MX2014000303A

MX2014000303A - Soporte de filtro con un medio de cambio de fase.

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Publication number: MX2014000303A
Application number: MX2014000303A
Authority: MX
Inventors: Menno Willem Jose Prins; Mikhail Mikhaylovich Ovsyanko; Freek Van Hemert; Arie Rombertus Van Doorn
Original assignee: Koninkl Philips Nv
Priority date: 2011-07-13
Filing date: 2012-07-04
Publication date: 2014-02-20
Also published as: US20140147883A1; MX344505B; US9291533B2; JP2014523534A; JP6096769B2; EP2546628A1; CN103649714A; CN103649714B; EP2732261A1; WO2013008142A1

Abstract

La presente invención se relaciona con un método para procesar células aisladas, en particular células tales como células de tumores circulantes, para hacerlas adecuados para imaginología óptica, comprendiendo las etapas de (a) depositar material filtrante que comprende células capturadas sobre un medio de cambio de fase; (b) fundir el medio de cambio de fase hasta que el medio se disperse fuera del material filtrante; y (c) descender la temperatura del medio de cambio de fase hasta que el medio solidifique, dando como resultado un filtro ópticamente plano que comprende las células en una posición fija. El método puede comprender además una etapa inicial de captura de una célula sobre un material filtrante. El medio de cambio de fase, preferentemente cera parafínica, puede comprender una estructura porosa o semejante a malla que permite el paso de un fluido a través del medio. El medio de cambio de fase puede montarse además sobre un portador tal como un portador de vidrio o un portador de material polimérico. La presente invención se relaciona además con un material filtrante procesado que comprende células aisladas adecuadas para imaginología óptica, que puede obtenerse por medio del método; el uso de el material filtrante para análisis de diagnóstico, histológico, microbiológico, bioquímico, oncológico, o hematolágico, así como un dispositivo para aislar células o procesar células para hacerlas adecuadas para imaginología óptica.

Description

SOPORTE DE FILTRO CON UN MEDIO DE CAMBIO DE FASE Campo de la Invención La presente invención se relaciona con un método para procesar células aisladas, en particular células tales como células de tumores circulantes, para hacerlas adecuados para imaginología óptica, comprendiendo las etapas de (a) depositar material filtrante que comprende células capturadas sobre un medio de cambio de fase; (b) fundir el medio de cambio de fase hasta que el medio se disperse fuera del material filtrante; y (c) descender la temperatura del medio de cambio de fase hasta que el medio solidifique, dando como resultado un filtro ópticamente plano que comprende las células en una posición fija. El método puede comprender además una etapa inicial de captura de una célula sobre un material filtrante. El medio de cambio de fase, preferentemente cera parafínica, puede comprender una estructura porosa o semejante a malla que permite el paso de un fluido a través del medio. El medio de cambio de fase puede montarse además sobre un portador tal como un portador de vidrio o un portador de material polimérico. La presente invención se relaciona además con un material filtrante procesado que comprende células aisladas adecuadas para imaginología óptica, el cual puede obtenerse por medio del método; el uso de el material filtrante para análisis de Ref. 244996 diagnóstico, histológico, microbiológico, bioquímico, oncológico, o hematológico, así como un dispositivo para aislar células o procesar células para hacerlas adecuadas para imaginología óptica.

Antecedentes de la Invención La metástasis, es decir, la diseminación del cáncer desde un sitio primario a sitios secundarios no adyacentes es uno de los mayores retos de la investigación, la diagnosis y el tratamiento del cáncer. Se cree que la metástasis se desarrolla a través de una serie de pasos que incluyen la invasión localizada, la intravasación, el transporte a través de circulación, el bloqueo en microvasos, la extravasación, la formación de micrometástasis , latencia, angiogénesis , colonización y formación de macrometástasis (Weinberg, 2007, The biology of cáncer, Garland Science, Nueva York) . Durante su transporte en el sistema circulatorio, en particular en el torrente sanguíneo, las células tumorales se conocen como células tumorales circulantes (CTC, por sus siglas en inglés) . Se considera que las CTC juegan un papel crítico en la diseminación metastásica de carcinomas, es decir de malignidades del epitelio. Su detección tiene por lo tanto implicaciones de pronóstico y terapéuticas importantes y está asociadas entre otras cosas con la etapa clínica, la recurrencia de la enfermedad, la respuesta al tratamiento y la supervivencia del paciente. Las CTC se ven además como marcadores sustitutos independientes, para evaluar el riesgo de recaída y el curso del tratamiento.

Sin embargo, las CTC son extremadamente raras en el torrente sanguíneo y se hallan solo con una frecuencia de 1-10 células por mi de toda la sangre en pacientes con enfermedades metastásicas , en comparación con 109 glóbulos rojos y varios millones de glóbulos blancos que pueden encontrarse en el mismo volumen. Por lo tanto es necesario seleccionar y enriquecer estas células tumorales circulantes raras. Tradicionalmente , el proceso de enriquecimiento se basaba en diferencias de densidad de las CTC, que se separaban por centrifugación por densidad. Sin embargo, las tasas de recuperación son muy pobres. Más recientemente, el enriquecimiento de CTC se basaba en la identificación de marcadores superficiales específicos, en particular la molécula de adhesión epitelial (EpCAM) . Consecuentemente las CTC pueden enriquecerse inmunomagnéticamente , por ejemplo por medio de nanopartículas ferrofluídicas . Sin embargo, este enfoque está impedido por un amplio intervalo de recuperación de aproximadamente 10 a 90 %, lo cual de debe aparentemente a la expresión variable de los marcadores superficiales (Zheng y colaboradores, 2011, Biomed Microdevices , 13: 203-213).

Como una alternativa para el aislamiento de CTC se ha propuesto el uso de métodos de exclusión por tamaño de células en particular debido al hecho de que las CTC son células epiteliales en muchos casos más grandes que las células sanguíneas de los alrededores. Se han desarrollado varios tipos de filtros incluyendo filtros de policarbonato que comprenden poros en sitios aleatorios, filtros microfabricados , filtros bidimensionales de capa simple microfabricados , filtros microfluídicos basados en campos eléctricos, dispositivos de matrices de microcavidades de filtros basados en electroformación de níquel o dispositivos de microfiltros tridimensionales (Zheng y colaboradores, 2011, Biomed Microdevices , 13: 203-213). Se han desarrollado enfoques similares para la selección de otros tipos de células, por ejemplo células bacterianas en el torrente sanguíneo o en ciertas formas de muestras, células de médula ósea o células del bazo, etc.

Sin embargo, la selección de células específicas de una solución es solo el primer paso de una secuencia de reacciones necesarias para determinar las propiedades de células, por ejemplo sus características metastásicas. Por lo tanto, después de haberse aislado, las células se someten típicamente a procedimientos de tinción y diferenciación óptica. El material filtrante durante estas etapas subsiguientes generalmente es difícil de manipular, es delgado, frágil y puede romperse con facilidad.

Además, los filtros con frecuencia con corrugados y no son ópticamente planos, complicando por lo tanto el proceso de imaginología óptica de las células. Aunque la técnica anterior proporciona enfoques para superar este problema, por ejemplo, usando perlas inmunomagnéticas e imanes para atraer las células hacia una cubierta de microscopio, los métodos son complejos, consumen tiempo o necesitan equipo especializado .

Por lo tanto existe una necesidad de proporcionar medios y métodos, que permitan la manipulación de material filtrante que comprende células aisladas de tal manera que las células capturadas puedan visualizarse rápidamente y con precisión sobre el material filtrante.

Breve Descripción de la Invención La presente invención soluciona estas necesidades y proporciona medios y métodos para procesar células aisladas para hacerlas adecuadas para imaginología óptica. El objetivo anterior se alcanza en particular por medio de un método para procesar células aisladas para hacerlas adecuadas para imaginología óptica, comprendiendo las etapas de (a) depositar material filtrante que comprende células capturadas sobre un medio de cambio de fase, el medio de cambio de fase montado sobre un portador; (b) fundir el medio de cambio de fase hasta que el medio se dispersa bajo el material filtrante; y (c) descender la temperatura del medio de cambio de fase hasta que el medio solidifica, dando como resultado un filtro ópticamente plano que comprende las células en una posición fija. El método proporciona la ventaja de que las células filtrables tales como células tumorales circulantes pueden procesarse para etapas de análisis óptico subsiguiente de manera simple, breve y precisa. En particular se ha encontrado que las células pueden visualizarse con un contraste muy alto en microscopios de campo brillante estándar, incluso sin ninguna tinción. La explicación para las propiedades de alta calidad observadas de células procesadas es que el medio dispersa luz y suprime reflexiones del material filtrante, los componentes ópticos y el material de soporte . El presente método establece por lo tanto una superficie filtrante ópticamente plana en una forma muy dócil. Además, las células procesadas sobre el filtro son aún accesibles para tinción, fijación, manipulación biológica o mecánica o enfoques de cultivo. Además, se puede evitar una deformación del área superficial durante etapas de manipulación subsiguientes mediante una fijación sobre materiales portadores tales como el vidrio. La metodología desarrollada está por lo tanto bien adaptada para el procesamiento de tipos de células derivables de muestras de sangre, el partículas CTCs . Además, puede aplicarse generalmente a cualquier situación, en la cual las células (de cualquier origen, tipo o tamaño) están presentes sobre un material filtrante, por ejemplo células que requieren un análisis óptico subsiguiente.

En una modalidad preferida de la presente invención el método como se definió arriba adicionalmente comprende la etapa inicial de capturar una célula sobre un material filtrante .

En una modalidad adicional preferida de la presente invención el material filtrante es capaz de aislar células por exclusión de tamaño de un fluido o una solución. El material filtrante puede tener preferentemente un tamaño de poros de aproximadamente 0.5 a 20 µp?, más preferentemente de aproximadamente 8 µp?. En modalidades adicionales preferidas de la presente invención el material filtrante como se definió arriba es un filtro de polímero, más preferentemente un filtro de policarbonato, de parileno o de nylon. En aún otra modalidad preferida de la presente invención el material filtrante como se definió arriba es un filtro que no es de polímero, más preferentemente un filtro de silicio. En aún otra modalidad preferida de la presente invención el material filtrante es un microfiltro tridimensional.

En otra modalidad preferida de la presente invención el medio de cambio de fase es un medio que funde y solidifica en un intervalo de temperaturas de aproximadamente 25 °C a 70 °C.

En una modalidad adicional preferida el medio de cambio de fase como se menciona arriba comprende una estructura porosa, semejante a malla, abierta, o parcialmente abierta y/o comprende elementos de canal, pasaje o tubo, en donde la estructura o elementos permiten el paso de un fluido a través del medio.

En aún otra modalidad preferida de la presente invención el medio de cambio de fase es una cera parafínica, preferentemente una cera parafínica que tiene una fórmula molecular de CnH2n+2 siendo n = 20 a 40.

En aún otra modalidad preferida de la presente invención, el medio de cambio de fase como se menciona arriba está montado sobre un portador. En una modalidad particularmente preferida de la presente invención, el portador es un portador de vidrio o un portador de material polimérico. En una modalidad adicional preferida el portador, por ejemplo portador de vidrio o material polimérico comprende un marcador de posición.

En una modalidad adicional preferida el método como se describió aquí arriba comprende como etapa adicional una actividad seleccionada del grupo de tinción, fijación, liberación, manipulación mecánica, manipulación biológica y manipulación bioquímica de las células aisladas.

En una modalidad particularmente preferida de la presente invención la actividad comprende cultivar las células aisladas, preferentemente mediante el flujo de fluido nutriente a través del medio de cambio de fase poroso, semejante a malla, abierto o parcialmente abierto.

En otra modalidad preferida de la presente invención la célula que será aislada o que está presente sobre un filtro como se menciono aquí anteriormente es una célula rara. En una modalidad particularmente preferida la célula es una célula tumoral circulante.

En una modalidad adicional preferida, la imaginología óptica como se describió aquí anteriormente es microscopía de campo brillante, microscopía de campo oscuro, microscopía de contraste de fases, microscopía de contraste de interferencia diferencial, microscopía de fluorescencia, microscopía de fuerza atómica, microscopía de barrido por láser confocal o microscopía de súper resolución.

En otro aspecto la presente invención se relaciona con el uso de material filtrante procesado que comprende células aisladas adecuadas para imaginología óptica, el cual se obtiene por medio de un método de conformidad con la presente invención, por ejemplo como se definió aquí anteriormente, para análisis de diagnóstico, histológico, microbiológico, bioquímico, oncológico o hematológico .

En aún otro aspecto la presente invención se relaciona con un dispositivo para procesar células para hacerlas adecuadas para imaginología óptica, que comprende: (a) un material filtrante para capturar una célula; (b) un sistema de suministro de presión removible acoplado al material filtrante que permite aislar células sobre el material filtrante; (c) una capa de medio de cambio de fase; (d) un medio para transportar el material filtrante y/o la capa del medio de cambio de fase a un portador; (e) una unidad de calentamiento para fundir el medio de cambio de fase hasta que el medio se dispersa bajo el material filtrante; y (f) una unidad de enfriamiento para descender la temperatura de la unidad de cambio de fase hasta que el medio solidifica, dando como resultado un filtro que comprende las células en un solo plano óptico y en una posición fija.

Finalmente, en una modalidad específica, la presente invención se relaciona con un dispositivo para procesar células para hacerlas adecuadas para imaginología óptica como se mencionó aquí anteriormente, que adicionalmente comprende un sistema de suministro de presión removible acoplado al material filtrante, permitiendo el aislamiento de células sobre el material filtrante, y/o un medio para transportar el material filtrante y/o la capa de medio de cambio de fase a un portador como se mencionó aquí anteriormente.

Breve Descripción de las Figuras La figura 1 ilustra una sección transversal del método: la fusión de la estructura de soporte distribuirá uniformemente el medio de cambio de fase entre el objetivo y el filtro. La solidificación fija el filtro en su lugar dejando y manteniendo todas las células en un solo plano óptico y en una posición fija con respecto al objetivo.

Las figuras 2A-2B muestran un elemento de Peltier que funde estructuras de parafina que soportan un filtro de policarbonato (figura 2A) el cual después de enfriarse da como resultado una superficie filtrante ópticamente plana y fija (figura 2B) .

La figura 3A muestra células MCF7 (cáncer de mama) sobre un filtro de policarbonato (membrana de surcos grabados de Whatman Cyclopore) con poros de 8 µp? (pequeños puntos negros) después de fundir una estructura de soporte de parafina. La figura 3B muestra células MCF7 (cáncer de mama) encima de un filtro de policarbonato (membrana de surcos grabados de Whatman Cyclopore) con poros de 8 pm (pequeños puntos negros) después de fundir una estructura de soporte de parafina y una tinción subsiguiente de H&E. Las células permanecen sobre el filtro y el filtro permanece unido al portaobjetos del microscopio mediante la parafina a través del protocolo de tinción.

La figura 4 muestra las etapas hacia la creación de un prototipo simple de un dispositivo para probar la funcionalidad integrada de filtración y aplanado óptico de un filtro.

Las figuras 5A-5B ilustran una modalidad con 2 cámaras separadas por un filtro. La figura 5A muestra una estructura de soporte fusible en una vista superior. La figura 5B muestra una estructura de soporte posible (4, figura 5A) que soporta el filtro. El primer compartimiento está sellado por el tubo interno (2) y el filtro (encima de la estructura de soporte) , el segundo compartimiento está sellado por el tubo interno (2) y el externo (3) . En esta modalidad, el suministro de células y la maquinaria de generación de vacío pueden removerse con facilidad, después de lo cual el filtro (3) puede aplanarse y visualizarse.

Descripción Detallada de la Invención La presente invención se relaciona con medios y métodos para procesar células aisladas para hacerlas adecuadas, para imaginología óptica.

Aunque la presente invención se describirá con respecto a modalidades particulares, esta descripción no se considerará en un sentido limitante.

Antes de describir detalladamente modalidades de ejemplo de la presente invención, se dan definiciones importantes para entender la presente invención.

Tal como se usa en la presente especificación y en las reivindicaciones anexas, las formas singulares de "un" y "una" también incluyen los plurales respectivos a menos que el contexto claramente indique lo contrario.

En el contexto de la presente invención, los términos "alrededor" y "aproximadamente" denotan un intervalo de precisión que una persona con experiencia en la técnica entenderá para todavía asegurar el efecto técnico de la característica en cuestión. El término típicamente indica una desviación del valor numérico indicado de + 20 %, preferentemente ± 15 %, más preferentemente ± 10 %, e incluso más preferentemente ± 5 %.

Se entenderá que el término "comprende" no es limitante. Para propósitos de la presente invención el término "que consiste de" se considera que es una modalidad preferida del término "que comprende" . Si de aquí en adelante se define un grupo comprendiendo por lo menos cierto número de modalidades, esto significa que también incluye un grupo que consiste preferentemente de solo estas modalidades.

Adicionalmente, los términos "primero", "segundo" o "(a)", "(b)", "(c)", "(d)", (i)", "(ii)", etc. y similares en la descripción y en las reivindicaciones, se usan para distinguir entre elementos similares y no necesariamente para describir un orden secuencial o cronológico. Se entenderá que los términos así utilizados son intercambiables bajo circunstancias apropiadas y que las modalidades de la invención descrita en la presente son capaces de operar en otras secuencias diferentes de las descritas o ilustradas en la presente.

En el caso de que los términos "(a)", "(b)", "(c)", "(d)", "(i)", "(ii)", etc. se relacionen con etapas de un método o el uso o ensayo en el mismo no tiene coherencia de tiempo o de intervalos de tiempo entre las etapas, es decir, las etapas pueden llevarse a cabo simultáneamente o pueden haber intervalos de segundos, minutos, horas, días, semanas, meses o incluso años entre tales etapas, a menos que se indique otra cosa en la solicitud como se presenta aquí arriba o más adelante.

Se entenderá que la presente invención no está limitada a la metodología, los protocolos, los reactivos, etc., particulares descritos en la presente debido que éstos pueden variar. También se entenderá que la terminología utilizada en la presente tiene como propósito solo describir modalidades particulares, y no pretende limitar el alcance de la presente invención la cual estará limitada solo por las reivindicaciones anexas. A menos que se defina otra cosa, todos los términos técnicos y científicos utilizados en la presente tienen los mismos significados como lo entiende comúnmente alguien con experiencia normal en la técnica.

Como se ha establecido arriba, la presente invención se relaciona en un aspecto con un método para procesar células aisladas para hacerlas adecuadas para imaginología óptica, comprendiendo las etapas de (a) depositar material filtrante que comprende células capturadas sobre un medio de cambio de fase; (b) fundir el medio de cambio de fase hasta que el medio se disperse bajo el material filtrante; y (c) descender la temperatura del medio de cambio de fase hasta que el medio solidifique, dando como resultado un filtro ópticamente plano que comprende las células en una posición fija.

El término "procesamiento de células aisladas" como se usa en la presente se refiere al tratamiento y manipulación de una o más células, que han sido seleccionadas y/o enriquecidas de su ambiente, es decir, etapas llevadas a cabo después de una etapa de selección o enriquecimiento de células. Una "células" como se emplea en la presente puede ser cualquier tipo de célula, por ejemplo, una célula procariótica tal como una célula bacteriana, o una célula eucariótica tal como una célula eucariótica menor o protozoarios , o una célula derivada de un eucariótico mayor. Típicamente, la célula es una célula derivada de un mamífero, preferentemente de un ser humano. Una célula puede derivarse además de un animal doméstico o pecuario, por ejemplo, una célula de perro, gato, res, cerdo, pollo, ratón, rata, o mono. Las células, en modalidades específicas, pueden derivarse de muestras de líquidos corporales tales como sangre completa, suero, plasma, linfa, licor. Las células pueden derivarse alternativamente de una muestra médica o forense, por ejemplo, una muestra de biopsia. En modalidades adicionales, las células pueden derivarse de una planta u hongo, por ejemplo, de un cultivo de callos. En modalidades adicionales, las células también pueden derivarse de muestras tales como o que comprenden materia fecal, lágrimas, saliva, fluido nasal, esputo, fluido de oídos, fluido genital, fluido de mama, leche, calostro, fluido de placenta, fluido amniótico, sudor, fluido sinovial, fluido de ascitis, fluido cerebroespinal, bilis, fluido gástrico, humor acuoso, humor vitreo, fluido gastrointestinal, exudado, trasudado, fluido pleural, fluido pericárdico, semen, fluido de vías aéreas superiores, fluido peritoneal, fluido cultivado de un sitio de una respuesta inmune, fluido cultivado de un sitio de recolección acumulado, lavado bronquial, o aspirados correspondientes, orina, material de biopsia, por ejemplo de todos los órganos adecuados, por ejemplo, el pulmón, el músculo, el cerebro, el hígado, la piel, el páncreas, el estómago, etc., una muestra de células nucleadas, un fluido asociado con una superficie mucosa, vello o piel. Además, las células pueden derivarse de muestras de fuentes ambientales, por ejemplo muestras de agua, muestras de carne o aves, muestras de fuentes de contaminación potencial, etc.

Consecuentemente la célula puede ser o derivarse de cualquier tipo de tejido o forma de tejido, por ejemplo, derivarse de tejidos sólidos, o tener libertad de movimiento o no estar unidas. En el caso de que se proporcionen estructuras sólidas, una célula puede disolverse de la estructura, por ejemplo en una solución amortiguadora o solución de nutrientes adecuada, empleando técnicas de disolución adecuadas como es el conocimiento de la persona con experiencia en la técnica. En algunas modalidades, las células pueden obtenerse directamente de muestras . En otras situaciones las muestras pueden someterse a técnicas de preparación de muestras, por ejemplo con base en protocolos estándar, incluyendo, por ejemplo, purificación parcial. Por ejemplo, las muestras de sangre pueden centrif garse, las muestras fecales pueden seccionarse y homogeneizarse con solución amortiguadora fisiológicamente aceptable y detergente, las muestras de esputo pueden licuarse y fraccionarse. Adicionalmente , en modalidades específicas pueden añadirse antibióticos o bactericidas a las muestras. Se prefiere usar células aisladas, las cuales no se proveen en una estructura o forma de capa densa de más de una célula, tridimensional u óptica. Consecuentemente se prefiere usar células proporcionadas en una estructura o una forma de capa de una célula, o una estructura más abierta. En modalidades específicas, las células pueden estar presentes individualmente, es decir, como células simples sin contacto directo con células vecinas, o conjuntamente, por ejemplo, como aglomeraciones de células o pares de células o grupos de células. Preferentemente, las células están presentes en una conformación no aglomerada, más preferentemente como células simples que no tienen contacto directo con células vecinas. En modalidades adicionales puede ser ventajoso si las células están presentes en una conformación aglomerada, o que tienen contacto con células vecinas, en particular cuando tales estructuras tienen una relevancia biológica, por ejemplo, en el caso de microémbolos circulantes.

Las células pueden tener cualquier tamaño, forma, superficie, o estructura superficial, por ejemplo, comprenden estructuras de proteínas o entidades superficies glucosiladas o no glucosiladas, etc. Las células pueden tener en consecuencia un diámetro pequeño de aproximadamente 0.5 a 5 µ?? o mayor, tener un diámetro de aproximadamente 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25 o 30 µ?? o más.

Las células pueden ser viables, por ejemplo, capaces de crecer y/o activarse mitóticamente y/o capaces de dividirse; estar latentes, por ejemplo mitóticamente inactivas, o incapaces de dividirse, pero metabólicamente activas; o estar muertas, por ejemplo metabólicamente inactivas. En modalidades adicionales, las células pueden aislarse como células viables o células latentes y morir durante el procesamiento de conformidad con la presente invención. En otra modalidad, las células pueden aislarse como células muertas. En modalidades específicas adicionales, las células pueden aislarse como células viables y ser todavía viables después del procesamiento, o partes del procesamiento de conformidad con la presente invención.

El aislamiento, es decir, la selección y/o enriquecimiento de células puede llevarse a cabo de acuerdo con cualquier método adecuado. Por ejemplo, las células pueden filtrarse, por ejemplo, pasarse a través de un dispositivo simple, doble, o triple. Alternativamente, las células pueden seleccionarse o aislarse de acuerdo con su estructura superficial, por ejemplo por interacciones específicas entre marcadores superficiales y ligandos o moléculas de unión correspondientes tales como un anticuerpo. En modalidades adicionales, las células pueden seleccionarse o aislarse de acuerdo con la forma y/o el tamaño, por ejemplo por medio de un dispositivo de clasificación de células. En aún otra modalidad, las células pueden seleccionarse o aislarse de acuerdo con su viabilidad, por ejemplo, probando su actividad metabólica o su actividad mitótica. En modalidades adicionales, el tamaño de estructuras intracelulares puede usarse para selección, por ejemplo, el tamaño o la forma de los núcleos, la presencia o capacidad de detección de mitocondrias, cloroplastos , vacuolas, etc.

El término "adecuado para imaginología óptica" como se una en la presente se refiere a la capacidad de la célula de ser ópticamente detectable a una alta resolución y con equipo de microscopía adecuado, típicamente con un microscopio de campo brillante. Las células adecuadas para imaginología óptica se presentan generalmente en un plano, es decir, todas las células dentro de un área de detección están presentes en una capa que tiene un espesor de aproximadamente el diámetro promedio de la célula aislada más aproximadamente 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 % o 110 % del diámetro, preferentemente más de aproximadamente 5 %, 10 %, 15 %, 20 % o 25 % del diámetro. Adicionalmente, o alternativamente, una célula adecuada para imaginología óptica puede mostrar un contraste alto con respecto a sus alrededores. El alto contraste puede mejorarse además mediante procedimientos de tinción, y/o usando una fuente de luz difusa y/o removiendo reflexiones de interferencia con respecto al espécimen.

En una primera etapa del método, el material filtrante que comprende células capturadas como se definió aquí anteriormente se deposita sobre el medio de cambio de fases. El término "material filtrante" como se usa en la presente se refiere a cualquier material que es capaz de portar o sostener una o más células, preferentemente un grupo de más de 10, 50, 100, 500, 1000, 5000 ó 10000 células. El material puede ser poroso o tener aberturas que permiten la penetración de moléculas de agua u otras moléculas de líquido. El material además puede ser capaz de permitir la penetración de aire o moléculas de oxígeno. En ciertas modalidades, un material filtrante puede tener adicionalmente una función de filtración o retención, por ejemplo, que proporciona poros o estructuras semejantes a poros que permiten el paso de ciertas células, tipos de células, tamaños de células, etc., reteniendo al mismo tiempo otras células, tipos de células o tamaños de células. El material filtrante que tiene una función de filtración o retención puede tener consecuentemente cualquier tamaño de poro, disposición de poros, espesor adecuados y/o estar compuesto de cualquier material adecuado conocido por la persona con experiencia en la técnica. El material filtrante puede tener cualquier forma adecuada, por ejemplo ser circular, elipsoidal, rectangular, cuadrada, triangular, o tener una mezcla de las formas mencionadas. Se prefieren materiales filtrantes circulares. En modalidades adicionales, el material filtrante puede cubrir un área interior continua y cerrada, o alternativamente puede ser de forma anular con un orificio central o asimétrico en el área interior, o comprender dos o más aberturas en el área interior.

Un "medio de cambio de fase" como se usa en la presente se refiere a un medio que muestra una transición de fases entre una fase sólida y una fase líquida dentro de un rango de temperatura adecuado para el procesamiento de entidades vivientes, preferentemente dentro de un intervalo de temperaturas de 25 °C a 70 °C. Preferentemente, un medio de cambio de fase solidifica a temperaturas superiores a la temperatura ambiente, por ejemplo, a una temperatura mayor que 28 °C. La transición de fases puede inducirse típicamente por la adición de energía al medio. Por ejemplo, al usar radiación UV, radiación infrarroja o calentamiento directo, puede inducirse una transición de fases, es decir hacerse fluida, preferentemente viscosa. Adicionalmente, un medio de cambio de fase como se usa en el contexto de la presente invención debe tener además la propiedad de ser translúcido en la fase sólida. El término "translúcido" como se usa en la presente se refiere a la capacidad de dejar pasar aproximadamente 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de un haz de luz aplicado. Además, o alternativamente, el medio de cambio de fase puede ser difuso. El término "difuso" como se usa en el presente se refiere a la capacidad del medio de cambio de fase de funcionar como un difusor de luz visible. Consecuentemente, el medio puede, además de presentar células en un solo plano óptico, remover venta osamente con efectividad reflexiones entre el material filtrante, el material de soporte y el equipo de imaginología óptica, en particular uno o ambos lados del portaobjetos del microscopio. Estas propiedades del medio de cambio de fase contribuyen por lo tanto a la calidad de imagen global .

En modalidades adicionales de la presente invención el medio de cambio de fase puede tener un espesor de aproximadamente 10 a 100 µp? , por ejemplo un espesor de 10 µp? , 15 µp? , 20 µp?, 25 µt? , 30 µp?, 35 µp?, 40 µp? , 45 µp? , 50 µ?? , 55 µp?, 60 µp?, 65 µ??, 70 µ??, 75 µp?, 80 µ??, 85 µp?, 90 µ??, 95 µp?, 100 µp? o más, o cualquier valor entre los valores mencionados. El espesor también puede ser menor, en modalidades específicas. En una modalidad particularmente preferida, el medio de cambio de fase tiene un espesor de aproximadamente 40 µp\. Particularmente se prefiere ajustar el espesor del medio de cambio de fase de tal manera que ningún medio de cambio de fase pase a través de poros o aberturas del material filtrante. En otra modalidad de la presente invención, el medio de cambio de fase puede cubrir un área de aproximadamente 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 %, 110 % o más o cualquier porcentaje entre estos valores del área de un material filtrante como se mencionó anteriormente.

En modalidades preferidas, el medio de cambio de fase inicialmente puede estar en un estado de transición sólido. En un estado de transición sólido el medio de cambio de fase puede tener cualquier forma adecuada, por ejemplo ser circular, elipsoidal, rectangular, cuadrada, triangular, o tener una mezcla de las formas mencionadas. Se prefieren medios de cambio de fase circulares. En modalidades adicionales, el medio de cambio de fase puede cubrir un área interior continua y cerrada, o alternativamente puede ser de forma anular con un orificio central o asimétrico en el área interior, o comprender dos, tres, 4, 5, 6, 7, 8 o más aberturas en el área interior. Un ejemplo de la forma de un medio de cambio de fase contemplado por la presente invención se ilustra en la figura 5A.

Se prefiere que el medio de cambio de fase se ajuste al tamaño, área o diámetro del material filtrante, por ejemplo tener la misma forma, tamaño o diámetro o esencialmente iguales o similares que el material filtrante. En modalidades adicionales, el medio de cambio de fase puede ajustarse al tamaño, área o diámetro del material filtrante de tal manera que el medio de cambio de fase en un estado de transición líquida cubra la misma áreas, esencialmente la misma área o similar y/o tenga la misma forma, tamaño o diámetro o esencialmente iguales o similares que el material filtrante con el fin de mejorar la dispersión del medio de cambio de fase bajo el material filtrante y/o con el fin de reducir el tiempo a mayor temperatura necesaria para establecer una superficie plana.

En otras modalidades, el medio de cambio de fase puede tener la misma forma o esencialmente la misma o similar que la del material filtrante, por ejemplo, si el material filtrante es circular, el medio de cambio de fase es también circular, si el material filtrante es de forma rectangular, el medio de cambio de fase también puede ser rectangular, etc. En modalidades adicionales, el medio de cambio de fase puede tener una forma diferente a la del material filtrante.

Preferentemente, el medio de cambio de fase puede tener una forma más pequeña que la del material filtrante. En modalidades preferidas, el medio de cambio de fase puede tener una forma anular, con el material filtrante con una forma circular. Alternativamente, el medio de cambio de fase puede tener una estructura semejante a rejilla o malla, con el material filtrante con una forma rectangular, etc.

El término "depositar material filtrante sobre un medio de cambio de fase" como se usa en la presente significa que un material filtrante como se definió en la presente, en particular un material filtrante que comprende células o células capturadas, se transfiere desde el sitio de filtración o captura de una o más células hasta un sitio en donde se localiza un medio de cambio de fase, preferentemente, en donde un medio de cambio de fase puede tratarse de tal manera que puede tener lugar una forma de transición de una fase sólida a líquida. El material filtrante se proporciona típicamente sobre el medio de cambio de fase. El material filtrante puede, en modalidades específicas, cubrir el medio de cambio de fase subyacente. En ciertas modalidades y situaciones, el material de cambio de fase puede colocarse o estar presente también encima del material filtrante. En modalidades adicionales específicas, el material de cambio de fase puede localizarse en forma de reborde o anillo alrededor de un material filtrante, o localizarse solo parcialmente bajo el material filtrante. En modalidades adicionales, el medio de cambio de fase puede ubicarse parcialmente por abajo o encima del material filtrante. En aún otra modalidad un material filtrante puede ubicarse entre dos capas del medio de cambio de fase en forma intercalada, es decir una capa bajo el material filtrante, otra capa encima del material filtrante. Si el medio de cambio de fase se usa encima del material filtrante, o en ambos lados, se prefiere tener una capa delgada o muy delgada del medio de cambio de fase, por ejemplo no exceder el espesor máximo de una célula capturada, o 50 %, 40 %, 30 %, 20 %, 10 % del espesor máximo de una célula capturada.

En ciertas modalidades, el procedimiento de deposición puede integrarse en una estructura de dispositivo o un flujo de trabajo de procesamiento global. Ejemplos son una etapa de deposición vinculada con la remoción de las unidades de dispositivos necesarias para los procesos de filtración o de captura de células, y/o vinculada con la remoción de residuos líquidos de un material filtrante. En estas modalidades, un medio de cambio de fase puede estar ya presente en una fase inicial, por ejemplo, durante un proceso de filtración o un proceso de captura de células, o el medio de cambio de fase puede tomar la posición de estructuras previamente utilizadas para llevar a cabo los procesos de filtración o de captura de células. En modalidades preferidas, un flujo de trabajo de procesamiento global puede incluir el uso de estructuras de compartimientos como se muestra en la figura 5B, o el uso de entidades como se muestra en la figura 4.

En una segunda etapa del método de medio de cambio de fase como se definió aquí anteriormente se funde hasta que el medio se dispersa bajo el material filtrante como se define en la presente. La etapa de fusión puede llevarse a cabo de acuerdo con el tipo, el tamaño, el espesor del medio de cambio de fase, sus propiedades de temperatura, el área cubierta, la temperatura ambiente o cualquier otro parámetro adecuado. La temperatura de fusión puede ajustarse a un valor elevado en un intervalo de temperatura adecuado como se indica en la presente, por ejemplo, de aproximadamente 37 °C a 70 °C con el fin de mejorar la velocidad de la transición de fases. En la modalidad, la viabilidad de las células puede no ser importante, por ejemplo debido a un tratamiento de fijación o químico subsiguiente. En otras modalidades, la temperatura de fusión puede ajustarse a un valor menor, por ejemplo, un valor de no más de 37-50 °C, preferentemente no más de 37 °C. En esta modalidad, las células pueden ser viables después del procedimiento de fusión y a continuación puede probarse con pruebas específicas para células vivientes. Alternativamente, las células pueden mantenerse sobre el material filtrante, por ejemplo proporcionando nutrientes adecuados, etc. El periodo de fusión también puede adaptarse al tipo, el tamaño, el espesor del medio de cambio de fase, a sus propiedades de temperatura, al área cubierta, a la temperatura ambiente o a cualquier otro parámetro adecuado. El periodo de fusión puede ser, por ejemplo, un periodo de 1 seg. , 5 seg. , 7 seg. , 10 seg., 15 seg., 20 seg., 25 seg., 30 seg., 35 seg., 40 seg., 45 seg., 50 seg., 1 min. , 2 min., 3 min., 4 min., 5 min., 7 min., 10 min., 15 min. o más, o cualquier valor entre los valores indicados.

La fusión del medio de cambio de fase puede transportarse por cualquier unidad de transferencia de energía adecuado, por ejemplo, por medio de un dispositivo de calentamiento, una fuente de luz UV, una fuente de luz infrarroja, una fuente de microondas, etc. Una unidad de transferencia de energía de conformidad con la presente invención puede, en modalidades específicas, localizarse en la vecindad del material filtrante, o dentro de una estructura de dispositivo o aparato. Una fuente de energía preferida es un elemento de Peltier.

En modalidades específicas de la presente invención, puede proveerse un medio de cambio de fase desde el exterior, por ejemplo, en forma de una jeringa o a través de una conexión fluida al material filtrante. En estas modalidades, no es necesaria una etapa de deposición como se mencionó arriba, dado que la actividad de aumento de temperatura se lleva a cabo a cierta distancia del material filtrante. El medio de cambio de fase fundido puede transportarse además al material filtrante con la ayuda de válvulas, unidades de bombeo, entidades de tuberías o cualquier otro medio de transporte microfluídico . En modalidades específicas, el proceso de transporte puede integrarse en un flujo de trabajo de un dispositivo o aparato microfluídico .

El término "dispersión del medio de cambio de fase bajo el material filtrante" como se usa en la presente se refiere a una dispersión completa o esencialmente completa del medio de cambio de fase en toda el área del material filtrante. Se prefiere que la diseminación o dispersión del medio de cambio de fase dé lugar a una capa equiplana del medio esencialmente del mismo espesor y densidad en todas las áreas del material filtrante. El medio de cambio de fase disperso puede estar preferentemente libre, o esencialmente libre de burbujas de aire .

En modalidades adicionales, alternativas de la invención, la dispersión o diseminación del medio de cambio de fase también puede localizarse en zonas específicas del material filtrante, por ejemplo, el centro del material filtrante, las zonas distales del material filtrante, zonas en donde se localizan células sobre el material filtrante, por ejemplo, en escenarios en los que solo están presentes pocas células sobre un material filtrante, o cualquier otra zona del material filtrante. En modalidades adicionales, las zonas pueden predeterminarse, por ejemplo por la provisión de las estructuras filtrantes que canalizan el medio de cambio de fase fundido.

En modalidades específicas adicionales de la presente invención, una etapa de fusión como se define en la presente puede repetirse una o más veces, por ejemplo en el caso de que el medio de cambio de fase no se haya dispersado completamente en toda el área del material filtrante, o en el caso de que la capa del medio no pueda ser esencialmente del mismo espesor.

En una tercera etapa del método la temperatura desciende hasta que el medio de cambio de fase solidifica. La etapa de descenso de temperatura puede llevarse a cabo de acuerdo con el grado de fusión y/o dispersión del medio de cambio de fase, sus propiedades de temperatura, el área cubierta, la temperatura ambiente o cualquier otro parámetro adecuado. La temperatura final puede alcanzarse mediante la actividad de descenso de temperatura que puede ajustarse a un intervalo de temperatura adecuado como se indica en la presente, por ejemplo de aproximadamente 4 °C-35 °C. La temperatura final puede ajustarse preferentemente a una temperatura baja de aproximadamente 4, 8, 10, 20, 22, 24, 25 ó 26 °C con el fin de mejorar la velocidad de la transición de fase hacia la fase sólida del medio de cambio de fase. El descenso de la temperatura puede llevarse a cabo por medio de un proceso de enfriamiento activo, por ejemplo, enfriando el medio fundido a la temperatura indicada, o terminando el calentamiento o el proceso de fusión, por ejemplo apagando el calentamiento, la luz UV o la luz infrarroja, o dispositivos de microondas y dejar que el medio de cambio de fase adapte su temperatura a la temperatura de los alrededores, o a la temperatura ambiente .

En modalidades adicionales, la etapa de descenso de temperatura puede llevarse a cabo en cascada, por ejemplo, descendiendo la temperatura en saltos de 5 °C, 10 °C, 15 °C, o 20 °C, o por un descenso directo, es decir enfriando hasta la temperatura final. Además el patrón de descenso o los programas de descenso de temperatura serían conocidos por la persona con experiencia en la técnica y también están contemplados por la presente invención.

En ciertas modalidades específicas de la presente invención un descenso en cascada de la temperatura puede combinarse con aumentos de temperatura parciales. Por ejemplo, después de descender la temperatura para 10 °C, puede hacerse un aumento de 5 °C, seguido por una disminución adicional de la temperatura, etc.

El medio de cambio de fase puede considerarse que solidifica cuando no comprende o esencialmente no comprende ninguna sección o área líquida.

El descenso de la temperatura del medio de cambio de fase puede realizarse por cualquier medio de enfriamiento adecuado. El dispositivo de enfriamiento puede, en modalidades específicas, localizarse en la vecindad del material filtrante, o dentro de una estructura de dispositivo o aparato. Una dispositivo de enfriamiento preferido es un elemento de Peltier. En modalidades adicionales preferidas, el elemento de Peltier se puede usar para la etapa de fusión así como también la etapa de enfriamiento subsiguiente. Adicionalmente , el elemento de Peltier puede tener la instrucción de realizar programas de fusión y enfriamiento específicas como es del conocimiento de la persona con experiencia en la técnica.

La etapa de descenso de temperatura del medio de cambio de fase puede llevarse a cabo de tal manera que el material filtrante se convierta a un filtro ópticamente plano, preferentemente un filtro que comprende células presentadas en un solo plano óptico, es decir todas las células dentro de un área de detección están presentes en una capa que tiene un espesor de aproximadamente el diámetro promedio de la célula aislada más aproximadamente 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 , 90 %, 100 % o 110 % del diámetro, preferentemente más aproximadamente 5 %, 10 %, 15 %, 20 % o 25 % del diámetro.

En modalidades adicionales preferidas, las células pueden estar en una posición fija sobre el filtro debido a su incrustación en el medio de cambio de fase. Esta posición fijada puede detectarse y memorizarse con el fin de permitir etapas de análisis subsiguientes, por ejemplo una primera ronda de análisis moleculares de los filtros procesados en un microscopio, etc. Por lo tanto, abre la identificación y selección de células específicas vía análisis microscópico, la posición fijada permite una remoción subsiguiente o etiquetado de las células identificadas, por ejemplo para pruebas individuales adicionales.

En una modalidad preferida de la presente invención el método como se definió arriba adicionalmente comprende la etapa inicial de capturar una célula sobre un material filtrante. La "captura" de una o más células sobre un filtro puede realizarse por cualquier medio adecuado que da como resultado la presencia de una o más células sobre un material filtrante como se define en la presente arriba y más adelante. En una modalidad, la captura puede llevarse a cabo por medio de un proceso de filtración, por ejemplo mediante el empleo de un sistema de suministro de presión, o el uso de flujos de fluido, por ejemplo en un sistema o dispositivo fluídico o microfluídico . En modalidades adicionales, la captura de una célula sobre un material filtrante puede realizarse seleccionando o aislando las células de acuerdo con su estructura superficial, por ejemplo por interacciones específicas entre marcadores superficiales y ligandos o moléculas de unión correspondientes tales como un anticuerpo. Se prefieren técnicas de adhesión basadas, por ejemplo, en la molécula de adhesión epitelial (EpCAM) . Las diferentes implementaciones de estas técnicas, que contempla la presente invención, serían del conocimiento de la persona experta. Una modalidad preferida es un proceso de selección inmunomagnética , por ejemplo con base en nanopartículas ferrofluídicas . En una modalidad adicional, las células pueden capturarse después del enriquecimiento y/o etapas de cultivo. Adicionalmente , las células pueden enriquecerse o procesarse específicamente con el fin de remover un exceso potencial de partículas inmunomagnéticas antes de la imaginología .

En modalidades específicas, la captura de células de tamaños diferentes, de orígenes específicos, o de constituciones superficiales específicas, etc., puede implementarse usando material filtrante o disposiciones de filtros que excluyen diferentes tamaños o formas de células. Por ejemplo, con el fin de capturar células pequeñas tales como células bacterianas, puede usarse una disposición de dos o tres filtros. En el caso de que se prueben muestras ambientales, puede usarse ventajosamente una disposición de un filtro con un tamaño de poro apropiado. En el caso de que se utilice sangre u otros líquidos corporales, puede ser ventajoso usar una disposición de dos o más de dos filtros en donde un filtro captura, por ejemplo células humanas grandes, mientras que un segundo filtro con poros más pequeños captura células bacterianas. Detalles adicionales pueden derivarse de publicaciones adecuadas, por ejemplo de Sage y Neece, 1984, J Clin Microbiol . , 20(1): 5-8.

En una modalidad preferida el material filtrante puede ser capaz de excluir células por tamaño para aislarlas del ambiente, por ejemplo de un fluido o una solución, típicamente de una muestra de sangre. La exclusión por tamaño puede implementarse por tamaños de poros o de aberturas específicos del material filtrante. Además, la forma del poro, es cilindrica, circular, elipsoidal, rectangular o rómbica. Un parámetro adicional relevante es la velocidad de flujo o presión fluídica durante los procesos de filtración o de captura. La velocidad de flujo puede, por ejemplo estar en el intervalo de 50 mi a 0.1 mi por minuto. Sin embargo, la presente invención también contempla velocidades de flujo adicionales por abajo o por arriba del intervalo indicado. Además, la forma de poro tridimensional puede modificarse con el fin de alcanzar un tamaño específico y/o exclusiones de flexibilidad. En modalidades específicas se prefiere usar material filtrante que permite la conservación de la integridad de membranas celulares de células, es decir, capturar células intactas y/o células viables. En modalidades alternativas, el material filtrante puede usarse de tal manera que no conserva necesariamente la integridad de la membrana celular. El material filtrante y opcionalmente el procedimiento de filtración o los parámetros de filtración pueden adaptarse consecuentemente al tamaño de las células, que se supone son capturadas, y/o los requerimientos funcionales para las células capturadas, es decir que están intactas o son viables, etc.

En modalidades preferidas de la presente invención el medio filtrante puede tener un tamaño de poro de aproximadamente 0.5 a 20 µp?, por ejemplo un tamaño de poro de aproximadamente 0.5 µp?, 0.75 µp?, 1 µ?t?, 2 µ?t?, 3 µp?, 4 µ??, 5 µp?, 6 µp?, 7 µp?, 8 µp?, 9 µp?, 10 µ??, 11 µ??, 12 µp?, 13 µp?, 14 µp?, 15 µp?, 16 µt?, 17 µ?t?, 18 µp?, 19 µ?? o 20 µp? o más, o cualquier valor entre los valores mencionados. El tamaño de poro puede seleccionarse de acuerdo con la célula que se aislará. En modalidades específicas de la presente invención, el material filtrante o el material filtrante implementado en un procedimiento de filtración puede tener una exclusión por tamaño de aproximadamente 0.5 a 20 µp?, por ejemplo una exclusión por tamaño de aproximadamente 0.5 µp?, 0.75 µp?, 1 µp?, 2 µ??, 3 µ??, 4 µ?a, 5 µp?, 6 µt?, 7 µt?, 8 µp?, 9 µp?, 10 µt?, 11 µt?, 12 µp?, 13 µp\, 14 µ??, 15 µp?, 16 µp?, 17 µp?, 18 µp\, 19 µp? o 20 µp? o más, o cualquier valor entre los valores mencionados. El término "exclusión por tamaño" como se usa en la presente significa que un valor de, por ejemplo, células de 5 µp? que tienen un diámetro promedio de aproximadamente 5 µ?? o mayor son capturadas sobre el material filtrante, mientras que las células que tienen un diámetro promedio menor que 5 µ?t? pasan por el filtro y no son capturadas.

Para la captura de células bacterianas, se prefiere usar material filtrante de un tamaño de poro de aproximadamente 0.5 µ?? a 4 µp?. Para la captura de componentes de la sangre sin plaquetas, se prefiere usar material filtrante de un tamaño de poro de aproximadamente 4 a 10 µp?. Para la captura de componentes de la sangre sin glóbulos rojos, se prefiere usar material filtrante de un tamaño de poro de aproximadamente 7 a 12 µp?. Para la captura de células tumorales puede usarse un tamaño de poro de aproximadamente 8 a 20 µp?. Se prefiere particularmente usar un tamaño de poro de 8 µp?, el cual se considera un tamaño de poro adecuado para el aislamiento de células tumorales, en particular para el aislamiento de células tumorales epiteliales. En modalidades adicionales específicas, también pueden capturarse o aislarse partículas virales, virus o bacteriófagos de una muestra, por ejemplo, de una suspensión de células huésped Usadas. Para el procedimiento de captura, puede usarse un tamaño de poro de aproximadamente 20 nm a 300 nm, más preferentemente de aproximadamente 20 nm a aproximadamente 50 nm. Filtros correspondientes pueden ser filtros de exclusión por tamaño o de remoción de virus tales como filtros Ultipor comercializados por Pall Corporation. Si se capturan o aislan virus, partículas virales o bacteriófagos, los filtros preferentemente se combinan con prefiltros de un tamaño de poro mayor. Una ventaja de la presente invención es que por ejemplo investigaciones de AFM y/o STM de partículas de virus se benefician en gran medida de la superficie uniforme muy plana que se crea por los métodos de conformidad con la presente invención.

En una modalidad preferida, el material filtrante a utilizar está compuesto de un material, el cual es elástico, y/o resistente a la presión de fluidos y/o químicamente inerte, es decir no reacciona con componentes biológicos o bioquímicos en la muestra y/o son resistentes a cambios de temperatura, por ejemplo dentro del intervalo de aproximadamente -80 °C a +130 °C. Adicionalmente , el material filtrante puede ser resistente a radiación UV.

En modalidades preferidas, el material filtrante puede ser un material polimérico adecuado. Ejemplos preferidos de un material polimérico son policarbonato, nylon o parileno. También se contemplan materiales similares, o derivados o combinaciones de los mismos, por ejemplo en el caso de que se use un filtro de dos o más capas. En modalidades adicionales preferidas, el material filtrante puede ser un material no polimérico adecuado. Un ejemplo preferido de un material no polimérico es silicio. También se contemplan materiales similares, o derivados o combinaciones de materiales poliméricos o no poliméricos, por ejemplo en el caso de que se use un filtro de dos o más capas. En modalidades adicionales preferidas de la presente invención, el material filtrante puede ser un microfiltro tridimensional compuesto de secciones de parileno dispuestas en forma tridimensional que comprenden una estructura semejante a un bolardo bajo la abertura de poro, por ejemplo como se deriva de Zheng y colaboradores, 2011, Biomed Microdevices , 13: 203-213. En una modalidad particularmente preferida de la presente invención, el material filtrante es un filtro de policarbonato, más preferentemente un filtro de membrana de surcos grabados de Whatman Cyclopore, incluso más preferentemente un filtro de membrana de surcos grabados de Whatman Cyclopore con poros de 8 µp?.

En una modalidad adicional preferida de la presente invención, el medio de cambio de fase como se definió aquí anteriormente es un medio que funde y/o solidifica en un intervalo de temperaturas de aproximadamente 25 °C a 70 °C. Por ejemplo, el medio de cambio de fase puede fundirse a una temperatura de aproximadamente 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, o 70 °C o a cualquier temperatura entre estos valores. Adicionalmente , el medio de cambio de fase puede solidificar a una temperatura de aproximadamente 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, o 70 °C o a cualquier temperatura entre estos valores. El término "funde" como se usa en la presente se refiere a la capacidad del medio de cambio de fase de cambiar completamente o esencialmente por completo de una fase sólida a una fase líquida. El término "solidifica" como se usa en la presente se refiere a la capacidad del medio de cambio de fase de cambiar completamente o esencialmente por completo de una fase líquida a una fase sólida. Se aprecia que, para el medio de cambio de fase, es decir, un medio de cambio de fase que tiene una composición molecular claramente definida, por ejemplo cera parafínica, sus propiedades físicas de transición de fase son idénticas. Por lo tanto, para el medio de cambio de fase la temperatura de fusión de ese medio es idéntica a su temperatura de solidificación. Sin embargo, la presente invención incluye el empleo de diferentes medios de cambio de fase que pueden seleccionarse de medios que tienen el intervalo antes indicado de temperaturas de fusión y solidificación .

En modalidades adicionales preferidas de la presente invención el medio de cambio de fase comprende una estructura porosa, semejante a malla, abierta, o parcialmente abierta.

El medio de cambio de fase puede, por ejemplo, tener una estructura tridimensional de cierto espesor permitiendo la presencia de aberturas o cavidades. En modalidades preferidas, las aberturas pueden tener la forma de un canal, un pasaje o un elemento tubular. Estas estructuras también pueden ser capaces de proporcionar una conectividad entre todos los sectores de áreas de un medio de cambio de fase, por ejemplo una conectividad para un fluido y/o para entidades gaseosas, por ejemplo para aire. Preferentemente, tales estructuras o elementos permiten el paso de un fluido a través de las cavidades del medio de cambio de fase.

Las cavidades, aberturas, o estructuras de canales pueden, por ejemplo, proveerse grabando o cortando sectores correspondientes de una masa compacta del medio de cambio de fase. Alternativamente, el medio de cambio de fase puede moldearse como un material fundido o líquido en un molde correspondiente y a continuación solidificarse, seguido por la extracción del molde. Alternativamente, puede usarse un láser o dispositivo láser para cortar una estructura ya sea para fundir o quemar localmente el material fuera de lugares específicos .

En el caso de que un material filtrante se coloque sobre el medio de cambio de fase, o se conecte con el mismo, la estructura porosa, semejante a malla, abierta o parcialmente abierta del medio de cambio de fase, y/o la presencia de elementos de canales, pasajes o tubos se pueden usar para el suministro de fluidos o soluciones, por ejemplo soluciones nutrientes a células capturadas sobre el material filtrante. Mediante el uso de características de conectividad del medio de cambio de fase, es posible un cultivo de células capturadas, en particular células capturadas viables, sobre un material filtrante como se describió aquí anteriormente. Por lo tanto, las células capturadas pueden mantenerse vivas, provistas con factores de inducción o inhibición, nutrientes seleccionados, etc., durante un periodo de tiempo de aproximadamente 30 minutos hasta varias semanas. Adicionalmente , las células pueden, después de cultivarse, removerse del filtro, por ejemplo, usando métodos estándares de cultivo de células tales como tripsinación, y a continuación transferirse a matraces de cultivo de células estándares. Las células capturadas pueden analizarse a través de procedimiento de imaginología, o procesarse, etc., como se describe en la presente. Típicamente, la estructura porosa, semejante a malla, abierta o parcialmente abierta del medio de cambio de fase puede estar presente en un estado solidificado, por ejemplo, después de depositar un material filtrante sobre el medio de cambio de fase, es decir antes de cualquier etapa de fusión. A continuación de la etapa de fusión como se define en la presente, el medio de cambio de fase puede haber perdido su estructura porosa, semejante a malla, abierta o parcialmente abierta, y haberse transformado en un filtro ópticamente plano. En modalidades específicas, el medio de cambio de fase puede sin embargo comprender aún una estructura porosa, semejante a malla, o una estructura parcialmente abierta después de haberse fundido y solidificado, por ejemplo, en áreas específicas la estructura puede estar presente, mientras que otras áreas muestran una estructura ópticamente plana.

En modalidades preferidas de la presente invención el medio de cambio de fase como se describe en la presente es una cera hidrocarbonada . El término "cera hidrocarbonada" se refiere a un hidrocarburo o mezcla de hidrocarburos de fórmula CnH2n+2 siendo n = 20 a 40 o mezclas de estos hidrocarburos con moléculas adicionales, preferentemente moléculas orgánicas adicionales. La cera hidrocarbonada puede, por ejemplo, estar compuesta de una mezcla de n- e isoalcanos saturados y/o nafteños, y/o compuestos aromáticos sustituidos con alquilo y nafteño y/o cicloalcanos . Los alcanos u otras moléculas incluidas en la cera hidrocarbonada pueden ser ramificadas o no ramificadas, o incluir una mezcla de moléculas ramificadas o no ramificadas. Las moléculas ramificadas pueden tener diferentes grados de ramificación, o tener diferentes grados de ramificación, por ejemplo comprender 1, 2, 3 o más ramificaciones, estar adicionalmente ramificadas dentro de una ramificación, es decir con 1, 2, 3 o más ramificaciones de segunda generación. En una modalidad preferida, el medio de cambio de fase es una cera parafínica. Una "cera parafínica" comprende hidrocarburos o una mezcla de carburos de la fórmula CnH2n+2 siendo n = 20 a 40. Ejemplos adicionalmente contemplados y potencialmente útiles del medio de cambio de fase incluyen moléculas que tienen la forma molecular CnH2n+2 con n = 24 a 36, o con n = 24, CnH2n+2 con n = 25, CnH2n+2 con n = 26, CnH2n+2 con n = 27, CnH2n+2 con n = 28, CnH2n+2 con n = 29, CnH2n+2 con n = 30, CnH2n+2 con n = 31, CnH2n+2 con n = 32, CnH2n+2 con n = 33, CnH2n+2 con n = 34, CnH2n+2 con n = 35, CnH2n+2 con n = 36, CnH2n+2 con n = 37, CnH2n+2 con n = 38, CnH2n+2 con n = 39, CnH2n+2 con n = 40, CnH2n+2 con n = 41, CnH2n+2 con n = 42, CnH2n+2 con n = 43, CnH2n+2 con n = 44, o CnH2n+2 con n = 45, o cualquier mezcla de estas moléculas. Las mezclas pueden estar presentes en cualquier proporción adecuada, comprendiendo 2, 3, 4, 5, 6 7, 8, 9, 10 o más moléculas, comprendiendo una molécula en una cantidad de 5 % , 10 %, 15 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 % o 90 % y comprendiendo una segunda molécula adicional en una cantidad correspondiente .

En otra modalidad preferida el medio de cambio de fase es un material desordenado que tiene propiedades de dispersión óptica uniformes. Ejemplos contemplados de este grupo de materiales son ácidos orgánicos de Ci0 a C2o, or ejemplo, ácido cáprico a ácido araquídico. El grupo también puede incluir ésteres y alcoholes con longitudes de cadenas de carbono variables. En otras modalidades, el medio de cambio de fase puede comprender sistemas reversibles basados en el mecanismo de Diels-Alder.

En modalidades adicionales específicas de la presente invención el medio de cambio de fase puede ser una cera animal o cera vegetal. Típicamente, las ceras son biosintetizadas por varias plantas o animales y pueden comprender ésteres de ceras, ácidos de ceras, alcoholes de ceras, e hidrocarburos. Los ésteres de ceras pueden derivarse de una variedad de ácidos carboxílicos y una variedad de alcoholes grasos. La composición de la cera animal puede depender de especies y de la localización geográfica del organismo. Ejemplos de ceras animales incluyen cera de abejas, u otras ceras secretadas por insectos, así como también cera de esperma de ballena. Ejemplos de ceras vegetales incluyen cera de carnauba la cual se deriva de la palma brasileña, así como también cera de candelilla, cera de uricuri, cera de caña de azúcar o cera de retamo. Las ceras vegetales puede ser preferentemente ceras epicuticulares de plantas que comprenden mezclas de hidrocarburos alifáticos de cadena larga sustituida, o contienen alcanos, ácidos grasos, alcoholes primarios y secundarios, dioles, cetonas y/o aldehidos. En modalidades adicionales de la presente invención el medio de cambio de fase puede montarse sobre un portador.

El término "portador" se usa aquí para referirse a cualquier estructura que permite soportar el medio de cambio de fase. El portador debe ser preferentemente resistente a temperaturas utilizadas para el procedimiento de fusión/solidificación como se define en la presente. Además, o alternativamente, el portador puede ser translúcido, por ejemplo, como se definió aquí anteriormente en el contexto del medio de cambio de fase. Por lo tanto, el portador puede ser, por ejemplo, translúcido para el espectro de la luz solar, y/o para rangos de longitud de onda específicos en el espectro de las longitudes de onda de la luz solar o fuera del espectro de las longitudes de onda de la luz solar. Ejemplos de tales longitudes de onda incluyen longitudes de onda de la luz ultravioleta. De esta manera, puede ser factible una imaginología óptica de células capturadas sobre el material filtrante.

Los portadores preferidos son portadores de vidrio. También se prefieren portadores compuestos de material polimérico o de plástico, por ejemplo de material termoplástico o elastomérico . El término "termoplástico" como se usa en la presente se refiere a un polímero de plástico de ablandamiento térmico, que se hace líquido cuando se caliente y se congela a un estado vitreo cuando se enfría suficientemente. El termoplástico puede ser un polímero de alto peso molecular cuyas cadenas se asocian a través de fuerzas de Van der Waals débiles, interacciones dipolo-dipolo más fuertes y enlace de hidrógeno; o apilamiento de anillos aromáticos. Ejemplos de termoplásticos incluyen Acrilonitrilo butadieno estireno (ABS, por sus siglas en inglés) Acrílico (PMMA) , Celuloide, Acetato de celulosa, Copolímero de Cicloolefina (COC) , Acetato de Etileno-Vinilo (EVA, por sus siglas en inglés, por sus siglas en inglés), alcohol etileno vinílico (EVOH, por sus siglas en inglés) , Fluoroplásticos (PTFE, con FEP, PFA, CTFE, ECTFE , ETFE) , Ionómeros, aleación de acrílico/PVC, Polímero de Cristal Líquido (LCP, por sus siglas en inglés) , Poliacetal (POM o Acetal) , Poliacrilatos (Acrílico) , Poliacrilonitrilo (PAN o Acrilonitrilo) , Poliamida (PA) , Poliamida- imida (PAI), Poliariletercetona (PAEK, por sus siglas en inglés o Cetona) , Polibutadieno (PBD) , Polibutileno (PB) , Tereftalato de polibutileno (PBT, por sus siglas en inglés) , Policaprolactona (PCL) , Policlorotrifluoroetileno (PCTFE) , Tereftalato de polietileno (PET, por sus siglas en inglés) , Tereftalato de policiclohexileno dimetileno (PCT, por sus siglas en inglés), Policarbonato (PC) , Polihidroxialcanoatos (PHAs) , Policetona (P , por sus siglas en inglés) , Poliéster, Polietileno (PE) , Polieteretercetona (PEEK, por sus siglas en inglés) , Polietercetonacetona (PEKK, por sus siglas en inglés) , Polieterimida (PEI ) , Polietersulfona (PES) , Polietileneclorinatos (PEC) , Poliimida (PI) , Ácido poliláctico (PLA, por sus siglas en inglés) , Polimetilpenteno (PMP) , Óxido de polifenileno (PPO, por sus siglas en inglés) , Sulfuro de polifenileno (PPS, por sus siglas en inglés) , Poliftalamida (PPA, por sus siglas en inglés) , Polipropileno (PP) , Poliestireno (PS, por sus siglas en inglés) , Polisulfona (PSU) , Tereftalato de politrimetileno (PTT, por sus siglas en inglés) , Poliuretano (PU) , Acetato de polivinilo (PVA, por sus siglas en inglés) , Cloruro de polivinilo (PVC, por sus siglas en inglés) , Cloruro de polivinilideno (PVDC, por sus siglas en inglés) , y Estireno-acrilonitrilo (SAN, por sus siglas en inglés) . El término "material elastomérico" como se usa en la presente se refiere a un polímero con la propiedad de viscoelasticidad, en donde los monómeros, que se unen para formar el polímero típicamente están hechos de carbono, hidrógeno, oxígeno y/o silicio Los materiales elastoméricos pueden ser polímeros amorfos que existen por arriba de su temperatura de transición vitrea, de tal manera que es posible un movimiento segmentario considerable. A temperaturas ambiente pueden ser relativamente blandos y deformables. Ejemplos de materiales elastoméricos incluyen Poliisopreno sintético (IR), Polibutadieno (BR) , Caucho de etireno-butadieno (copolímero de poliestireno y polibutadieno, SBR, por sus siglas en inglés) , Caucho de nitrilo (copolímero de polibutadieno y acrilonitrilo, NBR) , Cauchos de nitrilo hidrogenados (HNBR, por sus siglas en inglés) , Caucho de cloropreno (CR, por sus siglas en inglés) , policloropreno, Neopreno, EPM (caucho de etileno propileno, un copolímero de etileno y propileno) , Caucho de epiclorohidrina (ECO) , Caucho poliacrílico (ACM, ABR) , Caucho de silicona (SI, Q, VMQ) , Caucho de fluorosilicona (FVMQ) , Fluoroelastómeros (FKM, y FEPM) Viton, Tecnoflon, Fluorel, Aflas, Perfluoroelastómeros (FFKM) Tecnoflon PFR, Kalrez, Chemraz, Perlast, Amidas en bloque de Poliéter (PEBA, por sus siglas en inglés) , Polietileno clorosulfonado (CSM) , Etileno-acetato de vinilo (EVA, por sus siglas en inglés) , Elastómeros termoplás icos (TPE, por sus siglas en inglés) , Elastron, Olefinas termoplásticas (TPO) , resilina, elastina y Caucho de polisulfuro.

En una modalidad específica el portador puede estar compuesto de un polímero orgánico seleccionado del grupo de polietileno, polipropileno, poliestireno, policarbonato y policicloolefina . "Polietileno" tal como se usa en la presente se refiere a un material polimérico compuesto de cadenas largas del monómero etileno. El material de polietileno puede estar presente en formas diferentes de densidad y/o ramificación. Ejemplos de material de polietileno incluyen polietileno de ultra alto peso molecular (UHM PE, por sus siglas en inglés) , polietileno de ultra bajo peso molecular (ULMWPE ó PE- AX, por sus siglas en inglés) , polietileno de alto peso molecular (HM PE, por sus siglas en inglés) , polietileno de alta densidad (HDPE, por sus siglas en inglés) , polietileno reticulado de alta densidad (HDXLPE, por sus siglas en inglés) ; polietileno reticulado (PEX o XLPE, por sus siglas en inglés) ; polietileno de densidad media (MDPE, por sus siglas en inglés) ; polietileno lineal de densidad media (LLDPE , por sus siglas en inglés) ; polietileno de baja densidad (LDPE, por sus siglas en inglés) y polietileno de muy baja densidad (VLDPE, por sus siglas en inglés) . "Polipropileno" como se usa en la presente se refiere a un polímero termoplástico compuesto de unidades de propileno monomérico. Ejemplos de polipropileno incluyen homopolímero de polipropileno, copolímero aleatorio de polipropileno, y copolímero en bloque de polipropileno. El propileno también puede comprender derivados de propileno que comprenden unidades de polipropileno y etileno o unidades de polietileno. " Poliestireno" se usa aquí para referirse a un polímero aromático hecho del monómero aromático estireno. Ejemplos de poliestireno incluyen poliestireno isotáctico, poliestireno atáctico y poliestireno sindiotáctico . "Policarbonato" como se usa en la presente se refiere a polímeros termoplásticos que comprenden grupos carbonato. Los policarbonatos pueden derivarse de una combinación de bisfenol A y fosgeno, una transesterificación de bisfenol A y carbonato de difenilo. El material de policarbonato puede ser transparente en algunas modalidades. "Policicloolefina" como se usa en la presente se refiere a hidrocarburos alquenos que contienen más de un anillo cerrado de átomos de carbono, pero no tienen carácter aromático. Las policicloolefinas pueden, por ejemplo, estar compuestas de alquenos monoméricos tales como ciclopropeno, ciclobuteno, ciclopenteno, ciclohexeno, ciclohepteno, 2 , 3 -ciclohexadieno, 1 , 4 -ciclohexadieno o 1,5-ciclooctadieno . En modalidades adicionales, el portador puede comprender material adecuado para la producción de instrumentos ópticos, por ejemplo, lentes, objetivos, gafas para sol, lentes de contacto, etc. Ejemplos de tales materiales son materiales con alto índice de refracción, por ejemplo, materiales de plástico con un alto índice de refracción. El grupo de materiales de plástico adecuado para producción de instrumentos ópticos comprende, por ejemplo, plásticos de policarbonato tales como polialildiglicolcarbonato (PADC) o CR-39 o derivados de los mismos .

En una modalidad típica, el portador es un portaobjetos de vidrio usado para microscopios estándar.

En modalidades adicionales de la presente invención, el portador como se definió aquí anteriormente puede comprender o adicionalmente puede comprender un marcador de posición. El término "marcador de posición" como se usa en la presente se refiere a una marcación, una rejilla, un sistema de líneas, una dimensión o indicación de longitud, un número de código de letras, un código de barras, un código matricial o cualquier otro signo adecuado conocido por la persona con experiencia en la técnica, que permite determinar la ubicación de una célula, su tamaño o diámetro, la distancia a una célula vecina, etc. En modalidades específicas, el marcador de posición puede ser un marcador de posición detectable por la inducción bajo longitudes de onda específicas. Por ejemplo, el marcador de posición puede ser detectable cuando se excita con luz de una longitud de onda de aproximadamente 540 nm, 550 nm, 560 nm, 570 nm, 580 nm, 590 nm, 600 nm, 610 nm, 620 nm, 630 nm, 640 nm, 650 nm, 660 nm, 670 nm, 680 nm, 690 nm, 700 nm, o más. Pueden estar presentes otros marcadores físicos para facilitar la microscopía AFM de STM.

En una modalidad adicional preferida de la presente invención el método para procesar células aisladas como se describe en la presente comprende como etapa adicional una actividad para llevarse a cabo en las células aisladas. La actividad puede realizarse sobre células capturadas sobre un material filtrante antes de que el medio de cambio de fase se halla fundido y solidificado, o puede realizarse después de fundir y solidificar el medio de cambio de fase. Consecuentemente la actividad puede llevarse a cabo in situ, por ejemplo, en un dispositivo de conformidad con la presente invención, o puede realizarse en un sitio diferente, por ejemplo en un laboratorio específico, un dispositivo diferente, etc. Consecuentemente las actividades pueden adaptarse a las situaciones específicas, por ejemplo, la présencia o ausencia del medio de cambio de fase la presencia de entidades adicionales tales como portadores. Se contempla además una automatización o semiautomatización de las actividades, por ejemplo, en un sistema o ambiente microfluídico . Por ejemplo, las actividades pueden llevarse a cabo por medio de robots, o mediante un sistema que comprende partes mecánicamente movibles controladas por una unidad de control computarizada .

La actividad puede ser, en una modalidad, una actividad de fijación. "Fijación" como se usa en la presente se entiende que es una etapa de preparación para una tinción subsiguiente y puede depender del tipo de análisis planeado. Típicamente, la fijación tiene como objeto conservar la forma de las células tanto como sea posible. La fijación puede ser, en ciertas modalidades, una fijación térmica la cual se usa para matare, adherir, y alterar las células con el fin de permitir que las células acepten la tinción. Alternativamente, las células puede fijarse por secado con aire. En una alternativa adicional, puede realizarse una fijación química.

Ejemplos contemplados de fijación química son el uso de formaldehído, etanol, metano y/o ácido pícrico. En modalidades adicionales, la fijación puede estar seguida por técnicas de recuperación de antígeno tales como calentamiento breve de corta exposición a radiación de microondas.

La actividad puede ser, en una modalidad adicional, una actividad de tinción. "Tinción" como se usa en la presente se refiere a la adición de un colorante específica para la clase (por ejemplo, específico para ADN, proteína, lípido, carbohidrato) a una célula o un material filtrante que comprende células para calificar y/o cuantificar la presencia de la clase de compuesto. El término también incluye etiquetado fluorescente, por ejemplo como marcas o marcadores fluorescentes. La tinción puede llevarse a cabo in vivo, es decir con células vivientes, preferentemente con células que son cultivadas in situ sobre el material filtrante como se describe en la presente, o con células vivientes capturadas sobre el material filtrante como se describe en la presente. En una modalidad típica, la tinción se lleva a cabo con células que se fijan como se definió aquí anteriormente. El procedimiento de tinción puede adaptarse al tipo de célula presente sobre el material filtrante. Por ejemplo, las células bacterianas pueden teñirse de conformidad con el procedimiento de tinción Gram, o por tinción de Ziehl-Neelsen. Procedimientos de tinción adicionalmente contemplados incluyen tinción de hematoxilina y eosina, tinción Pap, tinción PAS, tinción tricrómica de Masson, tinción de Romanovsky, tinción de Plata o tinción de Conklin. Enfoques de tinción adicionales contemplados incluyen tinción con naranja de acridina, marrón de Bismarck, carmín, azul de Coomassie, violeta cristal, DAPI, eosina, bromuro de etidina, fucsina, tinciones de Hoechst, yodo, verde malaquita, verde de metilo, rojo neutral, Nilo azul, Nilo rojo, tetróxido de osmio, rofamina, o safranina. La tinción también puede incluir etiquetado fluorescente o etiquetado molecular, por ejemplo usando marcas o marcadores fluorescentes y/o anticuerpos que se etiquetan fluorescentemente o pueden ser reconocidos por anticuerpos secundarios que son etiquetados o reconocibles. Esto puede, por ejemplo, lograrse usando marcas adecuadas, que pueden conjugarse con una molécula de detección capaz de reconocer estructuras o entidades sobre la superficie o en las células capturadas sobre el material filtrante de conformidad con la presente invención. Ejemplos de marcas adecuadas incluyen colorantes fluorescentes (por ejemplo, fluoresceína, rodamina, ficoeritrina, fluorescamina) , colorantes cromofóricos (por ejemplo rodopsina) , compuestos quimioluminiscentes (por ejemplo, luminal, imidazol) y proteínas bioluminescentes (por ejemplo luciferina, luciferasa, proteína fluorescente verde, proteína fluorescente amarilla, derivados de los mismos) . Una molécula de detección tal como un anticuerpo puede marcarse además con una marca fluorescente como FITC, 6-FAM, HEX, TET, ROX, Cy3, Cy5, Rojo Texas y/o al mismo tiempo con una marca de apagado como TAMRA, Dabcyl , Black Hole Quencher, BHQ-1 o BHQ-2. Las moléculas de detección también pueden marcarse preferentemente con enzimas o dominios enzimáticos que generan una señal luminiscente, fluorescente o electroquímica. Ejemplos particularmente preferidos de tales enzimas incluyen peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina y beta-lactamasa . En modalidades adicionales las moléculas de detección pueden marcarse con radioisótopos (por ejemplo, 3H, 14C, 32P, 33P, 35S, 125? , "c, 13N, 150, 18F, 64Cu, 62Cu, 124I, 76Br, 82Rb, 68Ga o 18F) o partículas (por ejemplo, oro) . Los diferentes tipos de marcas pueden conjugarse con una molécula de detección usando varias químicas, por ejemplo la reacción con amina o la reacción con tiol. Sin embargo, también pueden usarse otros grupos reactivos diferentes de las aminas y tioles, por ejemplo aldehidos, ácidos carboxílieos y glutamina. En una modalidad particularmente preferida, la tinción puede llevarse a cabo con un anticuerpo anti EpCAM conectado con cualquiera de las tinciones fluorescentes mencionadas, más preferentemente con una marca FITC. Se prefiere particularmente el uso de la tinción Syto 9 para moléculas de ADN y ARN.

La actividad puede ser, en una modalidad adicional, una manipulación mecánica de la célula. "Manipulación mecánica" como se usa en la presente se refiere a cualquier intervención externa con respecto a una célula, un grupo de células o esencialmente todas las células sobre un material filtrante de conformidad con la presente invención. La intervención externa puede incluir una apertura mecánica de las células, un movimiento físico o rotación de las células. Se contemplan además intervenciones físicas debido al empleo de corrientes eléctricas, el flujo de líquidos, el uso de presión, el empleo de incrementos o decrementos de temperatura con respecto a una célula o a un grupo de células. Las actividades pueden llevarse a cabo, por ejemplo, por medio de una entidad robotica o semirrobótica, por ejemplo en el ambiente de un sistema microfluídico o sistema de preparación de células.

La actividad puede ser, en una modalidad específica adicional, una manipulación mecánica que comprende una actividad de liberación de células. El término "liberación" como se utiliza en la presente se refiere a la extracción de una o más células específicas o grupos de células de un material filtrante. La extracción puede realizarse antes, durante o después del procedimiento de fusión/solidificación, o antes, durante o después de una tinción o procedimiento de análisis óptico. Por ejemplo, una célula detectada por tinción in vivo como de interés potencial o que se ubica dentro de los criterios probados, puede liberarse del material filtrante, transportarse a continuación a un portador o medio diferente, por ejemplo un medio de cultivo y analizarse con diferentes metodologías, o cultivarse y amplificarse para etapas de análisis subsiguientes, etc. La liberación de células puede basarse en el uso de elementos marcadores de posición como se definieron aquí anteriormente. Por ejemplo, al guardarse un código de marcador de posición, o una coordenada correspondiente, se puede identificar una célula o reidentificarse fácilmente después de una etapa de tinción o detección inicial. Para la liberación de células pueden usarse micromanipuladores o equipo de succión. Debido al resultado ventajoso del método de conformidad con la presente invención para proporcionar un material filtrante que comprende células en una posición fija, los análisis subsiguientes y procedimientos de extracción pueden realizarse de manera rápida y precisa.

La actividad puede ser, en una modalidad adicional, una manipulación biológica de la célula. "Manipulación biológica" como se usa en la presente se refiere a la aplicación de entidades biológicas a las células con el fin de afectar su comportamiento, tamaño, estructura, histología, etc. Ejemplos de tales manipulaciones biológicas incluyen la aplicación de entidades de unión biológicas tales como anticuerpos. Ejemplos adicionales incluyen la provisión de nutrientes para las células que permiten el crecimiento y división mitótica de las células. También se contempla el empleo de factores de unión, tales como ligandos o factores de crecimiento, factores de transcripción, clases de azúcares específicos, el uso de inhibidores o activadores celulares, etc. Manipulaciones biológicas adicionales serían del conocimiento de la persona con experiencia en la técnica y también son contemplados por la presente invención.

La actividad puede ser, en aún otra modalidad, una manipulación bioquímica. Una "manipulación bioquímica" como se usa en la presente se entienden que es la exposición de una célula sobre un material filtrante de conformidad con la presente invención a entidades bioquímicamente activas, tales como moléculas de ARNi, enzimas de degradación, moléculas pequeñas que supuestamente tienen efectos moleculares específicos mediante la unión a ligandos o receptores, induciendo reacciones moleculares, etc. La manipulación bioquímica también incluye llevar a cabo reacciones bioquímicas in situ, por ejemplo, llevar a cabo la reacción de cadena de polimerasa in situ, la detección de expresión de genes in situ o la expresión de proteína, la detección de la presencia de proteína, lípido ADN/AR , Hibridación de Fluorescencia/Cromogénica in situ (FISH/CISH, por sus siglas en inglés) , estructuras glucosídicas u otras entidades en o sobre una o más células, etc. Manipulaciones bioquímicas adicionales serían del conocimiento de la persona con experiencia en la técnica y también son contemplados por la presente invención.

En una modalidad adicional particularmente preferida de la presente invención, la actividad comprende cultivar las células aisladas. Las células capturadas sobre un material filtrante se depositan preferentemente sobre un medio de cambio de fase que comprende una estructura porosa, semejante a malla, abierta o parcialmente abierta, puede proveerse con un medio de crecimiento o nutrientes, por ejemplo fuentes de carbono tales como azúcares, fuentes de nitrógeno, vitaminas, hormonas, factores de crecimiento, sales, minerales en trazas, proteínas, etc. El cultivo puede adaptarse a las células capturadas, por ejemplo células bacterianas, a células humanas, a células epiteliales, etc. En modalidades específicas adicionales, el medio de crecimiento puede ser un medio mínimo, un medio selectivo, o puede enriquecerse con marcadores para análisis subsiguientes, por ejemplo marcadores radioactivos o fluorescentes, o colorantes, etc. El cultivo puede hacerse haciendo pasar o haciendo fluir el medio de crecimiento bajo las células capturadas, por ejemplo, en la capa del medio de cambio de fase que comprende cavidades o aberturas. El flujo puede ser un flujo constante proporcionado por un sistema de tubería o fluídico que comprende válvulas o unidades de movimiento, depósitos, unidades de reciclo, o reemplazo, etc. En una modalidad específica, el cultivo puede llevarse a cabo en un ambiente microfluídico . Adicionalmente , el cultivo puede llevarse a cabo a temperaturas adecuadas, por ejemplo a una temperatura adecuada para el crecimiento de las células capturadas, por ejemplo en un intervalo de 28 a 40 °C, preferentemente a 37 °C. Al modificar la temperatura de incubación, las células pueden inducirse además a reacciones moleculares, que a continuación pueden detectarse ópticamente. El cultivo puede llevarse a cabo durante cualquier tiempo apropiado, por ejemplo, durante un periodo de tiempo de 30 minutos hasta varias semanas .

En una modalidad adicional particularmente preferida de la presente invención la célula que será aislada o capturada es una célula rada. El término "célula rara" como se usa en la presente se refiere a la frecuencia relativa de aparición de la célula en un grupo de otras células. Por ejemplo, una célula rara puede ser una célula que está presente en una relación de una célula versus 106, 107, 108, 109 o más células en un volumen de muestra de aproximadamente 1 mi . Una célula rara particularmente preferida es una célula tumoral circulante, en particular una célula tumoral de epitelios transportada a través del torrente sanguíneo de un ser humano o un mamífero o un eucariótico mayor. En modalidades específicas adicionales, una célula capturada puede ser una célula tumoral al como una célula de cáncer de mama, una célula de cáncer de pulmón, una célula de cáncer urotelial, una célula de cáncer urinario de riñón, una célula de cáncer de próstata, o una célula de cáncer de pulmón no pequeñas.

En modalidades adicionales preferidas, la célula puede ser una célula bacteriana, por ejemplo, una bacteria del género Neisseria, tal como Neisseria meningitidis, una bacteria del género Streptococcus, por ejemplo S. pneumoniae, una bacteria del género Staphylococcus , por ejemplo, S. aureus, una bacteria del género Haemophilus, por ejemplo, H. influenza, una bacteria del género Escherichia, por ejemplo E. coli, o una bacteria del género Mycobacterium, por ejemplo M. tuberculosis o M. leprae .

En una modalidad adicional preferida de la presente invención, el análisis de imaginología óptica o análisis óptico de células procesadas de conformidad con los métodos de la presente invención pueden realizarse con microscopios adecuados y tecnologías de microscopía. Ejemplos de tales técnicas de microscopía incluyen microscopía de campo brillante, microscopía de campo oscuro, microscopía de contraste de fases, microscopía de contraste de interferencia diferencial, microscopía de fluorescencia, microscopía de fuerza atómica, microscopía de súper resolución y microscopía de barrido láser confocal . Un aspecto particularmente ventajoso de la presente invención es que las células procesadas de conformidad con la metodología descrita en la presente puede representarse o visualizarse con calidad mejorada con base en la microscopía de campo brillante que es simple, ampliamente conocida, versátil y fácil de implementar. El procesamiento de células descrito está además bien adaptado parta enfoques de imaginología usando otras técnicas de microscopía. La adaptación de ciertas características y parámetros de la presente metodología al enfoque de microscopía seleccionado está dentro de las capacidades de la persona con experiencia. Por ejemplo, la tinción, el uso de marcadores fluorescentes, la longitud de onda de excitación y la detección, etc., pueden adaptarse, el portador puede adaptarse. Adicionalmente , en modalidades específicas puede usarse un cubreobjetos con el fin de cubrir las células procesadas sobre el material filtrante.

En un aspecto adicional la presente invención se relaciona con material filtrante procesado que comprende células aisladas adecuadas para imaginología óptica, el cual puede obtenerse por medio de un método de procesamiento como el utilizado en la presente. Consecuentemente, el material filtrante puede comprender células capturadas después del proceso de fusión y solidificación como se describe en la presente, que se localizan en un plano óptico. El material filtrante puede usarse para análisis óptico, o someterse a etapas de tinción o manipulación adicionales. Consecuentemente el material filtrante proporcionado puede usarse además para acciones de prolongación de la vida con respecto a células capturadas. Por lo tanto el material filtrante puede ponerse en contacto con medio de crecimiento como se define en la presente o puede almacenarse en un ambiente fresco, por ejemplo, en un refrigerador o cuarto de enfriamiento. Alternativamente el material filtrante puede congelarse, por ejemplo a -20 °C or at -80 °C para conservarlo para etapas de análisis posteriores. Antes de congelar, el material filtrante puede prepararse para condiciones de congelación, por ejemplo añadiendo un medio de congelación adecuado como es conocido por la persona con experiencia en la técnica.

En aún otro aspecto de la presente invención, el material filtrante procesado obtenido de conformidad con métodos como se describieron en la presente puede usarse para cualquier diagnóstico adecuado, o prueba analítica. Por ejemplo, puede usarse para examen histológico, preferentemente después de etapas de tinción como se describe en la presente. Adicionalmente , puede usarse para análisis microbiológico o virológico, por ejemplo, la identificación y caracterización de bacterias o virus capturados. En modalidades adicionales, puede usarse para propósitos bioquímicos, por ejemplo, para la identificación y selección de moléculas pequeñas activas que proporcionan efectos sobre células capturadas, la prueba de inhibición o la inducción de moléculas sobre células capturadas, la prueba de modificaciones bioquímicas con respecto al metabolismo, la estructura de viabilidad de una célula, etc. El material filtrante procesado, en modalidades particularmente preferidas, usarse para análisis oncológicos, por ejemplo la detección y caracterización de células raras capturadas tales como células tumorales circulantes. Las células pueden, por ejemplo, identificarse de acuerdo con la unión de anticuerpos a marcadores superficiales y la tinción concomitante o subsiguiente con colorantes fluorescentes, o la tinción con colorantes específicos de compartimiento para ADN o ARN con el fin de analizar la actividad mitótica. En una modalidad adicional preferida, el material filtrante procesado puede usarse para análisis hematológicos . Consecuentemente, la célula del material filtrante procesado puede derivarse de muestras de sangre que comprenden por ejemplo, glóbulos blancos, o tipos o clases específicas de leucocitos. Consecuentemente, las células pueden analizarse para determinar su frecuencia, tamaño, viabilidad, etc.

En aún otros aspectos la presente invención se relaciona con un dispositivo para procesar células para hacerlas adecuadas para imaginología óptica, que comprende (a) un material filtrante para capturar una célula como se definió aquí anteriormente, (b) un medio de cambio de fase como se definió aquí anteriormente; y (c) una unidad de calentamiento y/o enfriamiento. El dispositivo puede, en una modalidad, comprender un material filtrante que es removible, por ejemplo transferible a una unidad de filtración o insertable en un dispositivo de filtración, en donde una o más células, preferentemente células raras como se definieron aquí anteriormente, o cualquier otro tipo de células tales como células bacterianas como se definieron aquí anteriormente son capturadas sobre el material filtrante. La captura de las células también puede hacerse por métodos diferentes, por ejemplo, por unión selectiva a moléculas de unión tales como anticuerpos, procedimientos de aislamiento inmunomagnético, etc. A continuación, el material filtrante puede reintroducirse en un dispositivo para procesar células de conformidad con la presente invención.

En otra modalidad, el material filtrante para capturar células puede ya estar provisto o presente junto con células capturadas sobre el mismo, por ejemplo habiendo realizado una filtración o un proceso de captura de células en un dispositivo independiente o en una unidad de filtración, u otro procedimiento de captura como se mencionó en la presente. En modalidades especificas, el dispositivo puede comprender más de un material filtrante, por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 10, 15 o más materiales filtrantes, que permiten un procesamiento paralelo o semiparalelo . También, la presente invención contempla un procesamiento secuencial de más de un material filtrante o filtro.

En una modalidad adicional, el dispositivo puede comprender una ranura de inserción, una muesca o zona de introducción, que permite la inserción del material filtrante o filtros que comprenden una o más células capturadas. La zona puede estar equipada para la rápida introducción de filtros y su remoción después de las etapas de procesamiento, es decir, como material filtrante ópticamente plano que comprende células en una posición fija. En modalidades especificas, el dispositivo puede comprender más de una ranura de inserción, muesca o zona de introducción por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 10, 15 o más ranuras de inserción, muescas o zona de introducción, que permiten un procesamiento paralelo o semiparalelo . También se contempla el procesamiento secuencias en las zonas de inserción.

En otra modalidad de la presente invención, el dispositivo como se define en la presente comprende una o más capas de medio de cambio de fase como se definió aquí anteriormente. Estas capas de medio de cambio de fase pueden proveerse, por ejemplo, en un depósito o compartimiento de cartuchos y estar asociadas con un material filtrante durante la introducción del material filtrante que comprende células dentro del dispositivo. Alternativamente, el dispositivo puede proveerse para un reabastecimiento externo del medio de cambio después de completar el procedimiento de procesamiento para uno o más de un filtro. El medio de cambio de fase puede almacenarse, por ejemplo, en una forma lista para usarse en un ambiente adecuado y puede introducirse en el dispositivo al comienzo de un nuevo ciclo de procesamiento. Esto puede realizarse preferentemente de manera automática, por ejemplo usando técnicas robóticas, o a través de un sistema de suministro automatizado. En modalidades adicionales, el medio de cambio de fase puede proveerse en forma fundida por ejemplo, mantenerse en un depósito caliente o unidad de calentamiento y colarse en un molde, preferentemente como se describió aquí anteriormente, al comenzar un ciclo de procesamiento. Esto puede repetirse en cada ciclo del esquema de procesamiento. Consecuentemente, el molde puede removerse después de que el medio de cambio de fase ha solidificado. Los depósitos para un medio de cambio de fase, en modalidades específicas, también pueden ser parte de un dispositivo de conformidad con la presente invención. Alternativamente, estos depósitos pueden ser removibles y solo asociarse con el dispositivo cuando se necesitan.

En modalidades adicionales específicas, el dispositivo también puede contemplar la presencia de portadores como se definieron aquí anteriormente. Por ejemplo, el dispositivo puede comprender un compartimiento de cartuchos o un sistema de suministro para portadores, que pueden estar asociados con un material filtrante y un medio de cambio fase cuando se introduce el material filtrante que comprende células dentro del dispositivo. Alternativamente, el material portador puede estar ya conectado al medio de cambio de fase y asociado (como combinación) con el material filtrante cuando se introduce en el dispositivo. También se prefiere la provisión en el dispositivo de conjuntos o paquetes de portador y medio de cambio de fase previamente manufacturados, por ejemplo en un compartimiento de cartuchos. Al comienzo de un ciclo de procesamiento, se puede insertar un paquete de portador y medio de cambio de fase en el sitio de procesamiento. El paquete puede mantenerse en un ambiente adecuado, por ejemplo, en ambientes frescos o ambientes secos, etc.

En modalidades adicionales de la presente invención, el medio de cambio de fase, o la combinación de medio de cambio de fase y portador puede proporcionarse en un cultivo o ambiente que permite el crecimiento de células en el dispositivo. Consecuentemente, el dispositivo puede estar provisto con tubos o uniones; y/o puede comprender depósitos y almacenes para líquidos, por ejemplo, agua, sustancias químicas, ingredientes, nutrientes, factores de crecimiento, fuentes de carbono o nitrógeno, etc., o cualquier otra entidad que se utilizará para cultivar células tales como una unidad de control de temperatura y un suministro de C02. El dispositivo puede, por ejemplo, estar integrado en un sistema fluido o microfluido que comprende las conexiones y depósitos antes indicados. También pueden incluirse unidades para controlar el flujo de líquidos, el pH, la temperatura, la concentración de moléculas, etc. En modalidades adicionales, una unidad de cultivo como se describe en la presente puede ser removible del dispositivo y consecuentemente usarse de acuerdo con la necesidad, por ejemplo cuando se procesan células vivientes.

En un modalidad adicional preferida, un dispositivo como se define en la presente puede comprender una unidad, la cual es capaz de calentar un material filtrante y un medio de cambio de fase asociado, en particular con el fin de ofrecer la posibilidad de fundir el medio de cambio de fase como se definió aquí anteriormente. En modalidades adicionales, el dispositivo puede comprender una unidad de enfriamiento, en particular con el fin de ofrecer la posibilidad de mejorar el proceso de solidificación como se describe en la presente. En modalidades adicionales, la unidad de calentamiento o enfriamiento puede ser adicionalmente útil para controlar la temperatura de las etapas de cultivo en el dispositivo. El dispositivo de enfriamiento puede usarse además para una conservación in situ de material filtrante procesado de conformidad con la presente invención. La conservación puede, por ejemplo, ser refrigeración in situ hasta que se lleve a cabo un procedimiento de tinción subsiguiente o un análisis de imaginología óptica. El material filtrante procesado puede, por ejemplo, enfriarse hasta una temperatura de aproximadamente 4-8 °C. También se contempla la presencia de una unidad de congelación en el dispositivo, la cual permite congelar material filtrante procesado como se describe en la presente. El material filtrante congelado puede mantenerse in situ, o removerse del dispositivo con el fin de almacenarlo en un congelador, por ejemplo a -80 °C, o -20 °C o a cualquier otra temperatura adecuada. En modalidades adicionales, una unidad de congelación o enfriamiento como se describió arriba puede ser removible del dispositivo y consecuentemente usarse de acuerdo con la necesidad, por ejemplo cuando se requiere almacenar el material filtrante.

En una modalidad particularmente preferida, la unidad de enfriamiento o calentamiento puede ser un elemento de Peltier, que permite actividades de calentamiento y enfriamiento .

En otra modalidad preferida de la presente invención, un dispositivo como se definió aquí anteriormente puede comprender una unidad de filtración o de captura que permite aislar o capturar células sobre un material filtrante como se definió aquí anteriormente. La unidad de filtración o de captura, por ejemplo, puede ser capaz de proporcionar una presión sobre el flujo de líquido del material de muestra que se dirige a un paso forzado a través de un material filtrante como se definió aquí anteriormente. Alternativamente, la unidad de captura puede estar equipada con perlas magnéticas, o elementos inmunológicos , etc. que permiten una sección inmunomagnética o inmunológica de células.

Particularmente se prefiere que el dispositivo como se definió arriba incluya un sistema de suministro de presión removible. En una modalidad, el sistema puede acoplarse directamente al material filtrante. En una modalidad específica, el sistema de suministro de presión removible puede ser una aguja conectadas a un vacío o una unidad generadora de baja presión, por ejemplo una bomba de vacío. La aguja puede ser removible del material filtrante, o el compartimiento en donde se localiza el material filtrante después de realizar una filtración o etapa de aislamiento.

En modalidades específicas adicionales, el sistema de suministro de presión removible como se describió arriba puede implementarse con el fin de remover agua o residuos líquidos del material filtrante, por ejemplo, restos de etanol .

Adicionalmente , el dispositivo de conformidad con la presente invención puede tener un compartimiento o una estructura de compartimiento encajado. Un ejemplo de una estructura de compartimiento contemplada se proporciona en la figura 5B con la figura 5A mostrando un medio de cambio de fase posible para usarse en el dispositivo. La forma de dispositivo integrado puede combinarse con unidades adicionales como se describieron aquí anteriormente o que se describen abajo, por ejemplo, unidades de temperatura, depósitos, unidades de cartuchos, tubos, etc.

Particularmente se prefiere que un dispositivo como se definió aquí anteriormente incluya medios para transportar un material filtrante como se definió aquí anteriormente a un portador como se definió aquí anteriormente. La unidad de transporte puede ser una entidad robótica o un sistema de suministro. También se contemplan medios de transporte semiautomáticos . Particularmente se prefiere además que un dispositivo como se definió aquí anteriormente incluya medios para transportar una capa de medio de cambio de fase a un portador como se definió aquí anteriormente. La unidad de transporte puede ser una entidad robótica o un sistema de suministro. También se contemplan medios de transporte semiautomáticos .

En modalidades adicionales de la presente invención, un dispositivo como se definió aquí anteriormente puede conectarse a unidades o equipo de procesamiento y/o análisis corriente abajo. Por ejemplo, el dispositivo puede equiparse con unidades de tinción, fijación, manipulación mecánica, manipulación biológica y/o manipulación bioquímica, o entradas o salidas que permiten la actividad. Destalles de actividades posibles que pueden llevarse a cabo en o por medio de tales unidades se proporcionaron aquí arriba.

Adicionalmente, el dispositivo puede conectarse a un sistema de imaginología óptica, por ejemplo, un microscopio. Ejemplos de microscopios que pueden asociarse con o integrarse en el dispositivo de la presente invención incluyen un microscopio de campo brillante, un microscopio de campo oscuro, un microscopio de contraste de fases, un microscopio de contraste de interferencia diferencial, un microscopio de fluorescencia, un microscopio de fuerza atómica, un microscopio de barrido por láser confocal o un microscopio de súper resolución. Se contempla además la presencia de fuentes de luz, filtros ópticos, unidades de cámaras y otros elementos necesarios para imaginología óptica.

Preferentemente, el dispositivo también puede equiparse con una unidad de control que permite la realización, la supervisión y orquestación de las actividades del dispositivo. La unidad de control puede tener además una interfaz de usuario para la programación, supervisión y configuración del dispositivo. Adicionalmente, el dispositivo puede proveerse con una interfaz de Internet o Intranet que permite el control remoto, etc. También se contempla el uso de una unidad de captura y almacenamiento de imágenes, por ejemplo en forma de un dispositivo de cómputo. Esta unidad de captura y almacenamiento de imágenes puede equiparse además con software o programas de análisis adecuado que permiten una caracterización de células o histología de células, o 7 para procedimientos de análisis de diagnóstico, por ejemplo en el caso de células tumorales. También se contempla el uso de programas de identificación microbiológica en el caso de que se analicen células bacterianas o virus.

En aún otro aspecto la presente invención se relaciona con un método para producir material filtrante plano ópticamente plano. El método comprende las etapas de fundir un medio de cambio de fase como se definió aquí anteriormente hasta que el medio se disperse bajo el material filtrante; y descender la temperatura del medio de cambio de fase hasta que el medio solidifique, dando como resultado un filtro ópticamente plano. En una modalidad preferida, el método se realiza con un material filtrante que comprende células capturadas o aisladas, por ejemplo células bacterianas como se definió aquí anteriormente. El método puede usarse también, en modalidades específicas para la preparación de material filtrante que comprende elementos tales como partículas de virus, entidades inorgánicas tales como metal, madera, plástico u otro material, por ejemplo piezas de dimensión micrométrica de material como el derivado de accidentes, mediciones de control de calidad, mediciones de pruebas de productos, etc.

En aún otro aspecto la presente invención se relaciona con un método para producir un medio de cambio de fase para la presente metodología. El método comprende las etapas de cortar o grabar cavidades de un bloque de medio de cambio de fase sólido. El medio de cambio de fase puede proveerse consecuentemente con una estructura porosa, semejante a malla, abierta, o parcialmente abierta, uno o más canales, uno o más pasajes o uno o más elementos tubulares. El corte, por ejemplo puede hacerse por medio de un láser o dispositivo láser. Los canales o pasajes pueden tener una conexión con los márgenes del medio de cambio de fase y/o tener contacto con el exterior del medio de cambio de fase. Adicionalmente , los pasajes, las aberturas, etc., pueden interconectarse . Se prefiere que las aberturas permitan un flujo adecuado de líquidos, en particular medio de crecimiento o de cultivo por abajo o en la vecindad de las células capturadas sobre un material filtrante. En una modalidad adicional el método puede comprender la etapa de moldear el medio de cambio de fase en un estado fundido o líquido en un molde correspondiente y dejar que el material solidifique, seguido por la extracción del molde.

Los siguientes ejemplos y las figuras se proporcionan para propósitos ilustrativos. Por lo tanto se entiende que el ejemplo y las figuras no deben considerarse como limitantes. La persona con experiencia en la técnica claramente será capaz de contemplar modificaciones adicionales de los principios presentados aquí.

Ej emplos Ejemplo 1 - Preparación de células MCF7 (cáncer de mama) Procedimiento de filtración Un matraz de cultivo células de 75 cm2 (Nunc) con 90 % de células MCF7 confluentes se tripsinaron (Tripsina + EDTA Invitrogen) durante 6 minutos y se resuspendieron en medio RPMI1640 suplementado con FBS, Penicilina/Estreptomicina y Glutamax (Invitrogen) . Las células se lavaron después una vez por medio de centrifugación (5 min. , 1000 rpm) y se resuspendieron en 10 mi de DPBS (Invitrogen) . La suspensión de células se diluye de tal manera que las células cubran aproximadamente 10 % del área filtrante disponible en 10 mi de DPBS. Se usó un soporte de filtro de microanálisis de vidrio (Millipore) para filtrar 10 mi de suspensión de células aplicando un vacío modesto en el flujo a través del compartimiento .

Preparación y visualización del filtro El filtro se removió a continuación del soporte de filtro y se coloco sobre un portaobjetos de microscopio estándar con 20 µ? de cera parafínica sólida depositada sobre el mismo. El portaobjetos de microscopio se transfirió a un elemento de Peltier, el cual proporcionó calor y fundió la cera parafínica (véase la figura 2A) . En el momento en el que la parafina se fundió por completo, el portaobjetos de microscopio se removió y se enfrío a temperatura ambiente hasta que la parafina se resolidificó (véase la figura 2B) . El portaobjetos se visualizó en un microscopio estándar (Zeiss) usando luz reflejada (véase la figura 3A) o pasó a un procedimiento de tinción estándar con Hemotoxilina y Eosina (H&E) (véase la figura 3B) . Éste último proporcionó aún más contraste .

Cuando se procesó de acuerdo con el procedimiento descrito arriba el filtro se mantuvo perfectamente unido a la capa de parafina y las células permanecieron perfectamente unidas al filtro (con o sin fijación antes del procedimiento de tinción) . Esto es notable porque el protocolo de H&E requiere cientos de inmersiones en recipientes de fluidos diferentes y lavado bajo agua corriente. Las células biológicas se visualizaron con muy alta calidad de imagen. La alta calidad de imagen es debido a la superficie ópticamente plana y por el hecho de que la capa de cera parafínica solidificada actúa como un buen difusor de luz.

Ejemplo 2 - una estructura de soporte de filtro fusible con un sistema de flujo integrado Al pipetear aproximadamente 400 µ? de parafina fundida en un volumen grande de agua caliente que a continuación se deja enfriar, se crearon parches de parafina delgados, planos y homogéneos. Usando un troquel caliente, se extrajo un círculo del parte sobre un portaobjetos de microscopio (1). La parte interna del círculo se removió usando un troquel circular frío más pequeño (2) . Después se calentó una aguja y se fijó en la pared lateral de una estructura de soporte circular (3, 4) . El filtro se aplicó (5) y usando el troquel caliente grande el filtro se selló sobre la estructura de soporte anular (6) usando el troquel caliente grande (1) . Al aplicar un vacío a la aguja se generó una baja presión en el compartimiento bajo el filtro permitiendo llevar a cabo los procesos de filtración (véase la figura 4) .

También puede aplicarse vacío por otros medios distintos al de una aguja, por ejemplo, mediante poros u orificios en el material de sustrato, o mediante poros u orificios en la cera parafínica de soporte. El material filtrante (con células) puede unirse al portaobjetos de microscopio por calentamiento. El calentamiento hace que la cera parafínica se funda y atraiga el filtro al portaobjetos de microscopio (como en el Ejemplo 1) .

Debido a que las células se fijan con respecto al filtro y el portaobjetos de microscopio, las mismas células pueden localizarse antes y después de un tratamiento.

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones :

1. Método para procesar células aisladas para hacerlas adecuadas para imaginología óptica, caracterizado porque comprende las siguientes etapas : (a) depositar material filtrante que comprende células capturadas sobre un medio de cambio de fase, el medio de cambio de fase montado sobre un portador; (b) fundir el medio de cambio de fase hasta que el medio se disperse bajo el material filtrante; y (c) descender la temperatura del medio de cambio de fase hasta que el medio solidifique, obteniendo un filtro que comprende las células en un solo plano óptico y en una posición fija.

2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque además comprende la etapa inicial de capturar una célula sobre un material filtrante.

3. El método de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque el material filtrante es capaz de aislar células por exclusión de tamaño de un fluido o una solución, preferentemente con un tamaño de poro de aproximadamente 0.5 a 20 µp?, más preferentemente de aproximadamente 8 µ?? y en donde el material filtrante es preferentemente un filtro de polímero, más preferentemente un filtro de policarbonato, parileno o nylon; o un filtro no polimérico, más preferentemente un filtro de silicio; o un microfiltro tridimensional.

4. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque el medio de cambio de fase es un medio que funde y solidifica en un intervalo de temperaturas de aproximadamente 25 °C a 70 °C.

5. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque el medio de cambio de fase comprende una estructura porosa, semejante a malla, abierta, o parcialmente abierta y/o comprende elementos de canal, pasaje o tubo, en donde la estructura o elementos permiten el paso de un fluido a través de el medio.

6. El método de conformidad con la reivindicación 4 ó 5, caracterizado porque el medio es una cera hidrocarbonada , preferentemente una cera parafínica que tiene una fórmula molecular de CnH2n+2 siendo n = 20 a 40.

7. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque el portador un portador de vidrio o un portador de material polimérico, y en donde el portador comprende un marcador de posición.

8. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque comprende como etapa adicional una actividad seleccionada del grupo de tinción, fijación, liberación, manipulación mecánica, manipulación biológica y manipulación bioquímica de las células aisladas.

9. El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque la actividad comprende cultivar las células aisladas, preferentemente mediante el flujo de fluido nutriente a través del medio de cambio de fase poroso, semejante a malla, abierto o parcialmente abierto.

10. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque la célula es una célula rara, preferentemente una célula tumoral circulante, o una célula bacteriana.

11. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizado porque la imaginología óptica es microscopia de campo brillante, microscopia de campo oscuro, microscopia de contraste de fases, microscopia de contraste de interferencia diferencial, microscopia de fluorescencia, microscopia de fuerza atómica, microscopia de barrido por láser confocal o microscopia de súper resolución.

12. El uso de un material filtrante procesado que comprende células aisladas adecuadas para imaginología óptica, el cual se obtiene por el método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, para análisis de diagnóstico, histológico, microbiológico, bioquímico, oncológico, o hematológico .

13. Un dispositivo para procesar células aisladas para hacerlas adecuadas para imaginología óptica, caracterizado porque comprende : (a) un material filtrante para capturar una célula; (b) un sistema de suministro de presión removible acoplado al material filtrante que permite aislar células sobre el material filtrante; (c) una capa de medio de cambio de fase; (d) un medio para transportar el material filtrante y/o la capa del medio de cambio de fase a un soporte; (e) una unidad de calentamiento para fundir el medio de cambio de fase hasta que el medio se dispersa bajo el material filtrante; y (f) una unidad de enfriamiento para descender la temperatura de la unidad de cambio de fase hasta que el medio solidifica, dando como resultado un filtro que comprende las células en un solo plano óptico y en una posición fija. RESUMEN DE LA INVENCION La presente invención se relaciona con un método para procesar células aisladas, en particular células tales como células de tumores circulantes, para hacerlas adecuados para imaginologí óptica, comprendiendo las etapas de (a) depositar material filtrante que comprende células capturadas sobre un medio de cambio de fase; (b) fundir el medio de cambio de fase hasta que el medio se disperse fuera del material filtrante; y (c) descender la temperatura del medio de cambio de fase hasta que el medio solidifique, dando como resultado un filtro ópticamente plano que comprende las células en una posición fija. El método puede comprender además una etapa inicial de captura de una célula sobre un material filtrante. El medio de cambio de fase, preferentemente cera parafínica, puede comprender una estructura porosa o semejante a malla que permite el paso de un fluido a través del medio. El medio de cambio de fase puede montarse además sobre un portador tal como un portador de vidrio o un portador de material polimérico. La presente invención se relaciona además con un material filtrante procesado que comprende células aisladas adecuadas para imaginología óptica, que puede obtenerse por medio del método; el uso de el material filtrante para análisis de diagnóstico, histológico, microbiológico, bioquímico, oncológico, o hematológico , así como un dispositivo para aislar células o procesar células para hacerlas adecuadas para imaginología óptica.