av Parkinsons sykdom. Forbindelsen har hatt utbredt anvendelse som et middel for å administrere unilaterale lesjoner i nigrastriatalsystemet. Dyr behandlet med dette toksinet viser biokjemiske og adferdsforandringer som kan måles og undersøkes farmakologisk for å bestemme både lesjonens alvorlighet og for å bestemme effekten av potensielle terapeutiske intervensjoner.

Beskyttelsesdose-responsen for CPI-1189 til 6-hydroksydopamin-indusert skade på nigrastriatalsystemet ble bestemt. Skade på nigrastriatal ble målt uttrykt som striatal-dopaminnivåer.

Aklimatiserte Sprague-Dawley-hannrotter, 55-120 dager gamle ble benyttet.

6-hydroksydopamin (Research Biochemicals Incorporated) ble preparert i en 0,9 % NaCl-oppløsning inneholdende 0,1 mg/ml ascorbinsyre på morgenen for forsøket.

Malt CPI-1189 (partikkelstørrelse <, 106 u) ble formulert i en 1 % metylcellulose-suspensjon om morgenen for behandlingen. CPI-1189 ble administrert oralt ved et doseringsvolum på 0,0005 ml/g ved bruk av en 7,5 cm x 18 gauge inkubasjonsnål. Dyr ble bedøvet og mottok på kirurgisk måte en intrastriatal (kun høyre side) -injeksjon av enten 6-hydroksydopamin eller saltoppløsning. Dyr ble avlivet en uke etter 6-hydroksydopamin-behandling.

Umiddelbart etter avlivning ble det dissekerte striatalvevet innsamlet og analysert ved HPLC/EC for proteininnhold ved bruk av en bicichoninsyre-analyse med de resultater som er vist i tabell 5.

Tabell 5: Testside som prosent av kontrollside, med kun høyre striatum injisert med 6-hydroksydopamin

Resultatene fra disse forsøkene viser at CPI-1189 er i stand til å beskytte mot 6-hydroksydopamin-indusert dopamin-utarming.

Aktivitetstesting ved Alzheimers sykdom

Effekt av benzamider på dannelse Afi(l-40) fl-foldede ark;

Deteksjon av amyloidaggregering ved bruk av thioflavin T fluorescensspektra

Det har blitt utviklet flere analyser for å bestemme aktiviteten til forbindelser som midler for behandling av Alzheimers sykdom. En slik analyse støtter seg til den observasjon at pasienter med Alzheimers sykdom utviser uvanlige nivåer av amyloidaggregering.

Thioflavin T (ThT) forbindes hurtig med 13-foldede ark spesielt de aggregerte fibrilene av syntetisk AJ3 (1-40), som gir opphav til et nytt eksitasjonsmaksimum ved 440 nm og forsterket emisjon ved 490 nm. Ifølge dette prinsippet kan det være at midler som kan forsinke eller reversere dannelsen av slik forbindelse kunne ha terapeutisk nyttevirkning.

Forsøk ble foretatt i plater med 96 brønner og fluorescensendringene ble evaluert ved anvendelse av fluorescensplateleser-CytoFIuor JJ. I korthet ble det i hver brønn anbragt aliquoter på 95 ul av ThT (3 um) preparert i PBS (pH 6,0), 2 ul av NRT (10 um) preparert i 0,05 % metylcellulose i PBS (pH 6,0), og 3 ul av AJJ(l-40) (3 ug) preparert med dH20. Fluorescensmålingen begynte da AB(l-40) ble tilsatt og fortsatte i 4 timer hvorved aggregeringen nådde et platå. Den prosentvise beskyttelse av B-foldet arkdannelse ble beregnet utfra den relative fluorescensenhet-forskjell mellom aggregering i nærvær og i fravær av testforbindelser. Testresultatene er angitt i tabell 6.

Effekt av benzamider for beskyttelse mot amyloid 0(25-35)- eller glutamatindusert neuronalt celletap i hippocampal neuronal/astrocytt-embryokulturer fra rotte

En annen Alzheimers aktivitetstest ble utført. Sprague Dawley-rottehippocampus fra 18 dagers gestasjonsembryoer ble utskåret og deretter dissosiert ved triturering for preparering av primære neuronal/astrocytt-kulturer. Celler (3 x 10<s>) ble utspredt på 35 mm poly-D-lysin-belagte plater inneholdende Eagles minimum essensielle medium supplert med 10 % føtal-bovinserum. Etter 3-5 timer ble det opprinnelige mediet fjernet og erstattet med 1 ml friskt medium. Kulturer ble holdt ved 37°C i en 5 % C02/95 % luft-fuktet inkubator.

For forsøk med hensyn til A6(25-35)-indusert neuronal toksisitet: 30 nm av AB(25-35) oppløst i dH20 ble tilsatt til celler (7DIV) i nærvær eller fravær av 100 um benzamid preparert i 1 % metylcellulose i 96 timer.

For forsøk med hensyn til glutamatindusert neuronal toksisitet: 30 um glutamat ble tilsatt til cellene (9 DIV) i nærvær eller fravær av benzamid i 48 timer.

Neuronal levedyktighet er uttrykt som prosentandelen av morfologisk levedyktige

neuroner etter enten 48 timers eller 96 timers behandling i forhold til antall neuroner før behandling, i de samme på forhånd merkede kulturområdene (tre områder/kultur, n = 6). Resultater er angitt i tabell 7 med data uttrykt som middel ± SEM og sammenlignet med kontroller.

Claims

1. Farmasøytisk preparat, karakterisert ved at det omfatter en benzamidforbindelse med formelen: hvor R' en mettet alkyl med 3-5 karbonatomer, hver R er uavhengig -NO2 eller -NH2, eller NH-CO-CH3, og n er 1 eller 2, forutsatt at: 1) når n er 1 og R er -NO2 ved 4-stillingen i ringen så er R' ikke tert-butyl, iso-butyl eller propyl; 2) når n er 1 og R er -NO2 ved 2-stillingen i ringen så er R' ikke iso-butyl eller propyl; og 3) når n er 2 og R' er tert-butyl og begge R-grupper er -N02 så er R-gruppene ikke ved 3- og 5-stillingene i ringen, i en farmasøytisk akseptabel bærer.

2. Farmasøytisk preparat ifølge krav 1, karakterisert ved at benzamidforbindelsen er et acetamidobenzamid med formelen: hvor R' er en mettet alkyl med 3-5 karbonatomer og n er 1 eller 2.

3. Farmasøytisk preparat ifølge krav 2, karakterisert ved at n er 1 og R' er tert-butyl eller tert-amyl.

4. Farmasøytisk preparat ifølge krav 3, karakterisert ved at benzamidforbindelsen er N-tert-butyl-4-acetamidobenzamid.

5. Farmasøytisk preparat ifølge krav 3, karakterisert ved at benzamidforbindelsen er valgt fra N-iso-propyl-4-acetamidobenzamid, N-tert-amyl-4-acetamidobenzamid, N-tert-butyl-3-acetamidobenzamid og N-metylcyklopropyl-4-acetamidobenzamid.

6. Farmasøytisk preparat ifølge krav 1, karakterisert ved at hver R uavhengig av hverandre er -NO2 eller -NH2.

7. Farmasøytisk preparat ifølge krav 6, karakterisert ved at benzamidforbindelsen er N-tert-butyI-4-aminobenzamid

8. Farmasøytisk preparat ifølge krav 6, karakterisert ved at benzamidforbindelsen er valgt fra N-iso-propyl-4-nitrobenzamid, N-tert-butyl-3-nitrobenzamid, N-tert-butyl-2-nitrobenzamid, N-n-butyl-4-nitrobenzamid, N-n-propyl-4-nitrobenzamid, N-tert-butyl-3,5-dinitrobenzamid, N-l-metylpropyl-4-nitrobenzamid, og N-tert-butyl-3-aminobenzamid.

9. Farmasøytisk preparat ifølge krav 1, karakterisert ved at bæreren er en oral bærer eller en injiserbar bærer.

10. Acetamidobenzamidforbindelse, karakterisert ved at den har formelen: hvor R' er en mettet alkyl med 3-5 karbonatomer og n er 1 eller 2, forutsatt at når n er 1 og R' er enten n-butyl eller n-propyl så er acetamidogruppen ikke ved 2-stillingen i ringen, når n er 1 så er acetamdiogruppen ikke ved 3-stillingen i ringen og når n er 2 så er acetamidogruppene ikke ved 3- og 5-stillingene i ringen.

11. Acetamidobenzamidforbindelse, karakterisert ved at den utgjøres av N-tert-butyl-4-acetamodibenzamid.

12. Acetamidobenzamidforbindelse, karakterisert ved at den utgjøres av N-iso-propyl-4-acetamodibenzamid, N-tert-amyl-4-acetamodibenzamid og N-metylcyklopropyl-4-acetamodibenzamid.

13. Nitro-eller aminobenzamidforbindelse, karakterisert v e d at den er valgt fra gruppen bestående av N-tert-amyl-4-nitrobenzamid, N-1,2-dimetylpropyl-4-nitrobenzamid, N-n-butyl-3-nitrobenzamid, N-n-pentyl-4-nitrobenzamid, N-2-metylbutyl-4-nitrobenzamid, N-n-butyl-3,5-dinitrobenzamid, N-metylcyklo-propyl-4-nitrobenzamid, N-n-butyl-2-nitrobenzamid, N-n-pentyl-2-nitrobenzamid og N-metylcyklopropyl-4-aminobenzamid.

14. Anvendelse av et preparat ifølge et hvilket som helst av kravene 1-9 eller en forbindelse ifølge et hvilket som helst av kravene 10 - 13, for fremstilling av et medikament for behandling av en neurodegenerativ tilstand.

15. Anvendelse ifølge krav 14, der den neurodegenerative tilstanden er forbundet med et progressivt tap av sentralnervesystem funksjonen.

16. Anvendelse ifølge krav 14, der den neurodegenerative tilstanden er en dopamintilknyttet neurodegenerativ tilstand.

17. Anvendelse ifølge krav 14 eller 16, hvor den neurodegenerative tilstanden er Parkinsons sykdom.

18. Anvendelse ifølge krav 14 hvor den neurodegenerative tilstanden er Alzheimers sykdom.

19. Anvendelse ifølge krav 14, der den neurodegenerative tilstanden er en som er forbundet med et tap av sentralnervesystemfunksjonen på grunn av mitokondrieJl dysfunksjon.

20. Anvendelse ifølge et hvilket som helst av kravene 14-19, der medikamentet administreres oral, parenteralt eller ved intravenøs infusjon.