NO133590B - - Google Patents

Description

Fremgangsmåte til fremstilling av des-fenylalanin- Bl-insulin.

Oppfinnelsens gjenstand er en fremgangsmåte

til fremstilling av des-fenylalanin- Bl-insulin, idet fremgangsmåten erkarakterisert vedat man omsetter insulin i en blanding som består av et N,-W-dialkylkarboksylsyreamid med tilsammen 3 - 6 karbonatomer og en vandig pufferoppløs-ning med en pH-verdi fra 8,0 - 9,0., med et overskudd av tert.butyloksykarbonyl-azid ved værelsestemperatur eller lett forhøyede temperaturer, deretter omsetter med 2 - A ekvivalenter av et usubstituert eller med en negativ substi-tuent utstyrt fenylisotiocyanat og behandler reaksjonsproduktet med en sterk syre. Som sterk syre anvendes' fortrinnsvis trifluoreddiksyre.

Des-fenylalanin- Bl--insulin ble tidligere dannet av fluorescein- eller fenyl-tiokarbamoyl- Bl-insulin ved hjelp av Edmans avbygning. Ved omsetning av insulinet med de tilsvarende isotiocyanater til tiokarbamoylforbindelser oppstår imidlertid alltid blandinger, da tre tilstedeværende amino-grupper kan reagere i forskjellig grad. Disse blandinger måtte hittil nøysomt skilles ved søylekromatografi i 8 M urinstoff eller ved gel-elektroforese før man etter Edman-avbygningen fikk enhetlige forbindelser. Slike adskillelser er imidlertid bare mulig i liten grad og tjente hittil fremfor alt analytiske formål.

Eerimot lar fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen seg lett overføre i større målestokk, hvilket er den spesielle for-del ved denne fremgangsmåte.

Ved reaksjonen mellom tert.butyloksykarbonyl-azid og insulin oppstår overraskende under de nevnte "betingelser for

a( Al) fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen helt overveiende N , N e(B29)-di-tert.-butyloksykarbonyl-insylin, hvis ennå fri amino-gruppe på fenylalanin Bl bare omsettes selektivt med et fenyliso-

tiocyanat. Ved den etterfølgende behandling av reaksjonsproduktet med en sterk syre, fortrinnsvis trifluoreddiksyre, av-spaltes samtidig de to tert.butyloksykarbonylgrupper og fenylalanin Bl (som tioazolinon).

Som utgangsprodukter kommer det på tale insulin

av forskjellige arter, fortrinnsvis anvender man storfe-

eller svineinsulin eller en blanding av disse to insuliner i ønskelig blandingsforhold.

Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen gjennomføres eksempelvis således at man suspenderer resp. oppløser 1 mmol insulin i 30-70 ganger vektsmengden av et N,N'-dialkylkarboksylsyreamid, som kan inneholde inntil ca. 25% vann.

Som dialkylkarboksylsyreamid anvendes eksempelvis: dimetylformamid, dimetylacetamid, dietylformamid eller N-metylpyrrolidon-. Deretter tilsettes 20-75 mmol tert.butyloksykarbonyl-azid og

en pufferoppløsning i 2,5-4 ganger volummengden, referert til vekten av anvendt insulin og deretter omrøres 3-6 timer ved.

ca. 35-40<o>C~. Som puff eroppløsning kan det eksempelvis anvendes 1 N alkalibikarbonat eller alkalifosfatpuffer av pH

8,0 - 9>0. Reaksjonstemperaturen.kan også økes til ca. 50°C, foretrukket er imidlertid ca. 35_40°C. Omsetningen forløper allerede ved værelsestemperatur, imidlertid kreves da 4 - 6

.ganger tiden.

Til intermediær isolering av di-tert.-butyloksykarbonylinsulin.feller man enten direkte ut med eter. eller bringer oppløsningen først ved maksimalt 50°C badtemperatur

til tørrhet i vakuum og utdriver deretter med eter. For fjerning av puffersaltene digererer man med 5-10 ganger vektsmengden 1 - 2%- ig eddiksyre og vann og tørker i vakuum over P205*

For fremstilling av fenyltiokarbamoylforbindelsen oppløser man produktet fordelaktig i ca. 20-50 ganger mengden ca. p0-95$-ig vandig pyridin, fortrinnsvis 80-95$-ig, tilsettes 1,5-4 mmol av en fenylsennepsolje, som eventuelt kan være substituert. Istedenfor pyridin kan det også anvendes dimetylformamid som oppløsningsmiddel. Som substituenter av fenylsennepsolje kommer det på tale negative substituenter som f.eks. klor, nitro- eller- trifluormetyl. Man omrører 3~20 timer, fortrinnsvis 3-6 timer, ved værelsestemperatur, idet man hensiktsmessi<p->avslutter oppsetningen ved opptredende uklar- het (tegn på begynnende denaturering av reaksjonsproduktet). Man kan imidlertid arbeide under tilsvarende forkortelse resp. forlengelse av reaksjonstiden ved ca. 40°C eller ved 0 - 10°C.

Etter avsluttet reaksjon utfelles reaksjonsproduktet med eter, oppbevares 1-2 timer i ca. 10 ganger vektsmengden trifluoreddiksyre, utfelles igjen med eter og krystal-liserer på kjent måte ved en pH-verdi på 550-5,5-Aminosyreanalysen av forbindelsen viser den ventede sammensetning. En typisk analyse med glutaminsyre som foretrukket stoff er f.eks. for de interesserende aminosyrer:

, Glu beregnet 7 funnet 7,00

Gly beregnet 4 funnet 3,98

Phe beregnet 2 funnet 2,06

Lys beregnet 1 funnet 1,.01.

Det ifølge oppfinnelsen fremstilte des-fenylalanin- Bl-insulin har forbindelsens allerede kjente egenskaper. Dens fordelaktige og spesielle anvendelse som legemiddel (som antidiabetikum) beror på noen i forhold til insulin forandrede fysikalske egenskaper, f.eks. forhindelsens forandrede opp-løselighet.

Eksempler.

De følgende eksempler skal nærmere forklare oppfinnelsen. For karakteriseringen av de acylerte.insuliner tjente papirelektroforese (6 timer 200" volt: i eddiksyre/ maursyre pH 2: fargning med bromfenolblå), for kontroll av avspaltningen av fenylalanin tjente elektroforese og amino-syre-analyse.

E ksempel 1.

a) lg (0,l67 mmol) svine-insulin opptas i 70 cm^ 80^-ig- dimetylacetamid. Man tilsetter 1,45 g (10 mmol) tert.

butyloksykarbonyl-azid og 3,3 om^ (3» 3 mmol) 1 N natriumbi-karbonat og omrører i 5 timer ved 35°C. Deretter inndampes oppløsningen i vakuum ved maksimalt 50°C badtemperatur-. Resi-duet utdriver man med eter og får 1,275 g saltholdig produkt, som etter digerering med 20 cm^ 2% eddiksyre.gir 945 mg (Al) (B29 )-di-tert .butyloksykarbonylinsulin (svin).

b) Denne forbindelse oppløses i 4 cm^ 95% pyridin. Man tilsetter 0,0365 cm-' fenylisotiocyanat og omrører i 4

timer ved værelsestemperatur. Deretter inndampes i vakuum'

ved maksimalt 50°C badtemperatur til lite volum og forbindelsen

felles med eter. Utbytte: 820 mg N0^•Ne^B29^-di-tert. butyloksykarbonyl-Na^B1^-fenyltiokarbamoyl-insulin (svin). c) 820 mg av den ifølge b) fremstilte forbindelse oppbevares i 1 time i 8,5 cm^ trifluoreddiksyre ved værelse.s-temperatur. Ved tilsetning av 100 cm^ eter faller det ut 720 mg des-fenylalanin- Bl-insulin (svin), som på kjent måte kan bringes til krystallisasjon ved pH 5,0 til 5,5. Behand-lingen med trifluoreddiksyre kan også foretas 10 minutter ved 50°C under tilbakeløp. Phe.beregnet 2,00 funnet 2,Od. Ek sempel 2.

Man omsetter 1 g storfe-insulin ifølge eksempel 1 og fåo r 710 mg des-fenylalari—i■ n- B1-insulin (storfe).

Phe beregnet 2,00 funnet 2,05.

E ksempel 3.

Man omsetter 1 g storfe-insulin ifølge eksempel 1, gjennomfører imidlertid reaksjon b) i løpet av 50 timer ved +5°C i 85% pyridin.

Utbytte: 695 mg des-fenylalanin- B1-insulin (storfe).

Phe beregnet. 2,00 funnet 2,06.

Eksempel k .

Man omsetter 1 g svine-insulin ifølge eksempel 1, gjennomfører imidlertid reaksjon b.) i løpet av 1 time ved 40°C. Utbytte: 725 mg des-fenylalanin- Bl-insulin (svin).

Phe beregnet 2,00 funnet 2,03.

Ek sempel 5.

Man omsetter 1 g blandings-insulin"(storfe og svin) ifølge eksempel 1, fremstiller imidlertid reaksjon b) med 0,3 mmol 4-nitro-fenyl-isotiocyanat i løpet av 2 timer ved værelsestemperatur den tilsvarende 4-nitrofenyltiokarba-■rnoy 1-f orbindelse.

Utbytte: 780 mg des-fenylalanin- B1-insulin.

.Phe beregnet 2,00 funnet 2,02.

Eksempel 6.

Man omsetter 1 g storfe-insulin ifølge eksempel 1, fremstiller imidlertid i reaksjon b) med 0,4 mmol 4-klor-fenylisotiocyanat i løpet av 3 timer ved værelsestemperatur den tilsvarende 4-klor-fenyltiokarbamoyl-forbindelse. Utbytte: 765 mg des-fenylalanin- Bl-insulin (storfe).

Phe beregnet 2,00 funnet 2,05.

E ksempel 7.

Man omsetter 1 g svine-insulin ifølge eksempel 1, fremstiller imidlertid i reaksjon b) med 0,3 mmol 3-trifluor-metylfenylisotiocyanat i løpet av 2 timer ved værelsestemperatur den tilsvarende 3-trifluormetyltiokarbamoyl-forbindelse. Utbytte: 770 mg des-fenylalanin- RI-insulin (svin).

Phe beregnet 2,00 funnet 2,04.

Claims (2)

1. Fremgangsmåte til fremstilling av des-fenylalanin- Bl-insulin,karakterisert vedat man omsetter insulin i en blanding som består av et N,N'-dialkylkarboksylsyreamid med tilsammen 3 til 6 karbonatorner og én vandig pufferoppløsning av en pH-verdi fra 8,0 - 9,0, med et overskudd av tert.butyloksykarbonylazid ved værelsestemperatur eller lett forhøyede temperaturer, deretter omsetter med 2 til 4 ekvivalenter av et usubstituert eller med en negativ substi-tuent utstyrt fenylisotiocyanat og behandler reaksjonsproduktet med en sterk syre.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisert vedat det som sterk syre anvendes trifluoreddiksyre.