NO149879B - Fremgangsmaate og anordning til reduksjon av konsentrasjonen av vanndamp i en gassblanding - Google Patents

Description

Fremgangsmåte for fremstilling av lysergsyre- og isolysergsyre-amid ved dyrking av en stamme av arten Claviceps paspali Stevens et Hall.

Foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte for fremstilling

av lysergsyre- og isolysergsyre-amid ved hjelp av en ny stamme av Claviceps paspali Stevens et Hall. Forskjellige stammer av denne soppart har vært kjent i lang tid, men først i det aller siste er det lykkes å bevirke at en bestemt stamme av denne soppart ved spesielle kunstgrep produserer alkaloidaktige derivater av lysergsyre. Det nevnte kunstgrep besto i at sopp-stammen først ble "aktivert ved overpoding på gress-spirer. Senere har en annen forskergruppe funnet ut at dette kunstgrep kan unngås under bestemte betingelser,

hvorved de således oppnådde utbytter av lysergsyre dog ble temmelig små, noe som gjorde den tekniske gjennomføring av fremgangsmåten meget vanskelig. Hittil har det imidlertid ikke lykkes å finne eller å dyrke en stamme av Claviceps paspali Stevens et Hall som var i stand til å danne konidier in vitro.

Nå er det imidlertid av stor betydning ved utføring av mikro-biologiske prosesser i teknisk målestokk om den angjeldende sopp danner konidier eller ikke. Vgd hjelp av konidier er det nemlig mulig å foreta enkeltsporeisoleringer og derved nå frem til genetisk enhetlig material. Av konidier lar det seg dessuten meget lettere gjøre å frembringe og isolere mutanter ved røntgen- og ultrafiolett bestråling, samt med kjemikalier, enn av sterilt mycel. Dessuten kan blomstrende paspalumplanter infiseres med konidier og på denne måte kan det på den naturlige vert frembringes sklerotier som egner seg utmerket til konservering av stammen. Av dette holdbare material kan man f.eks. til en hver tid utvinne friskt podestoff når in-vitro-kulturene degenereres etter gjentatte passasjer. Konidier kan også lyofiliseres eller lagres ubegrenset etter frysetørring, hvilket likeledes muliggjør konservering av stammen. Endelig egner en konidiesuspensjon seg best til poding av en næringsløsning fordi podemengden dermed kan doseres best og fordi det derved er lettest å arbeide sterilt. Et sterilt mycel må derimot først homogeniseres i et blandeapparat.

Selvom det hittil ikke er beskrevet noen stamme av Claviceps paspali Stevens et Hall som er istand til å danne konidier, og enda det i litteraturen stadig er blitt understreket at det ved disse stammer hittil aldri er blitt observert konidier, lyktes det helt over-raskende å finne en ny stamme av Claviceps paspali Stevens et Hall på Ny-Guinea og som vokste i form av sklerotier på Paspalum dilatatum Poir., og som dannet konidier under bestemte betingelser. Prøver av disse sopper ble deponert i United States Department of Agriculture (Northern Utilization Research and Development Division), Peoria, 111., og ble der gitt nummeret NRRL 3027.

Oppfinnelsen angår således en fremgangsmåte for fremstilling av lysergsyre- og isolysergsyreamid ved dyrking av en stamme av arten

Claviceps paspali Stevens et Hall i et dyrkingsmedium som inneholder assimilerbare kilder for karbon, nitrogen og uorganiske salter, og isolering fra dyrkingsfiltratet av den blanding av forbindelser av ergolintypen som overveiende inneholder lysergsyreamid og isolysergsyreamid, og det særegne ved fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen er at man anvender stammen NRRL 3027 som er i stand til å danne konidier in vitro.

I motsetning til de hittil beskrevne stammer av Claviceps paspali Stevens et Hall er sklerotiene av stammen NRRL 3027 alkaloidholdige.. Alkaloidinnholdet i disse sklerotieprøver utgjorde 0,04$ og besto

av følgende stoffer:

Alkaloidblandingen ble analysert ved hjelp av papirkromatografi

og den prosentvise andel av de enkelte komponenter bestemt ut fra farveflekkintensiteten.

Av de kjente stammer av Claviceps paspali er de som er deponert i The American Type Culture Collection under ATCC nr. 13892, 13893, 13894 og 13895 også i stand til å danne lysergsyre- og isolysergsyre-amider. Disse stammer adskiller seg imidlertid på flere punkter fra stammen NRRL 3027. Som sistnevnte danner de således ikke ergobasin, ergobasinin og chanoclavin. Ennvidere er der den forskjell, at stammen NRRL 3027 vokser på gressarten Paspalum dilatatum, mens de overfor nevnte stammer skriver seg fra gressarten Paspalum distichum. Det skal i denne forbindelse henvises til V. Grosso: "Le Claviceps deile. Graminacee Italiane", side 66, 67 og 68, hvor det er beskrevet, hvilke forskjeller som oppstår for soppen Claviceps paspali ved anvendelse av forskjellige vertsplanter. Forskjellen ligger ikke bare i soppens sklerotiestørrelse (middel-verdi 2,8 x 3,2 mm på Paspalum dilatatum og 3,4 x 3,2 mm på Paspalum distichum), men også i sklerotienes spiringstid, som er hohholdsvis 65 og 85 dager i de to tilfeller.

Av det ovenstående fremgår det, at stammen NRRL 3027 og de nevnte kjente stammer er forskjellige i fysiologisk henseende. I morfolo-gisk henseende består der den for den foreliggende oppfinnelse meget vesentlige forskjell, at kun stammen NRRL 3027 er i stand til i saprofytisk kultur å danne konidier. Hos stammene ATCC nr. 13892, 13893, 13894, og 13895 er der aldri iakttatt konidier og heller ikke klamydosporer.

Til ytterligere belysning av de morfologiske forskjeller mellom stammen NRRL 3027 og de nevnte kjente stammer dyrkes den førstnevnte stamme på potet-glucose-agar. Derved oppstår der etter 12 dagers dyrking ved 27°C sirkelrunde, glattkantede kolonier på 0,8-1,5 cm i diameter med et øvre lag av hiitt, vattaktig luftmycel. Lette luftmycels hyfer har en diameter på 5-8 ji, og innsnevringene ligger 20-100 u fra hverandre. Det nedre, på agaren liggende mycellag består av tykkveggede, vakuoliserte, tettpakkede sylindriske celler med 3,5-7 u diameter og 15-20 y. lange. Disse celler utskiller et farvestoff, som farger den omgivende agar mørkebrun. Ved rissing av kulturen iakttas der imidlertid ingen fargeendring. De på mås-støpagar dannede konidier er 12,4 - 3,5 u lange og 5,3 - 1,5 y. brede. Tverrsnittsformen av disse konidier er elliptisk. Herav fremgår tydelig forskjellen mellom stammen NRRL 3027 og stammene ATCC nr. 13892, 13893, 13894.og 13895, hvilke siste ved tilsvarende dyrking på potet-glucose-agar danner runde kolonier på 1,5-3,0 cm i diameter, som består av et gråhvitt luftmycel, hvis hyfer har en diameter på 3,4 u og innsnøringer i en avstand av 20-50 fra hverandre,

og et vegetativt mycel, hvis celler har en polygonal form med en diameter på 3-4 x 10-15 ji. Ved rissing av kulturen fås her en lyserød farge eller kjøttfarge.

Isoleringen og formeringen av den nye soppstamme foregår på

følgende måte:

Fra det indre av et sklerotium tas det sterilt ut et lite vevstykke som overføres til vørter-agar. (Sammensetning: 250 ml uhumlet lys vørter (tørrsubstans 17$), 18 g agar-agar, destillert vann ad 1 liter (pH 5,2)). Det utvikler seg en sirkelrund koloni som etter 14 dager ved 24°C når en diameter på 15 mm. Den består av en ca. 1 mm tykk hud av pseudosklerotisk sturktur som er dekket med et polster av hvitt luftmycel som ligger oppå agaren. Et brunt fargestoff diffunderer inn i agaren. Det dannes ingen konidier. Denne koloni blir delt opp i stykker ved hjelp av en spatel og overført til reagensglass med 12 cm av følgende agar-næringsstoff:

Rundt hvert podestykke danner det seg en liten koloni av først hvitt, senere rødbrunt, mycel. Etter 10 dager begynner det å avsnøres konidier på hyfespissene. Etter 20 dager er det tilstede tilstrek-kelig konidier til å fremstille en vandig suspensjon som kan benyttes til poding av 20 skrå-agar-rør (samme agar som ovenfor). Disere kulturer inkuberes ved 24°C. Konidiene spirer etter 24-36 timer. Etter 6 dager er agaroverflaten jevnt overtrukket med et fint hvitt mycel, og etter 10 dager er det dannet et brungrått, smårynket mycelbelegg som ligger tett inntil agaren og som bare har korte lufthyfer. På disse avsnøres konidier. Etter 12 dager dannes det på flere steder i mycelet sentra hvor det utskilles små dråper av en rødbrun væske. Dråpene når en diameter på 1-3 mm og blir snart uklare og melkehvite av meget tallrike konidier.. Etter 16-18 dager er konidiedannelsen praktisk talt avsluttet. En skrå-agarkultur i et reagensglass med diameter på 2 cm som inneholder 12 ml agar-neringsstoff, inneholder ca 10 q konidier.

Por submers dyrking blir det først fremstillet en forkultur på følgende måte:

En 4,5$ vandig maltekstraktløsning med pH 5,4 benyttes som medium.

1 liter av denne løsning steriliseres ved 110°C i en 2 liter Erlenmeyerkolbe i 20 minutter, og podes deretter med 5 x 10 konidier av en 20 dager gammel agarkultur av den nye stamme og inkuberes 3 døgn på en roterende rystemaskin ved 23°C. Det oppstår en tett kultur av fine mycelfnokker. Fnokkene består av et løst nøste av hyfer og har en diameter på 2-4 mm. I disse er det ikke mulig å påvise alkaloider. Til fremstilling av større mengder for-kultur blir gjæringskar av glass som hvert inneholder 10 liter av det samme medium podet med 5 x 10 q konidier og inkubert 3 dager ved 23 oC under lufting med 6 liter luft pr. minutt og under uaring med 200 omdreininger pr. minutt. Som antiskummiddel benyttes en silicon-emulsjon. De derved oppnådde kulturer er av samme beskaffenhet som rystekulturene. Som næringsløsning for hovedkulturen viste seg den følgende, som pr. liter destillert vann inneholdt:

og som var blitt innstillet til pH 5,4 med NH^OH, å være særlig hensiktsmessig.

Denne næringsløsning podes med 10J6 av en 3 dager gammel forkultur og inkuberes i porsjoner på 100 ml i 500 ml Erlenmeyer-kolber på en resiprokvirkende rystemaskin ved 23°C. Andre kulturer blir dyrket på analog måte i et gjæringskar av rustfritt stål som inneholder 170 liter næringsmedium. Herunder foretas lufting med 170 liter luft pr. minutt og omrøring først med 70 omdreininger og siden med 180 omdreininger pr. minutt. Som antiskummiddel benyttes en siliconemulsjon.

På denne måte oppstår kulturer av tallrike likeartede mycel-partikler. Disse har en diameter på ca. 5 mm og har en kuleaktig kompakt kjerne med en diameter på ca. 1 mm av pseudoparenkymatisk vev. Denne kjerne bærer st^rneaktig anordnede ca. 2 mm lange fortsettelser av parallelt rettede hyfer. På slutten av dyrkings-prosessen som varer ca. 10 dager er mycelet mørkebrunt og filtratet . farget intenst rødbrunt.

pH verdien forandrer seg bare uvesentlig.

Det således oppnådde kulturfiltrat kan f.eks. opparbeides på følgende måte: En porsjon på 20 liter kulturfiltrat ble justert til en pH-verdi på 9,75 med ca. 1,2 kg natriumkarbonat og ekstrahert 3 ganger med etylenklorid, hver gang med 20 liter. Den organiske fase ble vasket en gang med 5 liter vann og inndampet i vakuum til et totalt volum på 4 liter. Konsentratet ble ekstrahert 3 ganger med 1 liter 5# vinsyre, og vinsyre-uttrekkene justert til pH = 9,0'natriumkarbonat og ekstrahert 3 ganger med etylenklorid, hver gang med 2 liter. Uttrekkene, som ble vasket med små mengder vann og tørket over natriumsulfat, ga etter inndamping i vakuum 16,7 g baser, som ifølge van Urk's prøve inneholdt 12,2 g indolforbindelser og ifølge papirkromatografiske undersøkelser inneholdt 11,3 g forsåpbare indoler.

Den således oppnådde baseblanding ble, som beskrevet ovenfor, analysert papirkromatografisk og viste seg å ha følgende sammensetning:

Når dyrkingen gjennomføres i et gjæringskar, oppnås etter 12 dagers dyrking 145 liter kulturfiltrat. Dette kulturfiltrat ble etter at det var gjort alkalisk med 2n natronlut ekstrahert

5 ganger med 200 liter etylacetat ved pH = 7,4 og 3 ganger med 200 liter etylacetat ved pH = 10. Hver av etylacetatekstraktene ble inndampes til 10 liter og fra konsentratene ble alkaloidene ekstrahert med vandig vinsyreløsning. De vinsure, vandige ut-trekk ble etter at de var gjort alkaliske ekstrahert på ny med etylacetat ved pH = 7,4 og ved pH = 10, og etter nøytralvasking med små mengder vann inndampet til tørrhet. Ekstraktresiduet ble, som beskrevet ovenfor, analysert papirkromatografisk og viste seg å ha følgende sammensetning:

En videre fordel ved fremgangsmåten i henhold til foreliggende oppfinnelse, hvor den nye stamme av Claviceps paspali Stevens et Hall benyttes, består i at den derved oppnådde blanding er spesielt rik på lysergsyreamid og isolysergsyreamid. Begge disse forbindelser lar seg nemlig, i motsetning til de naturlige meldrøyealkaloider, som f.eks. ergobasin, vesentlig lettere hydrolysere til fri lysergsyre som er et viktig mellomprodukt ved syntese av meget virksomme farmaka. Denne hydrolyse kan om ønskes, også foretas direkte i ett arbeids-trinn i forbindelse med isoleringen av alkaloidblandingen fra kulturfiltratet, f.eks. p.å følgende måte: 16,7 g av den rå alkaloid-blanding som ble oppnådd etter den ovenfor beskrevne fremgangsmåte, ble oppløst i 50$ etanol, hvorpå den alkaliske løsning, etter tilsetning av 75 g bariumhydroksyd og 2 g natriumditionit, ble kokt under tilbakeløpskjøling i 3,5 timer. Til den avkjølte reaksjons-blanding ble det tilsatt 16 ml konsentrert ammoniakk og 218 ml 2n svovelsyre, hvorpå bunnfallet ble frasentrifugert. Residuet ble oppslemmet 5 ganger til, hver gang med 200 ml varm metanol-ammoniakk (9:1). filtratet ble kombinert med metanol/ammoniakk-vaskeløsningen og inndampes i vakuum. Den rå lysergsyre, som ble utfelt med iseddik, ble utfelt på ny fra en blanding av 75 ml metanol og 75 ml 2n natronlut*-.ved tilsetning av 33 ml iseddik. Utbyttet av ren lysergsyre utgjorde 6,5 g.

De følgende tabeller gir opplysninger om hvilken innflytelse sink-og jern-ioner har på veksten av soppen og på alkåloidinnholdet av kulturløsningen:

1. Vekst uttrykt i g/liter tørrmyeel

2. Alkaloidinnhold.

Claims (1)

1. Fremgangsmåte for fremstilling av lysergsyre- og isolysergsyreamid ved dyrking av en stamme av arten Claviceps paspali Stevens et Hall i et dyrkingsmedium som inneholder assimilerbare kilder for karbon, nitrogen og uorganiske salter, og isolering fra dyrkingsfiltratet av den blanding av forbindelser av ergolintypen som overveiende inneholder lysergsyreamid og isolysergsyreamid, karakterisert ved at man anvender stammen NRRL 3027 som er i stand til å danne konidier in vitro.