NO154193B - Fremgangsmùte for fremstilling av monohydratisert picotami d - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte for fremstilling av monohydratisert N,N'-bis(3-picolyl)-4-metoksy-isoftalamin (picotamid) i krystallinsk form med formel

hvor 4-metoksy-isoftaloyl-diklorid omsettes med 3-picolylamin i tetrahydrofuran i nærvær av trietylamin som protonakseptor,

og det karakteristiske ved fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen er

a) at det anvendes vannfritt tetrahydrofuran,

b) at reaksjonsproduktet utfelles med vann,

c) at reaksjonsproduktet fra trinn b krystalliseres fra en

oppløsning av aceton/vann (volum-forhold 6:11) og

d) at produktet fra trinn c omkrystalliseres fra vann.

Picotamid i monohydratisert krystallform er farmasøytisk aktiv

ved at den motvirker aggregasjon av blodplater, motvirker tromboemboliske forstyrrelser i blodet og forsinker blodlev-

r ing.

Det er vel kjent at N,N<1->bis-(3-picolyl)-4-metoksy-isoftalamid

i det følgende benevnt med den vanlige internasjonale beteg-

nelse "picotamid" er en forbindelse med en høy fibrinolytisk og anti-koagulerende aktivitet, se fransk patentskrift 2.100.

850, videre Chimie Thérapeutique 6, 203-207, 1971, såvel som en god anti-aggregerende virkning for blodplater, se US-

patentskrift 3.973.026 samt Age andAgeing, 7, 246, 1978.

Picotamid som beskrevet i de ovennevnte publikasjoner er

kjent i den vannfri form og smeltepunktet er 124°C bestemt i

Kofler-benk, som beskrevet i fransk patentskrift 2.100.850.

Denne forbindelse blir i henhold til den fremgangsmåte som er beskrevet i ovennevnte patentskrifter, renset fra råproduktet som inneholder en mengde forurensninger, ved krystallisasjon fra vannfrie og apolare organiske løsningsmidler.

Krystallisasjon av det rå picotamid som er oppnådd ved syntese-reaksjonen, fra vannfrie og apolare organiske løs-ningsmidler som f.eks. benzen, resulterer i et pulverprodukt som under et mikroskop viser trekkene av en fibrøs substans, med karakter av voluminøs dun. Pulveret opptar lett en elek-trostatisk ladning og er forholdsvis ustabil. Disse egenskaper er spesielt uheldige når forbindelsen fremstilles for farmasøytisk bruk. De elektrifiserte partikler frastøter hverandre og har tendens til flyktighet når de veies og inn-føres i apparaturen for fremstilling av de forskjellige farma-søytiske preparater, og dette resulterer i en variasjon av partikkelvekten som gjør fremstillingen av bestemte og stabile doser vanskelig.

Den erkjennelse som ligger til grunn for den foreliggende oppfinnelse er at ved reaksjon mellom et funksjonelt derivat av

4-metoksy-isoftalsyre og 3-picolylamin, og ved krystallisering av råproduktet fra en vandig løsning, oppnås mono-hydratisert N,N'-bis-(3-picolyl)-4-metoksy-isoftalamid med egenskaper for kjemisk-fysikalsk struktur og stabilitet som gjør denne forbindelse avgjort foretrukket fremfor vannfrie picotamid-produkter som tidligere er kjent.

Det er også overraskende funnet at det således oppnådde monohydratiserte picotamid er mer aktivt og effektivt enn vannfritt picotamid, både fra et farmako-dynamisk synspunkt og med hensyn til klinisk farmakologi.

Den fremstilte monohydratiserte N,N'-bis-(3-picolyl)-4-metoksy-isoftalami<d><C>2i<H>20<N>4°3"<H>2° harmolekvlvekt 394,4, og den kjemiske struktur-formel kan indikeres som følger:

Det monohydratiserte picotamid fremstilt ved fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen er et hvitt, luktfritt, bittert smakende krystallinsk pulver som er stabilt i luft og lett krystalliseres fra vann, med et smeltepunkt på 95°C-97°C bestemt i Kofler-benk.

For enkelthets skyld skal den overfor definerte forbindelse i den etterfølgende beskrivelse benevnes med den genrelle be-tegnelse "monohydratisert picotamid".

Fra et fysikalsk-kjemisk synspunkt er den nye forbindelse forskjellig fra den tidligere vel-kjente forbindelse med hensyn til en uventet og avgjort forbedring i stabiliteten. Forbedringen skyldes det forhold at molekylet av hydratvann deltar i molekylstrukturen av den nye forbindelse, og er anbragt i krystallgitteret i en vel definert posisjon hvori oksygenatomet i hydratvannet etablerer godt identifiser-bare hydrogenbindinger med spesielle atomer som hører til forskjellige molekyler av picotamid, som det skal påvises i det følgende, slik at det bygges opp et én-krystall av forbindelsen med godt definerte egenskaper. Disse egenskaper påvirker på en overraskende måte den farmasøytiske opptreden av den nye forbindelsen og dens bio-disponerbarhet i patte- dyrorganismer, med en hurtigere absorpsjon når den tilføres til den nevnte klasse av dyr og mennesker.

Monohydratisert picotamid i den nye krystallinske

form unngår ikke bare på en overraskende måte de ovennevnte ulemper med den vannfri picotamid, men er på en overraskende måte mer aktiv og effektiv med hensyn til farmakologisk virkning, på bakgrunn av de fordelaktige virkninger som iakttas ved tilførsel til dyr og mennesker.

Selv om en begrunnet teoretisk forklaring på det nevnte forsøksresultat ikke kan fremsettes foreløpig, kan det

dog antas at oppløsningen i vann av den nye krystallinske forbindelse foregår med en annen mekanisme sammenlignet med den oppløsning som foregår i vann av den velkjente vannfri forbindelse i dens amorfe form.

Den nye forbindelse kan inkluderes i farmasøytiske preparater i de vanlige farmasøytiske former, for klinisk behandling av tromboemboliske•blodforstyrrelser.

Som tidligere angitt er smeltepunktet av monohydratisert

o o

picotamid 95 C-97 C.

I denne forbindelse påpekes at vannfritt picotamid har

et smeltepunkt på 124°C. Denne forskjell i smeltepunktene for de to forbindelser er allerede en indikasjon på den forskjellige molekylstruktur, noe som indikerer en vesentlig forskjell mellom strukturen av vannfritt picotamid og monohydratisert picotamid.

Oppfinnelsen skal beskrives mer detaljert med henvisning til de vedføyde tegninger, hvori: Fig. 1 er en tredimensjonal skisse av molekylet av monohydratisert picotamid, oppnådd fra røntgen-

spektrum

Fig. 2 er en tredimensjonal skisse av monokrys.tallen av monohydratisert picotamid Fig. 3 viser mer detaljert den samme monokrystall som er vist i fig. 2, og Fig. 4 er et skjema.som viser en direkte sammenligning mellom blodplate- anti-aggregasjonsaktiviteten av monohydratisert picotamid og vannfritt picotamid.

Strukturen av en krystall av monohydratisert picotamid

er ved siden av den fysikalske og kjemiske analyse ogsåkarakterisert vedhjelp av røntgenspektrumet av dets monokrystall.

Data fra røntgen-diffraksjonsspektrumet, sem viser den romlige posisjon av atom-sentrene i det nye molekyl,

tatt i sin helhet som en kompakt, stabil og ikke hygro-skopisk krystall, er gjengitt i den etterfølgende tabell I, hvori de forskjellige atomer i molekylet er angitt med deres kjemiske symbol etterfulgt av et identifikasjons-tall. Den romlige anbringelse og identifikasjonstallet

for de nevnte atomer kan iakttas i fig. 1 som representerer den geometriske, tredimensjonale posisjon av atom-sentrene, som oppnådd fra tabell, I.

Bindinger (Inklusive symmetrisk relaterte atomer)

Det kan spesielt iakttas at atom nr. 17, indikert

som 027, representerer hydratvannet, mens atom nr. 8 indikert som 09 representerer et oksygen i metoksygruppen, atom nr. 15 indikert som N19 er et nitrogenatom i amidgruppen og atom nr.21 indikert som N2 24

er et nitrogenatom i pyridin-gruppen.

I tabell I representerer symbolene X/A, Y/B og Z/C

de romlige koordinater for de forskjellige atomer.

Som det kan ses fra fig. 1, som viser strukturen av monohydratisert picotamid, er oksygenatomet i hydratvannet anbragt i krystallgitteret i en godt definert posisjon i forhold til picotamid-molekylet.

I fig. 2 kan det ses at oksygenet i hydratvannet inne

i monokrystallen representert av et rektangel, er knyttet med hydrogenbindinger (indikert med prikket linje) til godt bestemte atomer av forskjellige picot-amidmolekyler, idet disse molekyler befinner seg i et regelmessig tredimensjonalt mønster og er knyttet system-atisk sammen ved hjelp av de nevnte hydrogenbindinger med hydratvann-oksygenet.

Den nevnte binding er vist mer detaljert i fig. 3 hvorav det klart ses at oksygen 027 i hydratvannet er knyttet med hydrogenbindinger til henholdsvis:

1) Oksygenet i =C0 i metoksygruppen (Og) i et første picotamid-raolekyl (bindingslengde: 2,81 Å)2) Nitrogenet i amidgruppen =NH (N^:g) i et annet picotamid-molekyl anbragt i det samme plan som det ovennevnte molekyl (lengde av binding: '2,96 Å) 3) Nitrogenet i pyridin-ringen (N224^ av et tre^je picotamidmolekyl anbragt på det underliggende eller overliggende plan i forhold til de to andre bundne molekyler (bindingslengde 2,80 A)

Nærværet av de nevnte tre bindinger gir en forklaring

både på den styrke hvormed krystallvannet er innført mellom forskjellige picotamid-molekyler som danner krystallen, og kompaktheten av selve krystallen. Denne kompakthet, som tilveiebringes av molekylet av krystallvann, antas å være grunnen til forbedringen i.bio-disponerbarheten av monohydratformen i forhold til den tidligere kjente vannfri form, og denne forbedring skal vises i det følgende fra det farmakologiske synspunkt,

ved en sammenligning av absorpsjonstid, blodnivåverdier og aktiviteter av begge forbindelser.

Pga. den kunnskap som er tilgjengelig fra teknikkens stand med hensyn til det vannfri picotamid-molekyl,

kunne noen forbedret virkning, som skyldes inn-

føring av et krystallvann-molekyl, på kompaktheten av romstrukturen av picotamidet såvel som en forbedring i merkbar grad av bio-disponerbarheten klart ikke forut-sees. Elementæranalyse har tilveiebragt resultater i samsvar med den ovennevnte illustrerte struktur.

For C21H2()N403.H20 (molekylvekt 394 ,4) er det funnet:

C% 63,87 (teoretisk 63,94)> H% 5,72 (teoretisk 5,62);

N%14,18 (teoretisk 14,20) og oksygen som differanse.

Fremgangsmåten for fremstillingen av det nye monohydrat-

i

picotamidmolekyl følger hva angår syntesen, den allerede kjente fremgangsmåte for fremstilling av vannfritt picotamid.

Når det rå picotamid er oppnådd, er det overraskende funnet at ved å omkrystallisere råproduktet fra en vandig blanding, i motsetning til en vannfri blanding som i den tidligere kjente prosess, oppnås det krystallinske monohydratprodukt som tidligere definert.

De følgende eksempler illustrerer fremgangsmåten for syntese av det monohydratiserte picotamid, ved å gå ut fra 4-metoksyisoftaloyl-diklorid i en omgivelse av proton-akseptorer.

Eksempel på fremstilling.

3- picolylamin, trietylamin og 120 ml vannfritt tetrahydrofuran innføres i en 3 liters kolbe utstyrt med tilbake-løpskjøler, dråpetrakt og mekanisk røreverk.

4- metoksy-isoftaloyl diklorid oppløses separat i 200 ml vannfritt tetrahydrofuran.

Denne oppløsning innføres sakte gjennom dråpetrakten

i reaksjonsblandingen inneholdt i kolben under omrøring. Tilsetningen foretas i løpet av halvannen til to timer hvorved det foregår en eksotermisk reaksjon under avgivelse av 2 mol HC1.

Etter den nevnte diklorid-tilsetning kokes reaksjonsblandingen under tilbakeløp i omtrent to timer, for-tynnes sakte med vann til to liter og holdes under omrøring inntil separering av en krystallinsk tykk dispersjon som består av det rå picotamid.

Den nevnte dispersjon avsuges på filter og krystalliseres uten tørking fra 700-800 ml aceton-vannblanding (6 volum aceton + 11 volum vann).

Det oppnådde produkt omkrystalliseres fra vann og gir monohydratisert picotamid med smeltepunkt 95°C-97°C

på Kofler-benk. Omkrystallisering av det rå picotamid som oppnådd fra syntese-reaksjonen, gjennomføres således ved hjelp av et vannholdig løsningsmiddel, i motsetning til den tidligere kjente teknikk hvori vannfri og apolare organiske løsningsmidler ble anvendt, som f.eks. benzen, som ga et vannfritt produkt.

Farmakologiske tester

Det er funnet at monohydratisert picotamid viser en

høy aktivitet som blodplate-aggregasjons - og fibrinolytisk middel. Det har følgelig anvendelse innen klinisk farmakologi og human-terapi.

Ds nevnte aktiviteter ble testet in vivo ved spektro-fotometrisk bestemmelse i henhold til Born, for blodplate anti-aggregasjonsaktiviteten og ved tester med blodpropp-lysis in toto i henhold til Fearnley, for den fibrinolytiske aktivitet.

E ksempel 1:

Blodplate-antiaggregasjonsaktivitet in vivo ved

kaninforsøk.

New Zealand kaniner som var blitt holdt fastende i

12 timer med vann ad libitum ble bedøvet med en 20% etyl-alkohol-løsrurg av uretån i en dose på 0,6 ml/

100 g intraperitonealt. Blodet ble trukket ut fra karotidalarterien før (kontroll) og en og en halv time etter den intraperitoneale injeksjon av monohydratisert picotamid, i en dose på 25-50-100 mg/kg. Blodprøvene ble tilsatt et antikogulasjonsmiddel, som var en 3,8% oppløsning avnatriun-citrat i volumforholdet 9/1 og deretter sentrifugert med 1000 omdreininger pr. minutt i 15 minutter for oppnåelse av et blodplaterikt plasma (PRP) . En del av dette plasma ble deretter sentrifugert med 8000 omdreininger pr. minutt i 10 minutter for oppnåelse av et blodplatefattig plasma (PPP).

PPP ble anvendt for 0-innstilling av et Born aggregometer

og 1 ml PRP ble anbragt i beholderen i måleapparatet.

En blodplateaggregasjon ble frembragt ved varierbare konsentrasjoner av di-natrium-adenosin-difosfat (ADP) avhengig av blodplatereaktiviteten.

Blodplate-antiaggregasjonsaktiviteten ble beregnet som

50% inhibering av aggregasjonskurven etter behandling,

i forhold til kontrollen (ID ).

50

Resultatene er referert i det følgende.

Eksempel 2:

Virkningen av tiden på blodplateaggregasjonen og blod-nivået i hunder.

Monohydratisert picotamid i en dose på 100 mg/kg

ble tilført oralt til Beagle-hannhander som var u holdt uten mat i 18 timer med vann ad libitum.

Blod ble tatt før (kontroll) og henholdsvis 2/4,6,8,10

timer etter behandling,og som funksjon av tiden ble blodplate-aggregasjonsaktiviteten (ved hjelp av den ovennevnte metode) såvel som blodnivåer av forbindelsen bestemt.

En bestemmelse av blodnivåene ble gjennomført ved

hjelp av et UV-spektrofotometer i henhold til følgende metode: 5 ml plasma oppnådd ved sentrifugering ved 100 omdreininger pr. minutt i 10 minutter, ble tilsatt 2 ml konsentrert HC1 og hydrolysert på et vannbad ved 100°C

i 1 time. Det ble avkjølt, tilsatt 2 ml H20 og filtrert. Filtratet ble gjort sterkt alkalisk ved hjelp av NH^OH

og ekstrahert med 30 ml CHCl^. Kloroformsjiktet, tørket over vannfritt Na-jSO^, ble ekstrahert med 0,1 N ^SO^

og det således oppnådde sure lag ble tilsatt CINF^SC^

til 100 ml og spektrofotometret ble avlest ved 228 nm. Resultatene er gjengitt i det følgende.

Eksempel 3

Fibrinolytisk aktivitet in vivo i marsvin.

Den fibrinolytiske aktivitet ble bestemt med italienske marsvin og deretter ble monohydratisert picotamid til-

ført oralt i en dose på 100 mg/kg.

Fearnley-metoden, modifisert som følger, ble anvendt

for denne test:

I reagensrør holdt ved 0°C ble 1,7 ml fosfatbuffer

(pH 7,4) og 0,1 ml av en trombin-løsning med 50 NIH/ml tilført. Etter en tilsetning på 0,2 ml marsvinblod in toto ble rørene holdt ved 0°C i 30 minutter for å tillate levring og deretter holdt på vannbad ved 37°C

i 30 minutter for å frembringe en lysis.Vekten av koagelet ble så bestemt.

Den fibrinolytiske aktivitet er beregnet som % nedsettelse av koageivekten av de behandlede dyr, i forhold til koagelvekten av kontroller.

Eksempel 4

Blodplate-antiaggregasjons- og fibrinolytisk aktivitet

på frivillige forsøkspersoner.

En bekreftelse av begge aktiviteter in vivo for mono-hydratisert picotamid ble oppnådd med friske forsøks-personer av begge kjønn i alderen 35-65 år, som ble behandlet oralt med en enkel dose på 12 mg/kg. Den inhiberende virkning på blodplateaggregasjonen ble testet ved anvendelse av di natrium ADP som en antagonist, ved å følge samme metode som i eksempel 1.

Den fibrinolytiske aktivitet ble bedømt ved å bestemme lysis-tiden for euglobiner.

De oppnådde resultater er anført i det følgende.

RESULTATER

Fra de resultater som ble oppnådd i testen med blodplate-antiaggregasjonsaktivitet in vivo med kaniner (eksempel I) ved probit analyse av dosen som er istand til å inhibere blodplateaggregasjonen med 50% (ID^q) ble bedømt og denne dose var 54,10±1.43 mg/kg.

En maksimal effekt (53,82%) i hunder (eksempel 2)

ble funnet ved den fjerde time. Det tilsvarende blodnivå var 22,6 y/ ml plasma og tilsvarende en maksimal verdi som vist i diagrammet i fig. 4.

Den fibrinolytiske aktivitet i marsvin (eksempel 3) testet i en dose på 100 mg/kg oralt ble funnet å

være 27,83%.

I mennesker (eksempel 4) i en enkel dose på 12-mg/kg tilført oralt, ble maksimal blodplateaggregasjons-virkning påvist 4 timer etter behandling og målt som 81,4%. Den maksimale fibrinolytiske aktivitet ble målt som 54,2% nedsettelse av lysis-tiden av euglobiner.

Sammenligningskommentarer:

Ved å sammenligne aktivitet- og giftighets-resultater for monohydratisert picotamid med de tilsvarende for

vannfritt picotamid, som er beskrevet i US-patentskrift 3.973.026, kan det konkluderes at vesentlige forskjeller foreligger i aktivitet og disse forskjeller er gunstige for monohydratformen, noe som visselig ikke kunne forut-ses på basis av en enkel innføring av et krystallvann-molekyl som karakteriserer den nye forbindelse.

i

For sammenligning ble det gjennomført en test med hensyn til tidseffekt og blodnivåer i hunder, ved oral tilførsel, og under de samme forsøksbetingelser, med det tidligere kjente vannfri picotamid for å teste den biologiske tilgjengelighet derav etter tilførsel.

Resultatene av denne test er gjengitt i diagrammet i

fig. 4 som representerer tidsvirkningen på blodplate-aggregas j onen og på blodnivåer i hunder i en dose på

100 mg/oz.

Ordinataksen representerer tiden i timer og abcisse-

aksen representerer blodnivåene målt i y/ml plasma,

såvel som blodplate-antiaggregasjonsaktiviteten målt i<%>.

Linjen 1 og 1' representerer anti-aggregasjonsaktiviteten

av monohydratisert picotamid henhv. av vannfritt picotamid og de kontinuerlige linjer 2 og 2<1>representerer blod-

nivåer av monohydratisert picotamid henhv. vannfritt picotamid.

Ut fra en betraktning av de resultatene som fremgår av diagrammet fremgår det klart at vannfritt picotamid har en maksimal-antiaggregasjonseffekt etter 8 timer som er lik 49% mens det maksimale blodnivå er 19,75 y/ ml som er forskjøvet til den 6. time.

Til sammenligning viser monohydratisert picotamid maksimal blodplate-antiaggregasjonseffekt etter 4 timer og videre faller den maksimale aktivitetstopp i tid sammen med den maksimale topp for blodnivåer og dette viser en hurtigere bio-disponerbarhet i favør av monohydratisert picotamid

i forhold til vannfritt picotamid.

Resultatene av de farmakologiske tester gjennomført med monohydratisert picotamid er gjengitt i den følgende tabell II hvor data for den samme test med vannfritt picotamid også er oppført.

En sammenligning av testverdiene vist i tabell II for

de to molekyler viser at monohydratisert picotamid har forbedrede farmakologiske virkninger i forhold til vannfritt picotamid. En slik uventet forbedring kan tilskrives den forbedrede bio-disponerbarhet av den nye forbindelse i sin form av monohydratkrystall med stabil struktur.

Terapeutiske anvendelser

Monohydratisert picotamid kan pga. sin lave giftighet,

høye tålbarhet og fravær av ugunstige bivirkninger,

anvendes i human-terapien for behandling av forskjellige trombo-emboliske forstyrrelser, spesielt cerebrovaskulære forstyrrelser, myokardial infarkt, arterie- og flebo-tromboser, pulmonær emboli, generelle arteriosklerotiske forhold, generell kardio-kirurgi..

For de nevnte anveldelser kan forskjellige farmasøytiske former anvendes inneholdende fra 10-500 mg aktivt middel, f.eks. som følger: a) Oralt: kapsler, tabletter, piller inneholdende 10-500 mg, for en daglig dose på 50-3000 mg/døgn. b) Parenteralt: steriliserte endovenøse injiserbare ampuller, inneholdende 10-50 mg, for en daglig

dose på 10-200 mg/døgn.

Forbindelsene kan også tilføres rektalt i form av stikkpiller.

De farmasøytiske preparater kan inneholde vanlige farmasøytisk tålbare bærere og tilsetningsmidler og tilførselsformene for det monohydratiserte picotamid og de respektive doseringsmønstre kan variere i samsvar med kliniske forhold og legens bedømmelse.

Claims (1)

1. Fremgangsmåte for fremstilling av monohydratisert N,N'-bis-(3-picolyl)-4-metoksy-isoftalamin (picotamid) i krystallinsk form med formel

   hvor 4-metoksy-isoftaloyl-diklorid omsettes med 3-picolylamin i tetrahydrofuran i nærvær av trietylamin som protonakseptor,karakterisert veda) at det anvendes vannfritt tetrahydrofuran, b) at reaksjonsproduktet utfelles med vann, c) at reaksjonsproduktet fra trinn b krystalliseres fra en oppløsning av aceton/vann (volumforhold 6:11) og d) at produktet fra trinn c omkrystalliseres fra vann.