NO163595B - Fremgangsmaate for fremstilling av forbindelsen 3-(n-fenylacetylaminopiperidin)-2,6-dion fra urin. - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse gjelder en fremgangsmåte ved ekstrahering av peptidfraksjon inneholdende peptider med 2 til 9 aminosyrerester og forbindelsen 3-[N-fenylacetylaminopiperi-din] -2 , 6-dion fra urin.

Undersøkelser på nærvær av fysiologisk eller patologisk aktive peptider i urin har foregått i de siste 80 år. Biologisk aktive polypeptider er isolert fra urin som har vist hormon-lignende aktivitet eller ved regulering av biologisk funksjon. Eksempler på biologisk aktive polypeptid-preparater isolert fra urin omfatter vekst-faktorer, pituitære hormoner og kininer.

Den praktisk talt uendelige variasjon av peptidet som kan dannes ved kombinasjon av de tyve vanlige aminosyrene har fått mange forskere til å foreslå at peptidet kan utgjøre et system som kan overføre informasjon fra celle til celle og organ til organ. Ved å følge dette syn på den regulerende betydning av peptider, har forskere isolert urinære peptider som utøver en påvirkning på blodtrykket, modifisering av oppførselen, hjerte-kar-regulering og aktivitet i glatte muskler.

En rekke forskere har,derfor ment at neoplastisk vekst kan reguleres ved hjelp av naturlig forekommende biokjemiske forsvars-mekanismer. Den immunologiske prosess har for det meste vært tilskrevet antineoplastisk aktivitet (se for eksempel Aoki et al, Prog. Exp. Tumor Res., 19:23, 1974). Det er imidlertid andre mulige mekanismer.

Det er foreslått at neoplasi er en celle-differensierings-sykdom. Med det store antall av differensierende celler og antatt muligheten av feil i programmet for differensieringen,

kan grupper av unormalt voksende celler ofte oppstå under inn-virkning av karcinogene faktorer. Uten en pålitelig mekanisme for "normalisering" av slike feilaktig utviklede celler, ville organismene ikke leve meget lenge. En slik mekanisme skulle være i stand til å rette opp veksten av nylig utviklede neoplastiske celler og rette dem inn på normal differensiefings-

vei. Det er søkerens antagelse at peptider er ideelle forbindelser for å fungere som informasjonsbærende molekyler for å regulere celle-differensiering.

I de siste årene har søkeren beskrevet en rekke peptider

av middels størrelse som er oppnådd fra human urin, som demonstrerer inhibering av DNA-syntese og mitosis i kulturer

av forskjellige neoplastiske celler uten signifikant inhibering av normal celle-reproduksjon [se Burzynski, Physiol. Chem. Phys., 5: 437 (1973); Burzynski et al, Fred. Proe, 32 : 766 (1973), Burzynski et al, Physiol. Chem. Phys., 8:13 (1976), Burzynski

et al, Fred. Proe, 35 : 623 (1976); Gross et al, Physiol. Chem. Phys., 8:275 (1976); og Burzynski et al, Physiol. Chem. Phys., 9:485 (1977)].

De aktive forbindelser, men hittil uidentifiserte adskilte forbindelser, fra disse fraksjoner er gitt arbeidsnavnet "antineoplastoner". Søkeren har definert antineoplastoner som substanser fremstilt av en levende organisme som beskytter det mot utvikling av neoplastisk vekst ved hjelp av en ikke immunologisk prosess som ikke signifikant inhiberer veksten av normalt vev.

Selv om noen polypeptider er syntetisert som demonstrerer antineoplastiske egenskaper, (se de Barbieri et al, Boll. Chim. Farm., 111:216, 1972), kjenner ikke søkeren at det er kjent på området å beskrive lavmolekylære polypeptider av liten størrelse (mindre enn 10 aminosyrer) som er isolert og identifisert fra vev eller legemsvæsker som oppviser antineoplastisk aktivitet som er signifikant høyere enn inhibering av normal celle-vekst. Heller ikke kjenner søkeren til at det på det kjente område er beskrevet peptidet 3-[N-fenylacetylaminopiperidin]-2,6-dion eller dets bruk som antineoplastisk middel.

Substanser med lav molekylvekt (molekylvekt mindre enn 2-5000) er anvendbare ved behandling av human neoplastisk sykdom isolert og konsentrert fra human urin. Isoleringen omfatter først ultrafiltreringsoperasjoner som separerer forbindelser med lavere molekylvekt (mindre enn 2000-5000 molekylvekt) fra forbindelser med høyere molekylvekt og proteiner. Etter filtrerings- og ultrafiltreringsoperasjonene, underkastes det resulterende urin-ultrafiltratet som inneholder forbindelsene med lavere molekylvekt forskjellige separeringssekvenser som spesielt gir en antineoplaston-fraksjon omfattende peptidfor-bindelser av liten størrelse (mindre enn 10 aminosyrer).

Ifølge foreliggende oppfinnelse skilles det fra et urinvolum partikkelformet materiale og materiale med en større molekylvekt enn ca. 5000; urinen surgjøres til pH 2 til 3; alt utfelt materiale skilles fra den surgjorte urin; den surgjorte urin innføres i en PHLC (high performance liquid chromato-graphy)-kolonne med C-18-bundet-fase silikagel; og den cytostatisk aktive peptidfraksjon utvinnes, hvilken peptidfraksjon inneholder forbindelsen 3-[N-fenylacetylaminopiperidin]-2,6-dion.

Fortrinnsvis surgjøres urinen til pH ca. 2,5. Det kan

være hensiktsmessig å rense det oppnådde 3-[N-fenylacetylamino-piperidin] -2 , 6-dion fra peptidfraksjonen ved en andre HPLC-operasjon. Denne utføres med fordel på en sulfonert polystyren-kolonne for aminosyrer eller et ekvivalent system.

Den viktigste aktive komponent, 3-[N-fenylacetylamino-piperidin] -2,6-dion, syntetiseres ved omsetning av L-glutamin og fenylacetylklorid sammen fulgt av flere ekstraksjonsopera-sjoner for å isolere produktet 3-[N-fenylacetylaminopiperidin]-2,6-dion fra biproduktene.

Ved hydrolyse av 3-[N-fenylacetylaminopiperidin]-2,6-dion oppnås nedbrytningsproduktene, fenylacetylglutamin og fenyleddiksyre.

Antineoplaston-fraksjonene, 3-[N-fenylacetylaminopiperidin]-2,6-dion og nedbrytningsproduktene er anvendbare ved behandling av human neoplastisk sykdom.

Kort beskrivelse av tegningene

Figur 1 representeter et kromatogram av antineoplaston-fraksjon Al. Figur 2 representeter et kromatogram av antineoplaston-fraksjon A2. Figur 3 representerer et kromatogram av antineoplaston-fraksjon A3. Figur 4 representerer et kromatogram av antineoplaston-fraksjon A4. Figur 5 representerer et kromatogram av antineoplaston-fraksjon A5.

Oppfinnelsen skal beskrives i form av foretrukne utførelses-former som er kjent for søkeren på innleveringstidspunktet for denne søknad å representere den beste fremgangsmåte for isolering, rensing og anvendelse av urin antineoplaston-fraksjoner og syntetiske antineoplastoner oppvisende antineoplastisk aktivitet.

Ifølge slike foretrukne utførelsesformer er startmaterialet for fremstilling av hver antineoplaston-fraksjon urin samlet fra friske personer. Typisk varierer mengden urin som kreves for å utarbeide anvendbare utbytter av en ønsket antineoplaston-fraksjon A1-A5 fra ca. 2000-3000 liter. Brukbare utbytter ekstrahert fra 2000-3000 liter urin er i størrelsesorden 100-8 00 gram tørt stoff for hver av de respektive antineoplaston-fraksjonene. Oppsamlede urin-prøver kan lyofiliseres til en tørr pulverform dersom ekstraksjons-, isolasjons- og rense-fremgangsmåtene ikke skal gjennomføres straks. Typisk utføres imidlertid isolasjonen og rensningen av de respektive antineoplaston-f raks joner straks ved anvendelse av nylig samlet urin.

Det skal bemerkes at standard forsiktighetsregler mot bakterie-forurensning tas hele tiden og fremstillingene sjekkes rutinemessig på pyrogenisitet, toksisitet og sterilitet ifølge standard-teknikker. Pyrogen-fritt,sterilt vann anvendes i slutt-trinnene,og alle fremgangsmåter gjennomføres ved om-givende værelsestemperatur om ikke annet er konstatert.

A. Isolasjon og rensning av anti-

neoplaston- fraksjon Al fra human urin

Rekonstituert lyofilisert urin ( gjenoppløst i deionisert eller destillert vann) eller nyinnsamlet urin filtreres først fysisk gjennom papir, membran eller patron-filter med gjennomsnittlig porestørrelse på 3 u. Det første filtratet filtreres så gjennom et andre filter med en gjennomsnittlig porestørrelse på 0,2 y. Disse filtreringstrinnene gjennomføres for å skille suspendert partikkelformig eller sedimentert stoff fra urin-væsken.

Deretter underkastes den forfiltrerte urin ultrafiltrering. Ultrafiltrering gjennomføres ønskelig gjennom et hult fibersystem, fortrinnsvis et Amicon eller Romicon system-filter med en molekylvekt avkutting på ca. 5000 daltons. For ultra-filtreringsformålet kan ethvert annet ultrafiltreringsmembran eller hul fiber ultrafilter anvendes med et molekylvekt avkutt egnet i området 5000 til 2000. Slik ultrafiltrering tjener til å fjerne materialer med molekylvekter større enn 2000 til 5000 avhengig av det valgte filter som anvendes.

Ultrafiltratet surgjøres med konsentrert syre, passende

salt- eller svovel-syre, tilsatt langsomt under kraftig omrøring inntil løsningen når et pH-område fra 2 til 3, fortrinnsvis pH 2,5. Det surgjorte ultrafiltratet filtreres så gjennom et 0,2 u filter for å fjerne eventuelt utfelt partikkelformig stoff.

Høy-ytelses væske-kromatografi-teknikker anvendes for ytterligere å rense og konsentrere antineoplaston-fraksjon Al.

En prøve , gjerne 250 ml (mengden avhenger naturligvis av kapasiteten til systemet), av det surgjorte ultrafiltratet innføres i en,høy-ytelses væske-kromatografi-kolonne, ønskelig et Waters Prep 500 HPLC-system under anvendelse av Prep 500 C-18 silikagel patron-kolonne (silikagel av bundet fase-type). Systemet er også utstyrt med en refraktiv indeks detektor. Imidlertid kan enhver egnet deteksjonsmetode som for eksempel UV-fotometri, ionedetektor, osv. anvendes. Antineoplaston-fraksjon A2 elueres med deionisert eller destillert vann og er karakterisert som den peptid-fraksjon som har en refraktiv indeks-topp som opptrer etter passasje av ca. 450 ml vann gjennom kolonnen. Den resulterende antineoplaston-fraksjon Al oppsamles og konsentreres ved rotasjonsfordampning under redusert trykk og så ytterligere frysetørket ved lyofiliser-

ing.

Antineoplaston-fraksjon Al kan anvendes i en rekke farma-søytiske former omfattende, men ikke begrenset til, intravenøs, intramuskulær, subkutan, intrakavital og intratumor-injeksjoner, kapsler og tabletter for oral administrasjon, rektale supposi-torier og løsninger og sprayer for lokalt bruk.

B. Isolasjon og rensning av anti-

neoplaston- fraksjon A2 fra human urin

Urin som er forfiltrert og ultrafiltrert ifølge

beskrivelsen av fremstilling av antineoplaston-

fraksjon Al, surgjøres med konsentrert syre, typisk saltsyre. Syren tilsettes langsomt til ultrafiltrat-løsningen under kraftig omrøring inntil løsningen når et pH-område fra ca. 1 til ca. 2, fortrinnsvis pH 1,5.

Ultrafiltratet fra det ovenstående trinn innføres i en kromatografi-kolonne som inneholder en polymer-harpiks-adsorbent, fortrinnsvis Amberlite XAD-8 polymer-harpiks-adsorbent, et produkt fra Rohm & Haas Co., Philadelphia, Pennsylvania. Ethvert annet materiale som har lignende kjemisk struktur eller fysisk kjemiske egenskaper kan anvendes istedenfor Amberlite-adsorbenten. De aktive antineoplastiske materialene elueres fra kolonnen ved å anvende vaskninger i rekkefølge omfattende en første vaskning med deionisert eller revers osmose-vann (Wl), en andre vaskning med en blanding av vann og metanol (for eksempel 8 % volum/volum) (M), en tredje vaskning av deionisert eller revers osmose-vann (W2), en fjerde vaskning med 4 %ig vandig natriumhydroksyd-løsning (N), og en femte vaskning med deionisert eller revers osmose-vann inntil pH i eluatet ligger i det nøytrale område. Eluatene Wl, W2 og M oppsamles. pH i løsningene av Wl, W2 og M justeres til ca. 2,5 med dråpevis tilsetning av syre, for eksempel svovelsyre.

Eluatene Wl, W2 og M fra det foregående trinn føres gjennom en kromatografi-kolonne pakket med silikagel-preparat C-18 (silikagel av bundet fase-type) tilgjengelig fra Waters Associates, Whatman eller andre kompanier. Kolonnen vaskes først med deionisert eller destillert vann og elueres så med metanol. Tre brungulaktig farvede fraksjoner opptrer som bånd, betegnet MW1, MW2 og MM. Farvede fraksjoner MW1, MW2

og MM oppsamles hver for seg og hver fraksjon konsentreres på en sirkulerende fordamper til 1 liters volum. Hver fraksjon inndampes videre til tørrhet enten ved rotasjonsfordampning eller f rysetørkning. Tørre fraksjoner MVJl, MW2 og MM er egnet for farmasøytisk anvendelse separat eller sammenblandet. Blandingen av dem kalles .antineoplaston-fraksjon A2, og blandingen er egnet for farmasøytisk administrasjon på samme måte som administrasjonen beskrevet for antineoplaston-fraksjon Al.

C. Isolasjon og rensning av anti-

neoplaston- fraksjon A3 fra human urin

Antineoplaston-fraksjon A3 isoleres fra urin under samme operasjon som isolasjonen og rensningen av antineoplaston-fraksjon A2. Prefiltrering, ultrafiltrering, surgjøring, XAD-8-adsorpsjon og eluering er identisk med dem som utføres

for isolasjonen av antineoplaston-fraksjon A2.

Fraksjon N eluert fra XAD-8-kolonnen med 4 %ig natriumhydroksyd oppsamles og pH justeres til 2,5 med syre, fortrinnsvis svovelsyre. Fraksjon N underkastes så oksydasjonsoperasjoner. Oksydasjonen av fraksjon N gjennomføres fortrinnsvis ved dråpevis tilsetning av en mettet vandig løsning av kaliumpermanganat inntil den fiolette farve av kalium-permanganat forsvinner.

Etter oksydasjonsoperasjonen filtreres fraksjon N i rekke-følge gjennom et 3 u og 0,2 u filter,og det klare filtratet separeres videre ved C-18-kromatografi. Dette kromatografi-trinnet gjentas på samme måte som beskrevet for isolasjon av antineoplaston-fraksjon A2. Det farvede båndet som er synlig på kolonnen betegnet MN elueres med metanol. Det farvede båndet MN oppsamles og inndampes til tørrhet eller frysetørkes. Denne fraksjon kalles antineoplaston-fraksjon A3 og er egnet for direkte farmasøytisk anvendelse. Antineoplaston-fraksjon A3 kan brukes i samme variasjoner av farmasøytiske sammensetninger og administrasjonsmåter som angitt for antineoplaston-fraksjon Al.

D. Isolasjon og rensning av anti-

neoplaston- fraksjon A4 fra human urin

pH i rekonstituert eller ny urin justeres til 2,5 med syre, passende svovelsyre. Innholdet av urin oksyderes så

ved å blande urinen med en mettet løsning av kaliumpermanganat i vann inntil den fiolette farven av kaliumpermanganat forsvinner. Etter oksydasjonen filtreres den behandlede urin,

og det klare filtratet separeres ved C-18-kromatografi ut-ført på samme måte som beskrevet for isolasjonen av antineoplaston-f raksjon A2 .

Det farvede båndet som er synlig på kolonnen betegnes fraksjon U og elueres med metanol og inndampes til tørrhet eller frysetørkes. Denne fraksjon kalt antineoplaston-fraksjon A4 er egnet for farmasøytisk anvendelse i de samme variasjoner av farmasøytiske sammensetninger og administrasjonsmåter som beskrevet for antineoplaston-fraksjon Al.

E. Isolasjon og rensning av anti-

neoplaston- fraksjon A5 fra human urin

Prefiltreringen, ultrafiltreringen og surgjøringen av rekonstituert eller ny urin gjentas som beskrevet ovenfor for fremstilling av antineoplaston-fraksjon Al. Det surgjorte materialetsiLtreres igjen gjennom et 0,2 filter for å fjerne eventuelt utfelt eller sedimentert rest. Dette filtrat inn-føres så i en kromatografi-kolonne fylt med C-18-silikagel av bundet fase-type, (tilgjengelig eksempelvis fra Waters Associates eller Whatman). Andre silikagel-pakninger med samme fysisk kjemiske egenskaper kan erstatte kolonne-pakningen med C-18.

Kolonnen vaskes først med deionisert, destillert vann og elueres så med metanol. En farvet metanolisk fraksjon oppsamles, som inndampes til tørrhet eller frysetørkes. Den tørre fraksjon kalles antineoplaston-fraksjon A5. Antineoplaston A5 er egnet for farmasøytisk anvendelse i samme variasjoner av sammensetninger og administrasjonsmåter som beskrevet for antineoplaston-fraksjon Al.

F. Kromatografisk karakterisering

av antineoplaston- fraksjoner A1- A5

For det formål å identifisere hver av de oppnådde antineoplaston-f raksjoner, ble det utviklet et kromatografisk fingeravtrykk. Hver av de oppnådde antineoplaston-fraksjonene fra de respektive ovenfor beskrevne fremgangsmåter ble under-kastet høy-ytelses væske-kromatografi, med et Waters Prep 500 HPLC-system utstyrt med et Prep 500 C-18 silikagel-kolonne av bundet fase-type og refraktiv indeks-detektor.

Hver antineoplaston-fraksjon ble utviklet ifølge samme rekke-følge av vaskerutine. Først ble en forhåndsbestemt mengde av rekonstituert antineoplaston-fraksjon innført i kolonnen. Typisk ble antineoplaston-fraksjonen i pulverform rekonstituert med destillert vann.

Etter innføring av antineoplaston-fraksjonprøven, ble en første vasking på 100 ml vann ført gjennom kolonnen. Denne vann-vaskingen ble fulgt av 1000 ml av en eddiksyre-løsning, pH 2,5. Endelig ble 1000 ml vann ført gjennom kolonnen og 600 ml metanol. Når eluatene forlot kolonnen, målte og nedtegnet detektoren den tilsynelatende refraktive indeks til bestanddelene som ble eluert med et utløpende løsningsmiddel.

Med henvisning til figurene illustreres et karakteristisk kromatogram for hver av antineoplaston-fraksjonene. Figurene illustrerer den relative refraktive indeks som tilsvarer komponenter som er til stede i eluatene som går ut av kolonnen med de relative elueringsvolumene, tilsvarende passasje av hver av løsningsmiddel-vaskingene. Det vil forståes av de som er kjent med kromatografisk utvikling, at hvert kromatogram representerer en oppløsning av topp-fordeling som er karakteristisk for en spesiell blanding. Et kromatogram tjener som en fingeravtrykk-analyse for blandingen eller i dette tilfelle et fingeravtrykk for antineoplaston-fraksjonene. Det er derfor tydelig at de respektive produkt-antineoplaston-fraksjoner renset ifølge fremgangsmåtene i oppfinnelsen vil oppvise det karakteristiske kromatogram som tilsvarer figurene illustrert her når de utvikles ifølge de betingelser som er beskrevet ovenfor. Det vil også være klart for fagmannen at de relative høyder av toppene vil variere med konsentrasjonen av bestanddels-elementene det som er til stede i hver fraksjon, for-delingen av toppene vil imidlertid ikke variere vesentlig fra sats til sats i hver fraksjon.

I figur 1 er det avbildet et kromatogram hvor antineoplaston-f raks jon Al oppviser en adskilt skarp topp i området ved første vann-vasking. Videre oppviser antineoplaston-fraksjon Al en bred topp-fordeling omfattende en serie av moderat definerte topper konsentrert i området av enden av eddiksyre-vaskingen og av den andre vann-vaskingen. I tillegg opptrer skarpt definerte topper etter 450 ml av metanol-vaskingen.

Figur 2 angir kromatogrammet av antineoplaston-fraksjon

A2, hvori en serie av skarpt definerte topper er synlig i området av slutten av eddiksyre-vaskingen og strekker seg inn i området av den andre vann-vaskingen. Videre er det skarpt definerte topper i metanol-vaskingen.

Figur 3 avbilder kromatogrammet av antineoplaston-

fraksjon A3, som oppviser en liten topp i den første vann-vaskingen og et konsentrert bånd av topper i området av slutten av eddiksyre-vaskingen og som strekker seg inn i den andre vann-vaskingen. I tillegg er det vel definerte topper i metanol-vaskingen.

I figur 4 avbildes et kromatogram av antineoplaston-fraksjon A4 som oppviser en liten topp i den første vann-vaskingen og

en bred topp oppløst i eddiksyre-vaskingen og den andre vann-vaskingen. Videre er det skarpe topper i metanol-vaskingen.

I figur 5 er det et kromatogram av antineoplaston-fraksjon AS. Kromatogrammet avbilder en liten topp i den første vann-vaskingen og en bred topp omfattende en serie av moderat definerte topper i enden av eddiksyre-vaskingen som strekker seg inn i den andre vann-vaskingen. Det er også vel definerte topper i metanol-vaskingen.

Det ble gjort ytterligere forsøk på å isolere og identifisere bestanddelene i hver antineoplaston-fraksjon. Bestanddels-elementene i antineoplaston-fraksjonene A1-A5 ble separert ved høy-ytelses væske-kromatografi på en kolonne pakket med sulfonert polystyren. Et system utviklet av Glenco Scientific Inc. for aminosyre-analyse ble brukt. Elueringen ble gjennomført med 0,2M citrat-buffer i tre forskjellige pH-verdier, nemlig 3,25, 3,80 og 4,10 og ved temperaturer fra 50 til 70°C. For-andringene av buffere og temperaturer ble selektivt regulert ifølge programmet for aminosyre-analyse av Glenco Scientific, Inc.

Eluatene ble omsatt etter hvert som de kom ut av kolonnen

med ninhydrin ved 110°C for å gi absorpsjons-topper som samtidig ble målt og nedtegnet ved 47 0 y og 44 0 y. For å standardisere fremgangsmåten, ble en blanding av 18 aminosyrer separert for å etablere de oppholdstider som er vist i tabell 1.

Hver av antineoplaston-fraksjonene A1-A5 ble separert i adskilte homogene bestanddeler under samme betingelser som den standardiserte aminosyre-blandingen. Tabell 2 oppsummerer oppholdstidene for de adskilte bestanddelene som utgjør hver av de heterogene antineoplaston-fraksjonene.

Preparatene av antineoplaston-fraksjonene Al, A2, A3, A4 og A5 inneholder hverken aminosyrer eller proteiner. De topper

som er nedtegnet under analysen av antineoplaston-fraksjonene tilsvarer de forskjellige forbindelser som reagerer med ninhydrin, nemlig aminosyre-derivater og peptider. Som notert i tabell 2 måles den relative konsentrasjon av hver bestanddel-forbindelse i den spesielle antineoplaston-fraksjonen i forhold til reaktiviteten mellom ninhydrin og a-amino-nitrogenet i bestanddels-forbindelsen. Ifølge den kromatografiske analyse som er beskrevet i dette avsnitt, oppviser hver antineoplaston-fraksjon en signifikant tydelig topp ved en oppholdstid som tilsvarer 7 9 minutter. Ifølge metodene for fremstilling av hver antineoplaston-fraksjon omfattet av foreliggende oppfinnelse, er videre den relative konsentrasjon av den bestanddel som tilsvarer en 79 minutters oppholdstid minst to ganger den relative konsentrasjon av enhver annen gjenværende bestanddelsforbindelse. Det skal imidlertid forståes at den relative konsentrasjon av hver bestanddels-forbindelse som utgjør en antineoplaston-fraksjon vil variere med urin-kilden. Avhengig av urin-kilden

vil flere av bestanddels-forbindelsene i en antineoplaston-fraksjon ikke være selvklar. Søkeren påstår ikke at hver bestanddels-forbindelse i en antineoplaston-fraksjon har antineoplastisk aktivitet. Antineoplastisk aktivitet er demonstrert for hver antiplaston-fraksjon A1-A5 og for den bestanddels-f orbindelse som er karakterisert ved en 79 minutters oppholdstid oppnådd ved den ovenfor beskrevne separeringsteknikk.

Den felles aktive hovedkomponent i antineoplaston-fraksjon Al, A2, A3, A4 og A5 ble til slutt renset ved høy-ytelses væske-kromatografi og tynnsjikt-kromatografi. Søkeren har kalt denne forbindelse antineoplaston A10. Dens kjemiske struktur ble bestemt ved masse-spektrometri, 13^(NMR)-spektro-skopi, og infrarød spektrometri. Strukturen er avbildet neden-for og kalles 3-[N-fenylacetyl-aminopiperidin]-2, 6-dion.

G. Syntese av antineoplaston A10,

3-[ N- fenylacetylaminopiperidin]- 2, 6- dion

Natriumbikarbonat (4,7 mol) og L-glutamin (2,3 mol) ble oppløst i vann (13,5 liter). Fenylacetylklorid (3,0 mol) ble gradvis tilsatt til reaksjonsblandingen og omrørt kraftig i 90 minutter. Etter fullført reaksjon, ble løsningens pH justert til 2,5 med syre og løsningen filtrert. Filtratet ble ekstrahert to ganger med diklormetan og de nedre organiske sjiktene ble kastet. Det øvre vandige sjiktets pH ble justert til 7,0 med base, typisk IN NaOH. Det øvr e sjiktet ble så ytterligere renset ved blanding med Norit A (20 g) (tilgjengelig fra American Norit Co., Jacksonville, Florida). Blandingen ble filtrert etter 30 minutters kontakt med Norit A. Det resulterende filtratet ble inndampet og resten gjenoppløst i metanol. Den oppnådde metanoliske løsning ble filtrert og frysetørket eller inndampet. Den tørkede resten ble gjenoppløst i vann og pH justert til 2,5 passende med HC1. To sjikt ble dannet etter henstand ved værelsestemperatur. Det nedre sjiktet ble oppvarmet inntil det ble mørkebrunt. Det viskøse brune sjiktet ble gjenoppløst i metanol hvori rå antineoplaston A10 utfalt ved avkjøling. Det rå antineoplaston A10 ble gjenoppløst i varm metanol og Norit A ble tilsatt for å fjerne enhver farve. Løsningen ble filtrert mens den var varm. Ved avkjøling dannet det seg hvite krystaller av antineoplaston A10. Strukturen av det syntetiske materiale ble oppklart ved massespektrometri, 13c(NMR)-spektroskopi og infrarød spektrometri, og ble funnet å være identisk med den felles aktive hovedkomponenten i antineoplaston-f raks jonene Al, A2, A3, A4 og A5 med en 7 9 minutters oppholdstid.

Antineoplaston A10 er mest egnet for farmasøytiske anvendelser i form av salter, natriumsaltet foretrekkes. For å fremstille natriumsaltet, suspenderes antineoplaston A10 i etanol og oppvarmes med en løsning av natriumhydroksyd-vann inntil alt materiale er oppløst. Reaksjonsblandingen frysetørkes så. Den faste resten holdes ved værelsestemperatur inntil saltet krystalliserer ut. Etanol tilsettes og omrøres. Filtrering gir et hvitt krystallinsk fast stoff tilsvarende natriumsaltet av antineoplaston A10. Egnede løsninger for parenteral administrasjon fremstilles ved å oppløse natriumsaltet av antineoplaston A10 i pyrogen-fritt vann opp til en konsentrasjon av 100 mg/ml og justere pH til 7,0.

H. Nedbrytningsprodukter av antineoplaston AlO

Den første hydrolyse av antineoplaston A10 gir fenylacetyl-glutamin, og når den føres videre fremstilles fenyleddiksyre:

Fenylacetyl-glutamin ble først beskrevet av Thierfelder •

og Sherwin [se J. Physiol. Chem. 94:1 (1915)] som en bestanddel av normal human-urin. I senere undersøkelser av forbindelsen fenylacetyl-glutamin ble det vist at den hadde en svak effekt på veksten av murin-tumorer [se Lichtenstein et al, Israel J. Med. Sei., 13:316 (1977)] men det var ingen indikasjon på

at forbindelsen var anvendbar med behandling av human kanser. Natriumsaltet ble brukt av Neish ved behandling av Rd/3 sarkon hos rotter men mislyktes i å inhibere tumor-vekst. Resultatene antydet faktisk at behandlingen med fenyleddiksyre forårsaket noen økning av tumor-veksten [se Neish, Experientia, 27:860

(1971)]. Søkeren har i sine kliniske studier demonstrert at fenylacetyl-glutamin alene og en blanding av fenylacetyl-glutamin og fenyleddiksyre hver er anvendbare ved behandling av human kanser.

En blanding av natriumsaltene av fenylacetyl-glutamin og fenyleddiksyre i forholdet 1 til 4 er den foretrukne sammensetning for anvendelse ved behandling av human kanser.

Løsninger for parenteral administrasjon fremstilles ved å rekonstituere de respektive kjemikaliene i form av natrium-salter i pyrogen-fritt vann til ønsket total konsentrasjon, for eksempel 100 mg/ml. Løsningens pH justeres til 7,0 med IN NaOH eller IN HC1. Sterilisering av den rekonstituerte løsningen gjøres ved filtrering ifølge retningslinjene i U.S. Pharmacopeia. Steriliteten til materialet testes som nødvendig ved hjelp av regler og reguleringer til Food and Drug Administration, Section 610.12. De resulterende sterile blandingene er egnede for parenteral injeksjon.

I. Farmasøytiske anvendelser for anti-

neoplaston-f raks joner A1-A5, antineo-

plaston A10 og nedbrytningsprodukter

Løsninger for parenteral administrasjon fremstilles ved re-konstituering av hver av respektive antineoplaston-fraksjoner, antineoplaston A10 og nedbrytningsprodukter i pyrogen-fritt vann til en ønsket hensiktsmessig konsentrasjon, for eksempel 100 mg/ml. Løsningens pH justeres til 7,0 med IN HC1 eller IN NaOH.

Sterilisering av den rekonstituerte løsning utføres ved filtrering ifølge retningslinjene i U.S. Pharmacopeia. Alterna-tivt kan de lyofiliserte pulvere av de respektive antineoplaston-f raks jonene først gass-steriliseres, for eksempel med etylenoksyd, og pulverne deretter innblandes i det pyrogen-frie vannet som naturligvis i seg selv er sterilt. Steriliteten til materialet testes om nødvendig ved hjelp av Rules and Regulations of the Food and Drug Administration, Section 610.12. De resulterende sterile blandingene er egnede for intravenøs, intramuskulær, subkutan, intrakavital og intratumor-injeksjon.

Om de rekonstituerte lyofiliserte antineoplaston-fraksjonene ikke skal brukes straks, kan hindring av mikrobe-vekst oppnåes ved tilsetning av forskjellige antibakterielle og anti-fungale midler til antineoplaston-løsningene, for eksempel parabener, klorbutanol, benzylalkohol, fenol, sorbinsyre, thimerosal og lignende. I mange tilfeller vil det være ønskelig å innblande isotoniske midler til de injiserbare løsningene, for eksempel sukkere eller natriumklorid.

Den antineoplastiske aktiviteten til antineoplaston-fraksjonene A1-A5, antineoplaston A10 og nedbrytningsproduktene ble først fastslått eksperimentelt ved å observere de cytostatiske effektene preparatene ville ha på en tumor-linje sammen-lignet med den totale toksisiteten preparatet ville ha på eksperiment-dyrene. Derfor ansees preparatet med den største cytostatiske aktiviteten og den laveste dyre-toksisiteten å ha ,den beste antineoplastiske aktiviteten, eller terapeutiske effektiviteter.

Den cytostatiske aktiviteten til antineoplaston-fraksjon

Al ble testet i en kultur av human karcinom av bryst-typen MDA-MB-231 oppnådd fra M.D. Anderson Cancer Institute, Houston, Texas. MDA-MB-231 er en raskt voksende type av human bryst-kanser etablert av Cailleau et al, J. Nati. Cancer Inst., 53:661 (1974). Den beregnede fordoblingstid av disse celler er 18 timer når de dyrkes i det orginale medium beskrevet av Beall et al, Physiol. Chem. Physics, 8:281 (1976). For kort

å oppsummere den foretrukne metode og det foretrukne medium, dyrkes cellene i monosjikt ved 37°C i Leibovitz L-15-medium tilsatt 20 % kvegfoster-serum, 1,6 y g/ml glutation, 0,25 U/ml insulin, 100 y g/ml dinatrium-karbenicillin og 100 y g/ml gentamycin.

For bioforsøkene ble antineoplaston-fraksjon Al oppløst i det ovenfor beskrevne medium i fire forskjellige konsentrasjoner dersom var tilfeldig valgt i området 0,5 til 50 mg/ml. Monosjikt-kulturer ble inkubert med det antineoplaston-fraksjon Al-holdige medium i 96 timer. Cellene ble tellet ved visuell metode ved 24 timers intervaller. Kontroll-kulturer ble dyrket i standard-mediet uten tilsatt antineoplaston-fraksjon Al.

Antineoplaston-fraksjon Al i konsentrasjoner på 5 mg/ml produserer en cytostatisk effekt i slike human bryst-karcinom-kulturer. Den cytostatiske effekt bestemmes som et stabilt antall celler (innen grensene fra 80 % til 120 %) tellet etter 24 timer fra inkuberingen og fortsettes i minst ytterligere

48 timer.

Den cytostatiske konsentrasjon av antineoplaston-fraksjon A2-A5 og antineoplaston A10 og nedbrytningsprodukter ble bestemt på samme måte som beskrevet ovenfor. Den cytostatiske konsentrasjon for hver antineoplaston-fraksjon er som følger:

Over disse konsentrasjoner produserer alle antineoplaston-fraksjoner cytotoksisk effekt i human bryst-karcinom-kulturer.

Forsøk på akutt toksisitet på eksperiment-dyr avslører at antineoplaston-fraksjon Al har meget lav toksisitet. Forsøk omfattende 2 5 sveitsiske HA/ICR-mus injisert intraperitonealt med antineoplaston-fraksjon Al resulterte eksempelvis i en LDj-q på 1,3 5 g/kg. Autopsi og mikroskopiske studier av vevene til dyrene som døde under forsøket avslørte kongestion av leveren og markert lunge-ødem. Dyrene som overlevde ble holdt i 1 uke under nær observasjon og ble notert og ha normal aktivitet. Etter 1 uke ble et valgt antall av musene avlivet. Autopsi og mikroskopisk undersøkelse av vevene til disse dyrene var identisk med de til de uinjiserte kontroll-dyrene.

Undersøkelse av akutt toksisitet omfattende antineoplaston-fraksjonene A2-A5, antineoplaston A10 og nedbrytningsproduktene ble utført på samme måte som beskrevet ovenfor. De respektive LD.-Q for mus for hver fraksjon er som følger:

J. Klinisk vurdering av antineoplaston

Definisjonene av remisjon forbundet med neoplastisk sykdom er som følger: fullstendig remisjon er forsvinnin<q> av all klinisk evidens på sykdom,og delvis remisjon er reduksjon med minst 50 % i summen av produktene av to loddrette diametere av all målbar sykdom som varer minst 4 uker. Pasienter er ansett stabilisert dersom målbar tumor-regressjon opptrer men ikke tilsvarer kriteriene for delvis remisjon.

Human neoplastisk sykdom ble behandlet med forskjellige antineoplaston-fraksjoner. For hver neoplastisk sykdom som er undersøkt, var hver testet antineoplaston-fraksjon, antineoplaston A10 og nedbrytningsprodukt, fenylacetyl-glutamin, og en kombinasjon av fenylacetyl-glutamin og fenyleddiksyre effektive i noen grad for hjelp til regresjon av tumorer. Slik det kunne ventes, oppviste noen fraksjoner eller preparater større effektivitet for noen former av neoplasi enn andre fraksjoner.

Doseringen av den valgte antineoplaston-fraksjon for behandingen av den indikerte neoplastiske tilstand avhenger av alder, vekt og tilstand hos pasienten, den spesielle neoplastiske sykdommen og dens styrkegrad, og administrasjonsmåten. En dose på fra ca. 0,5 til ca, 12 g/m<2>/24 timer eller en total dose på fra ca. 0,9 til ca. 20 g gitt i oppdelte doser på opp til 6 ganger om dagen omfatter det effektive området for behandlingen av de fleste neoplastiske tilstander for hvilket som helst av antineoplaston-fraksjonene A1-A5, antineoplaston A10 og nedbrytningsproduktene.

EKSEMPEL I

Til idag har 14 pasienter med fremskredet kreft blitt behandlet med antineoplaston-fraksjon A2 og fulgt i opp til 1 sr. Den foretrukne administrasjonsmåte for preparatet er intravenøs injeksjon gitt hver tolvte time gjennom et kateter innført i venen under kravebenet. Direkte intrapleurale eller intra-peritionale injeksjoner kan også gis. Den gjennomsnittlige gitte dose var 0,8 5 g/m o og maksimum var 2,2 g/m 2 intravenøst hver tolvte time. Intravenøs behandling med full dose av antineoplaston-f raks jon A2 ble vanligvis gitt inntil det ble oppnådd fullstendig remisjon og så fortsatt i minst 6 uker for å fjerne eventuelt gjenværende mikroskopisk sykdom. Etterpå-ble IV-injeksjonene avbrutt og vedlikeholdsbehandlingen ble startet. Vedlikeholdsbehandlingen besto av IM-injeksjoner på 2 til 3 ml av 50 mg/ml antineoplaston-fraksjon A2 som opprinne-lig ble gitt annen hver dag. Dersom det ikke kom tilbake noe nytt tegn på kreft, ble frekvensen av IM-injeksjoner redusert hver 6-8 uke , avtagende fra en injeksjon hver tredje dag til en injeksjon en gang i uken.

I gruppen på 14 pasienter som ble behandlet med antineoplaston-f raks jon A2, oppnådde fire fullstendig remissjon.

Disse fire tilfeller omfattet udifferensiert stor-celle

karcinom i lungen, trinn III (T3N0M0), dårlig differensiert metastatisk karcinom i leveren med ukjent opprinnelse, og to tilfeller av tilbakekommende transitional celle-karcinom i blæren, grad II. I et ytterligere tilfelle omfattende adenokarcinom i brystet med multiple ben-og lever-metastaser,

trinn IV (TONOW 10SS, HEP) ble det oppnådd en fullstendig remissjon av store lever-metastaser og stabilisering av ben-metastaser. Det var også et annet tilfelle av transitionalt celle-karcinom i blæren, grad II i hvilken det ble oppnådd fullstendig remissjon ved hjelp av antineoplaston-fraksjon A2. I dette tilfelle ble antineoplaston-fraksjon A2 gitt som en vedlikeholdsbehandling etter at fullstendig remissjon var oppnådd med antineoplaston A.

Delvis remissjon ble oppnådd i tre tilfeller: peritoneal mesotheliomal, bryst-karcinom med multiple ben-metastaser,

trinn IV, TONOM10SS, og skjellett celle-karcinom i spiserøret med multiple lunge-metastaser, trinn III, T3N0M1PUL.

Stabilisering av sykdommen ble oppnådd i fire tilfeller som omfattet gliom, trinn IV, adenokarcinom i leveren med multiple lunge-metastaser, bryst-karcinom med multiple ben-metastaser, trinn IV, TONOM10SS og bryst-karcinom med lymfeknute-innbefat-ning, trinn IV, T0N3M0.

Den totale respons-grad på behandling med antineoplaston-fraksjon A2 er 93 % idet bare én pasient (7 %) viste fortsatt progressiv sykdom. Behandlingen tolereres meget godt. Få bi virk-ninger kunne registreres og omfattet stimulering av vekst av epidermis, stimulering av benmargen og meget sjelden feber. Stimulering av vekst av epidermis var tydelig etter 3 ukers behandling i form av raskere vekst av negler og tykkere hud på hånd-flaten. Stimulering av benmargen ble vist som forhøyet tall på hvite blodlegemer og plater. Disse bivirkninger er nyttige i de fleste tilfeller fordi dårlig heling av huden og myelo-undertrykking foreligger hos mange kreftpasienter.

EKSEMPEL II

Følgende sykdomshistorie illustrerer en vellykket be-handlingsmetode ved anvendelse av antineoplaston-fraksjon A3

for behandling av adenokarcinom i prostata med ben-metastase, trinn IV (RONOM10SS, G3).

Behandling av en 72 år gammel hvit mann ble startet med antineoplaston A [se Burzynski et al, Physiol. Chem. Phys. 9:485, 1977) i 3 måneder. Den opprinnelige behandling med antineoplaston A resulterte i stabilisering av sykdommen og en viss tvilsom minskning av størrelsen av metastasene.

Etter 3 måneder ble antineoplaston A avbrutt og pasienten ble startet på antineoplaston-fraksjon A3. Han fikk først injeksjon av 1 ml antineoplaston-fraksjon A2, 100 mg/ml, gitt gjennom et kateter under kravbenet fulgt av 3 ml normal saltløsning og 250 enheter heparin. Dosen ble ytterligere øket opp til 5 ml av samme preparat gitt intravenøst hver tolvte time. Slik be-handlings-regime tilsvarer dosering av 0,47 g/m 2/24 timer. Etter ca. 7 måneder ble frekvensen av injeksjonene minsket til 2 ml antineoplaston-fraksjon A3, 100 mg/ml, gitt intramuskulært hver tredje dag, og endelig etter 4 måneder ble dose-regimet ytterligere minsket til 2 ml av preparatet administrert intramuskulært en gang i uken.

Behandlingen med antineoplaston-fraksjon A3 resulterte i fullstendig remissjon av ben-metastasene fastslått ved ben-undersøkelser. Behandlingen ble meget godt tolerert uten noen synlig bivirkning.

Pasienten fortsetter en vedlikeholdsbehandling med antineoplaston-f raks jon A3, og har ikke vist noen tilbakekomst av sin kanser til nå.

EKSEMPEL III

Fenylacetyl-glutamin i form av dets natriumsalt ble gitt

på to administrasjonsmåter, intravenøst og oralt. Det obser-verte effektive doseringsområde var mellom 1,1 g/m 2'/24 timer til 3,0 g/m<2>/24 timer IV og 0,5 g/m<2>/24 timer til 2,87 g/m<2>/24 timer po. De intravenøse injeksjonene ble vanligvis gitt i oppdelte doser fortrinnsvis hver sjette time. Orale preparater ble gitt i form av 500 mg kapsler hver tolvte eller hver sjette time. Seks pasienter ble behandlet med natriumfenylacetyl-

glutamin. Fullstendig remissjon ble oppnådd i to tilfeller som omfattet skjellet celle-karcinom i strupen, trinn II og udifferensiert karcinom i store celler i lungen med lymfeknute og lever-metastaser, trinn III. Stabilisering av sykdommen ble observert i et tilfelle av adenokarcinom i lungen, trinn III. Progressjon av sykdommen ble notert hos tre pasienter

som led av adenokarcinom i den sigmoide tykktarm med multiple lever-metastaser, trinn IV og adenokarcinom i tykktarmen med flere metastaser, trinn IV og bryst-karcinom med multiple lunge og ben-metastaser, trinn IV. Behandlingen ble vanligvis startet med intravenøse injeksjoner og fortsatte inntil fullstendig remissjon ble oppnådd. Etterpå ble vedlikeholdsbehandling startet ved bruk av det orale preparatet. Oral administrasjon av natriumsaltet av fenylacetyl-glutamin produserte ofte svak irritasjon i maven, som ble mildnet ved samtidig administrasjon av antacide preparater.

EKSEMPEL IV

I kliniske studier omfattende den terapeutiske undersøkelse av fenylacetyl-glutamin og fenyleddiksyre ble en blanding på

1:4 av natriumsaltene valgt som basis-sammensetning. Denne blanding rekonstituert i sterilt, bufret vann ble først administrert intravenøst i et doseringsområde fra 0,24 g/m 2/24 timer til 5,3 g/m 2/24 timer. Den daglige mengde ble vanligvis gitt i oppdelte doser fortrinnsvis hver sjette time. 10 pasienter med forskjellige avanserte neoplastiske tilstander ble behandlet .

Det var bare ett tilfelle i hvilket fullstendig remissjon ble oppnådd, men fenylacetyl-glutamin og fenyleddiksyre ble brukt etter at pasienten hadde fått strålebehandling. Den nyttige effekten av behandling kunne derfor være forårsaket av kombinasjonseffekten fra strålingen og kjemoterapien. Denne pasient led av karcinom i livmorhalsen, trinn IA. Det var fire tilfeller av delvis remissjon oppnådd under behandlingen med blandingen. I tre av disse tilfeller ble det ikke gitt noen annen konvensjonell behandling i tillegg til blandingen. Disse tilfeller omfattet: bryst-karcinom med multiple ben-metastaser, trinn IV, lymfocytisk lymfom, trinn IV, og kronisk myelocytisk leukemi. I et ytterligere tilfelle av lunge-adenokarcinom med multiple hjerne-metastaser, trinn III ble behandlingen med fenyl-acetyl-glutamin og fenyleddiksyre-blanding gitt etter stråle-terapi. Stabilisering av sykdommen ble sett i tre tilfeller som omfattet karcinom i sigmoid tykktarm med multiple lever-metastaser, trinn IV, gliom (primær malign hjerne-tumor) og karcinom i strupen med multiple lunge-metastaser, trinn IV.

Anvendelse av de beskrevne antineoplaston-fraksjoner Al-

A5, antineoplaston A10, fenylacetyl-glutamin og en kombinasjon

av fenylacetyl-glutamin og fenyleddiksyre har hatt suksess i regresjon av tumorer forbundet med human kreft i spiserøret, brystkreft, blærekreft, tykktarmkreft, udifferensiert karcinom i store celler i lungen, mesotheliom, adenokracinom og skjellet celle-karcinom i lungen, havrecelle-karcinom, hjernemetastaser, ben-metastaser, lungemetastaser, prostatakreft, pankreakreft, lymfatisk lymfom, livmorhalskreft, primær malign hjernetumor.

Videre er hver av antineoplaston-fraksjonene A1-A5, antinoeplaston A10, fenylacetyl-glutamin og kombinasjonene av fenyl-acetyl-glutamin og fenyleddiksyre anvendbare ved behanding av andre former av neoplastisk sykdom omfattende myelocytisk leukemi, kreft i strupen, kreft i livmoren, lymfom, kreft i tykktarmen og sigmoid.

Den forangående beskrivelse av oppfinnelsen er rettet mot spesielle eksempler for ekstraksjon av antineoplastiske peptid-fraksjoner fra human urin for forklarings- og illustrasjonsformål. ■ Skal imidlertid forståes at mange modifikasjoner og forandringer

i produktsammensetninger, fremgangsmåtene for ekstrahering av antineoplaston-fraksjonene, syntesen av antineoplaston A10 og metodene for anvendelsene av de samme kan utføres for innføring og anvendelse av foreliggende oppfinnelse uten å avvike fra innen oppfinnelsens område som er definert i kravene. For eksempel antas det at peptider med antineoplastisk aktivitet kan ekstraheres fra andre kilder enn urin, som for eksempel blod, spytt,organer, eller vevprøver. Det skal forståes at søkeren har rettet sine fraksjoneringsfremgangsmåter mot urin basert på den økonomiske muligheten for å oppnå et stort volum av væsken som er nødvendig for å oppnå brukbare mengder av den antineoplaston-fraksjonen som normalt foreligger i slike væsker i meget lave konsentrasjoner. Det vil imidlertid forståes av fagmannen at andre vev-væsker eller vev-prøver også inneholder små mengder

av peptider som oppviser antineoplastisk aktivitet, og at slike peptider kan ekstraheres ved modifikasjon av de fremgangsmåter som er beskrevet her.

Claims (4)

1. Fremgangsmåte ved ekstrahering av en peptidfraksjon inneholdende peptider med 2 til 9 aminosyrerester og forbindelsen 3-[N-fenylacetylaminopiperidin]-2,6-dion fra urin, karakterisert ved at det fra et urinvolum utskilles partikkelformet materiale og materiale med en større molekylvekt enn ca. 5000; urinen surgjøres til pH 2 til 3; alt utfelt materiale skilles fra den surgjorte urin; den surgjorte urin innføres i en HPLC (high performance liguid chromatography)-kolonne med C-18-bundet-fase silikagel; og den cytostatisk aktive peptidfraksjon utvinnes, hvilken peptidfraksjon inneholder forbindelsen 3-[N-fenylacetyl- aminopiperidin] -2,6-dion.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at urinen surgjøres til pH Cd. • 2 f 5 •

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at forbindelsen 3-[N-fenylacetylaminopiperidin]-2,6-dion fra peptidfraksjonen renses videre ved en andre HPLC-operasjon.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 3, karakterisert ved at den andre HPLC-operasjonen utføres på sulfonert polystyren kolonne for aminosyrer eller et ekvivalent system.