MXPA97008689A - Promotores de la expresion de genes - Google Patents

Abstract

La presente invención proporciona un sistema de expresión novedoso para la producción de proteína en huéspedes bacterianos. El sistema utiliza promotores novedosos que son altamente eficientes en el inicio de la transcripción y por lo tanto aumentan el rendimiento de proteína. Los promotores comprenden la región -35 del promotor consensus E. coli, la región -10 del promotor IppP-5 y un separador entres esas dos regiones derivado de cualquiera de los promotores Ipp p lacUV5.

Description

PROMOTORES DE . LA EXPRESIÓN DE GENES CAMPO DE LA INVENCIÓN Esta invención se relaciona con la técnica de la ingeniería genética aplicada a huéspedes bacterianos. De manera más particular, la invención se relaciona con sistemas de expresión para la producción de proteínas en huéspedes bacterianos.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION El advenimiento de la tecnología del ADN recombinante ha permitido la producción de varias proteínas que se encuentran en la naturaleza y sintéticas en organismos tales co o bacterias, hongos, levaduras y células de mamífero. En general esta implica la inserción de genes que codifican para una proteina deseada en un organismo huésped, y utilizar la maquinaria celular del huésped para expresar el gen. La tecnología del ADN recombinante se está desarrollando continuamente para lograr la producción de proteínas en campos comercialmente aceptables. Un factor limitante en la producción recombinante de proteínas es la velocidad a la cual el gen que codifica a la proteína deseada REF: 26057 se expresa. En particular, se ha encontrado que la región promotora de un gen es critica en el proceso de transcripción de la expresión del gen. Un promotor eficiente tal como el promotor trp encontrado en E. coli se une fuertemente a la ARN polimerasa dirigida a el ADN para iniciar la trancripción del gen en la generación del ARNm. Un promotor menos eficiente tal como el promotor lac se une a la ARN polimerasa menos fuertemente, dando como resultado una velocidad de generación de ARNm más baja. El promotor trp ha sido ampliamente usado en la producción de proteínas heterólogas debido a su capacidad para iniciar eficientemente la transcripción. A pesar de su eficiencia, un inconveniente inherente del promotor trp es que no puede ser controlado fácilmente. Específicamente, el promotor trp no es completamente reprimible, es decir que puede activar la transcripción antes de que el huésped crezca en el cultivo a una fase apropiada para la producción de proteína. Otro promotor ampliamente usado es el lac el cual es menos eficiente que el trp, pero es más controlable. Para desarrollar promotores más eficientes-, se han combinado componentes funcionales de diferentes promotores, por ejemplo, aquellos descritos en la Patente Estadounidense US 5,362,646. En un ejemplo, se combinaron las porciones del promotor Ai ( PA1 ) del bacteriófago T7 con dos operadores lac. Específicamente, la región separadora entre las llamadas regiones -35 y -lü del promotor del bacteriófago T7 fue reemplazada con una secuencia del operador Jac modificada, y para controlar el híbrido del promotor resultante, se introdujo un segundo operador lac corriente abajo. Se encontró que el sistema promotor/operador resultante que se incorporó en los plásmidos pUHE comercialmente disponibles inician la transcripción eficientemente tras la inducción y se expresa aún altamente antes de la inducción. Otro promotor descrito por Tsung et al (Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 1990, 87:5940) comprende la región -35 del trp eficiente, la región -10 del promotor lppP-5 altamente eficiente (una variante del promotor lpp) y un separador derivado del promotor lac . Este promotor mostró ser muy altamente eficiente en el inicio de la transcripción que resultó ser letal para la célula. Aunque varios promotores han permitido rendimientos mejorados de proteína en huéspedes microbianos, sigue existiendo aún la necesidad de promotores que dirijan la producción de proteínas comercialmente valios-as más eficientemente.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN De acuerdo a un aspecto de la presente invención, se proporciona un constructo de ADN recombinante novedoso, útil para la expresión de una proteína en un huésped bacteriano. El constructo comprende una región codificadora para una proteína y ligada operablemente a esta, una región de control que comprende un promotor que tiene una secuencia de ADN seleccionada de: 5I-TTGACAACATAAAAAACTTTGTGTTATACT-3'; y 5 ' -TTGACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATACT-3 ' .

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1 ilustra la secuencia nucleotídica y una representación esquemática de un cásete de expresión que incorpora los constructos de ADN recombinante de acuerdo con la invención; Las Figuras 2 y 3 ilustran las secuencias nucleotídicas de los constructos de ADN de acuerdo a la invención, que comprende un promotor y una región operadora.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona secuencias de ADN útiles para conducir la expresión del ADN con alta eficiencia en huéspedes bacterianos tales como la E. coli. El uso de vectores de expresión que comprenden esas secuencias proporciona medios valiosos para lograr un incremento en la producción de proteínas expresables, tanto endógenas como heterólogas. En un aspecto de la invención, se proporciona un constructo de ADN recombinante novedoso, útil para la expresión de una proteína en un huésped bacteriano. El constructo comprende una región codificadora para la proteína ligada operablemente a una región que comprende un promotor que permite la expresión de la proteína en el huésped, en donde el promotor comprende una secuencia de ADN seleccionada de: 5' -TTGACAACATAAAAAACTTTGTGTTATACT-3 ' ; y 5' -TTGACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATACT-3f .

Esos promotores tienen una región -35 común de la secuencia de consenso TTGACA y una región -10 de la secuencia TATACT. La secuencia separador, es decir, la secuencia de 18 bases que interviene, puede, de acuerdo a la invención ser cualquiera de las secuencias ACATAAAAAACTTTGTGT o CTTTATGCTTCCGGCTCG y es preferiblemente la secuencia ACATAAAAAACTTTGTGT. En consecuencia, la invención proporciona en una. modalidad preferida, constructos de ADN en los cuales el ADN que codifica para una proteína deseada que se liga de manera operable bajo el control de la expresión a un promotor de la secuencia 5,-TTGACAACATAAAAACTTTGTGTTATACT-3, . Aquellos expertos en la técnica apreciarán que los promotores de la invención constituyen un elemento esencial de los componentes requeridos, dentro de la región de control funcional, para conducir la expresión. Además, esos promotores pueden ser insertados usando los procedimientos estándar en cualquier vector de expresión adecuado que pueda duplicarse en una bacteria Gram -ve o +ve. De manera más particular, y para formar una región de control de la expresión del gen, los promotores de la presente deberán ser incorporados con otros elementos de control cuando se requiera típicamente para esa expresión, incluyendo un sitio de unión ribosomal y en modalidades de la invención, un operador que funciona para controlar la función del promotor. Esos componentes se arreglan necesariamente en relación mutua según se requiera para que ocurra la expresión de acuerdo a los principios bien conocidos de la expresión de genes . En una modalidad de la invención, la región de control del constructo incorpora un operador. Los operadores que pueden ser usados incluyen a aquellos directamente inducibles por inductores químicos y a aquellos, tales como el IAC los cuales son desreprimibles. Los ejemplos de operadores adecuados incluyen a los operadores de la lactosa, galactosa, triptófano, y tetraciclina de E. coli, (véase Miller et al "El Operón", Cold Spring Harbour Laboratory, 1980 y Hillen et al, J. Mol. Biol., 1984, 172:185). Los operadores preferidos son altamente reprimibles, de modo que la expresión del ADN que codifica para la proteína puede ser controlado. En una modalidad específica, la región de control comprende el operador lac (fig. 1), el cual previene la expresión del promotor en ausencia del inductor sintético isopropil-ß-D-tiogalactopiranósido (IPTG) y del inductor natural lactosa. La región de control comprende además una secuencia del sitio de unión ribosomal (RBS) para facilitar la unión de los ribosomas al transcripto del ARNp. y por lo tanto iniciar la traducción del ARN que codifica para la región para generar la proteína. Los sitios de unión ribosomales adecuados incluyen al lac y el bacteriófago T5. En una modalidad preferida el RBS es una secuencia derivada del RBS del bacteriófago T5 que tiene la secuencia ATTAAAGAGGAGAAATTAAGC-3, . La región de control de los constructos de acuerdo a la presente invención está ligada operablemente a una región que codifica para ua proteína endógena o heteróloga. El término "proteina heteróloga" se refiere a un polipéptido o proteína la cual, aunque no es producida de manera natural por el huésped bacteriano, es expresada por este huésped cuando se transforma de manera adecuada con ADN que codifica para la proteína; puede usarse ADN genómico, ADNc y ADN sintético para transformar al huésped. Las proteínas que pueden ser producidas usando el sistema aquí descrito incluyen, pero no se limitan a, hormonas tales como la hormona paratiroidea (PTH) , glucagon o fragmentos de las mismas y péptidos relacionados tales como el GLP-1 y GLP-2; factores del crecimiento tales como el factor del crecimiento epidérmico (EGF) ; y linfocinas tales como la interleucina 6 y 8 (IL-1, -8) . Para facilitar el aislamiento de la forma auténtica de la proteína, es decir la proteína sin un residuo de Met N-terminal adicional, también pueden producirse proteínas de fusión las cuales se escinden después de la expresión. Por ejemplo, el ADN que codifica para una proteína de interés puede ser preferido por el ADN que codifica para un péptido de señal, tal como la proteína ompA de la membrana externa de E^ coli. En este caso el gen expresado produce una proteína de fusión que comprende un péptido de señal ompA que contiene N-Met el cual es seguido por la proteína deseada. El péptido de señal contiene la proteína de fusión a través de la intermembrana de la bacteria en donde el péptido de señal es escindido. Otros péptidos de señal que pueden ser usados incluyen la fosfatasa alcalina, enterotoxina II térmicamente estable de E. coli y la proteína A de Streptococcus. De manera alternativa, puede sintetizarse y escindirse a proteína de fusión en un procedimiento separado para producir la proteína deseada. Por ejemplo puede escindirse glutation-S-transferasa (GST) de una proteína deseada con trombina o factor Xa.

En una modalidad específica de la invención, la región codificadora comprende el ADN que codifica para la PTH humana, la secuencia de aminoácidos de la cual es descrita por Hendy et al {Proc. Nati. Acad. Sci. EUA, 1981, 78:7365). En los ejemplos aqui descritos, la secuencia de ADN que codifica para la PTH se acopla directamente a y en el marco de lectura con el ADN que codifica para el péptido do señal o pA. Los constructos de ADN recombinantes preferidos ilustrados en la Figura 1, que tienen el separador Ipp o lacUV5, se produjeron a partir de oligonucleótidos de uha sola hebra sintetizados por el método de la fosfora idita. La hebra purificada sobre gel que comprende la secuencia del sitio de restricción Xhol a EcoRI se usó entonces como un objetivo de la PCR inicial y se amplificó por PCR en un fragmento de ADN de doble hebra usando oligonucleótidos de ADN de una sola hebra complementarios los cuales se hibridaron específicamente a los extremos de cualquiera de las secuencias oligonucleotídicas iniciales mostradas o su hebra complementaria. De este modo, los constructos se prepararon usando la metodología de síntesis de genes estándar, como se describe por ejemplo por Maniatis et al ("Clonación Molecular" Cold Spring Harbour Laboratories, 1982) e Innis et al ("Protocolos de PCR, Una Guía para los Métodos y Aplicaciones") .

En otro aspecto de la invención se proporcionan vectores de expresión útiles para producir transformantes de células huésped bacterianas, los cuales incorporan un constructo de ADN recombinante de acuerdo a la invención. Los constructos de ADN de acuerdo a la invención pueden ser incorporados como un "cásete" en un vector, de manera preferible un vector plasmidico, por las técnicas establecidas. De manera general, un vector se escinde en sitios de restricción que corresponden a los sitios de restricción en cualquier extremo del cásete. El cásete es introducido entonces ligando los extremos a los sitios escindidos complementario en el vector. Aunque pueden usarse vectores basados en bacteriófagos, se prefieren los vectores plasmídicos tales como los plásmidos de las series pBR322 y pUC. Una vez incorporado en un vector adecuado, el plásmido resultante 'puede ser amplificado en un huésped para proporcionar cantidades suficientes para el trabajo de clonación poster.or. Deberá apreciarse que el ADN que codifica para la proteína seleccionada se incorpora de manera conveniente en el plásmido con sitios de clonación múltiples proporcionados en él, usando los métodos de clonación/ligación estándar. También, un plásmido necesariamente deberá incorporar un origen de duplicación y de manera más deseable deberá incorporar un marcador tal como los genes de resistencia a la ampicilina o tetraciclina para permitir la selección de las células transformadas. También deberá apreciarse que se requerirán codones de interrupción traslacional en los tres marcos de lectura y una región de terminación transcripcional colocada correctamente para la expresión satisfactoria de la proteína deseada. Los terminadores transcripcionales adecuados incluyen los terminadores transcripcionales de E. coli trpA, thr, his y genes de phe. Una vez que el ADN que codifica para la proteína deseada es incorporado en el vector, un huésped bacteriano seleccionado se transforma con este usando las técnicas de transformación mediada por cloruro de calcio estándar. Los huéspedes bacterianos adecuados incluyen bacterias gram negativas tales como E. coli y Salmonella. De manera preferible el huésped es una cepa de E. coli comercialmente disponible y de manera más preferible JM101 y derivados de la misma. Cuando la región de control de constructo de ADN comprende el operador lac, como se describe en más detalle aquí posteriormente, la cepa huésped transformada deberá ser capaz de expresar, y de manera deseable en algunos casos sobreproducir, el producto de lacl, de modo que la función del promotor y en consecuencia la expresión de la proteína, pueden ser reguladas. La necesidad de sobreproducción de lacl por algunos transformantes puede ser satisfecha, de acuerdo a una modalidad de la invención, mediante el uso de huéspedes que ya contienen el gen laclq responsable de la sobreproducción del producto de la lacL . Las cepas de E. coli que sobreproducen lacl que pueden ser empleadas como huéspedes incluye las series de cepas JM disponibles de Clontech Laboratories Inc., California, EUA. Las cepas huésped específicas adecuadas para usarse incluyen la JM101, JM105 y JM107. De manera alternativa, la sobreproducción de lacl en el transformante puede ser satisfecha incorporando el gen lacl"1 en los vectores de la invención. Puesto que, en esta situación, la sobreproducción de lacl es mediada por el vector, puede emplearse cualquiera de una variedad de cepas huésped bacterianas comercialmente disponibles, incluyendo las cepas de E. coli DH1, RR1, C600, CMK603 y EB505. El gen laclq a ser incorporado en el vector puede obtenerse como un fragmento HindIII de 1.2 kb del plásmido pMMB22 (descrito por Bagdasarin et al (Gene, 1983, 26:27-3) y a continuación se incorpora de manera no disruptiva en cualquier sitio en el vector plasmídico. Para aumentar la estabilidad de la herencia del vector, en particular los plásmidos, de la cepa originalmente transformada a su progenie, también puede incorporarse un elemento de partición (par) funcional en E. coli en el vector. Uno de tales elementos par puede ser liberado de pSClOl como un fragmento HincII/Aval de 380pb y a continuación clonarse en un sitio adecuado en el vector. Después de la transformación, los huéspedes bacterianos que albergan el vector de expresión se cultivan en un medio de cultivo más apropiado para el huésped seleccionado. Para E. coli, puede usarse caldo LB o medio 2YT (extracto de levadura/triptona) para cultivar aquellas cepas aquí preferidas. La presión selectiva para los tranformantes plasmidicos deberá mantenerse proporcionando un agente citotóxico el cual mata a las cepas huésped no transformadas. Por ejemplo, podría cultivarse un transformante con un plásmido que albergue al gen de resistencia a la tetraciclina en un medio que contenga tetraciclina. Concentraciones de tetraciclina en el medio de alrededor de 5-15µg/mL son adecuadas . El promotor en el constructo es preferiblemente regulable a través de la unión de una molécula represora a un operador localizado adyacente al promotor en la región de control. En una modalidad preferida, el producto del gen lacl se une al operador lac localizados adyacente al promotor. En este caso, la unión del producto de lacl reprime al promotor, bajando los niveles de expresión del ADN codificador bajo su control. Para aumentar los niveles de expresión, se agrega IPTG química (isoprspil-ßHD-tiogalactopiranósido), el cual se une al lacl y desreprime al promotor, al medio de cultivo para desreprimir el promotor e inducir la expresión. De manera adecuada, el IPTG se agrega al medio de cultivo cuando las células han alcanzado una fase de crecimiento logarítmico moderado. Para determinar la densidad óptima a la cual los cultivos deberán crecer para obtener el rendimiento máximo de a proteína deseada, pueden conducirse ensayos y ensayarse los niveles de proteína en un experimento de curso de tiempo. En general, pueden recuperarse rendimientos de proteína razonable una vez que las células alcanzan la fase logarítmica media, aunque puede esperarse que se acumulen cantidades mayores de proteína dentro de aproximadamente 4-5 horas después. La proteína deseada puede ser unificada por las técnicas establecidas en la técnica según sea apropiado para esa proteína. En una modalidad específica de la invención, la PTH expresada se excreta más allá del espacio periplásmico y hacia— el medio de cultivo en donde es recuperada directamente. Cuando la proteína es excretada, el gasto medio puede ser aislado usando técnicas bioquímicas que reflejen la naturaleza de la proteína en términos de su tamaño molecular, carga neta, punto isoelétrico, etc. El medio puede ser primero concentrado, por ejemplo por liofilización. Además, cuando están disponible anticuerpos o está disponible un ligando natural para la proteína, pueden usarse columnas de afinidad. Ahora se ejemplifican las modalidades específicas de la invención con referencia a los dibujos.

EJEMPLO 1 En su forma madura, la PTH es un péptido de 84 aminoácidos que actúa en los humanos para aumentar el calcio en sangre y modular la formación de huesos. El ADN que codifica para la PTH humana se sintetizó usando las técnicas establecidas y de acuerdo a la secuencia de aminoácidos publicada por Hendy et al., supra, e incorporada dentro de los constructos descritos más adelante, como se muestra en la Figura 1. Los constructos de ADN recombinantes preferidos que incorporan el promotor #1 y #2 así como los promotores de referencia #3 y #4, ilustrados en la tabla 1 y la figura 1, a las cuales 3e hacer referencia ahora se produjeron a partir de un_oligonucleótido de una sola hebra sintetizado por el método de la fosforamidita. La hebra purificada sobre gel que comprende las secuencias del sitio de restricción Xhol a EcoRI se usó entonces como objetivo de la PCR inicial y se amplificó por PCR en un fragmento de ADN de doble hebra usando oligonucleótidos de ADN de una sola hebra complementarios que se hibridan específicamente a los extremos de cualquiera de las secuencias oligonucleotídicas iniciales mostradas o su hebra complementaria. De este modo, se prepararon los constructos usando la metodología de síntesis de genes estándar, de acuerdo a lo descrito por ejemplo por Maniatis et al ("Clonación Molecular" Cold Spring Harbour Laboratories, 1982) e Innis et al ("Protocolos de PCR, Una Guía para los Métodos y Aplicaciones"). Los constructos se clonaron entonces en un plásmido derivado del pUC18 el cual confiere resistencia a la tetraciclina en lugares de resistencia a la ampicilina. Una cepa huésped JM101 derivada de E. coli se tranfectó entonces de acuerdo a las técnicas establecidas (véase Maniatis et al "Clonación Molecular" Cold Spring Harbour Laboratories, 1982) .

EJEMPLO 2 Expreßión dßl Huésped Transformado Los transformantes que contienen los vectores de PTH s**. cultivaron durante la noche a 30°C en caldo 2YT que contenía 0.5% de glucosa y tetraciclina y a continuación se inocularon en medio fresco de la misma composición, con cultivo continuo a 30°C hasta que se alcanzó la fase logarítmica media. Los cultivos se indujeron entonces (IPTG 1 mM) a intervalos de crecimiento de 1 hora, se extrajeron alícuotas de cultivo y se fraccionaron para producir muestras de medio de cultivo para identificar los productos de la PTH excretados usando un ensayo de Allegro estándar. Los resultados de esos ensayos se proporcionan en la Tabla 1 a continuación: Tabla 1 Promotor PTX Max. # región región RBS (mg/L) -35 separador -10 6-8 horas 1 trp Ipp IppP-5 T5 245 lac 148 2 typ lacUV5 IppP-5 T5 121 lac 10 3 trp lacO IppP-5 T5 50 — lac 5 4 T7 lacO T7 T5 100 lac 10 Los resultados del ensayo de Allegro indican que los promotores que incorporan las secuencias lpp de 18 pb y lacu"V5 facilitan niveles aumentados de proteína PTH heteróloga. Los promotores #1 y #2 se comparan favorablemente con el promotor #3 en donde el separador es sustituido con una secuencia operadora de lac modificada (lacO) ; y el promotor #4 en donde las regiones -35 y -10 son del bacteriófago T7 y el separador es el promotor lacO. Los estudios con los mismos promotores que expresan al gen que codifica para la cloranfenicol acetil transferasa (CAT) mostraron resultados similares de aumentar la expresión de los promotores #1 y #2. También, se notó que cada uno de los promotores estudiados exhibieron rendimiento de proteína aumentado cuando se combinaron con RBD del bacteriófago T5 en comparación col el RBS derivado de lac^ LISTADO DE SECUENCIAS (1) INFORMACIÓN GENERAL: (i) SOLICITANTE: ALLELIX BIOPHARMACEUTICALS INC. (ii) TITULO DE LA INVENCIÓN: PROMOTORES PARA LA EXPRESIÓN DE GENES (iii) NUMERO DE SECUENCIAS: 11 (iv) DIRECCIÓN PARA LA CORRESPONDENCIA: (A) DIRECCIÓN: Nikaido, Marmeistein, Murray & Oram LLP (B) CALLE: 655 Fifteenth Street N.W. Suite 330 (C) CIUDAD: Washington (D) ESTADO: D.C. (E) PAÍS: E.U.A. (F) CP: 20005-5701 (v) FORMA LEGIBLE EN COMPUTADORA: __ (A) TIPO DE MEDIO: Disco Flexible (B) COMPUTADORA: IBM PC compatible (C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Patentln Reléase #1.0, Versión #1.25 (vi) DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL: (A) NUMERO DE SOLICITUD: PCT/IB96/00462 (B) FECHA DE PRESENTACIÓN: 16-MAY-1996 (C) CLASIFICACIÓN: (vii) DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR: (A) NUMERO DE SOLICITUD: US 08/445,133 (B) FECHA DE PRESENTACIÓN: 19-MAY-1995 (viii) INFORMACIÓN DEL MANDATARIO/AGENTE: (A) NOMBRE: Strachan, Grahara (C) NUMERO DE REFERENCIA/EXPEDIENTE: F8074-6007 (ix) INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIÓN: (A) TELEFONO: (202) 638-5000 (B) TELEFAX: (202) 638-4810 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:l: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 30 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) HEBRA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi) DECRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:l: TTGACAACAT AAAAAACTTT GTGTTATACT 30 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 2: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 30 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) HEBRA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi) DECRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2: I'TGACACTTT ATGCTTCCGG CTCGTAIACT 30 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 3: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 18 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) HEBRA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi) DECRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 3: ACATAAAAAA CTTTGTGT 18 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ÍD NO: : (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 18 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) HEBRA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi) DECRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 4: CTTTATGCTT CCGGCTCG 18 ;2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ÍD NO: 5: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 21 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) HEBRA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi) DECRIPCION DE* LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 5: ATTAAAGAGG AGAAATTAAG C 21 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 6: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 136 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) HEBRA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi) DECRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 6: CTCGAGGCCA CCCGGGCCAA AATTTATCAA AAATATCTGC AGTTGACAAC ATAAAAAACT 60 TTGTGTTATA CTGTCGACAA TTGTGAGCGG ATAACAATTT CACACAGAAT TCATTAAAüA 120 GGAGAAATTA AGCATG 136 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 7: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 132 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) HEBRA: sencilla (D) TOPOLOG A: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi) DECRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 7: CTCGAGGCCA CCCGGGCCAA AATTTATCAA AAATATCTGC AGTTGACAAC ATAAAAAACT 60 TTGTGTTATA CTGTCGACAA TTG GAGCGG ATAACAATTT CACACAGAAT TCAGGAGGAA 120 AAAATTATGA TG 132 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 8: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 136 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) HEBRA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi) DECRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 8: CTCGAGGCCA CCCGGGCCAA AATTTATCAA AAATATCTGC AGTTGACACT TTATGCTTCC 60 GGCTCGTATA CTGTCGACAA TTGTGAGCGG ATAACAATTT CACACAGAAT TCATTAAAGA 120 GGAGAAATTA AGCATG 136 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ LÜ NO: 9: (i; CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 132 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) HEBRA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi) DECRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: : CTCGAGGCCA CCCGGGCCAA AATTTATCAA .AAATATCTGC: AGTTGAfACT TTATGCTTCC 60 GGCTCGTATA CTGTCGACAA TTGTGAGCGG ATAACAATTT CACACAGAAT TCAG^AGGAA 120 AAAATTATGA TG 13? (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 10: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 136 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) HEBRA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi) DECRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 10: CTCGAGGCCA CCCGGGCCAA AÍ'l iAfCArt. AAAlA.Ci'GC AúlTGACATT GTGAGCGGAT 60 AACAATTATA CTGTCGACAA TTGTGAGCGG AGAA AAÍTT CACACAGAAT TCATTAAAGA 120 GGAAATTA AGCATG 136 (2) INFORMACI N PARA LA SLQ ID NO:li: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 132 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) HEBRA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: iineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi) DECRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 11: CTCGAGGCCA CCCGGGCCAA AATTTATCAA AAAIA'CTGC AGTTGACATT GTGAGCGGAT 60 AACAATTATA CTGTCGACAA TTGTGAGCGG ATAACAATTT CAILACAGAAT TCAGGAGGAA 120 AAAATTATGA TG 132 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 12: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 101 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) HEBRA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi) DECRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 12: C'iCGAGGCCA CCCGGGCCAA AATT ATCA? AGTGAC ACA lA?rtAAALTT -G'IGTTATAC 60 TGTCGACAAT TGTGAGCGGA TAACAATTTC ACACAGAATT C 101 (2) INFORMACIÓN PARA LA SLQ ID NO: 13: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 101 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) HEBRA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi) DECRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 13: CTCGAGGCCA CCCGGGCCAA AATTTATCAA ATTGACACTT TATGCTTCCG GCTCGTATAC 60 TGTCGACAAT TGTGAGCGGA TAACAATTTC ACACAGAA1 C 101 Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes:

Claims (14)

REIVINDICACIONES

1. Un constructo de ADN recombmante, el cual expresa una prcLe.na en rid célala Hu sped bacteriana, el constructo comprende una región que codifica para ia protema .Ligada operablemente a ana región de control que comprende un promotor ei cual promueve ?a expresión de tal protema en ia oéíUi.a nuesped, caracterizado porque el promotor comprende una secuencia de ADN que consiste de 5'-TTGACAACATAAAAAACT'?GGGI AIACÍ-3' (SEQ ÍD NO: D y 5'-TTGACACrriArGCfTCCGGCrCGrAiAC'l-3' (SEQ iD NO: 2).

2. El constructo de ADN recombinante de c nformi ad con La 1 , caracterizado porque la región promotora comprende la secuencia de ADN S'-TTGACAACATAAAAAACTTTGTÜIG?IACI-S' (SEQ ÍÜ O: 1).

3. El constructo de ADN recombinante de conformidad con la reivindicación 1 ó 2 , caracterizado porque la célula huésped bacteriana es una célula de E. coll .

4. El construcco de ADN recombinante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque la región ce control comprende además un operador para regular la expresión de la proteína.

5. El constructo de ADN recombinante de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque el operador es el operador lac .

6. El constructo de ADN recombinante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque la proteína es la hormona paratiroidea humana.

7. El constructo de ADN recombinante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque comprende además el ADN que codifica para el péptido de señal OmpA en el marco de lectura con la región codificadora, promoviendo por lo tanto la secreción de la proteína al periplasma de la célula huésped.

8. El constructo de ADN recombinante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque la región de control comprende un sitio de unión ribosomal T5 que tiene la secuencia de ADN ATTAAAGAGGAGAAATTAAGC (SEQ ID NO: 5) .

9. El constructo de ADN recombinante de conformidad con cualquiera de ias reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque la región de control comprende la secuencia expuesta en la Figura 2 (SEQ ID NO: 12) .

10. El constructo de ADN recombinante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque la región de control comprende la secuencia expuesta en la Figura 3 (SEQ ID NO: 13) .

11. Un vector, caracterizado porque comprende el constructo de ADN recombinante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10.

12. Una célula huésped bacteriana, caracterizada porque es transformada con un vector de conformidad con la reivindicación 11.

13. La célula huésped bacteriana de conformidad con la reivindicación 12, caracterizada porque es una célula de E. coli .

14. Un proceso para la producción de una proteína recombinante, caracterizado porque comprende cultivar una célula huésped de conformidad con las reivindicaciones 12 ó 13 bajo condiciones mediante las cuales la proteína es producida, y recuperar tal proteína.