MXPA00012794A - Sobreexpresion de los genes de fitasa en los sistemas de levadura - Google Patents
Sobreexpresion de los genes de fitasa en los sistemas de levaduraInfo
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Abstract
La presente invención se refiere a un método para producir una proteína o polipéptido heterólogo que tiene actividad de la fitasa en un sistema de levadura. La invención también proporciona proteínas que tiene la actividad de la fitasa, las cuales tiene una termoestabilidad incrementada. Las cepas de levadura las cuales producen una fitasa heteróloga y también son provistos los vectores utilizados para producir la fita
Description
SOBREEXPRESION DE LOS GENES DE FITASA EN LOS SISTEMAS DE LEVADURA
Campo de la Invención
La presente invención se refiere a un método para la producción de la fitasa en la levadura, a las cepas de levadura que expresan la fitasa heteróloga, y a la fitasa heteróloga producida por la levadura.
Antecedentes de la Invención
Las fitasas, un grupo especifico de onoéster fosfatasas, son requeridas para iniciar la liberación del fostato ("P") del fitato (mio-inositol hexofosfato) , la forma de almacenamiento mayor del P en los alimentos o alimentaciones de cereales (Reddy, N.R. y colaboradores, "Phytates in Legumes and Cereals", Advances in Food Research, 28:1 (1982)). A causa de que los animales de un solo estómago semejantes a los cerdos y las aves de corral asi como los seres humanos tienen una actividad pequeña de la fitasa en sus tractos gastrointestinales, casi la totalidad del P del fitato ingerido es indigerible. Esto conduce a la necesidad de un suplemento de P orgánico, un R?f.125919
-ggwfcM-MMKj -, ^^* fe nutriente extenso y no renovable, en las dietas para estos animales. Más indeseablemente, el P del fitato no utilizado excretado a través del estiércol de estos animales llega a ser la contaminación con P del medio ambiente (Cromwell, G. L. y colaboradores, "P - A Key Essential Nutrient, Yet a Possible Major Pollutant - Its Central Role in Animal Nutrition", Biotechnology In the Feed Industry; Proceedings Alltech 7th Annual Symposium, p. 133 (1991)). Además, el fitato sufre la quelación con elementos de traza esenciales semejantes al zinc y produce deficiencias de nutrientes tales como el retardo mental y del crecimiento en los niños que ingieren principalmente alimentos de origen vegetal sin la remoción del fitato. Dos fitatos, phyA y phyB, del Aspergillus niger NRRL3135 han sido clonados y secuenciados (Ehrlich, K.C. y colaboradores, "Ehrlich, K.C. y colaboradores, "Identification and Cloning of a Second Phytatse Gene (Phys) from Aspergillus niger (ficuum)", Biochem. Biophys. Res. Commun., 195:53-57 (1993); Piddington, C.S. y colaboradores, "The Cloning and Sequencing of the Genes Encoding Phytase (phy) and pH 2.5-optimum Acid Phosphatase (aph) from Aspergillus niger var. Awamori", Gene, 133:56-62 (1993)). Recientemente, se han aislado nuevos genes de fitasa de Aspergillus terreus y Myceliophthota termophila (Mitchell y colaboradores, "The Phytase Subfamily of Histidine Acid Phosphatases: Isolation of Genes for Two Novel Phytases From the Fungi Aspergillus terreus and Myceliophthora thermophila", Microbiology 143:245-252. (1997)), Aspergillus fumigatus (Pasamontes y colaboradores, "Gene Cloning, Purification, and Characterization of a Heat-Stable Phytase from the Fungus Aspergillus fumigatus" Appl. Environ. Microbiol., 63:1696-1700 (1997)), Emericella nidulans y Talaromyces thermophilus (Pasamontes y colaboradores, "C_ ing of the Phytase from Emericella nidulans and the Thermophilic Fungus Talaromyces thermophilus, "Biochim. Biophys. Acta., 1353:217-223 (1997)), y el mai- (Maugenes y colaboradores, "Cloning and Characterization of a cDNA Encoding a Maize Seedling Phytase", Biochem. J. 322:511-517, 1997)). Varios tipos de enzimas de fitasa han sido aisladas y/o pui ficadas de Enterobacter sp.4 (Yoon y colaboradores, 'I olation and Identification of Phytase- Producing Bacter .um, Enterobacter sp. 4, and Enzymatic Properties of Phvtase Enzyme", Enzyme and Microbial Technology 18: -454 (1996)), Klebsiella terrigena (Greiner colaboradores, "Purification and Characterization of a Phytase from Klebsiella terrigena", Arch. Biochem. Bjp-hys. 341:201-206 (1997)), y Bacillus sp. DS11 (Kim y colacradores, "Purification and Properties of a Thermostable P ytase from Bacillus sp. DS11", Enzyme and
Microbial Technology 22:2-7 (1998)). Las propiedades de estas enzimas han sido estudiadas. Además, la estructura cristalina de phy A de Aspergillus ficuum ha sido reportada (Kostrewa y colaboradores, "Crystal Structure of Phytase from Aspergillus ficuum at 2.5 A Resolution", Nature Structure Biology 4:185-190 (1997)). Hartingsveldt y colaboradores introdujeron el gen phyA en A. niger y obtuvieron un incremento de diez veces de la actividad de la fitasa comparado con el tipo silvestre. ("Cloning, Characterization and Overexpression of the Phytase-Encoding Gene (phyA) of Aspergillus Niger", Gene 127:87-94 (1993)). La fitasa microbiana suplementaria de esta fuente en las dietas de los cerdos y las aves de corral se ha mostrado que va a ser efectiva para mejorar la utilización del P del fitato y el zinc (Simons y colaboradores, "Improvement of Phosphorus Availability By Microbial Phytase in Broilers and Pigs", Br. J. Nutr., 64:525 (1990); Lei, X.G. y colaboradores, "Supplementing Corn-Soybean Meal Diets ith Microbial Phytase Linearla Improves Phytate P Utilization by Weaning Pigs", J. Aniña. Sci., 71:3359 (1993); Leí, S.G. y colaboradores, "Supplementing Corn-Soybean Meal Diets ith Microbial Phytase Maximizes Phytate P Utilization by Weaning Pigs", J. Anim. Sci., 71:3368 (1993); Cromwell, G. L. colaboradores, "P - A Key Essential Nutrient, Yet s Possible Major Pollutant - Its Central Role in Animal Nutrition, "Biotechnology In the Feed Industry: Proceedings Alltech 7th Annual Symposium, p. 133 (1991)). Pero, los costos del suministro de fitasa comercial disponible limitada y la inestabilidad de la actividad de la enzima para el calentamiento de las microesferas de la alimentación evita su uso práctico en la industria de los animales (Jongbloed, A.W. y colaboradores, "Effect of Pelleting Mixed Feeds on Phytase Activity and Apparent Absorbability of Phosphorus and Calcium in Pigs", Animal
Feed Science and Tecnology, 28:233-242 (1990)). Además, la fitasa producida de A. niger es presumiblemente no la fuente más segura para la fabricación de alimentos humanos. La levadura puede ser utilizada para producir enzimas de manera efectiva mientras que crecen sobre un medio simple y económico. Con una secuencia de la señal apropiada, la enzima puede ser secretada en el medio para la colección conveniente. Algunos sistemas de expresión de la levadura tienen la ventaja agregada de que son bien aceptados en la industria de los alimentos y son productores seguros y efectivos de los productos alimenticios . La Pichia pastoris es una levadura metilotrófica, capaz de metabolizar el metanol como su única fuente de carbón. Este sistema es bien conocido por su capacidad para
- *•-*»---g^»- &,,^J^^^BÍ^^-^^^gifc^s8 ^^-^J«^te.i, .,.* expresar niveles elevados de las proteínas heterólogas. A causa de que es un eucariota, la Pichia tiene muchas de las ventajas de los sistemas de expresión eucariótica más elevada tales como el procesamiento de las proteínas, el pliegue o doblez, y la modificación postranscripcional. Por consiguiente, existe una necesidad de desarrollar un sistema simple y eficiente para producir la fitasa económicamente para la aplicación en la industria de la alimentación y los alimentos.
Breve Descripción de la Invención
La presente invención se refiere a un método de producción de la fitasa en la levadura por la introducción de un gen heterólogo el cual codifica una proteina o polipéptido con la actividad de la fitasa/fosfatasa acida en una cepa de levadura y que expresa este gen. La presente invención también se refiere a una proteina o polipéptido que tiene la actividad de la fitasa con una actividad óptima en un intervalo de temperatura de 57 - 65 °C a un pH de 2.5 a 3.5 o de 5.5. El pH óptimo a 2.5 a 3.5 es particularmente importante para la fitasa, a causa de que es el pH del estómago de los animales. La invención proporciona además una célula de levadura que lleva un gen heterólogo el cual codifica una
proteina o polipéptido con actividad de fitasa y la cual está enlazada funcionalmente con un promotor capaz de expresar la fitasa en la levadura. Todavía otro aspecto de la invención es un vector 5 que tiene un gen de un organismo diferente de la levadura el cual codifica una proteina o polipéptido con actividad de fitasa, un promotor el cual es capaz de iniciar la transcripción en la levadura enlazada funcionalmente al gen que codifica un péptido con la actividad de la fitasa, y
10 con un origen de replicación capaz de mantener el vector en la levadura o de ser capaz de integración en el genoma del huésped. La invención también proporciona un método para producir una proteina o polipéptido que tiene actividad de
15 fitasa. Un gen appA aislado, el cual codifica una proteina o polipéptido con actividad de fitasa, es expresado en una célula huésped. La invención también incluye un método para convertir el fitato a mositol y fosfato inorgánico. El gen
20 appA expresa una proteina del polipéptido con la actividad de fitasa en una célula huésped. La proteina o polipéptido se pone en contacto entonces con el fitato para catalizar la conversión del fitato al inositol y el fosfato inorgánico. 25
«&£"-. *-At »- a*-wJSl j -i ^ 0A¿ *?AS&&¿*SS A. -*¿. - « ,-A Breve Descripción de los Dibujos
La Figura 1 muestra un análisis de SDS-PAGE de la proteina soluble preparada a partir del E. coli transformado con el gen de fitasa inducido con IPTG. Las células se hicieron crecer 4 horas antes de la colección. Faja 1: Marcador: Fajas 2 y 3: Transformantes de pEPl (la proteina expresada fue de aproximadamente 55 kDa) ; Faja 4: Transformante con solamente el vector de expresión pET25b(+ ) . La Figura 2 muestra el análisis de manchado de Western de la proteina de fitasa expresada en E. coli. El anticuerpo también fue fabricado o cultivado contra la fitasa natural purificada de A. niger. Cada faja contuvo 50 µg de la proteina intracelular total. Las Fajas 1 y 2: Recombinantes después y antes de la inducción. Fajas 3 y 4: control (solamente el vector de expresión) después y antes de la inducción. La Figura 3 es una imagen de exploración del análisis de manchado de Northern del ARNm de PhyA en E.coli. Se utilizó una sonda de PhyA de 1.4 kb. Cada faja contuvo 20 µg del ARN total. Fajas 1 y 2: el ARN aislado de las células de control (solamente el vector de expresión) antes y después de la inducción. Fajas 3 y 4: ARN aislado
'^^^^^^^^^^^^^^^^^^K^^?^k^^^^^^^^ t^^^f^^^?^^ de los recombinantes que contienen PhyA antes y después de la inducción. La Figura 4 es un curso del tiempo de la expresión inducida de la fitasa (pEPl) en E. coli BL21 (DE3) . Las células fueron inducidas cuando la OD6oo alcanzó
0.5. La proteina soluble, preparada en cada punto del tiempo, se cuantificó por análisis de SDS-PAGE. La Figura 5 muestra un análisis de SDS-PAGE de la proteina de fita.., intracelular expresada por el S. lividans transformado con fitasa después del crecimiento durante 72 horas. Las células fueron se centrifugaron durante 15 minutos a 8,000 x gravedades, y el sobrenadante se sometió a electrofóresis del gel. Faja 1: Marcador; Faja 2: Control con el único vector de expresión; Faja 3: Colonias positivas expresadas en la figura y el tamaño fue de aproximadamente 57 kDa. La figura 6 muestra el análisis de manchado de Western de la fitasa expresada por S- lividans, utilizando un anticuerpo de "Jasa fabricado o cultivado contra la fitasa natural puj cicada de A. niger. Cada faja se cargó con 20 µg de la ccteina del medio (sobrenadante). Faja 1: Sobrenadanete dei cultivo de las células de control transformadas con ~1 vector; Faja 2: el Sobrenadante del cultivo inoculado la colonia positiva.
m ¡—^— mm m m¿Mm^áÉI^ ^StilM? ^¡t^ tí^^ ^^^^^bi ¡k La Figura 7 muestra un análisis de SDS-PAGE de la fitasa extracelular expresada por S. cerevisiae. Cada faja se cargó con 50 µg de la proteina del medio (sobrenadante) . Fajas 1 a 3: el Sobrenadante del cultivo inoculado con la colonia positiva colectada a las 5, 10, y 25 horas después de la inducción, respectivamente; Fajas 4 a 6: el Sobrenadante del cultivo de las células de control transformadas con el vector colectadas a 5, 10, y 25 horas después de la inducción, respectivamente; Faja 7: Marcador (kDa) . La fitasa expresada fue de aproximadamente 110 kDa (confirmado por el manchado de Western) . La Figura 8 es un curso del tiempo de la actividad de la fitasa extracelular expresada por S. cerevisiae transformado con la construcción de pYPPl después de la inducción por galactosa. La actividad fue analizada en el sobrenadante del medio colectado. La Figura 9 muestra el análisis del manchado de Western de la fitasa extracelular expresada por S. cerevisiae antes y después de la desglicosilación (Endo H), utilizando un anticuerpo de fitasa fabricado o cultivado contra la fitasa natural purificada en A. niger. Faja 1: estándares de SDS-PAGE (kDa) preteñidos de Bio-Rad; Fajas 2 y 3: 10 y 20 µg de proteina de fitasa desglicosilada, respectivamente; Faja 4; fitasa glicosilada (20 µg de proteina) .
La Figura 10 es una imagen de exploración del análisis de manchado de Northern para el ARN total aislado de las células de S. cerevisiae transformadas. Faja 1: Control (con solamente el vector de expresión pYES2); Fajas 5 2 y 3; Transformantes de pYPPl. La Figura 11 es un transcurso del tiempo de la actividad de fitasa de PhyA extracelular producida por los transformantes de Pichia pastoris de Muts (KM71) y Mut+ (X33) después de la inducción. 10 La Figura 12 muestra un análisis de SDS-PAGE de la fitasa sobreexpresada en Pichia, con la construcción de pPICZaA-PhyA en KM71 (MUTS) . Faja 1: escalera de proteina. Faja 2: 40 µl del sobrenadante de AK1 (una colonia mostró 21,700 U/ml de fitasa extracelular), colectado 108 horas 15 después de la inducción. Faja 3: 40 µl del sobrenadante de una cepa de control que sobreexpresa la albúmina del suero humano (HAS, 6.7 kDa) a un nivel de 1 g/1. Faja 4: 40 µl del sobrenadante del control KM71. La Figura 13 muestra los efectos de la 20 desglicosilación por Endo H sobre la termoestabilidad de la fitasa expresada en Pichia. La actividad de la fitasa se midió después de que las enzimas se calentaron durante 15 minutos bajo 37 u 80 °C en una solución amortiguadora de citrato 0.2 M, pH 5.5.
*fcB* <?~~> *=*» ^ ^^f^^^^^^^^^^^^^^^^^^ ?^^^^ La Figura 14 es una imagen de exploración del análisis de Northern del ARNm de phyA expresado por las cepas (KM71 y X33) de Pichia pastoris transformadas. Una sonda phyA de 1.3 kb se utilizó para el manchado. Fajas 1 y 2: el transformante de KM71 antes y después de la inducción; Fajas 3 y 4: el transformante de X33 después y antes de la inducción. La Figura 15 muestra el pH óptimo de la fitasa extracelular expresada por Pichia (X33) . Los amortiguadores de 0.2 M de glicina-HCl para pH 1.5, 2.5, 3.5; 0.2 M de citrato de sodio para pH 4.5, 5.5, 6.5, y 0.2 M de Tris-HCl para pH 7.5 y 8.5 fueron utilizados. La Figura 16 muestra la temperatura óptima de la fitasa extracelular expresada por Pichia (X33) . Los ensayos se llevaron a cabo en solución amortiguadora de citrato 0.2 M, pH 5.5. La Figura 17 muestra la liberación del fósforo liberado de la soya por la fitasa expresada en Pichia (X33) . Cinco gramos de soya fueron suspendidos en 25 mi de citrato 0.2 M, pH 5.5, con diferentes cantidades de la enzima. La incubación se llevó a cabo durante 4 horas bajo 37 °C y el fósforo libre liberado en el sobrenadante fue determinado. La Figura 18 muestra un transcurso del tiempo de la expresión de la actividad de fitasa extracelular de cinco transformantes de Pichia pastoris que contienen el gen appA de E. coli. La Figura 19 muestra gráficamente la relación entre el pH medio y la expresión de la actividad de la fitasa por Pichia pastoris. La Figura 20 es un análisis de SDS-PAGE de la fitasa de E. coli sobreexpresada en Pichia pastoris. Faja 1: escalera de proteina; Fajas 2 a 4: Sobrenadantes colectados de los cultivos de las colonias positivas 23, 22, y 11, respectivamente, a 118 horas después de la inducción. La Figura 21 muestra gráficamente el pH óptimo de la fitasa de E. coli sobreexpresada por Pichia pastoris. La Figura 22 muestra gráficamente la temperatura óptima de la fitasa de E. Coli sobreexpresada por Pichia pastoris . La Figura 23 muestra la cantidad del fósforo libre liberada de la harina de soya por la fitasa de E. coli sobreexpresada de Pichia pastoris después de cuatro horas de tratamiento.
Descripción Detallada de la Invención
La presente invención proporciona un método de producción de la fitasa en la levadura. De acuerdo con este
método, un gen heterólogo el cual codifica una proteina o polipéptido con la actividad de la fitasa es expresado en una cepa de levadura. Las enzimas que catalizan la conversión del fitato a inositol y los fósforos inorgánicos, son conocidas ampliamente como fitasas. Los microorganismos productores de la fitasa comprenden bacterias tales como Bacillus subtilis (Paver y colaboradores, J. Bacteriol. 151, 1102 (1982), la cual es incorporada aqui para referencia) y Pseudomonas (Cosgrave, Austral J. Biol. Sci. 23:1207 (1970), la cual es incorporada aqui para referencia); las levaduras, tales como Saccharomyces cerevisiae (Nayini y colaboradores, Lebensmittel Wissenschaft und Techonologie 17:24 (1984), la cual es incorporada aqui para referencia); y los hongos, tales como Aspergillus terreus (Yamada y colaboradores, Agrie. Biol. Chem. 32:1275 (1986), la cual es incorporada aqui para referencia), y Aspergillus ficuum (van Gorcom y colaboradores, Solicitud de Patente Europea 89/202,436, la cual es incorporada aqui para referencia). Las fitasas también están presentes endógenamente en muchas especies de plantas. Loewus, En: Plant Biology vol. 9: "Inositol Metabolism in Plants" (eds. D. J. Morre, W. F. Boss, F. A. Loewus (1990); y Gellatly, y colaboradores, Plant Physiology (suplemento) 93:562 (1990), las cuales son incorporadas aqui para referencia, mencionan el aislamiento y caracterización de un clon de ADNc de fitasa obtenido de los tubérculos de la papa. Gibson, y colaboradores, J. Cell Biochem., 12C:L407 (1988) y Christen, y colaboradores, J. Cell Biochem., 12C:L402 (1988), las cuales son incorporadas aqui para referencia, mencionan la síntesis de la fitasa endógena durante la germinación de lae semillas de soya. Preferentemente, la proteina o polipéptido con actividad de fita >s secretada por la célula en el medio de crecimiento. Esto permite niveles de expresión más elevados y el aislamiento más facilitado del producto. La proteina o polipéptido con actividad de fitasa es unida a una secuencia de la señal capaz de la dirección de la proteina fuera de la célula. Preferentemente, la secuencia de la señal es segmentada de la proteina. En una modalidad preferida, el gen heterólogo, el cual codifica una proteina o polipéptido con actividad de fitasa, es empalmado en el marco con un elemento mejorador transcripcional . Los genf- heterólogos preferidos que codifican las proteínas cor. _a actividad de fitasa son aislados de una célula bactecana. Un gen más preferido es el gen phyA de Aspergillus mgc Un gen que codifica la fitasa, phyA, del Aspergillus n ' ger NRRL3135 ha sido clonado y secuenciado (Piddjngton, C.S. y colaboradores, "The Cloning
and Sequencing of the Genes Encoding Phytase (phy) and pH 2.5-optimum Acid Phosphatase (aph) from Aspergillus niger var. Awamori", Gene, 133:56-62 (1993), las cuales son incorporadas aqui para referencia) . Hartingsveldt y colaboradores introdujeron el gen phyA en A. niger y obtuvieron un incremento de diez veces la actividad de la fitasa comparado con el tipo silvestre. (Hartingsveldt y colaboradores, "Cloning, Characterization and Ovserexpression of the Phytase-Encoding Gene (phyA) of Aspergillus Niger", Gene 127:87-94 (1993), la cual es incorporada aqui para referencia) . Otro gen heterólogo preferido es el gen appA de E. coli. El gen, definido originalmente como el gen de fosfohidrolasa del fosfoanhidrido periplásmico de E. coli (appA) , contiene 1,298 nucleótidos (número de acceso de GeneBank: M58708). El gen se encontró primero que codifica una proteina de fosfatasa acida de pH óptimo de 2.5 (EcAP) en E. coli. La fosfatasa acida es un monómero con una masa molecular de 44,644 daltons. La EcAP madura contiene 410 aminoácidos (Dassa, J. y colaboradores, "The Complete Nucleotide Sequence of the Escherichia Coli Gene AppA Reveáis Significant Homology Between Ph 2.5 Acid Phosphatase and Glucose-1-Phosphatase", J. Bacteriology, 172:5497-5500 (1990), la cual es incorporada aqui para referencia) . Ostatin, y colaboradores, sobreexpresaron la
appA en E. coli BL21 utilizando un vector de pT7 e incrementó su actividad de fostasa acida en aproximadamente 400 veces (440 mU/mg proteina) (Ostanin, K. y colaboradores, "Overexpression, Site-Directed Mutagenesis, and Mechanism of Escherichia Coli Acid Phosphatase", J.-Biol. Chem., 267:22830-36 (1992), la cual es incorporada aqui para referencia) . El producto del gen appA no se sabia previamente que tuviera actividad de fitasa. El gen appA o phyA puede ser expresado en cualquier sistema de expresión procariótico o eucariótico. Una variedad de sistemas de vector huésped pueden ser utilizados para expresar las secuencias de codificación de la proteina. Los vectores preferidos incluyen un vector viral, plásmido, cósmido o un oligonucléotido. Principalmente, el sistema del vector debe ser compatible con la célula huésped utilizada. Los sistemas del vector del huésped incluyen pero no están limitados a las siguientes bacterias transformadas con el ADN del bacteriófago, el ADN del plásmido, o el ADN del cósmido; los microorganismos tales como las levaduras que contienen vectores de levadura; los sistemas de células de mamífero infectados con el virus (po ejemplo, el virus de vaccinia, el adenovirus, etc.); los sistemas de células de insectos infectadas con el virus (por ejemplo, el baculovirus) ; y las células vegetales infectadas por bacterias. Los
g^^^^^^^^^^^g^g^^M^^^^^^^^^^m^jjj^^^^^^^^^^^á elementos de expresión de estos vectores varían en sus fuerzas y especificidades. Dependiendo del sistema de vector huésped utilizado, cualquiera de un número de elementos de transcripción y traducción adecuados, puede 5 ser utilizado. Los huéspedes preferidos para expresar appA y phyA incluyen las células fungosas, incluyendo las especies de los hongos de levadura o filamentosos, pueden ser utilizados como las células huésped de acuerdo con la
10 presente invención. Las células huésped de levadura preferidas incluyen diferentes cepas de Saccharomyces cerevisiae. Otras levaduras semejantes a LLKlluyveromyces, Torulaspora, y Schizosaccharomyces también pueden ser utilizadas. En una modalidad preferida, la cepa de levadura
15 utilizada para sobreexpresar la proteina es Saccharomyces cerevisiae. Las células huésped de hongos filamentosas preferidas incluyen Aspergillus y Neurospora. Una cepa más preferida de Aspergillus es Aspergillus niger. En otra modalidad preferida de la presente
20 invención, la cepa de levadura es una cepa de levadura metilotrófica. Las levaduras metilotróficas son aquellos géneros de levadura capaces de utilizar el metanol como una fuente de carbón para la producción de recursos de energía necesarios para mantener la función celular y contener un
25 gen para la expresión de la alcohol oxidasa. Las levaduras
á^^u ^^ ?j^^s£^áegS*?^g^^^^^í3U metilotróficas típicas incluyen los miembros de los géneros Pichia, Hansenula, Torulopsis, Candida, y Karwinskia. Estos géneros de levadura pueden utilizar el metanol como una fuente de carbón única. En una modalidad más preferida, la 5 cepa de levadura metilotrófica es Pichia pastoris. La presente invención también proporciona una proteina o polipéptido con actividad de fitasa. PhyA es sobreexpresada en Pichia y la proteina resultante producida tiene una actividad extracelular mucho más elevada (~65
10 mU/ml) . El rendimiento de la actividad de la fitasa fue aproximadamente 30 veces más grande que aquella en Saccharomyces cerevisiae transformada con phyA, 21 veces más grande que aquella en el tipo silvestre de Aspergillus niger, y 65,000 veces mayor que en la Pichia no
15 transformada. El pH óptimo de la fitasa expresada fue de 2.5 y 5.5, y la temperatura óptima fue de 60 °C. De manera similar, appA es expresada en Pichia y Saccharomyces cerevisiae con la proteina resultante que tiene una actividad extracelular mucho más elevada y un pH óptimo muy
20 preferido de 2.5 a 3.5. Una modalidad preferida de la invención es una proteina o polipéptido que tiene actividad de fitasa con una actividad óptima en un intervalo de temperatura de 57 a 65 °C. Una modalidad más preferida es una proteina c
25 polipéptido que tiene actividad de fitasa, en donde su
intervalo de temperatura para la actividad óptima es desde 58 hasta 62 °C. Todavía otra modalidad preferida es una proteina o polipéptido que tiene actividad de fitasa en donde la proteina retiene al menos 40% de su actividad después del calentamiento de la proteina durante 15 minutos a 80 °C. Es más preferida una proteina o polipéptido que tiene actividad de fitasa en donde la proteina retiene al menos 60% de su actividad después del calentamiento de la proteina durante 15 minutos a 60 °C. La proteina purificada puede ser obtenida por varios métodos. La proteina o polipéptido de la presente invención es producida preferentemente en la forma purificada (preferentemente de al menos aproximadamente 80%, más preferentemente del 90%, de pureza), por técnicas convencionales. Típicamente, la proteina o polipéptido de la presente invención es secretada en el medio de crecimiento de las células huésped recombinantes. Alternativamente, la proteina o polipéptido de la presente invención es producido pero no secretado en el medio de crecimiento. En tales casos, para aislar la proteina, la célula huésped que lleva un plásmido recombinante es propagado, lisado por la acción del sonido, el calor, o un tratamiento químico, y el homogenato es centrifugado para remover desechos celulares. El sobrenadante es sometido
entonces a precipitación con sulfato de amonio secuencial. La fracción que contiene el polipéptido o proteina de la presente invención es sometido a filtración en un gél en una columna de dextrano o poliacrilamida dimensionada apropiadamente para separar las proteínas. Si es necesario, la fracción de proteina puede ser purificada adicionalmente por CLAR. La presente invención también proporciona una cepa de levadura ,?e tiene un gen heterólogo el cual codifica una proteina o polipéptido con actividad de fitasa. El gen heterólogo debe ser enlazado funcionalmente a un promotor capa?, de expresar la fitasa en la levadura. Todavía otro aspecto de la invención es un vector para expresar la fitasa en la levadura. El vector lleva un gen de un órgano diferente de la levadura el cual codifica una proteina o polipéptido con actividad de fitasa. El gen de fitasa puede ser clonado en cualquier vector el cual se replique autónomamente o se integre en el genoma de la levadura. El número de copias de los plásmidos de replicación autónocí, por ejemplo, los plásmidos YEp puede ser elevado, pee su estabilidad mitótica puede ser insuficiente (Eitter y colaboradores, "Expression an Secretion Vector Or Yeast", Meth. Enzymol. 153:516-44 (1987), la cual c incorporada aqui para referencia). Las mismas pueden contener la secuencia del plásmido 2 mu
1^^^^^&^^^^^^^^^^^^fe^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^ responsable de la replicación autónoma, y una secuencia de E. coli responsable de la replicación en E. coli. Los vectores contienen preferentemente un marcador genético para la selección de los transformantes de la levadura, y un gen de resistencia a los antibióticos para la selección en E. coli. Los vectores episómicos que contienen las secuencias de ARS y CEN se presentan como una sola copia por célula, y las mismas son más estables que los vectores de YEp. Los vectores de integración son utilizados cuando un fragmento de ADN es integrado como una sola copia o como copias múltiples en el genoma de levadura. En este caso, el ADN recombinante es estable y ninguna selección es necesaria (Struhl y colaboradores, "High-Frequency Transformation of Yeast: Autonomous Replication of Hybrid DNA Molecules", Proc. Nat'l Acad. Sci. EUA 76:1035-39 (1979); Powels y colaboradores, Cloning Vectors, I-IV, y siguientes, Elsevier, (1985); Sakai y colaboradores, "Enhanced Secretion of Human Nerve Growth Factor from Saccharomyces Cerevisiae Using an Advanced d-Integration System", Biotechnology 9:1382-85 (1991), las cuales son incorporadas aqui para referencia) . Algunos vectores tienen un origen de replicación, el cual funciona en la célula huésped seleccionada. Los orígenes adecuados de la replicación incluyen 2µ, ARS1, y 25µM. Los vectores tienen sitios de endonucleasa de restricción para la inserción del gen de la fusión y las secuencias promotoras, y los marcadores de la selección. Los vectores pueden ser modificados por la remoción o adición de los sitios de restricción, o la remoción de otros nucleótidos no deseados. El gen de fitasa puede ser colocado bajo el control de cualquier promotor (Stetler y colaboradores, "Secretion of Active, Full- and Half-Length Human Secretory Leukocyte Protease Inhibitor by Saccharomyces cerevisiae", Biotechnology 7:55-60, (1990), la cual es incorporada aqui para referencia) . Se puede elegir un promotor de levadura constitutivo o regulado. La secuencias del promotor adecuadas para los vectores de levadura incluyen, entre otras, los promotores para la metalotionein, 3-fosfoglicerato cinasa (Hitzeman y colaboradores, J. Biol. Chem. 255:2073 (1980), la cual es incorporada aqui para referencia) u otras enzimas glicoliticas (Hess y colaboradores, J. Adv. Enzyme Reg. 7:149 (1968); y Holland y colaboradores, Biochem. 17:4900, (1978), las cuales son incorporadas aqui para referencia) , tales como la enolasa, la gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa, la hexocinasa, la piruvato descarboxilasa, la fosfofructocinasa, la glucosa-6-fosfato isomerasa, la 3-fosfoglicerato mutasa, la piruvato cinasa, la triosefosfato isomerasa, la fosfoglucosa isomerasa, y la glucocinasa. Otros vectores y
_ái¿i^C^^^tó? ^ ^^^^^^^^ ~&& &^ ^^* 2^ gj *s* *^3?^^^^^^ promotores adecuados para su uso en la expresión de la levadura son descritos adicionalmente en EP A-73,657 de Hitzeman, la cual es incorporada aqui para referencia. Otra alternativa es el promotor de ADH2 represible por la glucosa descrito por Rusell y colaboradores, J. Biol. Chem. 258:2674 (1982) y Beier y colaboradores, Nature 300:274 (1982), las cuales son incorporadas aqui para referencia). Se puede elegir un promotor de levadura constitutivo o regulado. Los promotores fuertes, por ejemplo el gen de fosfoglicerato cinasa (PGK), otros genes que codifican las enzimas glicoliticas, y el gen del factor alfa, son constitutivos. Cuando un promotor constitutivo es utilizado, el producto es sintetizado durante el crecimiento de las células. El promotor de ADH2 es regulado con el etanol y la glucosa, los promotores GAL-1-10 y GAL7 con galactosa y glucosa, el promotor PH05 con fosfato, y el promotor de metalotionina con cobre. Los promotores de choques térmicos, a los cuales pertenece el promotor de HSP150, son regulados por la temperatura. También se pueden utilizar los promotores híbridos. Un promotor regulado es utilizado cuando la expresión continua del producto deseado es perjudicial para las células huésped. En lugar de los promotores de levadura, un promotor procariótico fuerte tal como el promotor T7, puede ser utilizado, pero en este caso la cepa de levadura tiene que ser transformada con un gen
^*H ¿x&&^ . .^1^ ^ . .» ^^^^^jji^jíJS^ que codifica la polimerasa respectiva. Para la terminación de la transcripción, el terminador de HSP150, o cualquier otro terminador funcional es utilizado. Aqui, los promotores y terminadores son llamados los elementos de control. La presente invención no está restringida a ningún vector, promotor, o terminador especifico. El vector también puede llevar un marcador seleccionable. Los marcadores seleccionables son frecuentemente los genes resistentes a los antibióticos o los genes capaces de complementar las cepas de la levadura que tienen deficiencias metabólicas bien caracterizadas, tales como los mutantes deficientes en triptófano o histidina. Los marcadores seleccionables preferidos incluyen URA3, LEU2, HIS3, TRP1, HIS4, ARG4, o los genes de resistencia a los antibióticos. El vector también puede tener un origen de replicación capaz de la replicación en una célula bacteriana. La manipulación de los vectores es más eficiente en las cepas bacterianas. El origen bacteriano preferido de las replicaciones es de ColEl, Ori, u oriT. Una secuencia delantera o directora ya sea de los gentes de levadura o de fitasa o de otras fuentes, se puede utilizar para soportar la secreción de la enzima de fitasa expresada en el medio. La presente invención no está
restringida a ningún tipo especifico de secuencia directora o péptido de la señal. Las secuencias directoras adecuadas incluyen la secuencia directora del factor alfa de la levadura, las cuales pueden ser empleadas para dirigir la secreción de la fitasa. La secuencia directora del factor alfa es insertada frecuentemente entre la secuencia promotora y la secuencia de genes estructurales (Kurjan y colaboradores, Cell 30:933, (1982); Bitter y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci, EUA 81:5330, (1984); Patente U.S. No. 4,546,082; y la solicitud de patente publicada europea No. 324,274, las cuales son incorporadas aqui para referencia) . Otra secuencia directora adecuada es la MF alfa 1 (factor alfa) de S. cerevisiae que es sintetizada como una forma prepro de 165 aminoácidos que comprende el prepéptido o la señal de 19 aminoácidos seguido por un "director" o propéptido de 64 aminoácidos, que abarca tres sitios de glicosilación enlazados en N seguido por (LysArg (Asp/Glu,Ala) 2-3 factor alfa) 4 (Kurjan, y colaboradores, Cell 30:933-43 (1982), la cual es incorporada aqui para referencia) . La parte directora de la señal de preproMF alfa 1 ha sido utilizada ampliamente para obtener la síntesis y secreción de las proteínas heterólogas en S. cerevisiae. El uso de los péptidos delanteros/señal homólogos a la levadura, ya es conocido de la Patente U.S. No. 4,546,082, las Solicitudes de Patente Europeas Nos. 116,201; 123,294; 123,544; 163,529; y 123,289 y la Solicitud de Patente DK No. 3614/83, las cuales son incorporadas aqui para referencia. En la Solicitud de Patente Europea No. 123,289, la cual es 5 incorporada aqui para referencia, la utilización del precursor de S. cerevisiae es descrita en WO 84/01153, la cual es incorporada aqui para referencia, indica la utilización del péptido de la señal de invertasa de Saccharomyces . iae, y la Solicitud de Patente Alemana
10 DK 3614/83, la cual es incorporada aqui para referencia, indica la utilización del péptido de la señal de PH05 de Saccharomyces cerevisiae para la secreción de las proteínas extrañas . El director de la señal del factor alfa de
15 Saccharomyces cerevisiae (MF alfa 1 o MF alfa 2) también puede ser utilizaco en el proceso de secreción de las proteínas heteróioyas expresadas en la levadura (Patente U.S. No. 4,546,082, las Solicitudes de Patente Europea Nos. 16,201; 123,294; 123,544; y 163,529, las cuales son
20 incorporadas aqui era referencia) . Se demostró la fusión de una secuencia ije ADN que codifica la señal de MF alfa 1 de S. cerevisiae/secuencia delantera en el extremo 5' del gen para la se^cción de la proteina deseada y el procesamiento de ]_-> {. roteina deseada. El uso del péptido de
25 la señal de amildsa de la saliva del ratón (o un mutante
•^C.
del mismo) para proporcionar la secreción de las proteínas heterólogas expresadas en la levadura, ha sido descrito en las Solicitudes de Patente PCT Publicadas Nos. WO 89/02463 y WO 90/10075, las cuales son incorporadas para referencia. 5 La Patente U.S. No. 5,726,038 describe el uso del péptido de la señal de la proteasa 3 aspártica de levadura, la cual es capaz de proporcionar la secreción mejorada de las proteínas expresadas en la levadura. Otras secuencias directoras adecuadas para facilitar la secreción de los
10 polipéptidos recombinantes desde los huéspedes de levadura ya son conocidos por aquellas personas con experiencia ordinaria en la técnica. Una secuencia delantera puede ser modificada cerca de su extremo 3' para contener uno o más sitios de restricción. Esto facilitará la fusión de la
15 secuencia delantera al gen estructural. Los protocolos de transformación de la levadura ya son conocidos por aquellas personas expertas en la técnica. Uno de tales procotolos es descrito por Hinnen y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 75:1929 (1978),
20 la cual es incorporada aqui para referencia. El protocolo de Hinnen y colaboradores se selecciona para los transformantes de Trp en un medio selectivo, en donde el medio selectivo consiste de 0.67% de base de nitrógeno de la levadura, 0.5 % de casaminoácidos, 2% de glucosa, 10
25 µg/ml de adenina y 20 µg/ml de uracilo.
^^^—^^u^^^^^^^^^^^^^^g^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^ ^^^gg^^^g^^^^^^^^^^S^^g^^Ek^^'^^^^^^^^^^ ^^^ El gen puede ser mantenido sobre un vector de expresión estable, un cromosoma artificial, o por integración en el cromosoma de la célula huésped de levadura. La integración en el cromosoma puede ser efectuada por clonación del gen de fitasa en un vector el cual se recombinará en un cromosoma de levadura. Los vectores adecuados pueden incluir secuencias de nucleótidos las cuales son homologas con respecto a las secuencias de nucleótidos en el cromosoma de levadura. Alternativamente, el gen de fitasa puede estar localizado entre los sitios de recombinación, tales como los elementos transportables, los cuales pueden movilizar el gen hacia el cromosoma. La presente invención también proporciona un método para la producción de la fitasa proporcionando un gen de appA aislado, el cual codifica una proteina o un polipéptido con la actividad de la fitasa, y expresar el gen en la célula huésped. Preferentemente, el gen de appA es aislado de Escherichia coli. Las células huésped preferidas incluyen la levadura o los hongos filamentosos. El hongo filamentoso preferido es el Aspergillus niger y las levaduras preferidas son Saccharomyces, Klayveromyces, Torulaspora, y Schizosaccharomyces, en particular, la cepa de levadura, la Saccromyces cerevesia. Un método para convertir el fitato a inositol y el fósforo inorgánico también es provisto. Un gen appA es
-~ -""*--'--aislado de un organismo, utilizando técnicas bien conocidas en el arte. Una proteina o polipéptido con actividad de fitasa es expresado entonces desde el gen en una célula huésped. La proteina o polipéptido resultante es mezclado o puesto en contacto con el fitato. Esta técnica es especialmente útil para el tratamiento del fitato en los alimentos o en la alimentación del animal. El gen de appA preferido es aislado de Escherichia coli. Aunque la enzima de fitasa producida en un sistema de levadura liberó el fitato-P del maiz y la soya tan eficientemente como la fitasa comercial comúnmente, parece que va a ser más termoestable. Este sistema de sobreexpresión de la fitasa en la levadura puede ser utilizado para proporcionar una fitasa termoestable para su uso en las industrias de la alimentación y los alimentos.
EJEMPLOS
Ejemplo 1 - Materiales y Métodos para la Sobreexpresión de phyA en E. coli, S. Lividans, y un Sistema de Saccharomyces .
Gen de fitasa, cepas huésped, y plásmidos de expresión. El gen de fitasa, phyA, se proporcionó
_.,-. ^¿¿¿a^su ea** -afeaste ._._*JSL itü amablemente por el Dr. E.J. Mullaney de la USDA. El gen (Número de acceso del GenBank M94550) estuvo contenido en el plásmido pMD4.21 en la cepa de E. coli HB101. Un fragmento de 2.7 kb del ADN de A. niger contuvo la región de codificación de la fitasa desglicosilada y las secuencias de flanqueo 5' y 3' . Un plásmido que contiene la secuencia del péptido de la señal, Spxy, del gen de xilanasa activo de Aureobasidum pullulans (Número de acceso del GenBnak U10298) fue provisto amablemente por el Dr. X. L. Li de la Universidad de Georgia. La cepa DH5a de E. coli se utilizó como un huésped inicial para todos los plásmidos recombinantes. Para expresar phyA en E. coli, el vector de expresión, pET25b(+) (Novagen, Madison, WI) y el huésped de expresión, BL21 (DE3)pLysS, fueron utilizados. Para expresar phyA en S. lividans TK 24, el plásmido pSESl (Jung, E.D. y colaboradores, "DNA Sequences and Expression in Streptomyces Lividansoglucanase Gene and an Endoglucanase Gene from Termomonospora Fusca", Appl . Environ. Microbiol., 59:3032-43 (1993), la cual se incorpora aqui para referencia), se utilizó para construir el plásmido de lanzadera (del Dr. D.B. Wilson de Cornell University y él lo obtuvo del Dr. D. A. Hopwood, John Innes Institute, Norwich, Inglaterra) . Para expresar phyA en la levadura, el vector de expresión pYES2 y el la cepa de S.
cerevisiae huésped, INVScl (Invitrogen, San Diego, CA) fueron utilizados. Construcciones y transformaciones del cásete del plásmido. Todos los plásmidos construidos y los huéspedes correspondientes son listados en la Tabla 1. Un fragmento de PCR de 1.4 kb del gen phyA se amplificó a partir de pMD4.21 utilizando dos cebadores: corriente arriba 5' - CGG ATT TCG TCA CCT CCG GAC T - 3' (SEC ID No. 1) y corriente abajo 5' - CCC AAG CTT CTA AGC AAA ACÁ CTC - 3' (SEC ID No. 2) . El fragmento resultante contuvo la secuencia que codifica la fitasa desglicosilada de A. niger, phyA, y los sitios de restricción EcoRI y HindIII corriente arriba y corriente abajo, respectivamente. Después de la purificación con el juego o conjunto Geneclean II (Bio 101, Inc. La Jolla, CA) , el fragmento fue insertado en pET25(+), y el pEPl de la construcción resultante (6893 pb) se transformó en BL21 (DE3) pLysS después de la confirmación inicial en las células DH5a. La expresión fue bajo el control del promotor T7 seguido por la secuencia delantera (peí B) que codifica 21 aminoácidos, y phyA. El huésped transformado con el vector pET25(+) solo fue utilizado como el control.
Tabla 1: Vectores de expresión, construcciones, y sus cepas huésped utilizadas en el estudio Plásmido Huésped Descripción1 Referencia2
pET25b(+) DH5a y BL21 de E. coli Vector de expresión Novagen (DE3)pLysS pEPl BL21 de E. Coli gen pET25ba(+) + phy A Este (DE3)pLysS Documento PSES2 DH5a de E. coli y Vector de expresión Jung y cola¬
TK24 de S. lividans boradores, 19932 PSPP1 DH5a de E. coli y pSES2 + Spe2 +phyA Este TK24 de S. lividans Documento PYES2 DH5a de E. coli e Vector de expresión Invitrogen INVScl de S. cerevisiae PYEP1 DHa5 de E coli e pYES2 + Spe2 + phyA Este INVScl de S. cerevisiae Documento
PYXP1 DN5a de E. coli e pYES + Spxy + phyA Este INVScl de S. c;revisiae Documento PYPP1 DH5a de E. ,l? e pYES + Sphy + phyA Este INVScl de . cerevisiae Documento
1 Spe2 es el péptido de la señal para la endoglucanasa E2 de T. fusca (Wilson, L.£ , "Biochemistry and Genetics of Actinomycete Cellulases", Crit, } >v. Biotechnol., 12:45-63 (1992), la cual es incorporada aqui para referencia); Spxy es el péptido de la señal para la xilanasa de A. Pu.lalans (Li y Ljungdahl, "Cloning, Sequencing, and Regulation of a Xylar.ase Gene from the Fungus Aureobasidium pullulans Y-2331-1", Appl.Environ.Microbiol., 60:3160-66 (1994); Li y Ljungdahl, "Expression of Aureobasidiuirt pullulans xynA in, and Secretion of the Xylanase from, Saccharomyces cerevisiae", Appl .Environ.Microbiol . , 62:209-13 (1996), las cuales son incorporadas aqui para referencia); y Sphy es el péptido de la señal de phyA de A. niger (Hartingsveldt y colaboradores, "Cloning, Characterization and Overexpression of the Phytase-Encoding Gene (phyA) of Aspergillus Niger", Gene 127:87-94 (1993), la cual es incorporada aqui para referencia). 2 Jung, E.D. y colaboradores, "DNA Sequences and Expression in StreptomycesLividansoglucanase Gene and an Endoglucanase Gene from Thermomonospora Fusca", Appl . Env ron .Microbiol . , 59:3032-43 (1993), la cual es incorporada aqui para referencia) .
La construcción del plásmido para la expresión de phyA en S. lividans inició con la síntesis de un fragmento que contiene el promotor de pLTl y la del péptido de la señal de Spe2 (Lao, G. y colaboradores, "DNA Sequences of Three Beta-1, 4-endoglucanase Genes From Thermomonospora Fusca", J. Bacteriol., 173:3397-407 (1991), la cual es incorporada aqui para referencia) por PCR. Un cebador corriente arriba, 5' - CAG CTA TGA CCA TGA TTA CGC C - 3' 8SEC ID No. 3), y un cebador corriente abajo, 5' - CCT AGA ACG GGA ATT CAT TGG CCG CC - 3' (SEC ID No. 4), contuvieron los sitios de restricción PstI y EcoRI, respectivamente. El fragmento fue amplificado a partir de pBW2 (Jung, E.D. y colaboradores, "DNA Sequences and Expression in
Streptomyces Lividans of an Exoglucanase Gene and an Endoglucanase Gene From Thermomonospora Fusca", Appl . Environ .Microbiol . , 59:3032-43 (1993), la cual es incorporada aqui para referencia) y luego digerida con PstI y EcoRI, mientras que la construcción pEPl y el plásmido pBluescript SK+ (Stratagene, La Jolla, CA) se digirieron con EcoRI y HindIII, y PstI y HindIII, respectivamente. Los tres fragmentos digeridos se purificaron subsiguientemente utilizando el juego Geneclean II y se ligaron en una-construcción recombinante única que contuvo los sitios de restricción deseados de PstI y Kpnl (de pBluescript SK*), el promotor pLTl y el péptido delantero de Spe2 de la endoglucanasa E2 (551 pb) (Lao, G. y colaboradores, "DNA Sequences of Three Beta-1, 4-endoglucanase Genes From Thermomonospora Fusca", J. Bacteriol., 173:3397-407 (1991), la cual es incorporada aqui para referencia) , y el gen phyA (1365 pb) . Después que la construcción se digirió con PstI y Kpnl, el fragmento resultante se insertó en el vector de expresión pSESl, y el plásmido de lanzadera formado (pSPPl, pl31 pb) se transformó en los protoplastos de S- lividans del huésped de acuerdo con Hopwood y colaboradores (Hop ood, D.A., y colaboradores, Genetic Manipulation of Streptomyces-A Laboratory Manual, The John Innes Foundation, Norwich, Inglaterra (1985), la cual es incorporada aqui para referencia) . De manera semejante, se preparó un control transformando el S. lividans con el vector de expresión pSES2. Tres plásmidos de lanzadera con tres diferentes secuencias del péptido de la señal fueron construidos para
-ß* 'fl**- "- -- x r?_ftjü-j_t_l_l-llfc¡.Mf..E^^ expresar phyA en el sistema de levadura (Véase la Tabla 2) . El primer plásmido se originó de un fragmento digerido con HindIII de pSPpl, incluyendo el promotor pLTl, el Spe2 de la secuencia directora, y la secuencia de la región de 5 codificación de phyA. El fragmento se ligó en el sitio HindIII de pYES2 tratado con la fosfatasa alcalina intestinal del ternero y el plásmido se llamó pYEPI (7783 pb) después que su orientación legitima fue confirmada. El segundo plásmido contuvo Spxy, una secuencia del péptido de
10 la señal del gen de xilanasa de A. pullulans (Li, X.L. y colaboradores, "Cloning, Sequencing, and Regulation of a Xylanase Gene From the Fungus Aureobasidum Pullulans) Y- 2311-1", Appl. Environ. Microbiol., 60:3160-166 (1994): Li, X.L. y colaboradores, "Expression of Aureobasidium
15 Pullulans XynA in, and Secretion of the Xylanase From. Saccharomyces Cerevisiaea", Appl. Environ. Microbiol., 62:209-13 (1996), las cuales son incorporadas aqui para referencia), y el gen phyA. Spxy se empalmó con phyA por la extensión de la superposición (Horton, R.M., "In Vitro
20 Recombination and Mutagenesis of DNA:SOEing Together Tailor-Made Genes", PCR Protocols: Current Methods and Applications, 251-61 (1993), la cual es incorporada aqui para referencia) con dos pasos sucesivos de PCR. Uno fue amplificar la secuencia de Spxy de pCE4 (Li, X.L. y
25 colaboradores, "Expression of Aureobasidium Pullulans XynA
--*. *. , » , . t tj¿s* ~ i .yj'feat , - in, and Secretion of the Xylanase From. Saccharomyces Cerevisiaea", Appl. Environ. Microbiol., 62:209-13 (1996), la cual es incorporada aqui para referencia) utilizando el cebador corriente arriba (5' - CCC AAG CTT GAT CAC ATC CAT
5 TCA - 3' ) (SEC ID No. 5) con un sitio de restricción HindIII (cebador 1) y el cebador corriente abajo superpuesto (5' - CGG GGA CTG CTA GCG CAC GTT CGA T - 3', cebador 2) (SEC ID No. 6) . La otra PCR fue para amplificar la región de codificación de phyA de pEPl utilizando el
10 cebador corriente arriba superpuesto (5' - ATC GAA CGT GCG CTA GCA GCA GTC CCC G - 3' , cebador 3) (SEC ID No. 7) y el cebador corriente abajo (5' - GCT CTA GAC TAA GCA AAA CAC TCC - 3'), cebador 4) (SEC ID No. 8) con un sitio de restricción Xbal. El segundo paso de la PCR se llevó a cabo
15 para fundir dos fragmentos generados a partir de las dos
PCR anteriores utilizando « los dos fragmentos purificados como los moldes y los cebadores 1 y 4. El fragmento resultante contuvo los sitios de restricción HindIII y Xbal y se clonó en pSES2. Este plásmido fue llamado pYXPl (7219
20 pb) . El tercer plásmido contuvo la secuencia del péptido de la señal (Sphy) de phyA y la región de codificación de phyA, excluyendo el intrón entre ellos (Hartingsveldt, W. van, y colaboradores, "Cloning, Characterization and Overexpression of the Phytase-Encoding Gene (phyA) of
25 Aspergillus Niger", Gene 127:87-94 (1993), la cual es
¿aás**- .¿¡fcsr "t'- .
incorporada aqui para referencia) . Dos cebadores, incluyendo un cebador corriente arriba de 70 pb contuvo el péptido de la señal con un sitio de restricción de Kpnl diseñado y un cebador corriente abajo que fue el mismo utilizado para la construcción de pYXPl (cebador 4) fueron utilizados para amplificar el fragmento deseado a partir de pEPl. El producto de PCR se digerió con Kpnl y Xbal y se clonó en pSES2, conduciendo a un plásmido llamado pYPPl (7176 pb) . La totalidad de las tres construcciones anteriores fueron transformadas en S. cerevisiae por el método de Ito y colaboradores, "Transformation of Intact Yeast Cells Treated with Alkali Cations", J. Bacteriol., 153:163-68 (1983), la cual es incorporada aqui para referencia.
? Tabla 2. Péptidos de la señal utilizados para la expresión de phyA en S. cerevisiae
Tamaño de la Péptido Gen Organismo Actividad de Construcción la fitasa1 (pb) (mPU/ml)
pYEPl 7783 Spe2 Celulasa E2 T. fusca 0.80 (93 pb) 10 pYXPl 7219 Spxy Xilanasa A A. Pullula; (102 pb) pYPPl 7176 Sphy PhyA Fitasa A. niger 146 (57 pb^ pSESI2 7224 S. cerevisi 15 1 La actividdd de la fitasa se detectó en el sobrenadante del cultivo de las células leí medio de Sabouraud-rafinosa 15 horas después de inducida agregando galactosa. Véase el texto para la definición de las unidades de fitasa. 20 Vector de expresión para S. cerevisiae, utilizado como un control .
Medio de crecimiento e inducción de la expresión
25 del gen. En el s"1 stema de El coli, los transformantes se hicieron crecer en 50 mi del medio de LB que contiene 50 µg/ml de ampicilici a 30 °C. Después que el valor OD600 del medio alcanzó 0.5 s 0.6, la expresión del gen de fitasa se
indujo agregando IPTG (isopropil b-D-tiogalactopiranosida) en el medio a una concentración final de 1 mM. Tres horas después de la inducción, las células fueron colectadas por centrifugado descendente a 8000 x g durante 15 minutos, se 5 lavan con 1 x PBS, y son Usadas por una lisozima. Las fracciones solubles e insolubles de las células fueron preparadas, y una muestra que contiene 500 µg de la proteina total (Lowry, O.H. y colaboradores, "Protein Measurement With the Folin Phenol Reagent", J. Biol. Chem.,
10 193:265-75 (1951), la cual es incorporada aqui para referencia) se suspendió en el mismo volumen de la solución amortiguadora 2 x SDS y se analizó por SDS-PAGE (Laemmli, U.K., "Cleavage of Estructural Proteins During the Asembly of the Head of Bacteriophague T4", Nature, (Londres),
15 227:680-85 (1970), la cual es incorporada aqui para referencia) . La S. lividans recombinante se hizo crecer en un caldo de TSB con 5 µg/ml de thiostrepton a 30 °C (Jung, E.D. y colaboradores, "DNA Sequences and Expression in
20 Streptomyces Lividans of an Exoglucanase Gene and an Endoglucanase Gene From Thermomonospora Fusca", Appl . Environ .Microbiol . , 59:3032-43 (1993), la cual se incorpora aqui para referencia) . Después de 72 horas de incubación, las células y el medio se colectaron y se
25 prepararon para SDS-PAGE ( ilson, D.B. "Biochemistry and
-¿¿i-?-a^-ái^_-^-*--a^_^_i^ita^ik^^^_^^^^^_^^^^^^^^^^^^^^-^^^-^^^^^ Genetics of Actinomycete Cellulases", Crit. Rev. Biotechnol. , 12:45-63 (1992), la cual es incorporada aqui para referencia) . Los transformantes de S. cerevisiae se hicieron 5 crecer inicialmente en un medio de Sabaoraud-rafinosa (4 %) (100 mi) sin uracilo durante 48 horas, luego se agregó galactosa estéril en el medio (2%) para inducir la expresión de la fitasa. Las muestras del medio y las células se colectaron en varios puntos del tiempo y las 10 muestras extracelulares e intracelulares fueron preparadas como se describió por Li, X.L. y Ljungdahl, "Expression of Aureobasidium Pullulans XynA in, and Secretion of the Xylanase From. Saccharomyces Cerevisiaea", Appl. Environ. Microbiol. , 62:209-13 (1996), la cual se incorpora aqui 15 para referencia. Cuando sea necesario, el sobrenadante de las fracciones del cultivo celular expresado se concentraron con las Células Agitadas de Amicon (Beverly, MA) utilizando las membranas YM10 (corte de PM de 10,000). Otros medios fueron probados de acuerdo con esto. 20 Proteina de la enzima y ensayo de actividad. Las cantidades de la proteina de fitasa expresada bajo varias condiciones se cuantificaron por la densitometria relativa de las bandas especificas en SDS-PAGE, utilizando el IS- 1000 digital Imaging System (Alpha Innotech Corporation, 25 San Leandro, CA) . La actividad de la fitasa en las muestras
^?^^^g^^^=^^^,^^,-^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^¿¿^g^^^Sa^^^^^^^^^C¡^^^^^^^^^^^^^t^^^^¿S( del medio y las células se determinó como se describió previamente (Piddington, C.S. y colaboradores, "The Cloning and Sequencing of the Genes Encoding Phytase (phy) and pH 2-5óptimum Acid Phosphatase (aph) from Aspergillus niger var. Awamori", Gene, 133:56-62 (1993), la cual es incorporada aqui para referencia) y el fosfato inorgánico liberado fue evaluado por el método de Chen, P.S. y colaboradores, "Microdetermination of P", Anal. Chem., 28:1756-58 (1956), la cual es incorporada aqui para referencia. Una unidad de fitasa (PU) se definió como la cantidad de enzima que libera una µmol de fosfato inorgánico a partir del fitato de sodio por minuto a 37 °C.
Análisis por el manchado de Western (inmunomanchado) .
La fracción solubls de la masa celular de la E. coli transformada con fitasa y el sobrenadante de los transformantes del medio de S. lividans y S. cerevisiae fueron colectados para SDS-PAGE. Después de la electrofóresis, las proteínas fueron transformadas entonces sobre la membrana de nitrocelulosa Protran® (Schleicher & Schuell, Keene, NH, USA) en 20 mM de Tris-HCl (pH 8.3), 20% metanol, y 0.1 % SDS, utilizando una célula Mini Trans-Blot (Bio-Rad Laboratories). La transferencia se hizo toda la noche a 50 V constantes y la temperatura de la solución amortiguadora inicial fue de 4 °C. Las membranas fueron sometidas entonces al análisis de manchado de Western. Un IgG policlonal de conejo (provisto amablemente por el Dr. A. H. J. Ullah de USDA. Dilución, 1:5,000) contra la fitasa de A. niger natural purificada se utilizó como el primer anticuerpo. El manchado se finalizó utilizando el Juego de 5 Ensayo de Inmuno-Manchado (Bio-Rad Laboratories) que contiene un segundo anticuerpo conjugado con peroxidasa de rábano picante. Aislamiento y análisis del ARN total. El ARN total se aisló con el Reactivo TRIzol® (GIBCO BRL, Gaithersburg, MD)
10 de los transformantes de E. coli y S. cerevisiae 3 y 15 horas después de la inducción, respectivamente. Las muestras de ARN (10 µg or faja) se separaron entonces por electrofóresis en gel de formaldehido agarosa (1.5%, peso/vol) y se transfirieron a las membranas Hyblot
15 (National Labnet, Woodbridge, NJ) (Davis y colaboradores, Basic Methods in Molecular Biology, 2/a. Ed., Appleton y Lange, Norwalle, Ct . (1994), la cual es incorporada aqui para referencia). Un fragmento EcoRI-HindIII de 1.4 kb en el plásmido pEPl se preparó y se cebó al azar etiquetado
20 con 32P utilizando un juego o conjunto de etiquetación de ADN seguido por la purificación de la columna G-50 (Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) y luego se hibridizó con las membranas de ARN manchadas en un horno de hibridización (Hybaid, Middlesex, UK) . Las membranas
25 hibridizadas fueron expuestas a tamices en una Placa de
Formación de Imágenes Fuji y se analizó por el Analizador Bio-Imaging (Kohshin Graphic Systems, Fuji, Japón) .
Ejemplo 2 - Expression of PhyA en E. coli.
Cuatro horas después de la inducción, una banda especifica (~55 kDa) se observó en SDS-PAGE (12.5%) de la fracción de células soluble, comparado con el control transformado del vector de expresión único (Véanse las Figuras 1 y 2) . Esta banda representó 3.8 % de la proteina soluble total de esta fracción. En correspondencia, el análisis de Northern mostró la sobreexpresión del ARNm de phyA en estos transformantes del gen de fitasa y ninguna señal fue observada en las células de control (Véase la Figura 3) . Para optimizar la expresión de la proteina de la fitasa, el curso del tiempo y los efectos de una serie de factores sobre la expresión fueron estudiados. Estos factores incluyeron la temperatura de incubación (30 y 37 °C), el pH medio (4.0, 5.0, 6.0, 7.0, 8.0, y 9.0), la anaerobiosis (adición de aceite mineral estéril sobre la parte superior de las células en crecimiento) , el nivel del fosfato inorgánico en el medio (Dassa, E. y colaboradores, "The Acid Phosphatases with Optimum pH of 2.5 of Escherichia coli", J. Bio. Chem. , 257:6669-76 (1982), la
cual es incorporada por el presente para referencia) , y el fitato de sodio (0, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, y 0.5 nM) . Los resultados indicaron que la expresión de la proteina de fitasa se acumuló linealmente con el tiempo durante las 5 primeras seis horas después de la inducción (Véase la Figura 4). Después de esto, la expresión permaneció relativamente sin cambio aunque las células bacterianas continuaron creciendo. Solo el pH del medio y la concentración dci fitato de sodio afectaron
10 significativamente la expresión de la proteina de fitasa. La proteina máxima se mostró a pH 6.0 y 0.3 mM de fitato de sodio, en la cual l a proteina de fitasa se incrementó desde 3.8 hasta 9.6 % de la proteina soluble total. Ninguna actividad de fitasa fue detectada
15 extracelular o intracelularmente. Esto puede no ser completamente inesperado, a causa de que la fitasa natural de A. niger es una ?licoproteina con un tamaño de 70-80 kDa (Hartingsveldt y colaboradores, "Cloning, Characterization and Overexpression of the Phytase-Encoding Gene (phyA) of
20 Aspergillus Niger", Gene 127:87-94 (1993), la cual es incorporada aqui paia referencia) . La proteina expresada en el sistema E. col i de este estudio tuvo un tamaño de aproximadamente 55 kDa. Presumiblemente, la falta de glicosilación de la proteina y otras modificaciones
postranslacionales necesarias durante la secreción podrían evitar la actividad de la fitasa.
- Expresión de PhyA en S. lividans.
Los genes heterólogos han sido expresados en S. lividans, y los productos resultantes secretados en el medio con la actividad enzimática (Ghangas, G.S. y colaboradores, "Cloning of the Thermomonospora Fusca Endoglucanase E2 Gene in Streptomyces Lividans: Affinity Purification and Functional Domains of the Cloned Gene Product", Appl. Environ. Microbiol., 54:2521-26 (1988); Wilson, D.B. "Biochemistry and Genetics of Antinomycete Cellulases", Crit. Rev. Biotechnol., 12:45-63 (1992); Jung, E.D. y colaboradores, "DNA Sequences and Expression in Streptomyces Lividans of an Exoglucanase Gene and an Endoglucanase Gene From Thermomonospora Fusca", Appl . Environ .Microbiol . , 59:3032-43 (1993), las cuales son incorporadas aqui para referencia) . De manera similar, el gen phyA fue expresado en S. lividans y la proteina se introdujo en el medio, como se muestra en una banda especifica en las muestras del medio analizadas por SDS-PAGE (Véanse las Figuras 5 y 6) . Esto sugirió que el péptido de la señal del gen E2 de endoglucanase fue capaz de conducir a la proteina de la fitasa fuera de la célula.
Esta proteina fue de 57 kDa y representó 16.2% de la proteina total en el medio. Cambiando el pH del medio a 6.0 y agregando 0.3 mM de fitato de sodio en el medio, se mejoró el rendimiento de la proteina a 20.3 % de la proteina total. A causa de que la proteina de la fitasa fue-secretada en el medio a tal nivel elevado, debe ser fácil purificarla y utilizarse de manera efectiva para una variedad de propósitos tales como la producción de anticuerpos de la fitasa. Una vez más, no se encontró alguna actividad de fitasa incrementada ni en el medio ni en las células lisadas. Aunque el tamaño de la proteina se incrementó un fragmento pequeño (2-3%) comparado con una expresada en E. coli, presumiblemente debido a la glicosilación de la proteina de fitasa en este sistema de expresión, no existió todavía actividad de la fitasa.
Ejemplo 4 - Expresión de PhyA en S. cerevisiae.
Tres diferentes péptidos de la señal fueron utilizados para comparar la eficiencia en la conducción de la proteina expresada fuera de las células (Véase la tabla 2). La actividad de la fitasa se incrementó substancialmente en el medio de Sabouraud-rafinosa en el que crecen los transformantes de pYEPl y pYPPl, pero no pYXPl. La proteina de fitasa visible se mostró por SDS-PAGE 20 horas después de la inducción (Figura 7) . La expresión de los transformantes de pYEPl y pYPPl se determinó en tres diferentes tipos del medio: Sabouraud-rafinosa (Li, X.L. y colaboradores, "Expression of Aureobasidium Pullulans XynA in, and Secretion of the Xylanase From, Saccharomyces Cerevisiaea", Appl. Environ. Microbiol. , 62:209-13 (1996), la cual es incorporada aqui para referencia), Sabouraud-glicerol, y un medio de YEPD de propósito general modificado. En cuanto a los transformantes de pYEPl, una actividad de fitasa similar se expresó en el medio de Sabouraud-rafinosa y de Sabouraud, pero no existe actividad detectada en el medio de YEPD. En contraste, la actividad de la fitasa en el medio cultivado con los transformantes de pYPPl varió ampliamente con los diferentes tipos del medio. La actividad se mejoró a 375 mU/ml cuando se utilizó el medio de Sabouraud-glicerol. La actividad se incrementó adicionalmente hasta 1675 mU/ml, cuando el medio se cambió a YEPD (Véase la Tabla 3) . Aunque el medio de YEPD fue mucho más económico que el medio de Sabpuraud-rafinosa, el rendimiento de la fitasa se incrementó más de diez veces. Por consiguiente, el péptido de la señal supuesta del gen de fitasa fungosa logró la expresión más eficiente de la actividad de la fitasa extracelular. Casi la totalidad de la proteina producida
fue secretada en el medio de YEPD, a causa de que muy poca actividad fue detectada en las células de levadura. El transcurso del tiempo de la expresión de la expresión de la fitasa en este sistema se mostró en la Figura 8.
Tabla 3. Actividad de la fitasa expresada a partir del transformante con pYPPl en diferentes medios
Horas después de la inducción (mPU/ml)1
Medio 0 10 15
Sabouraud-rafinosa 22 136 146 Sabouraud-glicerol 6 174 375 YEPD 18 1238 1675
La actividad de la fitasa se detectó en el sobrenadante del cultivo celular de los tres medios a las 0, 10, y 15 horas después de inducida por la adición de la galactosa. Véase el texto para la definición de las unidades de la fitasa.
Una variedad de microorganismos incluyendo los bacilos, las levaduras, y los hongos filamentosos tienen
j^=?--¿S-ásC?;^^^™.^^^_ai—««««««_„.__^JÉ^^^á^^§í^^^^^^^_^^^^B^^^^^^^^^^^^ssgg^^^ actividad de fitasa, mientras que la cepa NRRL3135 de A. niger produce la actividad más elevada (340 mU/ml, Shieh, T.R. y colaboradores, "Survey of Microorganisms for the Production of Extracellular Phytase", Appl. Environ. Microbiol. , 16:1348-51 (1968), la cual es incorporada aqui para referencia) . La CBS 2863 de Schwanniomyces castellii tiene la actividad de fitasa más elevada entre las 21 cepas de levadura (140 mU/ml, Lambrechts, C, y colaboradores, "Utilization of Phytate by Some Yeasts", Biotechnology Letters, 14:61-6 (1992), la cual es incorporada aqui para referencia) . Claramente, la cepa de levadura recombinante transformada con pYPPl en el presente estudio produjo una actividad de fitasa mucho más elevada (1675 mU/ml) que CBS 2863 de A. niger (4 veces) y de S. castelli (11 veces) . La producción de fitasa máxima puede ser obtenida en el sistema optimizando las condiciones de incubación y modificando los cásete del plásmido (Demolder, J. W. y colaboradores, "Efficient Synthesis of Secreted Murine Interleukin-2 by Saccharomyces Cerevisiae: Influence of 3'-Unstranslated Regions and Codon Usage", Gene, 111:207-13 (1992), la cual es incorporada aqui para referencia). El alto nivel de la expresión de la actividad de la fitasa en S. cerevisiae fue más probablemente debido a la glicosilación suficiente de la proteina de la fitasa y otras modificaciones postranslacionales por la levadura.
„ .Jea*^..~»áí ¡ ¿a^*¿M, «¡BM*,, -_^ ,„• , . ^tAa-tA,^jA.
Después que el sobrenadante del medio se concentró y se sometió al análisis de SDS-PAGE, existió una banda de aproximadamente 110 kDa (Véanse las Figuras 7 y 9), la cual fue de tamaño más grande que la proteina natural de A. niger ( (Hartingsveldt, W. van, y colaboradores, "Cloning, Characterization and Overexpression of the Phytase-Encoding Gene (phyA) of Acpergillus Niger", Gene 127:87-94 (1993), la cual es incorporada aqui para referencia) . El análisis de Northern confia la sobreexpresión especifica del ARNm de phyA (Véase la Figura 10) . Estos resultados indicaron que el sistema de levadura fue eficiente para sobreexpresar la enzima de fitasa activamente extracelular. El sistema de levadura tiene varias ventajas sobre las bacterias u otros sistemas tales como el de A. niger (Hartingsveldt, W. van, y colaboradores, "Cloning, Characterization and Overexpression of the Phytase-Encoding Gene (phyA) of Aspergillus Niger", Gene 127:87-94 (1993), la cual es incorporada aqui para referencia) . El mismo lleva a cabo modificaciones p?s r ?nslacionales, incluyendo el pliegue apropiado, la glii dilación, la formación de enlaces de disulfuro, y ±a pcteólisis, durante la translocación de las proteínas a través del retículo endoplásmico y la membrana celular. Ta secreción de proteínas es facilitada por los péptidos d^ la señal corta hidrofóbica en las regiones N-terminales de los precursores de proteina (Li,
bátete.
X.L. y colaboradores, "Expression of Aureobasidium Pullulans XynA in, and Secretion of the Xylanase From. Saccharomyces Cerevisiaea", Appl. Environ. Microbiol., 62:209-13 (1996), la cual se incorpora aqui para referencia) . Las proteínas secretadas por las células de levadura son protegidas de la agregación y la degradación de la proteasa. De manera más importante, las proteínas de enzima producidas por S. cerevisiae son fácilmente purificadas, a causa de que las mismas secretan solamente pocas proteínas. Considerando la seguridad bien conocida de los productos de levadura tanto para los seres humanos como para los animales, este sistema es de gran potencial para la industria de los alimentos para los seres humanos y de la alimentación para los animales.
Ejemplo 5 - Propiedades de la Fitasa PhyA Sobreexpresada en Saccharomyces cerevisiae.
La fitasa sobreexpresada de los transformantes del plásmido pYPPl se concentraron y se utilizaron para estudiar sus propiedades (Véase la Tabla 4). La enzima mostró dos intervalos de pH óptimos: 2 a 2.5 y 5.0 a 5.5. Sin embargo, la actividad enzimática a pH 2 a 2.5 fue solamente del 60% de la actividad a pH 5 a 5.5. No existió actividad detectada a ninguno de los pHs de 1 u 8. El pH óptimo fue virtualmente el mismo que el de la fitasa de A. niger (Simmons y colaboradores, "Improvement of Phosphorus Availability by Microbial Phytase in Broilers and Pigs", Br. J. Nutr., 64:525 (1990), la cual es incorporada aqui 5 para referencia) , por consiguiente la función activa en la hidrólisis del fitato-P en las tractos gastrointestinales se podría esperar de manera cierta. La temperatura óptima de la enzima fue de 60 °C, mientras que una común en el mercado producida por Gist-Brocades es de 55 °C (BASF, 0 1996) . Más del 80% de la actividad permaneció en 50 a 55 °C, pero se detectó una actividad pequeña a 75 u 80 °C. Calentando la enzima durante 15 minutos a 37 y 80 °C, la actividad restante para la fitasa de levadura expresada de la presente invención fue de 100 y 63%, respectivamente, y 5 para la fitasa de BASF Gist-Brocades fue de 100 y 52%, respectivamente. Las diferencias entre las dos fuentes de enzima a cualquier temperatura dada fueron significativas (Véase la Tabla 5) . Por consiguiente, la fitasa de la levadura pareció que va a ser más estable con el calor que 0 el producto de fitasa comercial común.
5
- £.^. ^ TL* Tabla 4: Características de la fitasa sobreexpresada en la levadura1 pH Óptimo2
pH 1.0 2.0 2.5 3.0 4.0 5.0 5.5 6.0 8.0
Activ. 0.5C 59.7C 64.8C 48. ld 81.0 100.0a 95.0a 66.3C 0.8e
Relat. {*. )+0.2 +3 +6 +4 +5 +1 +6 +1 +0.4
Temperatura Óptima3 25 37 45 50 55 60 75 80 Activ. 24.2e 44.6d 63.9C 83.6b 89.8b 100.0a 0.6£ 0.9f
Relat. (*.) +0.8 +3 +8 +2 +4 +4 +0.1 +0.2
1 Los datos son los promedios de la actividad relativa + la desviación estándar (n = 4). Los promedios en una hilera con diferente letra de subíndice son diferentes (P < 0.05). El modelo lineal general del sistema de análisis estadístico (1988) fue utilizado para analizar los efectos del tratamiento principal como los diseños completos al azar y la prueba t de Bonferroni fue utilizada para la comparación promedio de tratamientos múltiples. El nivel de significación fue fijado como P < 0.05. 2 La actividad fue evaluada a 37 °C (véase el contexto para la definición de unidad de fitasa) . Se utilizaron diferentes soluciones amortiguadoras: 0.2mM de la solución amortiguadora de glicina-HCl para pH 1.0 a 3.5; solución amortiguadora 0.2 mM de citrato de sodio para pH 4.0 a 6.5; y solución amortiguadora 0.2 mM de Tris-HCl para un pH arriba de 7. 3 La temperatura óptima se determinó a pH 5.5 (solución amortiguadora de citrato de sodio 0.2mM).
^¿ís!ÉÉ_^í^_^^^.^i^^^^^^^^^^^^^^^^^^»-^^^^^aíá^^^^^^^?^^^^^.^^^^^^^^^^^^^^^ «^^^ág«í Tabla 5. Comparación de la termoestabilidad de la fitasa sobreexpresada en la levadura y la fitasa de Gist-Brocades producida por A. niger1'2
Actividad relativa, % 37 °C 80
Fitasa de levadura 100* + 1 63b + 1 Fitasa de A. niger 100* + 3 52y + 2 P3 < 0.03
1 Los datos son los promedios de la actividad relativa + la desviación estándar (n = 3) . Los promedios en una hilera con diferente letra de subíndice son diferentes (P < 0.05) . El modelo lineal general del sistema de análisis estadístico (1988) fue utilizado para analizar los efectos del tratamiento principal como los diseños completos al azar y la prueba t de Bonferroni fue utilizada para la comparación promedio de tratamientos múltiples. El nivel de significación fue fijado como P < 0.05. 2 La enzima fue calentada durante 15 minutos a diferentes temperaturas antes de la reacción a 37 °C y pH 5.5. 3 La significancia (valores de P) de la prueba t y entre la actividad de las dos fitasas a cada ajuste de temperatura.
Aunque no es claro como tal mejora en la termoestabilidad está relacionada con diferentes modificaciones postranslacionales (el plegado, la segmentación, la glicosilación, etc.), (Li, X.L. y colaboradores, "Expression of Aureobasidium Pullulans XynA in, and Secretion of the Xylanase From. Saccharomycee
ma?liíMiÉÉM^ ^^^^^^^^^^^ ^^^ Cerevisiaea", Appl. Environ. Microbiol., 62:209-13 (1996), la cual es incorporada aqui para referencia), ciertamente es ventajoso tner una enzima de fitasa más termoestable que pueda ser promisoriamente resistente al calentamiento durante la conversión en microesferas de la alimentación, el cual es un problema con la fitasa de Gist-Brocades actual .
Ejemplo 6 - Hidrólisis In Vitro de Fitato-P a partir de Afrechos de Maiz, Soya, y Trigo por la Fitasa de Levadura Expresada.
La fitasa de levadura expresada liberó el fitato-P de la harina de maiz y de soya tan efectivamente como la fitasa de Gist-Brocades con base en la actividad por unidad (Véase la Tabla 6) . Como se esperaba, la hidrólisis de fitato-P fue una función del tiempo y la dosificación de la actividad. La fitasa de levadura expresada también fue efectiva en la liberación de fitato-P del afrecho de trigo, indicando su gran potencial en la fermentación del pan. A causa de que el afrecho de trigo utilizado en este estudio contuvo una actividad de fitasa mucho más elevada que la harina de trigo utilizada comúnmente, se podria esperar un efecto mucho más grande de la fitasa de levadura expresada sobre la mejora de la hidrólisis de fitato-P de la harina y
, afcfc -A^aC-en la liberación de los elementos de traza, cuando la misma es utilizada en el horneo de pasteles (Hall, M.N., "The Early Days of Yeast Genetics, "Cold Spring Harbor Laboratory Press (1993), la cual es incorporada aqui para referencia) .
Tabla 6. Fósforo libre liberado del maiz, la harina de soya (SBM), y de los afrechos de trigo por la fitasa de levadura sobreexpresada y la "itasa de A. niger fungosa in vitro1
Fitasa de 0 100 250 500 1000 250 Levadura (fitasa
(PU/kg) fungosa)
Fósforo libre (mg/g)
Maíz: 1 hora 23J±o3 64c ± 08 1 I4b± 18 146'±04 1.54"±.04 I.l6b±.l5 4 horas 36c ± 02 126b±04 160' ±.03 166* ±06 l.72'±.04 I 68* ±.04 SBM 1 hora 68" ±01 118cd±02 I62C± I8 248b±32 313' ±.19 1.68c±.2 4 horas ?:> 167c 269b 341' 3.71' 2.78b A Affrreecchhooss ddee TTrriig¡ goo 1 hora 356 - 9 4 II ±64 467:±05 4 horas 5 b_ _ 5 602 ±48 6.38" ±07
1 Cada ue^.ra de 5 g se agitó en 20 mi de solución amortiguadora de cit'a.j de sodio 0.2mM a 37 °C durante 1 o 4 horas. El sobrenadante fue )^ tenido por la centrifugación durante 15 minutos a
8000 g. Después de viaja-" a través de papel filtro de Whatman 541, la muestra se sometió a- =nsayo de P libre por el método de Chen, P.S. y colaboradores, "Micodetermination of P", Anal.Chem. , 28:1756-58 (1956), la cual es incorporada aqui para referencia. Los datos en la tabla son los promedios de la actividad relativa + la desviadicón estándar (n=4) . El Modelo Lineal General del Sistema de Análisis Estadístico (1988) fue utilizado para analizar los efectos del tratamiento principal como los diseños completos al azar y la prueba t de Bonferroni se utilizó para la comparación del promedio de los tratamientos múltiples. El nivel de significancia fue fijado como P < 0.05. Existió una diferencia significativa de entre 1 y 4 horas para cada alimentación en cada dosis de la enzima como se analizó por la prueba t. Los promedios difieren en una hilera con letras de subíndice diferentes (P < 0.05) . 2 n = 2
La sobreexpresión de la fitasa de Aspergillus niger (phyA) en Escherichia coli, Streptomyces lividans, y Saccharomyces cerevisiae fueron comparadas para desarrollar un sistema simple y eficiente para producir la fitasa económicamente. Una proteina intracelular soluble de 55 kDa, que representa 9.6% de la proteina soluble total, se expresó en E. coli utilizando el sistema pET25b(+). Una proteina extracelular de 57 kDa, que representa 20.3 % de la proteina total en el medio, fue expresada en S. lividans utilizando un plásmido de lanzadera que contiene el promotor pLTl y el péptido conductor Spell de la endoglucanasa E2. Ningún incremento en la actividad de la fitasa fue mostrado en cualquier sistema de expresión, presumiblemente debido a la falta de glicosilación y otras modificaciones postranslacionales necesarias. En contraste, una actividad de fitasa extracelular elevada fue producida en S. cerevisiae transformada con el gen phyA. Tres diferentes péptidos de la señal y tres tipos diferentes del medio fueron comparados para identificar la mejor condición y vector de expresión. El uso del péptido de la señal Sphy del gen phyA y el medio YEPD produjo la actividad de fitasa extracelular más elevada. La fitasa sobreexpresada en la- levadura fue de aproximadamente 110 kDa, tuvo dos pHs óptimos; 2.0 y 2.5 y 5.5 a 6.0, y la temperatura óptima fue de 60 °C.
Ejemplo 7 - Métodos y Materiales para la Expresión de phyA en Pichia
Huésped y vector. Un Juego o Conjunto de Expresión de Pichia EasySelect® fue comprado de Invitrogen (San Diego, CA) . El juego proporciona huéspedes y vectores para expresar el gen ya sea intracelular o extracelularmente, en las cepas ya sea de Mut+ o Muts (Utilización de metanol normal o lenta) . El X33 se utilizó como una cepa de Mut+ y KM71 como una cepa Muts. Se utilizaron dos vectores, pPICZ B (3.3 kb) y pPICZaA (3.6 kb) , ambos usan AOXl como el promotor. Construcción de los Vectores de Expresión. Para comparar el efecto de los diferentes péptidos de la señal sobre la expresión de PhyA en el sistema Pichia, se prepararon dos construcciones. La primera, un fragmento
EcoRI-Kpnl de 1.4 kb, que contiene la secuencia de PhyA que codifica la proteina de fitasa madura, se ligó en pPICZaA. En este plásmido (pPICZa-phyA) , la phyA fue conducida por un factor alfa, un péptido de la señal de uso muy general de Saccharomyces cerevisiae. La segunda, un fragmento de Kpnl-Xbal de 1.4 kb de pYPPl se ligó en el vector (la región de codificación de phyA se condujo por su propio péptido de la señal que fue muy efectivo en la secreción de la fitasa expresada en Saccharomyces cerevisiae) . Transformación y expresión. Las construcciones confirmadas fueron linearizadas por Pmel y transformadas en GS115 y KM71, por EasyComp® provisto por el juego. Neocin® se utilizó para seleccionar las colonias positivas. Después que una sola colonia fue inoculada en 10 mi del medio MGY y se hizo crecer a OD6oo de 2-6 a 30 °C, las células fueron colectadas por centrifugación y resuspendidas en 10 mi del medio MMY (que contiene 0.5% de metanol). Las muestras fueron colectadas cada 12 o 24 horas después de la inducción. Las células fueron separadas del sobrenadante y Usadas con perlas de vidrio en la solución amortiguadora de ruptura. La actividad de la fitasa en el sobrenadante y las células se evaluó como se describió previamente. SDS-PAGE y el manchado de Western se llevaron a cabo para determinar el tamaño y la cantidad relativa de la proteina expresada.
__ .__. gg^g^l^ Ejemplo 8 - Actividad de la Fitasa de PhyA en Pichia
La construcción de la expresión que utiliza el factor alfa como el péptido de la señal para phyA fue transformada en dos cepas de Pichia. La KM71 es una cepa lenta de utilización del metanol, mientras que X33 es un tipo silvestre de Pichia que utiliza el metanol eficientemente. La selección y la incubación se llevaron a cabo en frascos de agitación de 10 mi bajo 29-30 °C. Para los transformantes de KM71, 19 de 20 colonias tomadas tuvieron actividad de fitasa extracelular mayor que 6 unidades/ml del sobrenadante del cultivo después de la inducción durante 24 horas. La colonia No. 13 mostró la actividad más elevada de 26 unidades/ml después de incubada durante 108 horas. Para los transformantes de X33, todas las colonias (20/20) tuvieron más de 10 unidades/ml después de inducidas durante 24 horas. Una de las colonias (#101) produjo la actividad de la fitasa de 65 unidades/ml del sobrenadante. Un estudio del transcurso del tiempo de la expresión de la fitasa en KM71 y X33 se resume en la Figura 11. A pesar de la diferencia de estas dos cepas en la utilización del metanol y, por lo tanto, de la capacidad en la expresión de la fitasa, se encontró que el factor alfa fue procesado correctamente por las células de levadura. Además, casi la totalidad de la proteina expresada fue
gQ& jj ¿% secretada en el medio puesto que no más del 5 % de la actividad total expresada se encontró intracelularmente. Los efectos del fósforo inorgánico y del pH del medio sobre la expresión de la fitasa fueron estudiados en el medio (MBGY y BMMY) utilizando un recombinante de phyA de X33 (#101) . El medio que contiene el fosfato 50 mM produjo la actividad de fitasa más elevada, 66 unidades/ml a 168 horas después de la inducción. Incluyendo el fosfato 50 mM en el medio, el efecto de un pH diferente de esta solución amortiguadora (3, 4, 5, 6, 7, y 8) sobre la expresión, también fue estudiado. Cuando el pH fue de 6, este transformante X33 produjo 75 unidades de fitasa/ml del sobrenadante. Con base en la concentración de la proteina y el análisis de SDS-PAGE, el rendimiento de la proteina de la fitasa de expresión se estimó que va a estar entre 3 y 4 mg/ml .
Ejemplo 9 - Propiedades de la Fitasa de PhyA Expresada en Pichia
Tamaño molecular y desglicosilación de la fitasa expresada. Después que el sobrenadante del medio inoculado con el transformante de phyA se sometió a SDS-PAGE, una banda fuerte de alrededor de 95 kDa fue observada (Figura 12) . Esta fue casi la única proteina observada en el
¡^g^^t sobrenadante. La fitasa expresada reaccionó eficientemente con el anticuerpo policlonal de conejo fabricado o cultivado contra la fitasa de A. niger natural purificada. Esto indicó que la inmunorreactividad de la fitasa expresada fue esencialmente la misma que aquella de la fitasa natural de A. niger. El tamaño fue reducido a 50 kDa por desglicosilación utilizando Endo H. El anticuerpo de phyA también se hizo reaccionar con la fitasa desglicosilada. Ada :s, la desglicosilación, conducida bajo condiciones naturales, redujo la actividad de la fitasa aproximadamente lb%, indicando que la glicosilación fue importante para la actividad de las fitasas. Además, la glicosilación afectó la termoestabilidad de las enzimas (Figura 13) . Análisis de Northern. Como se mostró en la Figura 14, una sonda de AON de phyA de 1.3 kb hibridizada con el ARNm de los trans ormantes inducidos tanto de KM71 (#13) como de X33 (#101). La respuesta también fue observada de los transformantes pievio a la inducción. Probablemente, la expresión de ph\ - en este sistema no fue controlada estrictamente al c /el de la transcripción. pH y temperatura óptimas e hidrólisis de fitato- fósforo. De manera similar a la fitasa de A. niger, la fitasa expresada tu/o dos pH óptimos, 2.5 y 5.5 (Figura 15). La temperatura óptima de la fitasa expresada fue de 60
°C (Figura 16) . Cuando la fitasa expresada fue incubada con las muestras de soya a 100, 200, 400, 800 mU/g de la muestra a 37 °C, el fósforo fue liberado de un modo lineal con la dosis de fitasa (Figura 17).
Ejemplo 10 - Métodos y Materiales para la Sobreexpresión del Gen de E. coli appA en Saccharomyces cerevisiae
Gen y Proteina. Este gen, definido originalmente como el gen de la fosfohidrolasa del fosfoanhidrido periplásmico de E. coli (appA), contiene 1,298 nucleótidos (GenBank número de acceso: M58708). El gen se encontró primero que codifica una proteina de fosfatasa acida de pH óptimo de 2.5 (EcAP) en E. coli. La fostasa acida es un monómero con una masa molecular de 44,644 daltons. La EcAP madura contiene 410 aminoácidos (Dassa, J. y colaboradores, "The complete Nucleótide Sequence of the Escherichia coli Gene appA Reveáis Significant Homology Between pH 2.5 Acid Phosphatase and Glucose-1-Phosphatase", J. Bacteriology, 172:5497-5500 (1990), la cual es incorporada aqui para referencia). Ostanin, K. y colaboradores ("Overexpression, Site-Directed Mutagenesis, and Mechanism of Escherichia coli Acid Phosphatase", J. Biol. Chem., 267:22830-36 (1992), la cual se incorpora aqui para referencia), sobreexpresó appA en E. coli BL21 utilizando un vector pT7
e incrementó su actividad de fosfatasa acida en aproximadamente 400 veces (440 mU/mg proteina) . El gen y una cepa CU 1869 de E. coli (No. 47092) fueron comprados del ATCC. El gen, un inserto de 1.3 kb, fue transformado en la cepa BL21 de E. coli (No. 87441) utilizando un vector de expresión pAPPAl Ostanin, K. y colaboradores ("Overexpression, Site-Directed Mutagenesis, and Mechanism of Escherichia coli Acid Phosphatase", J. Biol. Chem., 267:22830-36 (1992), la cual se incorpora aqui para referencia) . Huésped y Vector. El vector para la sobreexpresión del gen appA en Saccharomyces cerevisiae fue pYES2 y el huésped fue INVScI (Invitrogen, San Diego, CA) . Construcción del Vector de Expresión. Inicialmente, un fragmento de Xbal de 1.3 kb fue aislado de pAPPl . Este fragmento contuvo el gen de appA con su propio péptido de la señal. Después de ser ligado en el sitio Xbal de pYES2, la construcción (PYES2-appA) se transformó en Saccharomyces cerevisiae. Pero, ninguna actividad de la fitasa fue incrementada en las partes ya sea extra- o intra-celular comparado con los controles. pAPPAl y pYPPl (PhyA y su péptido de la señal en pYES2) fueron cotransformados en la cepa de levadura. Nuevamente, ningún incremento en la actividad de la fitasa debida a pAPPAl se detectó en el medio o las células de levadura.
Dos cebadores fueron sintetizados para construir el péptido de la señal del gen PhyA con la región de codificación del gen appA. Uno fue de 80 pb de longitud que contiene el péptido de la señal de PhyA y el sitio Kpnl en el extremo 5' : GGG GTA CCA TGG GCG TCT CTG CTG TTC TAC TTC CTT TGT ATC TCC TGT CTG GAG TCA CCT CCG GAC AGA GTG AGC CGG AG (SEC ID No. 9) . El otro cebador fue de 24 pb de longitud, con un sitio EcoRI en su extremo 3' : GGG AAT TCA TTA CA ACT GCA GGC (SEC ID No. 10). La PCR se hizo correr durante 25 ciclos, con 1 min de desnaturalización a 95 °C, 1 minuto de recocido a 58 °C, y 1 minuto de extensión de la cadena a 72 °C. Un fragmento de 1.3 kb se amplificó, se digirió, y se ligó en pYES2. Después que el inserto fue confirmado por el mapeo de restricción, la construcción (pYES2-SphyA-appA) se transformó en INVScI por el método del acetato de litio. Expresión. Los transformantes seleccionados fueron inoculados en el medio YEPD. La expresión se indujo agregando galactosa en el cultivo después que la OD6oo alcanzó 2, como se describió previamente. Las células fueron colectadas 15 o 20 h después de la inducción. Ensayo de la Actividad. La actividad de la fostasa acida se evaluó a 37 °C en la solución amortiguadora de glicina-HCl 25 mM (pH 2.5), utilizando el fosfato de p-nitrofenilo como el substrato (material en
almacenamiento a 250 mM) . La solución amortiguadora de la reacción de 1.7 mi se agregó en muestras de 0.1 mi. Después que las mismas fueron incubadas durante 5 minutos en un baño de agua a 37 °C, 0.2 mi del substrato precalentado fueron agregados y mezclados. La solución de la reacción se transfirió hacia una cuba precalentada y se incubó durante 2 minutos en un compartimiento espectrofotométrico a 37 °C. El p-nitrofenol liberado fue leido continuamente durante 5 minutos a 405 nm para el cálculo de la actividad de la enzima. Estudio in vitro. La harina de soya (5.0 g) se suspendió en 20 mi de solución amortiguadora de citrato 20 mM, pH 5.5, se mezcla con 200 mU de fitasa, se incuba a 37 °C durante 4 h con agitación continua. Después de enfriamiento sobre hielo durante 10 minutos, la suspensión se transfiere hacia un tubo centrifugo y se hace girar durante 15 minutos a 15,000 x g. El sobrenadante se utilizó para determinar el fósforo libre.
Ejemplo 11 - Cuantificación de la Actividad de la fitasa a partir de la Sobreexpresión del Gen appA de E. coli en Saccharomyces cerevisiae
La actividad de la fostasa acida intracelular en el E. coli sobreexpresado en appA (pAPPAl) fue de 440 mU/mg
>=a¡^ ^^-ñSfás^^Ée^^^^s^e^ ^ de proteina. De manera sin precedentes, una actividad de fitasa intracelular mayor que 4900 mU/mg de proteina se encontró en la cepa transformada. Pero, existió solo una actividad de fitasa mínima en el control (BL21). Por consiguiente, este gen de fosfatasa acida también codifica una fitasa. La secuencia del gen de appA se alineó con aquella de PhyA y se encontró que estos dos genes compartieron 23% de identidad. La transformación del INVScl con la construcción de pYES2-Sphy-appA (conducida por el péptido de la señal de PhyA) produjo la actividad de la fitasa extracelular en el sobrenadante que fue 2,000 veces más grande que aquella del tipo silvestre o del transformante que contiene el gen appA más su propio péptido de la señal (Véase la Tabla 7) .
Tabla 7. Actividad de la fitasa extracelular en los transformantes del gen de appA con diferentes péptidos de la señal
Construcción Señal Actividad (mU/ml) Actividad (mU/mg proteina)
PYES-appA a p^ No detectable No detectable
pYES2-SphyA- PhyA l,15í 445 appA
Los efectos del fósforo inorgánico medio (YEPD) , el fitato, el pH, y la temperatura sobre la expresión de la actividad de la fitasa por pYES2-Sphy-A-appA son presentados en la Tabla 8. La actividad de la fitasa más elevada fue de 2,286 mU/ml (633 mU/mg proteina) a la condición óptima.
* J&»*Úá&*i>¿*l*s ---_ « ^^ Tabla 8. Efecto de las diferentes condiciones en el medio de YEPD sobre la expresión de la actividad de la fitasa de pYES2-SphyA-appA en la levadura.
Condiciones Medias Actividad (mU/ml)
Fósforo, mg/100 mi 0 1402 1 714 5 722 10 456 Fitato de sodio, g/100 mi 0 870 0.1 1019 1.0 1748 pH 5.0 892 7.0 996 8.0 2286 Temperatura, °C 25 312 30 1036 37 996
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La termoestabilidad" de la actividad de la fitasa extracelular sobreexpresada producida por el transformante de la levadura fue mayor que aquella de la fitasa intracelular producida por el E. coli transformado con pAAPl (Véase la Tabla 9) . El calentamiento de la fitasa extracelular durante 15 minutos a 80 °C condujo al 30% de pérdida de su actividad de fitasa, mientras que casi la totalidad de la actividad de la fitasa del E. coli fue perdida bajo la misma condición.
Tabla 9. Efecto del calentamiento de diferentes fuentes de fitasas bajo 80 °C durante 15 minutos sobre sus actividades
Fitasa Actividad relativa después del calentamiento, %
appA en E. coli 0.1 appA en S. cerevisiae 69 PhyA en S. cerevisiae 66 Fitasa de BASF 50
Las comparaciones del efecto de la liberación del fósforo a partir de la harina de soya por las fitasas (200 mU) de E. coli, la AppA sobreexpresada en la levadura, y de BASF son presentadas en la Tabla 10. Los resultados indican que la totalidad de las tres fuentes de las fitasas liberaron el fitato-fósforo de manera efectiva a partir de la harina de soya.
Tabla 10. Fósforo libre liberado de la harina de soya por diferentes fuentes de fitasas.
Fitasa Fósforo (mg/g)
appA en E. coli 1.11 appA en S. cerevisise 0.69 BASF 0.87
El gen appA de E. coli (fosfatasa acida) cuando se expresó en Saccharomyces cerevisiae produce una actividad de fitasa extracelular en el medio que fue de más de 2,000 veces más grande que el control. La fitasa sobreexpresada libera de manera efectiva el fitato-fósforo de la harina de soya, y parece que va a ser más termoestable que la fitasa comercial disponible actualmente o la fitasa intracelular producida en E. coli por el mismo gen (appA) .
Ejemplo 12 - Métodos y Materiales para la Sobreexpresión del Gen appA de E. coli Que Codifica una Fosfatasa Acida/fitasa en Pichia pastoris
Gen y Proteina. El gen appA y la cepa CU1867 de la cepa de E. coli del huésped (No. 47092) fueron obtenidos del ATCC. El gen, un inserto de 1.3 kb, fue transformado en la cepa BL21 de E. coli (No. 87441) utilizando un vector de expresión pAPPAl (Ostanin, K. y colaboradores "Overexpression, Site-Directed Mutagenesis, and Mechanism of Escherichia coli Acid Phosphatase", J. Biol . Chem. , 267:22830-36 (1992), la cual se incorpora aqui para referencia) . Huésped y Vector. Un Juego de Expresión de Pichia EasySelect® fue obtenido de Invitrogen (San Diego, CA) . El juego o conjunto proporciona huéspedes y vectores para expresar el gen ya sea intracelular o extracelularmente en la cepa del tipo silvestre (X-33) . Dos vectores fueron utilizados, pPICZ B (3.3 kb) y pPICZaA (3.6 kb) , ambos utilizan AOXl como el promotor. Construcción del Vector de Expresión. Dos cebadores fueron utilizados para amplificar el gen appA de
* - .w- t ^ - ,. ^¿^fe¿ _ * , ' s®&&&¡k íz & ¿« . « pAPPAl y dos sitios de regts?icción EcoRI y Kpnl fueron producidos en los extremos 5' y 3' , respectivamente. Cebador corriente arriba: GGA ATT CCA GAG TGA GCC GGA (SEC ID No. 11) Cebador corriente abajo: GGG GTA CCT TAC AAA CTG
CAC G (SEC ID No. 12) Molde: ADN de pAPPPAl aislado de ATCC 87441 La PCR se hizo funcionar durante 30 ciclos, con 1 min de desnaturalización a 94 °C, 1 min. de recocido a 55 °C, y 1 min de extensión de la cadena a 72 °C. Se amplificó un fragmento de 1,245 pares base, digerido con EcoRI y Kpnl, y se unió (16 °C toda la noche) en pPICZ B (3.3 kb) y pPICZocA (3.6 kb) . La unión se confirmó por el mapeo de restricción después de la transformación de las construcciones en DH5a. Transformación de la construcción en Pichia (X33) . Para cada transformación, 100 µg del ADN del plásmido se prepararon y se linearizaron por la digestión con Pmel. Después de la linearización, el ADN se purificó y se resuspendió en 10 µl de agua desionizada, estéril. La mitad de la cantidad del ADN se utilizó realmente para cada transformación. La electroporación y el juego químico de EasyComp (Invitrogen) fueron utilizados ambos para transformar el ADN en X33. En el caso de la electroporación, se utilizan el dispositivo Electro Cell
^^j^^^ ^g^^^^^^^^^j^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^ ^^^^^ Manipulator (ECM 600, Gentromics, BTX Instrument División, San Diego, CA 92121) y cubas de 2 mm. La resistencia fue de 186 Ohmios, el voltaje de carga fue de 1.5 kilovoltios, y la duración de la carga real fue de aproximadamente 7 milisegundos. Las células electroporadas se incubaron sobre placas de agar de YPD que contienen 100 mg de Zeocina/ml a 30 °C durante 2-4 dias para el crecimiento de las colonias. En el caso de la transformación química, las células se hicieron crecer L- re las placas de agar de YPDS que contienen 100 mg de Zeocina/ml. Comparado con la electroporación, el método químico tuvo una eficiencia de transformación inferior. Expresión. Las colonias únicas fueron inoculadas en 10 mi del medio MGY (tubo de 30 mi) y se hicieron crecer (16-18 h) a OD6oo de 5-6 a 28-30 °C en un incubador de agitación (200 rpm) . Las células fueron colectadas por centrifugación (2,000 rpm) y se resuspendió en 10 mi del medio BMMY (que contiene 0.5% de metanol) para inducir la expresión. Las muestras (200 µl) fueron colectadas cada 12 o 24 horas desp?' s de la inducción. Se agregó metanol (100%) a 100 µl Cada 24 h para mantener una concentración de 0.5-1% en el mpdio. Ensayos? . Las células fueron separadas del medio (sobrenadante) y ;e Usaron con perlas de vidrio en una solución amortiguadora de ruptura. La actividad de fitasa
extracelular en el sobrenadante y la actividad de la fitasa intracelular en las células Usadas fueron evaluadas como se describió previamente (solución amortiguadora de citrato 0.2 M, pH 5.5 bajo 37 °C utilizando fitato de sodio 10 mM) . La actividad de la fosfatasa acida se evaluó a 37 °C en 25 mM de solución amortiguadora de glicina-HCl (pH 2.5), utilizando el fosfato de p-nitrofenilo como el substrato (materia prima a 250 mM) . La solución amortiguadora de la reacción de 1-7 mi se agregó en muestras de 0.1 mi. El p-nitrofenol liberado se leyó continuamente durante 5 minutos a 405 nm para el cálculo de la actividad de la enzima. La SDS-PAGE (12%) se llevó a cabo para determinar el tamaño y la cantidad relativa de la proteina expresada. El pH y la temperatura óptimos de la fitasa expresada fueron determinados como se describió en los resultados. Estudio in vitro. La harina de soya (5.0 g) se suspendió en 20 mi de solución amortiguadora de citrato 20 mM, pH 5.5, se mezcló con diferentes niveles de fitasa, y se incubó a 37 °C durante 4 h con agitación continua. Después de ser enfriada sobre hielo durante 10 minutos, la suspensión se transfirió en un tubo de máquina centrifuga y de hizo girar durante 15 minutos a 15,000 x g. El sobrenadante se utilizó para determinar el fósforo libre.
Ejemplo 13 - Selección de la Actividad de Fitasa de la Colonia para la Sobreexpresión en Pichia pastoris del Gen appA de E. coli
La Pichia X33 del tipo silvestre produce una actividad de fitasa mínima intracelularmente (<0.03 U/mg de la proteina) o extracelularmente (<0.05 U/ml). Las células de X33 transformadas con el gen de appA insertado en pPICZB (sin el factor a y presumiblemente produce una fitasa intracelular) no mostró ningún incremento en la actividad de la fitasa (extracelular, 0.2 U/ml e intracelular, 0.05 Ug/mg proteina) . La transformación de las células X33 con la construcción de pPIZaA-appA (conducido por el péptido de la señal del factor a) produjo una actividad de fitasa extracelular en el medio. Inicialmente, 72 colonias fueron seleccionadas. Solo dos colonias tuvieron actividad <1 U/ml 40 horas después de la inducción. La mayoría de las colonias tuvo una actividad que varia desde 10 hasta 20 U/ml 40 horas después de la inducción. La totalidad de las 70 colonias tuvieron actividad de la fitasa >80 U/ml 118 horas después de la inducción. La actividad de la fitasa más elevada asi detectada fue de 215 U/ml, 192 horas después de la inducción (Véase la Tabla 11) .
Tabla 11. Intervalo de actividad de la fitasa extracelular en las colonias de X33 transformadas con pPIZotA-appA 40 y 118 horas después de la inducción
Número de colonias 40 horas después 118 horas después de la inducción de la inducción
2 <1 U/ml 10 6 1 a 10 U/ml 36 11 a 20 U/ml 28 >20 U/ml
70 >80 U/ml 15
Las actividades de la fitasa y la fosfatasa acida en el transformante que expresa la actividad/ml de la fitasa 215U fueron comparadas con aquellas de la del tipo
20 silvestre de X33 (192 horas después de la inducción) (Véase la Tabla 12) . Casi la totalidad de la proteina de fitasa expresada fue secretada de las células, que indican que el factor a fue un péptido de la señal muy efectivo para la secreción de fitasa. 25
la fosfatasa acida en tipo silvestre de X33 192 horas después de la inducción. X33 tipo silvestre transformante de pPIZotA-appA
Extracelular Intracelular Extracelular Intracelular U/ml U/mg protelna U/ml U/mg proteína
Fitasa 0.05 0.03 215 0.5
Fosfatasa 0.01 0.002 5.88 0.9
Acida
Los transformantes de E. coli con el mismo gen appA de la fosfatasa acida tuvieron una actividad de la fitasa intracelular de 5 U/mg de proteina (Ostanin, K. y colaboradores "Overexpression, Site-Directed Mutagenesis, and Mechanism of Escherichia coli Acid Phosphatase", J^ Biol. Chem., 267:22830-36 (1992), la cual se incorpora aqui para referencia) . La transformación del gen de PhyA en A. niger produjo una actividad extracelular de 7.6 U/ml ( (Hartingsveldt y colaboradores, "Cloning, Characterization and Overexpression of the Phytase-Encoding Gene (phyA) of Aspergillus Niger", Gene 127:87-94 (1993), la cuál es
^Si &^s^Sn^,..: incorporada aqui para referencia) . Comparado con estos resultados, el sistema de expresión de la fitasa en Pichia es un sistema de expresión muy eficiente.
5 Ejemplo 14 - Transcurso del Tiempo de la Expresión de la Fitasa
Existió un incremento lineal en la actividad de la fitasa extracelular en el medio casi en la totalidad de 10 las colonias seleccionadas hasta 192 horas después de la inducción. La Figura 18 resume los cambios de la actividad de cinco colonias seleccionadas desde 24 hasta 163 horas después de la inducción.
15 Ejemplo 15 - Efectos del pH del Medio sobre la Expresión de la Fitasa (Colonia # 23, Actividad 136 U/ml a 186 h)
Utilizando 0.1 M del medio amortiguado con fosfato, los efectos de un pH diferente sobre la producción 20 de la fitasa extracelular en los transformantes fueron estudiados contra un medio de control sin amortiguador (pH 7.0). El medio amortiguado a pH 6 produjo la actividad de fitasa más elevada (Véase la Figura 19) .
Ejemplo 16 - Tamaño/- de la Fitasa Extracelular Expresada
Utilizando el análisis de SDS-PAGE (gel al 12%), se percibió una banda clara en el sobrenadante del medio del cultivo inoculado con tres colonias diferentes (Véase la Figura 20) . El tamaño fue de aproximadamente 55 kDa, probablemente glicosilado parcialmente. A causa de que la proteina expresada apresentó casi la única banda visible en el sobrenadante, podria ser conveniente colectar el producto de la enzima sin la necesidad de una purificación tediosa.
Ejemplo 17 pH y Temperatura Óptimos de la Fitasa Extracelular Expresada (Colonia # 23)
El pH opCmo de la fitasa expresada fue de 2.5 a 3.5 (Véase la Figura 21). Este es significativamente diferente de aquel de la fitasa de phyA ya sea de A. niger (BASF) o de lo.s otros sistemas de expresión de la invención. Esto e¿ _deal para la función de la fitasa al pH del estómago. La termcctura óptima de la enzima expresada fue de 60 °C (Véase l F gura 22).
£ t&&&?*>z ?¡fr.¿iiae*)sk.-<< . Ai » A» ... - «, ...<s. &>»-Ejemplo 18 - Efecto de la Fitasa Expresada sobre la Hidrólisis de Fitato-Fósforo de la Harina de Soya
Esta fitasa de E. coli sobreexpresada (Colonia #23) hidrolizó de manera efectiva el fitato-fósforo de la harina de soya (Véase la Figura 23) . La liberación del fósforo libre en la mezcla fue lineal desde 0 hasta 800 mU de la fitasa/g de la alimentación.
Ejemplo 19 - Efectos de la Fitasa de AppA de E. coli Expresada por Pichia pastoris sobre la Biodisponibilidad del Fitato Fósforo para Cerdos Destetados
Para determinar los valores nutricionales de la fitasa de E. coli expresada por Pichia en las dietas de los cerdos, la eficacia de esta nueva fitasa se comparó con aquellas del fósforo inorgánico o de la fitasa microbiana disponible comercialmente (Natuphos®, BASF Corp, Mt . Olive,
NJ) . Cuarenta y cinco cerdos destetados fueron seleccionados de las cerdas multíparas en la Cornell Swine
Research Farm. Los cerdos fueron destetados a los 21 dias de edad y alimentados con una alimentación para subir lentamente, comercial, hasta el dia 28. Los mismos se colocaron entonces dos por corral con seis corrales asignados al azar por tratamiento. A los cerdos se les dieron dos semanas para ajustarse a la dieta basal de harina de soya-maiz (Tabla 13) .
Tabla 13. Formulación de las Dietas Experimentales para los Cerdos
+c C YP MP Ingredientes % dieta % dieta % dieta % dieta
Maiz 60.5 61.57 61.07 61.07 Concentrado de Proteína de 3 3 3 3 Trigo SBM 44% 30 30 30 30 Aceite de Maíz 3 3 3 3 Cal 0.8 0.93 0.93 0.93 Fosfato de di-calcio 1.2 0 0 0 Premezcla de vitaminas y 0.5 0.5 0.5 0.5 minerales Premezcla de ECAP 0 0 0.5 0 Premezcla de MP 0 0 0 0.5 Sal 0.5 0.5 0.5 0.5 CSP 250 0.5 0.5 0.5 0.5 Total 100 100 100 100
¿¿»i^^^¿_aa¿^^^^.^-____¿fi^fe?^a^^,<,¡.^¿'^(, - „ ;t ., j-,»»&->,fr,.)jfcj¡ajs¿ Tabla 13. Continuación
CP 20.6 20.6 20.6 20.6 Ca 0.73 0.47 0.47 0.47 Ptotal 0.6 0.39 0.39 0.39
Nota: Todas las premezclas utilizan el maíz como el portador Suministro de la Premezcla de Vitaminas y Minerales: 2,540 UI Vit. A, 660 UI Vit. D, 15 UI Vit. E, 2.2 mg Vit. K, 3.3 mg Riboflavina, 13.2 mg ácido pantoténico, 17.6 mg de Niacina, 110.1 mg de Colina, 1.98 ug de B-12 37.4 mg de Mn, 0.6 mg de I, 10 mg de Cu, 0.3 mg de Se, 100 mg de Zn, y 100 mg de Fe por Kg de dieta
Luego, cada corral recibió una de las cuatro dietas de tratamiento. El grupo de control positivo (+C) recibió la dieta basal suplementada con el fosfato de dicalcio. El grupo de control negativo (-C) recibió justo la dieta basal. El grupo de fitasa de la levadura (YP) recibió la dieta basal suplementada con la fitasa de E. coli expresada a 1,200 U/kg de la alimentación. El grupo de fitasa microbiana (MP) recibió la dieta basal suplementada con la fitasa de BASF a 1,200 U/kg de la alimentación. A los cerdos se les dio acceso libre a la alimentación y el agua. La ganancia de peso corporal de los cerdos
individuales se registró por semana. La admisión de la alimentación diaria de los corrales individuales se registró diariamente. Las muestras de sangre de cada uno de los cerdos individuales fueron tomadas por semana a las concentraciones del fósforo inorgánico del plasma de ensayo. Los resultados del peso corporal (BW), la ganancia diaria promedio (ADG) , la admisión de la alimentación promedio (ADFI), y la relación de alimentación/ganancia (F:G), y el fósforo inorgánico del plasma (PP) son presentados en la Tabla 14.
¿t±^^^i -*"*-•-**- Tabla 14. Resumen de PP, 'BW, ADG, ADFI, y F:G de los Cerdos cuando se llevó a cabo por l Fitasa de la Dieta1.
+C -C YP MP
Inicial PP 12.99 13.02 13.07 13.54 BW 1 1.54 1 1.63 12 1 1.5 Sanana 1 PP 10.83A 6.48c 8.59B 8.35B BW 14 13.83 14.29 13.92 ADG .351 .316 .327 .345 ADFI .700 .684 .697 .697 F:G ?.04 2.20 2.18 2.13 Semana 2 PP 9.76A 5.64° 8.72B 7.84c BW 18.04 17.42 17.83 17.71 ADG .578 .512 .506 .542 ADF1 .833 .855 .784 .837 F:G 1 .46B 1 .67A 1.56AB 1.55AB Semana 3 PP I I A 6.26c 8.64B 8.13B BW 22.58 21.17 22 22.21 ADG .649A .- O .595AB .643AB ADFI 1 .166 1.02 1.001 1.003 F:G 1.8 1.92 1.71 1.36 Semana 4 PP 10.94A 6.31c 9.65B 9.2B BW 27.54 25.29 27.79 27.38 ADG 7 gAB .589B .827A .738AB ADFI 1 ?95A 1 049B 1 .309A 1.273AB F:G 1 .98 1.87 1.59 1.73
1 Los números en la misma hilera sin compartir una letra común son significativamente diferentes. El análisis de la diferencia se llevó a cabo con las pruebas T de Bonferroni (Dunn) con alfa=0.05 y df=20
Además, existió una deficiencia severa en el fósforo en el grupo de control negativo al final del experimento de la cuarta semana. Pero, no existe señal de deficiencia del fósforo en los otros tres grupos. Claramente, la f i tasa de E. coli expresada por Pichia fue al menos, si no es que más, efectiva que la fitasa comercial en la rrejora de la biodisponibilidad del fitato-fósforo de las die-tas de harina de soya-maiz para cerdos destetados. La mis... puede ser utilizada para reemplazar el suplemento de fósforo inorgánico a los cerdos destetados.
Ejemplo 20 - Efectos de la Fitasa de AppA de E. coli Expresada por Páchia pastoris sobre Hierro (Fe) y la Biodisponibilidad del Fitato Fósforo para los Cerdos Destetados
Para determinar el efecto de la fitasa de E. coli sobreexpresada per Pichia sobre del Fe unido al fitato dietario para los ce dos destetados, 20 cerdos anémicos (21 dias de edad y 7._ g de hemoglobina (Hb)/dl sangre) fueron seleccionados. l ; cerdos fueron alimentados con una alimentación de ascenso de peso lento deficiente en Fe durante 7 dias y se alojaron en jaulas metabólicas a la edad de 28 dias dt edad. Los cerdos fueron alimentados entonces con las dietas experimentales a la edad de 35
>.^«?rt- %*tv '>illt?»Jgtof dias de edad durante 5 semanas. Las dietas de tratamiento fueron como sigue: La dieta básal deficiente en Fe (-C, con fósforo inorgánico agregado) , la dieta suplementada con Fe (+C) , la dieta deficiente en Fe y fósforo suplementada con la fitasa de E. coli expresada (YP) , o la fitasa microbiana comercial (BASF, MP) a 1,200 U/kg de la alimentación. El peso corporal (EW) , el volumen de las células empacadas (PCV), el Hb, y el fósforo inorgánico del plasma (PP) fueron determinados por semana. Los resultados son
10 presentados en la Tabla 15.
15 20 25 Tabla 15. Resumen de PCV, Hb, BW, y PP de los Cerdos como es efectuado por la Fitasa de la Dieta1. +C -C YP MP
Tnirial PCV 25 25 26 24 Hb 7.73 7.22 7.85 7.08 BW 8.14 8.27 8.17 7.45 PP 7.92 7.76 7.21 7.36 Semana 1 PCV 25 26 29 27 Hb 7.62 8.3 8.77 7.88 BW 9.44 8.84 9.63 8.57 PP 8 41 8.45 8.48 8.22 Semana 2 PCV 29 26 30 28 Hb 8.6 7.34 8.93 8.27 BW 12.32 10.13 1 1.91 10.84 PP 10.28a 9.05ab 8.89ab 8.22a Semana 3 PCV 36a 29b 34a -< -« a JJ Hb 1 1.55a 8.2b 10.84a 9.96ab BW 16.77a 13b 15.62ab 14.62ab PP 12.14a 1 1.37ab 10.25bc 9.71c Semana 4 PCV 39 34 38 36 Hb 12.99a 10.1 1 b 12.27a 1 1.35ab BW 21.36a 17.37b 19.44ab 18.56ab PP 10.19a 9.34ab 9.49ab 8.8b Sanana 5 PCV 40 38 40 39 Hb 13.52a 12.24 13.64a 13.13ab BW 26.53 22.59 24.27 23.43 PP 9.27a 8.95ab 8.79ab 8.02" 1 Los valores son los promedios (n=5) . Los promedios dentro de la misma hilera sin compartir una letra de subíndice común son significativamente diferentes (P < 0.10).
""^""^ " • "*~ ' '*¿***»*»**¿ti'*- * - ~ - «-s*- *~?~ &.
En conclusión, la fitasa de E. coli sobreexpresada por Pichia fue al menos tan efectiva como la fitasa de BASF en la mejora del fitato-fósforo y la utilización de Fe en las dietas de maiz-soya para cerdos destetados. Aunque las modalidades preferidas han sido mostradas y descritas con detalle aqui, será evidente para aquellas personas expertas en la técnica que varias modificaciones, adiciones, substituciones, y semejantes se pueden hacer sin apartarse del espíritu de la invención y estas por lo tanto son consideradas dentro del alcance de la invención como se definen en las reivindicaciones que siguen.
LISTADO, DE LAS SECUENCIAS
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20 <210> 1 <211> 22 <212> ADN <213> Secuencia Artificial
25 <220>
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador para la Amplificación y Clonación por PCR
<400> 1 cggaattcgt cacctccgga ct 22
<210> 2 <211> 24 <212> ADN <213> Secuencia Artificial
<220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador para la Amplificación y Clonación por PCR
<400> 2 cccaagcttc taagcaaaac actc 24
<210> 3 <211> 22 <212> ADN <213> Secuencia Artificial
<220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador para la Amplificación y Clonación por PCR
<400> 3
cagctatgac catgattacg ce 22
<210> 4 <211> 26 <212> ADN <213> Secuencia .Artificial
<220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador para la Amplificación y Clonación por PCR
<400> 4 ectagaaegg gaattcat?_g gccgcc 26
<210> 5 <211> 24 <212> ADN <213> Secuencia Artificial
<220> <223> Descripció' de la Secuencia Artificial: Cebador para
^?&its¿Z* #*^ -^^ ^ ^^t^ ^^^^^^i^ la Amplificación y Clonación por PCR
<400> 5 cccaagcttg atcacatcca ttca 24
<210> 6 <211> 25 <212> ADN <213> Secuencia Ar:ificial
<220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador para la Amplificación y Clonación por PCR
<400> 6 cggggactgc tagcgaacgt tcgat 25
<210> 7 <211> 28 <212> ADN <213> Secuencia Artificial
<220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador para la Amplificación y Clonación por PCR
- ^^M?.
<400> 7 atcgaacgtg cgctagcagc agtccccg 28
<210> 8 5 <211> 24 <212> ADN <213> Secuencia Artificial
<220> 10 <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador para la Amplificación y Clonación por PCR
<400> 8 gctctagact aagcaaaaca ctcc 24 15 <210> 9 <211> 80 <212> ADN <213> Secuencia Artificial 20 <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador para la Amplificación y Clonación por PCR
25 <400>
ggggtaccat gggcgtctct gctgttctac ttcctttgta tctcctgtct ggagtcacct 60 ccggacagag tgagccggag 80
<210> 10 <211> 24 <212> ADN <213> Secuencia Artificial
<220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador para la Amplificación y Clonación por PCR
<400> 10 gggaattcat tacaaactgc aggc 24
<210> 11 <211> 21 <212> ADN <213> Secuencia Artificial
<220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador para la Amplificación y Clonación por PCR
»tjggfr» -. -**-££, «e* ^áSS^- *- "^ ^ a <400> 11 ggaattccag agtgagccgg a 21
<210> 12 5 <211> 22 <212> ADN <213> Secuencia Artificial
<220> 10 <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador para la Amplificación y Clonación por PCR
<400> 12 ggggtacctt acaaactgca cg 22
15 Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención. 20 Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes
25
MÍS. . » .. ,-.. ^ . ^ *.Jfe&?.*~.? &kass&
Claims (9)
1. Un método para la producción de una fitasa en levadura, caracterizado porque comprende: proporcionar un gen heterólogo el cual codifica una proteina o polipéptido con actividad de fitasa, y expresar el gen en una cepa de levadura.
2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la proteina o el polipéptido, conducido por un péptido de la señal, es secretado por la célula en el medio de crecimiento o solo expresado intracelularmente.
3. El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque la proteina o el polipéptido es secretado en el medio de crecimiento y tiene una concentración mayor que 300 unidades/ml.
4. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el gen heterólogo el cual codifica una proteina o polipéptido con la actividad de la fitasa es empalmado en el marco con un elemento mejorador de la transcripción.
5. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el gen heterólogo es transportado sobre un vector estable.
6. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el gen heterólogo es transportado sobre un cromosoma artificial.
7. El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado porque el gen heterólogo es integrado en el cromosoma de la cepa de levadura.
8. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el gen heterólogo es aislado de las células vegetales.
9. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el gen heterólogo es aislado de las células fungosas. ^^^j?g^? g¿*a^
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