Uprawniony z patentu: Hoechst Aktiengesellschaft, Frankfurt n/Menem, (Republika Federalna Niemiec) Sposób wytwarzania des-fenyloalaninoB1-insuliny Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania des-fenyloalaninoB 1 -insuliny.Des-fenyloalaninoB1-insuline otrzymywano dotychczas z fluoresceino- lub fenylotiokarbamoilo81-insuliny przez rozklad Edmana. Przy przeksztalcaniu insuliny za pomoca odpowiednich izotiocyjanianów w zwiazki tiokarbamoilowe powstaja jednak mieszaniny, gdyz trzy obecne grupy aminowe moga reagowac w róznym stop¬ niu. Mieszaniny te dotychczas z trudem rozdzielano na zwiazki jednorodne na drodze chromatografii kolumnowej w 8 molowym roztworze mocznika lub na drodze elektroforezy zelowej. Tego rodzaju rozdzielania sa mozliwe jednak tylko w malej skali i sluzyly dotad przede wszystkim do celów analitycznych.Natomiast sposób wedlug wynalazku mozna bez trudu zastosowac na wieksza skale, co stanowi szczególna zalete tego sposobu.Sposób wedlug wynalazku polega na tym, ze insuline w mieszaninie, skladajacej sie z amidu kwasu N,N'-dwualkilokarboksylowego posiadajacego lacznie 3—6 atomów wegla i wodnego roztworu buforowego o wartosci pH 8,0—9,0 poddaje sie reakcji z nadmiarem lll-rzed.-butyloksykarbonyloazydu w temperaturze po¬ kojowej lub w lekko podwyzszonej, a nastepnie z 2—4 równowaznikami niepodstawionego lub podstawionego ujemnym rodnikiem fenyloizotiocyjanianu, a produkt reakcji traktuje sie silnym kwasem, np. kwasem trójfluoro- octowym.Przy reakcji lll-rzed.-butyloksykarbonyloazydu z insulina powstaje niespodziewanie w warunkach poda¬ nych w sposobie wedlug wynalazku w przewazajacej Nosci N<*(A1), N^B29)-dwu(lll-rzed.-butyloksykarbony- lo)-insulina, której jeszcze wolna grupa aminowa przy fenyloalaninie61-zostaje selektywnie poddana reakcji z fe- nyloizotiocyjanianem. Przy nastepnym potraktowaniu produktu reakcji silnym kwasem, korzystnie kwasem trójfluorooctowym, obie grupy lll-rzed.-butyloksykarbonylowe i fenyloalanina61 (jako tiazolinon) ulegaja jedno¬ czesnie odszczepieniu.Jako produkt wyjsciowy stosuje sie insuline róznego rodzaju, korzystnie insuline swinska lub bydleca lub mieszanine obu tych insulin w dowolnym stosunku.Sposób wedlug wynalazku prowadzi sie np. tak, ze 1 milimol insuliny suspenduje sie lub rozpuszcza2 81164 w 30^70-krotnej wagowo ilosci amidu kwasu N,N'-dwualkilokarboksylowego, który moze zawierac do okolo 25% wody. Jako amid kwasu dwualkilokarboksylowego stosuje sie np. dwumetyloformamid, dwumetyloaceta- mid, dwuetyloformamid lub N-metylopirolidon. Nastepnie dodaje sie 20—75 milimoli lll-rzed.-butyloksykarbo- nyloazydu i 2,5—4 krotna objetosciowo ilosc roztworu buforowego w stosunku do ilosci wagowej uzytej insu¬ liny, po czym miesza sie wciagu 3—6 godzin w temperaturze 35°—40°C. Jako roztwór buforowy mozna stoso¬ wac np. 1 N roztwór wodoroweglanu alkalicznego lub bufor zawierajacy fosforan metalu alkalicznego o pH 8,0—9,0. Temperature reakcji mozna równiez podniesc do okolo 50°C, korzystna temperatura wynosi jednak 35°-40°C. Reakcja przebiega juz w temperaturze pokojowej, jednakze wymaga wtedy 4-6 krotnie dluzszego czasu.W celu wyodrebnienia posredniej dwu-(lll-rzed.-butyloksykarbonylo)-insuliny albo wytraca sie ja bezpo¬ srednio eterem albo najpierw odparowuje roztwór pod próznia do sucha w temperaturze lazni wodnej najwyzej 50°C, a nastepnie rozciera z eterem. W celu usuniecia soli buforowych ekstrahuje sie 5-10 krotna iloscia wagowa 1—2% kwasu octowego i wody i suszy pod próznia nad P2Os.W celu wytworzenia zwiazku fenylotiokarbamoilowego rozpuszcza sie produkt korzystnie w 20—50-krotnej ilosci 60—95%, najkorzystniej 80—95% wodnego roztworu pirydyny, dodaje 1,5—4 milimoli oleju fenylogorczy- cznego, który ewentualnie moze byc podstawiony Zamiast pirydyny mozna równiez jako rozpuszczalnik zasto¬ sowac dwumetyloformamid. Jako podstawniki oleju fenylogorczycznego moga wystepowac podstawniki ujemne jak np. chlor, grupa nitrowa lub trójfluorometylowa. Roztwór miesza sie w ciagu 3—20 godzin, korzystnie 3—8 godzin, w temperaturze pokojowej, przy czym w przypadku wystapienia zmetnienia wskazujacego na zaczynajaca sie denaturacje produktu reakcji, reakcje sie konczy. Mozna równiez pracowac, skracajac lub przedluzajac odpowiednio czas reakcji w temperaturze okolo 40°C lub 0°—10°C.Po zakonczeniu reakcji produkt wytraca sie eterem, przetrzymuje w ciagu 1—2 godzin w okolo 10-krotnej ilosci wagowej kwasu trójfluorooctowego, powtórnie wytraca eterem i krystalizuje w znany sposób przy wartosci pH5,0-5,5. L Analiza aminokwasów zwiazku wykazuje oczekiwany sklad. Typowa analiza z kwasem glutaminowym jako substancja porównawcza przedstawia sie np. dla branych w tym przypadku pod uwage aminokwasów nastepu¬ jaco: Glu (glutamina) obliczono 7 znaleziono 7,00 Gly (glicyna) obliczono 4 znaleziono 3,98 Phe (fenyloalanina) obliczono 2 znaleziono 2,06 Lys (lizyna) obliczono 1 znaleziono 1,01 Wytworzona wedlug wynalazku des-fenyloalaninoB1-insulina ma znane juz wlasciwosci tego zwiazku. Jej korzystne i specjalne zastosowanie jako leku przeciwcukrzycowego opiera sie na kilku zmienionych wlasciwos¬ ciach fizycznych w porównaniu z insulina np. zmienionej rozpuszczalnosci tego zwiazku Ponizsze przyklady wyjasniaja blizej sposób wedlug wynalazku. W celu scharakteryzowania zacylowanych- insulin poslugiwano sie elektroforeza bibulowa (6 godzin, 200 V; w mieszaninie kwasu octowego i kwasu mrówkowego pH 2: zabarwienie blekitem bromofenolowym); do kontroli odszczepienia fenyloalaniny sluzyly elektroforeza i analiza aminokwasów.Przyklad I. 1 g (0,167 milimola) insuliny swinskiej miesza sie z 70 ml 80% dwumetyloacetamidu.Dodaje sie 1,45 g (10 milimoli) lll-rzed.-butyloksykarbonyloazydu i 3,3 ml (3,3 milimola) 1 N roztworu wodoro¬ weglanu sodowego i miesza wciagu 5godzin w temperaturze 35°C. Nastepnie roztwór zateza sie pod próznia w temperaturze lazni wodnej nie wyzszej niz 50°C. Pozostalosc rozciera sie z eterem i otrzymuje 1,275 g pro duktu zawierajacego sól, z którego po wyekstrahowaniu 20 ml 2% kwasu octowego uzyskuje sie 945 mg NOrtAD^ Ne(B29)-dwu-(lll-rzed.butyloksykarbonylo)-insuliny (swinskiej). b) Zwiazek ten rozpuszcza sie w 4 ml 95% pirydyny. Dodaje sie 0,0365 ml fenyloizotiocyjanianu i miesza sie wciagu 4 godzin w temperaturze lazni wodnej nie wyzszej niz 50°C do niewielkiej objetosci i zwiazek wytraca eterem.Wydajnosc: 820 mg N<* lotiokarbamoilo-insuliny (swinskiej). c) 820 mg otrzymanego jak w punkcie b) zwiazku utrzymuje sie wciagu 1 godziny w 8,5 ml kwasu trój- fluorooctowego w temperaturze pokojowej. Na 100 ml dodanego eteru wytraca sie 720 rng des-fenyloalani- noB1-insuliny (swinskiej), która mozna w znany sposób poddali krystalizacji przy pH 5,0-5,5. Traktowanie kwasem trójfluorooctowym mozna równiez prowadzic wciagu 10 minut w temperaturze 50° C lub wciagu 5 minut gotujac pod chlodnica zwrotna.Phe (fenyloalanina) obliczono 2,00 znaleziono 2,06.81164 3 Przyklad II. Poddaje sie reakcji 1g insuliny bydlecej jak w przykladzie I i uzyskuje sie 710 mg des-fenyJoalaninoB1-insuliny (bydlecej).Phe (fenyloalanina) obliczono 2,0 znaleziono 2,05.Przyklad III. Poddaje sie reakcji 1 g insuliny bydlecej jak w przykladzie I, prowadzac jednak reakcje b) w ciagu 50 godzin w temperaturze +5°C w 85% pirydynie.Wydajnosc: 695 mg des-fenyloalaninoB1 -insuliny (bydlecej).Phe (fenyloalanina) obliczono 2,00 znaleziono 2,06.Przyklad IV. Poddaje sie reakcji 1 g insuliny swinskiej jak w przykladzie I, prowadzac jednakie reak¬ cje b) w ciagu 1 godziny w temperaturze40°C. J Wydajnosc: 725 mg des-fenyloa!aninoB1-insuliny (swinskiej).Phe (fenyloalanina) obliczono 2,00 znaleziono 2,03.Przyklad V. Poddaje sie reakcji 1 g insuliny mieszanej (bydlecej i swinskiej) jak w przykladzie I, wytwarzajac jednakze w reakcji b) z 0,3 milimola 4-nitrofenyloizotiocyjanianu w ciagu 2 godzin w temperaturze pokojowej zwiazek 4-nitrofenylotiokarbamoilowy.Wydajnosc: 780 mg des-fenyloalaninoB 1 -insuliny.Phe (fenyloalanina) obliczono 2,00 znaleziono2,02. ' Przyklad VI. Poddaje sie reakcji 1g insuliny bydlecej jak w przykladzie I wytwarzajac jednakie w reakcji b) z 0,4 milimola 4-chlorofenyloizotiocyjanianu wciagu 3 godzin w temperaturze pokojowej zwiazek 4-chlorofenylotiokarbamoilowy.Wydajnosc: 765 mg des-fenyloalaninoB1-insuliny (bydlecej).Phe (fenyloalanina) obliczono 2,00 znaleziono 2,05.Przyklad Vii. Poddaje sie reakcji 1 g insuliny swinskiej jak w przykladzie I, wytwarzajac jednakie w reakcji b) z 0,3 milimola 3-trójfluorometylofenyloizotiocyjanianu w ciagu 2 godzin w temperaturze pokojowej zwiazek 3-trójfluorometylotiokarbamoilowy.Wydajnosc: 770 mg des-fenyloalaninoB i -insuliny (swinskiej).Phe (fenyloalanina) obliczono 2,00 znaleziono 2,04. PL PL