NO144604B

NO144604B - Analogifremgangsmaate til fremstilling av terapeutisk virksomme histidinderivater

Info

Publication number: NO144604B
Application number: NO760741A
Authority: NO
Inventors: Barry Arnold Morgan; Derek John Schafer
Original assignee: Reckitt & Colmann Prod Ltd
Priority date: 1975-03-08
Filing date: 1976-03-04
Publication date: 1981-06-22
Also published as: IE42784L; HU175652B; AR208361A1; PH11727A; FR2303559A1; SE411671B; FI62823C; GB1523598A; IL49122A0; US4060603A; SE7602165L; ATA169776A; BE839187A; ZM2576A1; EG13624A; FI760538A; MX3055E; PL101401B1; OA05260A; GR59891B

Abstract

Analogifremgangsmåte til fremstilling av terapeutisk virksomme histidinderivater.

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører fremstilling

av terapeutisk virksomme histidinderivater med den generelle formel:

hvor R er hydrogen eller alkyl C-^-j, er alkyl 0^.3,

R<2> er hydrogen eller alkyl C;l_3 og R3 er hydrogen eller^ cykloheksyl. Forbindelsene er avledet fra aminosyrene L-pyroglutaminsyre og L-histidin, og det skal forstås at i forbindelsene med formel I er histidyl- og pyrogliitamyl-restene i L-konfigurasjon.

Forbindelsene med formel I kan anvendes i tera-i peutiske preparater omfattende nevnté forbinddlse sammen «: med et farmasøytisk akseptabelt fortynningsmiddel eller bærer. 2: Forbindelsene med formel I viser farmakologisk aktivitet hos.mus ved reserpin og hypotermiametoden, hvilket er et forsøk for undersøkelse av anti-depressiv aktivitet, og kan forventes benyttet ved behandling av depresjon. Forbindelsene som er kjemisk beslektet med det hypotallamisk tyrotropinfrigjørende hormon (TRH), L-pyro-

, i;

glutamyl-L-histidyl^-L-prolinamid kan forventes å utvise lignende virkninger på hypofysen.

Ifølge foreliggende oppfinnelse fremstilles forbindelsene med formel I ved at man

(a) kobler et histidinderivat med formelen:

hvor R har den ovenfor angitte betydning, A betegner en gruppe som kan danne en peptid-binding og Y betegner en beskyttelsesgruppe, med en forbindelse med formelen: hvor B\er hydrogen eller en beskyttelsesgruppe og X betegner ' en -gruppe som kan danne en peptidbindirig, for. dannelse av et dipeptid med formelen: hvor B,Y og R har den ovenfor angitte betydning, hvoretter beskyttelsesgruppen Y omdannes til en gruppe som kan danne en peptidbinding, og dipeptiden kobles med en forbindelse med formelen:

hvor R 1 , Rz 9 og R 3 har den ovenfor angitte betydning, hvoretter en eventuell beskyttelsesgruppe B fjernes for dannelse av en forbindelse med formel I, eller

(b) kobler et histidinderivat med formelen:

hvor R har den ovenfor angitte betydning, A betegner en fil-beskyttelse sgruppe, og Y betegner en gruppe som kan danne en peptidbindlng., med en forbindelse med formelen: 12 3 hvor R , R og R har den ovenfor angitte betydning., for dannelse av et dipeptid med formelen: hvor A, R, R 1, R 9 og R 3 har den ovenfor angitte betydning, hvoretter beskyttelsesgruppen A fjernes og dipeptidet kobles med en forbindelse med formelen:

hvor B er et hydrogenatom eller en beskyttelsesgruppe, og X er en gruppe som kan danne en peptidbinding, hvoretter

en eventuell beskyttelsesgruppe B fjernes, for dannelse av ,en forbindelse med formel I.

Forbindelsene kan således hensiktsmessig fremstilles ved å foreta kopling ved hjelp av de standardtek-nikker som forefinnes innen peptidkjemien, nemlig å kople en forbindelse med formel II hvor R har den ovenfor angitte betydning, A er hydrogen og Y er en beskyttende gruppe slik som en lavere alkoksygruppe C^_4, med en forbindelse med formel III hvor X er en gruppe som kan danne en peptid-binding slik som hydroksy, substituert fenoksy (f.eks. p-nitrofenoksy, tri- eller penta-klorfenoksy) eller azido og B er hydrogen eller en beskyttende gruppe slik som benzyloksykarbonyl, for dannelse av en dipeptidgruppe, hvoretter gruppen Y i nevnte dipeptidgruppe omdannes til en gruppe som kan danne en peptidbinding slik som hydroksy eller azido, og omsettes med en forbindelse med formel IV hvor R1, R2, R<3> og R<4> har den ovenfor angitte betydning, med etterfølgende fjerning av eventuelle beskyttende grupper. Koplingsreaksjonen som innebærer en karboksylgruppe, dvs. formel II når X er hydroksy eller i dipeptidgruppen når Y er hydroksy, utføres i nærvær av et koplingsmiddel slik som N,N'-dicykloneksylkarbodiimid, fortrinnsvis i nærvær av en recemiseringsinhibitor slik som hydroksybenzoetriazol.

Forbindelsene kan alternativt fremstilles ved å kople, ved hjelp av standrad teknikker som forefinnes innen peptidkjemien, en forbindelse med formel II hvor R har den ovenfor angitte betydning, A er en N-beskyttende gruppe

som vanligvis benyttes innen peptidkjemien (slik som t-

butoksykarbonyl eller benzyloksykarbonyl), og Y er en gruppe som kan danne en peptidbinding slik som hydroksy, substituert fenoksy eller azido, med en forbindelse med formel

19 3 4

IV hvor R , R , R og R har den ovenfor angitte betydning, for dannelse av et dipeptid. Den N-beskyttende gruppe fjernes og den resulterende forbindelse koples ved hjelp av. standardmetoder innen peptidkjemien, med en forbindelse med formel III hvor X er en gruppe som kan danne en peptidbinding, slik som hydroksy, substituert fenoksy, azido eller klor, og B er hydrogen ellet en beskyttende gruppe slik som benzyloksykarbonyl, med etterfølgende fjerning av eventuelle beskyttende grupper. Koplingsreaksjoner innebærer frie karboksylgrupper, dvs. når X eller Y er hydroksy, ut-føres i nærvær av et koplingsmiddel slik som N,N'-dicykloheksylkarbodiimid, fortrinnsvis i nærvær av en racemiserings-inhibitor slik som hydroksybenzoetriazol.

i .9 3 Forbindelsene med formel IV hvor R , R , R og

R<4> har den ovenfor angitte betydning, kan fremstilles fra

de tilsvarende alkylsubstituerte proliner ved å beskytte aminogruppen med f.eks. t-butoksykarbonyl- eller benzyloksykarbonyl-grupper, aktivere karbonylgruppen ved hjelp av en av de standard metoder som finnes i peptidkjemien (slik som blandet anhydrid- eller aktivert ester-metoden), kopling av den aktiverte forbindelse med ammoniakk eller et amin i et egnet oppløsningsmiddel og fjerning av den N-beskyttende gruppe ved hjelp av standard metoder innen peptidkjemien.

Følgende eksempler illustrerer oppfinnelsen.

Eksempel 1.

L-pyroglutamyl-L-histidyl-trans-3-metyl-L-prolinamid

(I, R = H, R<1> = trans-3-CH, R<2> = R3 =R<4>=H)

(i) N-t-butoksykarbonyl-trans-3-metyl-L-prolin.

Trietylamin (3,5 ml) og t-butyl-2,4,5-tr.ik.lor.-fenyl-karbonat (3,5 g) ble tilsatt til en oppløsning av trans-3-metyl-L-prolin (1,25 g) i t-butanol (12 ml) og vann (8 ml). Blandingen ble oppvarmet til 60°C i 2 timer, fordampet, resten ble oppløst i IN natriumbikarbonatopp-løsning (50 ml) og oppløsningen vasket med eter. Overskudd fast sitronsyre ble tilsatt, produktet ekstrahert i etylacetat, de kombinerte ekstrakter tørket (Na2S04) og fordampet, hvilket ga et urent krystallinsk produkt (1,6 g). Omkrystallisering fra etylacetat/lett petroleum (40-60°C) ga det ønskede produkt (1,33 g) , sm.p. 146-150°C (et)20 - 60,1° (c, 1,0, kloroform).

(iij N-t-butoksykarbonyl-trans-3-metyl-L-prolinamid.

N-metylmorfolin (6,0 ml) ble tilsatt en oppløs-ning av N-t-butoksy-karbonyl-trans-3-metyl-L-prolin (1,1 g) 1 tetrahydrofuran (50 ml) ved -20°C. Frisk destillert isobutylklorformiat (0,8 g) ble tilsatt dråpevis, og opp-løsningen ble omrørt i 10 min. ved -20°C. Konsentrert ammaniakkoppløsning (5 ml) ble tilsatt og oppløsningen om-rørt i 2 timer, fordampet, hvoretter resten ble opptatt i etylacetat (100 ml) og oppløsningen ble vasket med 10% vanndig natriumbikarbonet, saltoppløsning og tørket (Na2S04). Fordamping ga et urent krystallinsk produkt (0,1 g). Omkrystallisering fra etylacetat/lett petroleum (40-60°C) ga det ønskede produkt (0,91 g) sm.p. 100-101°C,

(a,D -79,7° (c,l,0, kloroform).

(iii) trans-3-metyl-L-prolinamid-hydroklorid. En oppløsning av hydrogenklorid i dioksan (7,5 N, 5 ml) ble tilsatt til en oppløsning av N-t-butoksykarbonyl-.trans-3-metyl-L-prolinamid (0,65 g) i 10 ml dioksan. Etter 2 timer ble det krystallinske faste stoff filtrert og om-krystalliser t fra etanol/eter, og dette ga produktet (0,47g), sm.p. 235-237°C (ct)p -14,8° (c, 1, 0 , vann) . (iv) L-pyroglutamyl-L-histidyl-trans-3-metyl-L-prolinamid.

trans-3-metyl-L-prolinamid-hydroklorid (0,50 g)

i dimetylformamid (5 ml) ble tilsatt til en oppløsning av L-pyroglutamyl-L-histidinhydrazid, (fremstilt som beskrevet nedenfor), i dimetylformamid (15 ml) ved -20°C, og trietylamin (0,45 ml) ble tilsatt. Blandingen ble hensatt ved

romtemperatur i 12 timer, filtrert, fordampet, og resten oppløst i 1% vanndig pyridin (10 ml) og anbragt på en kolonne med sulfoetyl "Sephadex C-25"-harpiks (50 g veid som fuktig harpiks, kolonnediameter 2 cm) ekvilibrert med 1% vanndig pyridin.

Kolonnen ble eluert ved hjelp av en gradientteknikk under anvendelse av 5% vanndig pyridin via en 1 liters sfærisk blandebeholder fylt med 1% vanndig pyridin. Fraksjonene inneholdende produktet (som påvist ved optisk rota-sjon og t.l.c.) ble kombinert, fordampet, og resten tritu-rert med eter og dette ga produktet (som monohydratet) i form av et amorft fast stoff (0,70 g) . (a)20-46,7°

(c, 1,0, vann). RF3B 0,48, sm.p. 145-148°C.

Analyse:

Funnet C 52,5, H 7,0, N 21,3

C17<H>24<N>6°4'<H>2° krever

C 51,8, H 6,7, N 21,3%

Det ovenfor benyttede L-pyroglutamyl-L-histidinhydrazid ble fremstilt på følgende måte:

N-bénzyloksykarbonyl-L-pyroglutaminsyre (5,2 g)

i acetonitril (20 ml) ble tilsattt til en oppløsning av L-histidinmetylester (3,38 g) i acetonitril (10 ml) og blandingen avkjølt til -10°C. Det resulterende bunnfall ble oppløst ved tilsetning av litt dimetylformamid. Dicykloheksylkarbodiimid (4,12 g) ble tilsatt og blandingen holdt i 1 time ved -10°C, og fikk nå romtemperatur natten over. Blandingen ble filtrert og filtratet inndampet. Resten

ble oppløst i metylenklorid, vasket med 0,5 M borsyre, 10% natriumbikarbonatoppløsning og en mettet saltoppløsning, hvoretter den ble tørket over natriumsulfat og inndampet. Resten ble omkrystallisert fra metanol/dietyleter og dette ga N-benzyloksykarbonyl-L-pyroglutamyl-L-histidylmetylester. Esteren ble oppløst i metanol og hydrogenert i nærvær av Pd/C-katalysator, katalysatoren ble fjernet og filtratet inndampet. Resten ble omkrystallisert fra metanol/dietyl, og dette ga L-pyroglutamyl-L-histidylmetylester. Hydra-zinhydrat (2 ml) ble tilsatt til den for beskyttelsesgrup-

pen befriede estere (2,8 g) i metanol (20 ml) ved 1-10°C. Etter henstand natten over ble det resulterende bunnfall oppsamlet, vasket med metanol og dietylester, tørket og omkrystallisert fra vanndig etanol.

Eksempel 2.

L-pyroglutamyl-L-histidyl-trans-3-etyl-dl-prolinamid

(i) trans-3-etyl-dl-prolin.

Dietylbenzyloksykarbonylaminomalonat (11,5 g,

38 mM) ble oppløst i tørr etanol (50 ml) og tilsatt til en oppløsning av natrium (150 mg) i tørr etanol (10 ml). Pent-2-enal (3,2 g, 38 mM) i etanol (10 ml) ble tilsatt dråpevis til den omrørte blanding og oppløsningen omrørt i 1 time.

En oppløsning av eddiksyre (0,29 ml) i etanol (1 ml) ble deretter tilsatt og oppløsningen hydrogenert i 2 timer ved atmosfærisk trykk under anvendelse av palladium på karbon (5%) som katalysator. Katalysatoren ble fjernet ved filtrering og filtratet fordampet. Resten ble oppløst i kloroform og oppløsningen vasket med saltoppløsning inneholdende litt natriumbikarbonet, tørket (Na2SC>4) og inndampet. Destilla-sjon av resten ved 15 mm Hg ga 4-etyl-5,5-dikarboetoksy-2-pyrrolin (5,65 g) som en fargeløs olje, kp. 115-120°C (15

mm Hg), I.R. 1715, 1610 cm-<1>.

Pyrrolinforbindelsen (4,68 g, 19,5 mM) ble tilsatt til en blanding av IM NaOH (80 ml) og etanol (80 ml) og opp-løsningen ble omrørt ved 50°C i 4 timer. Oppløsningen ble deretter avkjølt, natriumborhydrid (1,0 g) tilsatt og omrørt ved 25°C i ytterligere 10 timer. Oppløsningen ble deretter forsiktig surgjort med fortynnet HC1 til pH 4, konsentrert og anbragt på en kolonne med "Dowex 50WX8"-harpiks (H+<->form, 100 ml). Eluering med vanndig ammoniakk (2 M) ga en oppløs-ning som ved inndamping ga trans-3-etyl-dl-prolin (2,1 g) , sm.p. 208-209°C, Rp3B 0,43. Analyse på en Jeol 6AH aminosyre-analysator (50 cm kolonne, natriumcitratbuffer 0,2 N, pH 3,25, temperatur 57°C) viste en enkelt topp (elueringstid 117 min.).

(i i) t-butyloksykarbonyl-trans-3-etyl-dl-prolin.

Denne forbindelse ble fremstilt fra trans-e-etyl-

dl-prolin (1,72 g) ved å følge metoden som angitt i eksempel

l(i) som en olje (2,82 g) Rp3A 0,92.

(iii) . t-butyloksykarbonyl-trans.-3-etyl-dl-prolinamid.

Denne forbindelsé ble fremstilt fra ,t-butyloksy-karbonyl-trans-3-etyl-dl-prolin (3^5;;. g) ved metoden i eksem-

pel l(ii) og etter kromatografering<på en silisiumdioksyd-

kolonne oppnådde man t-butyloksykarbonyl-trans-3-etyl-dl-prolinamid (3,1 g) som hvite krystaller.,';- 'sm.p.' 78^-80°C .

(iv) trans-3-etyl-dl-prolinamid-hydroklorid.

Denne forbindelse ble fremstilt fra t-butyloksy-kar bonyl-trans-3-etyl-dl-prolinamid (3;0 g) ved metoden i eksempel l(iii) til trans-3-etyl-dl-prolinamidhydroklorid (1,5 g) i form av hvite krystaller, sm.p. 206-207°C, Rp3A .• 0,22, RF3B 0,72. (v) 'trans-3-etyl-dl-prolinamid. trans-3-etyl-dl-prolinamid-hydr<p>klorid (0,5 g) ble oppløst i vann og anbragt på en kolonnj|lav DEAE- "Sephadex"-harpiks (OH~-form). Fraksjonene innehoidende produktet (påvist ved t.l.c.) ble konbinert og fordampet til tørrhet til trans-3-etyl-dl-prolinamidhydr-at (0 j 4 5 g) i form av et hvitt fast stoff sm.p. 89,5-91°C, Rp3A 0,,2,2., Rp3B 0,72. (vi) L-pyrof lutamyl-L-histidyl-trans-3'-etfyl-dl-prolinamid.

trans-3-etyl-dl-prolinamid (288 mg, 2 mM) benzyloksykarbonyl-L-pyroglutamyl-L-histidin (822 mg, 2mM) frem-

stilt på den nedenfor beskrevne måte, og•hydroksybenzotria-

zol (550 mg, 4 mM) ble oppløst i dimetylformamid (6 ml), oppløsningen ble avkjølt til 0°C, dicyklqheksylkarbodiimid (480 mg, 2,2 mM) tilsatt pglblandingen ble omrørt i 18

timer. Blandingen ble deretter filtrert<!>og filtratet inn-

dampet. Den resulterende oije ble oppløst i tetrahydrofuran-

vann (1:1, 80 ml)", palladium-på-trekull (10%, 60 mg) ble til-

satt og oppløsningen hydrogenert i 4 timer ved atmosfæretrykk. Katalysatoren ble deretter fjernet ved filtrering og filtratet fordampet til tørrhet. Den resulterende gummi ble fordelt mellom etylacetat (50 ml) og vann (80 ml). Den vanndige fase.

ble separert, inndampet til tørrhet og resten oppløst i en

vanndig oppløsning inneholdende 1% eddiksyre/O,05% pyridin. Denne oppløsning ble påført på en kolonne av S.P. - "Sephadex

C 25"-harpiks (pyridiniumform) som var ekvilibrert med vanndig

1% eddiksyre/O,05% pyridin. Kolonnen ble fortynnet ved en gradientteknikk under anvendelse av vanndig 1% eddiksyre/1% pyridin via en 500 ml sfærisk blandebeholder fylt med vanndig 1% eddiksyre/O,05% pyridin. Fraksjonene inneholdende produktet (påvist ved t.l.c.) ble kombinert og fordampet, og dette ga L-pyroglutamyl-L-histidyl-trans-3-etyl-dl-prolinamid (205 mg) som et hvitt amorft fast stoff, sm.p. 156-160°C. Rp3A 0,27, Rp3B 0,50. Aminosyreanalyse etter sur hydrolyse ga følgende forhold:

Histidin 0,95, glutaminsyre 0,99, 3-etylprolin 1,06.

Det ovenfor benyttede N-benzyloksykarbonyl-L-pyroglutamyl-L-histidin ble fremstilt på følgende måte: Dicykloheksylkarbodiimid (1,36 g) ble tilsatt til en avkjølt oppløsning av N-benzyloksykarbonyl-L-pyroglutaminsyre (1,58 g) og N-hydroksysuccinimid (0,76 g) i dimetoksyetan og oppløsningen omrørt i 18 timer ved laboratorietemperatur. Blandingen ble filtrert, vasket med dimetoksyetan, filtratene inndampet til tørrhet og resten omkrystallisert fra isopropanol. 'Den'resulterende aktive ester (1,35 g) oppløst i dioksan (2,5 ml) ble tilsatt til en omrørt oppløsning av L-histidinnatriumsalt (fra L-histidin (0,64 g) og Na^O^ • 5H20 (0,51 g) i vann (5ml)). Etter omrøring i 4 timer ble blandingen konsentrert under redu-sert trykk til et lite volum, nøytralisert med fortynnet saltsyre og deretter konsentrert til omkring 2 ml. De resulterende faste stoff ble oppsamlet, vasket med isvann og omkrystallisert fra 30$ vandig metanol.

Eksempel 3.

L-pyroglutamyl-L-histidyl-3,3-dimetyl-dl-prolinamid.

(i) 3,3-dimetyl-dl-prolin.

Dietylbenzyloksykarbonylaminomalonat (3,09 g, 10 mM) ble oppløst i tørr etanol (15 ml) og tilsatt til en oppløsning av natriumetoksyd (fra 100 mg natrium) i etanol (3 ml). 3-metylbut-2-enal (840 mg, 10 mM) i etanol (6 ml) ble tilsatt og oppløsningen omrørt ved 25°C i 24 timer. Eddiksyre (0,28 ml) ble deretter tilsatt og oppløsningen hydrogenert i 24 timer under anvendelse av palladium-på-trekull (10%, 500 mg) som katalysator. Oppløsningen ble filtrert, inndampet og resten kromatografert på silisiumdioksydkolonne under anvendelse av eter/petroleumeter (40-60°C) (1:1) som elueringsmiddel, og dette ga 2,2-dikarboetoksy-3,3-dimetylpyrrolidin (0,9 g) .

Denne diester (850 mg) ble kokt under tilbakeløp i 5M saltsyre (10 ml) i 4 timer, og dette ga etter fordamping et pulverformig hvitt fast stoff. Omkrystallisering fra metanol-eter ga 3,3-dimetyl-dl-prolinhydroklorid (451 mg) som hvite krystaller, sm.p. 110-112°C.

(ii) t-butyloksykarbonyl-3,3-dimetyl-dl-prolin.

Denne forbindelse ble fremstilt fra 3,3-dimetyl-dl-prolinhydroklor id (1,07 g) ved metoden i eksempel l(i) og dette ga t-butyloksykarbonyl-3,3-dimetyl-dl-prolin (1,45 g) som et hvitt krystallinsk fast stoff, sm.p. 107-108,5°C.

(iii) t-butyloksykarbonyl-3,3-dimetyl-dl-prolinamid.

Denne forbindelse ble fremstilt fra t-butyloksykarbo-nyl-3 ,3-dimetyl-dl-prolin (900 mg) ved metoden i eksempel l(ii) til t-butyloksykarbonyl-3,3-dimetyl-dl-prolinamid (375 mg) som et hvitt krystallinsk fast stoff, sm.p. 115-117°C.

(iv) 3,3-dimetyl-dl-prolinamidhydroklor id.

Denne forbindelse ble fremstilt fra t-butyloksykarbo-nyl-3 , 3-dimetyl-dl-prolinamid (300 mg) ved metoden i eksempel l(iii) til 3,3-dimetyl-dl-prolinamidhydroklorid (175 mg) som et hvitt krystallinsk fast stoff, sm.p. 220-223°C.

(v) 3,3-dimetyl-dl-prolinamid.

Denne forbindelse ble fremstilt fra hydrokloridsaltet (170 mg) ved metoden ifølge eksempel 2(v) som et hvitt fast stoff (135 mg) RF3A 0,19, Rp3B 0,7.0. (vi) L-pyroglutamyl-L-histidyl-3,3-dimetyl-dl-prolinamid.

Denne forbindelse ble fremstilt fra 3,3-dimetyl-dl-prolinamid (100 mg) ved metoden ifølge eksempel 2(vi) som et hvitt pulver (195 mg), sm.p. 180°C (mykningspunkt 135°C). Rp3B 0,65. Aminosyreanalyse etter syrehydrolyse ga følgende forhold: histidin 1,02, glutaminsyre 0,89, 3,3-dimetylprolin 1,02, (a)<20>+ 5,9° (c = 1, dimetylf ormamid) .

Eksempel 4.

L-pyroglutamyl-NT<->metyl-L-histidyl-trans-3-metyl-L-prolinamid.

(i) Benzyloksykarbonyl-L-pyroglutamyl-NT<->metyl-L-histidin. NT-raetyl-L-histidin (428 mg) og natriumkarbonat (288 ; mg) oppløst i vann (5 ml) og oppløsningen innstilt til pH 8,5. Benzyloksykarbonyl-L-pyroglutaminsyre N-hydrokssuccinimido-ester (933 mg)i dioksan (5 ml) ble tilsatt og oppløsningen omrørt i 15 timer ved 22°C. Oppløsningen ble inndampet og resten kromatografert på en silisiumdioksydgel-kolonne (15 x 330 mm) under anvendelse av isopropanol-etylacetat-eddiksyre-vann (3:1:1:1) som elueringsmiddel, og dette ga etter inndamp- \\ j. ingen av den riktige fraksjon, produktet (615 mg) som et hvitt j?<:>'<f >fast stoff, sm.p. 192-195°C, RF3A 0,21, RF3B 0,69, (a)<22->l,3° (c = 1 dimetylformamid). (ii) L-pyroglutamyl.-NT<->metyl-L-histidyl-trans-3-metyl-L-prolinaraid.. : Denne forbindelse ble fremstilt fra benzyloksykarbonyl-L-pyroglutamyl-NT<->metyl-L-histidin (207 mg) og trans-3-metyl-L-prolinamid (77 mg) ved metoden i eksempel 2 (vi) hvil-

ket ga et hvitt hydroskopisk fast stoff (90 mg), RF3A, sm.p. 135-140°C, RF3B 0,60. (Funnet C 55,0, H 7,0, N 21,2, C18<H>23<->

N604 krever C. 55,4, H 6,7, N 21,5 %) . (a)<22->23,9° (c = 1 • dimetylformamid).

Eksempel 5.

L-pyroglutamyl-L-histidyl-trans-3-metyl-L-prolinacykloheksyl-

amid.

(i) t-butyloksykarbonyl-trans-3-metyl-L-prolincykloheksyl-

amid.

Denne forbindelse ble fremstilt fra t-butyloksykar-bonyl-trans-3-metyl-L-prolin (1,15 g) og cykloheksylamin

(2,85 ml) ved metoden i eksempel l(ii) som et hvitt fast

stoff (1,3 g), sm.p. 130-134°C, RF1F 0,53.

(ii) Trans-3-metyl-L-prolincykloheksylamid.

Denne forbindelse ble fremstilt fra t-butyloksy-karbonyl-trans-3-metyl-L-prolincykloheksylamid (900 mg) ved metoden i eksempel l(iii) og l(iv) for dannelse av et hvitt fast stoff (410 mg), sm.p. 111-113°C, RF2A 0,33. (iii) L-pyroglutamyl-L-histidyl-trans-3-metyl-L-prolin-cykloheksylamid.

Denne forbindelse ble fremstilt fra benzyloksykarbonyl-L-pyroglutamyl-L-histidin (565 mg) og trans-3-metyl-L-prolin-cykloheksylamid (300 mg) ved metoden i eksempel 2(vi)

som et hvitt fast stoff (272 mg), sm.p. 145-150°C. RF3A 0,43, RF3B 0,78, (a)<22->14,9° (c = 1, dimetylformamid), RF4A 0,50.

Eksempel 5a

Alternativ metode, for fremstilling av L-pyroglutamyl-L-histidyl-trans-3-metyl-L-prolincykloheksylamid. (i) Na<->t-butyloksykarbonyl-N<im->2,4-dinitrofenyl-l-histidyl-trans-3-metylprolincykloheksylamid.

Na<->t-butyloksykarbonyl-N<im->2,4-dinitrofenyl-L-histidin (1,18 g, 2,8 mM), L-trans-3-metylprolincykloheksylamid (590 mg, 2,8 mM) og N-hydroksy-5-norbornen-2,3-dikarboksimid (496 mg, 2,8 mM) ble oppløst i tørr dimetylformamid og den om-rørte oppløsning avkjølt til -10°C. N,N^-dicykloheksylkarbodiimid (639 mg, 3>1 mM) i dimetylformamid (2ml) ble tilsatt og oppløsningen omrørt i 19 timer ved laboratorietemperatur.

Videre ble Na<->t-butyloksykarbonyl-N<im->2,4-dinitrofenyl-L-histidin (60 mig) og NjN^-dicykloheksylkarbodiimid (35 mg) tilsatt og, etter 3 timer, ble oppløsningen filtrert og filtratet inndampet til tørrhet. Resten ble oppløst i etylacetat (50 ml), ekstrahert med mettet natriumbikarbonatoppløsning (2x50 ml), tørket og inndampet til tørrhet. Det urene materiale ble renset ved kromatografi på en kolonne med silisiumdioksydgel (45x2,5 cm, "6P^^4"^• Eluering ble foretatt med en blanding av etylacetat, eddiksyre, pyridin, og vann i volumforholdet 1920:6:20:11.

De fraksjoner som inneholdt det ønskede produkt ble kombinert

og inndampet til tørrhet. Dette ga det rene beskyttede dipeptid (i) (900 mg, 52$) som et gult fast stoff, smp. 103-

108°C. Rp3A 0,91; RF7C 0,78. (ii) Nlm<->2,4-dinitrofenyl-L-histidyl-L-trans-3-mety1-prolincykloheksylamiddihydroklorid.

Det beskyttede dipeptid (i). (600 mg) ble oppløst i eddiksyre (10 ml). En oppløsning av hydrogenklorid i eddiksyre (1 ml, 2,63 M) ble tilsatt og oppløsningen omrørt i 2 timer ved 22°C. Oppløsningen ble deretter fortynnet med tørr eter (100 ml) og metanol .(20 ml), inndampet og tørket under vakuum for opp-nåelse av det ønskede dihydroklorid (50 mg, 88$) som et gul-brunt fast stoff [a]|°8 +21,1° (C=l DMF); Rp3A 0,39; Rp4A 0,72;

RF7B °>29'

(iii) L-pyroglutamyl-L-histidyl-L-trans-3-metylprolin-cykloheksylamid. L-pyroglutaminsyre (130 mg, 1 mM), Nlm<->2,4-dinitro-fenyl-L-histidyl-L-trans-3-metylprolincykloheksylamiddihydro-klorid (583 mg, 1 mM), N-hydroksy-5-norbornen-2,3-dikarboksimid (177 mg, 1 mM) og N-metylmorfolin (303 mg, 3 mM) ble oppløst i dimetylformamid (20 ml) og oppløsningen avkjølt til 0°C. N,N<1->dicykloheksylkarbodiimid (227 mg, 1,1 mM) ble tilsatt og omrørt i 18 timer ved 22°C. Blandingen ble deretter filtrert og filtratet inndampet. Resten ble oppløst i dimetylformamid (15 ml) og tioetanol (1 ml) ble tilsatt. Etter 2 timer ble oppløsningen inndampet og oppløst i dimetylformamid/vann (95:5, 2 ml) og påført på en kolonne av "SP Sephadex" (HO-form; 2 x 10 cm). Etter kassering av den nøytrale fraksjon fra kolonnen ole elueringsmidlet forandret til dimetylformamid/vann/trietylamin (37:3:1) for å eluere basiske komponenter. Fraksjoner inne-holdende det ønskede produkt ble oppsamlet og inndampet.. Resten ole oppløst i etanol (5 ml) og påført på en kolonne av "SP Sephadex" i pyridiniumformen (13x30 cm). Man gjennomførte en gradienteluering fra pyridin inneholdende 5% vann, hvorved man benyttet et blandekammer med volumet 500 ml. De fraksjoner som inneholdt det ønskede produkt ble kombinert og inndampet.

Resten ble lyofilisert i vann hvilket ga det ønskede tripeptid (iii) (200 mg) som et kremfarget fast stoff [oi]<2>^ = -13,6°

(C=l, DMP). Produktet var kromatografisk homogent med det som

ble fremstilt ved den andre metoden (eksempel 5).

Eksempel 6- •

L- pyroglutamyl- L- histidyl- L- 3, 3- dimetylprolinamid

(i) L-3,3-dimetylprolinamid.

Denne forbindelse ble fremstilt ved oppløsning av

det racemiske amid under anvendelse av (-)vinsyre i metanol. Det. utfelte tartrat ble omkrystallisert tre ganger fra metanol. Fjerning av vinsyren- ved ionevekslingskromatografi på "Amberlite IRA-400" ga den rene L-isomer [a]<2>° = -39° (C=l, 0,1 M HC1).

RF3A °>lk> RF4A °'46-

(ii) L-pyroglutamyl-L-histidyl-L-3,3-dimetylprolinamid

N-benzyloksykarbonyl-L-pyroglutamyl-L-histidin (401 mg,

1 mM), L-3,3-dimetylprolinamid (142 mg, 1 mM) og N-hydroksy-5-norboren-2,3-dikarboksimid (117 mg, 1 mM) ble oppløst i dimetylformamid. Oppløsningen ble avkjølt til 0°C og NjN^-dicykloheksylkarbodiimid (227 mg, 1,1 mM) ble tilsatt. Oppløsningen ble deretter omrørt i 48 timer og det dannede NjN^-dicyklo-heksylurea ble fjernet ved filtrering. Filtratet ble inndampet

og resten oppløst i tetrahydrofuran/vann (1:1, 60 ml), palladium-på-karbon (100 mg, 10%) ble tilsatt og hydrogen boblet gjennom den omrørte suspensjon i 12 timer. Katalysatoren ble. deretter fjernet ved filtrering gjennom glassfiber og opp-løsningen ble inndampet til tørrhet. Det urene produkt ble 'renset ved fordelingskromatografi på "Sephadex G25" (3x80 cm) under anvendelse av n-butanol/eddiksyre/vann (4:1:5)• Det urene produkt ble oppløst i den øvre fasen (10 ml) og anbragt på kolonnen som var bragt i likevekt med først den undre og deretter den øvre fasen. Man oppsamlet fraksjoner på hver 300 dråper, l

og de fraksjoner som inneholdt det ønskede produkt ble kombinert og inndampet. Resten ble lyofilisert fra vann og dette ga L-pyroglutamyl-L-histidyl-L-3,3-dimetylprolinamid (130 mg) som et hvitt fast stoff, smp. l63-l66°C; Rp3A 0,10; Rp3B 0,43;

j<R>F4A °'<26->

I de ovenfor angitte eksempler ble tynnsjiktskromato-grafi (t.l.c.) foretatt på "Silisiumdioksyd GF2^^"-plater under anvendelse av følgende oppløsningsmiddelsystemer:

1E metanol, kloroform 1:4

1F metanol, kloroform 1:9

2A kloroform, metanol, eddiksyre 18:2:1

3A kloroform, metanol, eddiksyre, vann 80:18:2:3

3B kloroform, metanol, eddiksyre, vann 30:20:4:6

4A n-butanol, etylacetat, eddiksyre, vann 1:1:1:1

6C n-butanol, pyridin, eddiksyre, vann 30:20:6:12

7C etylacetat, pyridin, eddiksyre, vann 120:20:6:11

De nye forbindelsene med formel I har en kraftigere virkning mot reserpinfremkalt hypotermi hos mus enn hormonet TRH, dvs.. "L-pyroglutamyl-L-histidyl-L-prolinamid, og de derivater derav (sekundære amider) som beskrives i DE-utlegningsskrift 2 343 035- Dette fremgår av de nedenfor angitte forsøksresultater.

Man benyttet den forsøksmetode som er beskrevet av

B.M. Askew, Life Sei., 10, 725 (1963)- Som forsøksdyr ble benyttet grupper på åtte hannmus MFI-OLA med en vekt på 18-22 g. Musene ble -injisert subkutant med reserpin i en dose på 3 mg

fri base pr. kg kroppsvekt. Den reserpinfremkalte hypotermi fikk utvikles i 17-18 timer i en omgivelse med temperaturen

20 ± 1°C. Temperaturen i spiserøret ble målt ved hjelp av

en oralt innsatt sonde og indikert på et digitaltermometer.

Ved forsøkene ble det bare benyttet slike mus hvis temperatur

ble senket til 25°C eller lavere ved en slik injisering av reserpin.

Hver gruppe på 8 mus ble gitt enten saltoppløsning (legemiddelbærer) eller prøveforbindelse. Kroppstemperaturen

hos hver mus ble målt dels før administrasjonen og dels 0,5,

1, 2 og 4 timer etter administrasjonen. Alle temperaturmålinger ble gjennomført i et rom med en temperatur på 20 i 1°C.

Arealet under kurven for temperaturøkning som funk-sjon av tiden ble beregnet for hvert dyr med anvendelse av Simpsons trapetsformel. Man bestemte gjennomsnittarealet

(± standardavvik) ved hvert tidspunkt og de resultater som ble oppnådd med mus behandlet med prøveforbindelsen bie sammen

lignet med de resultater som ble oppnådd med kontrollmusene (behandlet med bærermaterialet). Man beregnet den minste

signifikante dosen ved oral administrasjon. Man bestemte dessuten den relative virkning i forhold til virkningen av TRH ved parallelle forsøk.

De oppnådde resultater er sammenstilt i nedenstående tabell hvor TRH-cykloheksylamid er forbindelsen ifølge eksempel 2 i nevnte DE-utlegningsskrift 2 3^3 935.

Terapeutiske preparater kan være i en form som er egnet for oral administrasjon eller i en form egnet for parente-ral administrasjon. Slike orale preparater kan være i form av kapsler, tabletter, granulater eller flytende preparater slik som eliksirer, siruper eller suspensjoner. Preparater for par-enteral administrasjon kan være i form av sterile, injiserbare preparater slik som oppløsninger i vann eller saltoppløsninger. Doseringen av preparatene anvendes med fordel i en enhets-doseringsform. For oral administrasjon kan denne enhets-doser-ingsform inneholde 1 - 100 rag av en forbindelse med formel I.

Claims

Analogifremgangsmåte til fremstilling av terapeutisk virksomme histidinderivater med den generelle formel:

hvor R er hydrogen eller alkyl C^_j, R"1" er alkyl C^_3, R2 er hydrogen eller alkyl C^_^ og R^ er hydrogen eller cykloheksyl, karakterisert ved at man (a) kobler et histidinderivat med formelen:

hvor R har den ovenfor angitte betydning, A betegner en gruppe som kan danne en peptid-binding og Y betegner en beskyttelsesgruppe, med en forbindelse med formelen:

hvor B er hydrogen eller en beskyttelsesgruppe og X betegner en gruppe som kan danne en peptidbinding, for dannelse av et dipeptid med formelen:

hvor B, Y og R har den ovenfor angitte betydning, hvoretter beskyttelsesgruppen Y omdannes til en gruppe som kan danne en peptidbinding, og dipeptidet kobles med en forbindelse med formelen: 12 3

hvor R , R og R har den ovenfor angitte betydning, hvoretter en eventuell beskyttelsesgruppe B fjernes for dannelse av en forbindelse med formel I, eller (b) kobler et histidinderivat med formelen:

hvor R har den ovenfor angitte betydning, A beregner en N-<1> beskyttende gruppe, og Y betegner en gruppe som kan danne en peptidbinding, med en forbindelse med formelen: 1 2 ' 3

hvor R , R og R har den ovenfor angitte betydning, for dannelse av et dipeptid med formelen: 12 3

hvor A, R, R , R og R har den ovenfor angitte betydning, hvoretter beskyttelsesgruppen A fjernes og dipeptidet kobles med en forbindelse med formelen:

hvor B er et hydrogenatom eller en beskyttelsesgruppe, og X er en gruppe som kan danne en peptidbinding, hvoretter en eventuell beskyttelsesgruppe B fjernes, for dannelse av en forbindelse med formel I.