MÉTODO PARA SEPARAR COMPUESTOS ORGÁNICOS ANÁLOGOS
CAMPO TÉCNICO 5 La presente invención se refiere a un método para separar compuestos análogos, más particularmente un método para separar un compuesto de elevado peso molecular que contiene lactona con un grupo alquilo como su cadena lateral de un
compuesto de elevado peso molecular que contiene lactona con un grupo alquenilo como su cadena lateral utilizando una resina fuerte de intercambio catiónico conteniendo grupos de ácido sulfónico pretratada con iones de plata. 15 ANTECEDENTES DE LA TÉCNICA Se conoce convencionalmente el uso de iones de plata para separar isómeros cis-trans de un ácido alifático no saturado con el mismo número de carbono
(J. Ch roma t ography 149 (1978) 417-) . Sin embargo, no se ha descubierto aún como separar efectivamente compuestos ligeramente diferentes en una parte de estructura molecular, por ejemplo, un compuesto que presenta un grupo alquilo como su cadena lateral de
un compuesto que presenta un grupo alquenilo como su
*-* "*-^*^ rmiF-iri r cadena lateral. Esto se debe a que tales compuestos presentan el mismo o casi el mismo número de carbono y son similares uno a otro en las propiedades físicas tales como solubilidad en y afinidad a solventes .
REVELACIÓN DE LA INVENCIÓN Los inventores de la presente invención han llevado a cabo importantes estudios en busca de un método para separar efectivamente compuestos similares uno a otro en propiedades físicas sin cambiar los compuestos mismos. Inesperadamente, hallaron un método para separar compuestos similares uno a otro en propiedades físicas, es decir, un compuesto de elevado peso molecular que contiene lactona con un grupo alquilo como su cadena lateral de un compuesto de elevado peso molecular que contiene lactona con un grupo alquenilo como su cadena lateral, los compuestos de elevado peso molecular que contienen lactona presentan una estructura química básica común, utilizando una resina fuerte de intercambio catiónico conteniendo grupos de ácido sulfónico pre-tratada con iones de plata .
Como ejemplos apropiados de resinas fuertes de intercambio catiónico conteniendo grupos de ácido sulfónico, se mencionan una base sintética o una base de un gel de silicio, tal como resinas tipo gel y resinas porosas que se pueden utilizar con un solvente polar pero no se pueden utilizar con un solvente no polar; y resinas sumamente porosas que se pueden utilizar tanto con solventes polares como no polares. Estas resinas se pueden seleccionar de acuerdo a la polaridad de un eluyente utilizado. La resina fuerte de intercambio catiónico conteniendo grupos de ácido sulfónico puede ser una resina fuerte de intercambio catiónico conteniendo grupos de ácido bencensulfónico con grupos de ácido bencensul fóni co s en extremo. Por ejemplo, la resina puede ser una base de un copolimero de un monómero de estireno y divinilbenceno ( DVB ) , o una base de gel de silice. Como ejemplos de resinas fuertes de intercambio catiónico conteniendo grupos de ácido bencensulfónico, es decir, copolimeros sulfonados de monómero de estireno, y DVB, se menciona Diaion©
(serie SK, serie RCP, serie HPK, serie PK tal como
PK 206) (marca registrada, elaborada por Mitsubishi Chemical Corporation, Japón), Amberlite® (IR120B, IR200) y Duolite® (C20, C26) (marca registrada, elaborado por Rohm & Haas Company) . Dowex® (50W-X8, MSC-1) (marca registrada, elaborado por Dow Chemical Company), Ionac® (C-240) (marca registrada, elaborado por Sybron Chemicals Inc.) Y Lewatit® (S-100, serie SP) (marca registrada, elaborado por Bayer Corporation) . Como ejemplos de resinas fuertes de intercambio catiónico conteniendo grupos de ácido bencensulfónico que presentan gel de silice como una base, se mencionan resinas fuertes de intercambio catiónico revestidas con polimero de silicona conteniendo grupos de ácido bencensulfónico tal como Capcell Pak® (serie SCX) (marca registrada elaborado por Shiseido Company Limited, Japón) cuya base se encuentra revestida con una delgada pelicula de polimero de silicona y a la cual se introduce luego en un extremo un grupo de ácido sulfónico. Entre estas resinas fuertes de intercambio catiónico conteniendo grupos de ácido bencensulfónico, se prefieren particularmente Diaion® (serie RCP y serie PK) y Capcell Pak® (serie SCX) . El ion de plata que se puede utilizar para pre-tratar la resina fuerte de intercambio catiónico conteniendo grupos de ácido sulfónico se puede proveer preferentemente de diversas sales de plata que pueden producir iones de plata en agua, tal como nitrato de plata, perclorato de plata o similares. La resina fuerte de intercambio catiónico conteniendo grupos de ácido sulfónico se puede pretratar con el ion de plata pasando una solución acuosa de la sal de plata a través de esto si la resina es de un tipo H, o si es de un tipo Na, cambiando la misma al tipo H, lavando con agua, regular a pH 3 a 4 y pasando una solución acuosa de la sal de plata. Este pre-tratamiento con iones de plata se puede llevar a cabo preferentemente cargando la sal de plata a 1 mol/L-R o superior. El método de purificación de la presente invención se puede llevar a cabo a través de los siguientes pasos. (i) La mezcla, es decir, la substancia cruda a separar, que contiene el "compuesto de elevado peso molecular que contiene lactona con un grupo alquilo como su cadena lateral" y el "compuesto de elevado peso molecular que contiene lactona con un grupo alquenilo como su cadena lateral" se puede disolver en un solvente apropiado, tal como acetona, etc., y cargar a la columna de cromatografía que
—_______ „ ?r^n^ contiene la resina fuerte de intercambio catiónico conteniendo grupos de ácido sulfónico pre-tratada con iones de plata. (ii) Y, la elución se puede llevar a cabo con un eluyente apropiado, tal como acetona, una mezcla de acetato de etilo y alcohol metilico, y asi suces ivamente . El método de separación que utiliza la resina fuerte de intercambio catiónico conteniendo grupos de ácido sulfónico pre-tratada con iones de plata se puede llevar a cabo a través de un sistema de lecho fijo o un sistema de lecho continuo. El sistema de lecho fijo incluye, desde un punto de vista del proceso operacional, un único sistema de lecho, un sistema de lecho múltiple, un sistema de lecho doble, un sistema de lecho mixto, un sistema de filtración de intercambio de iones, un sistema circulatorio y similares. El sistema de lecho fijo incluye, desde el punto de vista del proceso de regeneración, un sistema de regeneración de flujo descendente, un sistema de regeneración de flujo ascendente, un sistema de regeneración de flujo ascendente contracorriente, un sistema de regeneración contracorriente, un sistema de regeneración ex-columna y similares. Por otra parte, el sistema de lecho continuo incluye un sistema de lecho fluidizado (un sistema de contacto contracorriente, un sistema por lotes multietapa), un sistema de lecho móvil (un tipo ascendente (un tipo de columna única, un tipo de columna múltiple) , un tipo descendente (un tipo de columna única, un tipo de columna múltiple), un sistema de lecho-móvil simulado, un sistema de correa sin fin (un sistema de extracción 1 i quido- 1 i quido ) ) y similares, entre los cuales el sistema de lecho móvil simulado resulta eficiente y apropiado para la producción en serie . El compuesto de elevado peso molecular que contiene lactona al cual se puede aplicar el método de separación de la presente invención se refiere a aquellos que presentan al menos un anillo de lactona en sus moléculas y que presentan un peso molecular de aproximadamente 400 o más. Pueden ser monociclicos, biciclicos, triciclicos o similares. Más preferentemente, se encuentran formados por 12 o más átomos. Tales compuestos monociclicos incluyen eritromicinas, 1 eucomi c inas , metimicinas y similares. Tales compuestos triciclicos incluyen compuestos que presentan un anillo de lactona tal como un compuesto triciclico que se muestra en
^m^ _a-a_a?_d_u___M_u_a_i .-„,_--_- EP0184162; compuestos triciclicos que contienen heteroátomos que se muestran en EP042768O, EP0532088 o 093/04680. Y la más preferible es 1 , 14 -dihidroxi- 12- [2- (4-hidroxi-3-metoxiciclohexil) -1-metilvinil] - 5 23, 25-dimetoxi-13, 19, 21, 27-tetrametil-ll, 28-dioxa-4- azatriciclo [22.3.1. O4'9] octacos-18-eno-2, 3, 10, 16- tetraona. Y la posición mas preferible que se substituye por un grupo alquilo o alquenilo como la cadena lateral es la posición 17 del mismo, y que es
tacrólimus cuando la posición 17 se substituye con alilo y ascomicina cuando se substituye con etilo. Además, las rapamisinas y similares también se ejemplifican como apropiadas. Como grupo (s) alquilo como la cadena lateral
del compuesto de elevado peso molecular que contiene lactona, se mencionan grupos alquilo rectos o ramificados que presentan un número de carbono de 1 o 6 tal como metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo, isobutilo, sec-butilo, ter-butilo, pentilo,
isopentilo, hexilo y similares, entre los cuales se prefieren aquellos que presentan un número de carbono de 1 a 4 tal como metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo e isobutilo. Como grupo (s) alquenilo como la cadena
lateral del compuesto de elevado peso molecular que
-..-Jl-____i_t.__._M- .. . -_...
contiene lactona que presenta la estructura química básica común como el compuesto antes mencionado, se mencionan grupos alquenilo rectos o ramificados que presentan un número de carbono de 2 a 6 tal como vinilo, propenilo (alilo o 1 -propeni lo ) , butenilo, isobutenilo, pentenilo, hexenilo y similares, entre los cuales se prefieren vinilo y propenilo.
Preparación de una substancia a ser separada Un medio de cultivo (100 mL ) que contiene 1% de almidón de maiz, 1% de glicerina, 0.5% de glucosa, 1% de harina de orujo de algodón, 0.5% de levadura seca, 0.5% de licor de maiz macerado y 0.2% de carbonato calcico, regulado a pH 6.5 se volcó en ocho frascos Erlenmeyer de 500 mL y se esterilizó a
120C° durante 30 minutos. Una muestra de cultivo inclinado de S t rep t omyc e s t s uk uba en si s Número 9993
(Depósito Número FERM BP-927 en el Instituto
Nacional de Biociencia y Tecnología Humana), Agencia de Tecnología y Ciencia Industrial, Japón, bajo el Tratado de Budapest) se inoculó al medio en cada uno de los frascos y se cultivo a 30°C durante 72 horas sobre un agitador giratorio. Este cultivo se transfirió como cultivo de siembra a 160L del mismo medio que se encontraba contenido en un frasco fermentador de 200L pr e- e s t er i 1 i zado a 120°C durante 30 minutos y al cual se le habia agregado 0.05% de Adekanol® (agente desespumante, marca registrada, elaborado por Asahi Denka Co., Japón) y 0.05% de silicona (elaborado por Shinetsu Chemical Co . , Japón) . Esto se pre-cultivó a 30°C durante 48 horas con agitación a 200 rpm bajo aeración de 160L/min. Este pre-cultivo, 30L, se inoculó a 3,000 L de un medio de producción de pH 6.8 pre-es ter i 1 i zado a 120°C durante 30 minutos conteniendo 3% de almidón soluble, 0.8% de germen de trigo, 0.4% de levadura seca, 0.6% de licor de maiz macerado, 0.1% de carbonato calcico, 0.05% de Adekanol® y 0.05% de silicona en un tanque de 4 t, y se fermentó a 25°C durante 168 horas con agitación a 140 rpm bajo aeración de 1,500 L/min. El caldo de cultivo cultivado asi obtenido se filtró utilizando 50 kg de tierra de diatomáceas. Se extrajeron tortas miceliales con 1,000 L de acetona para obtener 1,000 L de extracto. El extracto de acetona de las tortas miceliales y el filtrado (2,700 L) se combinaron y se pasaron a través de una columna de una resina de adsorción no iónica. "Diaion HP-20" (marca registrada, elaborado por Mitsubishi Chemical Corporation, Japón) (200 L) .
u., Después de lavar con 600 L de 50% de acetona acuosa, la elución se llevó a cabo con 75% de acetona acuosa. El solvente en el eluato se retiró por evaporación bajo presión reducida para obtener 40 L 5 de un residuo acuoso. El residuo se extrajo con 40 L de acetato de etilo, dos veces. El extracto de acetato de etilo se concentro bajo presión reducida para obtener un residuo aceitoso. El residuo aceitoso se disolvió en una mezcla de n-hexano y
acetato de etilo (1:1, v/v, 3L) y se sometió a cromatografía de columna utilizando 70 L de gel de silice (elaborado por Merck & Co., Ltd. maya 70-230) empaquetado con el mismo solvente. La elución se llevo a cabo sucesivamente con
una mezcla de n-hexano y acetato de etilo (1:1, v/v, 420 L y 1:2, v/v, 420 L), 210 L de acetato de etilo y luego 210 L de acetona. Se recogieron fracciones en el volumen de elución de 350 L a 420 L (primer eluato), de 490 L a 840 L (segundo eluato) y de 980
L a 1,190 L (tercer eluato) . El segundo eluato se concentro bajo presión reducida, y se agregó acetona para reemplazar el solvente (50 mg/mL) . De este modo se obtuvo la substancia cruda a ser separada por cromatografía de columna. 25
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1 es un diagrama que muestra separación por cromatografía de columna utilizando Diaion® RCP160M pre-tratado con iones de plata; y 5 La Figura 2 es un diagrama que muestra separación por cromatografía de columna utilizando Capcell Pak® SCX pre-tratado con iones de plata.
MEJOR MODO DE LLEVAR A CABO LA INVENCIÓN 10 Los siguientes Ejemplos se proveen solamente con el propósito de ilustrar en mayor detalle la presente invención.
Ejemplo 1 15 Separación por cromatografía de columna utilizando Diaion® RCP160M (marca registrada, elaborado por Mitsubishi Chemical Corporation, Japón) . (1) Tratamiento de Diaion® RCP160M, una
resina de intercambio de iones, con una sal de plata . Una solución de nitrato de plata acuosa 1M (volumen 3 columnas) se paso a través de Diaion® RCP160M (tipo H+ ) , la cual se lavó a continuación con
agua (volumen 4 columnas) para retirar en exceso de
nitrato de plata. La resina de intercambio de iones se equilibró con metanol (volumen 4 columnas) y luego con una mezcla de acetato de etilo y metanol
(1:1) • 5 (2) Ensayo de separación utilizando una única columna La substancia cruda a ser separada por cromatografía de columna obtenida tal como se describe anteriormente se sometió a cromatografía de
columna utilizando Diaion® RCP160M tratada con la solución de nitrato de plata acuoso. La separación se llevo a cabo utilizando una columna de 20 mmf x 500 mH (425 µm) (150 mL ) y una mezcla de acetato de etilo y metanol (1:1) como un eluyente a una carga
de 10 g/L-R en términos de tacrólimus, una velocidad de circulación sv = 1 y una temperatura de 30°C. La configuración de separación obtenida se muestra en la Figura 1. Tacrólimus, ascomicina y 17 -propi 1- 1 , 14 - 20 dihidroxi-12 [2- (4-hidroxi-3-metoxiciclohexil) - 1 - metilvinil] -23, 25-dimetoxi-13, 19, 21, 27-tetrametil- ll,28-dioxa-4-azatriciclo-[22,3,l,04"9] octacos-18- eno-2 , 3 , 10 , 16- tetraona (denominado de ahora en adelante Compuesto A) se aislaron e identificaron.
_<_M_t_^-.frt|r ______ Ejemplo 2 Separación por columna de cromatografía utilizando Capcell Pak® SCX UG80 (marca registrada, elaborado por Shiseido Company Limited, Japón) . (1) Ensayo de separación utilizando una única columna La substancia cruda a ser separada por cromatografía de columna obtenida de la misma manera que en el Ejemplo 1 se sometió a cromatografía de columna utilizando Capcell Pak® SCX UG80 intercambiado con iones de plata. La separación y purificación se llevaron a cabo utilizando una columna de 20 mmf x 250 H (20µm) (78 mL) y acetona como un eluyente a una carga de 5 g/L-R en términos de tacrólimus, una circulación de flujo sv= 1.5 y 30°C. La configuración de separación obtenida se muestra en la Figura 2. (2) . Separación continua utilizando un dispositivo de lecho-móvil simulado de tamaño pequeño . La substancia cruda a ser separada por cromatografía de columna obtenida tal como se describe anteriormente se sometió a separación utilizando un dispositivo de lecho-móvil simulado de tamaño pequeño (fabricado por Órgano Corporation,
__. • -"---a* Japón, un separador cromatográ f i co sistema JO nuevo de tamaño pequeño, TREZONE®) provisto con Capcell Pak® SCX UG80 tratado con una solución acuosa de nitrato de plata. La separación y purificación se llevo a cabo bajo las siguientes condiciones; eluyente-acetona; concentración de carga -25 g/L; método de carga -24 g/ciclo x 4 ciclos; columna (20 µm) de 2.26 L (280 mL x 8); la suma de las cargas -42 g/L-R (una carga de lotes); cantidad de liquido en una fracción activa - 1.5 L/ciclo (con respecto a 0.65 volumen de columna), y temperatura de -20°C. La pureza de cada substancia en la fracción activa se determinó a través del análisis HPLC. Los resultados se muestran en la Tabla 1. Tabla 1
n.d: no se detecta APLICABILIDAD INDUSTRIAL Se obtuvo un efecto inesperado en la separación al aplicar la resina fuerte de intercambio catiónico conteniendo grupos de ácido sulfónico pretratada con iones de plata a la
.^^^j^^^^^ separación del compuesto de elevado peso molecular que contiene lactona y presenta un grupo alquilo como una cadena lateral de aquel que presenta un grupo alquenilo como una cadena lateral. El método de separación de la presente invención resulta verdaderamente útil debido a su repe t ibi 1 idad, aplicación a gran escala y/o su beneficio económico. Por lo tanto, la presente invención se puede aplicar en una industria química, particularmente una industria farmacéutica, en donde la producción en serie y la pureza de los compuestos objeto resultan criticas.