MXPA02001260A

MXPA02001260A - Metodo para detectar y clasificar hibridacion de acido nucleico.

Info

Publication number: MXPA02001260A
Application number: MXPA02001260A
Authority: MX
Inventors: Hefti John
Original assignee: Signature Bioscience Inc
Priority date: 1999-08-02
Filing date: 2000-07-27
Publication date: 2002-07-22
Also published as: AU6381700A; US6340568B2; US20010034030A1; JP2004500035A; WO2001009381A2; WO2001009381A3; US6287776B1; EP1218539A2; CA2378901A1

Abstract

La presente invencion proporciona una variedad de metodos para conducir analisis de acidos nucleicos, utilizando un sistema de deteccion, el cual es sensible a las propiedades dielectricas unicas de diferentes complejos de hibridacion, y que puede distinguir entre diferentes complejos de hibridacion directamente sin el uso de marcas. Tambien se proporcionan metodos para utilizar el sistema para realizar la verificacion de secuencia, analisis de expresion, secuenciacion de novo y una variedad de otros analisis de acido nucleico.

Description

MÉTODO PARA DETECTAR Y CLASIFICAR HIBRIDACIÓN DE ACIDO NUCLEICO REFERENCIAS CRUZADAS A LAS SOLICITUDES RELACIONADAS Esta solicitud es una continuación en parte de la Solicitud de E.U.A. No. 09/243,194, presentada el 1 de febrero de 1999, la cual reclama el beneficio de la Solicitud Provisional de E.U.A. No. 60/073,445, presentada el 2 de febrero de 1998. Esta solicitud también reclama el beneficio de la Solicitud Provisional de E.U.A. 60/134,740 presentada el 18 de mayo de 1999. Esta solicitud también está relacionada con una solicitud de E.U.A. intitulada "Test Systems and Sensors for Detecting Molecular Binding Events" (Sistemas de Prueba y Sensores para Detectar Eventos de Unión Molecular), Solicitud de E.U.A. No. 09/365,978, presentada concurrentemente con la presente el 2 de agosto de 1999. Cada una de estas solicitudes se incorpora aquí por referencia en su totalidad para todos los propósitos.

CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a métodos novedosos para analizar las secuencias de moléculas de ácido nucleico utilizando métodos espectroscópicos. En particular, la presente invención se refiere a métodos para el análisis de expresión de gen, verificación de secuencia, detección de mutación, y secuenciación de ácidos nucleicos. Como tales, los métodos de la presente invención ampliamente se refieren a genética molecular y diagnóstico médico.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El conocimiento de la información genética en la forma de la secuencia del nucleótido de genes es crítico para entender los varios fenómenos biológicos tales como desarrollo y diferenciación de células, crecimiento y reproducción de organismos, las causas subyacentes de enfermedades, etc. Por ejemplo, las proteínas sirven para una variedad de funciones estructurales y catalíticas. Estas propiedades de proteínas, sin embargo, son una función de la secuencia de aminoácido de la proteína, la cual a su vez es codificada por secuencias de ácido nucleico. Los ácidos nucleicos también juegan un papel más directo en procesos celulares funcionando en el control y la regulación de la expresión de gen. Se ha desarrollado una variedad de técnicas de hibridación para conducir varios tipos de análisis de ácido nucleico para ganar perspicacia en cómo la información genética funciona en estos tipos de diferentes procedimientos biológicos. Típicamente, las técnicas de hibridación involucran la unión de ciertos ácidos nucleicos objetivo a través de sondas de ácido nucleico bajo condiciones controladas, de manera que la hibridación solamente ocurre entre secuencias complementarias. Al utilizar dichas técnicas de hibridación, es posible conducir estudios de expresión de gen, estudios de verificación de secuencia y determinar la secuencia de ácidos nucleicos de una secuencia desconocida, así como una variedad de otros tipos de análisis. Los estudios de expresión de gen son importantes ya que la expresión diferencial del gen ha mostrado estar asociada con el desarrollo de células, diferenciación de células, estados de enfermedad y adaptación a varios estímulos ambientales. Por ejemplo, se han caracterizado muchas enfermedades a través de las diferencias en los niveles de expresión de varios genes, ya sea a través del cambio en un número de copias del ADN genético o a través de alteraciones en niveles de transcripción. En ciertas enfermedades, la infección frecuentemente es caracterizada por una expresión elevada de genes a partir de un virus particular. La verificación de secuencia se refiere a métodos en donde se analizan muestras que contienen activadores de ácido nucleico para detectar la presencia de una secuencia de interés. Este tipo de análisis tiene utilidad en diversas aplicaciones, incluyendo investigación, diagnóstico clínico, control de calidad, etc. Un tipo particular de verificación de secuencia, el cual es particularmente importante, es la identificación de polimorfismos, los cuales son variaciones en el código genético. Por lo general, los polimorfismos toman la forma de un cambio en un nucleótido individual y se denominan polimorfismos de nucleótido individual (SNPs). En otros casos, el polimorfismo puede existir como un estiramiento de secuencias de repetición que varían en ^^^^H^ funnm- ^?mál Éi ¡uí áÍ longitud entre diferentes individuos. En esos casos en donde estas variaciones existen en un porcentaje importante de la población, pueden ser fácilmente utilizados como marcadores enlazados a genes involucrados en rasgos mono- y poligénicos. De esta manera, el análisis de polimorfismos juega un papel importante en la ubicación, identificación y caracterización de genes que son responsables de rasgos específicos. En particular, se pueden utilizar polimorfismos para identificar genes responsables de ciertas enfermedades. Similarmente, también se pueden desarrollarse pruebas de diagnóstico para detectar polimorfismos que se sabe que están asociados con ciertas enfermedades o trastornos. Las técnicas de hibridación también pueden ser exitosamente utilizadas en la secuenciación de ácidos nucleicos de una secuencia desconocida. Tales métodos típicamente son considerablemente más rápidos que las técnicas de secuenciación convencionales. Se pueden utilizar un tipo de obleas o circuitos integrados a los cuales se unen sondas de ácido nucleico, para conducir análisis de ácido nucleico. Las sondas pueden estar unidas en ubicaciones específicas sobre la oblea o circuito integrado; estas ubicaciones por lo general son denominadas como elementos o sitios. En algunas aplicaciones, la oblea o circuito integrado puede incluir muchos elementos dispuestos en la forma de un arreglo. Los métodos genéticos que utilizan arreglos sobre disposiciones tienen la ventaja de permitir el procesamiento paralelo que puede incrementar dramáticamente la velocidad a la cual los análisis pueden ser conducidos según comparado con métodos convencionales que por lo general requieren de separaciones electroforéticas laboriosas. Sin embargo, los métodos actuales de ácido nucleico que utilizan obleas típicamente requieren de procedimientos de marcación complejos con el fin de identificar qué sondas de ácido nucleico han hibridizado con una molécula objetivo. Además, los métodos frecuentemente involucran lavados severos complicados con el fin de reducir al mínimo la unión entre sondas y objetivos, los cuales no son totalmente complementarios. La presente invención proporciona nuevos métodos para conducir varios tipos de análisis de ácido nucleico, en donde la hibridación de la sonda y secuencias objetivo puede ser directamente detectada, permitiendo así que los análisis sean simplificados con relación a metodologías existentes.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona varios métodos para analizar ácidos nucleicos utilizando un sistema, el cual es sensible a las propiedades dieléctricas de moléculas y complejos de unión, tales como complejos de hibridación formados entre una sonda de ácido nucleico y un objetivo de ácido nucleico. Los métodos incluyen métodos de diagnóstico que involucran detectar la presencia de uno o más ácidos nucleicos objetivo en una muestra, métodos cuantitativos, métodos cinéticos, y una variedad de otros tipos de análisis tales como verificación de secuencia, análisis de expresión y secuenciación de novo. Los métodos pueden detectar la unión entre ácidos nucleicos sin el uso de marcas. Ciertos métodos involucran el uso de arreglos que permiten una rápida producción. Otros métodos involucran el uso de perfiles espectrales, los cuales hacen posible distinguir entre diferentes tipos de complejos de hibridación. Algunos métodos provistos por la presente invención involucran poner en contacto una sonda de ácido nucleico que está electromagnéticamente acoplada a una porción de una trayectoria de señal con una muestra conteniendo un ácido nucleico objetivo. La porción de la trayectoria de señal a la cual la sonda de ácido nucleico está acoplada, típicamente es una línea de transmisión continua. Se detecta una señal de respuesta para un complejo de hibridación formado entre la sonda de ácido nucleico y el objetivo de ácido nucleico. La detección puede involucrar propagar una señal de prueba a lo largo de la trayectoria de señal y después detectar una señal de respuesta formada a través de la modulación de ia señal de prueba a través del complejo de hibridación. Ciertos métodos de diagnóstico utilizan este aspecto general e incluyen utilizar una sonda de ácido nucleico, la cual es complementaria a un objetivo de la secuencia conocida. Una muestra potencialmente conteniendo el objetivo de la secuencia conocida se pone en contacto con la sonda complementaria. En algunos métodos, el objetivo y la sonda se dejan hibridizar y después los objetivos y sondas se lavan bajo condiciones severas. En otros métodos, el lavado severo es innecesario. La detección de una señal de respuesta es indicativa de la muestra que contiene el objetivo de la secuencia conocida. Tales métodos pueden ser usados para detectar un polimorfismo de nucleótido individual (SNP). El objetivo de ácido nucleico que contiene un sitio polimórfico incluye una primera o una segunda base en el sitio polimórfico. La sonda de ácido nucleico se selecciona para que sea complementaria ya sea para un objetivo de ácido nucleico, en donde el sitio polimórfico incluye la primera base, o es complementaria a un objetivo de ácido nucleico, en donde el sitio polimórfico incluye la segunda base. Con conocimiento de la secuencia de la sonda de ácido nucleico, la detección de una señal de respuesta hace posible identificar si el objetivo contiene la primera o segunda base en el sitio polimórfico. En otros aspectos, la presente invención proporciona una variedad de métodos, los cuales utilizan perfiles espectrales para analizar complejos de hibridación de ácido nucleico. Un perfil es un espectro para un complejo de hibridación particular. Se pueden incluir ciertas señales que son características del complejo particular, haciéndolo así posible utilizar firmas como una herramienta de diagnóstico y como una forma para distinguir diferentes tipos de unión. De esta manera, ciertos métodos incluyen adquirir un espectro para un complejo de hibridación formado entre una sonda de ácido nucleico y un objetivo de ácido nucleico, en donde la sonda de ácido nucleico está electromagnéticamente acoplada a una trayectoria de señal. Una señal de prueba es propagada a lo largo de la trayectoria de señal y una señal de respuesta para el complejo de hibridación formado entre la sonda y el objetivo, es detectada. A medida que la señal de prueba es propagada hacia la trayectoria de señal, la señal de prueba es variada con el tiempo (por ejemplo, variando la longitud de onda o frecuencia de la señal de prueba). Ciertos espectros incluyen gráficas de un parámetro de señal (por ejemplo, energía transmitida) como una función de la frecuencia, por ejemplo. Se pueden utilizar métodos que utilizan perfiles para propósitos de diagnóstico. Estos métodos involucran obtener un espectro, justo como se describió, en donde la sonda de ácido nucleico se pone en contacto con una muestra que contiene un ácido nucleico objetivo antes de la propagación de la señal de prueba. El espectro resultante después es analizado para la presencia de una señal conocida, la cual es característica de un complejo de hibridación conocido entre una sonda particular y un objetivo particular. La presencia de la señal conocida en el espectro es indicativa del ácido nucleico objetivo particular que está presente en la muestra. Los métodos relacionados utilizan perfiles para distinguir entre complejos de hibridización complementarios y complejos de desigualdad. En estos métodos, el espectro que es obtenido utilizando una sonda conocida es examinada para la presencia de una señal complementaria y/o una señal de desigualdad. La presencia de la señal complementaria es indicativa de la unión complementaria entre la sonda de ácido nucleico y el objetivo de ácido nucleico; asimismo, la presencia de una señal de desigualdad es indicativa de un complejo de hibridación entre la sonda y el objetivo que incluyen una desigualdad.

En otros métodos relacionados, se utilizan perfiles para identificar si un SNP es de la forma del tipo silvestre o una forma variante. El objetivo incluye un sitio polimórfico que puede incluir una primera o una segunda base. La secuencia de sonda de ácido nucleico se selecciona de manera que si el objetivo incluye la primera base en el sitio polimórfico, el objetivo forma un complejo de hibridación complementario. Sin embargo, si el objetivo incluye la segunda base en el sitio polimórfico, entonces se forma un complejo de hibridación de desigualdad. Por lo tanto, la presencia de una señal complementaria en el espectro de prueba es indicativa del objetivo incluyendo la primera base en el sitio polimórfico; mientras que la presencia de una señal de desigualdad en el espectro es indicativa del objetivo incluyendo la segunda base en el sitio polimórfico. Se pueden utilizarse aspectos similares en donde existan más de dos formas alélicas. Ciertos métodos incluyen el uso de arreglos. Un arreglo incluye múltiples elementos, cada elemento incluyendo una línea de transmisión continua y una sonda de ácido nucleico (o pluralidad de sondas) que están electromagnéticamente acopladas a la línea de transmisión continua ubicada dentro del elemento. Los elementos se ponen en contacto con una muestra que contiene un objetivo de ácido nucleico. Después, se detecta una señal de respuesta para aquellos elementos en donde se forma un complejo de hibridación. Al utilizar este acercamiento general, se pueden utilizar arreglos para detectar rápidamente la presencia de múltiples objetivos en una muestra.

Por ejemplo, en una muestra que potencialmente contiene un primer objetivo de secuencia conocida y un segundo objetivo de secuencia conocida, se seleccionan sondas de ácido nucleico de manera que un primero grupo de sondas es complementario al primer objetivo y un segundo grupo de sondas es complementario a un segundo objetivo. Los primero y segundo grupos de sondas típicamente están localizados en un primer y segundo elemento respectivamente. La detección de una señal de respuesta a partir del primer elemento es indicativa de que la muestra incluye el primer objetivo; similarmente, una señal de respuesta del segundo elemento es indicativa de que la muestra incluye el segundo objetivo. A través de la selección apropiada de la secuencia de sondas en los varios elementos, estos métodos pueden ser usados para distinguir entre SNPs, para determinar qué genes son expresados en una célula particular, (es decir, conducir un análisis de expresión) y para determinar la secuencia de un ácido nucleico. La presente invención también proporciona métodos para obtener la información cuantitativa sobre eventos de hibridación de ácido nucleico. En general, tales métodos típicamente incluyen poner en contacto una sonda de ácido nucleico electromagnéticamente acoplada a una porción de una trayectoria de señal con una muestra que incluye un objetivo de ácido nucleico, por lo que se forma un complejo de hibridación entre la sonda y el objetivo. Los cambios en una señal o grupo de señales que son características del complejo de hibridación, después son verificados. En ciertos métodos, los cambios en la amplitud de señal o frecuencia son í-.. medidos en diferentes puntos de tiempo para obtener múltiples valores medidos. Los valores múltiples pueden ser utilizados, por ejemplo, para calcular parámetros cinéticos.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1A ilustra una modalidad del sistema de bioensayo de acuerdo con la presente invención. La Figura 1B ilustra una segunda modalidad del sistema de bioensayo de acuerdo con la presente invención. La Figura 1C ilustra una vista en sección transversal del sistema de bioensayo mostrada en la Figura 1B. La Figura 1 D ilustra una modalidad de una región de unión molecular de acuerdo con la presente invención. La Figura 1 E ilustra una modalidad de una región de unión molecular que tiene múltiples anti-ligandos, los cuales están espacialmente separados de acuerdo con la presente invención. La Figura 1F ilustra una modalidad de una región de unión molecular que tiene múltiples clases de anti-ligandos de acuerdo con la presente invención. La Figura 2A ilustra una modalidad del dispositivo de bioensayo de acuerdo con la presente ¡nvención. La Figura 2B ¡lustra una segunda modalidad del dispositivo de bioensayo de acuerdo con la presente invención. La Figura 2C es una vista en sección transversal de un dispositivo de bioensayo de la presente invención. La Figura 3 ilustra una modalidad de la química de superficie de unión, la cual ocurre a lo largo de la capa conductora de la interfase bio- eléctrica. La Figura 4A ilustra una modalidad de un método para detectar eventos de unión molecular de acuerdo con la presente invención. La Figura 4B ilustra una modalidad de un método para detectar eventos de unión secundarios o de orden más alto de acuerdo con la presente invención. La Figura 4C ilustra una modalidad de un método para medir cambios dieléctricos de la región de unión molecular de acuerdo con la presente invención. La Figura 4D ilustra una modalidad de un método para identificar un ligando en una solución desconocida de acuerdo con la presente invención. La Figura 4E ilustra una modalidad de un método para identificar la clase de un ligando de acuerdo con la presente invención. La Figura 4F ilustra una modalidad de un método para cuantificar la concentración de ligando de una solución de acuerdo con la presente invención. La Figura 4G ilustra una modalidad de un método para proporcionar una capacidad de autodiagnóstico del dispositivo de bioensayo de acuerdo con la presente invención. La Figura 5A ilustran una modalidad de un sistema de medición de frecuencia de acuerdo con la presente invención. La Figura 5B ilustra una primera respuesta de frecuencia medida, la cual puede ser usada para detectar o identificar una estructura molecular de acuerdo con la presente invención. La Figura 5C ilustra una segunda respuesta de frecuencia, la cual puede ser usada para detectar o identificar una estructura molecular de acuerdo con la presente invención. La Figura 6 ilustra una segunda modalidad de un sistema de medición de frecuencia de acuerdo con la presente invención. La Figura 7 ilustra una modalidad de un sistema de medición de dominio de tiempo de acuerdo con la presente invención. La Figura 8 ilustra una modalidad de un sistema de medición de relajación dieléctrico. La Figura 9 ilustra el cambio en la señal que resulta de la hibridización de una secuencia poly G y poly C. La Figura 10A muestra una exploración completa (1-21 GHz) mostrando señales para objetivos complementario y desiguales para una sonda de ácido nucleico que tiene la secuencia S'-CATATCATTC-S' (SEQ ID NO:1 ). La Figura 10B es una expansión del espectro mostrado en la Figura 10A. La Figura 11 ilustra una posible modalidad de un sistema de prueba de arreglo NxM de acuerdo con la presente invención. Las Figuras 12A-12B ¡lustran varias vistas de la característica de prueba de arreglo NxM de acuerdo con la presente invención. La Figura 13A ilustra una modalidad de un arreglo de bioensayo de acuerdo con la presente ¡nvención. La Figura 13B ¡lustra una modalidad de un elemento de arreglo de acuerdo con la presente invención comprendiendo un Transistor de Efecto de campo eléctricamente conmutado, conectado en serie. La Figura 13C ilustra una modalidad de un elemento de arreglo de acuerdo con la presente invención que comprende un Transistor de Efecto de Campo ópticamente conmutado, conectado en serie. La Figura 13D ilustra una modalidad de un arreglo de acuerdo con la presente ¡nvención comprendiendo dos trayectorias de dos dispositivos de FET conectados en serie. La Figura 13E ilustra el modelo equivalente de circuito del arreglo mostrado en la Figura 7D de acuerdo con la presente invención. La Figura 13F ilustra una modalidad de un arreglo de bioensayo de dos dimensiones de acuerdo con la presente invención.

DESCRIPCIÓN DE LAS MODALIDADES ESPECIFICAS 1. Definición de Términos Los términos "patrones de unión" o "ligando/anti-ligando" o "complejo de ligando/anti-ligando" se refieren a moléculas que específicamente reconocen (por ejemplo, se unen) otras moléculas para formar un complejo de unión tal como un anticuerpo- antígeno, lectina- carbohidrato, ácido nucleico-ácido nucleico, biotina-avidina, etc. Los patrones de unión biológicos no necesitan ser limitados a pares de moléculas individuales. De esta manera, por ejemplo, un ligando individual puede ser unido a través de la acción coordinada de dos o más "anti-ligando". "Ligando" o "analito" se refiere a cualquier molécula que va a ser detectada. Esta se detecta a través de su interacción con un anti-ligando, el cual específicamente o no específicamente une el ligando, o a través de las propiedades dieléctricas características del ligando. El ligando generalmente es definido como cualquier molécula para la cual existe otra molécula (es decir, un anti-ligando) el cual específicamente o no específicamente se une al ligando, considerando el reconocimiento de alguna porción del ligando. El anti- ligando, por ejemplo, pueden ser una sonda de ácido nucleico y el ligando un objetivo de ácido nucleico, el cual es complementario a la sonda. "Anti-ligando" generalmente se refiere a una molécula que específicamente o no específicamente une otra molécula (es decir, un ligando). El anti-ligando también es detectado a través de su interacción con un ligando al cual específicamente se une o a través de sus propias propiedades dieléctricas características. Como se utiliza en la presente, el anti-ligando usualmente está inmovilizado sobre la superficie, ya sea solo o como un miembro de un par de unión que está inmovilizado sobre la superficie. En algunas modalidades, el anti-ligando pueden consistir de las moléculas en la trayectoria de señal o superficie conductora. Alternativamente, una vez que un anti-ligando se ha unido a un ligando, el complejo de anti- ligando/ligando resultante puede ser considerado como un anti-ligando para los propósitos de unión subsecuente. En el caso de análisis de ácido nucleico, el anti-ligando típicamente es una sonda de ácido nucleico de secuencia conocida que hibridiza con un objetivo de ácido nucleico de secuencia desconocida. El término "trayectoria de señal" se refiere a un medio de transmisión a lo largo de la interfase bio-eléctrica, que es capaz de soportar una señal electromagnética de cualquier frecuencia útil incluyendo un campo estático de DC. Una lista no exhaustiva de trayectorias de señal incluye estructuras de guía de onda conductoras y dieléctricas, medios de transmisión de conductor múltiple tales como líneas de transmisión electromagnética transversales (TEM), líneas de transmisión con tres o más elementos conductores que soportan la propagación de modo TE, TM o TEM, tales como líneas cuadripolares y octopolares, guías de onda acopladas, estructuras de cavidad resonante, las cuales pueden o no estar acopladas, otras estructuras no modales como cables, circuitos impresos, y otras estructuras conductoras de circuito distribuido y de impedancia concentrada, y similares. La trayectoria de señal estructuralmente puede comprender el plano de señal, el plano a tierra o una combinación de ambas estructuras. Típicamente, la trayectoria de señal se forma a lo largo de una dirección la cual es no ortogonal a la superficie de la región de unión molecular. En modalidades en donde la trayectoria de señal consiste de una capa o región conductora, la región conductora se extiende continuamente sobre esa escala. En modalidades en donde la trayectoria de señal es no metálica, es decir, una guía de onda dieléctrica, la trayectoria de señal está definida como la trayectoria que tiene la última cantidad de pérdida de señal o que tiene una conductividad mayor que 3 mhos/m. Una "línea de transmisión" es un elemento conductor que puede soportar la propagación de una señal electromagnética a cierta frecuencia predefinida. Los términos "región de unión molecular" o "MBR" se refiere a una capa que tiene por lo menos una estructura molecular (por ejemplo, un analito, un anti-ligando, o un par de ligando/anti-ligando, etc.) acoplada a al trayectoria de señal a lo largo de la ¡nterfaz bio-eléctrica. La región de unión molecular puede consistir en uno o más ligandos, anti-lígandos, complejos de ligando/anti-ligando, enlazadores, matrices de polímeros y otros materiales, u otras estructuras moleculares descritas aquí. Además, la región de unión molecular puede ser extremadamente diversa y puede incluir uno o más componentes incluyendo capas de matriz y/o capas aislantes, las cuales pueden tener uno o más grupos de enlace. La región MBR está acoplada a la trayectoria de señal ya sea a través de una conexión física directa o indirecta o a través de acoplamiento electromagnético, cuando el ligando está físicamente separado de la trayectoria de señal. La región de MBR puede ser de una superficie derivatizada tal como a través de enlazadores de tiol, metales biotinilados y similares, todos de acuerdo con la práctica estándar en la técnica. Un "evento de unión" generalmente se refiere a una interacción o asociación entre un mínimo de dos estructuras moleculares, tales como un ligando y un anti-ligando. La interacción puede ocurrir cuando las dos estructuras moleculares están en contacto físico directo o indirecto, o cuando las dos estructuras están físicamente separadas, pero electromagnéticamente en contacto, o cuando las dos estructuras están físicamente separadas, pero electromagnéticamente acopladas entre sí. Ejemplos de eventos de unión de interés en un contexto médico incluyen, pero no se limitan a ligando/receptor, antígeno/anticuerpo, enzima/substrato, ADN/ADN, ADN/ARN, ARN/ARN, desigualdades de ácido nucleico, ácidos nucleicos complementarios y ácido nucleico/proteínas. Alternativamente, el término "evento de unión" puede referirse a una sola molécula o estructura molecular descrita aquí, tal como un ligando, o un complejo de anti-ligando/ligando, el cual está unido a la trayectoria de señal. En este caso, la trayectoria de señal es la segunda estructura molecular. El término "complejo de ligando/anti-ligando" se refiere a un JB..A..- _ '|--if i frt?fn tfír n?i i-jfft - complejo en el cual el ligando está unido al anti-ligando. Por ejemplo, un "complejo de ligando/anti-ligando" puede incluir una sonda de ácido nucleico hibridizada a un ácido nucleico objetivo. La unión puede ser específica o no específica, y las uniones típicamente son uniones covalentes, uniones de hidrógeno, unión inmunológica, fuerzas de Van der Waals, u otros tipos de unión. "Acoplamiento" se refiere a la transferencia de energía entre dos estructuras, ya sea a través de una conexión física directa o indirecta o a través de cualquier forma de acoplamiento de señal, tal como acoplamiento electrostático o electromagnético. De esta manera, el "acoplamiento electromagnético" se refiere a la transferencia de energía a través de interacciones electromagnéticas. El término "señal de prueba" se refiere a una señal que se propaga a cualquier secuencia útil definida dentro del espectro electromagnético. Por ejemplo, la secuencia de la señal de prueba está a o por arriba de 1 MHz, tal como 5 MHz 10 MHz, 20 MHz, 45 MHz, 100 MHz, 500 MHz, 1 GHz, 5 GHz, 10 GHz, 30 GHz, 50 GHz, 100 GHz, 500 GHz, 1000 GHz y frecuencias que varían entre estas. Una "solución" incluye un material en donde reside un ligando. Una lista no exhaustiva de soluciones incluye materiales en estados sólido, líquido o gaseoso. Las soluciones sólidas pueden está compuestas de moléculas de existencia natural o sintéticas incluyendo carbohidratos, proteínas, oligonucleótidos, o alternativamente, cualquier material polimérico orgánico, tal como nilón, rayón, dacrón, polipropileno, teflón, neopreno, delrin o similares. Las soluciones líquidas incluyen aquellas que contienen un componente acuoso, orgánico u otro componente primario, geles, gases, y emulsiones. Las soluciones ilustrativas incluyen celulosas, derivados de dextrana, solución acuosa de d-PBS, reguladores de pH de Tris, agua desionizada, sangre, regulador de pH fisiológico, fluido cerebroespinal, orina, saliva, agua, solventes orgánicos. La solución se utiliza en la presente para referirse al material en donde el ligando y/o anti-ligando es aplicado a la superficie de unión. La solución contiene la muestra que será analizada. Un "grupo de enlace" o "enlazador" representa estructuras químicas que son utilizadas para unir cualquiera de dos componente en el dispositivo de bioensayo. Los grupos de enlace de esta manera tienen una primera porción de unión que se une a un componente, tal como la superficie conductora, y tienen una segunda porción de unión que se une a otro componente, tal como la matriz o el anti-ligando. El término "dispositivo de bio-ensayo" se refiere a una estructura en donde se forma la región de unión molecular. El dispositivo de bio-ensayo puede consistir de una superficie, área deprimida, o un recinto herméticamente sellado, todos estos pueden ser de cualquier tamaño o forma particular. El término "sistema de bioensayo" significa el dispositivo de bioensayo como se describió anteriormente, junto con los componentes necesarios para sondear electromagnéticamente y detectar el dispositivo de bioensayo. Estos componentes incluyen, pero no se limitan a, la trayectoria (s) de señal, el substrato(s), dispositivos electrónicos tales como generadores de señal, osciloscopios, y analizadores de vector necesarios para sondear y detectar señales del dispositivo de bioensayo, microcircuitos y microprocesadores, los cuales pueden sondear y detectar señales electromagnéticas y analizar datos, y similares. "Resonante" o "resonancia" se refiere en general a una respuesta dieléctrica de cambio rápido, como una función de frecuencia. Una "interfase bio-eléctrica" se refiere a una estructura de interfase entre una trayectoria de señal para soportar la propagación de una señal de prueba y una región de unión molecular. Una "matriz" o "matriz de unión" se refiere a una capa de material sobre el circuito integrado del bioensayo que se utiliza como un separador o para mejorar el área de superficie disponible para la unión o para optimizar la orientación de moléculas para una unión mejorada, o para mejorar cualquier otra propiedad de unión con el fin de optimizar el dispositivo de bioensayo. La capa de matriz puede estar compuesta de carbohidratos tales como dextrana, poliaminoácidos, proteínas entrelazadas y no entrelazadas, y similares. El término "específicamente se une" significa una reacción de unión, la cual es determinante del ligando consanguíneo de interés en una población heterogénea de moléculas. Un "ácido nucleico" es un polímero de desoxiribonucleótido o --* - -toMfc.- - - *— > - -***' «-M ».-^-"'- «•• - -»»---fc » i ribonucleótido ya sea en una forma de estructura de cadena individual o doble, y a menos que se limite a otra cosa, abarca análogos conocidos de nucleótidos naturales que pueden funcionar en una forma similar como nucleótidos de existencia natural. Un" polinucleótido" se refiere a un polímero de estructura de cadena individual o doble de bases de desoxiribonucleótido o ribonucleótido. Una "sonda" o "sonda de pacido nucleico" es un ácido nucleico capaz de unirse a un ácido nucleico objetivo de secuencia complementaria a través de uno o más tipos de enlaces químicas, usualmente a través de formación de pares de base complementarios, usualmente a través de formación de enlace de hidrógeno, formando así una estructura doble. Una sonda puede incluir bases naturales (es decir, A, G, C, o T) o bases modificadas (por ejemplo, 7-deazaguanosina, inosina, etc.). Una sonda puede ser un oligonucleótido, el cual es un ADN de estructura de cadena individual. Las sondas de oligonucleótido pueden ser sintetizadas o producidas a partir de polinucleótidos de existencia natural. Además, las bases en una sonda pueden unirse a través de un enlace distinto a un enlace de fosfodiéster, siempre que no interfiera con la hibridación. De esta manera, las sondas pueden ser de ácidos nucleicos de péptido, en donde las bases constituyentes que se unen a través de enlaces de péptido en lugar de enlaces de fosfodiéster (ver, por ejemplo, Nielsen et al., Science 254, 1497-1500 (1991 )). Algunas sondas pueden tener secuencias anteriores y/o posteriores de no complementariedad flanqueando una región de complementariedad.

Una "sonda" perfectamente igualada tiene una secuencia perfectamente complementaria a una secuencia objetivo particular. Dicha sonda es perfectamente complementaria a una porción (subsecuancia) de la secuencia objetivo. El término "sonda de desigualdad" se refiere a sondas cuya secuencia no es perfectamente complementaria a una secuencia objetivo particular y, en algunos casos, deliberadamente seleccionada pero no perfectamente complementaria., Aunque la desigualdad(es) puede ser localizada en cualquier parte en la sonda de desigualdad, las desigualdades de terminal son menos deseables, ya que una desigualdad terminal probablemente tiene menos propensión a evitar la hibridación de la secuencia objetivo. De esta manera, las sondas por lo general están diseñadas para tener la desigualdad localizada en o cerca del centro de la sondas, de manera que la desigualdad muy probablemente va a desestabilizar el doble con la secuencia objetivo bajo las condiciones de hibridación de prueba. "Hibridación" se refiere a la unión entre una sonda de ácido nucleico y una secuencia objetivo a través de formación de pares de base complementario; el complejo resultante es denominado como un "complejo de hibridación". Un complejo de hibridación puede ser ya sea un complejo complementario o un complejo de desigualdad. Un "complejo complementario" es un complejo de hibridación donde no hay desigualdades entre la sonda y secuencias objetivo que comprenden el complejo. ftjílít I I .*¡*-*a-..J*--?.-4- Un "complejo de desigualdad" es un complejo de hibridación en donde existen una o más desigualdades entre la sonda y secuencias objetivo que comprenden el complejo. "Substancialmente complementario" significa que la secuencia del objetivo no es exactamente complementaria a la secuencia de la sonda; sin embargo, existe una complementariedad suficiente de que un complejo de desigualdad puede formar. "Hibridación específica" se refiere a la unión, formación doble, o hibridación de una molécula de ácido nucleico solamente a una secuencia de nucleótido particular bajo condiciones severas, cuando esa secuencia está presente en un ADN o ARN de mezcla compleja (por ejemplo, celular total). "Condiciones severas" son condiciones bajo las cuales una sonda hibridizará a su subsecuencia objetivo, pero no a otras secuencias, las condiciones severas son dependientes de la secuencia y son diferentes en diferentes circunstancias. Una variedad de factores significativamente puede afectar la severidad de la hibridación, incluyendo, entre otras cosas, la composición de la base, el tamaño de las estructuras de cadena complementarias, la presencia de solventes orgánicos y el grado de desigualdad de la base; la combinación de parámetros es más importante que la medida absoluta de cualquiera de estos. Para una discusión de factores generales que tienen influencia en la hibridación, ver por ejemplo, WO 93/02216 y Watson et al., Recombinant DNA, 2a edición, Scientific American Books, NY 1992, cada una de las cuales se incorpora aquí por referencia en su totalidad. Una guía extensa para la hibridación de ácidos nucleicos se encuentra en Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates, Inc. and John Wiley and Sons, Inc. (suplementada en 1998) la cual también está incorporada aquí por referencia en su totalidad. En general, las condiciones severas se seleccionan para que sean 5°C menor que el punto de fusión término (Tm) para la secuencia específica a una resistencia iónica definida y pH. La Tm es la temperatura (bajo resistencia iónica definida, pH, y concentración de ácido nucleico) a la cual el 50% de las sondas complementarias a la secuencia objetivo hibridizan a la secuencia objetivo en equilibrio. (Ya que las secuencias objetivo generalmente están presentes en exceso, a Tm, el 50% de las sondas están ocupados en equilibrio). Típicamente, las condiciones severas incluyen una concentración de sal de por lo menos aproximadamente 0.01 a 1.0 M de concentración de ion de Na (u otras sales) a un valor de pH de 7.0 a 8.3 y la temperatura es de por lo menos aproximadamente 30° C para sondas cortas (por ejemplo, de 10 a 50 nucleótidos). Las condiciones severas también pueden ser logradas con la adición de agentes de desestabilización tales como formamida o sales de tetraalquilamonio. Por ejemplo, las condiciones de 5X SSPE (750 M NaCI, 50 mm Fosfato Na, 5 mm EDTA, pH 7.4) y una temperatura de 25-30° C son típicamente adecuadas para hibridaciones de sonda de alelo específico. La severidad puede ser determinada empíricamente incrementando gradualmente la severidad de las condiciones (por ejemplo, incrementando la sal, incrementando la temperatura, etc) hasta que se obtiene el nivel deseado de carácter específico. Un "polimorfismo" se refiere a la ocurrencia de dos o más secuencias o alelos alternativos, genéticamente determinados, en una población. Un marcador o sitio polimórfico es el sitio en donde ocurre la divergencia. Los marcadores preferidos tienen por lo menos dos alelos, cada uno ocurriendo a una frecuencia mayor que 1%, y muy preferiblemente mayor que 10% o 20% de una población seleccionada. Un sitio polimórfico puede ser tan pequeño como un par de base. Los marcadores polimórficos incluyen polimorfismos de longitud de fragmento de restricción, número variable de repeticiones en tándem (VNTR), regiones hipervariables, minisatélites, repeticiones de dinucleótido, repeticiones de trinucleótido, repeticiones de tetranucleótido, repeticiones de secuencia simple, y elementos de inserción tales como Alu. La primera forma alélica identificada es arbitrariamente diseñada como la "forma de referencia" o la "forma de tipo silvestre" y otras formas alélicas son designadas como "alelos alternativos" o "alelos variantes". La forma alélica que ocurre con más frecuencia en una población seleccionada algunas veces es denominada como una forma de tipo silvestre. Los organismos diploides pueden ser homocigotos o heterocigotos para formas alélicas. Un polimorfismo dialélico tiene dos formas. Un polimorfismo trialélico tiene tres formas. Un "polimorfismo de nucleótido individual" ocurre en un sitio polimórfico ocupado por un solo nucleótido, éste es el sitio de variación entre secuencias alélicas. El sitio usualmente es precedido por y seguido por MW«P fe-*, J. rai*J ¿,~* ^>£ Si !tA*X2< ...,..~ Msí&. secuencias altamente conservadas del alelo (por ejemplo, secuencias que varían en menos de 1/100 ó 1/1000 miembros de las poblaciones). Un polimorfismo de nucleótido individual usualmente surge debido a la substitución de un nucleótido para otro en el sitio polimórfico. Una transición es el reemplazo de una purina por otra purina o una pirimidina por otra pirimidina. Una transversión es el reemplazo de una purina por una pirimidina o viceversa. Los polimorfismos de nucleótido individuales también pueden surgir a partir de la eliminación de un nucleótido o una inserción de un nucleótido con relación a un alelo de referencia. Una "muestra" se refiere esencialmente a cualquier fuente a partir de la cual se puedan obtener ácidos nucleicos. Una muestra puede ser adquirida a partir de esencialmente cualquier organismo, incluyendo animales y vegetales, así como cultivos de célula, células recombinantes y componentes de células. Las muestras pueden ser de un tejido biológico, fluido o espécimen y se pueden obtener de un organismo enfermo o saludable. Las muestras pueden incluir, pero no se limitan a esputo, fluido amniótico, sangre, células de sangres (por ejemplo, glóbulos blancos), muestras de biopsia de tejido o de aguja fina, orina, fluido peritoneal, fluido pleural, o células de los mismos. Las muestras también pueden incluir secciones de tejidos tales como secciones congeladas tomadas para los propósitos histológicos. Típicamente, las muestras son tomadas de un ser humano. Sin embargo, se pueden obtener muestras de otros mamíferos también, incluyendo sin limitación, perros, gatos, oveja, ganado, y cerdos. La muestra puede ser pretratada según sea necesario a través de la dilución en una solución reguladora de pH apropiada o concentrada si se desea. Cualquier número de soluciones reguladoras de pH acuosas estándares que empleen uno de una variedad de reguladoras de pH, tales como fosfato, Tris, o similares, preferiblemente a un pH fisiológico, puede ser utilizado. Los términos "aislado", "purificado", "biológicamente puro", o "substancialmente puro" se presentan una especie objetivo que es la especie predominante presente (es decir, en una base molar es más abundante que cualquier otra especie individual en la composición), y preferiblemente una fracción substanciaimente purificada en una composición, en donde la especie objetivo comprende por lo menos aproximadamente un 50 por ciento (en una base molar) de especies macromoleculares presentes. En general, una composición substancialmente pura comprenderá más de aproximadamente 80 a 90 por ciento de todas las especies macromoleculares presente en la composición. Muy preferiblemente, la especie objeto es purificada a una homogeneidad esencial (las especies contaminantes no pueden ser detectadas en la composición a través de métodos de detección convencionales), en donde la composición consiste esencialmente de una especie macromolecular individual. Íü.,¿a.-l II. Introducción A. Aspecto General La presente invención generalmente proporciona una variedad de métodos y aparatos para analizar eventos de unión entre un ligando y un anti-ligando. Más específicamente, la presente invención proporciona métodos para analizar ácidos nucleicos, especialmente reacciones de hibridación entre una sonda de ácido nucleico y un ácido nucleico objetivo, para obtener diferentes tipos de información genética. En general, los métodos involucran acoplar una sonda de ácido nucleico a una trayectoria de señal tal como una línea de transmisión y después poner en contacto la sonda con una solución que contiene una molécula de ácido nucleico objetivo bajo condiciones que permitan la hibridación de moléculas objetivo complementarias con la sonda de ácido nucleico. Una señal es lanzada hacia la trayectoria de señal seguido por la detección de una señal de respuesta que resulta del complejo de hibridación, el cual puede ser usado para analizar la unión entre la sonda de ácido nucleico y el objetivo. Los métodos del sistema de la presente pueden ser utilizados en una variedad de análisis de ácido nucleico, incluyendo, pero no limitándose a, análisis de expresión de gen, verificación de secuencia, o análisis de polimorfismo de nucleótido individual (SNP) y secuenciación de novo. Los métodos de la presente ¡nvención son condescendientes para conducir tales análisis sobre circuitos integrados u obleas que contienen múltiples arreglos de elementos. En ciertos métodos, cada elemento del arreglo incluye una línea de transmisión y un sistema de circuito para dirigir el elemento. Típicamente se unen múltiples sondas de ácido nucleico a la línea de transmisión en cada elemento del arreglo. Similar al caso descrito anteriormente, una señal es lanzada a una pluralidad de líneas de transmisión, cada una corriendo a un elemento diferente del arreglo. La señal transmitida y/o reflejada según modulada por el complejo de sonda/objetivo en el elemento es utilizada para caracterizar la naturaleza de la unión. Al utilizar el sistema de detección de la presente invención, es posible distinguir entre una unión perfectamente complementaria y una unión que involucra desigualdades. Algunos métodos implican determinar un perfil o huella de un complejo de hibridación particular. Estos perfiles son útiles para distinguir entre complejos complementarios y de desigualdad y detectar la presencia de objetivos particulares en una muestra, por ejemplo.

B. El Sistema de Bio-Ensavo La presente invención hace uso del hallazgo de que un basto número de moléculas pueden ser distinguidas basándose en las únicas propiedades dieléctricas que la mayoría de las moléculas exhiben. Estas propiedades dieléctricas distinguidas pueden ser observadas acoplando una señal a la estructura molecular unida. Las propiedades dieléctricas únicas de la estructura molecular unida modulan la señal, proporcionándole una única respuesta de señal. La respuesta de señal única después puede ser usada ¿?a*t~mmi¿ ?*?t?uaÍ¡?.*i~ *—» ^-^-*-a-tt-i-fe para detectar e identificar los ligandos y otras moléculas que forman la región de unión molecular. Aunque la siguiente descripción del sistema por lo general se describe con referencia a ligandos y anti-ligandos, debido a su amplia aplicabilidad, se deben entender que los ligandos y anti-ligandos específicamente pueden incluir ácidos nucleicos tales como sondas y objetivos. Similarmente, aunque se hace ampliamente referencia a eventos de unión, tales eventos pueden incluir hibridación entre ácidos nucleicos. La Figura 1A ilustra un sistema de bioensayo 100 de acuerdo con la presente invención. El sistema 100 es ilustrado en una topología de circuito, la no a tierra, plano a señal, de dos conductores, el cual puede ser realizado en una multitud de arquitecturas incluyendo circuitos de elemento concentrados o distribuidos en microtiras, líneas, guía de onda coplanar, línea ranurada o sistemas coaxiales. Además, aquellos expertos en la técnica de electrónica fácilmente apreciarán que el sistema puede ser fácilmente modificado a un sistema de guía de onda de conductor individual, o a un sistema de tres conductores o más conductores. Como se ilustra, el sistema 100 incluye una fuente de señal 110, líneas de transmisión 120, un plano a tierra de fuente/detector 130, un dispositivo de bioensayo 150, y un detector de señal 160. La modalidad ilustrada muestra dos líneas de transmisión 120 acopladas al dispositivo de bioensayo 150, aunque en modalidades alternativas, una línea de transmisión individual puede ser acoplada al dispositivo de bioensayo, o, alternativamente, se pueden acoplar tres o más líneas de transmisión al dispositivo de * t*~^ J . «&«.<». ' ^-^^ ká5át & < bioensayo 150. Las líneas de transmisión 120 se forman a partir de un material el cual puede soportar la propagación de una señal sobre la frecuencia deseada de operación. Las líneas de transmisión 120 son realizadas como una capa conductora, tal como oro, depositada sobre un substrato, tal como alúmina, diamante, zafiro, poliimida, o vidrio, utilizando técnicas de fotolitografía o de procesamiento de semiconductor convencionales. El sistema 100 además incluye un dispositivo de bioensayo 150 acoplado a las líneas de transmisión 120. El dispositivo de bioensayo 150 contiene un substrato de soporte 151 sobre el cual se deposita una línea de transmisión de interfases. La línea de transmisión 153 de interfase forma una interfase para soportar la propagación de una señal de prueba. El substrato de soporte 51 puede consistir de cualquier material aislante tal como vidrio, alúmina, diamante, zafiro, silicio, arseniuro de galio u otros materiales aislantes utilizados en procesamiento de semiconductor. Una región de unión molecular (MBR) 156 está acoplada a una o más áreas de la línea de transmisión de interfase 153. Como aquellos expertos en la técnica de electrónica apreciarán, el acoplamiento puede ocurrir ya sea a través de la conexión directa entre la línea de transmisión de interfase 153 y la MBR 156 como se ilustra, o alternativamente a través de un acoplamiento de señal, como se describe más adelante. La región MBR 156 principalmente está compuesta de uno o más ligandos, aunque también se pueden incluir otras moléculas y estructuras, como se describe en la presente. La región MBR 156 puede consistir solamente de una fila de ligando unido, por ejemplo, en el caso de unión primaria; o puede consistir de dos, tres, cuatro, cinco o más filas de ligando unido, en casos en donde existan eventos de unión secundarios o de orden más alto. Se pueden presentar múltiples filas de ligando en diferentes superficies de unión 155 sobre la misma línea de transmisión de interfase 153. En la modalidad ilustrada, el substrato dieléctrico 158 está localizado entre la solución 157 y un plano a tierra 159 del dispositivo de bioensayo. En la modalidad ilustrada, la capa dieléctrica 158 y el plano a tierra 159 del dispositivo de bioensayo están localizados dentro del dispositivo de bioensayo 150, aunque en modalidades alternativas, uno o ambos pueden ser ubicados externamente. Además, la disposición de la región MBR 156 y la solución 157 puede quedar conmutada y moverse hacia el plano a tierra del dispositivo de bioensayo, alternativamente, o además cerca de estas capas hacia la línea de transmisión de interfase 153. El sistema 100 incluye una fuente de señal 110 la cual lanza la señal de prueba sobre la línea de transmisión 120 y hacia el dispositivo de bioensayo 150. Un detector de señal 160 está colocado a lo largo de la trayectoria de transmisión para detectar la señal resultante (ya sea reflejada o transmitida, o ambos). Cuando la señal se propaga a lo largo de la línea de transmisión de interfase 153 del dispositivo de bioensayo 150, las propiedades dieléctricas de la región MBR 156 modulan la señal de prueba. La señal modulada después puede ser recuperada y utilizada para detectar e identificar ©ventos de unión moleculares que ocurren dentro del dispositivo de bioensayo, como se describe más adelante. En una modalidad alternativa de la invención, la detección e identificación de un ligando, complejo de anti-ligando/ligando (por ejemplo, un complejo de hibridación entre una sonda y un objetivo complementario) u otra estructura molecular descrita aquí, es posible cuando se separa físicamente de la línea de transmisión de interfase 153. En esta modalidad, el ligando no está físicamente conectado a la línea de transmisión 153, sino que más bien está eléctrica o electromagnéticamente acoplado a la línea de transmisión de interfase 153. El acoplamiento entre la línea de transmisión de interfase 153 y el ligando suspendido alterará la respuesta de la señal de prueba que se propaga a lo largo de la línea de transmisión de interfase 153, proporcionando así un medio para detectarla y/o identificarla. La separación máxima entre la línea de transmisión de interfase 153 y el ligando suspendido se determina por factores tales como la constante dieléctrica efectiva del medio entre la línea de transmisión de interfase 153 y el ligando, el área de acoplamiento total, la sensibilidad del detector de señal, la concentración de los ligandos en solución, y el tiempo de detección deseado. Las distancias de separación típicamente son del orden de 10'1m, 10"2m 10"3m, lO^m, 10"5m, 10"6m, 10"7m, 10"8m, 10"9m, 10"10m o cualquier escala entre estos valores. La Figura 1 B ilustra una segunda modalidad del sistema de bioensayo comprendiendo un arreglo de circuitos de microtira resonantes 170. Cada circuito resonante 170 consiste de una línea de transmisión 172 que termina en una línea corta 176 de circuito abierto. Aquellos expertos en la técnica de diseño de circuito apreciarán que se pueden emplear otras estructuras resonantes en topologías de circuito de elemento concentrado o distribuido, o combinaciones de los mismos. La Figura 1C ilustra una vista en sección transversal de un circuito resonante 170. La línea corta 176 de circuito abierto forma la interfase bio-eléctrica del circuito resonante 170 y estrechamente queda paralela a la interfase dieléctrica mostrada en la Figura 1A. En particular, la línea corta 176 de circuito abierto consiste de una línea de transmisión de interfase 176a colocada sobre una capa dieléctrica 176b, y está colocada por arriba del plano a tierra 176c. En esta modalidad, la región MBR 176d está acoplada a través de una conexión directa a la línea de transmisión 176a. La región MBR 176d puede unirse a lo largo de la línea de transmisión de interfase en una forma específica o no específica. Como antes, la estructura molecular objetivo puede ser suspendida desde, pero eléctricamente acoplada o electromagnéticamente acoplada, a la línea de transmisión de interfase 176a para proporcionar la información de detección e identificación de evento de unión. Las dimensiones de la línea de transmisión de interfase 176a se ven influenciadas por consideraciones tales como el tiempo de medición deseado (un área grande que resulta en un tiempo de detección más rápido), la frecuencia resonante deseada fres, ciertas condiciones de igualdad de impedancia para lograr una eficacia superior u ocasionar discontinuidades para resaltar eventos de unión, y el procesamiento a través del cual se forma todo el arreglo. Por ejemplo, si se utiliza fotolitografía de microondas convencional, el área de superficie de unión puede variar de 10'1m2 a 10"6m2, utilizando una capa dieléctrica relativamente gruesa tal como alúmina, diamante, zafiro, durioide u otros materiales de substrato convencionales. Alternativamente, si el procesamiento de semiconductor se utiliza, el área de superficie de unión puede variar de 10"6m2 a 10"12m2 utilizando una capa dieléctrica relativamente delgada de silicio o arseniuro de galio. Al utilizar técnicas de diseño de microondas convencionales o herramientas de CAD, tales como Microwave Spice™, EEsof Touchstone™ y Libra™, la longitud e impedancia de la línea de transmisión 172, las dimensiones de la línea de transmisión de interfase 176a, y el espesor y la constante dieléctrica de la capa dieléctrica 176b pueden ser seleccionadas de manera que la estructura resonante exhiba una respuesta de señal resonante a un punto de frecuencia resonante deseado fres. El punto de frecuencia resonante deseada fres típicamente es la escala de frecuencias sobre la cual las moléculas de interés reciben un cambio dramático en sus propiedades dieléctricas, la medición del cual permitirá su detección. Alternativamente, el punto de frecuencia resonante fres puede ser definido como el centro de la escala de frecuencia de prueba deseada, para permitir la escala más amplia de detección de señal. En la modalidad ilustrada, la frecuencia resonante fres incluye 10 MHz, 20 MHz, 45 MHz, 100 MHz, 500 MHz, 1 GHz, 5 GHz, 10 GHz, 30 GHz, 50 GHz, 100 GHz, 500 GHz, 1 ,000 GHz, o frecuencias que varían entre estos valores. Durante la medición, la solución 176e es aplicada sobre una o más de las líneas cortas de circuito abierto 172. Se forma una región MBR 176d cuando una o más moléculas dentro de la solución se unen a la línea de transmisión de interfase 176a. En este caso, la región MBR 176d y la solución eléctricamente se comportan como un circuito parásito, descrito más adelante, el cual ocasiona que el punto de frecuencia resonante fres se desplace por arriba o por debajo de su punto de frecuencia resonante originales. Este desplazamiento en frecuencia puede ser detectado y se utiliza para indicar la ocurrencia de un evento de unión molecular. La respuesta de señal también puede ser interrogada sobre un amplio espectro para averiguar la identidad de la estructura molecular unida, como se describe más adelante. Cada circuito resonante 170 puede ser fabricado para unir diferentes estructuras moleculares, y cada circuito resonante 170 puede ser dirigido, permitiendo así la detección e identificación simultánea de grandes números de estructuras moleculares dentro de la misma solución. En una modalidad alternativa, cada circuito resonante 170 puede ser diseñado para exhibir una frecuencia resonante distinta, en cuyo caso, todos los circuitos resonantes 170 pueden ser interrogados sobre un espectro de frecuencia continua para determinar la unión molecular. La región de interfase bio-eléctrica consiste de una trayectoria de señal diseñada para soportar la propagación de una señal electromagnética a til-.j.-- --a|...,.J-«^.^ la frecuencia de prueba deseada. Son posibles muchas configuraciones, un ejemplo es una línea de transmisión de oro obtenida por pulverización iónica entre D.C. y 110 GHz. En otra modalidad, la trayectoria de señal consiste de un medio dieléctrico, tal como la misma región MBR. En esta modalidad, la trayectoria de señal bloquea los voltajes y corrientes DC, pero de otra manera soporta la propagación de la señal de prueba deseada, ocurriendo a frecuencias de, por ejemplo 1 MHz, 5 MHz 10 MHz, 20 MHz, 45 MHz, 80 MHz, 100 MHz, 250 MHz, 500 MHz, 750 MHz, 1 GHz, 2.5 GHz, 5 GHz, 7.5 GHz, 10 GHz, 12 GHz, 18 GHz, 20 GHz, 22 GHz, 24 GHz, 26 GHz, 30 GHz, 33 GHz, 40 GHz, 44 GHz, 50 GHz, 80 GHz, 96 GHz, 100 GHz, 500 GHz, 1000 GHz, o frecuencias que varían entre estos valores. Por consiguiente, la trayectoria de señal es diseñada utilizando técnicas de diseño de circuito de alta frecuencia, conocidas en la técnica. Dichas técnicas de diseño incluyen impedancia para igualar la trayectoria de señal a las estructuras de interconexión, reducción al mínimo de la pérdida de inserción de la trayectoria de señal, y reducción al mínimo de la Relación de Onda En Reposo de Voltaje (VSWR) de la trayectoria de señal. En una modalidad preferida de la presente ¡nvención, la trayectoria de señal y la región MBR se orientan en una orientación no ortogonal. La presente invención no está limitada a la detección de una molécula de un tamaño o estructura anticipado unida a la trayectoria de señal. La región MBR puede consistir de 1 , 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 50, 100, 1000, o más longitudes moleculares unidas o separadas de, pero acopladas a la trayectoria de señal. Además, la región MBR puede consistir de capas múltiples de moléculas homogéneas, una capa molecular individual pero heterogénea, o capas múltiples moleculares heterogéneas.

C. Línea de Transmisión y región MBR Las interacciones de unión del sistema generalmente ocurren dentro del dispositivo de bioensayo, y en particular a lo largo de la capa conductora (línea de transmisión de interfase en las Figuras 1A-1 C). La capa conductora se fabrica de materiales que tienen una morfología, la cual es conductora para soportar la propagación de la señal de prueba de alta frecuencia. La superficie conductora se construye a partir de materiales que exhiben una conductibilidad apropiada sobre la escala de frecuencia de prueba deseada, así como poseen buenas calidades de unión molecular como se describe anteriormente. Tales materiales incluyen, pero no se limitan a oro, óxido de indio-estaño (ITO), cobre, plata, zinc, estaño, antimonio, galio, cadmio, cromo, manganeso, cobalto, iridio, platino, mercurio, titanio, aluminio, plomo, hierro, tungsteno, níquel, tantalio, renio, osmio, talio o aleaciones de los mismos. La capa conductora también se puede formar a partir de materiales semiconductores, los cuales pueden ser ya sea cristalinos o amorfos en estructura, incluyendo carbono químicamente corregido o puro, silicio, germanio, arseniuro de galio, arseniuro de indio, galio, o similares. El material conductor también se puede formar a partir de polímeros, especialmente aquellos que son conductores tales como poliacetileno, politiofeno y similares. La capa conductora puede ser gruesa o solamente de varias capas moleculares en profundidad según lo requiera la aplicación. La capa conductora puede estar compuesta de una capa de metal delgada evaporada o una capa epitaxial de arseniuro de galio u otros materiales semiconductores que se hacen conductores a través de técnicas de procesamiento de semiconductor conocidas. Además, la capa conductora puede ser derivatizada, el procedimiento a través del cual es bien conocido, por ejemplo, ver Kumar et al., "Pattemed Self-Assembled Monolayer and Mesoscale Phenomena," Accounts of Chemical Research, 28:219-226 (1995). La capa conductora además se fabrica a partir de materiales que tienen una morfología, la cual es conductora para la unión molecular. Los ligandos se pueden unir directamente, indirectamente a través de otras estructuras moleculares, o a través de ambas configuraciones a la capa conductora. La escala de moléculas que se pueden unir a la capa conductora incluyen, pero no se limitan a proteínas, ácidos nucleicos, pequeñas moléculas, sacáridos, lípidos y cualquier otra molécula de interés. La unión puede involucrar solamente una especie individual de moléculas unidas a la superficie, un arreglo completo de diferentes especies unidas a la superficie, o múltiples eventos de unión entre especies directamente unidas a la superficie y ligandos de interés en la solución. En términos generales, los eventos de unión en una modalidad se pueden describir como unión primaria y unión secundaria. También pueden ocurrir capas adicionales de unión molecular. La unión primera se refiere a la unión de un anti-ligando a la superficie conductora, lo cual se puede realizar a través de la y una de una molécula enlazadora. La unión secundaria se refiere a la unión de un ligando al anti-iigando, el cual puede ser otra molécula en la región de MBR o directamente a la misma superficie conductora. Típicamente, la unión involucra un ligando de fase líquida uniéndose a un anti-ligando de fase sólida inmovilizado. Por ejemplo, la unión primaria puede ser la unión de una sonda de ácido nucleico a la capa conductora del dispositivo de bioensayo, y la unión secundaria puede involucrar la unión de una molécula objetivo complementaria en una solución de muestra a la sonda de ácido nucleico. Alternativamente, la unión secundaria puede ser la unión directa de una sonda de ácido nucleico a la superficie conductora, tal como el término amina de una proteína que se une directamente a una capa conductora de oro. La unión antes mencionada da como resultado la formación de una región de unión molecular (MBR) 180 a lo largo de una o más áreas de la capa conductora, una modalidad la cual se ilustra en la Figura 1 D. En esta modalidad, la región MBR 180 opcionalmente consiste de un primer enlazador 181 , un aislante 182, un segundo enlazador 183, una matriz 184, un tercer enlazador 185, una capa de anti-ligando 186, y una capa de ligando 187. El primero enlazador 181 proporciona unión entre la capa aislante 182 y la capa conductora (no mostrada). El primer enlazador 181 consiste de molécula tales como tioles, aminas, amidas, o metales tales como cromo o titanio. La capa aislante 182 proporciona una barrera entre la capa ..».- .aiÁ-.i. Ju?tabM?QÉu t?Ét* conductora y la región MBR 180 y la solución (no mostrada). La capa aislante 182 puede proporcionar una barrera hermética para evitar el deterioro estructural de la capa conductora debido a la exposición a la región MBR y/o solución. Alternativamente, o además, la capa aislante 182 puede consistir de un material eléctricamente no conductor para evitar el flujo de corriente DC o una energía de baja frecuencia desde la capa conductora hacia la región MBR y/o solución, lo cual puede interferir con la solución. La capa aislante puede incluir poliimida, alúmina, diamante, zafiro, polímeros no conductores, un material aislante semiconductor tal como dióxido de silicio o arseniuro de galio u otros materiales que proporcionen características herméticas y/o eléctricamente aislantes. La capa aislante también puede consistir de aire, u otra substancia gaseosa, en cuyo caso el enlazador 181 puede ser eliminado. El segundo enlazador 183 proporciona la unión entre la capa aislante 182 y la matriz 184 y consiste de las mismas moléculas o moléculas similares como los primeros enlazadores 181. La capa de matriz 184 puede consistir de una capa de polímero, pero también opcionalmente es una capa de carbohidrato, de proteína, de políaminoácido o similares. La matriz típicamente se utiliza como un separador para mejorar el área de superficie disponible para la unión o para optimizar la orientación de las moléculas con el fin de mejorar la unión. Para ácidos nucleicos, las moléculas de matriz típicas incluyen varios polímeros orgánicos, carbohidratos, polipéptidos, y similares. El tercer enlazador 185 consiste de moléculas adecuadas para la unión de la capa de matriz al anti-ligando 186, y puede consistir de las mismas moléculas o de moléculas similares como los primero y/o segundo enlazadores 181 y 183. El anti-ligando 186 se utiliza para unir específicamente o no específicamente el ligando 187 dentro de la solución y/o para medir propiedades físicas de la solución, algunos ejemplos de estos son la temperatura, el pH, resistencia iónica, y similares. El ligando 187 consiste de una molécula o estructura que específicamente o no específicamente se une al anti-ligando 186. Por ejemplo, en el caso en donde el ligando 187 consiste de un ácido nucleico objetivo, el anti-ligando 186 consistirá de una sonda de ácido nucleico. En general, la región MBR será suficiente para interactuar en forma medible como se describe hasta aquí con una señal de prueba electromagnética a lo largo de la trayectoria de señal asociada. De esta manera, esencialmente cualquier composición de la región MBR que exhiba propiedades dieléctricas variables puede ser analizada. En la mayoría de las modalidades, la región MBR variará en espesor de entre aproximadamente 1- 5 ? a 1 cm. Para eventos de unión molecular simples, la escala usualmente será de entre aproximadamente 10 Á a 10,000 Á, típicamente de entre 100 Á y 5,000 A, o 500 Á a 1 ,000 A. En interacciones más grandes (por ejemplo, celular) la región MBR variará entre 1µm y 100 µm, de preferencia de entre 5 µm a 50µm. Con materiales aislantes, matices y similares, el tamaño será significativamente más grande. La modalidad de la Figura 1 D no está destinada a ser exhaustiva de todas las configuraciones posibles de la región MBR. Aquellos expertos en la técnica apreciarán que una basta multitud de combinaciones que forman la región MBR puede ser diseñada, como se dicta por las aplicaciones específicas. Por ejemplo, en otra modalidad, los primero, segundo y tercero enlazadores 181, 183, 185, la capa aislante 182, y la capa de matriz 184 no se utilizan, de manera que la región MBR consiste del anti-ligando 186 y el ligando 187. Además, alternativamente, el primero enlazador 181 y la capa aislante 182 pueden ser eliminados. Otras modalidades alternativas en donde se eliminan una o más de las capas descritas, o se agregan capas adicionales, serán evidentes para aquellos expertos en la técnica. Además, la región MBR puede estar compuesta de moléculas heterogéneas las cuales pueden estar espacialmente agrupadas o aleatoriamente en capas distribuidas dependiendo del formato de arreglo particular. Por ejemplo, la Figura 1 E ilustra una vista superior de una región MBR 180 que tiene cuatro anti-ligandos diferentes 190, 191 , 192 y 193, los cuales están espacialmente separados. La Figura 1 F ilustra una región MBR 180 en donde cuatro anti-ligandos diferentes 190, 191 , 192 y 193 están aleatoriamente distribuidos. Eléctricamente, la región MBR se exhibe propiedades dieléctricas únicas, las cuales son en parte atribuibles a las propiedades estructurales y conformacionales, y cambios en las mismas, de las moléculas unidas, tanto aisladas como en presencia de cambios ambientales tales como eventos de unión, cambios de pH, temperatura, resistencia iónica y similares.

Las propiedades dieléctricas de las estructuras moleculares unidas, junto con ^ las estructuras locales del medio de solvatación (la solución) también pueden ser atribuibles a cambio en los enlaces intramoleculares e intermoleculares causados por la unión primaria o de orden más alto, y el desplazamiento del medio de solvatación cerca de la capa conductora. La región de interfase dioeléctrica consiste de una trayectoria de señal designada para soportar la propagación de una señal electromagnética a la frecuencia de prueba deseada. Son posibles muchas configuraciones, un ejemplo siendo una línea de transmisión de oro obtenido mediante pulverización iónica que opera entre D.C. y 110 GHz. En otra modalidad, la trayectoria de señal consiste de un medio dieléctrico, tal como la misma región MBR. En esta modalidad, la trayectoria de señal bloquea los voltajes y corrientes D.C., pero por otra manera soporta la propagación de la señal de prueba deseada, que ocurre a frecuencias de, por ejemplo, 1 MHz, 5 MHz 10 MHz, 20 MHz, 45 MHz, 80 MHz, 100 MHz, 250 MHz, 500 MHz, 750 MHz, 1 GHz, 2.5 GHz, 5 GHz, 7.5 GHz, 10 GHz, 12 GHz, 18 GHz, 20 GHz, 22 GHz, 24 GHz, 26 GHz, 30 GHz, 33 GHz, 40 GHz, 44 GHz, 50 GHz, 80 GHz, 96 GHz, 100 GHz, 500 GHz, 1000 GHz, o frecuencias que varían entre estos valores. Por consiguiente, la trayectoria de señal se diseña utilizando técnicas de diseño de circuito de alta frecuencia, conocidas en la técnica. Dichas técnicas de diseño incluyen impedancia que iguala la trayectoria de señal con las estructuras de interconexión, reducción al mínimo de la pérdida de inserción de la trayectoria de señal, y reducción al mínimo de la Relación de Onda en Reposo de Voltaje (VSWR) de la trayectoria de señal. En la modalidad preferida de la presente invención, la trayectoria de señal y la región MBR son orientadas en una orientación no ortogonal. La presente invención no está limitada a la detección de una molécula de un tamaño o estructura anticipado, unida a la trayectoria de señal. La región MBR puede consistir de 1 , 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 50, 100, 1000, o más longitudes moleculares unidas o separadas de, pero acopladas a la trayectoria de señal. Además, la región MBR puede consistir de capas múltiples de moléculas homogéneas, una capa molecular individual pero heterogénea, o capas múltiples moleculares heterogéneas.

III. El Dispositivo de Bio-Ensavo A. Estructura del Dispositivo Estructuralmente, el dispositivo de bioensayo incluye una trayectoria de señal y una interfase bio-eléctrica. La trayectoria de señal puede consistir de un puerto de señal individual de entrada/salida, una trayectoria de puerto de señal de entrada y una trayectoria de puerto de salida, o múltiples trayectorias de puerto de señal de entrada y/o salida. La trayectoria(s) de señal puede ser realizada en un número de diferentes arquitecturas, tales como un cable conductor, una línea de transmisión, una estructura de guía de onda, una cavidad resonante, o cualquier medio de transmisión que pueda soportar la propagación de la señal de prueba sobre la escala de frecuencia deseada. Para posibles modalidades, ver R. E. Collins ??* *JuÉm&ub».Íu*i.!Í Foundations for Mocrowave Enqineerinq, McGraw-Hill Publishing Co., 1966; and S. March, Microwave Transmission Lines and Their Phvsical Realizations, Les Besser and Associates, Inc., 1986. Además, el dispositivo de bioensayo también puede ser realizado en una variedad de diferentes configuraciones. Las configuraciones no exhaustivas incluyen estructuras grandes a tamaño de miniatura utilizando técnicas de fabricación convencionales, ataque químico y fotolitografía convencionales, o técnicas de procesamiento de semiconductor. La Figura 2A ilustra una modalidad del dispositivo de bioensayo como se muestra en la vista en sección transversal. El dispositivo de bioensayo 230 consiste de una placa superior 231, terminales de contacto 237, y una placa de fondo 239. La placa superior 231 incluye una superficie de fondo que tiene una línea de transmisión de interconexión 233 dispuesta sobre la misma. El substrato dieléctrico 240 y el plano a tierra 250 están ubicados fuera del dispositivo de bioensayo. La placa superior 231 y/o el substrato dieléctrico 240 se forman a partir de un material aislante, tal como vidrio, los cuales son preferiblemente compatibles con fotolitografía o pulverización iónica mediante oro convencionales, ataque químico o procesamiento de deposición de vapor químico (CVD). Alternativamente se pueden utilizar otros materiales tales como alúmina, silicio, arseniuro de galio u otros materiales aislantes. Como se ilustra en la Figura 2A, la superficie de fondo de la línea de transmisión de interfase 233 está en contacto con la región de unión molecular (MBR) 234. Como se ilustra, la región MBR puede consistir de estructuras moleculares unidas de diferentes capas o tipos así como estructuras moleculares que ocurren dentro de la solución. En modalidades alternativas, la región MBR 234 puede extenderse sobre porciones pequeñas o grandes de la línea de interfase de transmisión 233 y puede consistir de diferentes estructuras moleculares unidas como se muestra. La región MBR puede consistir solamente de estructuras de anti-ligando/ligando, o una variedad de intermediarios de enlazador, matriz, y capas aislantes, como se muestra en la Figura 1 D. Cuando se implementa, la capa aislante 182 (Figura 1 D) puede consistir de aire, poliimida, alúmina, diamante, zafiro, o material aislante semiconductor tal como dióxido de silicio o arseniuro de galio o un material no conductor además de los otros materiales aislantes convencionales. El espesor y la constante dieléctrica de la capa aislante son de manera que la región MBR 234 y la línea de transmisión de ¡nterfase 233 queden herméticamente acopladas durante la transmisión de señal. El espesor de la capa aislante 182 puede ser de 10"1m, 10"2m 10"3m, lO^m, 10" 5m, 10"6m, 10"7m, 10"8m, 10"9m, 10"10m o menor, o valores que varíen entre estos, dependiendo de la cantidad de acoplamiento requerido, la constante dieléctrica de la capa aislante y el área total de acoplamiento. El acoplamiento puede lograrse a través de un número de diferentes configuraciones, incluyendo configuraciones acopladas transversales y desviadas en capas múltiples, coplanares o topologías de circuito de guía de onda. La implementación de una capa aislante puede ser ventajosa para sellar herméticamente la línea de transmisión de interfase del medio de solución y/o •».-•*' -fci .-fc t.d»-..--|ftf^..---..jj para prevenir que la corriente DC o la corriente de baja frecuencia fluya haca la solución, lo cual posiblemente podría interrumpir los eventos de unión moleculares. La línea de transmisión de interfase 233 consiste de un material que es capaz de soportar la propagación de señal y el cual es capaz de unir la región MBR 234. El material variará dependiendo de la formación de la región de MBR, pero algunos incluirán oro, óxido de indio, estaño, (ITO), cobre, plata, zinc, estaño, antimonio, galio, cadmio, cromo, manganeso, cobalto, iridio, platino, mercurio, titanio, aluminio, plomo, hierro, tungsteno, níquel, tantalio, renio, osmio, talio o aleaciones de los mismos. Alternativamente, la línea de transmisión de interfase 233 puede incluir una o más estructuras moleculares (anti-ligando) (que forman una parte de la región MBR 234) para formar uniones con una o más moléculas activadas (ligandos). El material que comprende la línea de transmisión de interfase también puede ser seleccionado para promover la unión de enlazadores así como para soportar la propagación de señal. Otros materiales que pueden ser utilizados para formar la línea de transmisión de interfase 233 serán fácilmente evidentes para aquellos expertos en la técnica. Los ligandos pueden ser transportados hacia la región MBR 234 utilizando una solución 260, tal como varias soluciones reguladas en su pH (por ejemplo, salina regulada en su pH con fosfato de Dulbecco (d PBS)). El ligando de interés, tal como un objetivo de ácido nucleico, por ejemplo, puede ser aplicado a la superficie de unión utilizando una variedad de técnicas tales t .^ ^^ii?a?^i^*?s"f -- --"-Jffc^-^Ma-j f&*. como penetración, mediante una pipeta, goteo, caída, contacto directo, acción capilar, o a través de varios dispositivos de fluido. En una modalidad específica, la línea de transmisión de interfase 233 está diseñada para proporcionar una baja pérdida de señal y una impedancia estrecha igualándose a las líneas de transmisión externa 270. La baja pérdida de señal se logra fabricando la línea de transmisión de interfase 233 a partir de un material conductor, algunos ejemplos siendo oro, cobre, aluminio, óxido de indio-estaño (ITO) u otros materiales conductores descritos anteriormente. La igualación de impedancia estrecha se logra definiendo la anchura de la línea de transmisión de interfase 233 a aproximadamente la anchura de las líneas de transmisión externa 270, dependiendo de las propiedades dieléctricas relativas del substrato, la solución, y la región MBR. La continuidad de señal entre la línea de transmisión de interfase 232 y las líneas de transmisión externa 270 se proporciona a través de terminales de contacto 237. Como se explicó anteriormente, la región MBR 234 y el medio de solución 260 pueden ser localizados cerca del plano a tierra 250 alternativamente, o además de esta ubicación de capa cerca de la línea de transmisión de ¡nterfase 232. Se puede incluir un sistema de circuito analógico y/o digital adicional en forma de elemento concentrado, forma distribuida o una combinación de ambos, en los puertos de entrada y/o salida del dispositivo de bioensayo. Por ejemplo, los circuitos de igualación de impedancia y/o los circuitos amplificadores de regulador de pH pueden ser empleados en el puerto de entrada. Alternativamente, o además, el sistema de circuito de igualación de impedancia y uno o más amplificadores de salida pueden ser implementados para mejorar más la señal de salida. Aquellos expertos en la técnica de electrónica apreciarán que se pueden utilizar también otros tipos de sistema de circuito de acondicionamiento en las modalidades alternativas. La Figura 2B ilustra una segunda modalidad del dispositivo de bioensayo. En esta modalidad, la solución ocupa un espacio por arriba de la línea de transmisión de interfase 233 la cual se forma sobre la superficie superior de la placa de fondo 239. El lado superior de la línea de transmisión de interfase 233 forma la superficie de unión a la cual se adhiere la región MBR 234. La capa dieléctrica 240 está colocada entre la línea de transmisión de interfase 233 y el plano a tierra 250. Las terminales de contacto 237 proporcionan una trayectoria de señal a las líneas de transmisión externa 270. La línea de transmisión de interfase, la placa superior, la placa de fondo, las terminales de contacto y la capa dieléctrica se pueden formar a partir de los materiales y los procedimientos descritos anteriormente. La región MBR también puede ser configurada como se describe anteriormente en la Figura 1 D o sus variaciones. Además, la región MBR 234 y el medio de solución 260 pueden ser ubicados cerca del plano a tierra 250 alternativamente, o además cerca de la ubicación de la capa a la línea de transmisión de ¡nterfase 233. La Figura 2C ilustra una vista en sección transversal vertical de otro dispositivo de bioensayo 150 de la invención. Este dispositivo de bioensayo 150 comprende una configuración de línea de cinta de dos elementos similar a aquella mostrada en la Figura 1A. El dispositivo de bioensayo 150 incluye un substrato de soporte 151 hecho de vidrio (con un espesor de aproximadamente 1mm) sobre la cara superior de la cual se pulveriza iónicamente una línea de transmisión de oro 120. Un recipiente de reacción 90 (de 6.0 cm x 1.5cm x 0.5mm) hecho de LEXAN (un material de policarbonato fabricado por DuPont) se sella a una sección de la línea de transmisión 120. El substrato 151 y la línea de transmisión unida 120, junto con el recipiente de reacción 90 unido a la línea de transmisión 120, quedan emparedados entre una capa superior y una inferior del material dieléctrico 70, 72, respectivamente. En esta modalidad particular, el material dieléctrico 70, 72, así como el recipiente de reacción, están compuestos de LEXAN. Las capas dieléctricas o separadores 70, 72 funcionan con el fin de obtener el nivel deseado de impedancia en el sistema. De esta manera, otros materiales capaces de lograr un resultado similar pueden ser utilizados en lugar del material LEXAN. En esta modalidad particular, la línea de transmisión está diseñada para dar una impedancia de banda amplia nominal de 35 O, y tuvo una anchura de 1.5cm, una longitud de 7.5cm y un espesor de aproximadamente 100 Angstroms. El subensamble que incluye el substrato de vidrio 151 , la línea de transmisión 120, el recipiente de reacción 90 y las capas dieléctricas 70, 72 están encerrados en una placa de cubierta de acero inoxidable o un elemento a tierra 159 para proteger electromagnéticamente la línea de transmisión 120 y proporcionar un soporte mecánico y para mantener sellado el dispositivo de bioensayo 150. Un conector (por ejemplo, un conector de 3.5mm) 84, 86 está unido a cada uno de los dos extremos del dispositivo de bioensayo 150. La pata central de los conectores (no mostrada) está unida a través de epoxi conductor (no mostrado) a la línea de transmisión 120 y al substrato 151 con una junta de hule de 50 µ. Un puerto de entrada y de salida 80, 82 se extiende a través de la placa de cubierta 159, la capa superior del material dieléctrico 70 y se conecta en forma separada al recipiente de reacción 90, (típicamente en los extremos opuestos del recipiente de reacción 90). Estos dos puertos 80, 82, permiten que las soluciones fluyan dentro y fuera del recipiente de reacción 90. El dispositivo de bioensayo 150 después puede ser conectado a través de otro conector 84 a un analizador o detector (no mostrado) capaz de medir los parámetros S de 45 MHz a 40 GHz. El otro conector 86 está conectado a la fuente de señal (no mostrada). Otras modalidades estructurales incluyen dispositivos de bioensayo que tienen múltiples líneas de transmisión de elemento, guías de onda, y cavidades resonantes, en donde la región MBR puede ser unida a uno o más de los elementos de línea o cavidad de tal forma que se mejora el carácter específico y sensibilidad de detección. Ejemplos de tales estructuras incluyen combinadores de señal dispuestos en forma paralela, cavidades resonantes, o guías de onda a lo largo de las cuales la región MBR unida sobre un elemento altera las propiedades de propagación de señal según comparado con otro elemento en paralelo sin la estructura unida, y de esta manera sirve para cambiar las propiedades de modo de la señal combinada, dando como resultado propiedades de señal de salida fácilmente detectables. Estos últimos efectos hacen uso de técnicas bien conocidas para medir la frecuencia, estabilidad de frecuencia, y cambios muy pequeños en frecuencia con precisión ultra alta.

B. Superficie de Unión La Figura 3 ilustra una modalidad de la química de la superficie de unión, la cual ocurre a lo largo de la capa conductora de la ¡nterfase bio- eléctrica. La interfase bio-eléctrica incluye un substrato 320, una capa conductora 330, una región MBR 340, y una solución 350. El substrato 320 puede ser cualquiera de la capa dieléctrica o materiales de substrato descritos aquí incluyendo alúmina, diamante, zafiro, plástico, vidrio y similares, y puede proporcionar soporte estructural a la capa conductora 320. En una modalidad alternativa, el substrato 320 es removido y el soporte estructural es provisto a través de la capa aislante 342. La capa conductora 330 consiste de un material que tiene una morfología que promueve la propagación de señal sobre las frecuencias deseadas y que promueve la unión de la región MBR 340, como se describió anteriormente. En una topología de circuito de dos conductores, la capa conductora 330 puede comprender el plano de señal o el plano a tierra. En cualquier caso, sin embargo, una segunda capa conductora (ya sea el plano de señal o el plano a tierra, no mostrado) está localizada ya sea por abajo del substrato 320 (ia disposición de la Figura 2B), o por lo menos una capa de substrato removida de la solución 350 (una disposición invertida de la Figura 2A). Alternativamente, las capas conductoras pueden ser colocadas en ambos de estos niveles. La solución 350 está acoplada a la región MBR 340 para permitir el flujo de ligandos hacia la región MBR 340. El flujo de ligando de la solución 350 hacia la región MBR 340 pueden ser direccionalmente o no direccional. La solución consiste de cualquier medio de transporte tal como gases, líquidos, o materiales de fase sólida, algunos ejemplos siendo d-PBS acuoso, regulador de pH Tris, reguladores de pH de fosfato, y similares. A lo largo de la interfase bio-eléctrica, la región MBR está colocada entre por lo menos una porción de la solución y la trayectoria de señal, de manera que la región MBR está más cerca de al trayectoria de señal que la solución a lo largo de esa porción. En la modalidad de la Figura 3, la región MBR 340 está colocada entre la solución 350 y la capa conductora 330, más cerca a la última. En una modalidad (mostrada en la Figura 2A), la solución está colocada entre los planos de señal y el de a tierra. En una segunda modalidad (mostrada en la Figura 2B), la solución está colocada fuera de la región del plano de señal-a tierra. La región MBR puede consistir de un ligando, complejo de ligando/anti-ligando, u otras estructuras moleculares como se describe aquí. Típicamente, el ligando estará funcionalmente intacto, lo más cercano posible a la superficie, y la densidad de superficie del anti-ligando será lo -.^i^,,^^ ^SJMA.****. ¡Hff fflrÉÉJ'llUlÉTl? suficientemente alta para proporcionar el efecto dieléctrico mayor, pero no tan alta para dañar la función de la unión, tal como a través de un impedimento esférico o físicamente bloqueando el sitio de unión activo del anti-ligando inmovilizado a través de moléculas circundantes. Los ligandos pueden unirse específicamente o no específicamente ya sea directamente a la capa conductora 320 o estructuras intermedias como se muestra en la Figura 3. Si se desean ligandos específicamente unidos, opcionalmente se utiliza un enlazador para facilitar la unión, por ejemplo, para unir todas las moléculas de manera que la capa conductora 320 queda expuesta a la solución. Se pueden aplicar sustancias a la capa conductora 320 en un número de formas, incluyendo fotolitografía, procesamiento de semiconductor, o cualquier otra técnica convencional de aplicación. Además, algunos ligandos y anti-ligandos pueden ser capaces de unirse en múltiples formas. Estos ligandos típicamente tienen un modo estadísticamente predominante de unión o pueden ser diseñados por ingeniería para unirse en una forma de sitio específico. Algunos anti-ligandos opcionalmente se unen a la superficie en una forma de sitio específico. Por ejemplo, un oligonucleótido puede unirse en un término. En general, el anti- ligando será unido en una forma que no dañará la función del anti-ligando, por ejemplo, preferiblemente a concentraciones que reducen al mínimo la desnaturalización de la superficie. La concentración del anti-ligando sobre la superficie de unión, variará, dependiendo del analíto específico. Por ejemplo, las concentraciones típicas para proteínas son 107/cm2, 108/cm2, 109/cm2, 1010/cm2, 1011/cm2, 1012/cm2, 1013/cm2, 1014/cm2, 10 5/cm2, o concentraciones que varían entre estas. Las concentraciones típicas para ácidos nucleicos son 1O7/cm2, 108/cm2, 109/cm2, 1010/cm2, 1011/cm2, 1012/cm2, 1013/cm2, 1014/cm2, 1015/cm2, 1016/cm2, 1017/cm2, 1018/cm2, 1019/cm2, 1020/cm2, o concentraciones que varían entre estas. Las concentraciones típicas para analitos en sangre entera varían de 55M, 25M, 10M, 1M, .5M, 10"1M, 10-2M, 10-3M, lO /l, 10'5M, lO /l, 10"7M, 10-8M, 10"9M, 10'10M, 10-11M, 10"12M, 10-13M, 10-14M, lO^M, 10"16M, 10" 17M, 10"18M, o concentraciones que varían entre estas. Suficiente ligando deben ser adherido dentro de la región MBR para alterar la transmisión de una señal a través de la inferíase bio-eléctrica. La cantidad de ligandos que se adhieren a la superficie de unión puede consistir de 1 , 10, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 1010, 1011, 1012, 1013 o más ligandos, así como cualquier número entre estos valores dependiendo del área de superficie de la capa conductora. Los ligandos no necesitan ser aplicados en regiones predefinidas a lo largo de la capa conductora, ya que las respuestas de señal son determinadas por propiedades dieléctricas inherentes de la región MBR según opuesto a la colocación sobre el dispositivo o circuito integrado del bioensayo. La región MBR generalmente tendrá una densidad de superficie para moléculas más pequeñas variando de 1010 cm2 a 1024 cm2, típicamente 1015 cm2 a 1020 cm2. La capa del ligando puede ser tan delgada como una capa, pero 2, 3, 4, 5 o 10 o más capas opcionalmente se utilizan. Una vez que un ligando queda unido a la capa conductora, la química y/o biología estructural del sistema entra en juego. Las propiedades dieléctricas del ligando producen una respuesta de señal, la cual esa característica de la estructura(s) unida, permitiendo así la detección de evento de unión, así como la detección de otras propiedades de interés en la estructura. La respuesta única provista por el evento de unión dependerá del anti-ligando inmovilizado, su ligando objetivo y la redisposición de las moléculas de solución circundantes (tal como agua y iones libres). La escala de moléculas que se puede unir a la superficie incluyen pero no se limitan a proteínas, ácidos nucleicos, moléculas pequeñas, sacáridos, lípidos, y cualquier otra molécula de interés. Típicamente, las moléculas de la región MBR quedan dispuestas dentro de una solución, la cual consiste de una solución acuosa de agua, d-PBS, Tris, sangre, regulador de pH fisiológico, fluido cerebroespinal, orina, sudor, saliva, otras secreciones del cuerpo, solventes orgánicos y similares. Otras soluciones pueden incluir gases, emulsiones, geles, y compuestos orgánicos e inorgánicos. La reacción de unión secundaria ocurre en la región MBR del dispositivo de bioensayo. Un ligando en una solución es transportado a través del dispositivo de bioensayo de manera que hace contacto con el anti-ligando de la capa de unión. La concentración del ligando en la solución varía y puede consistir de 1Q-1M, 1Q-2M, 1Q-3M, 10^/1, 1Q-5M, 10"6M, 10"7M, 10"8M, 1Q-9M, 10" Í,ÍÁJ 10M, 10*11M, 10"12M, 10"13M, 10 M, 1<r15M, 10"16M, 10"17M, 10-18M, 1(r1ßM, 10" 20M. Cuando ocurre una interacción, tal como la unión, entre el ligando y el anti-ligando, el ligando, después opcionalmente forma parte de la capa de unión, como es dictado por las características de equilibrio químico del evento de unión. La región MBR incluye los ligandos unidos y también puede incluir moléculas de solución. Los ligandos unidos pueden ser cualquier molécula, incluyendo proteínas, carbohidratos, lípidos, ácidos nucleicos, y otras moléculas discutidas aquí. La región MBR además puede incluir un enlazador para ayudar a la unión del anti-ligando a la capa de superficie de unión. Además, la interacción del anti-ligando con el ligando cambia la respuesta dieléctrica característica de la capa de unión solamente con el anti- ligando unido. Por ejemplo, si el anti-ligando A es el anti-ligando que forma la capa de unión, la respuesta dieléctrica de una señal de prueba que se propaga a lo largo de la línea de transmisión reflejará las propiedades características de la estructura del anti-ligando A. Cuando el ligando B se une al anti-ligando A, la estructura y/o propiedades dieléctricas de la capa de unión cambiarán debido a la unión de A a B. La estructura de A puede cambiar a medida que B se une a la misma, proporcionando así una respuesta de señal diferente. El cambio en señal debido a la interacción de unión será característica de la unión de A a B. Por lo tanto, la presencia de una interacción de unión puede ser determinada a partir del cambio en la señal. i¡- Además, la información con respecto al tipo de unión o los cambios estructurales y/o conformaciones después de la unión se obtiene notificando qué partes de la respuesta de señal han cambiado debido a la interacción. El ligando B opcionalmente es detectado e identificado por el cambio de señal después de su unión al anti-ligando A. La unión del ligando B al anti-ligando A induce un cambio conformacional, u otro cambio en la estructura molecular o solución circundante, en el anti-ligando A y sus alrededores. Estos cambios alteran las propiedades dieléctricas de la región MBR, alterando así la respuesta de señal de la señal de prueba que se propaga a lo largo de la trayectoria de señal. El cambio en la señal de prueba puede ser usado para detectar el evento de unión del ligando B y los aspectos particulares del cambio pueden ser utilizados para identificar el ligando B. Ya que la relación entre la estructura y la función de la molécula es conocida, por ejemplo en el caso de enzimas, anticuerpos, receptores y similares, la función del ligando unido puede ser deducida a partir de su identificación espectral. En una modalidad, se aplica un tipo de anti-ligando a la superficie de unión para formar una región MBR, y un ligando es aplicado a través de la región MBR para detectar un evento de unión entre las dos moléculas. Por ejemplo, el anti-ligando puede ser una pluralidad de sondas de ácido nucleico que tienen la misma secuencia y el ligando puede ser una secuencia objetivo complementaria. En otra modalidad, el anti-ligando puede ser una mezcla (por ejemplo, numerosas sondas de ácido nucleico que tienen diferentes secuencias) y el ligando que es aplicado a través de la capa de '-< »** - - unión es un analito conocido, por ejemplo, un ácido nucleico objetivo de secuencia conocida). Al detectar los cambios específicos en la respuesta de señal, el ligando particular con el cual interactúa el anti-ligando puede ser determinado debido a cambios conformaciones y otros cambios inducidos en 5 el ligando o anti-ligando, y la respuesta espectral que resulta de estos. Dicha modalidad no requiere del aislamiento espacial de cada uno de los anti- ligandos específicos, sino que más bien deriva el nivel deseado de carácter específico de la respuesta espectral, de manera que se determina una interacción de unión dada observando la respuesta electromagnética en lugar 10 de notificar en qué parte del ensayo se presentó el evento de unión. En otra modalidad, el anti-ligando puede ser una molécula conocida (por ejemplo, una sonda de ácido nucleico de secuencia conocida) sobre la capa de unión y el ligando aplicado a través del dispositivo de bioensayo como una mezcla de productos desconocidos (por ejemplo, una 15 mezcla de varios ácidos nucleicos objetivo que tienen diferentes secuencias). En este caso, la presencia de un ligando particular es detectada por la presencia o ausencia de un pico o señal particular en el espectro que resulta de pasar una señal a través del dispositivo de bioensayo. Alternativamente, el ligando puede ser detectado debido a los cambios en el espectro del anti- 20 ligando o ligando después de la unión del ligando. Dicha modalidad incrementa el carácter específico de la detección sobre aquel de la química de unión sola, ya que la señal contiene información con respecto a la naturaleza del evento de unión. De esta manera, la unión específica puede ser distinguida sobre la unión no específica, y el carácter específico total de detección puede ser enormemente mejorado sobre el carácter específico de la química sola. El sistema de detección formado a través del uso del dispositivo de bioensayo proporciona un sistema de detección de alta producción ya que la detección opcionalmente ocurre en tiempo real y se pueden analizar rápidamente muchas muestras. El período de respuesta es opcionalmente verificado en una escala de tiempo de nanosegundos. Tan pronto como las moléculas se unen entre sí, ocurre la detección. Opcionalmente se requiere de más tiempo para medir bajas concentraciones de eventos de unión entre moléculas con una afinidad de unión baja. El tiempo real es opcionalmente limitado por regímenes de difusión. A diferencia de estas limitaciones potenciales, miles de compuestos son opcionalmente realizados a través del sistema muy rápidamente, por ejemplo, en una hora. Por ejemplo, utilizando tecnologías de fabricación de circuito integrado, es posible un dispositivo de 10,000 canales (utilizando algunas de las tecnologías de microfluído emergente), y con pequeños volúmenes y de esta manera cortos tiempos de difusión, las mediciones cinéticas que miden solamente el inicio de la reacción, están midiendo opcionalmente 10 millones de muestras por hora. Con concentraciones conocidas, la afinidad de unión es opcionalmente calculada a partir de la cinética sola y de esta manera el dispositivo puede ser sondeado a una escala de tiempo muy rápido y la afinidad calculada y/o valorada a partir de la pendiente de la curva cinética. Las referencias para cinética y afinidades pueden encontrarse en cualquier contexto de bioquímica o química estándar, Tal como el de Mathews and van Holde, Biochemistrv. Benjamín Cummings, New York, 1990.

C. Inferíase Bio-Eléctrica La interfase bio-eléctrica es la estructura a lo largo de la cual la región MBR y la trayectoria de señal se forman. Como se describió anteriormente, la trayectoria de señal puede consistir de unas estructuras de guía de onda conductora o dieléctrica, una estructura de dos conductores tal como una estructura convencional de plano de señal/a tierra, o estructuras de tres o más conductores conocidas en la técnica. En general, el espesor de la región conductora de la trayectoria de señal se designa para proporcionar una pérdida mínima de señal. Por ejemplo, un espesor típico de línea de transmisión de oro es del orden de 0.1 a 1000µm, preferiblemente alrededor de 1-10µm. La trayectoria de señal se forma a lo largo de una dirección que es no ortogonal a la región MBR. En una modalidad, la señal de prueba se propaga en paralelo hacia una tangente sobre la superficie sobre la cual se forma la región MBR. En otras modalidades, la señal de prueba puede propagarse a un ángulo de ± 1 °, ± 2o, ± 3°, ± 4°, ± 5°, ± 10°, ± 15o, ± 20o, ± 30°, ± 40°, ± 45°, ± 50°, ± 60°, ± 70°, ± 80°, o ± 85°, con relación a la región de MBR que une la superficie, o cualquier valor entre estos. En una primera modalidad, la trayectoria de señal consiste de una línea de transmisión en una estructura de dos conductores y la dirección de la trayectoria de señal se define por el vector de Poynting como es conocido en la técnica de electromagnética. En una segunda modalidad, la línea de transmisión puede consistir de una región o capa conductora la cual se extiende continuamente a lo largo de la región de interfase bio-eléctrica. En una tercera modalidad, la trayectoria de señal puede ser definida como la trayectoria que tiene la última cantidad de pérdida de señal a lo largo de la interfase bio-eléctrica sobre la escala de operación de frecuencia deseada. En una cuarta modalidad, la trayectoria de señal puede ser definida por tener una conductividad a.c. mayor que 3 mhos/m, es decir, que tiene una conductividad mayor que aquella de una solución salina, típicamente mayor que 5 mhos/m, pero idealmente en la escala de 100 a 1000 mhos/m y mayor. De esta manera, ciertos métodos de la presente invención involucran colocar un ligando o anti-ligando tal como un ácido nucleico, de manera que quede acoplado en una trayectoria de señal. En tales métodos, la señal transmitida a lo largo de la trayectoria de señal no necesita pasar a través de la solución, por ejemplo, de un contacto eléctrico hacia otro. Esto es importante, ya que, como se describe completamente más adelante, el agua significativamente atenúa las señales electromagnéticas que pasan a través del agua, reduciendo así enormemente la sensibilidad de tales métodos. La región de interfase bio-eléctrica consiste de una trayectoria de señal diseñada para soportar la propagación de una señal electromagnética a la frecuencia de prueba deseada. Muchas configuraciones son posibles, un ejemplo siendo una línea de transmisión de oro pulverizado en forma iónica, que opera entre D.C. y 110 GHz. En otra modalidad, la trayectoria de señal consiste de un medio dieléctrico, tal como la misma región MBR. En esta modalidad, la trayectoria de señal bloquea los voltajes y corrientes DC, pero de otra manera soporta la propagación de la señal de prueba deseada, que ocurre a frecuencias de, por ejemplo, 1 MHz, 5 MHz 10 MHz, 20 MHz, 45 MHz, 80 MHz, 100 MHz, 250 MHz, 500 MHz, 750 MHz, 1 GHz, 2.5 GHz, 5 GHz, 7.5 GHz, 10 GHz, 12 GHz, 18 GHz, 20 GHz, 22 GHz, 24 GHz, 26 GHz, 30 GHz, 33 GHz, 40 GHz, 44 GHz, 50 GHz, 80 GHz, 96 GHz, 100 GHz, 500 GHz, 1000 GHz, o frecuencias que varían entre estos. Por consiguiente, la trayectoria de señal se diseña utilizando técnicas de diseño de circuito de alta frecuencia, conocidas en el campo. Tales técnicas de diseño incluyen impedancia que iguala la trayectoria de señal con estructuras de interconexión, reducir al mínimo la pérdida de inserción de la trayectoria de señal, y reducir al mínimo la Relación de Onda en Reposo de Voltaje (VSWR) de la trayectoria de señal. En la modalidad preferida de la presente invención, la trayectoria de señal y la región MBR son orientadas en una orientación no ortogonal. La presente invención no está limitada a la detección de una molécula de un tamaño o estructura anticipado unido a la trayectoria de señal. La región MBR puede consistir de 1 , 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 50, 100, 1000, o más longitudes moleculares unidas o separadas de, pero acopladas a la trayectoria de señal. Además, la región MBR puede consistir de capas ff •* AiL *Js'ti ii?l? tíltf ??tt-i-StfSAai«.4a»á&.. múltiples de moléculas homogéneas, una capa molecular individual pero heterogénea, o capas múltiples moleculares heterogéneas. Detalles adicionales con respecto al diseño y operación de ia interfase bio-eléctrica se presentan en la Solicitud de EUA copendiente comúnmente cedida 09/243,194, presentada el 1 de febrero de 1999, la cual ha sido previamente incorporada aquí por referencia.

V.Metodología de Medición A. Resumen General La metodología de medición de la presente invención hace uso de la observación que un basto número de moléculas tales como ácidos nucleicos, se pueden distinguir de una a otra basándose en sus propiedades dieléctricas únicas, las cuales incluyen efectos de dispersión, efectos de resonancia y efectos sobre la solución que rodea dichas moléculas. En la presente invención, cuando una señal de prueba se acopla a la región MBR, la región MBR interactúa con la energía de la señal de prueba, dando como resultado una respuesta de señal única. La respuesta de señal única después puede ser utilizada para detectar e identificar las moléculas que forman la región MBR. Aquéllos expertos en la técnica apreciarán que la mayoría de las moléculas exhiben variación en propiedades dieléctricas sobre diferentes frecuencias. Por ejemplo, una molécula puede exhibir un cambio dramático en sus propiedades dieléctricas como una función de frecuencia en una o más . aa... -. - 1 -Mfcjt.fa-g .*- i .^ ataáMÜ regiones del espectro electromagnético. La banda de frecuencia sobre la cual la molécula exhibe un cambio dieléctrico dramático por lo general es denominada como el régimen de dispersión de la molécula. Sobre estos regímenes, la constante Sobre estos regímenes, la constante dieléctrica de la molécula, permitividad, momentos dipolares y/o multipolares, y susceptibilidad, cambiarán dramáticamente como una función de frecuencia. Estas cantidades por lo general son complejas, teniendo tanto partes reales como imaginarias que representan cambios de magnitud como de fase que ocurren en la respuesta de señal. Los regímenes de dispersión varían sobre varias frecuencias, incluyendo la RF, microondas, ondas de milímetros, frecuencias infrarrojas lejanas y frecuencias infrarrojas. Las propiedades dieléctricas de la molécula pueden ser observadas acoplando una señal de prueba a la molécula y observando la señal resultante. Cuando la señal de prueba excita la molécula a una frecuencia dentro del régimen de dispersión de la molécula, especialmente a una frecuencia resonante, la molécula interactuará fuertemente con la señal, y la señal resultante exhibirá dramáticas variaciones en su amplitud y fases medidas, generando así una respuesta de señal única. Esta respuesta puede ser utilizada para detectar e identificar la estructura molecular unida. Además, ya que la mayoría de las moléculas exhibirán diferentes propiedades de dispersión sobre las mismas bandas de frecuencia o bandas de frecuencia diferentes, cada una genera una respuesta de señal única que puede ser utilizada para identificar la estructura molecular.

La detección e identificación de eventos de unión molecular puede lograrse detectando e inhibiendo las propiedades dieléctricas al nivel molecular. Las propiedades dieléctricas a nivel molecular pueden ser definidas por los momentos multipolares de la de cual, la energía potencial de la cual puede ser representada como una serie infinita como es conocido en la técnica: La serie infinita consiste de términos múltiples, cada uno de los cuales describe, en grados variables, las propiedades dieléctricas de la molécula en presencia de un campo eléctrico, magnético o electromagnético.

El primer término es denominado como el momento monopolar y representa la cantidad de escalar de la energía potencial electrostática que surge de la carga total sobre la molécula. El segundo término o "momento dipolar" es una cantidad de vector y consiste de tres grados de libertad. El tercer término o "momento cuadripolar" es un tensor de rango 2 y describe la respuesta de la molécula sobre 9 grados de libertad. En general, el N término es un tensor de escala N 1 , con 3N-1 grados de libertad, aunque las simetrías pueden reducir el número total de grados de libertad. Como se puede apreciar, los momentos de orden más alto proporcionan un detalle mayor con respecto a las propiedades dieléctricas de la molécula, y de esta manera revela más de la firma dieléctrica única de la molécula. Ya que el gradiente del potencial da como resultado el campo eléctrico: - -*-*— *• *- •-^^--^t ,ew b*^w?*^Aj dtíAtt^&ú3feh*rtk_t-?i>_ff_i_?É¡ilL-i .-¡Si- lií E = -VF (x), El campo de resistencia de los momentos de orden más alto cae rápidamente como una función de la distancia y de esta manera su contribución es difícil de medir. Por ejemplo, el campo debido al momento dipolar cae como r"3 y el campo debido al momento cuadripolar cae como r"4. De esta manera, este aspecto requiere de una estrecha cercanía entre las moléculas de unión y la trayectoria de señal de prueba y la baja pérdida de señal entre estas. Ya que por lo general es el caso que la detección de evento de unión molecular ocurra en soluciones de absorción de señal fuertes, tal como muestras de sangre entera o soluciones únicas, la pérdida de señal entre los eventos de unión y la trayectoria de señal se vuelve absolutamente alta, y la detección de los momentos de orden superior es muy difícil. Además, cada término multipolar se acopla al campo eléctrico en una forma diferente. Esto se demuestra observando la energía de un sistema electrostático dado: La expansión del potencial electrostático en una serie de Taylor proporciona: F(x) = F(0) + ? . VF(0) + i??;c(x, ^> 2 , ; axpXj Ya que E = -VF (x), Además, para el campo externo, V? = 0, de manera que se obtiene d Ej F(x) = F(O) - x • E(0) - i ? ? *, x, dx.

Insertando esto de regreso a la ecuación para la energía dada anteriormente se produce Esto muestra la forma en la cual cada término multipolar ¡nteractúa con el campo de interrogación: la carga total q con el potencial, el dipolar p con el campo eléctrico, el cuadripolar Q,y con el gradiente del campo eléctrico, etc. Esto ilustra la segunda dificultad con la detección de los momentos multipolares de orden más alto. Es difícil en una muestra a granel obtener suficientes gradientes de campo para acoplarse a momentos de orden más alto.

La presente invención supera los obstáculos antes mencionados implementando en la interfase bioeléctrica descrita. La interfase incluye una región MBR, la cual está acoplada a lo largo de la trayectoria de señal. La región MBR consiste de una capa muy delgada y altamente inhomogénea (desde un punto de vista dieléctrico), proporcionando así la cercanía requerida a la estructura electromagnéticamente sondeada, así como los gradientes de campo suficientes para acoplarse a los momentos multipolares de orden más alto. Estas cantidades permiten la detección de momentos más altos que proporcionan una vista enormemente mejorada de las propiedades 5 dieléctricas de la molécula. La colocación de la región MBR cerca de los planos de señal y/o a tierra sirve para aislar la señal que se propaga desde la misma de quedar absorbida en la solución, reduciendo así la pérdida de señal y permitiendo el uso de frecuencias de prueba más altas para detectar e identificar con más exactitud los eventos de unión. De esta manera, la 10 presente invención permite a un grado mayor la recuperación o la respuesta de señal incluyendo las contribuciones de los momentos dipolares y otros momentos multipolares de orden más alto de la molécula. Al utilizar el dispositivo de bioensayo descrito de la presente invención, se pueden detectar numerosas propiedades asociadas con la 15 región MBR. La Figura 4A ¡lustra una modalidad de este método. Inicialmente en el paso 602 se forma una región MBR y se acopla a lo largo de una porción de una trayectoria de señal. Como se describe, la región MBR puede consistir de un ligando, un complejo de anti-ligando/ligando, etc., y puede estar en contacto físico directo o indirecto con, o electromagnéticamente acoplado a la 20 trayectoria de señal. La trayectoria de señal puede consistir del plano de señal o del plano a tierra en una topología de transmisión de dos conductores. Después, en el paso 604, se propaga una señal de prueba a lo largo de la trayectoria de señal. La señal de prueba puede ser cualquier señal de tiempo variable de cualquier frecuencia, por ejemplo, una frecuencia de señal de 10 MHz, o una escala de frecuencia de 45 MHz a 20 GHz. Después, en el paso 606, la señal de prueba se acopla a la región MBR y en respuesta desarrolla una respuesta de señal al acoplamiento. La respuesta de señal después es recuperada y proporciona información como una o más propiedades de la región de unión molecular. El dispositivo de bioensayo puede ser usado para proporcionar información con respecto a numerosas propiedades de la región MBR, tales como la detección e identificación de eventos de unión moleculares, concentraciones de ligando, cambios en propiedades dieléctricas de la región MBR, clasificación de eventos de unión detectados, y similares. La habilidad para detectar y medir momentos dipolares, cuadripolares, y multipolares de orden más alto, moleculares en solución, representa un avance importante en la técnica por un número de razones. En primer lugar, muchas moléculas de interés biomédico tienen estructuras muy diferentes, y, por lo tanto, distintos momentos multipolares. De esta manera, la identificación de los momentos multipolares para una molécula dada revela las propiedades de dicha molécula, las cuales son únicas, y de esta manera permite la identificación de dicha molécula. En segundo lugar, la estructura y función están íntimamente relacionadas en muchas moléculas de importancia biomédica. De esta manera, la habilidad para detectar propiedades de una molécula dada, las cuales se relacionan directamente con la función de dicha molécula, significa que la funcionalidad puede ser verificada para escalas completas de actividades. En tercer lugar, el ambiente fisiológico local juega un papel importante en la estructura y función de una molécula dada, de manera que una habilidad para detectar las propiedades físicas descritas anteriormente significan que las moléculas pueden ser utilizadas como monitores y sondas con el propósito de medir cambios en un sistema dado. De esta manera, con la habilidad para traducir propiedades complejas e informativas con respecto a sistemas moleculares y celulares a un formato de datos electrónicos detectable, nuevas posibilidades completas emergen en las áreas discutidas aquí.

B. Detección de Estructuras Moleculares Unidas El dispositivo de bioensayo descrito aquí permite la detección de eventos de unión moleculares que ocurren a lo largo de la trayectoria de señal. Los eventos de unión detectables incluyen eventos de unión primarios, secundarios, y de orden más altos. Por ejemplo, en una interfase bioeléctrica de dos conductores que tiene una región MBR preexistente, las moléculas de la capa conductora formarán los anti-ligandos para la unión a los ligandos, los ligandos que forma la región MBR. En otra modalidad, el anti-ligando y el ligando ambos están incluidos en la región MBR. En esta modalidad, la región MBR se está unida a la superficie de trayectoria de señal a través de enlazadores, moléculas de matriz, capas aislantes o una combinación de cada uno como se muestra en la Figura 1 D. y * **¥ La Figura 4A ilustra una modalidad de este procedimiento. Inicialmente, en el paso 602, se forma una trayectoria de señal a partir de un material que puede soportar la propagación de una señal sobre la frecuencia de operación deseada. La trayectoria de señal puede consistir de una trayectoria de puerto individual, una señal de dos puertos, o una trayectoria de puertos múltiples dentro de uno de los dispositivos de bioensayos descritos en la presente. Además, la trayectoria de señal puede ser realizada como una línea de transmisión, cavidad resonante, o como una estructura de guía de onda. Después, en el paso 604, se proporciona una solución que contiene la molécula objetivo o estructura molecular. En el paso 606, una región MBR que consiste del ligando se forma a partir de la solución y se acopla entre por lo menos una porción de la trayectoria de señal y la solución. Después, en el paso 608, se propaga una señal de prueba a lo largo de la trayectoria de señal. Alternativamente, la señal de prueba puede ser lanzada durante la aplicación de la solución con el fin de observar en tiempo real, la respuesta de señal que ocurre como resultado de los eventos de unión. En el paso 610, la señal de prueba se propaga sobre, se acopla a la región MBR y desarrolla una respuesta de señal que indica la presencia del ligando. Después, en los pasos 612 y 614, la señal de prueba es recuperada, la respuesta de la cual indica la detección del ligando. Las propiedades dieléctricas de la región MBR pueden contribuir a inducir cualquier número de respuestas de señal, cada una de las cuales puede ser indicativa de la unión molecular. Por ejemplo, las propiedades de dispersión de la región MBR pueden variar dramáticamente sobre la frecuencia. En este caso, la respuesta de señal de prueba exhibirá grandes cambios en la amplitud y/o respuesta de fase sobre la frecuencia cuando ocurren eventos de unión molecular a lo largo de la superficie de unión, proporcionando así un medio para detectar eventos de unión molecular a lo largo de la superficie de unión. En otra modalidad, las propiedades de relajación dieléctricas de la región MBR variarán como una función del período de pulso de la señal de entrada. En este caso, la respuesta de señal de prueba indicará un cambio en la cantidad de energía absorbida, o un cambio en algún otro parámetro de la señal de prueba como la fase o amplitud, en o cerca de un período de pulso particular. AL observar un cambio en la energía absorbida u otros parámetros, se pueden detectar eventos de unión a lo largo de la superficie de unión. Otras cantidades tales como impedancias características, velocidad de propagación, amplitud, fase, dispersión, pérdida, permitividad, susceptibilidad, frecuencia, y constante dieléctrica también son posibles indicadores de eventos de unión molecular, El método anteriormente descrito puede ser usado para detectar la unión primaria de un anti-ligando o ligando directamente o indirectamente a lo largo de la trayectoria de señal. Similarmente, el procedimiento de la Figura 4A también puede ser usado para detectar la unión secundaria de un ligando a un anti-ligando. El método de la Figura 4A no está limitado a la detección de eventos de unión primarios o secundarios que ocurren a lo largo de la trayectoria de señal. En realidad, también se pueden detectar eventos de unión terciarios, y de orden superior que ocurren ya sea a lo largo de la trayectoria de señal o se suspenden en solución, utilizando este método. La Figura 4B ilustra un segundo procedimiento para detectar eventos de unión secundarios y de orden más alto que ocurren ya sea a lo largo de la trayectoria de señal. Inicialmente en el paso 620, el evento de unión primario es detectado y la respuesta de señal es medida, una modalidad de la cual se muestra en los pasos 602-612. Subsecuentemente, en el paso 622, la respuesta de señal de evento de unión primaria es almacenada y utilizada como una respuesta de línea de base. Enseguida, en el paso 624, se agrega una segunda solución molecular al dispositivo de bioensayo y se deja circular sobre ia superficie de unión. Después, en el paso 626, los pasos 608 al 612 de la Figura 4A son repetidos para obtener una segunda respuesta de señal. Después, en el paso 628, la segunda respuesta de señal y la respuesta de línea de base son comparadas. Un pequeño cambio o ningún cambio indica que las dos respuestas de señal están muy cercanas, indicando que las propiedades estructurales y dieléctricas de la región MBR no han sido alteradas por la adición de las moléculas dentro de la nueva solución. En este caso, la unión secundaria no ha ocurrido a un grado importante (paso 630). Si la comparación da como resultado un cambio fuera de la escala predeterminada, la estructura y/o propiedades dieléctricas de la región MBR han sido alteradas, indicando así eventos de unión secundarios (paso 632).

Las cantidades que pueden ser usadas para indicar eventos de unión secundarios serán paralelas a las cantidades antes mencionadas, por ejemplo, amplitud, fase, frecuencia, dispersión, pérdida, permitividad, susceptibilidad, impedancia, velocidad de propagación, constante dieléctrica, así como otros factores. Los eventos de unión terciarios o de orden alto pueden ser detectados utilizando este aspecto. Un método alternativo para detectar eventos de unión secundarios o de orden más alto no requiere de conocimiento anterior del evento de unión primario específico. En esta modalidad, el dispositivo de bioensayo está diseñado en la etapa de desarrollo de ensayo para operar con parámetros conocidos, de manera que si se detecta un cambio predefinido en uno de estos parámetros, por ejemplo, en el punto de uso, el evento o eventos de unión entonces se sabe que ocurren. En esta modalidad, la medición previa de un evento de unión primario no es necesaria, ya que la caracterización inicial se ha realizado ya sea en el momento de la fabricación o en el momento del diseño. También se pueden obtener eventos de unión secundarios detectando cambios en la estructura de la molécula unida primaria. Cuando una molécula queda unida, esta experimenta cambios conformaciones y otros cambios en su estructura molecular con relación a su estado no unido. Estos cambios afectan las propiedades dieléctricas de la molécula de unión primaria, así como induce cambios en la solución circundante, la variación de los cuales puede ser detectado utilizando los pasos 620-628 de la Figura 4B, descrita anteriormente. Las cantidades que pueden ser verificadas para indicar un cambio en las propiedades dieléctricas de la molécula unida primaria incluyen las cantidades antes mencionadas, Por ejemplo, amplitud, fase, frecuencia, dispersión, pérdida, permitividad, susceptibilidad, impedancia, velocidad de propagación, constante dieléctrica, así como otros factores.

C. Detección de Cambios en las Propiedades Dieléctricas de la Capa de Unión Molecular El dispositivo de bioensayo descrito aquí también puede ser usado para medir los cambios dieléctricos de la región MBR como un resultado de cambios en temperatura, pH, resistencia iónica, y similares. La Figura 4C ilustra una modalidad ilustrativa del procesamiento.

El procesamiento estrechamente queda en paralelo con el método descrito para identificar eventos de unión, la excepción siendo que el método permite la detección y cuantificación de cambios en propiedades dieléctricas de la región MBR. El procedimiento comienza en el paso 641 , cuando una solución que tiene una propiedad dieléctrica inicial es agregada al dispositivo de bioensayo, la respuesta de señal es medida y registrada. En una modalidad, este paso se realiza de acuerdo con los pasos 602-612. Después de un tiempo de operación predeterminado, se realiza una segunda medición y se registra una segunda respuesta de señal (paso 642), otra vez en una modalidad de acuerdo con los pasos 602-612. En el paso 643, se hace después una comparación entre las primera y segunda señales para determinar si las dos señales se correlacionan dentro de una escala predefinida. Si es así, las propiedades de la solución se considera que no han sufrido ningún cambio dieléctrico (paso 644). Si las respuestas de señal no se correlacionan con una escala predefinida, se considera que se han experimentado una o más propiedades dieléctricas de la solución (paso 645). Opcionalmente el cambio en propiedades dieléctricas puede ser cuantificado de la siguiente manera. En el paso 646, la segunda señal es almacenada y correlacionada con una respuesta de señal conocida, la respuesta correlacionada más cercana identificará la propiedad dieléctrica de la solución y la primera respuesta de señal puede ser correlacionada con el valor inicial de ia propiedad dieléctrica, la diferencia de la cual puede ser usada para determinar la cantidad a través de la cual la propiedad dieléctrica identificada ha sido alterada (paso 647).

D. Identificación de Estructuras Moleculares Unidas Utilizando los dispositivos de bioensayo descritos, es posible caracterizar un ligando conocido y subsecuentemente identificarlo en una solución que tenga una formación de ligando desconocido. La Figura 4D ilustra una modalidad de este procedimiento. Inicialmente en el paso 652, se mide un gran número de estructuras moleculares y sus respuestas se almacenan utilizando uno o más de los sistemas de medición descritos más adelante. En una modalidad, este paso se realiza de acuerdo con los pasos 602-612. Cada respuesta almacenada puede corresponder a un ligando individual que ocurre dentro de la solución o lígandos múltiples que ocurren dentro de la misma solución. Subsecuentemente, en el paso 654, se hace una medición de la solución desconocida. En una modalidad, este paso es realizado de acuerdo con los pasos 602-612. Después, en el paso 656, la respuesta de señal de la solución es comparada con las respuestas de señal almacenadas para determinar el paso de correlación con la misma. En el paso 658, la estructura molecular desconocida es identificada seleccionando la respuesta almacenada que exhibe la correlación más cercana a la respuesta desconocida. La comparación puede hacerse utilizando uno o más puntos de datos para determinar la correlación entre una o más respuestas almacenadas, y puede involucrar el uso de software de reconocimiento de patrón o medios similares para determinar la correlación. El procedimiento puede ser usado para identificar estructuras moleculares unidas, primeras, secundarias o de orden más alto.

E. Identificación de Clases de Estructuras Moleculares Unidas También es posible caracterizar subestructuras moleculares conocidas tales como homologías de secuencias en ácidos nucleicos. En una modalidad, el procedimiento prosigue como se muestra en la Figura 4D, excepto que en el paso 652, el número N de subestructuras moleculares, es medido y sus respuestas son almacenadas. Cada respuesta de señal almacenada puede corresponder a una o más subestructuras. El procedimiento continúa como se describe en los pasos 654, 656, y 658, hasta que sea detectado un número suficiente de estructuras y se caracterizan para identificar el compuesto desconocido. Una vez que un número suficiente de correlaciones a ocurrido, entonces es posible clasificar la estructura molecular desconocida. La Figura 4E ilustra otro procedimiento a través del cual se pueden clasificar ligandos desconocidos. El procedimiento identifica el ligando desconocido detectando la unión a motivos estructurales sobre el compuesto desconocido. Inicialmente en el paso 660 se proporciona un dispositivo de bioensayo, el cual tiene múltiples arreglos dirigibles, cada uno de los cuales tiene un anti-ligando para una subestructura de ligando específico. Después, en el paso 662, se detecta la presencia de subestructuras particulares a través de la unión de cada una a su respectivo anti-ligando, y subsecuente caracterización. En una modalidad, este paso se realiza de acuerdo con los pasos 602-612. Subsecuentemente, en el paso 664, cada uno de los eventos de unión después se caracteriza mediante la identificación de cualidades tales como afinidad, cinética, y respuesta espectral. En el paso 666, entonces se hace una correlación entre las respuestas conocidas y desconocidas. Si cada una de las respuestas desconocidas se correlación con respuestas conocidas, el ligando es identificado como el ligando que corresponde a la respuesta conocida. Si las subestructuras exhiben tanto respuestas correlacionadas como no correlacionadas, las respuestas correlacionadas pueden ser utilizadas para construir una clasificación más general de ligando desconocido. Este procedimiento puede ser usado para identificar cualquier estructura molecular, por ejemplo, proteínas, las cuales ocurren dentro de la misma clase o tienen homologías estructurales reocurrentes. También es posible que se pueda conducir un análisis espectral intensivo de un compuesto desconocido dado en cuanto a la estructura y función, ya que se pueden hacer comparaciones con estructuras conocidas, y la extrapolación conducirá a cierto grado de clasificación.

F. Unión Específica contra No Específica La unión de ligando específica se distingue de la unión no específica a través de la "huella" o "firma" espectral del evento de unión. Un evento de unión dado de interés (por ejemplo, una sonda de ácido nucleico y ácido nucleico objetivo) primero puede ser caracterizado en una solución purificada conteniendo solo el ligando de interés y el anti-ligando específico para dicho ligando en la región MBR. Después se realiza un estudio espectral amplio para ver en donde se encuentran las respuestas más fuentes del espectro. El ensayo después es repetido en las soluciones típicamente encontradas en las aplicaciones dedicadas, por ejemplo, sangre entera, para determinar qué efectos tiene la unión no específica sobre la respuesta. Después, se encuentran varios puntos que son determinantes de la unión específica, y se encuentra un grupo separado de puntos, los cuales son determinantes de la unión no específica, y un subgrupo de estos puntos de frecuencia es elegido para la aplicación de ensayo real. Al comparar la respuesta debido a la unión específica con aquellos debido a la unión no específica, se puede determinar el grado de unión específica.

G. Caracterización de un Ligando Dado Por lo general es deseable determinar ciertas calidades de una molécula dada. Los ejemplos incluyen determinar la clase a la cual pertenece una proteína, o qué tipo de polimorfismo tiene un gen u otra secuencia de ácido nucleico dada. Esto puede realizarse en un número de formas. Por ejemplo, un gen dado se puede saber que tiene ciertas secuencias de pares de bases. Algunas veces, por naturaleza existirán pequeñas variaciones en esta secuencia. Por ejemplo, en el gen que codifica para un canal de transporte de ion de cloro en muchas membranas de célula existen mutaciones de pares de bases individuales comunes, o cambios. Dichos cambios conducen a una enfermedad llamada fibrosis crítica en seres humanos. De esta manera, la caracterización de una secuencia de ácido nucleico dada con respecto a pequeñas variaciones es de gran importancia. Dichas variaciones por lo general son denominadas como polimorfismos, y dichos polimorfismos en realidad son detectados formando estructuras de cadena complementarias para cada uno de los polimorfismos conocidos. Ya que cualquier gen dado puede tomar la forma de cualquiera de cientos o miles de polimorfismos, en general es una gran tarea generar estructuras de cadena complementarias para cada polimorfismo. Al utilizar la invención descrita aquí, se puede detectar unión o hibridación no complementaria y distinguirse midiendo muchas de las propiedades físicas que fueron descritas en el párrafo previo: las propiedades dieléctricas del evento de hibridación pueden ser caracterizadas y correlacionadas con datos conocidos, determinando así el tipo de hibridación que ha ocurrido, ya sea completa o incompleta. De esta manera, con un anti-ligando compuesto de una secuencia de ácido nucleico dada, se pueden detectar cientos de diferentes polimorfismos (como ligando) a través de la caracterización del evento de unión. Un experto en la técnica apreciará que son posibles otras refinaciones, tales como modificar las condiciones de severidad para alterar el procedimiento de hibridación, o variar la temperatura y determinar el punto de fusión, que sirve como otro indicador de la naturaleza del procedimiento de hibridación.

H. Cuantificación de Concentraciones Los dispositivos de bioensayo descritos aquí también pueden ser usados para cuantificar las concentraciones de ligandos. La Figura 4F ilustra una modalidad de este proceso. En el caso que el dispositivo no se ha precalibrado (paso 679), inicialmente en el paso 670, se seleccionan anti- ligandos que tengan las propiedades de unión apropiadas, tales como afinidad de unión o cinética, para el analito medido. Estas propiedades se seleccionan de manera que la constante de equilibrio del anti-ligando está cercana del centro de su región de operación lineal. Para aplicaciones en dónde la escala de concentración es demasiado amplia para el uso de un anti-ligando individual, se pueden utilizar varios anti-ligandos con diferentes afinidades y/o escalas de operación lineal, produciendo así un valor para la concentración sobre una escala mucho más amplia. Después, en paso 672, los anti-ligandos se unen al dispositivo de bioensayo o circuito integrado y en paso 673 el dispositivo es conectado al sistema de medición. En paso 674, se hace una decisión de que si respuesta requiere de caracterización para carácter especifico máximo. Si es así, se realiza un análisis espectral, en donde las frecuencias en dónde la unión de analito tiene la unión máxima, son determinadas (paso 675a), las regiones en dónde la unión no específica tiene un efecto máximo son determinadas (paso 675b), y la respuesta única debido a la unión de analito es determinada (paso 675c). Si la caracterización no es requiera, o si es requerida después de su término, el dispositivo es calibrado. Este paso se realiza en una modalidad suministrando una concentración conocida de ligandos al dispositivo de bioensayo inhibiendo la respuesta resultante (paso 676a). Alternativamente, si más puntos de datos son necesarios para la calibración (paso 676b), entonces se puede seleccionar una muestra con una concentración diferente (paso 676c), y la respuesta contra esta concentración puede ser medida (paso 676a). En una modalidad, la medición se hace de acuerdo con los pasos 602- 612. Subsecuentemente en el paso 677, se genera un algoritmo de extrapolación registrando los puntos de la calibración de la respuesta anterior. Después, en el paso 678, se mide una muestra de concentración de ligando desconocida. Este paso se logra en una modalidad suministrando la muestra desconocida al dispositivo de bioensayo, correlacionando la respuesta con el **algoritmo de titulación, y determinando a partir de esta la concentración de ligando. En el caso de que un dispositivo de bioensayo dado sea tanto precalibrado, como calibrado por diseño, el único paso requerido es aplicar el ligando o analito a la superficie, y medir la respuesta. Dicho dispositivo de bioensayo puede ser realizado en muchas formas diferentes. Por ejemplo, algún parámetro de circuito de tipo impedancia o frecuencia característica de un circuito resonante puede ser diseñado para cambiar en una forma predeterminada cuando ocurre el evento de unión, y la cantidad a través de la cual el parámetro cambia además, puede ser diseñada para tener dosis- respuesta. De esta manera, una medición de dicho parámetro de circuito producirá, cuando se analice a través de un algoritmo adecuado, inmediatamente un valor cuantitativo para la concentración de un5 analíto o ligando dado.

I. Auto-Calibración de Dispositivo del bioensavo Los dispositivos de bioensayos descritos poseen una capacidad de auto-diagnóstico y de esta manera un control de punto de calidad de uso y seguro. Para una aplicación de dedicación dada, un anti-ligando particular (especies de unión primarias) actuará como un anti-ligando para algún ligando (las especies secundarias de unión) de interés en la solución. Las especies de unión primaria pueden ser unidas en el punto de fabricación, y las especies de unión secundarias pueden ser unidas en el punto de uso. De esta manera, las variaciones en fabricación especialmente la unión de las especies primarias ocasionará variaciones en la habilidad del dispositivo para unir su ligando específico. Sin embargo, la cantidad de ligando unido estará en proporción directa con la cantidad de anti-ligando unido, de esta manera es posible una medición de relaciones de los dos. La Figura 4G ilustra una modalidad del procedimiento. Inicialmente en el paso 680, se forma una superficie de unión molecular a lo largo de la trayectoria de señal uniendo el anticuerpo apropiado a varias concentraciones y caracterizando la respuesta resultante para cada uno de estas concentraciones, produciendo algún valor "x" para cada concentración. Después, en el paso 682, se genera una curva de titulación similar para ligando midiendo la respuesta de unión del anticuerpo/ligando para diferentes concentraciones de ligando, y una curva de titulación de ligando es predeterminada. Después, en el paso 684 se genera el factor de escala A tomando la relación de respuestas de la unión de anticuerpo a la unión de ligando. En el punto de uso, el ensayo no calibrado después primero es sondeado (paso 686) para determinar la cantidad de anticuerpo unido "x". El factor de escala "y" es subsecuentemente como A*x. El ligando después es aplicado al ensayo y la respuesta es media (paso 689), y la respuesta y la curva de la titulación predeterminada son clasificadas por el factor de escala "y" (paso 690) para determinar la concentración desconocida. El procedimiento de Figura 4F también puede ser modificado para permitir la cuantificación de la cantidad de ligando en la solución. En la modificación, la superficie de unión del dispositivo de bioensayo incluye anti-ligandos que tiene una afinidad predefinida y un carácter específico de ligando. La solución subsecuentemente es aplicada al dispositivo, y se mide una respuesta. La respuesta de señal será proporcional a la cantidad de ligando que se ha unido. De esta manera, se puede realizar una titulación de un ligando dado seleccionando un anti-ligando con una escala de operación lineal apropiada, la escala en donde la constante de equilibrio está dentro de un acoplamiento de unidades de registro de ia escala deseada de concentraciones que serán detectadas. El mismo análisis de medición de relaciones como el descrito anteriormente puede ser aplicado para producir un ensayo cuantitativo, robusto y preciso con controles internos y calibración necesarias para asegurar la confiabilidad.

VI. Sistemas de Medición Se pueden utilizar varios sistemas de medición para realizar los métodos anteriormente descritos. Las Figuras 5-8 ilustran tres ejemplos de posibles sistemas de medición: un sistema de prueba de dominio de frecuencia, un sistema de prueba de dominio de tiempo y un sistema de medición de relajación dieléctrica.

A. Sistema de Medición de Frecuencia La Figura 5A ilustra una modalidad de un sistema de medición de frecuencia de acuerdo con la presente ¡nvención. El sistema 800 incluye una fuente de señal 810 acoplada a la entrada de dispositivo de bioensayo 852 y un detector de señal 890 acoplado a la salida 858 del dispositivo de bioensayo. Opcionalmente, se puede acoplar una fuente señal adicional a ta salida 858 del dispositivo de bioensayo y un detector señal adicional acoplado a la entrada se circuito de prueba 852 para proporcionar una completa capacidad de medición de dos puerto. La medición puede ser modificada para un sistema de prueba de puerto en donde un detector de señales acoplado a la trayectoria de señal para recibir una señal reflejada. En una modalidad específica, el sistema de medición de frecuencia entes mencionado consiste en un analizador de red tal como el número de modelo 851 OC de Hewlett- Packard Company. Alternativamente se pueden utilizar otros sistemas de medición de alta frecuencia, tales como analizadores de red escalares, los cuales proporcionan información de señal basándose en señales transmitidas y reflejadas. Las mediciones se hacen de acuerdo con las metodologías antes mencionadas. Inicialmente, una señal incidente 860 es lanzada hacia el circuito de la prueba y las señales transmitidas y/o reflejadas 870 y 890, respectivamente, son subsecuentemente recuperadas. Las respuestas de señal resultantes tomarán la forma de respuestas de frecuencia única, también denominadas como "huellas espectrales" o "firmas", dos ejemplos de estos se muestran en las Figuras 5B y 5C. La Figura 5B ilustra un tipo de respuesta de frecuencia en donde ocurre una resonancia a la de frecuencia fres- Aquí, la respuesta 870 experimenta una caída e incrementos . « escalonados, indicando que poca o nada de energía señal llega al puerto de salida a esta frecuencia. La resonancia es ocasionada por la propiedad dieléctrica e impedancia de la región MBR que cambia sobre la frecuencia fstart a fstop- Diferentes ligandos tendrá resonancia en diferentes puntos de frecuencia. Además, algún ligandos puede exhibir múltiples puntos de frecuencia resonantes sobre la banda medida fstart a fstop. Una vez que el ligando ha caracterizado por tener uno o más puntos de resonancia de existencia única, estos datos pueden ser usados para identificar la presencia de ligando en una solución desconocida. Esta caracterización puede ser averiguada a partir de los datos empíricos o de cálculos teóricos de momentos multipolares y frecuencias resonantes. Además, cuando se detecta la presencia de eventos de unión secundarios, estos datos pueden indicar cuando un analito queda unido a un ligando, a través de cambio en uno o más puntos de resonancia únicos. La Figura 5C ilustra otro tipo de respuesta de frecuencia, el cual puede ser usado para detectar o identificar una estructura molecular. En este caso, la respuesta de frecuencia exhibe una tendencia a incrementar o reducir general y monotón icamente con algún grado de variación de amplitud. La pendiente y/o la variación de amplitud de la respuesta se puede utilizar para detectar y/o individualmente caracterizar la molécula unida. De esta la manera, en la forma descrita, los puntos de frecuencia resonante, la inclinación, la tendencia y variación de la fase de señal de prueba se pueden utilizar para identificar individualmente el evento de unión molecular. La -A..-a-A-W- -» ***^^Í-~m^J*?S¡f?A ^^-a1fa??lA¡*L respuesta de frecuencia puede ser medida en el puerto de entrada 852, en el puerto de salida 858 o en ambos puertos para identificar individualmente la estructura molecular unida. La Figura 6 ilustra una segunda modalidad ilustrativa de un sistema de medición de frecuencia de acuerdo con la presente invención. El dispositivo de bioensayo bajo la prueba 920 consiste de topología coaxial teniendo un conductor central 921 , un primer aislante 922 teniendo una cavidad 922a, un segundo aislante 923, y un conductor externo 924. La solución 926 ocupa la cavidad 922a. Claro, los dispositivos de otras topologías del circuito pueden ser probados también. Una vez que la solución 926 es agregada a la cavidad 922a, las moléculas dentro de la solución 926 forman una región MBR 921a cerca del conductor central 921. Durante la medición, una fuente señal 910 lanza una señal de prueba incidente 912 hacia el conductor central 921. La región MBR 922a modula la señal de prueba incidente 912, y la señal de prueba reflejada 932 proporciona una respuesta de señal única que puede ser usada para identificar el ligando. La configuración coaxial de un puerto puede presentarse, por ejemplo, como una estructura de aguja subcutánea.

B. Sistema de Medición de Dominio de Tiempo La Figura 7 ilustra una modalidad de un sistema de medición de dominio de tiempo 1000 de acuerdo con la presente invención. El sistema incluye una fuente de pulso 1002 y un detector 1004 acoplado a la entrada • - * ¡efv* 1022 del circuito de prueba 1020 (consistiendo de cualquiera de los dispositivos de bioensayo descritos aquí). En una modalidad alternativa, una fuente de pulso adicional y detector pueden ser acoplados al puerto de salida 1028 para proporcionar una completa capacidad de medición de dos puertos. 5 Además, alternativamente, el sistema puede comprender un sistema de prueba de un puerto, en donde un detector de señal es acoplado a la trayectoria de señal para recibir una señal reflejada. En una modalidad específica, el sistema de medición de dominio de tiempo consiste de un reflectómetro de dominio de tiempo, tal como el modelo número 11801 0 fabricado por Tektronix Corporation. Otros sistemas de medición de alta frecuencia, tales como analizadores de red, que tienen un modo de medición de dominio de tiempo, los cuales proporcionan información de señal basada en pulsos de transmitidos y reflejados, alternativamente puede ser utilizado. En el sistema de medición de dominio de tiempo, la señal de 5 prueba la entrada 1060 consiste de un pulso de dominio de tiempo, las porciones reflejadas del cual pueden se presentadas con el tiempo. En ia modalidad de la presente, un pulso incidente 1060 es lanzado hacia la porción de la línea de la transmisión, que está herméticamente acoplada a la superficie de ensayo. Debido a la propiedad dieléctrica de la región MBR, una 0 porción del pulso incidente 1060 es e refleja hacia el detector 1004. El pulso reflejado 1070 exhibirá una forma única y/o retraso de tiempo el cual es característico de las propiedades dieléctricas de la región MBR, las cuales a su vez son enormemente definidas por las propiedades dieléctricas de ligando, anti-ligando, y solución circundante. De esta manera la forma y retraso del pulso reflejado 1070 se puede utilizar para caracterizar e identificar el ligando. El sistema de prueba de dominio de tiempo puede ser usado en forma separada o junto con el sistema de prueba de alta frecuencia para identificar uno o más ligandos desconocidos.

C. Sistema de Medición de Relajación Dieléctrica Como se conoce en la técnica, la frecuencia de relajación dieléctrica de un ligando es la velocidad a la cual las propiedades dieléctricas del nivel molecular cambia cuando un campo eléctrico es aplicado a la molécula. Como con las propiedades dieléctricas de ligando, la frecuencia de relación dieléctrica principalmente se define por la estructura y geometrías de unión únicas para cada molécula. De esta manera, una vez medida, la frecuencia de relajación dieléctrica de un ligando puede ser utilizar para identificarla. La frecuencia de relajación dieléctrica puede ser cuantificada midiendo la velocidad a la cual el ligando absorbe la energía sobre de la frecuencia. La Figura 8 ilustra una modalidad de un sistema 1100 para hacer esta medición. El sistema de medición 1100 es similar al sistema de medición de dominio de tiempo 1000 ilustrado en la Figura 7 e ¡ncluye una fuente de pulso 1102 y un detector 1104 acoplado a la entrada 1122 del circuito de prueba 1120 (consistiendo de cualquiera de los dispositivos de bioensayos descritos aquí). Una fuente de pulso adicional y detector pueden ser «-* Sf..-. ?..~l „ » ^^J^^a ^^¿J^ 1.,->^m^a^^^»-----¡i^a^^-^ ta'^, -— ^«fr*"" acoplados al puerto de salida 1128 para proporcionar una completa capacidad de medición de dos puertos. En una modalidad específica, el sistema de medición de dominio de tiempo consiste de un reflectómetro de dominio de tiempo, tal como el modelo número 11801 , fabricado por Tektronix Corporation. Alternativamente, se pueden utilizar otros sistemas de medición de alta frecuencia, tales como analizadores de red que tienen un modo de medición de dominio de tiempo, los cuales proporcionan información de señal basándose en pulsos de señal transmitida y reflejada. La señal de prueba de entrada 1160 consiste de grupos del pulso separados, cada grupo teniendo dos o más pulsos incidentes y un intervalo de pulso diferente. Los grupos de pulso 1162 y 1164 son lazados hacia la porción de la línea de transmisión, la cual está herméticamente acoplada a la superficie de unión. Si un grupo de pulso 1162 tiene un intervalo sustancialmente equivalente al período de relajación dieléctrica (el movimiento recíproco de la frecuencia de relajación), la región MBR absorberá sucesivamente menos energía en pulsos exitosos. La reducción en la absorción de señal puede ser medida en la respuesta reflejada 1170 en el puerto de entrada 1122 o en el puerto de salida 1128. Como una cantidad de medición alternativa, la energía de la señal restante puede ser medida ya sea en el puerto de entrada 1122 o el puerto de salida 1128. La velocidad del cambio de la absorción de señal y el intervalo del pulso en donde ocurre el cambio, después pueden ser graficados y utilizados para caracterizar e identificar la molécula(s) unida desconocida.

Esta caracterización de sistemas se puede utilizar independientemente o junto con los sistemas de prueba de tiempo y/o de prueba de dominio frecuencia anteriormente descritos. En todos los sistemas anteriores, un experto en la técnica fácilmente apreciará que tales sistemas pueden ser escalados al nivel del circuito integrado utilizando tecnologías tales como Circuitos Integrados Monolíticos de Microondas (MMIC) y similares. Dichos sistemas de tamaño miniatura pueden ser fácilmente extendidos a sistemas altamente paralelos capaces de detectar y medir, cientos midiendo, miles, o cientos de miles de compuestos, simultáneamente. Estos sistemas pueden ser configurados para producir "compuertas lógicas" las cuales son conmutadas a través del mismo evento de unión, tal como cambiando una impedancia característica y de esta manera los coeficientes de transmisión y/o reflexión, o cambiando las propiedades de paso de banda de dicho un circuito, y utilizando esto como la compuerta de encendido/apagado.

Vil. Integración del Sistema de Detección con Tecnología de Circuito Integrado A. Aspecto General El dispositivo de bioensayo descrito anteriormente puede ser incluido en un circuito integrado no costoso, desechable. Debido a la facilidad de miniaturización, se pueden preparar circuitos integrados muy pequeños con miles o cientos de miles de dispositivos de bioensayos dirigibles contenidos allí. Como se describe más delante con detalle adicional, se pueden utilizar circuitos integrados conteniendo arreglos de ácidos nucleicos el la verificación de expresión, verificación de secuencia, detección e identificación de SNPs, y aplicaciones de secuencia de novo, así como una variedad de otros propósitos de diagnóstico, detección e identificación. Para una revisión de uso de microarreglos en análisis de ácido nucleico ver, por ejemplo, los artículos revisados por varios autores en Nature Genetics Supplement; 21 :1-60 (1999), cada una de las cuales se incorpora aquí por referencia en su totalidad. Los circuitos integrados pueden se fabricados a partir de una variedad de materiales no costosos, tales como substratos de plástico de vidrio, por ejemplo. Los circuitos pueden tener una variedad de formas y tamaños y la capa de unión puede variar en la estructura como se describe anteriormente con relación a las Figuras 1 D - 1 F. En metodologías actuales que utilizan circuitos integrados para analizar ácidos nucleicos, los ácidos nucleicos objetivo contenidos en una muestra generalmente necesitan ser marcados, muy comúnmente con una marca o etiqueta fluorescente. La presente invención elimina la necesidad de ácidos nucleicos objetivo de marca y los problemas asociados con dicha marcación, ya que los eventos de unión pueden ser detectados directamente a través de la modulación de la señal transmitida.

B. Diseño General El circuito integrado utilizado en los métodos de la presente invención típicamente incluye múltiple arreglos de elementos, en donde cada elemento o sitio incluye una sonda de ácido nucleico o, más típicamente, una pluralidad de sondas. Cada elemento del arreglo incluye un trayectoria de señal tal como una línea de transmisión y sistema de circuito apropiado para dirigir el elemento. Cada elemento se pone en contacto con una solución que potencialmente contiene ácidos nucleicos objetivo bajo condiciones de hibridación. Después de proporcionar un período suficiente para que ocurra la hibridación, los elementos son lavados para remover moléculas no unidas a las sondas. Sin embargo, como se describe con mayor detalle más debajo, dada la sensibilidad del sistema de detección de la presente ¡nvención y su habilidad para distinguir entre diferentes eventos de unión, no es necesario en algunos métodos un ciclo de lavado. Los arreglos pueden variar ampliamente en el número de elementos o sitios, así como con respecto al número de sondas dentro de cualquier elemento dado. Como para el número de elementos, el número de elementos deseados puede variar de acuerdo con el tipo de aplicación. De esta manera, por ejemplo, el número de elementos en aplicaciones de verificación o de diagnóstico de secuencia puede ser relativamente bajo, ya que típicamente el número de ácidos nucleicos diferentes que se está probando es relativamente limitado. Sin embargo, el arreglo puede consistir en un elemento individual si solamente se está analizando una secuencia.

Existen elementos adicionales si se van a verificar secuencias, o si se van utilizar elementos redundantes adicionales como controles (es decir, elementos en donde las sondas localizada allí tienen la misma secuencia como el elemento). En estudios de análisis de expresión, el número de diferentes elementos es típica y considerablemente mayor en aplicaciones de verificación de secuencia ya que la presencia de muchos más ácidos nucleicos se está sondeando. El número de elementos en aplicaciones de secuenciación generalmente es aún mayor, ya que, en algunas modalidades, se puede desear utilizar ADNcs de longitud completa para sondear muchos genes diferentes, el ADNc para cada gen estando colocado dentro de un elemento separado. En tales modalidades, el número de elementos puede ser de hasta 100,000 elementos. Por lo tanto, en general, el número de elementos puede variar de 1 a hasta 100,000. Más específicamente, algunas modalidades pueden incluir 101, 102, 103, 104, ó 105 elementos, o cualquier número entre estos. El número o densidad de sondas de ácido nucleico dentro de un arreglo también varía dependiendo de la aplicación y consideraciones de sensibilidad de señal. En algunos métodos, solamente una sola sonda individual queda unidad a un elemento, por ejemplo, cuando la secuencia objetiva está presente en un exceso considerable sobre otras sustancias o en muestras conteniendo secuencias objetivo relativamente pocas. Ya que las sondas individuales también pueden ser utilizadas, por ejemplo, cuando picos característicos para el complejo de hibridación de interés están bien definidos y no traslapan con otras señales adyacentes en exploración espectral. Es posible utilizar sondas en una variedad de otras situaciones, también. Para aplicaciones que involucran muestras más complejas y sensibilidad más baja, el número de sondas por elemento puede ser de hasta depender de 1018 sondas/cm2. De esta manera, la densidad de sonda típicamente varía de una sonda por elemento a 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 1010, 1011, 1012, 1013, 1014, 1015, 1016, 1017, ó 1018 sondas/cm2, o cualquier densidad de entre estos valores. La longitud de sonda es otra variable en la estructura de arreglo. Los arreglos que utilizan sondas de oligonucleótidos sintéticas pueden ser absolutamente cortas, tales como 5, 10, 20, 30, 40, 50, 100 o una longitud de pares de base de unos cuantos cientos, o cualquier número de pares de base entre; las sondas de ADNc también pueden ser relativamente cortas si se prepara a partir de segmentos de genes. Sin embargo, las sondas pueden, tener una longitud de hasta 105 pares de base, especialmente con los clones de longitud completa de ADNc. De esta manera, las sondas son típicamente 5, 10, 102, 103, 104, 105 ó 106 pares de base en longitud, incluyendo todas las escalas de tamaño entre estos.

C. Dirección de Elementos de Arreglo En términos generales, es posible interrogar a cada elemento de un arreglo propagando una señal, cada una de las trayectorias de señal que corren hacia los varios elementos y detectan una señal que resulta de la formación de un complejo de hibridación en un elemento, en donde se forma un complejo de hibridación. En algunos casos, la detección de señal involucra propagar una señal a lo largo de la trayectoria de señal cuando solamente se acopla a una sonda de ácido nucleico a la trayectoria de señal y medir una señal de línea de base. En otros casos, la señal de línea de base es provista solamente cuando una solución regulada en su pH está en contacto con la trayectoria de señal. Después de que la sonda se pone en contacto con la muestra y el arreglo opcionalmente enjuagado, se propaga otra señal por debajo de la línea de transmisión y una señal medida comparada con la señal de línea de base para obtener una diferencia entre las señales. También es posible transmitir simultáneamente señales a múltiples trayectorias de señal, una trayectoria extendiéndose hacia un elemento de prueba, y la otra trayectoria corriendo hacia un elemento del control, el cual carece tanto de sonda y/o objetivo. Las señales propagadas hacia debajo de varias trayectorias de señal, pueden ser lanzadas simultáneamente o en serie, es decir, lanzadas en diferentes tiempos. El nombre exacto de la dirección depende de las aplicaciones, pero un ejemplo de la estrategia general es como sigue. Un espacio de vector es identificado por las variables Keq, kA, y ?=(?1 , a>2, ?3,...) en donde estas variables representan una constante de equilibrio de la constante cinética, y un grupo base de frecuencias N a las cuales se sondean las propiedades dieléctricas. Un espacio dimensional N+2 es de esta manera definido, en donde cada evento de unión puede ser mapeado. Un grupo de moléculas de referencia (por ejemplo, ácidos nucleicos) subsecuentemente se selecciona, el cual representa un espectro de eventos de unión de interés, tales como un grupo de ácidos nucleicos con diferentes secuencias; éstas moléculas de referencia después de unen a puntos dirigibles sobre el circuito integrado. Se introdujo el circuito integrado una especie particular de moléculas o grupo de especies (por ejemplo, secuencias de ácido nucleico objetivo) al circuito integrado, y cada dirección después es sondeada para el valor de cada uno de los puntos en el espacio de vector definido anteriormente (o un subgrupo del mismo adecuado). Cada especie después puede ser representada por una dirección en el espacio del vector. La complejidad y el sistema dependerán del tamaño del espacio del vector y el número total de diferentes ligandos inmovilizados sobre la superficie. Como un ejemplo de lo anterior, considerar un sistema simple compuesto de dos sondas de ácido nucleico diferentes, las cuales son analizadas a cuatro frecuencias diferentes; y además, cada una de estas frecuencias puede ser analizada a diez diferentes amplitudes. Dicho sistema podría tener 100 millones de direcciones posibles (104 para un primer polimorfismo, por ejemplo, y 104 para el segundo polimorfismo, por ejemplo). Un material desconocido, colocado en el sistema puede ser representado por una única dirección única de la forma [(1 ,5,3,7)(4,8,6,7)], en dónde los primeros cuatro números representan la respuesta espectral de la primera sonda a las cuatro frecuencias seleccionadas, y la última para números que representan la respuesta espectral de la segunda sonda en cuatro frecuencias seleccionadas. De esta manera, justo con dos sondas y cuatro frecuencias, se pueden generar 100 millones de direcciones únicas.

D. Detección Se pueden rastrear señales generadas como resultado de la hibridación en varios sitios utilizando una computadora que almacena las señales para los varios elementos. De esta manera, es posible identificar qué elementos incluyen un complejo de hibridación. Por lo general, la medición de la señal involucra la exploración de una escala de frecuencias o longitudes de onda. Como se indicó anteriormente, la señal generalmente varía de MHz a cientos del nivel de Gigaherts. En algunas modalidades, la señal es una microonda. En ciertos casos, por ejemplo, una señal puede ser explorada de 1 a 61 GHz. El detector para de la señal modula puede incluir una versión de una "compuerta lógica", en donde la presencia de un ligando o analito particular tiene el efecto ya sea de encender la compuerta o apagar la compuerta, según sea apropiado para una aplicación dada. Dicha compuerta puede ser lograda en cualquier número de formas que traduzcan el evento de unión a una señal electromagnética, la cual puede ser asignada a uno de dos posibles estados que corresponden a apagado y encendido, 1 ó 0, y similares. Los dos estados pueden ser de diferentes frecuencias de una cavidad resonante o guía de onda que corresponde a los cambios unidos o no unidos, o de amplitud en una línea de la transmisión o guía de onda que corresponde a la unión y no unión, o cambios en el paso de banda de un circuito particular, o similares.

E. Modalidades de Arreglo Específico La Figura 11 ilustra una posible modalidad de un sistema de prueba de arreglo N x M 1500 de acuerdo con la presente invención. El sistema de prueba incluye una prueba característica 1600 descrita más adelante, un conmutador de entrada 1xN 1530, un sistema de medición 1540, un conmutador de salida Mx1 1550, y una computadora 1560. El sistema de medición 1540 comunica las señales de prueba al primer accesorio de prueba 1600 a través de cable de prueba de entrada 1524a y un conmutador de entrada de 1xN 1530. La señal de prueba subsecuentemente recibida de la característica de prueba a través del conmutador de salida de Mx1 1550 y el cable de prueba de salida 1524b. La computadora 1560 controla el conmutador de entrada 1xN 1530, el sistema de medición 1540, y el conmutador de salida Mx1 1550 a través de una barra colectora de control 1550. En una modalidad, el sistema de medición 1540 incluye un Módulo de Prueba de Parámetro S no. de modelo 8516A, un Sintetizador de Frecuencia (no mostrado) modelo no. 8341 B, y un modelo de analizador de re Red de Vector modelo no. 8510B, todos estos se fabrican por la compañía Hewlett Packard Company de Palo Alto. California (www.hp.com). En esta modalidad, el sistema de medición 1540 proporciona una capacidad de medición. En la modalidad preferida, la computadora 1560 incluye un microprocesador de + 450 MHz, tal como aquella fabricada por Intel Corporation of San ta Clara, California (www.intel.com). El control de sistema de prueba, la adquisición de datos y el análisis pueden ser realizados utilizando una herramienta de software de programación de gráficos, así como Lab VIEW(R) fabricado por National Instruments Corporation of Austin, Texas (www.natinst.com). Alternativamente, o además, el sistema de medición 1540 puede incluir un sistema de Reflectómetro de Dominio de Tiempo (TDR), tales como aquellos opcionalmente disponibles con los analizadores de red anteriormente descritos, o descritos en la solicitud de patente incorporada y titulada "Method and Apparatus for Detecting Molecular Binding Events," serie no. 09/243,194. Esencialmente, los sistemas de TDR transmiten un pulso de señal hacia una unidad bajo la prueba. La señal de regreso (ya sea reflejada o transmitida a través de la prueba de unidad) puede ser analizada para averiguar la información con respecto a la prueba unitaria. Específicamente en la modalidad presente, las propiedades dieléctricas de la región MBR modularán el pulso de señal, permitiendo así la detección e identificación de los eventos de unión moleculares allí. Las mediciones de TDR se pueden hacer al nivel de accesorio utilizando los sistemas antes mencionados, o a nivel de dispositivo de bioensayo utilizando uno o más de las técnicas estándares de tecnologías de circuito monolítico de microondas (MMIC). Cuando se hace la medición de TDR a nivel deseado, se genera una señal de prueba de dominio de tiempo muy cerca del dispositivo de bioensayo. La señal después propagada a lo largo de la trayectoria de señal hacia el elemento de bioensayo a través de geometría conductor estándar utilizada en tecnologías de MMIC. La región de unión molecular modula la señal de prueba de dominio de tiempo y la señal modulada es recuperada para ser analizada. El conmutador de entrada 1xN 1530 dirige la señal de prueba desde el cable de prueba de entrada 1524a hacia una de las entradas de señal de accesorio de prueba N. El conmutador de salida Mx1 1550 dirige la señal de prueba de una de las salidas característica de la prueba M hacia el cabíe de prueba de salida. Los conmutadores de entrada y salida 1530 y 1550 pueden consistir de cualquier conmutación o medios de multiplexión, los cuales soportarán la propagación de la señal de prueba deseada. Por ejemplo, los conmutadores de entrada y salida 1530 y 1550 pueden consistir de conmutadores de baja frecuencia (DC a 2 GHz), tales como aquéllos fabricados por Amplifonix, Inc., of Philadelphia, Pennsylvania (www.amplifonix.com). Los conmutadores para utilizarse a frecuencias más altas (2-18 GHz), tales como aquellos descritos por General Microwave Corporation of Amityville, Nueva York (www.generalmicrowave.com) pueden ser alternativamente empleados. La conexión entre el dispositivo de bioensayo y los conmutadores de unión y salida 1530 y 1550, puede hacerse utilizando cables aislados, enlaces de alambres, u otros medios de interconexión convencionales apropiados para la frecuencia de prueba de operación. En una modalidad alternativa, los interruptores de entrada y salida 1530 y 1550 y el arreglo de bioensayo forman un circuito integrado monolítico. Por ejemplo, cuando el arreglo de bioensayo es fabricado utilizando técnicas de procedimiento semiconductoras de GaAs, en conmutadores de entrada y salida 1530 y 1550 pueden consistir en diodos de NIP integralmente formados, los cuales están acoplados al arreglo de bioensayo. Además, alternativamente, los conmutadores de entrada y salida 1530 y 1550 pueden formar un ensamble integrado en donde los conmutadores de entrada y salida 1530 y 1550 son componentes discretos que están conectados (a través de enlaces de alambre o listón) al arreglo de bioensayo. Cualquiera de estas modalidades alternativas proporcionan la ventaja ya que las estructuras de interconexión se hacen en una forma de miniatura o se elimina, reduciendo así o eliminando la pérdida de señal asociada con la misma. Como se explicó, el arreglo de bioensayo puede ser fabricarse en forma de panecillo utilizando técnicas de procedimiento semiconductoras. En esta modalidad, el sistema de prueba de arreglo 1500 puede consistir de una estación de prueba de sonda de panecillo, tal como aquellos descritos por Cascade Microtech, Inc. of Beaverton, Oregón (www.cascademicrotech.com) que incluye o está acoplado a los conmutadores de entrada y salida antes mencionados 1530 y 1550, y la computadora 1560. La estación de sonda de panes pequeños utiliza una o más tarjetas de sonda, cada una de las cuales es capaz de proporcionar un gran número de pérdida baja, interconexiones de señal de VSWR al arreglo de bioensayo. La tarjeta(s) de sonda puede ser utilizada para proporcionar interacciones de señal N y/o M hacia los conmutadores de entrada y/o salida remotamente localizados, 1530 y 1550, respectivamente. Alternativamente, los conmutadores de entrada y/o salida 1530 y 1550 pueden ser monolíticamente fabricados con el arreglo de bioensayo, en ese caso la tarjeta(s) de la sonda proporciona una transición de señal de entrada y/o salida hacia el sistema de medición 1540, en esta última modalidad, la tarjeta(s) de la sonda incluye sondas para proporcionar voltajes de control de conmutador a los diferentes conmutadores monolíticamente formados. Alternativamente o además, el sistema de medición 1540 puede incluir un sistema de Reflectómetro de Dominio de Tiempo (TDR), tales como aquellas opcionalmente disponibles con los analizadores de red antes mencionados o como se describió en la solicitud de patente incorporada: "Method and Apparatus for Detecting Molecular Binding Events", serie no. 09/243,194. 2. Característica de Prueba de Arreglo La Figura 12A ilustra una amplia variedad de una posible modalidad del accesorio de prueba de arreglo NxM de acuerdo con la presente invención. La característica de prueba 1600 incluye una placa superior 1602, una placa inferior 1604, y una cavidad de muestra 1640, (teniendo depresiones superiores e inferiores 1640a y 1640b, respectivamente), que se une al recipiente de reacción anteriormente mencionado 1610, dispositivo de bioensayo 1700 (que además se describe en la Figura 13A a continuación), y elementos separadores de fondo 1630. En la modalidad ilustrada, la muestra suministrada está contenida en la superficie superior del dispositivo de bioensayo en la depresión 1618 del recipiente de reacción 1610. En la modalidad de accesorio de prueba de arreglo N x M, las dimensiones de la cavidad de muestra 1640, correspondiendo entre el recipiente 1610 y el separador de fondo 1630 se diseñan para adaptar el dispositivo de bioensayo 1700, el cual puede ser más grande o más pequeño que el dispositivo de bioensay?. Cada elemento de arreglo incluye una pequeña estructura, monolíticamente depositada para formar una área deprimida sobre la trayectoria de señal con el fin de mantener una porción de la muestra aplicada en comunicación electromagnética con la trayectoria de señal de cada elemento de arreglo. La Figura 12B ilustra una vista extrema de la característica de prueba de arreglo N x M 1600. La característica de prueba 1600 ¡ncluye los conectores de entrada N 1660a? a 1600an y los conectores de salida M 1660b? a 1660bm. La característica de prueba 1600 también ¡ncluye líneas de transmisión de entrada N (no mostrada) las cuales proporcionar una transición de señal entre los N conectores de la característica M 1660a? a 1660am, y las entradas N de bioensayo. La característica de prueba 1600 además incluye líneas de transmisión de salida M (no mostrada) cuya transición es de entre las salidas M de bioensayo y los conectores de salida de M accesorios M 1660b? a 1660bm. Las líneas de transmisión de entrada y salida pueden ser realizadas como tales cables conductores aislados, microtiras, tiras, líneas de transmisión de guía de onda coplanares, depositadas sobre el substrato dieléctrico, u otras arquitecturas de trayectoria de señal convencionalmente conocidas. La selección de la arquitectura de la línea de transmisión se verá influenciada por la banda de frecuencia de prueba y la densidad de puerto de entrada y salida del dispositivo de bioensayo. 3. Arreglo de Bioensavo La Figura 13A ilustra una modalidad de un arreglo de bioensayo integrado 1700 de acuerdo con la presente invención. El arreglo integrado 1700 está suministrado con una señal de prueba a través de la fuente señal del sistema de medición 1540. El arreglo 1700 incluye un conmutador de entrada 1xN integrado 1702 y un conmutador de salida Mx1 en 1704, los cuales se forman monolíticamente durante el procedimiento de fabricación del semiconductor. El número de entradas puede ser igual al número de salidas, en cuyo caso M=N, el número de entradas y de salidas puede diferir. El conmutador de entrada 1xN 1702 dirige la señal de prueba de entrada hacia el elemento de arreglo deseado dentro del arreglo 1703. La región MBR en el elemento de arreglo 1703, modula la señal de prueba de acuerdo con las propiedades dieléctricas de los eventos de unión moleculares, los cuales forman la región MBR. Un conmutador de salida Mx1 1704 dirige la señal de prueba modulada hacia un detector de sistema de medición 1540. Un analizador del sistema de prueba 1540 compara las señales de prueba de entrada y moduladas para determinar la respuesta de señal medida. Aunque casa elemento de arreglo 1703¡ está ilustrado como un dispositivo de dos puertos, aquellos expertos en la técnica apreciarán que se pueden utilizar alternativamente elementos de arreglo de un solo puerto o de puertos múltiples. Como se explicó anteriormente, el arreglo 1703 y los conmutadores de entrada y salida 1702 y 1704 pueden ser fabricados ya sea como componentes discretos o en forma de pastilla e integrarse en grados variantes dependiendo de la aplicación. Una modalidad ¡lustrada, el arreglo 1703 y los conmutadores de entrada y salida 1702 y 1704 están monolíticamente formados sobre una pastilla semiconductora. En otra modalidad, los conmutadores de entrada y salida 1702 y 1704 están monolíticamente formados en forma separada a partir del arreglo detector 1703 y conectados a través de cables o uniones de listón. En una modalidad adicional, los conmutadores de entrada y salida 1702 y 704 y arreglo 1703 cada uno son unidades discretas. Aquellos expertos en la técnica apreciarán que son posibles otras disposiciones. La Figura 13B ilustra una modalidad de un elemento de arreglo, mostrado como primer Transistor de Efecto de Campo eléctricamente conmutado, conectado en serie (FET) 1710. El FET 1710 puede ser un Transistor de Efecto de Campo Semiconductor Metálico (MESFET) fabricando utilizando procesamiento con GaAs. También son posibles otras configuraciones de transistor, por ejemplo, Transistores de Alta Movilidad de Electrones (HEMT), los transistores FETs, de heteroestructura, transistores 5 bipolares homogéneos o de heterounión, o dispositivos de unión PN tales como diodos NIP por nombrar algunos. Alternativamente o además de estos también se pueden utilizar otros elementos de arreglo activos o pasivos. En la modalidad de la Figura 13B, la fuente y terminales de drenaje 1712 y 1714 de transistor FET 1710 son empleados como los puertos 10 de entrada y salida, 1711 y 1715, respectivamente, y el estado de encendido/apagado del transistor FET 1710 es controlado á través de un voltaje aplicado a la terminal de compuerta 1713. La muestra es aplicada sobre el transistor FET 1710 de manera que la región MBR 1716 proporciona una trayectoria paralela entre la fuente y las terminales de drenaje 1712 y 15 1714. El transistor FET 1710 está diseñado de manera que cuando se apaga, presenta un drenaje hacia la resistencia de fuente (RdS) la cual es mucho más alta que la resistencia a través de la región MBR 1716. En este caso, la trayectoria de señal se propaga a través de la región MBR 1716 la cual modula la señal de prueba. La señal de prueba modulada es recuperada (a 20 través de un capacitor de bloqueo DC para remover la derivación de la corriente DC) y compara la señal de prueba de entrada para detectar y/o identificar los eventos de unión moleculares que ocurren dentro de la región MBR 1716. Cuando el transistor FET 1710 es activado, proporciona una 71, ?tü5£_sí** * .lli litt&.^^iM^ resistencia de fuente mucho más baja a la resistencia de la región MBR 1716. En este caso, la región MBR 1716 es efectivamente conmutada fuera de la trayectoria de señal y la señal la propaga enormemente sin ser afectada. De esta manera, simplemente abriendo o cerrando un conmutador, se puede dirigir un elemento de arreglo. La Figura 13C ilustra una modalidad adicional de un transistor FET utilizado como un elemento de arreglo, el cual está ópticamente conmutado. El transistor FET 1720 está conectado similarmente al transistor FET 1710 descrito en la Figura 13B y puede consistir en un transistor fotosensible, diodo u otro dispositivo fotosensible. La unión de compuerta 1722 puede ser iluminada, por ejemplo, con luz del sol normal, un rayo láser, un Diodo Emisor de Luz (LED), u otra fuente que tenga una longitud de onda en la cual el transistor FET 1720 tenga alta sensibilidad. La luz incidente activa el transistor FET 1720 para conmutar la región MBR 1722. Cuando el transistor FET 1720 es desactivado, la señal de la prueba se propaga desde la entrada 1721 del transistor FET hacia la salida 1723 del transistor FET, a través de la región MBR 1722 y es modulada por esta. La señal de prueba modulada es recuperada (a través de un capacitor de bloqueo de corriente DC, mostrado) y es analizada para determinar la presencia y/o identificar eventos de unión moleculares dentro de la región MBR 1722. La Figura 13D ilustra una extensión de las Figuras 13B y 13C en donde dos o más transistores FET están conectados en serie. El arreglo 1750 incluye una primera trayectoria de prueba 1753, a lo largo de la cual se acoplan conmutadores dirigibles 1753a y 1753c. En una modalidad, los conmutadores dirigibles están electrónica u ópticamente controlados por MESFETs, como se describe anteriormente. La trayectoria de arreglo 1753 además incluye regiones de muestra 1753b y 1753d cada una de los cuales proporciona una trayectoria de señal paralela hacia los conmutadores dirigibles correspondientes 1753a y 1753c. Como se describe anteriormente, los conmutadores dirigibles 1753a y 1753c operan para conmutar dentro y fuera de las regiones de muestra 1753b y 1753d entre una fuente de señal 1751 y un detector de señal 1756 a través del conmutador de entrada 1752 y el conmutador de salida 1755. De esta manera, se forma una fila particular en una trayectoria de transmisión, en donde aparece un sitio de ensayo individual como una desigualdad de impedancia. Cada sitio de ensayo puede ser ya sea conmutado al circuito, o conmutado fuera del circuito, o como se desee. La naturaleza de la desigualdad de impedancia es una función de la unión y otros cambios en la región MBR. Se pueden incluir trayectorias de señal adicionales tales como la trayectoria de señal 1754 (que tiene conmutadores dirigibles 1754a y 1754c conectados en paralelo en las regiones de muestra 1754b y 1754d) en el arreglo y cruzarse como tiras en las otras trayectorias utilizando otros conmutadores de pérdida baja (no mostrado) para permitir que la señal de prueba se propague entre trayectorias de señal 1753 y 1754. Los conmutadores de entrada y salida 1752 y 1755 son utilizados para inyectar y recuperar la señal de prueba a/desde el arreglo 1750. Como aquellos expertos en la técnica apreciarán, el arreglo descrito puede ser extendido a cualquier número de elementos N x M para proporcionar un dispositivo de arreglo de dos dimensiones. La Figura 13E ilustra el modelo equivalente de circuito de arreglo mostrado en La Figura 13D. La fuente de entrada 1751 , el conmutador de entrada 1752, el conmutador de salida 1755, y el detector de señal 1756 son Gomo se ilustraron en la Figura 13D. La impedancia de conmutación Zs está designada para ser una igualdad estrecha con la impedancia de referencia de la trayectoria de señal Zo, y la impedancia de ensayo ZI,J está designada para ser mucho más diferente que cualquiera de la impedancia del conmutador o de referencia. De esta manera, los pequeños cambios en la impedancia de ensayo dominarán las propiedades eléctricas de cualquier fila dada, y por lo tanto, serán fácilmente detectables. Los valores exactos para las impedancias dependerán de los criterios de diseño para el arreglo particular, pero ciertos principios generales de ingeniería se aplican, tales como la eficiencia mayor en términos de energía suministrada hacia la carga (detector) que es obtenida con un diseño de impedancia igualada, y frecuentemente se toman impedancias de referencia dando de 50O. En una modalidad alternativa, cada elemento de arreglo puede consistir en una compuerta lógica, la cual es capaz de ocupar uno de dos posibles estados, dependiendo de las condiciones de la compuerta. Como un ejemplo, las condiciones de compuerta pueden ser o no un evento de unión particular que haya ocurrido. Dicha condición puede ser la hibridación del material de ácido nucleico a sondas de captura específicas sobre la superficie del dispositivo, o una interacción de fármaco-receptor, particular. En cualquier caso, el dispositivo está diseñado por ingeniería de manera que un evento de unión o cambio estructural en la región MBR activan la compuerta. Esencialmente, la modulación de cualquier parámetro del circuito puede activar la compuerta; todo lo que se requiere es tener el hardware y software necesarios para hacer la decisión de que si ha modulado o no el parámetro de circuito. Como un ejemplo, se puede verificar una frecuencia característica de un sistema dado tal como una estructura resonante. El desplazamiento en esta frecuencia como resultado de un evento de unión particular puede servir como la modulación que da señal al estado lógico. Cualquier parámetro que cambie como una función de unión puede ser usado para activar la compuerta lógica. Dichos parámetros incluyen, pero no se limita a: frecuencia, voltaje, corriente, energía, fase, retraso, impedancia, reactancia, admisión, conductancia, resistencia, capacitancia, inductancia, u otros parámetros. La Figura 13F ilustra una modalidad de un arreglo de de bioensayo dimensional 1770. Como se muestra, el arreglo 1770 indica un primer eje de entrada/salida (E/S) 1772 y un segundo eje de E/S 1774 para introducir/sacar señales de prueba. El arreglo está interconectado con hardware de diagnóstico externo convencional el cual es capaz de generar y detectar la frecuencia . A, a???iXh t?eSk'^-^ apropiada o frecuencias, después comunicándolo a y de arreglo de ensayo a través de un multiplexor, a través de los puertos como se ilustra anteriormente. Dicho sistema externamente soportado puede estar compuesto de cualquier número de fuentes electromagnéticas, tales como analizadores de red escalares y de vector, dispositivos de dominio de tiempo como analizadores TDR y otras técnicas pulsadas; utilizan cualesquiera de los esquemas de detección mencionados aquí, incluyendo los analizadores de vector y de red; y utilizan cualquier número de técnicas bien conocidas para suministrar las señales a y del arreglo de ensayo a través de técnicas del multiplexor estándares y no estándares. Genéricamente, dicho circuito integrado puede ser fabricado utilizando aspectos de circuito integrado de semiconductor estándar. Aquéllos expertos en la técnica fácilmente apreciarán que dicha configuración puede ser usada en un formato de un puerto, un formato de dos puertos, o utilizar más de dos puertos. La región de interfase bio-eléctrica consiste de una trayectoria de señal diseñada para soportar la propagación de una señal electromagnética a la frecuencia de prueba deseada. Son posibles muchas configuraciones, un ejemplo siendo una línea de transmisión de oro pulverizado en forma iónica que opera de entre D.C. y 110 GHz. En otra modalidad la trayectoria de señal consiste de un medio dieléctrico, tal como la misma región MBR. En esta modalidad, la trayectoria de señal bloque los voltajes y corrientes DC pero de otra manera soporta la propagación de prueba deseada, que ocurre a frecuencias, de por ejemplo 1 MHz, 5 MHz 10 MHz, 20 MHz, 45 MHz, 80 MHz, 100 MHz, 250 MHz, 500 MHz, 750 MHz, 1 GHz, 2.5 GHz, 5 GHz, 7.5 GHz, 10 GHz, 12 GHz, 18 GHz, 20 GHz, 22 GHz, 24 GHz, 26 GHz, 30 GHz, 33 GHz, 40 GHz, 44 GHz, 50 GHz, 80 GHz, 96 GHz, 100 GHz, 500 GHz, 1000 GHz, o frecuencias que varía entre estos valores. Por consiguiente, la trayectoria de señal es diseñada utilizando técnicas de diseño de circuito de alta frecuencia, conocidas en el campo. Dichas técnicas de diseño incluyen impedancia para igualar la trayectoria de señal con estructuras de interconexión, reducir al mínimo la inserción pérdida de trayectoria de señal, y reducir al mínimo la Relación de Onda de Reposo de Voltaje (VSWR) de la trayectoria de señal. En una modalidad preferida de la presente invención, la trayectoria de señal y la región MBR están orientadas en una orientación no ortogonal. La presente invención no está limita a la detección de una molécula de un tamaño o estructura anticipado unidad a la trayectoria de señal. La región MBR puede consistir de 1 , 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 50, 100, 1000, o más longitudes moleculares unidas o separadas de, pero acopladas a la trayectoria de señal. Además, la región MBR puede consistir de capas múltiples de moléculas homogéneas, una capa molecular individual pero heterogénea, o capas múltiples moleculares heterogéneas. Información adicional con respecto a arreglos de la presente invención se describen en la solicitud de U.A. copendiente comúnmente cedida intitulada "Test Systems and Sensores for Detecting Molecular Binding Events" que tiene el número de apoderado 019501-000500US la cual se presento en la misma fecha como la presente solicitud y la cual se incorporó previamente aquí por referencia en su totalidad por todos los propósitos.

VIII. Síntesis de Arreglo de Sonda Los arreglos de ácido nucleico para métodos de hibridación tales como aquellos previstos por la presente invención pueden ser preparados en dos formas generales. Un aspecto involucra la unión ADN de colecciones genómicas o de ADNc de algún tipo de soporte sólido, tal como vidrio, por ejemplo. (Ver por ejemplo: Meier-Ewart, et al., Nature 361 :375-376 (1993); Nguyen, C. et. al., Genomics 29:207-216 (1995); Zhao, N., et. al., Gene 158:207-213 (1995); Takahashi, N., et. al., Gene 164:219-227 (1995); Schena, et. al, Science 270:467-470 (1995); Southern et. al., Nature Genetics Supplement 21:5-9 (1999); y Cheung, et. al., Nature Genetics Supplement 21 :5-9 (1999), cada una de las cuales se incorpora aquí por referencia en su totalidad para todos los propósitos.) El segundo aspecto general involucra la síntesis de sondas de ácido nucleico. Un método implica la síntesis de las sondas de acuerdo con técnicas automáticas estándares y después la unión post-sintética de las sondas a un soporte. Ver por ejemplo, Beaucage, Tetraedro Lett., 22:1859- 1862 (1981) y Needham VanDevanter, et. a., Nucleic Acids Res., 12:6159- 6168 (1984) cada una de las cuales se incorpora aquí por referencia en su totalidad. Una segunda amplia categoría es el así llamado aspecto de "síntesis de oligonucleótido espacialmente dirigido". Los métodos que caen dentro de esta categoría además incluyen, a manera de ilustración y no limitación, síntesis de oligonucleófidos dirigida con luz, microlitografía, aplicación a través de chorro de tinta, deposición de microcanales en sitios específicos y secuestro por barreras físicas. Los métodos de combinación dirigidos con luz para preparar sondas de ácido nucleico se describe en las Patentes Norteamericanas Nos. 5,143,854 y 5,424,186 y 5,744,305; solicitudes de patente de PCT Nos. WO 90/15070 y 92/10092; Fodor et al., Science 251 :767-777 (1991); y Lipshutz, et. al., Nature Genetics Supplement 21 :20-24 (1999) cada una de los cuales se incorpora aquí por referencia en su totalidad. Estos métodos combinan síntesis química de fase sólida y litografía basada en semiconductor. En resumen, tales métodos comienzan con la unión de enlazadores modificados con grupos protectores fotoquímicamente removibles a un sustrato sólido. La luz es dirigida a través de una máscara fotolitográfica en áreas específicas de la superficie de síntesis, activando esas áreas para acoplamiento químico. El primero de una de una serie de nucleósidos que incluye un grupo protector fotosusceptible en el extremo 5' es incubado con el arreglo; ocurre el acoplamiento químico en esos sitios que han sido iluminados en el paso precedente. Después, se alinea una máscara diferente con el circuito integrado y la luz es dirigida hacia una región diferente del sustrato a través de esta máscara, y se repite el ciclo químico. A través de la selección apropiada de máscaras y pasos químicos, se puede sintetizar una colección definida oligonucleótidos en posiciones predefinidas sobre la superficie del arreglo. Un algoritmo para diseñar máscaras para reducir el número de ciclos de síntesis se describen en las Patentes Norteamericanas Nos. 5,571 639 y 5,593,839 to Hubbel et al., y por Fodor et. al., Science 251 :767-777 (1991), cada una de las cuales se incorpora aquí por referencia en su la totalidad. Otros métodos de la combinación que pueden ser usados para preparar arreglos para usarse en la presente invención incluyen reactivos de localización sobre el soporte utilizando impresoras de chorro de tinta. Ver, Pease et. al., EP 728, 520, y Blanchard, et. al., Biosensors y Bioelectronics II: 687-690 (1996), las cuales se incorporan aquí por referencia en su totalidad. Los arregios también pueden ser sintetizados utilizando química de combinación usando trayectorias de flujo o microcanales mecánicamente restringidos para suministrar monómeros a células de un soporte. Ver Winkler et al., EP 624,059; WO 93/09668; y Patente Norteamericana No. 5,885,837 cada una de las cuales se incorpora aquí por referencia en su totalidad.

IX. Unión de Sondas de Acido Nucleico a la Línea de Transmisión La línea de transmisión generalmente se construye de materiales que exhiben una conductibilidad apropiada sobre la escala de frecuencia de prueba deseada y que posee buenas calidades de unión molecular como se describió anteriormente. Tales materiales incluyen, pero no se limitan a oro, óxido de indio-estaño (ITO), cobre, plata, zinc, estaño, antimonio, galio, cadmio, cromo, manganeso, cobalto, iridio, platino, mercurio, titanio, aluminio, plomo, hierro, tungsteno, níquel, tántalo, renio, osmio, talio o aleaciones de los mismos. La capa conductora también puede ser formar a partir de materiales semiconductores, los cuales pueden ser ya sea cristalinos o amorfos en la estructura, incluyendo carbono químicamente corregido o puro, silicio, germanio, arseniuro de galio, arseniuro de indio-galio, vidrio, cuarzo, cerámicas, o similares. El material conductor también se puede formar de polímeros incluyendo, a manera de ilustración y no limitación, polietileno, el polipropileno, poliacetileno, politiofeno y similares. En general, se pueden unir ácidos nucleicos a la línea de transmisión a través de interacciones electrostáticas o enlaces covalentes, por ejemplo. La unión puede lograrse utilizando varios grupos funcionales sobre el ácido nucleico y/o la línea transmisión. Ejemplos de tales grupos funcionales incluyen, por ejemplo, tioles, ácidos carboxílicos, silanos, siloxanos, amidas, succinimidas, y cloruros del acilo. Los ácidos nucleicos pueden ser unidos directamente a la línea de transmisión o, como se describió con referencia a las Figuras 1 D - 1 F, el ácido nucleico puede ser unido a través de uno o más enlazadores. Un enlazador es una molécula que puede ser usada para unir el patrón de unión biológico (por ejemplo ligando o anti-ligando) a la superficie subyacente (por ejemplo, aparato o dispositivo). El enlazador es capaz de formar enlaces covalentes con un ácido nucleico y la línea de transmisión. Un enlazador bifuncional teniendo un grupo funcional, el cual puede reaccionar con un grupo en la superficie de la línea de transmisión, y el otro grupo reactivo con ^^g^^&? . -üsáíi: j^^g^^ ^¿¿ ,, «I ácido nucleico se puede utilizar para formar el conjugado deseado. Muchos procedimientos y moléculas enlazadoras para la unión de varias moléculas biológicas a varios metales, vidrio, y sustratos de plástico son conocidos en la técnica. Ver, por ejemplo, Solicitud de Patente Europea No. 188,256 Patentes Norteamericanas Nos. 4,671 ,958, 4,659,839; 4,414,148; 4,699,784 4,680,338; 4,569,789; y 4,589,071 ; y Borlinghaus et al., Cáncer Res. 47 4071-4075 (1987). Una lista ilustrativa pero exhaustiva de enlazadores que se pueden utilizar con ácidos nucleicos incluyen polietilenglicol, tioles, alcano funcionales, péptidos y otros ácidos nucleicos. En una modalidad, la línea de transmisión es oro y el ácido nucleico esta unido a la línea de transmisión a través de un ácido nucleico que tiene un grupo tiol unido al mismo (la preparación de ácidos nucleicos tiolados se describe por James D. Watson, et. al., Recombinant ADN, 2o Editión, Scientific American Books Ny 1992; la cual se incorpora aquí por referencia en su totalidad). Un método para fabricar una línea de transmisión de oro es como sigue. Se utiliza un material de soporte tal como vidrio u otro material relativamente liso no costoso, como la estructura física subyacente. Sobre la parte superior de este material, se deposita una capa delgada de titanio (10- 100 Angstroms) a través de evaporación térmica, pulverización iónica, deposición química de vapor u otros medios. El titanio actúa como una capa adhesiva entre el oro y el soporte. Subsecuente a la deposición de titanio, de deposita el oro (10-10000 Angstroms) a través de a deposición térmica, pulverización iónica, deposición química de vapor, o métodos similares. Los ácidos nucleicos derivatízados que tienen un término de disulfuro pueden ser unidos a la línea de oro. La funcionalidad de disulfuro sobre el ácido nucleico puede ser reproducida con ditiotreitol antes de uso, o el ácido nucleico puede ser unido a través del disulfuro. El ácido nucleico (ya sea reducido al tiol o como disulfuro) se prepara en una solución de regulador de pH. La unión, se logra, por ejemplo, sumergiendo la línea de transmisión en la solución, haciendo fluir la solución a través de la línea de transmisión, o penetrando la solución sobre la línea de transmisión. La línea de transmisión es subsecuentemente lavada para remover cualquier material no unido y después está lista para utilizarse en un experimento de hibridación. En otros casos, la línea de transmisión puede ser fabricada a partir de óxido de indio-estaño y unida a un ácido nucleico utilizando ácidos nucleicos silanizados (la preparación de ácidos nucleicos silanizados se describe en, por ejemplo, James D. Watson, et. al., Recombinant ADN, 2o Edition, Scientific American Books, NY 1992). Se puede preparar una línea de transmisión de óxido de indio-estaño (ITO) a través de pulverización iónica de indio corregido con estaño en una cámara de pulverización iónica. El material de soporte puede incluir, por ejemplo, vidrio, plástico o silicio. El soporte fabricado de ITO resultante después típicamente es horneado en un horno a 400 °C durante varias horas para inducir una conductibilidad mayor según se desee. Se pueden preparar ácidos nucleicos silanizados en un regulador de pH y después ponerse en contacto con la línea de transmisión, por ejemplo, sumergiendo la línea de transmisión en la solución de ADN, haciendo fluir el regulador de pH a través de la línea de transmisión en una célula, o impregnando la solución en la línea de transmisión. El producto fabricado después es lavado con agua destilada y calentada a 80-90°C durante 60-120 minutos; la línea de transmisión resultante después está lista para uso.

X. Ácidos Nucleicos Objetivo A. Aspecto General Una secuencia objetivo generalmente es una secuencia conocida, o una variante de secuencias de referencia conocidas o parcialmente conocida. Sin embargo, en algunos casos, tales como en el análisis de secuencia de hovo por ejemplo, la secuencia de ácido nucleico objetivo es desconocida. Una secuencia objetivo por lo general codifica un gen o parte de un gen. Por lo general la secuencia objetivo contiene uno o más sitios polimórficos conocidos. La función de la secuencia objetivo puede o no puede ser conocida. El ácido nucleico objetivo puede ser genómico, ARN o ADNc. Las muestras ADN genómico usualmente son amplificadas antes de la aplicación a un arreglo utilizando iniciadores flanqueando la región de interés. El ADN genómico puede ser obtenido de virtualmente cualquier fuente del tejido (distinta a glóbulos rojos). Por ejemplo, las muestras de tejido convenientes incluyen sangre entera, semen, saliva, lágrimas, orina, materia fecal, sudor, bucal, piel y cabello. En algunos casos, es de gran ayuda amplificar ia secuencia objetivo para ayudar a la detección. Sin embargo, ya que los métodos de la presente invención son más sensibles que otros métodos de detección de ácido nucleico y no se someten a interferencia desde antes, es posible, en algunos, evitar tener que amplificar la secuencia de interés o por lo menos reducir el grado al cual se debe amplificar la secuencia. La amplificación del ADN genómico conteniendo un sitio polimórfico genera una especie individual de ácido nucleico objetivo, si el individuo de la muestra donde fue obtenida es homocigoto en el sitio polimórfico o dos especies de moléculas objetivos si el individuo es heterocigoto. Por lo general, también se somete muestras de ARN a amplificación. En este caso, la amplificación típicamente es precedida por transcripción inversa. La amplificación de todo el ARNm expresados se puede realizar como se describe en las publicaciones WO 96/14839 y WO 97/01603. La amplificación de una muestra de ARN a partir de una muestra diploide puede generar dos especies de molécula objetivo si el individuo a partir del cual se obtuvo la muestra es heterocigoto en un sitio polimórfico de ocurrencia dentro del ARN expresado. El método de PCR de amplificación se describe en Tecnology, Principies and Applications for DNA Amplification (ed. H.A. Eriich, Freeman Press, NY, NY, 1992); PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (eds. Innis, et. al., Academic Press, San Diego, CA, 1990); Mattila et al., Nucleic Acids Res. Acids Res. 19, 4967 (1991); Eckert et. al., PCR Methods and Applications 1 , 17 (1991); PCR (eds. McPherson et. al., IRL Press, Oxford); y Patente Norteamericana No. 4,683,202 (cada una de las cuales se incorpora aquí por referencia para todos los propósitos). Los ácidos nucleicos en una muestra objetivo usualmente son marcados en el curso de amplificación a través de la inclusión de uno o más nucleótidos marcados en la mezcla de amplificación. Las marcas o etiquetas también pueden ser unidas a productos de amplificación después de la amplificación, por ejemplo, a través de marcación final. El producto de amplificación puede ser ARN o ADN dependiendo de la enzima y sustratos usados en la reacción de amplificación. Otros métodos de amplificación adecuados incluyen la reacción de cadena de ligasa (LCR) (ver Wu y Walláce, Genomicss 4, 560 (1989), Landegren et al., Science 1077 (1988), amplificación de transcripción (Kwoh et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 86, 1173 (1989)), y replicación de secuencia independiente (Guatelli et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 87, 1874 (1990)) y amplificación de secuencia basada en ácido nucleico (NASBA). Los dos últimos métodos de amplificación involucran reacciones isotérmicas basadas en la transcripción isotérmica, la cual produce tanto ARN de estructura de cadena doble (ARNss), como ADN de estructura de cadena doble (ADNds) como los productos de amplificación en una relación de aproximadamente 30 ó 100 a 1 , respectivamente. •^^tt* ii*^*» *^^ii **tJA? *?~ L? XI. Análisis Libre de Marca Con el sistema de detección de la presente invención, se pueden detectar eventos de unión sin uso de marcas o etiquetas. Esto es verdad en la hibridación entre sondas y objetivos también. Absolutamente todos los métodos de hibridación actuales requieren del uso de etiquetas o marcas como una para identificar que sondas han hibridizado a un objetivo. Los tipos de marcas utilizados en métodos existentes varían, pero frecuentemente incluye marcas radiactivas o marcas fluorescentes. Ya que los métodos de la presente invención involucran la detección directa, no es necesario preparar ácidos nucleicos marcados antes de conducir un experimento, simplificando así el procedimiento y reduciendo los costos. Al no tener que utilizar marcas también asegura que no hay ningún impedimento esférico causado por la presencia de la marca que pudiera interferir con el procedimiento de hibridación. Además, a diferencia de la mayoría de los otros métodos, los métodos aquí descritos son insensibles a la señal anterior que resulta de ácidos nucleicos marcados no unidos (por ejemplo, fluorescencia anterior que resulta de ácidos nucleicos no unidos). Esto significa que los métodos de la presente invención pueden verificar el procedimiento de hibridización en tiempo real, permitiendo así que se tomen estudios cinéticos. Aunque las marcas no son necesarias con la presente invención, la naturaleza del sistema de detección no excluye su uso.

XII. Análisis Utilizando Huellas o Perfiles de Hibridización A. Adquisición de una Huella o Perfil Con el sistema de detección de la presente invención, posible obtener exploraciones espectrales que incluyen señales que son características para ciertos complejos de ligando/anti-ligando o para ciertos tipos de interacciones de unión. Tales exploraciones son denominadas en la presente como perfiles o huellas. Los perfiles pueden ser obtenidos esencialmente para cualquier tipo de complejo de ligando/anti-ligando. Dichos perfiles son particularmente útiles para estudiar complejos de hibridación de ácido nucleico. Como se describe con mayor detalle más adelante, los perfiles pueden ser utilizados para identificar la formación de un complejo particular, detectar la presencia de ciertos ácidos nucleicos, y distinguir entre diferentes tipo de interacciones de unión. Por lo tanto, ciertos métodos la presente invención incluyen determinar el perfil o huella para varios tipos de complejos ligando/anti- ligando, en particular varios tipos de complejo de hibridación. Dentro del contexto de estudios de ácido nucleico, dicho procedimiento típicamente involucra verificar una señal electromagnética transmitida a una trayectoria de señal en donde se acopla electromagnéticamente una sonda que es hibridizada a un objetivo. Una señal de respuesta (transmitió y/o reflejada) generada de la interacción de la señal transmitida con el complejo de hibridación es verificada ya sea como la frecuencia o longitud de onda que es explorada sobre una escala deseada para obtener un espectro que presenta la señal de respuesta como una función de la frecuencia o longitudes de onda. Ya que cada complejo de hibridación proporciona un espectro diferente, el espectro puede servir como un perfil o huella para ese complejo particular. Por ejemplo, es posible identificar ciertos picos o señales a frecuencias particulares en el espectro, las cuales son únicas para un complejo de hibridación particular. Al verificar tales tipos característicos, es posible distinguir entre complejos de hibridación complementarios y desiguales, cuantificar la cantidad de un complejo particular y conducir a estudios cinéticos, por ejemplo. Al repetir este análisis con los numerosos complejos de hibridación diferentes, se puede acumular una base datos de perfiles' o huellas. Al almacenar estos perfiles en un medio del almacenamiento electrónico, los perfiles pueden ser rápidamente accesados durante un experimento y comparados con un espectro experimental para ayudar en los tipos de análisis ya listadas.

B. Distinción entre Complejos de Hibridación Complementarios v no complementarios Los perfiles ya descritos tienen utilidad para distinguir entre un complejo complementario y uno de desigualdad. En general, un espectro es obtenido para una muestra de prueba en una forma usual midiendo una señal generada a partir de un complejo de hibridación entre una sonda y el objetivo. El espectro resultante después es examinado para la presencia de una señal complementaria o una señal de desigualdad. Una señal complementaria es una que es característica para un complejo complementario entre una sonda particular y objetivo particular, las cuales tienen secuencias complementarias. Similarmente, una señal de desigualdad es una señal que es característica para un complejo de desigualdad formado entre una sonda específica y un objetivo específico, los cuales son sustancialmente complementarios, pero los cuales incluyen una o más desigualdades. La presencia de la señal complementaria indica que el complejo entre la sonda y el objetivo es complementario, mientras que la señal de desigualdad indica que la sonda y el objetivo forman un complejo de desigualdad. Al utilizar una base de datos conteniendo datos para muchas diferentes desigualdades, es posible, en algunos casos, no solamente identificar la existencia de una desigualdad particular, sino también identificar qué tipo de desigualdad existe en el complejo de hibridación, es decir, es posible identificar la base el sitio de desigualdad. En ciertas modalidades que utilizan perfiles para analizar complejos de hibridación, es innecesario conducir lavados severos para remover ácidos nucleicos no unidos, los cuales fallan para formar un complejo de hibridación con la sonda de ácido nucleico. En métodos existentes, se marcan ya sea la sonda de ácido nucleico o el objetivo de ácido nucleico, generalmente el último. Ya que las técnicas convencionales difieren de los métodos de la presente invención en cuanto a que no pueden detectar directamente complejos de hibridación, se debe ufilizar ácidos nucleicos marcados para identificar que sondas han formado complejos de hibridación. Tales requieren lavados severos por lo menos por dos razones. En primer lugar, es necesario remover los ácidos nucleicos marcados no unidos, de manera que es posible distinguir entre señales que resultan de ácidos nucleicos hibridizados y no hibridizados. En segundo lugar, los lavados deben ser realizados utilizando condiciones severas ya que las metodologías actuales no pueden diferenciar entre complejos de hibridación complementarios y complejos de hibridación de desigualdad. En el contraste, al utilizar los perfiles ya descritos, es posible no solamente diferenciar entre ácidos nucleicos unidos y ácidos nucleicos no unidos, sino que también es posible distinguir entre complejos de hibridación complementarios o de desigualdad. En realidad, como se describe además en el Ejemplo II que se presenta más adelante, es posible distinguir entre desigualdades individuales. En algunos casos, puede ser necesario lavar las sondas de moléculas no unidas. Sin embargo, aún en tales casos, por lo general sigue siendo posible utilizar perfiles de hibridación para reducir la canfidad de lavado y/o reducir la severidad de las condiciones de lavado, permitiendo así mayor flexibilidad en el análisis. La habilidad para evitar el lavado severo a través del uso de perfiles significa que es posible simplificar el análisis de ácido nucleico evitando un paso complejo de técnicas estándares, permitiendo así también que los análisis sean realizados en una forma más rápido y de costo más efectivo. De esta manera, se permite realizar ciertos métodos como ensayos msKf ^^j? ??A homogéneos, es decir, como ensayos en donde no se requiere un paso de separación. También se pueden utilizar perfiles para hacer mediciones cuantitativas para diferentes complejos hibridación.

XIII. Análisis Cuantitativo El hecho de que los métodos de detección puedan ser realizados sin marcas (y de esta manera las señales pueden ser verificadas en tiempo real) y que es posible correlacionar ciertas señales con complejos de hibridación particulares (es decir, desarrollar perfiles de hibridización) hace posible realizar ciertos análisis cuantitativos. Por ejemplo, ciertas señales en un espectro mostradas previamente correlacionadas con un complejo particular, pueden ser medidas con tiempo para obtener información cinética con respecto a la velocidad de hibridación. Las mediciones pueden incluir, por ejemplo, medir amplitudes de señal o un desplazamiento en la frecuencia señal. También se pueden verificar otros cambios. También es posible comparar la velocidad de cambio de varias señales para obtener información importante con respecto al procedimiento de hibridación. Por ejemplo, los complejos de hibridación complementarios se forman más rápidamente que los complejos de hibridación de desigualdad. De esta manera, se pueden utilizar diferencias en la velocidad de cambio de diferentes señales dentro del espectro para diferenciar entre complejos de hibridación complementarios y de desigualdad. Al verificar las señales complementarias y las señales de desigualdad, también es posible comparar M*.~»»*é *Í~~. t^+A mJj Ai las velocidades de hibridación para complejos complementarios y complejos de desigualdad. Dichos estudios de velocidad pueden ser usados para determinar el número de desigualdades en un complejo de hibridación, por ejemplo. XIV. Análisis de Expresión A. Aspecto General Ciertos métodos de la presente invención involucran el análisis de niveles de expresión de gen. En términos generales, el análisis de expresión involucra la detección y cuantificación de los niveles de ARNm en uno o más muestras. El análisis de expresión proporciona una visión clave hacia una variedad de fenómenos biológicos. El desarrollo y diferenciación celular es un área en donde el análisis de expresión encuentra utilidad particular. En cualquier célula dada, solamente se expresa una fracción de todos los genes codificados. Los niveles y control de tiempos de expresión controlan el desarrollo celular, diferenciación, función y fisiología. De esta manera, se puede utilizar expresión de gen de verificación para analizar estos procedimientos. Como un ejemplo, se puede utilizar el análisis de expresión para determinar diferencias en la expresión entre diferentes tipos de tejido. Los estudios de expresión también pueden proporcionar información importante en la base genética para diferencias de envejecimiento y fenotípicas. El análisis de expresión también puede ser de valor en estudios de varias enfermedades. Por ejemplo, se puede utilizar el análisis de expresión para analizar el desarrollo y progresión de cáncer, ya que estos eventos están acompañados por cambios complejos en el patrón de expresión de gen. Dichos estudios pueden involucrar, por ejemplo, una comparación de la expresión de gen en el tejido enfermo y tejido normal o tejido infectado y tejido normal. También se puede utilizar el análisis de expresión en otras aplicaciones clínicas, incluyendo evaluar los efectos de los varios tratamientos de fármaco en la expresión. Por ejemplo, se pueden comparar variaciones en la expresión de gen para tejido normal tratado con fármacos o un candidato de fármaco y tejido normal. Se pueden realizar estudios similares de fármaco con tejido enfermo y tejido normal. Al determinar que genes son expresados en varias enfermedades, es posible identificar genes o sus productos de proteína que pueden ser fármacos u objetivos de fármacos. En otras aplicaciones clínicas, se puede utilizar el análisis de expresión en evaluaciones toxícológicas comparando niveles de expresión entre el tejido tratado con veneno o toxinas y tejido normal. Claro que, el análisis de expresión puede ser usado en una variedad de otros estudios comparativos para determinar el impacto de variaciones en la expresión del gen. Los métodos generales para utilizar arreglos para sondas de ácido nucleico para verificar la expresión de moléculas de ARNm se describe en PCT/US/96/143839 y WO 97/17317, las cuales se incorporan aquí por referencia en su totalidad. Estos métodos utilizan sondas de los ácidos nucleicos que son complementarias a objetivos de ARNm de interés o productos de amplificación de los mismos. En general, las moléculas de ARNm o productos de amplificación generados de las mismas son aplicadas a las sondas de ácido nucleico para identificar objetivos de interés. En algunos casos, la unión del objetivo a sondas que se sabe que son desiguales con el objetivo puede ser utiliza para controlar ara la unión no específica. Discusiones adicionales con respecto al uso de microarreglos en el análisis de expresión se pueden encontrar por Duggan, et. al., Nature Genetics Supplement 21 :10-14 (1999); Bowtell, Nature Genetics Supplement 21 :25-32 (1999); Brown and Botstein, Nature Genetics Supplement 21 :33-37 (1999); Colé et. al., Nature Genefics Supplement 21 :38-41 (1999); Debouck and Goodfellow, Nature Genetics Supplement 21 :48-50 (1999); Bassett, Jr., et. al., Nature Genetics Supplement 21 :51-55 (1999); Chakravarti, Nature Genetics Supplement 21 : 56-60 (1999); cada una de las cuales se incorpora aquí por referencia en su totalidad.

B. Preparación e Hibridación de ARN Como se describe anteriormente, las muestras pueden ser obtenida de esencialmente cualquier fuente a partir de la cual se pueden obtenerse ácidos nucleicos. Las células en la muestra pueden ser separadas en una variedad de formas para liberar el ARN de allí (ver por ejemplo, Watson, et. al., Recombinant ADN, 2o Edition, Scientific American Books, NY 1992) la cual se incorpora aquí por referencia en su totalidad). Por ejemplo, los ácidos nucleicos pueden ser liberados a través de separación mecánica (tal como ciclos de tejidos de congelación/descongelación, abrasión y aplicación de sonidos), separación física/química, tal como el tratamiento con detergentes (por ejemplo, Tritón, Tween, sodio de dodecilsulfato), choque osmótico, calor, o lisis enzimática (por ejemplo, lisosina, proteinasa K, pepsina, etc.). Una vez que los ácidos nucleicos, han sido obtenidos, estos típicamente son transcritos en forma inversa a ADNc aunque el ARNm puede ser utilizado directamente. Después de la formación del ADNc, generalmente la secuencia de interés son amplificadas de acuerdo con cualquiera de las varias técnicas de amplificación que son conocidas en la técnica y describirán anteriormente. Una muestra que contiene los ácidos nucleicos después se pone en contacto con una sonda, normalmente una multitud de sondas que son parte de un arreglo. Después de permitir un período para que los objetivos se hibridicen a las sondas, en algunos métodos las sondas lavados severamente para remover el objetivo no unido y para reducir al mínimo la unión no específica a las sondas de ácido nucleico de arreglos. Sin embargo, tales lavados pueden ser necesarios debido a la habilidad del el sistema de detección actual para distinguir entre la unión perfectamente complementaria y unión que involucra desigualdades, como se describe anteriormente. Ya que los métodos actuales no requieren de marcación de las moléculas objetivo, no hay ninguna señal antecedente para sustraer esto. Esto significa que se pueden hacerse mediciones en tiempo real, permitiendo así que la cinética de la unión sea verificada y haciendo posible distinguir espectroscópicamente entre unión perfectamente complementaria y de desigualdad.

C. Tipos de arreglos Las sondas utilizadas en los arreglos de la presente invención pueden incluir, por ejemplo, sondas sintetizadas de longitud relativamente corta (por ejemplo, 20-mer o 25-mer), ADNc (de longitud completa o fragmentos de gen), ADN amplificado, fragmentos de ADN (generados por enzimas de restricción, por ejemplo), y ADN transcrito en forma inversa. Para una revisión sobre los diferentes tipos de microarreglos, ver por ejemplo, Southern et al., Nature Genetics Supplement 21 :5-9 (1999), la cual se incorpora aquí por referencia 1. Arreglos Sintetizados En general, se pueden utilizar dos categorías principales de arreglos con los métodos de análisis de expresión de la presente invención: arreglos de costumbre y arreglos genéricos. Los arreglos de costumbre son útiles para detectar la presencia y/o concentración de secuencias de ARNm particulares que son conocidas de antemano. En tales arreglos, se pueden seleccionar sondas de ácido nucleico para hibridizar a subsecuencias preseleccionadas particulares de frecuencia de gen de ARNm o productos de amplificación preparados a partir de estas. En algunos casos, tales arreglos pueden incluir una pluralidad de sondas para cada ARNm o producto de amplificación que será detectado. El segundo tipo de arreglo algunas veces es denominado como arreglo genérico ya que el arreglo puede ser usado para analizar ARNms o productos de amplificación generados de los mismos sin considerar si la secuencia es conocida de ante mano del análisis. Los arreglos genéricos pueden ser subdivididos adicionalmente en categorías adicionales tales como, grupos de sondas aleatorios, seleccionados al azar, o arbitrarios. En algunos casos, un arreglo genérico puede incluir todas las sondas de ácido nucleico posibles de una longitud preseleccionada particular. Un arreglo de ácido nucleico aleatorio es uno en donde la combinación de secuencia es de nucleótido de una longitud particular no varía significativamente de una combinación de secuencias de nucleótidos seleccionadas en una forma deseada o no deseada, formen una colección de todas las posibles secuencias de esa longitud. Los arreglos de nucleótido arbitrarios o al azar de sondas de ácido nucleico son arreglos en donde la selección de la sonda se hace sin identificar y/o preseleccionar ácidos nucleicos objetivo. Aunque los arreglos de nucleótido arbitrarios o al azar pueden acercarse o aún ser aleatorios, los métodos a través de los cuales el arreglo es generado no aseguran que las sondas en el arreglo en realidad satisfagan la definición estadística de aleatoriedad. Los arreglos pueden reflejar alguna selección de nucleótido basándose en la composición de la sonda, y/o no redundancia de sondas, y/o desviación de secuencia de codificación; sin embargo, tales de grupos de sondas aún no han sido elegidos para ser específicos para cualquier gen particular. Alternativamente, los arreglos genéricos pueden incluir todos los posibles nucleótidos de una longitud dada; es decir, polinucleótidos que tienen secuencias que corresponden a cada permutación de una secuencia. De esta manera, ya que las sondas de polinucleótido de esta ¡nvención preferiblemente incluyen hasta 4 bases (A, G, C, T) o (A, G, C, U) o derivados de estas bases, un arreglo que tiene todos los posibles nucleótidos de longitud X contiene sustancialmente 4X diferentes ácidos nucleicos (por ejemplo, 16 ácidos nucleicos diferentes para un 2 mer, 64 ácidos nucleicos diferentes para un 3 mer, 65536 ácidos nucleicos para un 8 mer). Algún número pequeño de secuencias puede estar ausente de una combinación de todos los posibles nucleótidos de una longitud particular debido a problemas de síntesis, y escisión inadvertida). En algunas aplicaciones, puede ser ventajoso utilizar arreglos de oligonucleótido conteniendo colecciones de pares de sondas de ácido nucleico para cada uno de los ARNs que se está verificando. En dichos casos, cada par de sonda incluye una sonda (por ejemplo, un 20-mer o 25-30 mer) que es perfectamente complementaria a una subsecuencia de un ARNm particular o producto de amplificación generado a partir del mismo, y una sonda compañera que es idéntica excepto por una diferencia de base individual en una posición central. Esta sonda de desigualdad de cada par puede servir como un control interior para el carácter específico de la hibridación. Ver por ejemplo, Lockhart, et. al, Nature Biotechnology 14: 1675- 1680 (1996); y Lipshutz, et. al., Nature Genetics Supplement 21 : 20-24, 1999, las cuales se incorporan aquí por referencia en su totalidad. 2. Arreglos de ADNc En lugar de utilizar arreglos que contengan sintetizadas, las sondas pueden más bien ser moléculas de ADNc de longitud completa o fragmentos de las cuales están unidas a un soporte sólido. Los análisis de expresión conducidos utilizando tales sondas se describen por, por ejemplo, Schena et al., (Science 270:467-470 (1995) y DeRisi et. al., (Nature Genetics 14:457-460 (1996) las cuales se incorporan aquí por la referencia en su totalidad.

D. Estructura de arreglo Como indicó anteriormente, el número de elementos en un arreglo puede variar dependiendo de factores tales como la sensibilidad y el número de elementos redundantes deseados para usarse como controles, con el número de elementos generalmente variando de 1 a 105. Para métodos de análisis de expresión, el número de elementos típicamente debe incluir por lo menos 1000 elementos y extenderse hasta 10,000 o aún 100,000 elementos dependiendo del número de secuencias que se están sondeando y si el ADNc o sondas de oligonucleófidos sintéticos son utilizadas. Sin embargo, se pueden utilizar otros números de elementos dentro de las escalas generales establecidas anteriormente.

*""¥**! -'-' ,' E. Densidad v Longitud de la Sonda La densidad de sondas con un elemento puede variar ampliamente, dependiendo de factores como sensibilidad, complejidad de muestra y si han identificado señales características para el complejo de hibridación de interés. Dependiendo de tales factores, la densidad típicamente varía de 1 a 1018 sondas/cm2, como se estableció anteriormente. La densidad en algunas modalidades es de 102 a 105 sondas /cm2. En otros métodos, la densidad es de aproximadamente 105 a 108 sondas/cm2. En otras modalidades más, la densidad es de entre 108 y 1012 sondas/cm2. En otras modalidades más, la densidad es de entre 1012 y 1015 sondas/cm2. La concentración de sonda en otros métodos es de entre 1015 a 1018 sondas/cm2. La longitud sonda puede variar significativamente, dependiendo de, por ejemplo sí los oligonucleótidos sintéticos o ADNcs son utilizados en el arreglo. Los oligonucleótidos sintéticos tienden a ser absolutamente cortos, tales como de 10-20, 20-30, 30-40 ó 40-50 bases de pares de longitud, aunque también se pueden utilizar fragmentos de ADNc en esta longitud. Cuando se utilizan en el arreglo ácidos nucleicos correspondientes a genes de longitud completa, la longitud de la sonda puede variar de algunos miles de pares de bases hasta aproximadamente 100,000 pares de la base. La longitud de sonda entre los elementos también puede variar ampliamente, ya que diferentes ADNcs, por ejemplo, pueden ser unidos en diferentes elementos del arreglo. Sin embargo, como se describe previamente, las sondas pueden variar de 5 hasta 106 pares de base en longitud, incluyendo todos los tamaños entre estos valores.

F. Detección v Cuantificación La transmisión y detección de señal es como se describe anteriormente. En general, una señal es lanzada a cada trayectoria de señal y una señal transmitida y/o modulada (es decir, señal de respuesta) detectada para identificar la unión del objetivo a una sonda. Ya que la secuencia de la sonda o sondas en cada elemento es conocida, una computadora puede verificar de qué elemento sale una señal, haciendo posible determinar la secuencia del objetivo hibridizado en cada uno de los elementos a partir del cual se generó la señal de respuesta. La cuantificación es posible midiendo cambios en la intensidad de un pico característico asociado con hibridación, o aún el antecedente. Los cambios en un pico de absorción, por ejemplo, corresponden a un cambio en concentración. En algunos casos, se puede agregar una cantidad conocida de un objetivo que tiene una secuencia complementaria a una sonda en el arreglo para realizar una calibración. Otros métodos de detección por leer microarreglos se describen por Cheung et al., Nature Genetics Suplement 21 :10-15-19 (I999).

XV. Comprobación de la Secuencia A. General Ciertos métodos de la presente invención involucran varios aspectos de verificación de secuencia. Por ejemplo, algunos métodos involucran clasificar muestras para secuencias conocidas. Dichos métodos encuentran utilidad en una variedad de diferentes aplicaciones. Los ejemplos incluyen, por ejemplo, identificar mutaciones que se sabe que afectan la eficacia de ciertos tipos de tratamiento médico, analizar una muestra forense tomada de una escena de un crimen, prueba de paternidad, verificación de secuencias vírales o bacterianas para la prueba de la infección y prueba de alimento para contaminación de microorganismos. Otras aplicaciones de verificación de secuencia involucran el desarrollo una "firma" para una secuencia desconocida y en descubrimiento de gen. El desarrollo de una firma para secuencias desconocidas involucra la hibridación de ácidos nucleicos de secuencia conocida con ácidos nucleicos de secuencia desconocida, los cuales están unidos a un soporte sólido. Al identificar el número y secuencias particulares de ácidos nucleicos que hibridizan a una secuencia de ácido nucleico desconocida más larga, es posible desarrollar una "firma" para la secuencia desconocida, permitiendo así poder clasificar el ácido nucleico de secuencia desconocida. Dichas firmas son útiles en la clasificación inicial para los nuevos genes. Los métodos para la verificación de secuencia han revisados por Hacia, Nature Genetics Suplement 21 :42-47 (1999), la cual se incorpora aquí por referencia en su totalidad.

B. Identificación de Mutaciones Particulares 1. Preparación de Muestra En general, los tipos de muestra y métodos para aislar ácidos nucleicos de células son similares a los métodos descritos para el análisis de expresión. Una vez que los ácidos nucleicos de una muestra son obtenidos, típicamente se amplifican segmentos de interés a partir del ADN genómico, ARN o plantillas clonadas de acuerdo con los métodos establecidos anteriormente. Después de la amplificación, se someten los objetivos a degradación aleatoria parcial para reducir al mínimo las estructuras inter e intramoleculares que pudieran interferir con la hibridación de objetivo con sondas. Los objetivos después son conectados con sondas de la secuencia apropiada como se describió. 2. Metodología Para métodos diseñados para identificar mutaciones particulares, se seleccionan sondas de ácido nucleico para tener secuencias que por lo menos sean parcialmente complementarias con la secuencia objetivo de interés. De esta manera por ejemplo, en el caso de prueba de evidencia forense, la sonda podría ser complementaria a una secuencia única del sospechoso. En la prueba de paternidad, se podría preparar una sonda para que sea complementaria con una secuencia del padre putativo. Similarmente, '%, en prueba de adulteración de alimentos, se podrían seleccionar sondas para que sean complementarias a secuencias únicas de varios microorganismos. Como se aprecia fácilmente, se pueden diseñar otras secuencias de sonda de acuerdo con la secuencia particular de interés. En métodos en donde se selecciona una sonda para que sea complementaria con la secuencia del objetivo de interés, se utilizan típicamente lavados severos para remover ácidos nucleicos que forman desigualdades con la sonda. La detección de un complejo de hibridación estos casos simplemente involucra verificar una señal generada por la formación de un complejo de hibridación. La formación de una señal es indicativa del objetivo de interés que está presente en la muestra. En este aspecto, no es necesario haber adquirido previamente un perfil de hibridación. Sin embargo, para otros métodos en donde se conoce un complejo de hibridación para el complejo/objetivo de interés, la detección puede incluir examinar el espectro de prueba para la presencia de una señal (o grupo de señales), la cual es característica para ese complejo particular (por ejemplo, una señal complementaria). La existencia de dicha señal indica que la muestra incluye el objetivo de interés. Como se describió anteriormente, al utilizar perfiles es posible evitar lavados severos. Sin considerar el aspecto, con los métodos de verificación de secuencia de la presente invención, no es necesario utilizar ácidos nucleicos marcados. Con perfiles, también es posible utilizar pocas secuencias sobre un arreglo porque ya que una sola sonda puede proporcionar una información de secuencia inequívoca, particularmente ya que es posible distinguir entre desigualdades de pares de base individuales con los métodos de la presente invención. 3. Diseño de Arreglo Como métodos de análisis de expresión, los métodos de verificación de secuencia también pueden utilizar tecnología de arreglos. En general, el número de elementos en el arreglo es considerablemente menor en el caso de análisis de expresión, ya que menos objetivos son examinados en la verificación de secuencia. Sin embargo, se pueden utilizar múltiples elementos si la presencia de múltiples ácidos nucleicos diferentes en una muestra está siendo probada. En tales métodos, cada elemento podría contener sondas complementarias por lo menos a una porción de una de las secuencias objetivos que se está analizando. También es deseable utilizar elementos redundantes (por ejemplo, elementos múltiples, cada uno teniendo la misma secuencia) como un control. Dada la naturaleza de la aplicación, los arreglos típicamente tienen de 1 a 100 elementos. Sin embargo, como se describe anteriormente, desde un punto de vista técnico, no hay razón de que el arreglo no pueda incluir muchos más elementos. La densidad de las sondas dentro de cada elemento puede variar ampliamente como se estableció anteriormente, en general variando de 1 sonda por el elemento a 1018 sondas/cm2, y todos los tamaños entre estos valores. Una sonda individual por elemento se puede utilizar en situaciones en donde exista una excelente sensibilidad y/o señales características bien definidas para el complejo de hibridación de interés. La densidad en otras modalidades es de 102 a 105 sondas/cm2. En otros métodos, la densidad es de aproximadamente 105 a 108 sondas/cm2. En otras modalidades más, la densidad es de entre 108 y 1012 sondas/cm2. En todavía otras modalidades, la densidad es de entre 1012 y 1015 sondas/cm2. La concentración de sondas en otros métodos es de entre 1015 a 1018 sondas/cm2. La longitud de sonda también puede variar ampliamente, variando desde pocas bases a 100,000 bases, por ejemplo. En varias modalidades, la longitud puede ser 10-25 pares de base, 25-50, 50-100, 100-250, 250-500, 500-1000, 1 ,000-10,000 y 10,000 a 100,000 pares de base.

C. Firma de Secuencia y Descubrimiento de Gen Típicamente estos métodos incluyen la colocación de numerosos ácidos nucleicos de secuencia desconocida (por ejemplo, ADNcs) en un circuito integrado para formar un arreglo de ácidos nucleicos de secuencia desconocida. Estos ácidos nucleicos desconocidos después pueden ser sondeados con ácidos nucleicos relativamente cortos de secuencia conocida. La identidad de la secuencia o secuencias conocidas que hibridizan con un ácido nucleico particular de secuencia desconocida proporciona una "firma" del ácido nucleico de secuencia desconocida. Como se observó anteriormente, tales perfiles pueden ser útiles para categorizar una secuencia desconocida o en el descubrimiento de genes. ^^tt. »,.^ XVI. Análisis de Polimorfismo Nucleótido Individual A. Aspecto General Los polimorfismos del nucleótido individual (SNPs) son mutaciones de punto que constituyen el tipo más común de variación genética. Los polimorfismos de nucleótidos individuales son mutaciones estables que pueden ser factores de contribución para enfermedades humanas y también pueden servir como marcadores genéticos. En realidad ya se ha correlacionado de polimorfismos SNPs con varias enfermedades humanas. La publicación WO 93/02216 proporciona una lista extensa de tales polimorfismos SNPs. Otros polimorfismos SNPs adicionales se listan por Cooper et. al., Hum. Genet. 85:55-74 (1990). Ambas publicaciones se incorporan aquí por referencia en su totalidad.

B. Metodología Los métodos de detección de polimorfismo SNP de la presente invención son similares a los métodos de verificación de secuencia descritos anteriormente, particularmente con respecto a la preparación de muestra, condiciones de hibridación y lavado. Típicamente, una sonda de ácido nucleico es unida a un elemento sobre un circuito integrado. Dependiendo del número de polimorfismos SNPs que van a ser interrogados, puede existir una pluralidad de elementos, formando así un arreglo. Cada elemento normalmente incluye sondas de la misma secuencia. En ciertos métodos, la secuencia de sonda es tal que existe una unión complementaria con el * *• -"- —^tt '^LAé»J^uir^-».A-té-i» *-^'^^^-^'^^¡íltt ét^^ S ^¡ objetivo conteniendo el polimorfismo SNP de interés (es decir, la sonda y el objetivo forma un complejo complementario). El análisis de polimorfismo SNP es particularmente adecuadamente para el análisis utilizando perfiles de hibridación. Al utilizar perfiles de hibridación para cada secuencia polimórfica y su complemento correspondiente, es posible examinar un espectro para la presencia de una señal o señales características para cada uno de los varios complejos de hibridación SNP para identificar el polimorfismo que está presente en la secuencia objetivo. Como un ejemplo de formas alternativas de análisis, asumir que la forma del tipo salvaje de una secuencia conteniendo un polimorfismo SNP tiene la secuencia GCGCCGAGACAGCCAGGTCG (SEQ ID NO: 6) y el alelo variante tiene la secuencia GCGCCGAGACTGCCAGGTCG (SEQ ID NO: 7). La secuencia complementaria para la forma del tipo silvestre es CGCGGCTCTGTCGGTCCAGC (SEQ ID NO: 8); mientras que en la secuencia complementaria para el alelo variante es CGCGGCTCTGACGGTCCAGC (SEQ ID NO: 9) (para todas las secuencias, el sitio polimórfico está indicado en negritas). En ciertas modalidades, una sonda que tiene una secuencia complementaria a aquella de la forma de tipo silvestre es acoplada a una trayectoria de señal y después se pone en contacto con una muestra que contiene objetivos que tienen ya sea la forma de tipo silvestre (es decir, base A es el sitio polimórfico) y/o la forma de alelo variante (es decir, la base T en el sitio polimórfico). Después de lavar la sonda acoplada bajo condiciones severas para remover las secuencias no complementarias, una señal generada por la formación de un complejo de hibridación indica que el objetivo es la forma del tipo silvestre. Alternativamente, se pueden utilizar perfiles de hibridación en el análisis. Asumiendo el acoplamiento de la forma de tipo silvestre a la trayectoria de señal, si un objetivo en la muestra es la forma de tipo silvestre, se generan señales características de un complejo complementario. Sin embargo, si el objetivo es la forma alélica variante, entonces se forma un complejo de desigualdad y se forman una señal o señales características de ese complejo. Si un perfil de hibridación para ese complejo de hibridación de desigualdad particular ya ha sido obtenido y almacenado, es posible identificar la forma polimórfica directamente. Son posibles variaciones en este aspecto básico. Por ejemplo, la secuencia de sonda unida a la línea de transmisión puede ser aquella del alelo variante en lugar del tipo silvestre. En otros métodos, una sonda o grupos de sondas complementarias a la forma de tipo silvestre y una sonda diferente o grupos de sondas complementarias al alelo variante se unen en diferentes líneas de transmisión, tales como diferentes elementos de un arreglo por ejemplo.

C. Arreglos 1. Métodos de Análisis Se pueden utilizar arreglos en el análisis de polimorfismo SNP en diferentes formas. En algunos casos, se pueden acoplar sondas complementarias a diferentes secuencias que tienen diferentes polimorfismos SNPs a trayectorias de señal en diferentes elementos; en tales casos, se pueden analizar múltiples secuencias diferentes para diferentes polimorfismos SNPs. Con otros métodos, las sondas complementarias a las diferentes formas alélicas de un polimorfismo particular se unen a diferentes elementos de un arreglo. En otros métodos para analizar polimorfismos SNPs, se puede utilizar un arreglo de sondas de ácido nucleico que son complementarias a subsecuencias de una secuencia objetivo, para determinar la identidad de una secuencia objetivo, medir su cantidad, y detectar diferencias entre el objetivo y una secuencia de referencia utilizando un procedimiento comúnmente conocido como "inclinación". Ver por ejemplo, (WO 95/11995; Patente Norteamericana No. 5,858,659; Chee, et al., Science 274:610-614 (1996); Patente Norteamericana No. 5,837,832; y Lipshutz, et al., BioTechniques 19:442-447 (1995), cada una de las cuales se incorpora aquí por referencia en su totalidad. En resumen, las estrategias se inclinación utilizan un arreglo inclinado, tal como un arreglo inclinado 4L, por ejemplo. En un arreglo inclinado 4L, existe un grupo de cuatro sondas de longitud relativamente corta "„T. es b* .^.. ^^.;Éñ|^ (por ejemplo, 15-mers) las cuales varían en la posición de polimorfismo SNP, pero las cuales de otra manera son idénticas y son complementos perfectos para un segmento del ácido nucleico que se está clasificando. Una sonda perfectamente complementaria se une más herméticamente que aquellas sondas que tienen una desigualdad individual. En métodos tradicionales que utilizan sondas fluorescentemente marcadas, la sonda con la intensidad más alta corresponde a la base desconocida. En los métodos actuales, la marca es innecesaria; a través de medición directa se pueden distinguir igualdades perfectas y desigualdades. Este aspecto para el análisis del polimorfismo SNP puede se extendido para examinar objetivos de ácido nucleico largos y detectar numerosos polimorfismos/mutaciones con relación a una secuencia de consenso caracterizada. 2. Diseño Las consideraciones para el diseño de arreglo en el análisis de polimorfismo SNP va paralelo para la verificación de secuencia, ya que el análisis del polimorfismo SNP es esencialmente una aplicación específica de la verificación de secuencias. De esta manera, las consideraciones de densidad y longitud de sonda descritas con relación a la verificación de secuencia se aplican también al análisis SNP. El número de elementos en el arreglo, así como para las aplicaciones de verificación de secuencia en general, por lo general es absolutamente pequeño dada la naturaleza específica del análisis. Con señales característica para las varias formas alélicas de un polimorfismo SNP, es posible tener un elemento individual. Sin embargo, pueden ser útiles múltiples arreglos de elementos. Por ejemplo, como se describe anteriormente, puede ser deseable tener una sonda para cada una de diferentes formas alélicas en un elemento separado. También, puede ser útil, para propósitos de control, tener elementos múltiples cada uno conteniendo la misma sonda. Otro aspecto de control puede involucrar utilizar diferentes secuencias para la misma forma alélica de un polimorfismo SNP en diferentes elementos. Las diferentes secuencias se seleccionan de manera que el sitio de polimorfismo SNP hibridizan diferentes ubicaciones sobre las varias secuencias (por ejemplo, en un elemento el sitio de polimorfismo SNP hibridiza cerca de un extremo de la sonda; en otro elemento, el sitio de polimorfismo en SNP hibridiza en la parte media de la sonda, etc.).

XVII. Determinación de Secuencia A. Aspecto General Las tecnologías de secuenciación tradicionales involucran procedimientos complicados y consumidores de tiempo que requieren separación de tamaño electroforético de fragmentos de ADN marcados (ver, por ejemplo, Alphey, ADN Sequencing: From Experimental Methods to biolnformatics, Springer-Verlag, New York 1997). Se ha propuesto una alternativa, típicamente denominada como, "Secuenciación a través de Hibridación" (SBH) ver, por ejemplo, Lysov et al., Dokl. Akad. Nauk SSSR 303: 1508-1511 (1988); Bains et al., J. Teor. Biol. 135:303-307 (1988); Drmanac et al., Genomics 4:114-128 (1989); Barinaga, Science 253: 1489, (1991); Stresoska et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 88:10089 (1992); Bains, BioTechnology 10:757-758 (1992); y Patente de E.U.A. No. 5,202,231 cada una de las cuales se incorpora aquí por referencia en su totalidad. En general, la secuenciación por hibridación utiliza un grupo de sondas de ácido nucleico cortas de secuencia definida para sondear secuencias complementarias en una estructura de cadena objetivo más larga de ADN. Las secuencias definidas que hibridizan el objetivo pueden después ser alineadas utilizando algoritmos de computadora para construir la secuencia de ácido nucleico objetivo.

B. Metodología La estrategia de la SBH puede se ilustrada a través del siguiente ejemplo. Una secuencia de ADN objetivo de 12-mer, AGCCTAGCTGAA (SEQ ID NO: 10), se mezcló con un grupo completo de sondas de octanucleótido. Si se considera solamente una complementariedad perfecta, cinco de las 65,536 sondas de octámero, -TCGGATCG (SEQ ID NO: 11), CGGATCGA (SEQ ID NO: 12), GGATCGAC (SEQ ID NO: 13), GATCGACT (SEQ ID NO: 14), y ATCGACTT (SEQ ID NO: 15) hibridizaran al objetivo. La alineación de las secuencias traslapantes desde las sondas de hibridación reconstruye el complemento objetivo original de 12-mer: TCGGATCG (SEQ ID NO: 11 ) CGGATCGA (SEQ ID NO: 12) GGATCGAC (SEQ ID NO: 13) GATCGACT (SEQ ID NO: 14) ATCGACTT (SEQ ID NO: 15) TCGGATCGACTT (SEQ ID NO: 16) La SBH puede realizarse en dos formatos. La metodología de hibridación puede realizarse uniendo el ADN objetivo a una superficie. El objetivo después es interrogado con un juego de sondas de oligonucleótido, una a la vez (ver, Strezoska et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 88:10089-10093 (1991 ); y Drmanac et al., Science 260:1649-1652, (1993), cada una de las cuales se incorporada aquí por referencia en su totalidad). Aunque este aspecto puede implementado con métodos bien establecidos de inmovilización y detección de hibridación, involucra un gran número de manipulaciones. Por ejemplo, para sondear una secuencia utilizando un grupo completo de octanucleótidos, se deben realizar miles de reacciones de hibridación. En el segundo formato, la SBH se realiza uniendo sondas a una superficie en un formato de arreglo en donde la identidad de las sondas en cada sitio es conocida. El ADN objetivo después es agregado al arreglo de sondas. El patrón de hibridación determinado en un experimento individual revela directamente la identidad de todas las sondas complementarias. La metodología de detección de la presente invención puede ser utilizar con ambos formatos. Sin embargo, preferentemente el análisis es conducido con arreglos. Cada elemento del arreglo podría incluir una sonda de secuencia conocida. La hibridación en cada uno de los varios elementos puede ser detectada a través de modulación de la señal transmitida al elemento particular. Otros métodos de SBH requieren algún tipo de marcación para visualizar el patrón de hibridación e identificar que sondas en el arreglo han hibridizado con el objetivo. La marcación con los métodos de la presente invención no es requerida, ya que la hibridación puede ser verificada directamente. Se han desarrollado variaciones del procedimiento de SBH, principalmente para dirigir a un problema principal con SBH, en particular el problema dé desigualdad es que crea errores en la determinación de secuencia. Uno de estos métodos denominado, "SBH posicional" (PSBH) utiliza sondas dobles que tienen salientes de estructura de cadena individual 3' para capturar el objetivo, y es seguido por ligación enzimática del objetivo a la sonda doble. Este aspecto esta diseñado para reducir desigualdades (ver por ejemplo, Broude, et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 91 :3072-153076 (1994) la cual se incorpora aquí por referencia en su totalidad). La misma PSBH ha sido modificada aún más de manera que después de la reacción de ligación, se agreda la polimerasa de ADN para extender la sonda inmovilizada como una forma de reducir más las desigualdades durante la captura del objetivo (ver por ejemplo, Kuppuswamy, et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 86 1143-1147 (1991) la cual se incorpora aquí para referencia en su totalidad). El sistema de detección de la presente invención puede manejar .infria ,---ÉÍ¿!»jt..m-r-..o estas variaciones en la metodología estándar de la SBH, y esencialmente el aspecto es igual como se describió con el aspecto de SBH tradicional con la adición de los pasos de ligación y/o extensión. Sin embargo, ya el sistema de detección de la presente puede distinguir entre desigualdad y unión perfectamente complementaria, estos pasos adicionales de se creen que son innecesarios. La habilidad para distinguir entre los tipos de unión también es anticipada para permitir una mayor flexibilidad en los lavados severos.

C. Diseño de Arreglo En general, se prefiere un gran número de elementos para métodos de secuenciación. El número de elementos en métodos de secuenciación por lo general es de por lo menos 1000 y puede extenderse a 100,000. En varias modalidades, el número de elementos puede ser 103, 104, 105, o cualquier valor entre estos. Pueden existir ciertos casos, sin embargo, en donde el número de elementos preferido está fuera de estas escales. Los factores de densidad de sonda van paralelos con aquellos establecidos para el análisis de expresión. La longitud de las sondas puede variar ampliamente. Los arreglos utilizando sondas sintéticas, por ejemplo, pueden tener sondas que típicamente tienen una longitud de 5-25 bases. La longitud de la sonda en otras modalidades puede ser de 10 a 25, 25 a 50, 50 a 100, 100-250, 250 a 500 o 500 a 1 ,000 bases. Se proporciona los siguientes ejemplos para ilustrar ciertos aspectos de la invención pero no están construidos como limitantes del alcance de la invención.

EJEMPLO I Hibridización de Acido Nucleico:Secuencias Poli G v Poli C Este ejemplo se realizó para demostrar la habilidad del sistema para detectar hibridación entre secuencias complementarias y discriminar contra secuencias que carecen de complementariedad. El experimento fue conducido utilizando un dispositivo de bioensayo en la Figura 2C y se describen en el contexto. Un oligonucleótido (purificado mediante HPLC) compuesto de un 51 -mer de guanina (oligo G) tiolatado en el extremo 5', de Operan Technologies, Inc., (Alameda, CA). Este oligonucleótido se volvió a suspender en 1 mL en 1x SSC (Sigma, St. Louis, MO), se removió una alícuota y se redujo agregando un volumen igual de 0.08M DTT en 1x SSC. La mezcla se incubó durante aproximadamente 16 hr a 37°C después se hizo pasar a través de una columna NAP 10 (Sephadex G-25, Pharmacia, Uppsala, Sweeden). Las alícuotas no utilizadas del material reducido fueron almacenadas bajo gas nitrógeno a -20 °C. Para los experimentos, se dejaron unir 200 pmoles/mL de oligo-G reducido al sustrato de oro durante 60 min, y se midieron los parámetros S y después fueron almacenados. Un 50-mer compuesto completamente de los nucleótidos A, T. y G en 1x SSC a una concentración de 100pM se utilizó como un control, ya £¡ que estas combinaciones de bases no hibridizan con un ácido nucleico que comprende solamente residuos G. La respuesta en los parámetros S se midió a varios intervalos de tiempo (durante varias horas); no se observó ningún cambio durante este periodo de tiempo. Subsecuentemente, un ácido nucleico objetivo de 50-mer (1 pM) compuesto solamente de citosina de ("C") en un regulador de pH idéntico se puso en contacto con la sonda. En este caso, se esperó que el objetivo hibridizará fuertemente con la sonda de ácido nucleico unida. Otra vez, se volvieron a medir los parámetros S a varios intervalos de tiempo. Sin embargo, en este caso, se observa un cambio considerable. La Figura 9 muestra los efectos sobre la energía transmitida tanto los experimentos de control (línea punteada con variación de señal pequeña) y los experimentos de hibridación (línea sólida) después de una hora y se muestra una respuesta fuerte, a la hibridación del 50-mer basado en C a la sonda basada en G unida a la línea de transmisión; la señal para el control objetivo en contraste, cambio muy poco. Este experimento demuestra la capacidad del método de la presente para detectar la formación de complejos de hibridación, aún en presencia de secuencias no complementarias a concentraciones de 100 veces a aquellas de la secuencia complementaria.

EJEMPLO II Discriminación entre Secuencias Complementarias. Desiguales v No Complementarias Se condujo otro grupo de experimentos para determinar si el sistema de la presente invención puede diferenciar entre varios complejos de hibridación involucrando diferentes desigualdades de pares de bases individuales, secuencias complementarias y secuencias no complementarias. El dispositivo de bioensayo, y las condiciones generales experimentales y la adquisición señal fueron como se describieron en el Ejemplo I. Se obtuvieron tres ácidos nucleicos' (10-mers) incorporando desigualdades con relación a una secuencia de prueba. La secuencia de prueba de ácido nucleico fue 5'-CATATCATTC-3' (SEQ ID NO: 1 ) y fue tiolada en el extremo 5'; se utilizó el grupo tiol para unir la sonda a la superficie de oro. La sonda se expuso a la superficie del oro durante 60 minutos después se lavó con 1x SSC (citrato de sodio salino). Se prepararon ácidos nucleicos incorporando una desigualdad con el fin de tener una desigualdad al principio, a la mitad o al final de la secuencia (5'-GAATGATATC-3' (SEQ ID NO: 2); d'GAATCATATG-3' (SEQ ID NO: 3); d'-CAATGATATG-S' (SEQ ID NO: 4), respectivamente). También se probaron controles consistiendo de una estructura de cuerda complementaria (5'-GAATGATATG-3' (SEQ ID NO: 5)) y una estructura de cadena 10-mer de citosina no complementaria de "C's". Cada una de las sondas de control se dejó hacer contacto con la secuencia Objetivo sobre la superficie de oro durante 30 minutos y después se lavó con 1x SSC. Se adquirió un espectro para cada ácido nucleico en presencia de la sonda midiendo los parámetros S durante varios intervalos de tiempo. Los resultados se muestran en las Figuras 10A y 10B en donde la frecuencia (en GHz) se gráfico contra la energía transmitida (dB). La Figura 10A es una completa exploración de 1-21 GHz y en general ilustra que cada complejo de hibridación tiene un espectro diferente. El espectro para el complejo de hibridación complementario (línea punteada) es significativamente diferente de aquel para los complejos de hibridación no complementarios (líneas sólidas). Esta diferencia se muestra aun más claramente en la Figura 10B la cual ¡lustra una expansión del espectro de 1-3 GHz. Estos resultados indican la habilidad de los métodos de la presente ¡nvención para diferenciar entre diferencias de subtítulo en secuencias, incluyendo secuencias que varían solamente en una base individual. Dicha energía de discriminación es de utilidad particular en análisis de polimorfismo SNP, por ejemplo. Este experimento también demuestra cómo es posible utilizar los métodos descritos aquí para obtener una firma para diferentes complejos de hibridación y como es posible utilizar dicha firma, en señales particulares que son características para cierto complejo, para determinar si dicho complejo existe en una solución de prueba y/o si está presente un complejo compuesto de ácidos nucleicos relacionados. Aunque lo anterior es una completa descripción de posibles modalidades de la invención, se pueden utilizar varias alternativas, modificaciones, y equivalentes. Por ejemplo, un experto en la técnica apreciará que la trayectoria de señal para el dispositivo de bioensayo anterior no está limita a una línea de transmisión. Alternativamente se pueden utilizar otros medios transmisión, tales como guías de onda conductores o dieléctricas. La descripción anterior debe ser vista solamente como modalidades ilustrativas de la invención, los límites de las cuales se definen apropiadamente por las satisfacciones y uniones de las siguientes reivindicaciones. Además, todas las publicaciones, documentos de patente y otras referencias citadas en esta solicitud se incorporan aquí por referencia en su totalidad para todos los propósitos al mismo grado como si cada publicación individual, documento de patente o referencia se denotara individualmente. *?*?¿a?.ut .^.a-^ e.^ LISTADO DE SECUENCIAS <110> Signature BioScience, Inc. Heffi, John <120> Método para detectar y clasificar hibridación de ácido nucleico <130> 000600US <140> US 09/365,581 <141> 1999-08-02 <150> US 09/243,194 <151> 1999-02-01 <150> US 60/073,445 <151> 1998-02-02 <150> US 60/134,740 <151> 1999-05-18 <160> 16 <170> Patentln versión 3.0 <210> 1 <211> 10 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Esta secuencia artificial demuestra el principio para distinguir señales desiguales y complementarias y no tiene relación con ninguna secuencia conocida. Se sintetizó utilizando un secuenciador de polinucleótido automatizado y se utilizó como se describió en el texto. <400> 1 catatcattc 10 <210> 2 <211> 10 <212> ADN <213> Artificial , <220> <223> Esta secuencia artificial demuestra el principio para distinguir señales desiguales y complementarias y no tiene relación con ninguna secuencia conocida. Se sintetizó utilizando un secuenciador de polinucleótido automatizado y se utilizó como se describió en el texto. <400> 2 gaatgatatc 10 <210> 3 <211> 10 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Esta secuencia artificial demuestra el principio para distinguir señales desiguales y complementarias y no tiene relación con ninguna secuencia conocida. Se sintetizó utilizando un secuenciador de polinucleótido automatizado y se utilizó como se describió en el texto. <400> 3 gaatcatatg 10 <210> 4 <211> 10 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Esta secuencia artificial demuestra el principio para distinguir señales desiguales y complementarias y no tiene relación con ninguna secuencia conocida. Se sintetizó utilizando un secuenciador de polinucleótido automatizado y se utilizó como se describió en el texto. <400> 4 caatgatatg 10 <210> 5 <211> 10 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Esta secuencia artificial demuestra el principio para distinguir señales desiguales y complementarias y no tiene relación con ninguna secuencia conocida. Se sintetizó utilizando un secuenciador de polinucleótido automatizado y se utilizó como se describió en el texto. <400> 5 gaatgatatg 10 <210> 6 <211> 20 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Esta secuencia es completamente hipotética y se diseñó para ¡lustrar el principio para distinguir señales desiguales y complementarias. No se diseñó para tener ninguna relación con ninguna secuencia conocida y nunca se sintetizó. <400> 6 gcgccgagac agccaggtcg 20 <210> 7 <211> 20 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Esta secuencia es completamente hipotética y se diseñó para ¡lustrar el principio para distinguir señales desiguales y complementarias. No se diseñó para tener ninguna relación con ninguna secuencia conocida y nunca se sintetizó. <400> 7 gcgccgagac tgccaggtcg 20 <210> 8 <211> 20 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Esta secuencia es completamente hipotética y se diseñó para ilustrar el principio para distinguir señales desiguales y complementarias. No se diseñó para tener ninguna relación con ninguna secuencia conocida y nunca se sintetizó. <400> 8 cgacctggct gtctcggcgc 20 <210> 9 <211> 20 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Esta secuencia es completamente hipotética y se diseñó para ¡lustrar el principio para distinguir señales desiguales y complementarias. No se diseñó para tener ninguna relación con ninguna secuencia conocida y nunca se sintetizó. <400> 9 cgacctggca gtctcggcgc 20 <210> 10 <211> 12 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Esta secuencia es completamente hipotética e ilustra el principio para determinar una secuencia total a partir de señales complementarias traslapadas. No se diseñó para tener ninguna relación con ninguna secuencia conocida y nunca se sintetizó. <400> 10 agcctagctg aa 12 <210> 11 <211> 8 <212> ADN <213> Artificial <220> *£, <223> Esta secuencia es completamente hipotética e ilustra el principio para determinar una secuencia total a partir de señales complementarias traslapadas. No se diseñó para tener ninguna relación con ninguna secuencia conocida y nunca se sintetizó <400> 11 gctaggct 8 <210> 12 <211> 8 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Esta secuencia es completamente hipotética e ilustra el principio para determinar una secuencia total a partir de señales complementarias traslapadas. No se diseñó para tener ninguna relación con ninguna secuencia conocida y nunca se sintetizó 0 <400> 12 agctaggc 8 <210> 13 <211 > 8 <212> DNA <213> Artificial <220> 5 <223> Esta secuencia es completamente hipotética e ilustra el principio para determinar una secuencia total a partir de señales complementarias traslapadas. No se diseñó para tener ninguna relación con ninguna secuencia conocida y nunca se sintetizó <400> 13 cagctagg 8 <210> 14 <211> 8 0 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Esta secuencia es completamente hipotética e ilustra el principio para determinar una secuencia total a partir de señales complementarias traslapadas. No se diseñó para tener ninguna relación con ninguna secuencia conocida y nunca se sintetizó <400> 14 tcagctag 8 <210> 15 <211> 8 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Esta secuencia es completamente hipotética e ¡lustra el principio para determinar una secuencia total a partir de señales complementarias traslapadas. No se diseñó para tener ninguna relación con ninguna secuencia conocida y nunca se sintetizó <400> 15 ttcagcta 8 <210> 16 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Esta secuencia es completamente hipotética e ilustra el principio para determinar una secuencia total a partir de señales complementarias traslapadas. No se diseñó para tener ninguna relación con ninguna secuencia conocida y nunca se sintetizó <400> 16 ttcagctagg ct 12

Claims

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1. Un método por detectar complejos de hibridación de ácido nucleico complementarios y de desigualdad, caracterizado porque comprende adquirir un espectro para un complejo de hibridación formado entre (a) una sonda de ácido nucleico que está electromagnéticamente acoplada a una porción de una trayectoria de señal, y (b) un objetivo de ácido nucleico en una muestra, propagando una señal de prueba a lo largo de dicha trayectoria de señal y detectando una señal de respuesta para el complejo de hibridación formado entre la sonda y el objetivo, en donde una o más de las trayectorias de señal y una o más de las sondas están presentes en un aparato en donde se realiza dicho método, cada trayectoria de señal teniendo una sonda de ácido nucleico correspondiente, la pluralidad de sondas y trayectorias de señal opcionalmente están dispuestas como un arreglo, en donde la propagación comprende variar la amplitud de la señal de prueba con tiempo, y en donde la detección de una señal de respuesta ocurre antes de lavar los ácidos nucleicos no unidos de la sonda de ácido nucleico.

2. El método de acuerdo con la reivindicación 1 , caracterizado además porque comprende: examinar el espectro para la presencia de una señal conocida la cual es característica de un complejo de hibridación conocido entre la sonda de ácido nucleico y un objetivo particular, dicha señal conocida siendo una señal complementaria o una señal de desigualdad, la presencia de la señal complementaria siendo indicativa de un complejo de hibridación complementario entre la sonda de ácido nucleico y el objetivo particular, y la presencia de la señal de desigualdad siendo indicativa de un complejo de desigualdad entre la sonda de ácido nucleico y el objetivo particular.

3. El método de acuerdo con la reivindicación 1 , caracterizado además porque: (a) el objetivo incluye un sitio polimórfico, el cual puede incluir una primera o segunda base, y en donde el objetivo forma un complejo de hibridación complementario con dicha sonda si el objetivo incluye la primera base y forma un complejo de hibridación de desigualdad si el objetivo incluye la segunda base; y (b) la presencia de la señal complementaria es indicativa del objetivo incluyendo la primera base en el sitio del polimórfico y la presencia de la señal de desigualdad es indicativa del objetivo incluyendo la segunda base en el sitio polimórfico.

4. El método de acuerdo con la reivindicación 1 , en donde la sonda y el objetivo no están marcados.

5. El método de acuerdo con la reivindicación 1 , caracterizado además porque la variación comprende variar la frecuencia o longitud de onda de la señal de la prueba, la cual es propagada a lo largo de la trayectoria de señal.

6. El método de acuerdo con la reivindicación 5, caracterizado además porque la señal de prueba es una señal de microondas. ^¡tj&K.O A-,.-.* ...^.^ ^..^^te^ . 'BBMt ijiif i ?¡n? ?iMi--i»m?t«ffiríiir?i?mi?i uff naiferf ¡ir

7. El método de acuerdo con reivindicación 1 , caracterizado además porque la porción de la trayectoria de señal comprende una línea de transmisión.

8. El método de acuerdo con la reivindicación 7, en donde dicha sonda está directamente unida a la línea de transmisión.

9. El método de acuerdo con la reivindicación 1 , caracterizado además porque: (a) la muestra potencialmente comprende un objetivo de secuencia conocida; (b) la sonda tiene una secuencia que es complementaria al objetivo de la secuencia conocida; y (c) la señal de respuesta es indicativa de la muestra que contiene el objetivo de la secuencia conocida.

10. El método de acuerdo con la reivindicación 1 , caracterizado además porque la muestra contiene ácidos nucleicos amplificados de genes expresados en una célula particular.

11. El método de acuerdo con la reivindicación 1 , caracterizado además porque: (a) la muestra comprende un primer objetivo de secuencia conocida y un segundo objetivo de secuencia conocida; (b) la pluralidad de sondas comprende un primera sonda complementaria para el primer objetivo y una segunda sonda complementaria para el segundo objetivo, las primeras y segundas sondas están ubicadas en un primer y segundo elemento de arreglo, respectivamente; y (c) la detección comprende verificar los primero y segundo elementos para una primera y segunda de señal de la respuesta, respectivamente, en donde la primera señal de respuesta indica la presencia del primer objetivo en la muestra, y en donde la segunda señal de respuesta fetan» ..¿ate^^^ . -^ j> t ..^ ^^jH^^ ¡^¡L indica la presencia del segundo objetivo en la muestra.

12. El método de acuerdo con la reivindicación 11 , caracterizado además porque la secuencia del primer objetivo es la forma de tipo silvestre de un polimorfismo y la secuencia del segundo objetivo es una forma variante de dicho polimorfismo.

13. El método de acuerdo con la reivindicación 11 , caracterizado además porque la muestra contiene ácidos nucleicos amplificados de genes expresados en una célula particular.

14. El método de acuerdo con la reivindicación 11 , caracterizado además porque la detección comprende propagar una señal de frecuencia de microóndas para cada uno de pluralidad de elementos.

15. El método de acuerdo con la reivindicación 1 , caracterizado además porque la adquisición comprende medir cambios en la amplitud de señal a una pluralidad de diferentes puntos de frecuencia para obtener una pluralidad de valores medidos.

16. El método de acuerdo con la reivindicación 15, en donde los valores medidos son utilizados para evaluar la cinética de hibridación entre la sonda y el objetivo.

17. El método de acuerdo con la reivindicación 1 , caracterizado además porque la pluralidad de sondas de la misma secuencia está electromagnéticamente acoplada a la trayectoria de señal y en donde los cambios pueden ser utilizados para cuantificar el número de complejos de hibridación formados.

18. Un método para detectar complejos de hibridación de ácido nucleico complementarios o de desigualdad, caracterizado porque comprende: (1) adquirir un espectro para un complejo de hibridación formado entre: (a) una sonda de ácido nucleico que está electromagnéticamente acoplada a una porción de una trayectoria de señal, en donde una o más de las trayectorias de señal y una o más de las sondas están presentes en un aparato en donde se lleva a cabo el método, cada trayectoria de señal tiene una sonda de ácido nucleico correspondiente, la pluralidad de sondas y trayectorias señal opcionalmente dispuestas como un arreglo; y (b) un objetivo de ácido nucleico en una muestra, propagando una señal de la prueba a lo largo de la trayectoria de señal, en donde la propagación comprende variar la amplitud de la señal de prueba con el tiempo, y (2) examinar el espectro para la presencia de una señal la cual es característica para un complejo de hibridación entre la sonda y un objetivo particular, la señal siendo una señal complementaria o una señal de desigualdad, la presencia de la señal complementaria siendo indicativa de un complejo de hibridación complementario entre la sonda y el objetivo, y la presencia de la señal de desigualdad siendo indicativa de un complejo de desigualdad entre la sonda y el objetivo.

19. El método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado además porque: (a) el objetivo incluye un sitio polimórfico que puede incluir una primera o segunda base, y en donde el objetivo forma un complejo de hibridación complementario con la sonda si el objetivo incluye la írimera base, y forma un complejo de hibridación de desigualdad si el objetivo incluye la segunda base; y (b) la presencia de la señal complementaria es indicativa del objetivo incluyendo la primera base en el sitio polimórfico y la presencia de la señal de desigualdad es indicativa del objetivo incluyendo la segunda base en el sitio polimórfico.

20. El método de conformidad con la reivindicación 19, en donde la porción de la trayectoria de señal comprende una línea de la transmisión.

21. El método de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado además porque la sonda está directamente unidad a la línea de la transmisión.