CN103649714A - 相变介质的过滤器支撑物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于处理经分离的细胞（尤其是诸如循环肿瘤细胞的罕见细胞）以使其适于光学成像的方法，所述方法包括以下步骤：（a）在相变介质上沉积包括捕获到的细胞的过滤材料；（b）熔化所述相变介质，直到介质在所述过滤材料下方被分散；以及（c）降低所述相变介质的温度，直到介质固化，在固定位置处形成包括所述细胞的光学平面过滤器。所述方法可以额外地包括在过滤材料上捕获细胞的初始步骤。所述相变介质（优选为石蜡）可以包括允许穿过所述介质的流体通过的多孔或网状结构。所述相变介质还可以被安装在载体上，诸如，玻璃载体或聚合材料载体。本发明还涉及经处理的过滤材料，其包括适于光学成像的经分离的细胞，通过所述方法可获得所述经分离的细胞；这种过滤材料用于诊断、组织学、微生物学、生物化学、肿瘤学或血液分析，还涉及一种用于分离细胞或处理细胞以使其适于光学成像的设备。

Description

相变介质的过滤器支撑物
技术领域
本发明涉及一种用于处理经分离的细胞（尤其是诸如循环肿瘤细胞的罕见细胞）的方法，以使其适于光学成像，所述方法包括以下步骤：（a）在相变介质上沉积包括经捕获的细胞的过滤材料；（b）熔化所述相变介质，直到所述介质在所述过滤材料下方被分散；以及（c）降低所述相变介质的温度，直到所述介质固化，在固定位置处形成包括所述细胞的光学平面过滤器。所述方法可以额外地包括在过滤材料上捕获细胞的初始步骤。所述相变介质（优选为石蜡）可以包括允许穿过介质的流体通过的多孔或网状结构。所述相变介质还可以被安装在载体上，诸如，玻璃载体或聚合材料载体。本发明还涉及经处理的过滤材料，其包括适于光学成像的经分离的细胞，通过所述方法可获得所述经分离的细胞；这种过滤材料用于诊断、组织学、微生物学、生物化学、肿瘤学或血液分析，也涉及一种用于分离细胞或处理细胞设备，以使其适于光学成像。
背景技术
转移（即，癌症从原发部位到不相邻的二级部位的扩散）是癌症研究、诊断和处置的主要挑战之一。转移被认为通过包括局部浸润、血管内渗、循环输送、微血管中抑制、血管外渗、微小转移形成、休眠、血管新生、移植以及大量转移形成（Weinberg，2007，The biology of cancer，GarlandScience，New York）的一系列步骤而得到发展。在其循环系统中（尤其在血流中）的输送期间，肿瘤细胞被称为循环肿瘤细胞（CTC）。CTC被认为在癌（即，上皮的恶性肿瘤）的转移扩散中起到关键作用。由此，对其的检测具有重要的预后和处置性含义，并且尤其与临床分期、疾病复发、处置反应和患者存活期相关联。CTC还被视为用于复发风险评估和处置疗程的独立替代标记。
然而，CTC在血流中是极其罕见的，并且在患有转移性疾病患者中被发现仅具有全血中每毫升1–10个细胞的频率，相比之下，在相同的体积中能够发现109个红血球和数百万个白血球。因此，有必要选择并富集这些罕见的循环肿瘤细胞。传统上，富集处理是基于CTC的密度差异，其通过密度离心法被分开。然而，痊愈率非常低。最近，CTC的富集是基于对具体表面标记（尤其是上皮黏附分子（EpCAM））的识别。因此，例如通过磁流体纳米粒子，能够以免疫磁性的方式富集CTC。然而，这种途径被约10%到90%的宽痊愈范围阻碍，所述约10%到90%的宽痊愈范围显然应归于表面标记的可变表达（Zheng等人，2011，Biomed Microdevices，13：203–213）。
作为用于分离CTC的备选方案，已经提出细胞尺寸排阻方法的使用，尤其应归于在许多情况下作为上皮细胞的CTC大于周围血细胞的事实。已经发展了若干过滤器类型，包括在随机位置处包括孔的聚碳酸酯过滤器、微加工过滤器、微加工单层2D过滤器、基于电场的微流体过滤器、基于镍电成型的过滤器微腔阵列设备或3D微过滤器设备（Zheng等人，2011，Biomed Microdevices，13：203–213）。还已经发展了类似的途径，其用于其他细胞类型的选择，例如，血流内或某些样本形态内的细菌细胞、骨髓细胞或脾细胞等。
然而，从溶液中选择具体细胞仅仅是确定细胞特性（例如，其转移性特征）必要的反应序列的第一步。由此，在细胞已经被分离之后，通常接受染色和光学微分过程。在这些后续步骤期间，过滤材料通常难以处理、变薄、易碎，并且容易破损。
另外，过滤器经常起皱并且不是光学平面，由此使细胞的光学成像处理复杂化。尽管现有技术提供了克服这个问题的途径，例如，通过使用免疫磁珠和磁体，以倚靠显微镜盖拉动细胞，这些方法复杂、耗时或需要专用装备。
因此，需要提供允许处理包括经分离的细胞的过滤材料的装置和方法，使得能够在过滤材料上快速并且精确地对捕获到的细胞进行成像。
发明内容
本发明解决了这些需要，并且提供用于处理经分离的细胞以使其适于光学成像的装置和方法。尤其通过用于处理经分离的细胞以使其适于光学成像的方法来实现以上目的，所述方法包括以下步骤：（a）在相变介质上沉积包括捕获到的细胞的过滤材料；（b）熔化所述相变介质，直到介质在所述过滤材料下方被分散；以及（c）降低所述相变介质的温度，直到介质固化，在固定位置处形成包括所述细胞的光学平面过滤器。所述方法提供以下优势：能够以简单、省时和精确的方式来处理可过滤细胞（诸如循环肿瘤细胞），用于后续光学分析步骤。尤其，甚至在不具有任何染色的情况下，已经发现在标准明视场显微镜中具有非常高的对比度的细胞是可成像的。对于经处理细胞的观察到的高质量特性的解释是介质散射光并且抑制来自过滤材料、光学组件和支撑材料的反射。由此，本方法以非常温和的方式建立光学平面过滤器表面。此外，过滤器上的经处理的细胞仍经过染色、固定、生物或机械操纵或培养途径。另外，在后续处理步骤期间，表面区域的变形能够通过固定在诸如玻璃的载体材料上来避免。由此，所述发展方法非常适于处理从血液样本中可推导的细胞类型，尤其是CTC。另外，它一般能够被应用于任何情况，其中（不管来源、类型或尺寸的）细胞（例如要求后续光学分析的细胞）存在于过滤材料上。
在本发明的优选实施例中，上文中定义的方法额外地包括在过滤材料上捕获细胞的初始步骤。
在本发明的又一优选实施例中，所述过滤材料能够以尺寸排阻细胞，以将其从流体或溶液中分离。过滤材料可以优选地具有0.5到20μm的孔尺寸，更优选为约8μm。在本发明的其他优选实施例中，上文中定义的所述过滤材料是聚合物过滤器，更优选为聚碳酸酯、聚对二甲苯或尼龙过滤器。在本发明的又一优选实施例中，上文中定义的所述过滤材料是非聚合物过滤器，更优选为硅过滤器。在本发明的又一优选实施例中，所述过滤材料是3D微过滤器。
在本发明的另一优选实施例中，所述相变介质是在约25℃到70℃的温度范围内熔化和固化的介质。
在又一优选实施例中，以上提及的相变介质包括多孔、网状、开放或部分开放的结构，和/或包括通道、通路或管元件，其中，所述结构或元件允许穿过所述介质的流体通过。
在本发明的又一优选实施例中，所述相变介质是烃蜡，优选为具有CnH2n+2（n=20到40）分子式的石蜡。
在本发明的又一优选实施例中，以上提及的所述相变介质被安装在载体上。在本发明的具体优选实施例中，所述载体是玻璃载体或聚合材料载体。在又一优选实施例中，所述载体（例如玻璃或聚合材料载体）包括位置标记。
在又一优选实施例中，上文描述的方法包括从对经分离的细胞进行染色、固定、释放、机械操纵、生物操纵和生化操纵的群组中选择的活动，作为额外的步骤。
在本发明的具体优选实施例中，所述活动包括优选地经由流动营养液穿过所述多孔、网状、开放或部分开放的相变介质来培养所述经分离的细胞。
在本发明的另一优选实施例中，上文提及的被分离或存在于过滤器上的细胞是罕见细胞。在具体优选实施例中，所述细胞是循环肿瘤细胞。
在又一优选实施例中，上文描述的所述光学成像是明视场显微镜检查、暗视场显微镜检查、相位对比度显微镜检查、微分干涉对比度显微镜检查、荧光显微镜检查、原子力显微镜检查、共聚焦激光扫描显微镜检查或超分辩率显微镜检查。
在另一方面，本发明涉及包括适于光学成像的经分离的细胞的经处理的过滤材料，通过例如上文定义的根据本发明的方法可获得所述经处理的过滤材料。
在另一方面，本发明涉及包括适于光学成像的经分离的细胞的经处理的过滤材料的使用，通过例如上文定义的根据本发明的方法可获得所述经分离的细胞，用于诊断、组织学、微生物学、生物化学、肿瘤学、或血液分析。
在另一方面，本发明涉及一种用于处理细胞以使其适于光学成像的设备，包括：
（a）上文定义的用于捕获细胞的过滤材料；
（b）上文定义的相变介质层；以及
（c）加热和/或冷却单元。
最后，在具体实施例中，本发明涉及一种上文提及的用于处理细胞以使其适于光学成像的设备，额外地包括被耦合到过滤材料的可移动压力递送系统，允许在过滤材料上分离细胞，和/或上文提及的用于将所述过滤材料和/或所述相变介质层输送到载体的装置。
附图说明
图1描绘了所述方法的横截面：熔化支撑结构将使相变介质均匀地分布在物镜和过滤器之间。固化在适当的位置固定过滤器，使其关于物镜在单光学平面和在固定的位置留下并且保持全部细胞。
图2示出了珀耳帖（Peltier）元件，其熔化支撑聚碳酸酯过滤器的石蜡结构（图2A），冷却之后所述聚碳酸酯过滤器形成光学平面且固定的滤波器表面（图2B）。
图3A示出了在石蜡支撑结构熔化之后在具有8μm孔（小黑点）的聚碳酸酯过滤器（Whatman Cyclopore跟踪蚀刻膜）顶部的MCF7（乳腺癌）细胞。图3B示出了在石蜡支撑结构熔化和后续H&E染色之后在具有8μm孔（小黑点）的聚碳酸酯过滤器（Whatman Cyclopore跟踪蚀刻膜）顶部的MCF7（乳腺癌）细胞。所述细胞保持在过滤器上并且在整个染色协议中过滤器经由石蜡保持附着显微镜载玻片。
图4示出了对设备的样本原型创建的步骤，以测试过滤器的过滤和光学平化的集成功能。
图5描绘了具有由过滤器分开的2室的实施例。图5A示出了以顶部观察的可熔化支撑结构。图5B示出了支撑过滤器的可能的支撑结构（4，图5A）。由内管（2）和过滤器（在支撑结构的顶部）密封第一隔室，由内管（2）和外管（3）密封第二隔室。在该实施例中，能够容易地被移除细胞供应和真空生成机器，在其之后过滤器（3）可以变平并且被成像。
具体实施方式
本发明涉及用于处理经分离的细胞以使其适于光学成像的装置和方法。
尽管将关于具体实施例描述本发明，本说明书不被解释为限制意义。
在详细描述本发明的范例性实施例之前，给出对理解本发明重要的定义。
如在本说明书和所附的权利要求中使用的，“一”、“一个”和“这个”的单数形式也包括相应的复数，除非上下文清晰地另有指示。
在本发明的上下文中，术语“约”和“近似”指代本领域技术人员将理解的精确度的区间，以仍确保讨论中的特点的技术效果。所述术语通常指示与指示的数值的偏差为±20%、优选为±15%、更优选为±10%、以及甚至更优选为±5%。
应当理解，术语“包括”不是限制。为了达到本发明的目的，术语“构成”被认为是术语“包括”的优选实施例。如果在下文中，群组被定义为包括至少某个数量的实施例，这意味着也涵盖仅由这些实施例优选构成的群组。
另外，术语“第一”、“第二”、“第三”或“（a）”、“（b）”、“（c）”、“（d）”、“（i）”、“（ii）”等以及在说明书中和权利要求中的类似表述被用于在相似元件之间进行区分，并且不一定用于描述连续或按时间排列的顺序。应当理解，如此使用的术语在适当情况下是可互换的，并且本文描述的本发明的实施例能够以除本文描述或图示以外的其他次序进行操作。
假如术语“第一”、“第二”、“第三”或“（a）”、“（b）”、“（c）”、“（d）”、“（i）”、“（ii）”等涉及方法或使用或化验的步骤，在所述步骤之间不存在时间或时间间隔一致，即，可以同时实施所述步骤或在这些步骤之间可以有几秒、几分钟、几小时、几日、几周、几月或甚至几年的时间间隔，除非在上文或下文中陈述的申请中另有指示。
应当理解，由于本文描述的具体方法、协议、试剂等可以变化，本发明不限于本文描述的具体方法、协议、试剂等。也应当理解，本文使用的词汇仅仅是出于描述具体实施例的目的，并不意味着限制本发明的范围，将仅通过所附的权利要求限制本发明的范围。除非另有定义，本文使用的全部技术和科学术语具有与本领域普通技术人员中的一个普遍理解的相同的含义。
如上文已经陈述的，在一个方面，本发明涉及一种用于处理经分离的细胞以使其适于光学成像的方法，所述方法包括以下步骤：（a）在相变介质上沉积包括捕获到的细胞的过滤材料；（b）熔化所述相变介质，直到介质在所述过滤材料下方被分散；以及（c）降低所述相变介质的温度，直到介质固化，在固定位置处形成包括所述细胞的光学平面过滤器。
本文使用的术语“处理经分离的细胞”涉及对一个或更多细胞的处置和处理，所述一个或更多细胞从其环境中已经被选择和/或富集，即，涉及在对细胞的选择或富集步骤之后实施的步骤。本文使用的“细胞”可以是任何类型的细胞，例如，诸如细菌细胞的原核细胞、或诸如低等真核或原生生物细胞的真核细胞、或来源于高等真核生物的细胞。通常，所述细胞是来源于哺乳动物的细胞，优选为来源于人类的细胞。细胞还可以是来源于家畜或农畜的细胞，例如狗、猫、牛、猪、鸡、小鼠、大鼠、鸡、或猴细胞。在具体实施例中，所述细胞可以来源于体液样本，诸如全血、血清、血浆、淋巴液、清液。所述细胞可以备选地来源于医学或法医样本，例如活检样本。在其他实施例中，所述细胞可以来源于植物或真菌，例如来源于愈伤组织培养。在其他实施例中，所述细胞也可以来源于以下样本，诸如或包括粪便、泪液、唾液、鼻液、痰液、耳液、生殖器液、胸液、乳液、初乳、胎液、羊水、汗液、滑液、腹水、脑脊液、胆汁、胃液、眼房水、玻璃体液、胃肠液、渗出液、漏出液、胸水、心包液、精液、上呼吸道液、腹膜液、从免疫反应的部位获得的液体、从合并收集部位获得的液体、支气管灌洗、或相应的抽取物、或尿液、或例如来自全部适当的器官（例如肺、肌、脑、肝脏、皮肤、胰、胃等）的活检材料、有核细胞样本、与粘膜表面、毛发、皮肤相关联的液体。另外，所述细胞可以来源于环境资源的样本，例如水样本、肉类或家禽样本、来自潜在污染源的样本等。
因此，所述细胞可以是或来源于任何已知组织类型或组织形态，例如来源于固体组织，或是可自由移动或独立的。假如给定固体组织，通过采用本领域技术人员已知的适当的溶解技术，例如在适当的缓冲溶液或营养液中，可以将细胞从这样的结构中溶解。在一些实施例中，可以从样本中直接获得细胞。在其他情况下，样本可以经受例如基于标准协议的样本制备技术，例如，所述样本制备技术包括部分纯化。例如，血液样本可以被离心，排泄物样本可以被切片并且用生理可接受的缓冲使其均质化，并且清洗液、痰液样本可以被液化和分馏。并且，在具体实施例中，抗生素或杀菌剂可以被添加到样本中。优选使用经分离的细胞，在三维或光学密集大于一个细胞层结构或形态中提供所述经分离的细胞。因此，优选使用在一个细胞层结构或形态或更开放的结构中提供的细胞。在具体实施例中，细胞可以单独存在，即，作为不直接接触相邻细胞的单个细胞，或互相协调，例如，作为细胞集聚或细胞对或细胞群。优选地，细胞存在于非集聚构造中，更优选地作为与相邻细胞没有直接接触的单细胞。在又一实施例中，如果细胞存在于集聚构造中，或与相邻细胞有接触，尤其当这样的结构携带生物相关性，例如在循环微栓子的情况下，可以是有利的。
所述细胞可以具有任何尺寸、形态、表面或表面结构，例如所述细胞包括蛋白质结构、或糖基化或非糖基化表面实体等。因此，所述细胞可以具有约0.5到5μm的小直径，或更大，具有约7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25或30μm或更大的直径。
所述细胞可以是有活性的，例如能够生长和/或核分裂活跃和/或能够分裂等；所述细胞可以是休眠的，例如核分裂不活跃，或不能分裂，但代谢活跃；所述细胞或是死亡的，例如代谢不活跃。在其他实施例中，根据本发明，细胞可以被分离作为活性细胞或休眠细胞，并且在处理期间死亡。在其他实施例中，细胞可以被分离作为死细胞。在其他具体实施例中，根据本发明，细胞可以被分离作为活性细胞，并且在处理或部分处理之后仍有活性。
可以根据任何适当方法实施所述分离，即，对细胞的选择和/或富集。例如，例如通过单、双或三重过滤设备可以过滤细胞。备选地，例如通过表面标记和相应的配体或结合分子（诸如抗体）之间的具体相互作用，根据细胞表面结构可以选择或分离细胞。在其他实施例中，例如通过细胞分选设备，可以根据形态和/或尺寸来选择或分离细胞。在另一实施例中，例如通过测试细胞代谢活动，或其核分裂活动，可以根据其活性来选择或分离细胞。在其他实施例中，细胞内结构的尺寸可以用于选择，例如核的尺寸或形态、线粒体、叶绿体、液泡的存在或可检测性等。
本文中使用的术语“适于光学成像”涉及在高分辨率和具有适当显微镜装备（通常具有明视场显微镜）的细胞可被光学检测的能力。适于光学成像的细胞一般存在于单光学平面，即，检测区域内的全部细胞存在于层，所述层具有约经分离的细胞的平均直径加上所述直径的约5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%或110%，优选地加上所述直径的约5%、10%、15%、20%或25%的厚度。额外地或备选地，适于光学成像的细胞可以示出关于其周围的高对比度。通过染色过程和/或通过使用漫射光源和/或通过消除有关标本的干涉反射，还可以增强这样的高对比度。
在所述方法的第一步骤中，过滤材料（包括上文定义的捕获到的细胞）被放置在相变介质上。本文使用的术语“过滤材料”涉及能够承载或支持一个或更多细胞，优选多于10、50、100、500、1000、5000或10000个细胞的群的任何材料。所述材料可以是多孔或具有开口，其允许水分子或其他液体分子渗透。所述材料还能够允许空气或氧气分子渗透。在某些实施例中，例如通过提供孔或孔状结构，其允许某些细胞、细胞类型、细胞尺寸等通过，而保留其他细胞、细胞类型或细胞尺寸，过滤材料可以额外地具有过滤或保留功能。因此，具有过滤或保留功能的过滤材料可以具有任何适当的孔尺寸、孔布置、厚度，和/或由本领域技术人员已知的任何适当的材料构成。所述过滤材料可以具有任何适当形态，例如是圆形、椭圆形、矩形、方形、三角形，或具有提到的形态的混合。优选是圆形过滤材料。在其他实施例中，所述过滤材料可以覆盖连续、封闭的内部区域，或其备选地是在内部区域内具有中心或不对称孔洞的环形形态，或其在内部区域内包括两个或更多开口。
本文中使用的“相变介质”涉及示出了在适于处理生命体的温度范围内（优选在约25℃到70℃温度范围内）固相和液相之间的相转变的介质。优选地，相变介质在室温以上的温度（例如在高于28℃的温度）固化。通常对介质的能量添加可以诱导相转变。例如，通过使用UV辐射、红外辐射或直接加热，可以诱导相转变，即，介质变成优选粘性的流体。而且，本发明上下文中使用的相变介质还应当具有在固相是半透明的特性。本文中使用的术语“半透明”涉及让应用光束的约50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%通过的能力。另外，或备选地，相变介质可以是漫射的。本文使用的词“漫射”涉及作为可见光漫射器的相变介质的能力。因此，介质可以有利地—除在单光学平面存在细胞之外—有效地消除过滤材料、支撑材料和光学成像装备、尤其是显微镜载玻片的一侧或两侧之间的反射。由此，相变介质的这些特性对总体图像质量做出贡献。
在本发明的其他实施例中，相变介质可以具有约10到100μm的厚度，例如厚度为10μm、15μm、20μm、25μm、30μm、35μm、40μm、45μm、50μm、55μm、60μm、65μm、70μm、75μm、80μm、85μm、90μm、95μm、100μm或更多、或在提及的值之间的任何值。在具体实施例中，所述厚度也可以更小。在特定优选实施例中，相变介质具有约40μm的厚度。特定优选地调整相变介质的厚度，使得没有液体相变介质穿过过滤材料的孔或开口。在本发明的其他实施例中，相变介质可以覆盖以上提到的过滤材料的面积的约10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、110%或更多或在这些值之间的任何比例的面积。
在优选实施例中，相变介质初始可以为固体转变状态。在固体转变状态中，相变介质可以具有任何适当形态，例如是圆形、椭圆形、矩形、方形、三角形，或具有提及的形态的混合。优选是圆形相变介质。在其他实施例中，相变介质可以覆盖连续、封闭的内部区域，或其备选地具有在内部区域内具有中心或不对称孔洞的环形形态，或其在内部区域内包括两个、三个、4、5、6、7、8或更多开口。在图5A中描述了本发明设想的相变介质形态的范例。
优选地，例如通过使相变介质具有与过滤材料相同、基本上相同或相似的形态、尺寸、面积或直径，将相变介质调整为过滤材料的尺寸、面积或直径。在其他实施例中，可以将相变介质调整为过滤材料的尺寸、面积或直径，使得处于液体转变状态中的所述相变介质覆盖与过滤材料相同，基本上相同或相似的面积，和/或具有与过滤材料相同或基本相同或相似的形态、尺寸或直径，以便增强在过滤材料下方的相变介质的分散和/或减少建立平整表面需要的更高温度的时间。
在其他实施例中，相变介质可以具有与过滤材料相同、基本相同或相似的形态，例如，如果过滤材料是圆形的，则相变介质也是圆形的，如果过滤材料是矩形形态，则相变介质也可以是矩形等。在其他实施例中，相变介质可以具有不同于过滤材料的形态。优选地，相变介质可以具有小于过滤材料的尺寸。在优选实施例中，相变介质可以具有环形形态，而过滤材料具有圆形形态。备选地，相变介质可以具有格栅或网状结构，而过滤材料具有矩形形态等。
本文中使用的术语“将过滤材料放置在相变介质上”意味着上文定义的过滤材料，尤其包括细胞或经捕获的细胞的过滤材料，从过滤或捕获一个或更多细胞的部位被转移到相变介质所在的部位，优选地，在所述部位能够处理相变介质，使得能够发生从固相到液相的转变。通常在相变介质的顶部提供过滤材料。在具体实施例中，过滤材料可以覆盖下面的相变介质。在某些实施例和情况中，相变材料也可以位于或存在于过滤材料的顶部。在其他具体实施例中，相变材料可以位于围绕过滤材料的边缘或环形形态，或仅仅部分位于过滤材料下方。在其他实施例中，相变介质可以被部分地放置在过滤材料的下方和顶部。在又一实施例中，过滤材料可以以类似三明治的方式被放置在两层相变介质之间，即，一层在过滤材料下面，另一层在过滤材料顶部。如果相变介质被用在过滤材料的顶部，或两侧，优选具有薄，或非常薄的一层的相变介质，例如不超过捕获到的细胞的最大厚度，或捕获到的细胞最大厚度的50%、40%、30%、20%、10%。
在某些实施例中，沉积过程可以被集成在设备结构或整个处理工作流程内。范例是针对过滤或细胞捕获处理所需的设备单元移除和/或针对液体残留形成过滤材料移除的沉积步骤。在这些实施例中，例如在过滤处理或细胞捕获处理期间，相变介质可以已经存在于初相，或相变介质可以替代先前使用的结构，用于实施过滤或细胞捕获处理。在优选实施例中，整个处理工作流程可以包括使用图5B中示出的隔室结构，或使用图4中示出的实体。
在所述方法的第二步骤中，熔化本文中定义的相变介质，直到介质被分散在本文中定义的过滤材料下方。可以根据相变介质的类型、尺寸、厚度、其温度特性、覆盖的面积、室温或任何其他适当的参数来实施熔化步骤。可以设置熔化温度为本文中指示的适当温度范围（例如约37℃到70℃）内的高位值，以便提高相转变的速度。在这样的实施例中，例如由于后续固定或化学处理等，细胞的活性可以不重要。在其他实施例中，可以设置熔化温度为更低的值，例如不高于37–50℃，优选不高于37℃的值。在这个实施例中，细胞在熔化过程之后可以有活性，并且后续其可以利用针对活细胞的具体测试进行测试。备选地，例如通过提供适当的营养等，这样的细胞在过滤材料上可以保持存活。熔化期也可以适于相变介质的类型、尺寸、厚度、其温度特性、覆盖的面积、室温或任何其他适当的参数。例如，熔化期可以是1秒、5秒、7秒、10秒、15秒、20秒、25秒、30秒、35秒、40秒、45秒、50秒、1分、2分、3分、4分、5分、7分、10分、15分或更多、或在指示值之间的任何值的时段。
通过任何适当的能量传递单元，例如通过加热设备、UV光源、红外光源、微波源等可以传达相变介质的熔化。在具体实施例中，根据本发明的能量传递单元可以位于过滤材料附近，或设备或装置结构内。优选的能量源是珀耳帖（Peltier）元件。
在本发明的具体实施例中，从外部例如以注射器的方式或经由连接到过滤材料的流体可以提供熔化的相变介质。在这些实施例中，由于在离过滤材料某个距离处实施温度升高活动，以上提及的沉积步骤不是必要的。借助于阀门、泵送单元、管道实体或任何其他微流体输送装置，熔化的相变介质还可以被输送到过滤材料。在具体实施例中，输送处理可以被集成在微流体设备或装置的工作流程内。
本文中使用的术语“相变介质分散在过滤材料下方”涉及相变介质完全或基本完全散布在过滤材料的整个区域。优选地，相变介质的分散或散布导致在过滤材料的全部区域中基本相同厚度和密度的等平面介质层。分散相变介质可以优选无气泡，或基本无气泡。
在本发明的其他备选实施例中，相变介质的散布或分散也能够位于过滤材料的具体区，例如过滤材料的中心、过滤材料的远区、过滤材料上细胞所在的区，例如在过滤材料上仅仅非常少的细胞存在的场景，或过滤材料的任何其他区。在其他实施例中，例如通过提供传送熔化的相变介质的过滤结构，可以预确定区。
在本发明的其他具体实施例中，例如在相变介质未完全分散在过滤材料的整个区域的情况下，或在介质层不具有基本相同厚度的情况下，本文中定义的熔化步骤可以重复一次或更多次。
在所述方法的第三步骤中，降低温度，直到相变介质固化。根据相变介质的熔化和/或分散的程度、其温度特性、覆盖的面积、室温或任何其他适当的参数，可以实施温度降低步骤。通过温度降低活动可以达到的最终温度可以被设置为本文中指示的适当的温度范围，例如约4℃–35℃。最终温度可以优选被设置为约4、8、10、20、22、24、25或26℃的低温，以便提高相变介质向固相的相转变速度。通过主动冷却处理，例如，通过将熔化的介质冷却到指示的温度，或通过终止加热或熔化处理，例如通过停止加热、UV光或红外光、或微波设备并且让相变介质的温度适于周围温度或室温，可以实施温度的降低。
在其他实施例中，例如通过在5℃、10℃、15℃或20℃的跳跃降低温度，或通过直接降低（即，冷却到最终温度），可以以级联方式实施温度降低步骤。本领域技术人员将已知并且本发明也设想其他降低模式或温度减少程序。
在本发明的某些具体实施例中，温度的级联降低可以与部分温度升高结合。例如温度降低为10℃之后，可以执行5℃的升高，随后温度进一步减少等。
当相变介质不包括或基本不包括液体区间或区域时，相变介质可以被认为是固化的。
通过任何适当的冷却设备可以传达相变介质的温度降低。在具体实施例中，这样的冷却设备可以位于过滤材料附近，或设备或装置结构内。优选的冷却设备是珀耳帖元件。在其他优选实施例中，珀耳帖元件可以用于熔化步骤和后续的冷却步骤。而且，可以指导珀耳帖元件来执行本领域技术人员已知的具体熔化和冷却程序。
可以实施相变介质的温度降低步骤，使得过滤材料被转换为光学平面过滤器，优选为包括在单光学平面存在的细胞的过滤器，即，检测区域内的全部细胞存在于层，所述层具有约经分离的细胞的平均直径加上所述直径的约5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%或110%，优选地加上所述直径的约5%、10%、15%、20%或25%的厚度。
在其他优选实施例中，由于在相变介质中细胞的嵌入，所述细胞可以在过滤器上的固定位置。例如对显微镜中经处理的过滤器的第一轮分子分析之后等，可以检测并且记住这个固定位置，以便允许后续分析步骤。由此，经由显微镜分析开放对具体细胞的识别和选择，所述固定位置允许经识别的细胞的后续移除或标签，例如以进行其他个体测试。
在本发明的优选实施例中，上文中定义的方法额外地包括在过滤材料上捕获细胞的初始步骤。通过任何适当的装置可以执行在过滤器上“捕获”一个或更多细胞，导致在上或下文定义的过滤材料上存在细胞。在一个实施例中，通过过滤处理可以实施捕获，例如经由采用压力传递系统，或例如在流体或微流体系统或设备中使用流体流。在其他实施例中，可以根据其表面结构通过选择或分离细胞来执行在过滤材料上捕获细胞，例如通过表面标记和相应的配体或结合分子（诸如抗体）之间的具体相互作用。优选为基于例如上皮黏附分子（EpCAM）的黏附技术。由本发明设想的这些技术的不同实施方式对于本领域技术人员来说将是已知的。一个优选实施例是例如基于磁流体纳米粒子的免疫磁性选择处理。在其他实施例中，继富集和/或培养步骤之后可以捕获细胞。而且，可以富集或具体处理细胞，以便在成像之前移除潜在过量的免疫磁性粒子。
在具体实施例中，通过使用过滤材料或排除不同尺寸或形态的细胞的过滤器组，可以实现捕获不同尺寸、具体起源、或具体表面构成等的细胞。例如，为了捕获小细胞，诸如细菌细胞，可以使用一个或两个或三个过滤器组。在测试环境样本的情况下，使用具有恰当孔尺寸的一个过滤器组可以是有利的。在使用血液或其他体液的情况下，使用两个或多于两个的过滤器机构可以是有利的，其中，一个过滤器捕获大的，例如人类细胞，而具有更小孔的第二过滤器捕获细菌细胞。可以从适当的出版物，例如Sage和Neece，1984，J Clin Microbiol，20（1）：5–8中获得其他细节。
在优选实施例中，过滤材料可以能够尺寸排阻细胞，使其从环境，例如从流体或溶液，通常从血液样本中分离。通过过滤材料的具体孔或开口尺寸可以实现尺寸排阻。另外，孔形态是圆柱形、圆形、椭球形、矩形或菱形。另一相关参数是在过滤或捕获处理期间的流速或流体压力。例如，流速可以在从每分钟50ml到0.1ml的范围内。然而，本发明也设想在指示的范围以下或以上的其他流速。另外，可以修改3维孔形态，以便实现具体尺寸和/或灵活排除。在具体实施例中，优选使用过滤材料，其允许保留细胞的细胞膜完整性，即，以捕获完整细胞和/或有活性的细胞。在备选实施例中，可以使用不必要保留细胞膜完整性的过滤材料。因此，过滤材料和任选的过滤过程或过滤参数可以适于应当被捕获的细胞尺寸，和/或捕获到的细胞的功能要求，即，是完整的或有活性的等。
在本发明的优选实施例中，过滤材料可以具有约0.5到20μm的孔尺寸，例如孔尺寸约为0.5μm、0.75μm、1μm、2μm、3μm、4μm、5μm、6μm、7μm、8μm、9μm、10μm、11μm、12μm、13μm、14μm、15μm、16μm、17μm、18μm、19μm或20μm或更多、或指示值之间的任何值。根据要分离的细胞可以选择孔尺寸。在本发明的其他具体实施例中，过滤材料或在过滤过程内实现的过滤材料可以具有约0.5到20μm的尺寸排阻，例如约0.5μm、0.75μm、1μm、2μm、3μm、4μm、5μm、6μm、7μm、8μm、9μm、10μm、11μm、12μm、13μm、14μm、15μm、16μm、17μm、18μm、19μm或20μm或更多、或在指示值之间的任何值的尺寸排阻。本文中使用的术语“尺寸排阻”意味着具有约5μm和更大的平均直径的细胞，例如5μm值的细胞在过滤材料上被捕获，而具有小于5μm平均直径的细胞通过过滤器并且不被捕获。
对于捕获细菌细胞，优选地使用约0.5μm到4μm孔尺寸的过滤材料。对于捕获无血小板的血液成分，优选地使用约4μm到10μm孔尺寸的过滤材料。对于捕获无红血球的血液成分，优选地使用约7μm到12μm孔尺寸的过滤材料。对于捕获肿瘤细胞，可以使用约8μm到20μm的较大孔尺寸。对于肿瘤细胞的分离，尤其对于上皮肿瘤细胞的分离，具体优选使用8μm的孔尺寸，其被认为是恰当的孔尺寸。在其他具体实施例中，还可以从样本中（例如从溶解宿主细胞的悬浮液中）捕获或分离病毒颗粒、病毒或噬菌体。对于这样的捕获过程，可以使用约20nm到300nm的孔尺寸，更优选约20nm到约50nm。相应的过滤器可以是尺寸排阻/病毒移除过滤器，诸如颇尔公司销售的多孔环氧纤维过滤器。如果将要捕获或分离的是病毒、病毒颗粒或噬菌体，则过滤器优选与具有更大孔尺寸的预过滤器进行组合。本发明的优势是，例如病毒颗粒的AFM和/或STM研究在很大程度上得益于通过根据本发明的所述方面创建的均匀的、非常平整的表面。
在优选实施例中，使用的过滤材料由弹性和/或耐液压和/或化学惰性的材料构成，即，不与样本内的生物或生化成分反应和/或耐例如约–80℃到+130℃范围内的温度变化。而且，过滤材料可以耐UV辐射。
在优选实施例中，过滤材料可以是适当的聚合材料。聚合材料的优选范例是聚碳酸酯、尼龙或聚对二甲苯。例如，在使用两层或更多层过滤器的情况下，也设想是相似材料，或衍生物或其组合。在其他优选实施例中，过滤材料可以是适当的非聚合材料。非聚合材料的优选范例是硅。例如，在使用两层或更多层过滤器情况下，也设想是相似材料，或衍生物或聚合材料和非聚合材料的组合。在本发明的其他优选实施例中，过滤材料可以是由以3维方式布置的聚对二甲苯部分构成的3D微型过滤器，3D微型滤波器在孔开口下下方包括系船柱状的结构，例如从Zheng等，2011，BiomedMicrodevices，13：203–213中可获得。在本发明的具体优选实施例中，过滤材料是聚碳酸酯过滤器，更优选Whatman Cyclopore跟踪蚀刻膜过滤器，甚至更优选具有8μm孔的Whatman Cyclopore跟踪蚀刻膜过滤器。
在本发明的其他优选实施例中，上文中定义的相变介质是在约25℃到70℃的温度范围内熔化和/或固化的介质。例如相变介质可以在约25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69或70℃的温度或在这些值之间的任何温度熔化。而且，相变介质可以在约25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69或70℃的温度或在这些值之间的任何温度固化。本文中使用的术语“熔化”涉及相变介质完全或基本完全从固相转变为液相的能力。本文中使用的术语“固化”涉及相变介质完全或基本完全从液相转变为固相的能力。应注意，对于相同的相变介质，即，具有清晰定义的分子成分的相变介质，例如石蜡，其物理相转变特性是相同的。由此，对于这样的相变介质，该介质的熔化温度与其固化温度相同。然而，本发明涵盖不同相变介质的使用，其可以从具有以上指示的熔化和固化温度范围的介质中选择。
在本发明的其他优选实施例中，相变介质包括多孔、网状、开放、或部分开放的结构。例如，相变介质可以具有某个厚度的3维结构，允许存在开口或空腔。在优选实施例中，这样的开口可以具有通道、通路或管元件形态。这些结构可以能够在相变介质的全部分区或区域之间提供连通性，例如，对于流体和/或对于气态实体（例如对于空气）的连通性。优选地，这样的结构或元件允许流体通过相变介质的空腔。
例如，通过从大量紧密的相变介质中刻出或切出相应的分区可以提供空腔、开口或通道结构。备选地，当熔化或液体材料放入相应的模具可以烧铸相变介质，并且随后使其固化，然后抽取模具。备选地，通过在特定位置局部地熔掉或燃掉材料，激光或激光设备可以用于切出结构。
假如过滤材料位于所述相变介质上，或与其连接，相变介质的多孔、网状、开放或部分开放的结构和/或通道、通路或管元件的存在可以用于将流体或溶液（例如营养液）递送到所述过滤材料上捕获的细胞。通过使用相变介质的连通性特点，在本文中描述的过滤材料上培养捕获到的细胞，尤其有活性的捕获到的细胞变得可能。由此，在约30分钟到几周的时间段内，提供诱导或抑制因子、选定的营养素等，捕获到的细胞可以保持活性。而且，例如通过使用标准的细胞培养方法（诸如胰蛋白酶化），培养之后，细胞可以从过滤器上移除，并且随后被转移到标准的细胞培养瓶。经由光学成像过程，可以分析捕获到的细胞，或如本文中描述的进行处理等。通常，例如过滤材料沉积在相变介质上之后，即，任何熔化步骤之前，相变介质的多孔、网状、开放、或部分开放结构可以存在于固化状态。继本文定义的熔化步骤之后，相变介质可以失去其多孔、网状、开放、或部分开放结构，并且转换为光学平面过滤器。在具体实施例中，然而，在已经熔化和固化之后，相变介质仍可以包括多孔、网状结构或至少部分开放的结构。例如，这样的结构可以存在于具体区域，同时其他区域示出光学平面结构。
在本发明的优选实施例中，本文中描述的相变介质是烃蜡。术语“烃蜡”涉及具有CnH2n+2（n=20到40）分子式的碳氢化合物或碳氢化合物的混合物，或具有其他分子（优选为其他有机分子）的这些碳氢化合物的混合物。例如，烃蜡可以由饱和n–和异烷烃和/或环烷和/或烷基–和环烷取代的芳香化合物和/或环烃的混合物构成。在烃蜡中包括的烷烃或其他分子可以含支链或不含支链，或包括含支链和不含支链分子的混合物。含支链分子可以具有不同程度的支链，或有不同程度的支链，例如所述含支链分子包括1、2、3或更多支链，或支链中还含支链，即具有1、2、3或更多二级生成支链。在优选实施例中，相变介质是石蜡。“石蜡”最大包括碳氢化合物或具有CnH2n+2（n=20到40）分子式的碳氢化合物的混合物。相变介质的其他设想的和潜在有用的范例包括具有CnH2n+2（n=24到36，或n=24）、CnH2n+2（n=25）、CnH2n+2（n=26）、CnH2n+2（n=27）、CnH2n+2（n=28）、CnH2n+2（n=29）、CnH2n+2（n=30）、CnH2n+2（n=31）、CnH2n+2（n=32）、CnH2n+2（n=33）、CnH2n+2（n=34）、CnH2n+2（n=35）、CnH2n+2（n=36）、CnH2n+2（n=37）、CnH2n+2（n=38）、CnH2n+2（n=39）、CnH2n+2（n=40）、CnH2n+2（n=41）、CnH2n+2（n=42）、CnH2n+2（n=43）、CnH2n+2（n=44）、或CnH2n+2（n=45）分子式的分子，或这些分子的任何混合物。这样的混合物可以以任何适当的比例存在，所述混合物包括2、3、4、5、6、7、8、9、10种或更多分子，包括占量的5%、10%、15%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或90%的分子并且包括占相应的量的第二或其他分子。
在另一优选实施例中，相变介质是无序材料，其具有一致的光散射特性。该材料组的设想范例是C10到C20有机酸，例如，癸酸到花生酸。所述组也可以包括具有不同碳链长度的酯类和醇类。在其他实施例中，相变介质可以由基于狄尔斯阿尔德（Diels-Alder）机制的可逆系统构成。
在本发明的其他具体实施例中，相变介质可以是动物蜡或植物蜡。通常，蜡是通过若干植物或动物进行生物合成，并且可以包括蜡酯、蜡酸、蜡醇和碳氢化合物。蜡酯可以从各种羧酸和各种脂肪醇中获得。动物蜡的成分可以取决于物种和有机体的地理位置。动物蜡的范例包括蜂蜡，或其他昆虫分泌的蜡，以及抹香鲸蜡。植物蜡的范例包括源于巴西棕榈的巴西棕榈蜡，以及小烛树蜡、小冠椰子蜡、甘蔗蜡或藤蔓蜡。植物蜡可以优选为植物的表皮蜡，其包括取代的长链脂肪烃的混合物，或所述植物蜡含有烷烃、脂肪酸、伯醇和仲醇、二醇、酮和/或醛。在本发明的其他优选实施例中，相变介质可以被安装在载体上。
本文中使用的术语“载体”涉及允许支撑相变介质的任何结构。所述载体应当优选为对本文所述的用于熔化/固化过程的温度有抵抗力的。另外，或备选地，例如在相变介质的上下文中上文所述的，载体可以是半透明的。由此，例如对于太阳光光谱和/或对于太阳光的波长的光谱内或太阳光的波长的光谱外的特定波长范围，载体可以是半透明的。这类波长的范例包括紫外光的波长。从而，在过滤材料上捕获到的细胞的光学成像可以变得可行。
优选的载体是玻璃载体。也优选是由聚合物或塑性材料（例如由热塑性塑料或弹性材料）构成的载体。本文中使用的术语“热塑性塑料”涉及热软化塑料聚合物，当加热时其变成液体，并且当充分冷却时冻结到玻璃状态。热塑性塑料可以是高分子量聚合物，其链通过弱范德华力、更强的偶极–偶极相互作用和氢键、或芳环进行关联。热塑性塑料的范例包括丙烯睛一丁二烯一苯乙烯共聚物（ABS）、丙烯酸（PMMA）、赛璐珞、醋酸纤维素、环烯共聚物（COC）、乙烯–醋酸乙烯酯（EVA）、乙烯醇（EVOH）、氟塑料（PTFE、与FEP、PFA、CTFE、ECTFE、ETFE）、离聚物、丙烯酸/PVC合金、液晶聚合物（LCP）、聚缩醛（POM或缩醛）、聚丙烯酸酯（丙烯酸）、聚丙烯腈（PAN或丙烯腈）、聚酰胺（PA）、聚酰胺–酰亚胺（PAI）、聚芳醚酮（PAEK或酮）、聚丁二烯（PBD）、聚丁烯（PB）、聚对苯二甲酸丁二醇酯（PBT）、聚己内酯（PCL）、聚三氟氯乙烯（PCTFE）、聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）、聚亚环己基对苯二甲酸乙二醇酯（PCT）、聚碳酸酯（PC）、聚羟基烷酸（PHAs）、聚酮（PK）、聚酯、聚乙烯（PE）、聚醚醚酮（PEEK）、聚醚酮酮（PEKK）、聚醚酰亚胺（PEI）、聚醚砜（PES）、氯化聚乙烯（PEC）、聚酰亚胺（PI）、聚乳酸（PLA）、聚甲基戊烯（PMP）、聚苯醚（PPO）、聚苯硫醚（PPS）、苯丙醇胺（PPA）、聚丙烯（PP）、聚苯乙烯（PS）、聚砜（PSU）、聚对苯二甲酸丙二醇酯（PTT）、聚氨酯（PU）、聚乙烯酯（PVA）、聚氯乙烯（PVC）、聚偏二氯乙烯（PVDC）、和苯乙烯丙烯腈（SAN）。本文中使用的术语“弹性材料”涉及具有粘弹特性的聚合物，其中，链接以形成聚合物的单体，通常由碳、氢、氧和/或硅制成。弹性材料可以是在其玻璃转变温度以上存在的非晶态聚合物，使得相当大的链段运动是可能的。在环境温度下，它们可以比较柔软并且可变形。弹性材料的范例包括合成聚异戊二烯（IR）、聚丁二烯（BR）、丁苯橡胶（聚苯乙烯和聚丁二烯的共聚物、SBR）、丁腈橡胶（聚丁二烯和丙烯腈的共聚物、NBR）、氢化丁腈橡胶（HNBR）、氯丁橡胶（CR）、聚氯丁烯、氯丁橡胶、EPM（乙烯丙烯橡胶，乙烯和丙烯的共聚物）、氯醚橡胶（ECO）、聚丙烯酸酯橡胶（ACM、ABR）、硅橡胶（SI、Q、VMQ）、氟硅橡胶（FVMQ）、氟橡胶（FKM、和FEPM）、氟化橡胶、Tecnoflon、氟橡胶（Fluorel）、四丙氟橡胶、全氟醚橡胶（FFKM）、Tecnoflon PFR、全氟化橡胶、密封圈、Perlast、聚醚嵌段酰胺（PEBA）、氯磺化聚乙烯（CSM）、乙烯–醋酸乙烯酯（EVA）、热塑性弹性体（TPE）、Elastron、热塑性烯烃（TPO）、节肢弹性蛋白、弹性蛋白和聚硫橡胶。
在具体实施例中，载体可以由从聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯、聚碳酸酯和聚环烯的群组中选择的有机聚合物构成。本文中使用的“聚乙烯”涉及由单体乙烯的长链构成的聚合材料。聚乙烯材料可以以不同形态的密度和/或支链存在。聚乙烯材料的范例包括超高分子量聚乙烯（UHMWPE）、超低分子量聚乙烯（ULMWPE或PE–WAX）；高分子量聚乙烯（HMWPE）；高密度聚乙烯（HDPE）；高密度交联聚乙烯（HDXLPE）；交联聚乙烯（PEX或XLPE）；中密度聚乙烯（MDPE）；线性低密度聚乙烯（LLDPE）；低密度聚乙烯（LDPE）和超低密度聚乙烯（VLDPE）。本文使用的“聚丙烯”涉及由单体丙烯单元构成的热塑性聚合物。聚丙烯的范例包括聚丙烯均聚物、无规聚丙烯共聚物和嵌段聚丙烯共聚物。丙烯也可以包括聚丙烯衍生物，其包括聚丙烯单元和乙烯或聚乙烯单元。本文中使用的“聚苯乙烯”涉及由芳香族单体苯乙烯制成的芳香族聚合物。聚苯乙烯的范例包括等规聚苯乙烯、无规聚苯乙烯和间规聚苯乙烯。本文中使用的“聚碳酸酯”涉及包括碳酸酯组的热塑性聚合物。聚碳酸酯可以从双酚A和碳酰氯的组合（双酚A和碳酸二苯酯的酯交换）中获得。在一个实施例中，聚碳酸酯材料可以是透明的。本文中使用的“聚环烯”涉及包含多于一个碳原子闭环但不具有芳香族特性的烯烃碳氢化合物。例如，聚环烯可以由单体烯烃（诸如环丙烯、环丁烯、环戊烯、环己烯、环庚烯、1,3–环己二烯、1,4–环己二烯或1,5–环辛二烯）构成。在其他实施例中，载体可以包括适于光学仪器（例如镜头、镜片、太阳镜、接触镜等）生产的材料。这种材料的范例是具有高折射率的材料，例如具有高折射率的塑料材料。例如，适于光学仪器生产的塑料材料的群组包括聚碳酸脂塑料，诸如聚碳酸烷基乙二醇酯（PADC）或CR–39或其衍生物。
在典型实施例中，所述载体是用于标准显微镜的载玻片。
在本发明的其他实施例中，上文中定义的载体可以包括或可以额外地包括位置标记。本文中使用的术语“位置标记”涉及标记、网格、线系、维数或长度指示、数字或字母代码、条形码、矩阵代码或本领域技术人员已知的任何其他适当标记，其允许确定细胞的位置、其尺寸或直径、到相邻细胞的距离等。在具体实施例中，位置标记可以是在具体波长下诱导的可检测的位置标记。例如，当利用波长为约540nm、550nm、560nm、570nm、580nm、590nm、600nm、610nm、620nm、630nm、640nm、650nm、660nm、670nm、680nm、690nm、700nm或更高的光进行激发时，位置标记可以是可检测的。另外，可以存在物理标记，以便于STM显微镜的AFM。
在本发明的又一优选实施例中，本文中描述的用于处理经分离的细胞的方法包括将在经分离的细胞上实施的活动，作为额外步骤。在相变介质已经被熔化和固化之前，可以在过滤材料上捕获到的细胞上执行这样的活动，或在相变介质熔化和固化之后可以执行这样的活动。因此，根据本发明，例如在设备之内原位可以实施所述活动，或其在不同地点（例如在具体实验室、不同设备等）可以执行所述活动。因此，所述活动可以适于具体情况，例如存在或不存在相变介质、存在额外的实体诸如载体。另一设想是，例如在微流体系统或环境中活动的自动化或半自动化。例如，活动步骤可以由机器人实施，或由包括计算机控制单元控制的机械移动部件的系统实施。
在一个实施例中，所述活动可以是固定活动。本文中使用的“固定”被理解为后续染色的准备步骤，并且可以取决于规划的分析类型。通常，固定的目的在于尽可能多地保留细胞的形状。在某些实施例中，固定可以是用于杀死、粘附和改变细胞的加热固定，以便允许细胞接受染色。备选地，细胞可以通过风干来固定。在又一备选方案中，可以执行化学固定。化学固定的设想范例是甲醛、乙醇、甲醇和/或苦味酸的使用。在其他实施例中，固定可以跟随抗原修复技术，诸如短暂暴露到微波辐射的短加热。
在又一实施例中，所述活动可以是染色活动。本文中使用的“染色”涉及特定类（例如特定的DNA、蛋白质、脂类、碳水化合物）染料添加到细胞或包括过滤材料的细胞，以对该类化合物的存在进行定性和/或定量。所述术语也包括例如利用荧光标签或标记进行荧光标注。在活体中，即利用活细胞，优选地利用如本文中描述的过滤材料上原位培养的细胞，或用在本文所述的过滤材料上捕获到的活细胞，可以实施染色。在典型实施例中，利用上文中定义被固定的细胞实施染色。染色过程可以适于存在于过滤材料上的细胞类型。例如，可以根据革兰氏染色过程或通过抗酸染色对细菌细胞进行染色。又一设想染色过程包括苏木精和伊红染色、巴氏染色、PAS染色、马森（Masson）三色染色、罗马诺夫斯基（Romanovsky）染色、银染色或康克林（Conklin）染色。又一设想的染色途径包括利用吖啶橙、俾斯麦棕、胭脂虫红、考马斯蓝、结晶紫、DAPI、伊红、溴化乙啶、酸性品红、赫斯特染色、碘、孔雀绿、甲基绿、中性红、尼罗蓝、尼罗红、四氧化锇、罗丹明或番红染色进行染色。例如通过使用荧光标签或标记和/或经荧光标注的抗体或通过经标注或可识别的第二抗体识别的抗体，染色还可以包括荧光标注或分子标注。例如，这能够使用适当标签来实现，根据本发明所述适当的标签能够共轭到检测分子，其能够识别表面上或过滤材料上捕获到的细胞中的结构或实体。适当标签的范例包括荧光染料（例如荧光素、罗丹明、藻红蛋白、荧光胺）、发色团染料（例如视网膜红质）、化学发光化合物（例如鲁米那、咪唑）和生物发光蛋白质（例如荧光素、荧光素酶、绿色荧光蛋白质、黄色荧光蛋白质、其衍生物）。诸如抗体的检测分子可以进一步利用荧光标签如FITC、6–FAM、HEX、TET、ROX、Cy3、Cy5、德克萨斯红和/或同时利用淬火标签如TAMRA、淬灭剂、黑洞猝光剂、BHQ–1或BHQ–2进行标记。检测分子也可以优选地利用酶或酶域生成发光、荧光或电化学信号进行标记。这种酶的具体优选范例包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶和β–内酰胺酶。在其他实施例中，检测分子可以利用放射性同位素（例如3H、14C、32P、33P、35S、125I、11C、13N、15O、18F、64Cu、62Cu、124I、76Br、82Rb、68Ga或18F）或粒子（例如金）进行标记。使用各种化学反应（例如胺反应或硫醇反应），不同类型的标签可以被共轭到检测分子。然而，除了胺和硫醇之外，还能够使用其他反应基，例如醛、羧酸和谷氨酰胺。在具体优选实施例中，利用被连接到的任何提到的荧光染色剂，更优选为被连接到FITC标签的反EpCAM抗体，可以实施染色。又一具体优选是针对DNA或RNA分子使用Syto9染色剂。
在又一实施例中，所述活动可以是对细胞的机械操纵。本文中使用的“机械操纵”涉及对于细胞、细胞群或据本发明在根过滤材料上捕获到的全部或基本全部细胞的任何外部干预。外部干预可以包括细胞的机械开口、细胞的物理移动或旋转。由于对于细胞或细胞群采用电流、液体流、使用压力、采用温度增加或降低，因此又一设想是物理干预。例如，例如在微流体系统或细胞制备系统的环境中，通过机器人或半机器人实体，可以实施这样的活动。
在又一具体实施例中，所述活动可以是包括细胞释放活动的机械操纵。本文中使用的术语“释放”涉及抽取来自过滤材料的一个或更多具体细胞或细胞群。在熔化/固化过程之前、期间或之后，或者在染色或光学分析过程之前、期间或之后，可以执行所述抽取。例如，在测试标准内潜在感兴趣或注意到的通过活体染色检测的细胞，可以从过滤材料中释放，随后被输送到不同载体或介质（例如培养基），并且利用不同方法进行分析，或被培养和放大，用于后续分析步骤等。细胞的释放可以基于上文定义的位置标记元件的使用。例如，通过存储位置标记代码或相应坐标，在初始染色或检测步骤之后，可以容易地识别或再识别细胞。针对细胞的释放，可以使用显微操纵器或抽吸装备。由于根据本发明的方法的有利结果，以提供包括处于固定位置的细胞的过滤材料，可迅速并精确地实现后续分析和抽取过程。
在又一实施例中，所述活动可以是细胞的生物操纵。本文中使用的“生物操纵”涉及针对细胞的生物实体的应用，以便影响其行为、尺寸、结构、组织等。这些生物操纵的范例包括生物结合实体（诸如抗体）的应用。其他范例包括针对细胞的营养供给，允许细胞的生长和有丝分裂。另一设想是采用结合因子，诸如配体或生长因子、转录因子、具体糖类、使用细胞抑制剂或激活剂等。其他生物操纵对于本领域技术人员将是已知的，并且也是本发明设想的。
在又一实施例中，所述活动能够是生化操纵。本文中使用的“生化操纵”被理解为将根据本发明的过滤材料上的细胞暴露到生物活性实体，诸如RNAi分子、降解酶、通过结合到配体或受体而引起分子反应等应该具有具体分子影响的小分子。生化操纵也可以包括执行原位生化反应，例如执行原位聚合酶链反应、检测原位基因表达或蛋白质表达、检测蛋白质、脂类、DNA/RNA、荧光/显色原位杂交（FISH/CISH）、糖苷结构或一个或更多细胞内的其他实体等的存在。其他生化操纵对于本领域技术人员将是已知的，并且也是本发明设想的。
在本发明的又一具体优选实施例中，所述活动包括培养经分离的细胞。可以向在过滤材料上捕获到的细胞提供生长介质或营养，例如碳源，诸如糖、氮源、维生素、激素、生长因子、无机盐、矿物质、蛋白质等，所述过滤材料优选地沉积在包括多孔、网状、开放、或部分开放结构的相变介质上。培养可以适于捕获的细胞，例如细菌细胞、人类细胞、上皮细胞等。在其他具体实施例中，生长介质可以是最低限度介质、选择介质、或利用用于后续分析的标签进行富集，例如放射性或荧光标签、或染料等。例如在包括空腔或开口的相变介质层内，通过使生长介质捕获到的细胞下方通过或流过，可以执行培养本身。所述流可以是由包括阀门或运动单元、容器、循环或替换单元等的管道或流体系统提供的恒定流。在具体实施例中，可以在微流体环境中实施培养。而且，可以在适当温度实施培养，例如适于捕获到的细胞生长的温度，例如在28℃到40℃的范围，优选处于37℃。通过修改孵育温度，可以进一步诱导细胞发生分子反应，其随后能够被光学检测。可以在任何适当时间内实施培养，例如30分钟到若干周的时间段。
在本发明的又一具体优选实施例中，被分离或捕获的细胞是罕见细胞。本文中使用的术语“罕见细胞”涉及在其他细胞群内所述细胞出现的相对频率。例如，罕见细胞可以是以在约1ml的样本体积内一个细胞对106、107、108、109或更多细胞的比率存在的细胞。具体优选的罕见细胞是循环肿瘤细胞，尤其是通过人体或哺乳动物或高等真核生物的血流输送的上皮肿瘤细胞。在其他具体实施例中，捕获到的细胞可以是肿瘤细胞，诸如乳腺癌细胞、肺癌细胞、泌尿道上皮癌细胞、膀胱癌细胞、肉瘤细胞、前列腺癌细胞或非小细胞肺癌细胞。
在其他优选实施例中，所述细胞可以是细菌细胞，例如奈瑟氏菌属的细菌，诸如脑膜炎奈瑟氏菌、链球菌属的细菌，例如肺炎链球菌、葡萄球菌属的细菌，例如金黄色葡萄球菌、嗜血杆菌属的细菌，例如流感、大肠埃希菌属的细菌，例如大肠杆菌或分支杆菌属的细菌，例如结核分枝杆菌或麻风分枝杆菌。
在本发明的又一优选实施例中，可以利用适当的显微镜和显微镜技术执行根据本发明的方法处理的细胞的光学成像或光学分析。这样的显微镜技术的范例包括明视场显微镜检查、暗视场显微镜检查、相位对比度显微镜检查、微分干涉对比度显微镜检查，荧光显微镜检查、原子力显微镜检查、超分辩率显微镜检查和共聚焦激光扫描显微镜检查。本发明的具体有利方面是基于简单、广为人知、通用和容易实现的明视场显微镜，根据本文中描述的方法处理的细胞能够以改善的质量地被成像或可视化。所述细胞处理还非常适于使用其他显微镜技术的成像途径。使本方法的某些特点和参数适于选择的显微镜途径在本领域技术人员的能力之内。例如，可以适于染色、荧光标记的使用、激发和检测波长等，可以适于载体。而且，在具体实施例中，可以使用盖玻片，以便覆盖过滤材料上的处理细胞。
在另一方面，本发明涉及经处理的过滤材料，其包括适于光学成像的经分离的细胞，通过本文中使用的处理方法可获得所述过滤材料。因此，过滤材料可以包括在本文中描述的熔化和固化处理之后的捕获到的细胞，所述捕获到的细胞位于一个光学平面中。所述过滤材料可以用于光学分析，或经受额外的染色或操纵步骤。因此，提供的过滤材料还可以用于对于捕获到的细胞的生命延长活动。由此，所述过滤材料可以与本文中定义的生长介质接触，或其可以被储存在冷却环境中，例如在冰箱或冷却室。备选地，可以例如在–20℃或在–80℃冷冻过滤材料，以将其保存用于后续分析步骤。冷冻之前，例如通过添加本领域技术人员已知的适当冷冻介质，可以为冷冻条件制备过滤材料。
在本发明的又另一方面，根据本文中描述的方法获得的经处理的过滤材料可以用于任何适当的诊断或分析测试。例如，优选在本文中描述的染色步骤之后，所述经处理的过滤材料可以用于组织学检查。而且，所述经处理的过滤材料可以用于微生物学或病毒学分析，例如对捕获到的细菌或病毒的识别和表征。在其他实施例中，所述经处理的过滤材料可以用于生化目的，例如用于对在捕获到的细胞上提供影响的活性小分子的识别和选择、在捕获细胞上抑制或诱导分子的测试、对于新陈代谢的生化修改的测试、细胞活性结构等。在具体优选实施例中，所述经处理的过滤材料可以用于肿瘤学分析，例如对捕获到的罕见细胞（诸如循环肿瘤细胞）的检测和表征。例如，根据抗体与表面标记的结合和伴行或后续的利用荧光染料的染色、或针对DNA或RNA利用隔室具体染料进行染色，可以识别细胞，以便分析有丝分裂活动。在又一具体优选实施例中，所述经处理的过滤材料可以用于血液分析。因此，所述经处理的过滤材料细胞可以从包括例如白血球或具体白细胞类型或种类的血液样本中获得。因此，针对细胞的频率、尺寸、活性等，可以分析所述细胞。
在又一方面中，本发明涉及一种用于处理细胞以使其适于光学成像的设备，所述设备包括（a）上文中定义的过滤材料，其用于捕获细胞。（b）上文中定义的相变介质的层；以及（c）加热和/或冷却单元。在一个实施例中，所述设备可以包括可移除的过滤材料，例如，其可转移到过滤单元或被插入过滤设备，其中，在过滤材料上捕获一个或更多细胞，优选为上文中定义的罕见细胞，或任何其他细胞类型，诸如上文中定义的细菌细胞。还可以通过不同方法执行对细胞的捕获，例如经由选择性结合到诸如抗体的结合分子、免疫磁性分离过程等。随后，过滤材料可以被重新引入用于根据本发明处理细胞的设备。
在另一实施例中，例如在独立设备或在过滤单元中已经执行过滤或细胞捕获处理，或本文中提到的另一捕获过程之后，用于捕获细胞的过滤材料可以已经具有捕获到的细胞或与其上的捕获到的细胞一起存在。在具体实施例中，所述设备可以包括多于一个过滤材料，例如2、3、4、5、6、7、10、15或更多过滤材料或过滤器，其允许并行或半并行处理。本发明也设想多于一个过滤材料或过滤器的相继处理。
在又一实施例中，所述设备可以包括插入槽、缺口或引入区，其允许插入包括一个或更多捕获到的细胞的过滤材料或过滤器。在处理步骤之后，这个区可以配备过滤器的快速引入及其移除，即如在固定位置处包括细胞的光学平面过滤材料。在具体实施例中，所述设备可以包括多于一个的插入槽、缺口或引入区，例如2、3、4、5、6、7、10、15或更多插入槽、缺口或引入区，其允许并行或半并行处理。也设想在所述插入区中的相继处理。
在本发明的另一实施例中，本文中定义的设备包括上文中定义的相变介质的一层或更多层。例如，相变介质的这些层可以被提供在容器或库隔室中，并且在将包括细胞的过滤材料引入设备时，其与过滤材料相关联。备选地，在针对一个或多于一个过滤器的处理过程完成之后，所述设备可以提供相变介质的外部补给。例如，相变介质在适当环境中可以以准备使用的方式进行存储，并且当新的处理周期开始时，其被引入设备。例如通过使用机器人技术，或经由自动递送系统，可以优选地自动执行这一过程。在其他实施例中，可以以熔化形态提供相变介质，例如，在处理周期开始时被保持在热容器或加热单元中，并且在优选上文描述的模具中被烧铸。在处理方案的每个周期中可以重复这一过程。因此，在相变介质已经固化之后，可以移除模具。在具体实施例中，用于熔化的相变介质的容器也可以是根据本发明的设备的一部分。备选地，这些容器可以是可移除的，并且当需要时仅与设备相关联。
在其他具体实施例中，所述设备也可以提供上文中定义的载体的存在。例如，所述设备可以包括库隔室或针对载体的递送系统，在将包括细胞的过滤材料引入设备时，所述载体可以与过滤材料和相变介质相关联。备选地，载体材料可以已经被连接到相变介质，并且在将过滤材料引入设备时，所述载体材料与过滤材料相关联（组合）。也优选，在设备中（例如在库隔室中）提供预制造载体相变介质束或包。当处理周期开始时，载体相变介质包可以被插入处理部位。所述包可以保持在适当环境中，例如冷却环境或干燥环境中等。
在本发明的其他实施例中，在设备中，在培养或允许细胞生长的环境中可以提供相变介质或相变介质与载体的组合。因此，所述设备可以配备管或节点；和/或其可以包括用于液体（例如水、化学品、原料、营养素、生长因子、碳或氮源等）的容器和贮藏室，或用于培养细胞的任何其他实体，诸如温度控制单元和CO2供给。例如，所述设备可以被集成在流体或微流体系统中，所述流体或微流体系统包括以上指示的连接和容器。也可以包括用于控制液体流、pH、温度、分子浓度等的单元。在其他实施例中，以上描述的培养单元可以从设备中移除，并且因此当必要时（例如当处理活细胞时）被使用。
在又一优选实施例中，本文中定义的设备可以包括能够加热过滤材料和相关联的相变介质的单元，尤其以便提供熔化上文中定义的相变介质的可能性。在其他实施例中，所述设备可以额外地包括冷却单元，尤其以便提供增强本文中描述的固化处理的可能性。在其他实施例中，所述加热或冷却单元可以额外地用于控制在设备中培养步骤的温度。冷却设备还可以用于根据本发明经处理的过滤材料的原位保护。例如，这样的保护可以原位制冷，直到实施后续染色过程或光学成像分析。例如，所述经处理的过滤材料可以被冷却到约4–8℃的温度。也设想在设备内存在冷冻单元，其允许对本文中描述的经处理的过滤材料进行冷冻。经冷冻的过滤材料可以原位保持，或者从设备中移除，以便储存在–80℃，或–20℃或在任何其他适当温度的冷冻箱中。在其他实施例中，以上描述的冷冻单元或冷却单元可以从设备中移除，并且因此在必要时（例如当要求储存过滤材料时）使用。
在具体优选实施例中，冷却单元或加热单元可以是珀耳帖元件，其允许加热和冷却活动。
在本发明的另一优选实施例中，上文中定义的设备可以包括过滤单元或捕获单元，其允许对在上文中定义的过滤材料上细胞的分离或捕获。例如，过滤单元或捕获单元能够在或样本材料的液体流上提供压力，导致强行通过上文中定义的过滤材料。备选地，捕获单元可以配备磁珠或免疫元件等，其允许对细胞进行免疫磁性或免疫选择。
尤其优选地，上文中定义的设备包括可移除的压力递送系统。在一个实施例中，所述系统可以被直接耦合到过滤材料。在一个具体实施例中，可移除的压力递送系统可以是被连接到真空或低压生成单元（例如真空泵）的针。所述针可以从过滤材料或隔室中移除，在已经执行过滤或细胞分离步骤后，所述过滤材料位于所述隔室。
在其他具体实施例中，可以实现以上描述的可移除压力递送系统，以便从过滤材料中移除水或液体残留物，例如乙醇剩余物。
而且，根据本发明的所述设备可以具有隔室或嵌入的隔室结构。在图5B中提供了设想隔室结构的范例，图5A示出了在设备中使用的可能的相变介质。这样的集成设备形态可以与上或下文中描述的额外的单元进行组合，例如温度单元、容器、库单元、管等。
尤其优选地，本文中定义的设备包括用于将上文中定义的过滤材料输送至上文中定义的载体的装置。这样的输送单元可以是机器人实体或递送系统。也设想是半自动输送装置。另外具体优选地，上文中定义的设备包括用于将相变介质层输送至上文中定义的载体的装置。这样的输送单元可以是机器人实体或递送系统。也设想是半自动输送装置。
在本发明的其他实施例中，上文中定义的设备可以被连接到下游处理和/或分析单元或装备。例如，所述设备可以配备染色、固定、机械操纵、生物操纵和/或生化操纵单元，或允许这样的活动的入口或出口。上文提供了可以在这些单元中实施或由这些单元实施的可能的活动细节。而且，所述设备可以被连接到光学成像系统，例如显微镜。可以与本发明的所述设备相关联或在其中集成的显微镜的范例包括明视场显微镜、暗视场显微镜、相位对比度显微镜、微分干涉对比度显微镜、荧光显微镜、原子力显微镜、共聚焦激光扫描显微镜和超分辩率显微镜。另外设想是存在光源、光学过滤器、摄像单元和光学成像所必需的其他元件。优选地，设备也可以配备控制单元或计算机单元，其允许执行、监管和编排设备活动。控制单元还可以具有用户接口，其允许对所述设备进行编程、监管和配置。而且，可以向所述设备提供互联网或内联网接口，其允许远程控制等。也设想，使用例如以计算机设备形态的图像捕获和储存单元。该图像捕获和储存单元还可以配备适当的分析软件或程序，其允许例如在肿瘤细胞的情况下对细胞或细胞组织学的表征，或用于诊断分析过程。假如分析细菌细胞或病毒，也设想使用微生物识别程序。
在又一方面，本发明涉及一种用于生产光学平面过滤材料的方法。所述方法包括以下步骤：熔化上文中定义的相变介质，直到所述介质被分散在过滤材料下方；以及降低相变介质的温度，直到介质固化，形成光学平面过滤器。在优选实施例中，利用包括捕获到或经分离的细胞（例如上文中定义的罕见细胞或细菌细胞）的过滤材料执行所述方法。在具体实施例中，所述方法也可以用于过滤材料的制备，所述过滤材料包括元件（诸如病毒粒子）、无机实体（诸如金属、木材、塑性或其他材料），例如从事故、质量控制测量、产品测试测量等获得的这种材料的微米尺寸片。
在又一方面，本发明涉及一种用于生产适于本方法的相变介质的方法。所述方法包括从固体相变介质的块中切出或刻出空腔的步骤。因此，相变介质可以提供多孔、网状、开放或部分开放的结构、一个或更多个通道、一个或更多个通路或一个或更多个管元件。例如，所述切出可以由激光或激光设备执行。通道或通路可以与相变介质的边缘连接和/或与相变介质的外部接触。而且，可以将通路、开口等互相连接。优选地，所述开口允许适当的液体流，尤其在过滤材料上捕获到的细胞附近或下方的生长或培养介质。在又一实施例中，所述方法可以包括把熔化的或液态的相变介质烧铸到相应的模具中并且随后使材料固化的步骤，接着抽取模具。
出于说明目的，提供以下范例和附图。由此，应当理解，所述范例和图不应被解释为限制。本领域技术人员将清楚地能够设想本文中陈述的原理的其他修改。
范例
范例1–MCF7（乳腺癌）细胞的制备
过滤过程
具有90%融合MCF7细胞的75cm2细胞培养瓶（Nunc）被胰蛋白酶化（胰蛋白酶+EDTA，英杰公司）6分钟，并且悬浮在提供FBS、青霉素/链霉素和Glutamax（英杰公司）的RPMI1640介质中。之后，所述细胞借助离心分离（5分钟，1000RPM）被一次洗掉，并且悬浮在10ml DPBS（英杰公司）。以使得细胞将在10ml DPBS中覆盖约10%的有效过滤面积的方式来稀释细胞悬浮液。通过在穿过隔室的流中应用适度的真空，玻璃微观分析过滤支架（微孔过滤器）用于过滤10ml的细胞悬浮液。
过滤器的制备和可视化
过滤器随后从过滤支架上移除，并且被放置在标准显微镜载玻片的顶部，在所述标准显微镜载玻片上沉积20μl固体石蜡。显微镜载玻片被转移到珀耳帖元件，其提供热量以熔化固体石蜡（见图2A）。当石蜡被完全熔化时，显微镜载玻片被移除并且在室温下冷却，直到石蜡已经重新固化（见图2B）。之后，所述载玻片使用反射光在标准显微镜（蔡司）上成像（见图3A），或者进入标准苏木精和伊红（H&E）染色过程（见图3B）。后者甚至提供更大的对比度。
当根据以上列举的过程进行处理时，过滤器保持完全地附着石蜡层，并且细胞保持完全地附着过滤器（在染色过程之前使用或者不使用固定）。值得注意的是，由于H&E协议要求在若干不同流体箱中数百次侵泡并且在流动的自来水下进行冲洗。以非常高的图像质量对生物细胞进行成像。高图像质量归因于光学平面和固化石蜡层充当非常好的光漫射器的事实。
范例2–具有集成流系统的熔化过滤支撑物结构
通过将约400μl熔化的石蜡移液到大量热水中，随后允许石蜡冷却、变薄、变平，创建石蜡均匀小点。使用热印，在显微镜载玻片上的小点被穿孔出圆圈（1）。使用更小的圆形冷印移除圆圈的内部（2）。然后针被加热，并且被固定在圆形支撑结构的侧壁（3、4）。应用过滤器（5），并且使用大热印，将过滤器密封在环形支撑结构上（6）使用大热印（1）。通过对针应用真空，在过滤材料下方的隔室中生成低压，允许进行过滤处理（见图4）。
通过除针以外的其他装置，例如通过基底材料中的孔或孔洞，或通过支撑石蜡中的孔或孔洞，也能够应用真空压。通过加热，过滤材料（具有细胞）能够被附着在显微镜载玻片。加热引起固体石蜡熔化，并且将过滤器吸引到显微镜载玻片（如范例1）。
因为关于过滤器和显微镜载玻片固定细胞，在处置之前和之后能够定位相同的细胞。

Claims (15)

1.一种用于处理经分离的细胞以使其适于光学成像的方法，所述方法包括以下步骤：
（a）在相变介质上沉积包括捕获到的细胞的过滤材料；
（b）熔化所述相变介质，直到所述介质被分散在所述过滤材料下方；以及
（c）降低所述相变介质的温度，直到所述介质固化，形成在单光学平面中和在固定位置处包括所述细胞的过滤器。
2.根据权利要求1所述的方法，所述方法额外地包括在过滤材料上捕获细胞的初始步骤。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述过滤材料能够尺寸排阻细胞，以使其从流体或溶液中分离，所述过滤材料优选具有约0.5μm到20μm的孔尺寸，更优选具有约8μm的孔尺寸，并且其中，所述过滤材料优选是聚合物过滤器，更优选为聚碳酸酯、聚对二甲苯或尼龙过滤器，或非聚合物过滤器，更优选为硅过滤器；或3D微型过滤器。
4.根据权利要求1至3中的任一项所述的方法，其中，所述相变介质是在约25℃到70℃的温度范围内熔化和固化的介质。
5.根据权利要求1至5中的任一项所述的方法，其中，所述相变介质包括多孔、网状、开放或部分开放结构和/或包括通道、通路或管元件，其中，所述结构或元件允许流体通过所述介质。
6.根据权利要求4或5所述的方法，其中，所述介质是烃蜡，优选为具有CnH2n+2的分子式的石蜡，n=20到40。
7.根据权利要求1至6中的任一项所述的方法，其中，所述相变介质被安装在载体上，优选为玻璃载体或聚合材料载体，并且其中，所述载体任选地包括位置标记。
8.根据权利要求1至7中的任一项所述的方法，其中，所述方法包括从对所述经分离的细胞的染色、固定、释放、机械操纵、生物操纵和生化操纵的群组中选择的活动，作为额外的步骤。
9.根据权利要求8所述的方法，其中，所述活动包括培养所述经分离的细胞，优选经由使营养液流过所述多孔、网状、开放或部分开放的相变介质。
10.根据权利要求1至9中的任一项所述的方法，其中，所述细胞是罕见细胞，优选为循环肿瘤细胞或细菌细胞。
11.根据权利要求1至10中的任一项所述的方法，其中，所述光学成像是明视场显微镜检查、暗视场显微镜检查、相位对比度显微镜检查、微分干涉对比度显微镜检查、荧光显微镜检查、原子力显微镜检查、共聚焦激光扫描显微镜检查或超分辩率显微镜检查。
12.一种包括适于光学成像的经分离的细胞的经处理的过滤材料，所述处理过滤材料能够由根据权利要求1至11中的任一项所述的方法获得。
13.一种包括适于光学成像的经分离的细胞的经处理的过滤材料的用途，所述经分离的细胞能够通过根据权利要求1至11中的任一项所述的方法获得，其用于诊断、组织学、微生物学、生物化学、肿瘤学或血液分析。
14.一种用于处理细胞以使其适于光学成像的设备，所述设备包括：
（a）根据权利要求3所述的过滤材料，其用于捕获细胞；
（b）根据权利要求4至7中的任一项所述的相变介质的层；以及
（c）加热单元和任选的冷却单元。
15.根据权利要求14所述的设备，所述设备额外地包括被耦合到所述过滤材料的能够移除的压力递送系统，允许在过滤材料上进行细胞的分离，以及任选地包括一种用于输送所述过滤材料和/或所述相变介质的层到根据权利要求7所述的载体上的装置。
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