NO150360B

NO150360B - Analogifremgangsmaate for fremstilling av terapeutisk aktive merkaptoacyldipeptider

Info

Publication number: NO150360B
Application number: NO800931A
Authority: NO
Inventors: Miguel A Ondetti; Josip Pluscec
Original assignee: Squibb & Sons Inc
Priority date: 1979-04-02
Filing date: 1980-03-31
Publication date: 1984-06-25
Also published as: IE49653B1; GB2045771B; NL8001675A; FR2453135B1; PT71044A; ATA179480A; AT373577B; AU537592B2; LU82316A1; NO150360C; DE3012140A1; ES8104200A1; GR67752B; JPS55133345A; FR2453135A1; HU181087B; IT1147332B; PH22024A; BE882601A; CH645092A5

Abstract

Analogifremgangsmåte for fremstilling av terapeutisk aktive, spesielt hypotensive, forbindelser med formelen. og alkylestere og salter derav. R. er hydrogen, alkanoyl, benzoyl eller. rer hydrogen, alkyl eller fenylalkyl,. n er 0 eller 1, og. A.^ og Aer hver en a-amino- eller a-imlnosyrerest bundet sammen gjennom en peptid-binding.

Description

Forbindelser med formelen

og alkylestere og salter derav har nyttig hypotensiv aktivitet. I formel I og i beskrivelsen har symbolene de nedenfor angitte betydninger.

er hydrogen, alkanoyl, benzoyl eller

1*2 er hydrogen, alkyl eller fenylalkyl,

n er 0 eller 1, og

og A2 er hver en a-amino- eller a-iminosyrerest valgt fra prolin, tryptofan, glye in, fenylglycin, alanin, fenylalanin, leucin, isoleucin, valin og arginin, bundet sammen gjennom en peptidbinding.

Betegnelsen "alkyl" som her anvendt betegner grupper med

1 til 7 karbonatomer.

Betegnelsen "alkanoyl" som her anvendt, betegner alkanoyl-grupper med 2 til 7 karbonatomer. Acetyl er den foretrukne alkanoylgruppe.

Som angitt ovenfor er gruppene A^ og A2 bundet sammen ved hjelp av "en peptid-binding", dvs. leddet -CO-NH- mellom a-karboksylgruppen i resten A^ og a-amino- eller a-iminogruppen i gruppen A2.

Merkaptoacyldipeptidene med formel I hvor R., er alkanoyl eller benzoyl kan fremstilles ved acylering av et dipeptid med formelen

eller et alkylesterderivat derav, med en tiosyre med formelen

I formel III og videre i beskrivelsen er symbolet ' alkanoyl eller benzoyl. Den ovenfor beskrevne acylering kan utføres ved anvendelse av hvilken som helst av alle de metoder som er kjent innen teknikken. F.eks. kan acyleringen utføres i nærvær av et koblingsmiddel så som et karbodiimid (av hvilke dicykloheksylkarbodiimid er det vanligst anvendte). Alternativt kan tiosyren med formel III aktiveres ved dannelse av dens blandede anhydrid, symmetriske anhydrid, syreklorid eller aktive ester, eller ved anvendelse av Woodward reagens K eller N-etoksykarbonyl-2-etoksy-1,2-dihydrokinolin. For en mer detaljert beskrivelse av forskjellige acyleringsmetoder henvises til Methoden der organischen Chemie (Houben-Weyl), Vol. XV, del II, side 1 og videre (19 74) .

En alternativ syntese for forbindelsene med formel I hvor R^ er alkanoyl eller benzoyl omfatter trinnvis acylering i mot-setning til den tidligere beskrevne direkte acylering, dvs. acylering av aminosyren "A^ " med en merkaptoalkanoylsyre med formel III (under anvendelse av den ovenfor beskrevne fremgangs-måte) for å danne en merkaptoalkanoylaminosyre med formelen

fulgt av acylering av aminosyren " A^" eller en alkylester derav med en merkaptoalkanoylaminosyre med formel IV. Acyleringen kan utføres ved en hvilken som helst av de velkjente metoder for kobling av aminosyrer. For en oversikt over disse metoder kan det henvises til Bodanszky og Ondetti, Peptide Synthesis, Interscience Publishers (1966). Forbindelser med formel I hvor er hydrogen, kan fremstilles ved ammonolyse eller alkalisk hydrolyse av de tilsvarende forbindelser med formel I hvor R^ er alkanoyl eller benzoyl, som kan fremstilles under anvendelse av hvilken som helst av de ovenfor beskrevne fremgangsmåter. Forbindelser med formel I hvor R^ er

kan fremstilles ved oksydasjon

av den tilsvarende frie tiol med formel I med jod.

Alternativer til de ovenfor beskrevne synteser vil fremgå for en fagmann. Hvis f.eks. en ester av A^- A^ eller A^ anvendes ved en av de ovenfor beskrevne synteser, kan den tilsvarende frie syre erholdes fra det forestrede produkt ved sur eller alkalisk hydrolyse.

Merkaptoalkanoylsyrer med formel III og merkaptoalkanoyl-aminosyrer med formel IV og fremgangsmåter for fremstilling derav er beskrevet i litteraturen, se f.eks. US-patenter 4.046.889, 4.105.776 og 4.053.651.

Forbindelsene som fremstilles ifølge oppfinnelsen, danner basiske salter med forskjellige uorganiske og organiske baser som også kan fremstilles ifølge oppfinnelsen. Slike salter omfatter ammoniumsalter, alkalimetallsalter så som natrium-

og kaliumsalter (som foretrekkes), jordalkalimetallsalter så som kalsium- og magnesiumsalter, salter med organiske baser, f.eks. dicykloheksylaminsalter, benzatin-, N-metyl-D-glukamin-, hydrabamin-salter, salter med aminosyrer så som arginin, lysin og lignende. De ugiftige, fysiologisk godtagbare salter foretrekkes, selv om andre salter også er nyttige, f.eks. for isolering eller rensning av produktet.

Forbindelsene med formel I og alkylestrene og saltene

derav er nyttige som hypoterisive midler. De hemmer omdannelsen av dekapeptidet angiotensin I til angiotensin II og er derfor nyttige til å redusere eller lindre angiotensin-tilknyttet hypertensjon. Virkningen av enzymet renin på angiotensinogen,

et pseudoglobulin i blodplasma, danner angiotensin I.

Angiotensin I omdannes ved hjelp av angiotensin-omdannende

enzym (ACE) til angiotensin II. Sistnevnte er en aktiv pressor-substans som er foreslått som det stoff som forårsaker forskjellige former for hypertensjon i forskjellige pattedyrarter, f.eks. rotter og hunder. Forbindelsene som fremstilles ifølge oppfinnelsen, griper inn i angiotensinogen -*- (renin) -*■ angiotensin I -> (ACE) angiotensin II-forløpet ved å hemme angiotensin-omdannende enzym og redusere eller eliminere dannelsen av pressorsubstansen angiotensin II. Ved administrering av et preparat inneholdende én eller en kombinasjon av forbindelser med formel I, lindres angiotensin-tilknyttet hypertensjon hos pattedyr som lider av dette. En enkelt dose eller fortrinnsvis to eller flere oppdelte daglige doser, gitt på grunnlag av

ca. 0,1 til 100 mg pr. kg kroppsvekt pr. dag, fortrinnsvis ca. 1 til 50 mg pr. kg kroppsvekt pr. dag, er passende til å

redusere blodtrykket. Forbindelsen administreres fortrinnsvis oralt, men parenterale veier kan også anvendes så som subkutan, intramuskulær, intravenøs eller intraperitoneal administrering.

Forbindelsene med formel I kan tilberedes for anvendelse for reduksjon av blodtrykk, i slike preparater som tabletter, kapsler eller eliksirer for oral administrering eller i sterile oppløsninger eller suspensjoner for parenteral administrering. Ca. 10 til 500 mg av en forbindelse eller en blanding av forbindelser med formel I blandes med et fysiologisk godtagbart bæremiddel, hjelpestoff, bindemiddel, konserveringsmiddel, stabiliseringsmiddel, smaksstoff osv., i en enhetsdoseform i henhold til godtatt farmasøytisk praksis. Mengden av aktivt stoff i disse preparater er slik at en passende dosering i det angitte område oppnås.

De følgende eksempler illustrerer oppfinnelsen.

Eksempel 1

1-[ N- ( acetyltioacetyl) glycyl]- L- prolin

Glycyl-L-prolin (1,72 g) innføres i 10 ml IN natriumhydroksyd under omrøring i et isbad. Til denne blanding settes 5 ml 2N natriumhydroksyd fulgt av 1,13 g kloracetylklorid, og badet fjernes. Efter 3 timer ved romtemperatur tilsettes tioleddiksyre (836 mg) og kaliumkarbonat (960 mg) i 10 ml vann,

og reaksjonsblandingen omrøres i ca. 16 timer ved romtemperatur. Reaksjonsblandingen surgjøres med sulfonert polystyren-kationebytterharpiks, elueres med vann og konsentreres til tørrhet i vakuum. Residuet opptas i eddiksyre, og de uoppløselige bestanddeler (smeltepunkt over 320°C) filtreres. Filtratet konsentreres til tørrhet i vakuum, og 7:3 kloroform:eddiksyre tilsettes. Produktet sentrifugeres, og væsken på toppen tilføres en 60 g silikagelkolonne og elueres med 7:3 kloroform:eddiksyre for å gi 1,0 g av tittelforbindelsen.

Eksempel 2

1-[ N-( merkaptoacetyl) glycyl]- L- prolin

1-[N-(acetyltioacetyl)glycyl]-L-prolin (1,0 g) behandles

i 30 minutter under argon i en oppløsning av 6 ml vann og 6 ml konsentrert natriumhydroksyd. Oppløsningen konsentreres i vakuum, surgjøres med sulfonert polystyren kationebytterharpiks, tilføres til en kolonne av det samme og elueres med vann. 800 mg materiale som man derved får (pluss 200 mg fra en tidligere fremstilling) kromatograferes på en 30 g kolonne av silikagel med 7:3 kloroform:eddiksyre. Dette produkt (740 mg) tilføres til en 85 ml kolonne av dietylaminoetyl-dekstran anionebytterharpiks og elueres med en lineær gradient fra 0,005 M ammoniumbikarbonat til 0,5M ammoniumbikarbonat (750 ml av hver). Produktet omdannes til den frie syre på sulfonert polystyren-kationebytterharpiks og behandles derefter med 7 ml eddiksyre og 350 ml sinstøv under omrøring under et argonteppe i 6 timer. Suspensjonen sentrifugeres, væsken på toppen konsentreres til tørrhet i vakuum, opptas i vann og lyofiliseres. Produktet surgjøres med sulfonert polystyren-harpiks, tilføres til en kolonne av det samme og elueres med vann for å gi 36 5 mg av tittelforbindelsen.

Analyse: CgH^N^S (0, 3) H20:

Beregnet for: C 42,95, H 5,68, N 11,13, S 12,72

Funnet: C '42,92, H 5,78, N 10,94, S 12,68

SH: beregnet -i,00, funnet -0,9 8

Eksempel 3

t- butylester av ( S)- 1-[ 3-( acetyltio)- 2- metyl- l- oksopropyl]-L- prolyl- L- prolin

Til en oppløsning av 7,8 g 1-[S-3-(acetyltio)-2-metyl-l-oksopropyl] -L-prolin i 75 ml diklormetan settes 5,13 g t-butyl-L-prolinat, og oppløsningen avkjøles til 5°C. Til denne oppløsning settes (dråpevis) en oppløsning av dicykloheksylkarbodiimid i 50 ml diklormetan. Omsetningen utføres ved romtemperatur i ca. 16 timer. Efter at bunnfallet er fjernet, vaskes den resulterende oppløsning suksessivt med vann, 5% natriumbikarbonat, vann, 10% natriumbisulfat og vann, og derefter tørres den over natriumsulfat. Råproduktet (12 g) som erholdes efter at oppløsningsmidlet er fjernet, stivner ved henstand. Omkrystallisering fra etylacetat:pentan gir tittelforbindelsen, sm.p. 104-106°C.

Eksempel 4

1-( S- 3- merkapto- 2- metyl- l- oksopropyl)- L- prolyl- L- prolin

t-butylester av L-[S-3-(acetyltio)-2-metyl-l-oksopropyl]-L-prolin (12 g) opptas i 60 ml redestillert trifluoreddiksyre, og den resulterende oppløsning får stå ved romtemperatur i 1 time. Trifluoreddiksyre fjernes i vakuum, og residuet tørres forsiktig i høyvakuum i 24 timer. Den tunge olje opp-løses i 30 ml metanol, og til denne oppløsning settes 20 ml konsentrert ammoniumhydroksyd. Blandingen holdes ved romtemperatur i 1 time, og oppløsningsmidlet fjernes derefter i vakuum, og det oljeaktige residuum tørres og behandles med 6 ml dicykloheksylamin. Saltet behandles med eter, og en olje utfelles. Oljen opptas i etylacetat, og oppløsningen vaskes med 10%ig kaliumbisulfat og tørres derefter over natriumsulfat. Efter fjernelse av oppløsningsmidlet opptas residuet i metanol, og hele mengden absorberes på silikagel. Oppløsningsmidlet fjernes, og silikagelen inneholdende det absorberte produkt tilføres til en silikagelkolonne tilberedt i kloroform. Kolonnen elueres med kloroform, og de merkapto-positive fraksjoner samles. Oppløsningsmidlet fjernes, og residuet lyofiliseres fra vann for å gi 1,05 g av tittelforbindelsen som et hygroskopisk, fast stoff.

Analyse: <C>14H22N2°4S'1/2 H2°

Beregnet: C 51,99, H 7,17, N 8,66, S 9,92

Funnet: C 52,12, H 7,44, N 8,18, S 9,37. Nøytralisasjonsekvivalent: beregnet 323, funnet 341.

Eksempel 5

N-( acetyltioacetyl)- L- valyl- L- prolin

En oppløsning- av t-butyloksykarbonyl-L-valyl-L-prolin (3,1 g) i trifluoreddiksyre (20 ml) holdes ved romtemperatur

i 15 minutter, oppløsningsmidlet fjernes i vakuum, og det oljeaktige residuum tørres i vakuum i flere timer. Oljen føres inn

i dimetylformamid (25 ml), og til denne oppløsning settes N-hydroksy-succinimidester av acetylmerkaptoeddiksyre (2,2 g).• Omsetningen utføres ved pH 7,5 (regulert med trietylamin) og ved romtemperatur i 17 timer. Efter fjernelse av oppløsnings-midlet opptas residuet i etylacetat, og oppløsningen vaskes suksessivt med vann, 10%ig kaliumbisulfat, vann, mettet natriumbikarbonat og vann, og tørres til slutt over natriumsulfat for å gi 4,8 g av tittelforbindelsen som en olje.

Eksempel 6

N- ( merkaptoacetyl)- L- valyl- L- prolin

N-(acetyltioacetyl)-L-valyl-L-prolin (4,8 g) innføres i en blanding av 12 ml metanol og 7,5 ml konsentrert ammoniumhydroksyd, og den resulterende oppløsning holdes ved romtemperatur i 1 time. pH-verdien reguleres til 7, og metanol fjernes i vakuum. Det gjenværende, vandige lag surgjøres til pH 2 med 2N saltsyre, og oppløsningen mettes med natriumklorid. Produktet ekstraheres med etylacetat, oppløsningen tørres over natriumsulfat, og oppløsningsmidlet fjernes i vakuum for å gi 2 g materiale, smeltepunkt 158-162°C. Omkrystallisering fra etylacetat (med tilsetning av en liten mengde metanol) gir produktet, smeltepunkt 162-165°C. Efter tørring av en prøve ved 55°C i 2 timer er smeltepunktet 190-192°C.

Eksempel 7

1-( S- 3-( acetyltio)- 2- metyl- l- oksopropyl]- L- prolylglycin-etylester

Ved å følge fremgangsmåten ifølge eksempel 3, men ved å anvende 10,4 g 1-[S-3-(acetyltio)-2-metyl-l-oksopropyl]-L-prolin, 100 ml diklormetan, 5,6 g av etylesteren av glycin (fremstilt fra 5,5 8 g av hydrokloridsaltet av etylesteren av glycin og 5,6 ml trietylamin i 50 ml diklormetan) og 8,24 g dicykloheksylkarbodiimid, får man 11,2 g av tittelforbindelsen som en viskøs olje.

Eksempel 8

( S)- 1-( 3- merkapto- 2- metyl- l- oksopropyl)- L- prolylglycin-

litiumsalt

1-[S-3-(acetyltio)-2-metyl-l-oksopropyl]-L-prolylglycin-etylester (11,2 g) opptas i metanol (200 ml) hvortil en vandig oppløsning av kaliumhydroksyd (9 g i 40 ml vann) settes. Hydrolysen får skje ved romtemperatur i 2 timer. Det organiske oppløsningsmiddel fjernes i vakuum, og det vandige residuum reguleres til pH 7,0. Produktet ekstraheres med etylacetat, oppløsningen tørres over natriumsulfat, og oppløsningsmidlet fjernes i vakuum. Residuet (3,5 g) opptas i vann, og pH-verdien reguleres til pH 2,0. Den frie syre opptas igjen i etylacetat under anvendelse av natriumklorid for å redusere oppløselig-

heten i vann. Efter fjernelse av oppløsningsmidlet lyofiliseres residuet fra vann for å danne 2,16 g av den frie base av tittelforbindelsen. Hele mengden opptas i vann, og pH-verdien reguleres forsiktig til pH 7,0 under anvendelse av 0,05N litium-hydroksyd. Oppløsningen lyofiliseres for å gi 1050 mg av tittelforbindelsen som et hygroskopisk, fast stoff.

Analyse : ci]_H17N2°4S *Li

Beregnet: C 47,14, H 6,12, S 11,44, Li 2,48

Funnet: C 46,56, H 6,42, S 11,37, Li 2,43.

Eksempel 9

( S)- 1-( 3- merkapto- 2- metyl- l- oksopropyl)- L- prolyl- L- alanin

Ved å følge fremgangsmåten ifølge eksempel 3 og 4, men

ved å anvende 7,8 g 1-[S-3-(acetyltio)-2-metyl-l-oksopropyl]-L-prolin, 75 ml dimetylformamid, 6,2 g dicykloheksylkarbodiimid, 4,2 g av hydrokloridsaltet av metylesteren av L-alanin og 4,2 ml trietylamin (pH 7,5-8,0), får man 8 g materiale. Dette materiale føres gjennom en silikagelkolonne under anvendelse av etylacetat som elueringsmiddel. Man får to fraksjoner

(R^ = 0,76 og R^ = 0,4, silikagel, etylacetat).

Fraksjonen som vandrer langsomst (2 g R^ = 0,4) opptas i kaliumhydroksyd/vandig metanol (1,5 g kaliumhydroksyd i 7 ml vann og 35 ml metanol), og oppløsningen holdes ved rom-

temperatur i 2 timer. Det organiske oppløsningsmiddel fjernes

i vakuum, og det vandige lag surgjøres til pH 2,0. Efter tilsetning av natriumklorid ekstraheres produktet fem ganger med etylacetat. Oppløsningen tørres, og oppløsningsmidlet fjernes i vakuum. Det faste residuum krystalliseres fra varm etylacetat for å gi 1 g produkt, smeltepunkt 128-130°C.

Eksempel 10

Acetyltioacetyl- valyl- tryptofan- metylester

En oppløsning av 15 g av metylesteren av t-butyloksykarbonyl-valyl-tryptofan i 150 ml trifluoreddiksyre og 15 ml anisol omrøres i 1 time under nitrogen. Oppløsningen underkastes avdrivning i vakuum til et oljeaktig residuum.

En oppløsning av 4,83 g acetyltioeddiksyre og 6,18 g hydroksybenzotriazol-monohydrat i 120 ml tetrahydrofuran avkjøles til 0°C og behandles med en oppløsning av 8,16 g dicykloheksylkarbodiimid i 60 ml tetrahydrofuran. Blandingen omrøres ved 0°C i 0,5 time og derefter ved romtemperatur i 1 time. Det utfelte urinstoff frafiltreres, og filtratet

underkastes avdrivning i vakuum til et hvitt, fast stoff.

Den aktive ester oppløses i 90 ml dimetylformamid, hvorefter en oppløsning av det ovennevnte dipeptid-metylester-trifluoreddiksyresalt i 60 ml dimetylformamid tilsettes sammen med tilstrekkelig N-metylmorfolin til å holde pH-verdien ved 7,5, og den resulterende blanding omrøres i 16 timer ved romtemperatur. Reaksjonsblandingen underkastes avdrivning i vakuum til en olje som fordeles mellom etylacetat og vann. Etylacetatfasen vaskes med 2N sitronsyre, vann, mettet natriumbikarbonatoppløsning og vann, og tørres over natriumsulfat og underkastes avdrivning til et fast stoff. Materialet krystalliseres fra etylacetat:pentan for å gi 10 g av tittelforbindelsen, smeltepunkt 110-112°C.

Eksempel 11

N-( merkaptoacetyl)- L- valyl- L- tryptofan- litiumsalt

Acetyltioacetyl-valyl-tryptofan-metylester (5,0 g) opp-løses i 52 ml metanol, og en oppløsning av 2,1 g kaliumhydroksyd i 10,5 ml vann tilsettes. Blandingen omrøres under nitrogen ved romtemperatur i 1,5 timer, hvorefter metanolen

i

avdrives i vakuum. Den vandige rest fortynnes med vann, ekstraheres med etylacetat og surgjøres til pH 2,0 med 6N saltsyre. Det faste stoff filtreres, vaskes med vann og tørres for å gi 3,4 g materiale. Det faste stoff kromatograferes på en "Sephadex LH-20" kolonne under anvendelse av 7:3 metanol:vann som elueringsmiddel for å gi 1,5 g av en olje. Oljen oppløses i 1:1 etanol:vann og reguleres til pH 7,0 med 0,1N litium-hydroksyd. En liten mengde uoppløselig materiale fjernes ved filtrering, og filtratet underkastes avdrivning i vakuum til en olje. Oljen oppløses i vann og lyofiliseres for å gi 1,5 g av et hygroskopisk, fast stoff.

Analyse for <c>i8<H>22<N>3°4<S>"Li

Beregnet: C 51,54, H 6,25, S 7,65, Li 1,65.

Funnet: C 51,94, H 6,03, S 7,28, Li 1,62. Nøytralisasjonsekvivalent: Beregnet 419, funnet 413

Eksempel 12

( S)- 1-[ 3-( acetyltio)- 2- metyl- l- oksopropyl]- L- propy1- D- alanin-metylester

Til en oppløsning av 1-[S-3-(acetyltio)-2-metyl-l-oksopropyl ]-L-prolin (7,8 g) i acetonitril (150 ml) settes karbonyldiimidazol (4,9 g) ved 0°C. Blandingen omrøres i 1 time ved denne temperatur, hvorefter oppløsningen blir nesten klar, og D-alanin-metylester-hydroklorid (4,2 g) tilsettes. pH-verdien reguleres til 7,5-8,0 med trietylamin (4,2 ml), og reaksjonsblandingen omrøres i 17 timer ved romtemperatur. Bunnfallet og oppløsningsmiddel fjernes, og det oljeaktige residuum opptas i etylacetat. Oppløsningen vaskes suksessivt med vann, 0,1N HC1, vann, mettet NaHCO^ og vann og tørres. Efter fjernelse av oppløsningsmidlet viser den gjenværende olje en flekk på TLC (silikagel, EtOAc og CHCl3:Me0H 9:1) ved Rf = 0,5 med spor ved Rf = 0,75 (i etylacetat). Utbytte: 4 g.

Eksempel 13

( S)- 1-( 3- merkapto- 2- metyl- l- oksbpropyT)- L- prolyl- D- alariin (S)-[3-(acetyltio)-2-metyl-l-oksopropyl]-L-prolyl-D-alanin-metylester (4 g) opptas i kaliumhydroksyd/vandig metanol

(3 g kaliumhydroksyd i 14 ml vann og 70 ml metanol), og opp-løsningen holdes ved romtemperatur i 2 timer. Produktet (2,1 g) isoleres under anvendelse av fremgangsmåten beskrevet i eksempel 9, sm.p. 152-155°C som et krystallinsk, fast stoff. Analyse for C12<H>20<N>2°4<S><:>

Beregnet: C 49,98, H 6,99, S 11,12

Funnet: C 50,02, H 7,24, S 10,90.

Nøytralisasjonsekvivalent: Beregnet 288, funnet 284.

Eksempel 14

1-[ N-( merkaptoacetyl)- L- alanyl]- L- prolin

Til en oppløsning av acetyltioeddiksyre (1,3 g) og hydroksybenzotriazol (1,44 g) i tetrahydrofuran (39 ml) settes dicykloheksylkarbodiimid (2 g), og blandingen omrøres ved 0°C i 30 minutter og ved romtemperatur i 1 time. Bunnfallet fjernes ved filtrering, og til filtratet settes L-alanyl-L-prolin som trifluoracetatsaltet (fremstilt fra t-butyloksykarbonyl-L-alanyl-L-prolin, 2,8 g og trifluoreddiksyre). pH-verdien reguleres til 7,5-8,0 med N-metylmorfolin, og omsetningen får skje ved romtemperatur i ca. 16 timer. Opp-løsningsmidlene fjernes i vakuum, og residuet oppløses i en blanding av metanol (18 ml) og konsentrert ammoniumhydroksyd (18 ml). Efter 30 minutter konsentreres blandingen i vakuum, residuet oppløses i vann og tilføres til en kolonne av sulfonert polystyren kationebytterharpiks og elueres med vann. Dette materiale renses videre ved silikagelkromatografi (eddiksyre:kloroform, 7:3) og krystalliseres fra etylacetat, 850 mg, smeltepunkt 152-155°C

[a]D = -128° (c = 1,5, 50% vandig MeOH).

Eksempel 15

1-[ N-( merkaptoacetyl)- L- alanyT] - L- tiazolidiri- 4- karboksylsyre

Ved å følge fremgangsmåten ifølge eksempel 14, men ved å anvende trifluoreddiksyresaltet av L-alanyl-L-tiazolidin-4-karboksylsyre istedenfor trifluoreddiksyresaltet av L-alanyl-L-prolin ved fremgangsmåten ifølge eksempel 14, får man tittelforbindelsen .

Eksempel 16

1-[ N-( merkaptoacetyl)- L- alanyl]- 4- metoksy- L- prolin

Ved å følge fremgangsmåten ifølge eksempel 14, men ved å anvende trifluoreddiksyresaltet av L-alanyl-4-metoksy-L-prolin istedenfor trifluoreddiksyresaltet av L-alanyl-L-prolin får man tittelforbindelsen.

Eksempel 17

1-[ N-( merkaptoacetyl- L- alanyl]- 4- hydroksy- L- prolin

Ved å følge fremgangsmåten ifølge eksempel 14, men ved å anvende trifluoreddiksyresaltet av L-alanyl-4-hydroksy-L-prolin istedenfor trifluoreddiksyresaltet av L-alanyl-L-prolin, får man tittelforbindelsen.

Eksempel 18

1-[ N-( merkaptoacetyl)- L- alanyl]- 4, 4- etylendioksy- L- prolin

Ved å følge fremgangsmåten ifølge eksempel 14, men ved å anvende L-alanyl-4,4-etylendioksy-L-prolin istedenfor trifluoreddiksyresaltet av L-alanyl-L-prolin, får man tittelforbindelsen .

Eksempel 19

1-[ N-( 2- merkaptopropanoyl)- L- alanyl]- L- prolin

Ved å følge fremgangsmåten ifølge eksempel 14, man ved å anvende 2-acetyltiopropionsyre istedenfor 2-acetyltioeddiksyre, får man tittelforbindelsen som et voksaktig, fast stoff, sm.p. (47°) 54-65°C (spaltn.)

Analyse for <C>11<H>18<N>2°4<S*H>2°

Beregnet: C 46 , 63, H 6 ,76 , S 9,89

Funnet: C 46,50, H 6,58, S 9,78

SH-titrering: 100%

i

Eksempel 20

1-[ N-( 3- merkapto- l- oksopropyl- L- alanyl]- L- prolin

Ved å følge fremgangsmåten ifølge eksempel 14, men ved å anvende 3-acetyltio-propionsyre istedenfor 2-acetyltioeddiksyre, får man tittelforbindelsen som et hygroskopisk, fast stoff, sm.p. (61°) 75-84°C.

Analyse for cnHi8N2°4 *0' 75 H2°

Beregnet: C 45,89, H 6,83, S 11,14

Funnet: C 45,75, H 6,62, S 10,98

SH-titrering: 99,6%

Eksempel 21

1-[ N-( 2- merkaptopropanoyl)- L- alanyl]- 4- hydroksy- L- prolin

Ved å følge fremgangsmåten ifølge eksempel 14, men ved å anvende 2-acetyltiopropionsyre istedenfor acetyltioeddiksyre og trifluoreddiksyresaltet av L-alanyl-4-hydroksy-L-prolin istedenfor trifluoreddiksyresaltet av L-alanyl-L-prolin, får man tittelforbindelsen.

Eksempel 22

1-[ N-( 2- merkaptopropanoyl)- L- alanyl]- L- tiazolidin- 4- karboksylsyre

Ved å følge fremgangsmåten ifølge eksempel 14, men ved å anvende 2-acetyltiopropionsyre istedenfor acetyltioeddiksyre og trifluoreddiksyresaltet av L-alanyl-L-tiazolidin-4-karboksylsyre istedenfor trifluoreddiksyresaltet av L-alanyl-L-prolin, får man tittelforbindelsen.

Eksempel 2 3

1-[ N-( 2- merkaptopropanoyl)- L- alanyl]- 4- metoksy- L- prolin

Ved å følge fremgangsmåten ifølge eksempel 14, men ved å anvende 2-acetyltiopropionsyre istedenfor acetyltioeddiksyre og trifluoreddiksyresaltet av L-alanyl-4-metoksy-L-prolin is-tedenfor trif luoreddiksyresaltet av L-alanyl-L-prolin, får man tittelforbindelsen.

Eksempel 24

1-[ N-( 2- merkaptopropanoyl)- L- alanyl]- 4, 4- etylendioksy- L- prolin

Ved å følge fremgangsmåten ifølge eksempel 14, men ved

å anvende 2-acetyltiopropionsyre istedenfor acetyltioeddiksyre og L-alanyl-4,4-etylendioksyd-L-prolin istedenfor trifluoreddiksyresaltet av L-alanyl-L-prolin, får man tittelforbindelsen .

Eksempel 25

1-[ N-( 2- merkapto- 3- fenylpropanoyl)- L- alanyl]- 4- hydroksy- L- prolin

Ved å følge fremgangsmåten ifølge eksempel 14, men ved

å anvende 2-acetyltio-3-fenylpropionsyre istedenfor acetyltioeddiksyre og trifluoreddiksyresaltet av L-alanyl-4-hydroksy-L-prolin istedenfor trifluoreddiksyresaltet av L-alanyl-L-prolin, får man tittelforbindelsen.

Eksempel 26

1-[ N-( 2- merkapto- 3- fenylpropanoyl)- L- alanyl]- L- tiazolidin-4- karboksylsyre

Ved å følge fremgangsmåten ifølge eksempel 14, men ved å anvende 2-acetyltio-3-fenylpropionsyre istedenfor acetyltioeddiksyre og trifluoreddiksyresaltet av L-alanyl-L-tiazolidin-4-karboksylsyre istedenfor trifluoreddiksyresaltet av L-alanyl-L-prolin, får man tittelforbindelsen.

Eksempel 2 7

1-[ N-( 2- merkapto- 3- fenylpropanoyl)- L- alanyl]- 4- metoksy- L- prolin

Ved å følge fremgangsmåten ifølge eksempel 14, men ved å anvende 2-acetyltio-3-fenylpropionsyre istedenfor acetyltioeddiksyre og tri fluoreddiksyresaltet av L-alanyl-4-metoksy-L-prolin istedenfor tri fluoreddiksyresaltet av L-alanyl-L-prolin, får man tittelforbindelsen.

Eksempel 2 8

I-[ N-( 2- merkapto- 3- propanoyl)- L- alanyl]- 4, 4- etylendioksy-L- prolin

Ved å følge fremgangsmåten ifølge eksempel 14, men ved å anvende 2-acetyltio-3-fenylpropionsyre istedenfor acetyltioeddiksyre og L-alanyl-4,4-etylendioksy-L-prolin istedenfor trifluoreddiksyresaltet av L-alanyl-L-prolin, får man tittelforbindelsen .

Eksempel 29

1-[ N-( merkaptoacetyl)- L- prolin]- L- prolin

Metode A

Benzyloksykarbonyl-L-prolyl-L-prolin (3 g) hydrogeneres

i en blanding av absolutt etanol (50 ml) og N saltsyre (7,5 ml) i nærvær av 10% palladium på trekull. Efter 5 timer frafiltreres katalysatoren, og oppløsningsmidlet fjernes i vakuum. Residuet oppløses i en blanding av dimetylformamid (15 ml) og trietylamin (1,05 ml), og acetyltioeddiksyre-N-hydroksy-succinimidoester (1,7 g) tilsettes. Efter oppbevaring ved romtemperatur i ca. 16 timer fjernes oppløsningsmidlene i vakuum, og residuet kromatograferes på en kolonne av silikagel (benzen :heksan, 7:1). Dette materiale oppløses i trifluoreddiksyre (5 ml) og anisol (2 ml), og oppløsningen holdes ved romtemperatur i 1 time. Reaksjonsblandingen konsentreres til tørrhet, og residuet oppløses i 7,7 ml N natriumhydroksyd med omrøring under argon. Efter 15 minutter nøytraliseres blandingen med sulfonert polystyren-kationebytterharpiks, tilføres til en kolonne av den samme harpiks og elueres med vann. Det erholdte materiale krystalliseres fra etylacetat og har et smeltepunkt på 182-183°C.

Metode B

Dicykloheksylkarbodiimid (2,06 g) og 1-(acetyltioacetyl)-L-prolin (2,3 g) settes til en' oppløsning av L-prolin-t-butylester (1,7 g) og. hydroksybenzotriazol (1,5 g) i diklormetan (15 ml) avkjølt i et isbada Efter omrøring ved 5°C i ca.

16 timer frafiltreres det resulterende bunnfall, og filtratet vaskes inntil det er nøytralt. Det organiske lag konsentreres til tørrhet, og residuet renses ved silikagel-kromatografi og krystalliseres fra eter-heksan for å gi et materiale med et smeltepunkt på 95-98°C. Dette materiale befries for beskyttelsesgrupper ved trinnvis behandling med trifluoreddiksyre og natriumhydroksyd som beskrevet i metode A.

Eksempel 30

Acetyltioacetyl- L- alanyl- L- tryptofan- metylester

L-alanyl-L-tryptofan-metylester-acetat (2,5 g) oppløses

i 20 ml dimetylformamid, og 2,0 g acetyltioeddiksyre-N-hydroksy-succinimidester tilsettes. Oppløsningens pH-verdi reguleres til 7,5 med N-metylmorfolin, og blandingen omrøres natten over ved romtemperatur. Oppløsningsmidlet fjernes i vakuum, og den gjenværende olje opptas i etylacetat, vaskes med vann, tørres og underkastes avdrivning i vakuum til et skumaktig residuum

(3 g). Residuet oppløses i etylacetat og tilføres til en

1,5 cm x 45.cm kolonne inneholdende 60 g Woelm basisk aluminium-oksyd (aktivitet I). Eluering med etylacetat gir 1,6 g av et skumaktig, fast stoff som gir en flekk med Rf 0,69 på en silikagel tynnskiktkromatograf, kloroform-metanol (3:1).

Eksempel 31

N-[ N-( merkaptoacetyl)- L- alanyl]- L- tryptofan- litiumsalt

En oppløsning av produktet fra eksempel 30 (1,2 g i

36 ml metanol) omrøres med 6 ml IN natriumhydroksydoppløsning under en nitrogenatmosfære i 1/2 time ved romtemperatur. Reaksjonsblandingen reguleres til pH 6, og oppløsningsmidlet fjernes i vakuum. Residuet fordeles mellom etylacetat og mettet natriumbikarbonatoppløsning (1:1). Den vandige fase vaskes med etylacetat, mettes med natriumklorid, surgjøres til pH 2,0 og ekstraheres med etylacetat. Etylacetat-ekstrakten tørres med natriumsulfat og underkastes avdrivning i vakuum til et skumaktig residuum. Residuet oppløses i en 50%ig vandig etanoloppløsning, og pH-verdien reguleres til 7 med IN litium-hydroksydoppløsning. Oppløsningen inndampes til tørrhet, og residuet opptas i vann og lyofiliseres til et hvitaktig, fast stoff (390 mg).

i

Analyse for ci6H18N3°4S-Li • 2H20:

Beregnet: C 49,11, H 5,67, N 10,73, S 8,18

C 48,78, H 5,07, N 10,41, S 7,85.

Eksempel 32

( R) - 1-[ N-( 2- merkapto- l- okso- 3- fenylpropyl)- L- alanyl]- L- prolin A. ( R)- 2- acetyltio- 3- fenyl- propionsyre

Natriumnitritt (32,75 g) settes til en avkjølt oppløsning av L-fenylalanin (51 g) og kaliumbromid (125 g) i 620 ml 25N svovelsyre over en periode på 1 time mens temperaturen i reaksjonsblandingen holdes ved 0°C. Reaksjonsblandingen omrøres i ytterligere 1 time ved 0°C og derefter i 1 time ved romtemperatur. Reaksjonsblandingen ekstraheres derefter med eter, og eterekstrakten tørres over natriumsulfat. Eteren fjernes for å efterlate (S)-2-brom-3-fenyl-propionsyre som et oljeaktig residuum (44,9 g) som destilleres ved 142-144 C (0,25 mm Hg).

En blanding av tioeddiksyre (8,7 ml) og kaliumhydroksyd (6,8 g) i 225 ml acetonitril omrøres i 1 time og 15 minutter ved romtemperatur. Blandingen avkjøles i et isbad, og 25,3 g (S)-2-brom-3-fenyl-propionsyre i 25 ml acetonitril tilsettes i løpet av 10 minutter. Efter omrøring i 5 timer filtreres reaksjonsblandingen, og oppløsningsmidlet fjernes i vakuum, og det oljeaktige residuum oppløses påny i etylacetat og tørres, og oppløsningsmidlet fjernes for å gi 24 g uren (R)-2-acetyltio-3-fenyl-propionsyre. Det urene materiale renses via dannelse av dicykloheksylaminsaltet under anvendelse av eter som et krystallisasjonsoppløsningsmiddel. Den frie syre, [a]D =6 2°

(c = 2,8, kloroform) regenereres med saltsyre og ekstraksjon med etylacetat.

B. R-( 2- acetyltio- 3- fenyl)- propionyl- L- alanyl- L- prolin

Det ovenstående produkt fremstilles ved omsetning av (R)-2-acetyltio-3-fenylpropionsyren fra del (A) ovenfor med L-alanyl-L-prolin ved fremgangsmåten ifølge eksempel 14,

sm.p. (124°) 135-138°C, [a]<25> = -23° (c = 1,4, kloroform).

C. R- l-[ N-( 2- merkapto- l- okso- 2- fenylpropyl)- L- alanyl- L- prolin

Ved å fortsette fremgangsmåten ifølge eksempel 14 med materialet fra del (B) ovenfor og å anvende natriumhydroksyd istedenfor ammoniumhydroksyd, får man tittelproduktet som et skumaktig, fast stoff, [a]25 = -78,4° (c = 1,1, kloroform).

Analyse for <c>i7<H>22<N>2°4<S>'2H2°

Beregnet: C 52,83, H 6,78, N 7,25, S 8,30

Funnet: C 52,54, H 6,26, N 7,01, S 8,16

Eksempel 33

( S)- 1-[ N-( 2- merkapto- l- okso- 3- fenylpropyl)- L- alanyl- L- prolin

A. ( S)- 2- acetyltio- 3- fenylpropionsyre

Ved å følge fremgangsmåten fra del (A) i eksempel 32 og anvende D-fenylalanin istedenfor L-fenylalanin får man produktet med sm.p. 146-147°C fra etylacetat i form av dicykloheksylaminsaltet. Den frie syre regenereres med saltsyre og ekstraheres med etylacetat, [a]p = -70,1° (c = 1,91, kloroform)

B. ( S)- ( 2- acetyltio- 3- fenyl) propionyl- L- alanyl- L- prolin

Ved omsetning av materialet fra del (A) ovenfor med L-alanyl-L-prolin ved fremgangsmåten ifølge eksempel 32(B)

får man den ovenstående tittelforbindelse som et oljeaktig residuum som stivner ved utgnidning med etyleter og heksan, sm.p. 161-163°C, [a]<25> = -109,6° (c = 1,5, kloroform).

C . ( S) - 1- [ N- ( 2- merkapto- l- okso- 3-- fenylpropyl) - L- alanyl- L- prolin

Den ovenstående tittelforbindelse erholdes ved behandling av materialet fra del (B) ovenfor ved fremgangsmåten ifølge eksempel 32(C), som et skumaktig, fast stoff,

[a]<25> = -82,7° (c = 1,5, kloroform).

Analyse for <C>17<H>22N2<0>4<S*>H20:

Beregnet: C 55,42, H 6,56, N 7,50, S 8,70

Funnet: C 55,25, H 6,18, N 7,36, S 8,43

SH-titrering: 99,1%

Eksempel 3 4

N-[ N-[ 2-( merkaptometyl)- l- okso- 3- fenylpropy13glycyl]-L-arginin

A. N-[ 2-[( acetyltio) metyl]- l- okso- 2- fenylpropyl] glycin

En prøve på 13 g (0,06 7 mol) benzylmalonsyre blandes med

7,6 g (0,068 mol) 40%ig vandig dimetylamin og 5,4 g (0,068 mol) 37%ig formalin i 150 ml vann. Det voluminøse, faste, stoff som dannes i løpet av 15 minutter, frafiltreres efter 2 timer,

vaskes med vann og tørres delvis i luft for å gi 20,8 g (teoretisk = 16,8 g). Det faste stoff smeltes i 170° oljebad

og oppvarmes i 10 minutter inntil aminutviklingen er stoppet og bobling i realiteten har opphørt. Det avkjølte produkt,

en flyktig væske, surgjøres med 10% KHSO^, ekstraheres med heksan, tørres (Na2S0^) og inndampes for å gi 6,3 g fast stoff. De vandige filtrater fra Mannich-reaksjonen får stå natten over og oppvarmes derefter ved 100°C på en dampkonus inntil bobling opphører (2 timer). Avkjøling, surgjøring og ekstraksjon som ovenfor gir ytterligere 1,2 g fast stoff, for å gi totalt 7,5 g (75%) benzylakrylsyre.

En prøve på 6,2 g (0,04 mol) benzylakrylsyre i 350 ml diklormetan behandles med 5,4 g (0,04 mol) etylglycinat-hydroklorid og 3,8 g (0,04 mol) trietylamin. Blandingen avkjøles i is, og 7,9 g (0,04 mol) dicykloheksylkarbodiimid tilsettes. Blandingen omrøres ved 25°C natten over og filtreres derefter. Filtratene ristes med vandig bikarbonat, 10% KHSO^, derefter vann, og tørres (Na2S04) og inndampes til en olje. Denne opptas i 200 ml metanol og behandles med overskudd av 10%ig NaOH. Blandingen oppvarmes i 15 minutter på en dampkonus og inndampes derefter til en vandig oppslemning. Denne filtreres, og filtratene ekstraheres med eter. Den vandige fase surgjøres (10%ig HC1) og ekstraheres med kloroform, ekstraktene tørres (Na2S0^) og inndampes til en olje, 7,3 g (80%).

Tioleddiksyre (10 ml) settes til 3,2 g (0,014 mol) av glycinderivåtet, og den resulterende oppløsning inndampes neste dag i vakuum. Utgnidning med isopropyleter gir et nesten hvitt, fast stoff, 2,9 g. Omkrystallisering fra etylacetat-heksan gir 2,5 g (60%), sm.p. 97-10l°e.

Analyse for C,.H,-N0.S:

J 14 17 4

Beregnet: C 56,93, H 5,80,_ N 4,74, S 10,85

Funnet: C 56,68, H 5,87, N 4,77, S 10,81

B. N-[ N-[ 2-[( acetyltio) metyl]- l- okso- 3- fenylpropyl] glycyl-L- arginin

En 0,3 g prøve (1 mmol) av produktet fra del (A) oppløses

i 25 ml tørr tetrahydrofuran, 0,11 g (1,1 mmol) trietylamin tilsettes, og blandingen avkjøles til 0°C. Derefter tilsettes 0,11 g (1 mmol) etylklorformiat, og efter at blandingen er omrørt i 40 minutter ved 0°C filtreres den inn i en oppløsning av 0,17 g (1 mmol) arginin i 10 ml v?.nn. Efter omrøring ved 25°C natten over inndampes blandingen til en vandig blanding som fortynnes til 30 ml med vann og ekstraheres forsiktig (for å unngå emulsjoner) med etylacetat. Den vandige fase kromatograferes på 50 g "Avicel" i vann, idet man oppsamler 25 ml fraksjoner.

De to Sakaguchi-positive fraksjoner samles og filtreres gjennom et såkalt "nuclepore" polykarbonat-filter og lyofiliseres for å gi 0,3 g (63%) hvitt pulver, sm.p. 105-120°, som efter tørring ved 95-100°C i 6 timer i vakuum gir korrekt analyse for til-stedeværelse av 1,5 mol vann.

Analyse for C20H2gN505S•1,5 H20:

Beregnet: C 50,19, H 6,74, N 14,63, S 6,70

Funnet: C 50,38, H 6,56, N 14,95, S 6,50

C. N-[ N-[ 2-( merkaptometyl)- l- okso- 3- fenylpropyl] glycyl]-L- arginin

En 0,5 g (1,1 mmol) prøve av produktet fra del (B) avkjøles i is og behandles med 4 ml kons. NH^OH under argon. Efter om-røring i 1 time inndampes prøven :. vakuum til et glass. Dette utgnies med 25 ml acetonitril i 2 timer, og derefter dekanteres oppløsningsmidlet og erstattes med friskt oppløsningsmiddel og omrøres i 2 1/2 dager under argon. Det resulterende, hvite, faste stoff filtreres og vaskes med acetonitril og eter.

Tørring ved 45° over KOH, P2°5°^ paraffin ved 0,01 mm Hg

natten over gir 0,25 g (55%) fast stoff, sm.p. 120-137°C.

Analyse for C gH^N^S ■ 1, 75 H2,0

Beregnet: C 49,02, H 6,97, N 15,88, S 7,27

Funnet: C 48,89, H 6,67, N 16,17, S 7,28

Claims

Analogifremgangsmåte for fremstilling av en terapeutisk aktiv forbindelse med formelen

eller en alkylester eller et salt derav, hvor er hydrogen, alkanoyl eller

R2 er hydrogen, alkyl eller fenylalkyl,

n er 0 eller 1, og A^ og A2 er hver en a-amino- eller a-imino-syrerest valgt fra prolin, tryptofan, glycin, fenylglycin, alanin, fenylalanin, leucin, isoleucin, valin og arginin, bundet sammen gjennom en peptidbinding, karakterisert ved at et dipeptid med formelen A-^-A,, eller et alkylesterderivat derav, acyleres, direkte eller trinnvis, med_enHtiosyre med formelen

hvor R^' er alkanoyl eller benzoyl, for å danne produkter hvor R^ er alkanoyl eller benzoyl, og produktene underkastes konvensjonell hydrolyse for å danne produkter hvor R^ er hydrogen, og produktene hvor R^ er hydrogen oksyderes for å danne produkter hvor R^ er