MX2013015175A - Composiciones probioticas y metodos. - Google Patents

Composiciones probioticas y metodos.

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Abstract

La presente invención se relaciona a composiciones y métodos para la modulación del sistema inmune de la mucosa. Las composiciones incluyen alimentos fermentados por el organismo probiótico, Lactobacillus paracasei CBA L74 (Acceso Depositario Internacional Número LMG P-24778) Alternativamente, las composiciones pueden incluir L. paracasei CBA L74 y un portador fisiológicamente aceptable. En algunas modalidades, el L. paracasei CBA L74 puede ser no replicante. Las composiciones se pueden administrar a un sujeto que tiene o está en riesgo para trastornos gastrointestinales relacionados con la inmadurez del sistema inmune, infección o enfermedad.

Description

COMPOSICIONES PROBIOTICAS Y MÉTODOS Campo de la Invención La presente invención se relaciona a organismos probióticos, productos alimenticios preparados con organismos probióticos y composiciones farmacéuticas que comprenden organismos probióticos. Estas composiciones son útiles en estimular el sistema inmune de la mucosa y para el tratamiento de trastornos asociados con la inmadurez del sistema inmune de la mucosa.
Antecedentes de la Invención El epitelio intestinal constantemente está expuesto a materiales extraños que pueden ser ya sea per udiciales o benéficos al hospedero. Como resultado, el sistema inmune intestinal debe dirigirse a un balance delicado entre: 1) las respuestas inmunes protectoras que son inducidas por patógenos o toxinas intestinales y 2) la evitación de respuestas inmunes tanto contra antigenos del alimento como los 1014 microrganismos benéficos comensales que normalmente residen en el sistema intestinal. La interrupción de ya sea las respuestas protectoras o las respuestas de tolerancia puede dar por resultado un amplio arreglo de trastornos que incluyen, por ejemplo, infecciones, inflamación, alergias a los alimentos, hipersensibilidad a los alimentos, enfermedad de intestino inflamatorio, enfermedad de Crohn, enfermedad celiaca, enfermedad periodontal, artritis reumatoide, aterosclerosis y cáncer de colon.
La red imnunoreguladora que comprende el sistema inmune intestinal cambia con la edad. La red es deficientemente desarrollada en recién nacidos humanos y se establece gradualmente durante los primeros pocos años de vida. La inmadurez del sistema inmune desempeña una función en la prevalencia de infecciones y trastornos relacionados con alimentos en infantes y niños pequeños. A la inversa, la habilidad del sistema intestinal para responder a nuevas estimulaciones declina en la edad avanzada.
Los trastornos gastrointestinales, por ejemplo, infecciones, trastornos inflamatorios y trastornos relacionados con los alimentos tales como alergias a los alimentos, intolerancia a alimentos o hipersensibilidad a los alimentos tiene un impacto significativo en la salud y la calidad de vida tanto en niños como en adultos. La gastroenteritis infecciosa es el trastorno gastrointestinal pediátrico mucho más común. Aproximadamente 1 billón de episodios ocurren mundialmente cada año, mucho más comúnmente en países en desarrollo entre niños abajo de 5 años de edad. Las tasas de muerte mundiales para la gastroenteritis infecciosa promedian de 3 a 6 millones de niños por año. En los Estados Unidos, 25 a 35 millones de nuevos casos ocurren anualmente, dando por resultado 300 a 400 muertes. Además, la gastroenteritis infecciosa en los Estados Unidos da por resultado un estimado de 200,000 hospitalizaciones y 1.5 millones de visitas de paciente externo a un costo por arriba de 1 billón de dólares. Los trastornos relacionados con los alimentos tales como alergias también tienen un efecto sustancial sobre la salud en tanto niños como adultos. Los síntomas de las alergias a los alimentos pueden variar dependiendo de la severidad de la alergia y pueden variar de una sensación de comezón leve alrededor de la boca y los labios a la anafilaxis amenazante de la vida. Se estima que las alergias a los elementos afectan entre 1-10% de la población en los Estados Unidos. El Centro para el Control de Enfermedades fundamenta que en 2007, aproximadamente 3 millones de niños de abajo de la edad de 18 años (3.9%) se reportaron que tienen una alergia a los alimentos o digestiva en los 12 meses previos. Para algunos niños, las alergias a los alimentos llegan a ser menos severas con la edad, para otros, permanecen como un problema de largo plazo. Los infantes quienes sufren de alergia temprana en la vida pueden desarrollar "marcha alérgica". Por ejemplo, muchos individuos quienes tienen varias reacciones alérgicas a la leche de vaca en la infancia están en riesgo para el desarrollo de asma posterior en la infancia. Hay indicaciones de que la prevalencia de las alergias a los alimentos está incrementándose mundialmente .
Sin considerar la etiología, los trastornos gastrointestinales no solamente afectan a adversamente la salud de un niño, sino que pueden tener un serio impacto en la economía familiar, interacciones sociales y atención de trabajo escolar y paternal. Hay una necesidad continua por estrategias terapéuticas que promuevan la salud gastrointestinal, particularmente en individuos quienes están en riesgo por o quienes sufren de trastornos gastrointestinales .
Breve Descripción de la Invención La presente invención proporciona composiciones que comprenden un producto alimenticio fermentado, en donde el producto alimenticio se ha fermentado por la bacteria probiótica, Lactobacillus paracasei CBA L74, Acceso Depositario Internacional Número L G P-24778. El producto alimenticio puede ser un producto lácteo o un producto de cereal. También se proporcionan composiciones que comprenden la bacteria probiótica, Lactobacillus paracasei CBA L74, Acceso Depositario Internacional Número LMG P-24778 y un portador fisiológicamente aceptable. El portador fisiológicamente aceptable puede ser un producto alimenticio o un portador farmacéutico. También se proporcionan métodos para hacer una composición nutricional, el método que comprende: proporcionar un producto alimenticio; combinar el producto alimenticio con una cantidad efectiva de la bacteria probiótica, Lactobacillus paracasei CBA L74, Acceso Depositario Internacional Número LMG P-24778, y, opcionalmente, un co-inóculo, para formar una mezcla, e incubar la mezcla a una temperatura y durante un tiempo suficiente para que ocurra la fermentación. La composición nutricional puede ser secada. La composición nutricional se puede combinar con uno o más productos alimenticios adicionales. Para cualquiera de las composiciones y métodos descritos en la presente, las células de Lactobacillus paracasei CBA L74 se pueden someter a tratamientos que las vuelven no replicantes. La concentración de Lactobacillus paracasei CBA L74 en las composiciones pueden variar dependiendo del uso propuesto, por ejemplo, como una composición nutricional o una composición farmacéutica. Los intervalos útiles incluyen el equivalente de aproximadamente 1 x 102 unidades formadoras de colonia por gramos ("cfu/g") a aproximadamente 1 x 102 unidades formadoras de colonia por gramo ("cfu/g") en peso seco.
También se proporcionan métodos para tratar a un sujeto en riesgo por desarrollar un trastorno gastrointestinal, el método que comprende: identificar a un sujeto en riesgo para un trastorno gastrointestinal; administrar una cantidad efectiva de una composición que comprende un producto alimenticio en donde el producto alimenticio se ha fermentado por la bacteria probiótica Lactobacillus paracasei CBA L74, Acceso Depositario Internacional Número LMG P-24778. El trastorno gastrointestinal puede ser un déficit del sistema inmune de la mucosa, por ejemplo, un sistema inmune inmaduro, una alergia a los alimentos, un trastorno asociado con diarrea, una infección bacteriana o viral, síndrome de intestino irritable, enfermedad de intestino inflamatorio, enfermedad de Crohn, enterocolitis necrotizante o envejecimiento, particularmente envejecimiento del sistema gastrointestinal.
También se proporcionan métodos para tratar a un sujeto que tiene un trastorno gastrointestinal. Los métodos incluyen: identificar a un sujeto que tiene un trastorno gastrointestinal; administrar una cantidad efectiva de una composición que comprende un producto alimenticio en donde el producto alimenticio se ha fermentado por la bacteria probiótica, Lactobacillus paracasei CBA L74, Acceso Depositario Internacional Número LMG P-24778. En lagunas modalidades, los métodos incluyen: identificar a un sujeto que tiene un trastorno gastrointestinal; administrar una cantidad efectiva de una composición farmacéutica que comprende la bacteria probiótica, Lactobacillus paracasei CBA L74, Acceso Depositario Internacional Número LMG P-24778. El trastorno gastrointestinal puede ser un déficit del sistema inmune de la mucosa, para examinar, un sistema inmune inmaduro, una alergia a los alimentos, un trastorno asociado con diarrea, una infección bacteriana o viral, síndrome de intestino irritable, enfermedad de intestino inflamatorio, enfermedad de Crohn o enterocolitis necrotizante .
También se proporcionan métodos para modular el sistema inmune en un sujeto. Los métodos incluyen: identificar a un sujeto en necesidad de la modulación del sistema inmune y administrar una cantidad efectiva de una composición que comprende un producto alimenticio en donde el producto alimenticio se ha fermentado por la bacteria probiótica, Lactobacillus paracasei CBA L74, Acceso Depositario Internacional Número LMG P-24778.
También se proporcionan artículos de manufactura. Estos pueden incluir equipos que comprenden una cantidad medida de una composición nutricional que comprende un producto alimenticio fermentado, en donde el producto alimenticio se ha fermentado por la bacteria probiótica, Lactobacillus paracasei CBA L74, Acceso Depositario Internacional Número LMG P-24778 y uno o más artículos seleccionados del grupo que consiste de material de empaquetamiento, un inserto de paquete que comprende instrucciones para el uso, un fluido estéril, y un recipiente estéril. En algunas modalidades, el equipo puede incluir una cantidad medida de una composición farmacéutica que comprende Lactobacillus paracasei CBA L74, Acceso Depositario Internacional Número LMG P-24778 y uno o más artículos seleccionados del grupo que consiste de material de empaquetamiento, un inserto de paquete que comprende instrucciones para el uso, un fluido estéril y un recipiente estéril .
Los detalles de una o más modalidades de la invención se exponen en los dibujos acompañantes y la descripción enseguida. Otras características, objetivos y ventajas de la invención serán evidentes a partir de la descripción y los dibujos y a partir de las reivindicaciones. Breve Descripción de los Dibujos Estas y otras características y ventajas de la presente invención serán más completamente descritas en, o hechas obvias mediante, la siguiente descripción detallada de la modalidad preferida de la invención, que se va a considerar junto con los dibujos acompañantes en donde números similares se refieren a partes semejantes y además en donde : La FIG. 1 es una tabla que muestra un análisis del efecto de L. paracasei CBA L74 sobre el fenotipo de célula DC.
La FIG. 2a es una gráfica que representa la producción de IL-10 en DCs co-cultivádas con Caco2 expuesto a L. paracasei CBA L74. La FIG. 2b es un gráfica que representa la producción de IL-12 en DCs co-cultivadas con Caco2 expuesto a L. paracasei CBA L74.
La FIG. 3 es una gráfica que representa la proliferación de células T expuestas al DCs co-cultivadas con células Caco2.
La FIG. 4 es una gráfica que representa la producción de IL-?ß en la mucosa intestinal de ratones suplementados con L. paracasei CBA L74.
La FIG. 5 es una gráfica que representa la producción de IL-4 en la mucosa intestinal de ratones suplementados con L. paracasei CBA L74.
La FIG. 6 es una gráfica que representa la producción de IgA en la mucosa intestinal de ratones suplementados con L. paracasei CBA L74.
La FIG. 7 representa un análisis de los niveles de TLR2, TLR4 y TLR9 en la mucosa intestinal de ratones suplementados con L . paracasei CBA L74.
La FIG. 8 representa un análisis de los niveles de PPARy en la mucosa intestinal de ratones suplementados con L. paracasei CBA L74.
La FIG. 9a es una gráfica que representa los niveles de IL-?ß en el suero en ratones suplementados con L. paracasei CBA L74. La FIG. 9b es una gráfica que representa los niveles de IL-4 en el suero en ratones suplementados con L. paracasei CBA L74.
La FIG. 10 es una tabla que muestra un análisis del efecto de L. paracasei CBA L74 sobre el fenotipo DC en ratones suplementados con L. paracasei CBA L74.
La FIG. lia es una gráfica que representa los fenotipos de linfocitos CD4+ intestinales en ratones suplementados con L. paracasei CBA L74. La FIG. 11b es una gráfica que representa los fenotipos de linfocitos CD8+ intestinales en ratones suplementados con L. paracasei CBA L74.
La FIG. 12 es una gráfica que representa la producción de IL-10 en la mucosa intestinal de ratones suplementados con leche fermentada por L. paracasei CBA L74.
La FIG. 13 es una gráfica que representa la producción de IL-?ß en la mucosa intestinal de ratones suplementados con leche fermentada por L. paracasei CBA L74.
La FIG. 14 es una gráfica que representa la producción de IgA en la mucosa intestinal de ratones suplementados con leche fermentada por L. paracasei CBA L74.
La FIG. 15 representa un análisis de los niveles de TLR2, TLR4, TLR.9 y PPARy en la mucosa intestinal de ratones suplementados con leche fermentada por L. paracasei CBA L74.
La FIG. 16 representa un análisis de los niveles de pNF-kB y IKBa en la mucosa intestinal de ratones suplementados con leche fermentada por L. paracasei CBA L74.
La FIG. 17 representa un análisis del efecto de L. paracasei CBA L74 sobre el fenotipo de célula DC en ratones suplementados con leche fermentada por L. paracasei CBA L74.
La FIG. 18 es un análisis del efecto de L. paracasei CBA L74 sobre el fenotipo de célula DC después de la exposición a LPS o CpG en ratones suplementados con leche fermentada por L . paracasei CBA L74.
La FIG. 19 es una gráfica que representa los fenotipos de linfocitos CD4+ intestinales en ratones suplementados con leche fermentada por L. paracasei CBA L74.
La FIG. 20 es una gráfica que representa los fenotipos de linfocitos CD8+ intestinales en ratones suplementados con leche fermentada por L. paracasei CBA L74.
La FIG. 21 muestran la evaluación histológica de la mucosa ileal en ratones suplementados con leche fermentada por L . paracasei CBA L74.
La FIG. 22 es una gráfica que representa la producción de IL-?ß e IL-4 en la mucosa intestinal de ratones suplementados con arroz fermentado por L. paracasei CBA L74.
La FIG. 23 es una gráfica que representa la producción de IL-10 en la mucosa intestinal de ratones suplementados con arroz fermentado por L. paracasei CBA L74.
La FIG. 24 es un análisis de los niveles de TLR2 y TLR4 en la mucosa intestinal de ratones suplementados con arroz fermentado por L. paracasei CBA L74.
La FIG. 25a es un análisis de los niveles de PPARy en la mucosa intestinal de ratones suplementados con arroz fermentado por L. paracasei CBA L74. La FIG. 25b es un análisis de los niveles de pNF-kB y IKBOÍ en la mucosa intestinal de ratones suplementados con arroz fermentado por L. paracasei CBA L74.
La FIG. 26 es una tabla que muestra un análisis del efecto de L . paracasei CBA L74 sobre el fenotipo DC en ratones suplementados con arroz fermentado por L. paracasei CBA L74.
La FIG. 27 es una tabla que muestra un análisis del efecto de L. paracasei CBA L74 sobre el fenotipo DC después de la exposición a LPS o CpG en ratones suplementados con arroz fermentado por L. paracasei CBA L74.
La FIG. 28 es una gráfica que representa los fenotipos de linfocitos CD4+ intestinales en ratones suplementados con arroz fermentado por L. paracasei CBA L74.
La FIG. 29 es una gráfica que representa los fenotipos de linfocitos CD8+ intestinales en ratones suplementados con arroz fermentado por L. paracasei CBA L74.
La FIG. 30 es una gráfica que representa un análisis del efecto de las células de L. paracasei CBA L74 y el sobrenadante de células sobre la producción de IL-10 en MoDCs humanas en la presencia de Salmonella typhimurium.
La FIG. 31 es una gráfica que representa un análisis del efecto de las células de L. paracasei CBA L74 y el sobrenadante de células sobre la producción de IL-12p70 en MoDCs humanas en la presencia de Salmonella typhimurium.
La FIG.. 32 es una gráfica que representa un análisis del efecto de la leche fermentada con L. paracasei CBA L74 sobre la producción de IL-10 en MoDCs humanas en la presencia de Salmonella typhimurium y el efecto de la inactivación de L. paracasei CBA L74 sobre la producción de IL-10 en MoDCs humanas en la presencia de Salmonella typhimurium.
La FIG. 33 es una gráfica que representa un análisis del efecto de la leche fermentada con L. paracasei CBA L74 sobre la producción de IL-12p70 en MoDCs humanas en la presencia de Salmonella typhimurium y el efecto de la inactivación de L. paracasei CBA L74 sobre la producción de IL-12p70 en MoDCs humanas en la presencia de Salmonella typhimurium .
La FIG. 34 es una gráfica que representa un análisis del efecto del arroz fermentado con L. paracasei CBA L74 sobre IL-?ß, TNF- e IL-10 en un modelo de explanta de tejido intestinal en la presencia de Salmonella typhimurium. Descripción Detallada La presente invención se basa, en parte, sobre el descubrimiento de los inventores de que los alimentos fermentados por el organismo probiótico Lactobacillus paracasei , cepa CBA L74, pueden tener propiedades inmunomoduladoras . Esta cepa se aisló por los inventores y se depositó bajo el Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microrganismos para los Propósitos de Procedimiento de Patente el 9 de septiembre de 2008 en el Belgian Coordinated Collections of Micro-organisms (BCCM) Laboratorium voor Microbiologie (LMG) , Guent, Bélgica. El Número de Acceso dado por la Autoridad Depositaría Internacional es LMG P-24778. Para facilidad de lectura, los inventores no repetirán la frase "Número de Acceso LMG P-24778" en cada ocasión. Se va a entender que donde los inventores se refieren a L. paracasei, cepa CBA L74, los inventores se refieren a la cepa depositada que tiene el Número de Acceso LMG P-24778.
Las composiciones de la invención incluyen el organismo probiótico L. paracasei CBA L74. La Organización Mundial de la Salud ha definido los probióticos como: "Microorganismos vivos que cuando se administran en cantidades adecuadas contienen un beneficio saludable al hospedero". En algunas modalidades, el L. paracasei CBA L74 se puede someter a tratamientos que los vuelven no replicantes, por ejemplo, la exposición a calor, desecación, irradiación gamma o irradiación uv. Un L. paracasei CBA L74 no replicante puede ser una célula muerta o una célula viviente que se ha vuelto incapaz de división celular. Un L. paracasei CBA L74 no replicante puede ser una célula intacta o una célula que se ha sometido a lisis parcial o completa. En algunas modalidades, las células no replicantes pueden incluir una mezcla de células intactas y lisadas.
Mientras que los inventores creen que para entender ciertos eventos que ocurren en la administración de composiciones que comprenden o hechas por la fermentación con L. paracasei CBA L74, las composiciones de la presente invención no están limitadas a aquellas que trabajan al afectar cualquier mecanismo celular particular. La hipótesis del trabajo de los inventores es que los organismos o composiciones probióticas fermentadas con organismos probióticos pueden proporcionar una barrera incrementada a la translocación de las bacterias y los productos bacterianos a través de la mucosa, competitivamente excluyen patógenos potenciales, modifican la respuesta del hospedero a los productos microbianos y aumentan la nutrición enteral en maneras que inhibe el crecimiento de patógenos. Los efectos benéficos de las composiciones que comprenden organismos probióticos no replicantes pueden derivarse, por ejemplo, de metabolitos producidos durante la fermentación, por ejemplo, ácidos orgánicos tales como ácido láctico, ácido butilico o ácido acético. Alternativamente o además, el DNA microbiano, por ejemplo dinucleótidos CpG no metilados, fragmentos de pared celular bacterianas y otros componentes bacterianos sub-celulares , tales como proteínas, carbohidratos y lípidos, pueden ejercer efectos inmunomoduladores sobre el sistema inmune de la mucosa.
Los inventores han encontrado que el L. paracasei CBA L74 aislado moduló los niveles de los marcadores tanto pro- como anti-inflamatorios cuando se ensayaron in vitro e in vivo. Por otra parte, también se observaron efectos inmunomoduladores después de la administración de los alimentos que se han fermentado por L. paracasei CBA L74. Tales efectos inmunomoduladores se observaron aun cuando los alimentos fermentados se han tratado, por ejemplo, por calor, para volver el L. paracasei CBA L74 no replicante. Por consiguiente, la invención se relaciona a compresiones y métodos que se pueden utilizar para estimular al sistema inmune intestinal. Las composiciones pueden incluir productos alimenticios que se han fermentado por L . paracasei CBA L74. Los productos alimenticios pueden ser cualquiera de una amplia gama de alimentos que están disponibles a la fermentación por L. paracasei CBA L74. En algunas modalidades, las composiciones pueden incluir L. paracasei CBA L74 aislado y un portador fisiológico. El portador fisiológico puede ser un producto alimenticio, pero la invención es de esta manera limitante y en algunas modalidades el portador puede ser un portador farmacológico. También se proporcionan métodos para hacer y utilizar las composiciones. Los métodos de la invención incluyen métodos para producir composiciones que comprenden L. paracasei CBA L74, métodos para fermentar productos alimenticios con L. paracasei CBA L74 y métodos para administrar las composiciones para generar una respuesta inmunomoduladorá en un sujeto. Las composiciones se pueden administrar a un sujeto que tiene un sistema inmune inmaduro, un sujeto en riesgo por un trastorno gastrointestinal o quien tiene un trastorno gastrointestinal. Los métodos se pueden utilizar en sujetos humanos, por ejemplo, infantes y niños o en la medicina veterinaria. Sin considerar al sujeto (ya sea humano o no humano) , cualquiera de los presentes métodos pueden incluir una etapa de identificación del sujeto. Por ejemplo, los métodos pueden incluir una etapa determinar si el sujeto está en necesidad de tratamiento.
Composiciones Alimentos fermentados Las composiciones de la invención incluyen composiciones nutricionales, es decir, productos alimenticios fermentados por el organismo probiótico, L. paracasei CBA L74. Cualquier producto alimenticio disponible para la fermentación por L. paracasei CBA L74 se puede utilizar. El producto alimenticio puede ser un producto lácteo, por ejemplo, leche o un producto a base de leche. Las fuentes de leche ejemplares se incluyen, sin limitación, ganado vacuno, ovejas, cabras, yaks, búfalo de agua, caballos, asnos, renos y camellos. Sin considerar la fuente, la leche o productos de leche pueden estar en cualquier forma adecuada para la fermentación por L. paracasei CBA L74. Por ejemplo, la leche puede ser leche entera o leche que se ha procesado para remover algo o toda la grasa de mantequilla, por ejemplo leche al 2%, leche al 1% o leche sin grasa. Alternativamente o además, la leche previamente puede ser pasterizada y/o homogenizada, secada y reconstituida, condensada o evaporada. Las fracciones de producto de leche que incluyen caseína, proteína de suero o lactosa también se pueden utilizar. En algunas modalidades, el producto de leche puede ser de aproximadamente 1% a aproximadamente 30% de polvo de leche descremada reconstituida, por ejemplo aproximadamente 2%, aproximadamente 5%, aproximadamente 7%, aproximadamente 9%, aproximadamente 10%, aproximadamente 12%, aproximadamente 15%, aproximadamente 20%, aproximadamente 25%, aproximadamente 30% de polvo de leche descremada reconstituida. Antes de la fermentación el producto de leche se puede combinar con uno o más de los siguientes: a) un carbohidrato (por ejemplo un disacárido tal como dextrosa o un almidón; b) un lípido; c) una vitamina; y d) un mineral. Por ejemplo, el polvo de leche descremada se puede combinar con dextrosa a aproximadamente 2%, por ejemplo a aproximadamente 0.25%, aproximadamente 0.50%, aproximadamente 0.75%, aproximadamente 1.0%, aproximadamente 1.5%, aproximadamente 2.0%.
El producto alimenticio puede ser un producto de cereal, por ejemplo, arroz, trigo, avenas, cebada, maíz, centeno, sorgo, mijo o triticale. El producto de cereal puede ser un grano entero o ser molido en una harina. El producto alimenticio puede ser una sola clase de cereal o una mezcla de dos o más clases de cereales, por ejemplo, una harina de avena más harina de cebada malteada. Los productos de cereal pueden ser de un grado y tipo adecuado para el consumo humano o pueden ser productos adecuados para el consumo por animales domésticos. Generalmente, el producto de cereal se hidrata antes de la fermentación. La concentración de cereal puede variar, pero intervalos útiles incluyen de aproximadamente 5% a aproximadamente 50% peso/volumen, por ejemplo, aproximadamente 8% peso/volumen, aproximadamente 10% peso/volumen, aproximadamente 12% peso/volumen, aproximadamente 15% peso/volumen, aproximadamente 18% peso/volumen, aproximadamente 20% peso/volumen, aproximadamente 22% peso/volumen, aproximadamente 25% peso/volumen, aproximadamente 30% peso/volumen, aproximadamente 35% peso/volumen, aproximadamente 40% peso/volumen, aproximadamente 45% peso/volumen, aproximadamente 50% peso/volumen, Las concentraciones ejemplares incluyen 15% en peso/volumen de arroz o una mezcla de 18.5% en peso/volumen de harina de avena más 5% en peso/volumen de harina de cebada malteada. El pH de los cereales hidratados se puede ajustar utilizando cualquier ácido adecuado para el consumo. El ácido puede ser, por ejemplo, un ácido orgánico. Los ácidos orgánicos útiles incluyen ácido acético, ácido cítrico, ácido láctico, ácido adípico, ácido málico y ácido tartárico. Se puede utilizar cualquier combinación de dos o más ácidos. En algunas modalidades, el pH se puede ajustar a aproximadamente 4.0 utilizando ácido cítrico.
El producto alimenticio también puede ser un vegetal o un producto frutal, por ejemplo, un jugo, un puré, un concentrado, una pasta, una salsa, un escabeche o una cátsup. Los vegetales y frutas ejemplares incluyen, sin limitación, calabazas, por ejemplo, calabacín, calabaza amarilla, calabaza de invierno, zapallo; papas, espárragos, brócoli, col de Bruselas, frijoles, por ejemplo, judías verdes, alubias, judías, habas, semillas de soja, col, zanahorias, coliflor, pepinos, colinabo, porros, escalonias, cebollas, guisantes de azúcar, guisantes ingleses, pimientos, nabos, rutabagas, tomates, manzanas, peras, duraznos, ciruelas, fresas, frambuesas, zarzamoras, arándanos, arándanos rojos, moras grande y oscuras, grosella silvestre, uvas, grosellas, naranjas, limones, toronjas, plátanos, mangos, fruta de kiwi y carambola.
El producto alimenticio también puede ser una "leche" hecha de grano (leche de cebada, avena o espelta) nueces de árbol (leche de almendra, anacardo, coco, avellana o nuez), legumbres ("leche" de soja, cacahuate, chícharo o lupino) o semillas ("leche" de quinua, semilla de ajonjolí o semilla de girasol) .
También se contemplan productos alimenticios que comprenden proteínas de animales, por ejemplo, carne, por ejemplo, salchichas, carnes secas, pescado, y productos de pescado secos .
Sin considerar el tipo de producto alimenticio que es utilizado, el producto se combina con L. paracasei CBA L74 y se incuba a una temperatura y durante un tiempo suficiente para que ocurra la fermentación. Se puede utilizar cualquier método de fermentación estándar conocido en la técnica. Las condiciones de fermentaciones específicas variarán de acuerdo con muchos factores incluyendo, por ejemplo, el tipo de producto alimenticio, la concentración del producto alimenticio, la instrumentación que es utilizada, el volumen de muestra, la concentración inicial del inoculo de L. paracasei CBA L74, la presencia, si lo hay, de co-inóculo, las propiedades organolépticas del alimento fermentado y el uso propuesto del alimento fermentado.
Tanto la instrumentación como el sustrato (es decir, el producto alimenticio que es fermentado) se esterilizan antes de la inoculación con L. paracasei CBA L74 con el fin de disminuir el nivel de, o eliminar, las bacterias viables y/u hongos y/o virus infecciosos. La instrumentación se puede esterilizar utilizando métodos estándares o de acuerdo con las instrucciones del fabricantes. La elección de un método particular para la esterilización del sustrato dependerá, en parte, sobre la estabilidad del sustrato al método de esterilización. Por ejemplo, el sustrato se puede esterilizar por vapor y presión, por ejemplo mediante la colocación en autoclave, ciclos repetidos de calentamiento y enfriamiento (por ejemplo tindalización) la exposición a altas presiones (por ejemplo pascalización) , ultrafiltración o radiación (por ejemplo la exposición a rayos gamma, rayos x, haz electrónico y/o ultravioleta) , longitud de onda de 10 nm a 320 nm, por ejemplo 50 nm a 320 nm, 100 nm a 320 nm, 150 nm a 320 nm, 180 nm a 320 nm, o 200 nm a 300 nm) . Alícuotas del sustrato se pueden remover después del tratamiento y colocar en placa sobre el medio adecuado para confirmar la ausencia de contaminantes bacterianos y/o fúngales. Si el sustrato se ha esterilizado por la exposición a altas temperaturas, este se debe enfriar a por lo menos 37°C antes de la inoculación L. paracasei CBA L74.
El sustrato se puede inocular con L. paracasei CBA L74 de acuerdo con métodos estándares, por ejemplo, a partir del cultivo líquido fresco o un cultivo deshidratado por congelación que se ha resuspendido en un medio acuoso durante un tiempo corto antes de la inoculación. En general, L. paracasei CBA L74 se adicionan en concentraciones de aproximadamente 0.5 x 106 a aproximadamente 1 x 106 cfu/ml de sustrato, por ejemplo, aproximadamente 1 x 106 cfu/ml, aproximadamente 2 x 106 cfu/ml, aproximadamente 5 x 106 cfu/ml, 7 x 106 cfu/ml, 8 x 106 cfu/ml. El cultivo debe ser agitado lo suficiente para producir una distribución relativamente uniforme de bacterias y el sustrato, pero no excesivamente puesto que L. paracasei CBA L74 es una bacteria anaeróbica. Por ejemplo, un cultivo de cinco litros se puede agitar a aproximadamente 150 rpm. La temperatura de fermentación es generalmente a 37 °C. Varios parámetros, por ejemplo, el pH, la presión parcial de 02, la velocidad del agitador, temperatura, mezclado de gas, nivel de espuma y concentración del sustrato se pueden inspeccionar durante la fermentación y ajustar de conformidad. El crecimiento del L. paracasei CBA L74 se puede inspeccionar utilizando métodos microbiológicos estándares. La fermentación se lleva a cabo hasta que la concentración de L. paracasei CBA L74 está aproximadamente entre aproximadamente 108/ml y aproximadamente 109/ml. Dependiendo del sustrato y otras condiciones, esta concentración se puede alcanzar en aproximadamente 10 a aproximadamente 30 horas después de la inoculación, por ejemplo aproximadamente 12 horas, aproximadamente 15 horas, aproximadamente 18 horas, aproximadamente 24 horas, aproximadamente 30 horas.
Muestras del sustrato se pueden ensayar antes, durante y después de la fermentación para el aseguramiento de calidad utilizando métodos microbiológicos estándares. Los métodos ejemplares incluyen, pero no están limitados a, el crecimiento sobre agar Rogosa para L. paracasei CBA L74, crecimiento sobre agar de control en placa (PCA) para aerobios totales, crecimiento sobre agar McConkay para coliformes, crecimiento sobre agar clostridial reforzado (RCM) para Clostridia. Además de los conteos de colonia las morfologías de la colonia se pueden observar y comparar con muestras de referencia.
En algunas modalidades, un co-inóculo se puede adicionar junto con el L. paracasei CBA L74 con el fin de ayudar a iniciar la fermentación. Los co-inóculos útiles para la fermentación de productos de leche incluyen, por ejemplo, sin limitación Streptococcus thermophilus, Lactobacillus paracasei , Lactobacillus salivarious , Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus casei, Lactobacillus lactis, Lactobacillus delbrueckii , subsp. Bulgaricus , Lactobacillus acidophilus , Lactobacillus brevis, o Leuconostoc mesenteroides . En general, la concentración del co-inoculo será menor que aquella de L. paracasei CBA L74, por ejemplo, aproximadamente 1 x 104/ml x loVml. La concentración final de S. thermophilus puede variar de aproximadamente 0.5 x 108/ml a aproximadamente 2.5 x 108/ml.
Productos Alimenticios Una vez que se han alcanzado las concentraciones adecuadas de L. paracasei CBA L74, el alimento fermentado puede ser además procesado para el uso. En algunas modalidades, el pH del alimento fermentado se puede ajusfar, por ejemplo de aproximadamente 3.0 a más cerca de la neutralidad, por ejemplo 6.5, con la adición de NaOH o OH. En algunas modalidades el alimento fermentado se puede secar. El producto alimenticio fermentado se puede secar mediante cualquier método conocido en la técnica que da por resultado la retención de las propiedades inmunomoduladoras del alimento fermentado. Los métodos de secado ejemplares incluyen el secado por roció, secado por congelación, por ejemplo liofilización o secado en tambor. El contenido de agua final del producto alimenticio fermentado puede variar, pero puede estar entre aproximadamente 1% y aproximadamente 10% o más. En algunas modalidades, el proceso de secado puede volver al L. paracasei CBA L74 no replicante.
Los alimentos fermentados secos se pueden hidratar antes del uso. Dependiendo de la cantidad de liquido utilizada en la hidratación, los productos alimenticios fermentados pueden contener el equivalente de aproximadamente 102 y 1012 cfu/ml de L . paracasei CBA L74. El L. paracasei CBA L74 seco no forma colonias, asi se entiende que esta cantidad se calcula en base al número de bacterias vivas que estuvieron presentes en los alimentos fermentados antes de la etapa de secado. En algunas modalidades, los productos alimenticios fermentados pueden incluir el equivalente de aproximadamente 107 a aproximadamente 1012 cfu/g, por ejemplo, aproximadamente 5 x 107 cfu/g, aproximadamente 1 x 108 cfu/g, aproximadamente 5 x 108 cfu/g, aproximadamente 1 x 109 cfu/g, aproximadamente 5 x 109 cfu/g, aproximadamente 1 x 1010 cfu/g, aproximadamente 5 x 1010 cfu/g, aproximadamente 1 x 1011 cfu/g, aproximadamente 5 x 1011 cfu/g de peso seco.
Dos o más productos alimenticios fermentados preparados por los métodos de la invención se pueden combinar antes de la administración. Por ejemplo, los productos de leche fermentados se pueden combinar con productos de cereal fermentados. Alternativamente, el producto alimenticio fermentado se puede combinar con otros productos alimenticios, por ejemplo, productos alimenticios no fermentados o productos alimenticios fermentados utilizando otras cepas bacterianas. Se puede utilizar cualquier combinación siempre y cuando se retengan las propiedades imunomoduladoras del alimento fermentado. Los productos alimenticios ejemplares incluyen, sin limitación, productos lácteos, por ejemplo leche, yogurt, requesón, queso y productos a base de queso, leches fermentadas, productos fermentados a base de leche, polvos a base de leche, fórmulas infantiles, alimentos infantiles, colados a base de leche, helado, gelato, budines, sopas, salsas, purés o aderezos, fórmulas nutricionales para la edad avanzada; productos de cereal, por ejemplo pablum, alimentos infantiles colados a base de cereal, harina de avena, fariña, sémola, polenta, pasta, bizcochos, galletas, barras energéticas, productos vegetales, por ejemplo purés, alimentos infantiles colados a base de vegetales, vegetales en vinagre incluyendo pepinos, col, zanahorias, frijoles, pimientos o condimentos; productos frutales, por ejemplo alimentos infantiles colados a base de fruta, productos de tomate, purés, salsas, pastas, cátsups, purés frutales; o productos a base de proteina, por ejemplo legumbres, salchichas, carnes de refrigerio, perros calientes o carnes en puré. En algunas modalidades el alimento fermentado se puede combinar con alimentos para mascotas o alimentos para animales.
En algunas modalidades, las composiciones pueden incluir fermentados de L. paracasei CBA L74, de los cuales todos o sustancialmente todas, de las células L. paracasei CBA L74 se han removido. Métodos para separar células del medio de crecimiento son bien conocidos en la técnica y pueden depender de métodos físicos, por ejemplo, centrifugación para producir una pelotilla de células y un sobrenadante de cultivo, filtración, ultrafiltración, filtración de flujo tangencial, filtración de flujo normal u osmosis inversa. Alternativamente o además, el método de separación puede ser a base de ligando e incluye, por ejemplo, un anticuerpo que específicamente enlaza a L. paracaseí CBA L74. El anticuerpo se puede acoplar a un soporte sólido tal como una cuenta o perla magnética.
L. paracasei CBA L74 aislado En algunas modalidades, las composiciones de la invención incluyen L. paracasei CBA L74 que son parcial o sustancialmente aislados del medio en el cua'l se cultivaron. El L. paracasei CBA L74 puede ser vivo o no replicante, por ejemplo, inactivado, por ejemplo, mediante el tratamiento térmico. Las células se pueden liofilizar o secar por congelación bajo condiciones que preservan la viabilidad celular. Métodos de liofilización son bien conocidos en la técnica .
Portadores Fisiológicos En algunas modalidades, las composiciones de la invención pueden incluir L. paracasei CBA L74 aislado en combinación con un portador fisiológicamente aceptable. El L. paracasei CBA L74 puede ser vivo o no replicante, por ejemplo, inactivado, por ejemplo, mediante el tratamiento térmico. La dosificación puede variar, pero puede variar del equivalente de aproximadamente 102 a aproximadamente 1012 cfu/g, por ejemplo 1 xlO2 cfu/g, 5 xlO2 cfu/g, 1 xlO3 cfu/g, 5 xlO3 cfu/g, 1 xlO4 cfu/g, 5 xlO4 cfu/g, 1 xlO5 cfu/g, 5 xlO5 cfu/g, 1 xlO6 cfu/g, 5 xlO6 cfu/g, 1 xlO7 cfu/g, 5 xlO7 cfu/g, 1 xlO8 cfu/g, 5 xlO8 cfu/g, 1 xlO9 cfu/g, 5 xlO9 cfu/g, 1 xlO10 cfu/g, 5 xlO10 cfu/g, 1 xlO11 cfu/g, 5 xlO11 cfu/g, 1 xlO12 cfu/g de peso seco.
El portador fisiológicamente aceptable puede ser un alimento o producto alimenticio. El L. paracasei CBA L74 aislado se puede adicionar a un alimento o producto alimenticio antes del empaquetamiento o procesamiento. Alternativamente o además, L. paracasei CBA L74 aislado se puede adicionar a un alimento o producto alimenticio antes del consumo. Por ejemplo, L. paracasei CBA L74 aislado se puede combinar con cualquiera de los alimentos o productos alimenticios descritos en lo anterior. El producto alimenticio puede ser un producto alimenticio fermentado o un producto alimenticio no fermentado. Por ejemplo, L. paracasei CBA L74 aislado se puede adicionar a un producto lácteo o de cereal no fermentado. En algunas modalidades, el L. paracasei CBA L74 se puede adicionar a un alimento producto alimenticio para incluir el equivalente de aproximadamente de aproximadamente 107 a aproximadamente 1012 cfu/g, por ejemplo, aproximadamente 5 xlO7 cfu/g, aproximadamente 1 xlO8 cfu/g, aproximadamente 5 xlO8 cfu/g, aproximadamente 1 xlO9 cfu/g, aproximadamente 5 xlO9 cfu/g, aproximadamente 1 xlO10 cfu/g, aproximadamente 5 xlO10 cfu/g, aproximadamente 1 xlO11 cfu/g, aproximadamente 5 xlO11 cfu/g de peso seco.
Portadores Farmacéuticos Las composiciones también incluyen un portador farmacéuticamente aceptable. Los inventores utilizan los términos "farmacéuticamente aceptables" (o "farmacológicamente aceptables") para referirse a entidades moleculares y composiciones que no producen una reacción adversa, alérgica o de otra manera indeseable cuando se administra un animal o un humano, como sea apropiado. El término "portador farmacéuticamente aceptable" como se utiliza en la presente, incluye cualquiera y todos los solventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos, isotónicos y de retardo de absorción, soluciones amortiguadoras, excipientes, aglutinantes, lubricantes, geles, surfactantes y los similares, que se pueden utilizar como medios para una sustancia farmacéuticamente aceptable.
Esta invención también incluye composiciones farmacéuticas que contienen como el ingrediente activo, el L. paracasei CBA L74 descrito en la presente, en combinación con uno o más portadores farmacéuticamente aceptables. En algunas modalidades, el L. paracasei CBA L74 se puede esterilizar utilizando técnicas de esterilización convencionales antes o después de que se combine con el portador farmacéuticamente aceptable. En la elaboración de las composiciones de la invención, el L. paracasei CBA L74 se mezcla típicamente con un excipiente, diluido por un excipiente o encerrado dentro de tal portador en la forma de, por ejemplo, una cápsula, tableta, saquito, papel u otro recipiente. Cuando el excipiente sirve como un diluyente, este puede ser un material sólido, semisólido o liquido (por ejemplo solución salina normal) que actúa como un vehículo, portador o medio para el ingrediente activo. De esta manera, las composiciones pueden estar en la forma de tabletas, pildoras, polvos, pastillas, saquitos, cachets, elixires, suspensiones, emulsiones, soluciones, jarabes, aerosoles (como un sólido o en un medio liquido) , ungüentos, cápsulas de gelatina blanda y dura, supositorios, soluciones inyectables estériles y polvos empaquetados estériles. Como es conocido en la técnica, el tipo de diluyente puede variar dependiendo de la ruta de administración propuesta. Las composiciones resultantes pueden incluir agentes adicionales, tales como conservadores. El excipiente o portador se selecciona en la base del modo de ruta de administración. Los portadores farmacéuticos adecuados, así como necesidades farmacéuticas para el uso en formulaciones farmacéuticas, son descritos en Remington ' s Pharmaceutical Sciences (E. W. Martin), un texto de referencia bien conocido en este campo, y en la USP/NF (Farmacopea de los Estados Unidos y el Formulario Nacional). Algunos ejemplos de excipientes adecuados incluyen lactosa, dextrosa, sacarosa, sorbitol, manitol, almidones, goma de acacia, fosfato de calcio, alginatos, tragacanto, gelatina, silicato de calcio, celulosa microcristalina, polivinilpirrolidona, celulosa, agua, jarabe y metilcelulosa . Las formulaciones adicionalmente pueden incluir: agentes lubricantes tales como talco, estereato de magnesio y aceite mineral; agentes humectantes, agentes emulsificantes y de suspensión; agentes preservantes tales como benzoatos de metilo y de propilhidroxi, agentes edulcorantes y agentes saborizantes . Las composiciones farmacéuticas se pueden formular para proporcionar una liberación rápida, sostenida o retardada del ingrediente activo después de la administración al paciente al emplear procedimientos conocidos en la técnica .
Las composiciones farmacéuticamente aceptables para el uso en los presentes métodos, que incluyen aquellas en las cuales L. paracasei CBA L74 es atrapado en un coloide para suministro oral, se pueden preparar de acuerdo con técnicas estándares. El L. paracasei CBA L74 se puede secar y compactar al moler o pulverizar e insertar una cápsula para la administración oral. En algunas modalidades, el L. paracasei CBA L74 se puede combinar con uno o más excipientes, por ejemplo, un desintegrante, un rellenador, un agente deslizante o un conservador. Las cápsulas adecuadas incluyen tanto cápsulas de cubierta dura como cápsulas de cubierta blanda. Cualquier coloide a base de lipido o a base de polímero se puede utilizar para formar la cápsula. Los polímeros ejemplares útiles para preparaciones coloidales incluyen gelatina, polisacáridos de plantas o sus derivados tales como carragenanos y formas modificadas de almidón de celulosa, por ejemplo hipromelosa. Opcionalmente, se pueden adicionar otros ingredientes a la solución de agente de gelificación, por ejemplo plastificantes tales como glicerina y/o sorbitol para disminuir la dureza de la cápsula, agentes colorantes, conservadores, desintegrantes, lubricantes y tratamiento superficial. En algunas modalidades, la cápsula no incluye gelatina. En otras modalidades, la cápsula no incluye polisacáridos de planta o sus derivados.
Sin considerar su fuente original o la manera en la cual se obtienen, el L. paracasei CBA L74 de la invención se pueden formular de acuerdo con su uso. Estas composiciones se pueden preparar de una manera bien conocida en la técnica farmacéutica, y se pueden administrar mediante una variedad de rutas, dependiendo de si se desea el tratamiento local o sistémico y sobre el área que es tratada. La administración puede ser oral o tópica (incluyendo oftálmica y a las membranas mucosas incluyendo intranasal, vaginal y suministro rectal) . En algunas modalidades, la administración puede ser pulmonar (por ejemplo, mediante inhalación o insuflación de polvos o aerosoles, incluyendo por nebulizador; intratraqueal, intranasal, epidérmica y transdérmica) u ocular. Métodos para suministro ocular pueden incluir la administración tópica (gotas para los ojos), inyección subcon untival, periocular o intravitrea o interrupción mediante el catéter de balón o insertos oftálmicos quirúrgicamente colocados en el saco conj untival. La administración parenteral incluye la inyección intravenosa, intra-arterial, subcutánea, intraperitoneal o intramuscular o infusión; o intracraneal, por ejemplo administración intratecal o intraventicular . La administración parenteral puede estar en la forma de una dosis de un solo bolo, o puede ser, por ejemplo, mediante una bomba de perfusión continua. Las composiciones farmacéuticas y formulaciones para la administración tópica pueden incluir partes transdérmicos , ungüentos, lociones, cremas, geles, gotas, supositorios, roció, líquidos, polvos y los similares. Los portadores farmacéuticos convencionales, acuosos, a base de polvo o aceitosos, espesantes y los similares pueden ser necesarios o deseables .
Las composiciones se pueden formular en una forma de dosificación unitaria, cada dosificación que contiene, por ejemplo, de aproximadamente 0.005 mg a aproximadamente 2000 mg de L. paracasei CBA L74 por dosis diaria. El término "forma de dosificación unitaria" se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas, dosificaciones unitarias para sujetos humanos y otros mamíferos, cada unidad que contiene una cantidad predeterminada de material activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado, en asociación con el excipiente farmacéutico adecuado. Para preparar composiciones sólidas tales como tabletas, el ingrediente activo principal se mezcla con un excipiente farmacéutico para formar una composición de preformulación sólida que contiene una mezcla homogénea de un compuesto en la presente invención. Cuando se hace referencia a estas composiciones de preformulación como homogéneas, el ingrediente activo se dispersa de manera atipica uniformemente por toda la composición de modo que la composición se puede subdividir fácilmente en forma de dosificación unitaria igualmente efectiva tales como tabletas, pildora y cápsulas. Esta formulación sólida luego se subdivide en forma de dosificación unitaria del tipo descrito en lo anterior que contienen de, por ejemplo, 0.005 mg a aproximadamente 1000 mg del L. paracasei CBA L74 de la presente invención.
Las composiciones se pueden formular en una forma de dosificación unitaria, cada dosificación que contiene, por ejemplo, de aproximadamente 0.1 mg a aproximadamente 50 mg, de aproximadamente 0.1 mg a aproximadamente 40 mg, de aproximadamente 0. 1 mg a aproximadamente 20 mg, de aproximadamente 0. 1 mg a aproximadamente 10 mg, de aproximadamente 0. 2 mg a aproximadamente 20 mg, de aproximadamente 0. 3 mg a aproximadamente 15 mg, de aproximadamente 0. 4 mg a aproximadamente 10 mg, de aproximadamente 0.5 mg a aproximadamente 1 mg, de aproximadamente 0.5 mg a aproximadamente 100 mg, de aproximadamente 0.5 mg a aproximadamente 50 mg, de aproximadamente 0.5 mg a aproximadamente 30 mg, de aproximadamente 0.5 mg a aproximadamente 20 mg, de aproximadamente 0.5 mg a aproximadamente 10 mg, de aproximadamente 0.5 mg a aproximadamente 5 mg, de aproximadamente 1 mg a aproximadamente 50 mg, de aproximadamente 1 mg a aproximadamente 30 mg, de aproximadamente 1 mg a aproximadamente 20 mg, de aproximadamente 1 mg a aproximadamente 10 mg, de aproximadamente 1 mg a aproximadamente 5 mg, de aproximadamente 5 mg a aproximadamente 50 mg, de aproximadamente 5 mg a aproximadamente 20 mg, de aproximadamente 5 mg a aproximadamente 10 mg, de aproximadamente 10 mg a aproximadamente 100 mg, de aproximadamente 20 mg a aproximadamente 200 mg, de aproximadamente 30 mg a aproximadamente 150 mg, de aproximadamente 40 mg a aproximadamente 100 mg, de aproximadamente 50 mg a aproximadamente 100 mg del ingrediente activo.
En algunas modalidades, las tabletas o pildoras de la presente invención se pueden recubrir o de otra manera combinar para proporcionar una forma de dosificación que proporciona la ventaja de acción prolongada. Por ejemplo, la tableta o pildora puede comprender una dosificación interior de un componente de dosificación exterior, este último que está en la forma de una envoltura sobre el primero. Los dos componentes se pueden separar mediante una capa entérica que sirve para resistir la desintegración en el estómago y permitir que el componente interior pase intacto en el duodeno o sea retardado en liberación. Una variedad de materiales se puede utilizar para tales capas entéricas o recubrimientos, tales materiales que incluyen un número de ácidos poliméricos y mezclas de ácidos poliméricos con tales materiales tales como laca, alcohol cetilico y acetato de celulosa.
Las formas liquidas en las cuales las composiciones de la presente invención se pueden incorporar para la administración oralmente o mediante inyección incluyen soluciones acuosas, jarabes adecuadamente saborizados, suspensiones acuosas o de aceite y emulsiones saborizadas con aceites comestibles tal como aceite de semilla de algodón, aceite de ajonjolí, aceite de coco o aceite de cacahuate, así como elixires y vehículos farmacéuticos similares.
La proporción o concentración de las composiciones de la invención en una composición farmacéutica puede variar dependiendo de un número de factores que incluyen la dosificación, características químicas (por ejemplo hidrofobicidad) y la ruta de administración. Por ejemplo, el L. paracasei CBA L74 de la invención puede proporcionar en una cápsula que contiene de aproximadamente 0.005 mg a aproximadamente 1000 mg para administración oral. Alternativamente o además, la dosificación se puede expresar como cfu/g de peso seco. La dosificación puede variar, pero puede variar del equivalente de aproximadamente 102 a aproximadamente 1012 cfu/g, por ejemplo 1 xlO2 cfu/g, 5 xlO2 cfu/g, 1 xlO3 cfu/g, 5 xlO3 cfu/g, 1 xlO4 cfu/g, 5 xlO4 cfu/g, 1 xlO5 cfu/g, 5 xlO5 cfu/g, 1 xlO6 cfu/g, 5 xlO6 cfu/g, 1 xlO7 cfu/g, 5 xlO7 cfu/g, 1 xlO8 cfu/g, 5 xlO8 cfu/g, 1 xlO9 cfu/g, 5 xlO9 cfu/g, 1 xlO10 cfu/g, 5 xlO10 cfu/g, 1 xlO11 cfu/g, 5 xlO11 cfu/g, 1 xlO12 cfu/g de peso seco.
Métodos de uso Las composiciones descritas en la presente son generalmente y variadamente útiles para la estimulación de una respuesta inmunomoduladora en el sistema inmune de la mucosa. Los sujetos para quienes es benéfica tal estimulación incluyen aquellos que incluyen un déficit del sistema inmune de la mucosa, por ejemplo, aquellos que tienen un sistema inmune inmaduro, tales como infantes o niños pequeños, aquellos que tienen un sistema inmune deprimido, tal como los de la tercera edad, pacientes que toman fármacos inmunosupresores, radiación o quimioterapia, aquellos que tienen un sistema inmune hiperactivado debido a alergias o trastornos autoinmunes y aquellos que sufren de trastornos gastrointestinales. Los trastornos gastrointestinales pueden incluir infecciones debido a virus, por ejemplo, rotavirus bacterias patogénicas, por ejemplo Salmonella , Yersinia , Shigella , Listeria , Clostridium, E. coli, E. sakazaki , H, pylorí; o protozoarios patogénicos, por ejemplo, Entamoeba histolytica , Cryptosporidium spp, Campylobacter spp. Los trastornos gastrointestinales también pueden incluir, por ejemplo, alergias a los alimentos, hipersensibilidad a los alimentos, síndrome de intestino irritable, enfermedad de intestino inflamatorio, pouchitis, enfermedad de Crohn, colitis ulcerativa, enfermedad celiaca, enterocolitis necrotizante y envejecimiento, particularmente envejecimiento del sistema gastrointestinal.
Un sujeto se trata de manera efectiva si sobreviene un resultado clínicamente benéfico. Esto puede significar, por ejemplo como una resolución completa de los síntomas asociados con un déficit del sistema inmune de la mucosa, una disminución en la severidad de los síntomas asociados con un déficit del sistema inmune de la mucosa, o un retardo de la progresión de síntomas asociados con un déficit del sistema inmune de la mucosa. Estos métodos además pueden incluir las etapas de a) identificar a un sujeto (por ejemplo un paciente, y más específicamente, un paciente humano) quien tiene un déficit del sistema inmune de la mucosa; y b) proporcionar al sujeto una composición que comprende L. paracasei CBA L74 descrito en la presente, tal como cualquier producto alimenticio fermentado o composición que comprende L. paracasei CBA L74 en un portador fisiológicamente aceptable. Una cantidad de tal composición proporcionada al sujeto que da por resultado una resolución completa de los síntomas asociados con un déficit del sistema inmune de la mucosa, una disminución en la severidad de los síntomas asociados con un déficit del sistema inmune de la mucosa, o un retardo de la progresión de sistemas asociados con un déficit del sistema inmune de la mucosa se considera una cantidad terapéuticamente efectiva. Los presentes métodos también pueden incluir una etapa de inspección para ayudar a optimizar la dosificación y programación así como predecir el efecto .
Los métodos descritos en la presente se pueden aplicar a una amplia gama de especies, por ejemplo, humanos, primates no humanos (monos) , caballos, cerdos, vacas u otro tipo de ganado, perros, gatos u otros mamíferos mantenidos como mascotas, ratas, ratones u otros animales de laboratorio. Las composiciones descritas en la presente son útiles en composiciones terapéuticas y regímenes o para la elaboración de un medicamento para el uso del tratamiento de condiciones como es descrito en la presente (por ejemplo un déficit del sistema inmune de la mucosa debido a inmadurez, envejecimiento, infección, alergias a los alimentos, un trastorno inflamatorio o autoinmune) .
Las composiciones nutricionales descritas en la presente se pueden administrar oralmente como parte de la dieta diaria ordinaria de un sujeto. Las composiciones alimenticias se pueden administrar como soporte nutricional para tanto niños como adultos. Cuando se formulan como productos farmacéuticos, las composiciones se pueden administrar a cualquier parte del cuerpo del hospedero para el suministro subsecuente a una célula objetivo. Una composición se puede suministrar a, sin limitación, el cerebro, el fluido cerebro espinal, articulaciones, mucosa nasal, sangre, pulmones, intestinos, tejidos musculares, piel o la cavidad peritoneal de un mamífero. En términos de rutas de suministro, una composición se puede administrar mediante inyección intravenosa, intracraneal, intraperitoneal, intramuscular, subcutánea, intramuscular, intrarectal, intravaginal, intratecal, intratraqueal , intradérmica o transdérmica, mediante administración oral o nasal, o mediante perfusión gradual a través del tiempo. En un ejemplo adicional, una preparación en aerosol de una composición se puede proporcionar a un hospedero mediante inhalación.
Sin considerar si las composiciones se formulan como productos alimenticios o como productos farmacéuticos, la dosificación requerida dependerá de la ruta de administración, la naturaleza de la formulación, la naturaleza de la condición del sujeto, por ejemplo, inmadurez del sistema inmune o un trastorno gastrointestinal, el tamaño del sujeto, peso, área de superficie, edad y sexo, otros fármacos que son administrados y el buen criterio de los clínicos asistentes. Las dosificaciones adecuadas están en el intervalo de 0.01-1,000 mg/kg. Algunos intervalos de dosis típicos son de aproximadamente 1 µ?/kg a aproximadamente 1 g/kg de peso corporal por día. En algunas modalidades, el intervalo de dosis es de aproximadamente 0.01 mg/kg a aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal por día. En algunas modalidades, la dosis puede ser, por ejemplo, 1 mg/kg, 2 mg/kg, 5 mg/kg, 10 mg/kg, 20 mg/kg, 50 mg/kg o 100 mg/kg. La dosificación es probable que dependa de tales variables como el tipo y grado de progresión de la enfermedad o trastorno, el estado de salud global del paciente particular, la eficacia biológica relativa del compuesto seleccionado, la formulación del excipiente y su ruta de administración .
Las dosis efectivas se pueden extrapolar de las curvas de dosis-respuesta derivadas de sistemas de prueba in vitro o de modelo de animal. Por ejemplo, el análisis in vitro de la producción de citoquina por las células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) puede ser útil para ensayar respuestas pro- y anti-inflamatorias, por ejemplo las secreción de IL-?ß, IL-12, IL-4, TNF-OÍ O IL-10 respectivamente. Las composiciones también se pueden analizar para efectos en modelos animales, por ejemplo, la producción de IgA, producción de citoquina por explantas de partes Peyer, y célula dendrítica y respuesta de células T.
Amplias variaciones en la dosificación necesaria van hacer esperadas en vista de la variedad de objetivos celulares y la diferentes eficiencias de varias rutas de administración. Las variaciones en estos niveles de dosificación se pueden ajustar utilizando rutinas empíricas estándares para la optimización, como es bien entendido en la técnica. La administración puede ser única o múltiple (por ejemplo 2- o 3-, 4-, 6-, 8-, 10-, 20-, 50-, 100-, 150-, o más veces) . La encapsulacion de los compuestos en un vehículo de suministro adecuado (por ejemplo, micropartículas poliméricas o dispositivos implatables) puede incrementar la eficiencia del suministro.
La duración del tratamiento con cualquier composición proporcional en la presente puede ser de cualquier lapso de tiempo de tan corto como un día a tan largo como el lapso de vida del hospedero (por ejemplo, muchos años) . Por ejemplo, una composición se puede administrar una vez a la semana (por ejemplo, por 4 semanas a muchos meses o años) ; una vez al mes (por ejemplo, tres a doce meses o por muchos años) ; o una vez al año durante un periodo de 5 años, diez años o más tiempo. También se observa que la frecuencia de tratamiento puede ser variable. Por ejemplo, en las presentes composiciones se puede administrar una vez (o dos veces, tres veces, etc.) diariamente, semanalmente, mensualmente o anualmente. Cuando las composiciones se formulan como un producto alimenticio, por ejemplo, las composiciones se pueden administrar diariamente en cada comida .
Cualquier método conocido para aquellos en la técnica se puede utilizar para determinar si se induce una respuesta particular. Los métodos clínicos que pueden estimar el grado de un estado de enfermedad particular se pueden utilizar para determinar si se induce una respuesta. Por ejemplo, un sujeto se puede inspeccionar para el alivio sintomático, por ejemplo, alivio de cólico, diarrea, constipación, nausea, vomito, dolor abdominal, calambre, acidez, distención abdominal, flatulencia o incontinencia. Alternativamente o además, se pueden utilizar marcadores séricos, técnicas de formación de imagen, por ejemplo, métodos de ultrasonido, de rayos x y endoscópicos .
Las composiciones también se pueden administrar en conjunción con otras modalidades terapéuticas. Otras modalidades terapéuticas variarán de acuerdo con el trastorno particular, pero pueden incluir, por ejemplo, medicaciones anti-diarreicas, anti-eméticos, agentes anti-colinérgicos, agentes anti-inflamatorios , anti-histaminas antibióticas y otros tratamientos dietéticos, por ejemplo, fórmulas infantiles hipoalergénicas . La administración concurrente de dos o más agentes terapéuticos no requiere que los agentes sean administrados al mismo tiempo por la misma ruta, mientras que haya una sobreposición en el periodo de tiempo durante el cual los agentes están ejerciendo su efecto terapéutico. Se contempla la administración simultánea o secuencial, como es la administración en diferentes dias o semanas .
Articulo de manufactura Las composiciones descritas en la presente también se pueden ensamblar en equipos, junto con instrucciones para el uso. Por consiguiente, los productos empaquetados (por ejemplo, recipientes que contienen una o más de las composiciones de L. paracasei CBA L74 descritas en la presente y empaquetados para almacenamiento, envió o venta en concentraciones concentradas o listas para el uso) y equipos, que incluyen por lo menos un compuesto de la invención e instrucciones para el uso, también están dentro del alcance de la invención. En cualquiera de los productos empaquetados o equipos, las composiciones de L. paracasei CBA L74 pueden incluir L. paracasei CBA L74 que se ha vuelto no replicante. Por ejemplo, los equipos pueden incluir cantidades medidas de una composición nutricional que incluye uno o más productos alimenticios fermentados con L. paracasei CBA L74. Las instrucciones para el uso se pueden transportar por cualquier medio adecuado. Por ejemplo, se pueden imprimir en un inserto de papel en uno o más lenguajes o suministrar audiblemente o visualmente (por ejemplo, en un disco compacto) . Los materiales de empaquetamiento pueden incluir materiales de empaquetamiento, por ejemplo, frasquitos, paquetes, recipientes. En algunas modalidades, los equipos pueden incluir cantidades medidas de una composición que comprende L. paracasei CBA L74 en un portador fisiológicamente aceptable junto con materiales de empaquetamiento e instrucciones para el uso en cualquiera de los formatos descritos en lo anterior. En algunas modalidades, los equipos pueden incluir recipientes que incluyen una o más composiciones de L. paracasei CBA L74, por ejemplo, L. paracasei CBA L74 y un portador farmacéutico, y uno o más de un estabilizador adecuado, molécula portadora, saborizante o los similares, como sea apropiado por el uso propuesto. Un producto puede incluir un recipiente (por ejemplo, un frasquito, frasco, botella, bolsa o los similares) que contiene una o más composiciones de L. paracasei CBA L74. Además, un articulo de manufactura además puede incluir, por ejemplo, los materiales de empaquetamiento, instrucciones para el uso, jeringas, soluciones amortiguadoras u otros reactivos de control para el tratamiento o inspección de la condición para la cual se requiere profilaxis o tratamiento.
El producto también puede incluir una leyenda (por ejemplo, una leyenda o inserto impreso u otro medio que describe el uso del producto (por ejemplo, un audio- o videocinta) ) . La leyenda se puede asociar con el recipiente (por ejemplo, fijada al recipiente) y puede describir la 'manera en la cual el compuesto en el mismo debe ser administrado (por ejemplo, la frecuencia y la ruta de administración) , indicaciones por el mismo y otros usos. Los componentes del equipo pueden ser adecuados para el uso inmediato. Los compuestos pueden estar listos para la administración (por ejemplo, presentes en unidades apropiadas de dosis) , pueden incluir un adyuvante, portador u otro diluyente farmacéuticamente aceptable y/o un agente terapéutico adicional. La invención abarca equipo, sin embargo, que incluyen formulaciones concentradas y materiales que pueden requerir dilución antes del uso. Al tentativamente, los compuestos se pueden proporcionar en una forma concentrada con un diluyente e instrucciones para dilución. Los componentes del equipo pueden ser adecuados para el uso inmediato. La invención a barca equipos, sin embargo, que incluyen formulaciones concentradas y/o materiales que pueden requerir dilución antes del uso.
Ej emplos Ejemplo 1: Aislamiento y caracterización de L. paracasei CBA L7 Los inventores analizaron diferentes cepas de Lactobacilli para su habilidad para fermentar suspensiones acuosas que contienen diferentes concentraciones de harina de arroz o harina de trigo. El L. paracasei CBA L74 se seleccionó para el análisis adicional en base a los bajos valores de pH y altos conteos de CFU. Esta cepa se depositó bajo el Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento Internacional del Repósito de Microrganismos para los Propósitos de Procedimiento de Patente el 9 de septiembre del 2008 en el Belgian Coordinated Collections of Micro-organisms (BCCM) Laboratorium voor Microbiologie (L G) , Ghent, Bélgica. El Número de Acceso dado por la Autoridad Depositaría Internacional es LMG P-24778.
Ejemplo 2: Preparación de Leche Fermentada con . paracasei CBA L7 Condiciones: • Sustrato: polvo de leche descremada reconstituido al 9%, dextrosa adicional al 0.25%.
• Tratamiento con calor de sustrato: UHT- 135°C durante 3s o F0 equivalente.
· Co-inóculo: 5 x 106 para Lactobacillus paracasei CBA L74, 5 x 104 para Streptococcus thermophilus (como iniciador en la fermentación) .
• Temperatura de Fermentación: 37 °C.
• Tiempo de Fermentación: 15 horas. · pH durante la fermentación; sin ajuste.
• Al final de la fermentación el ajuste de pH a 6.5 con solución de NaOH.
• Secado con roclo con la temperatura de entrada a 190 °C y temperatura de salida de 90°C.
· Análisis: Conteo de células en el material fermentado para determinar Streptococcus thermophilus y Lactobacillus paracasei CBA-L74.
Colocación en placa: Agar selectivo de Lactobacilli (LBS) se utilizó para la detección de Lactobacillus paracasei CBA-L74. Agar L-M17 se utilizó para los conteos de Streptococcus thermophilus . Ambos se incubaron a 37 °C anaeróbicamente . El agar de conteo de placas (PCA) se utilizó para la detección de contaminantes y se incubó a 30 °C aeróbicamente .
Fermentación: Se adicionaron el co-inóculo de L. paracasei CBA-L74 y S. thermophilus 1773 como cultivos frescos. La fermentación se llevó a cabo durante 15 horas, a una concentración de 108 cfu/mL de L. paracasei CBA-L74. El pH inicial fue 6.6. Al final de la fermentación el pH fue 5.1. El pH se ajustó a 6.5 al adicionar NaOH 2.5 N. La concentración inicial de Streptococcus thermophilus fue 5 x 106 CFU/ml; la concentración final fue más de 108 CFU/ml. La concentración inicial de Streptococcus thermophilus fue 5 x 104 CFU/ml; la concentración final fue 1 x 108 CFU/ml. El conteo bacteriano total inicial sobre PCA fue 0 en la leche antes de la inoculación y en T0 y muy pocas colonias se contaron (TFTC) después del periodo de fermentación de 15 horas. Fue 5 x 104 CFU/ml; la concentración final fue 1 x 108 CFU/ml.
Secado : El fermentado se secó a una temperatura de entrada de 190 °C y una temperatura de salida de 90 °C. El contenido de humedad del polvo después del secado por roció fue de 4.87%.
E emplo 3 : Preparación de Harina de Avena y de Cebada Fermentada con L. paracasel CBA L74 Los inventores prepararon una solución de un litro de 18.5% (p/vol) de harina de avena + 5 % (p/p) de harina de cebada malteada, utilizando 185 g de harina de avena y 9.25 g de harina de cebada malteada. La mezcla de harina y agua se ajustó a pH 4,00 con ácido cítrico 0.5 M. El termentador se esterilizó mediante la colocación en autoclave. Luego la mezcla de harina + agua + ácido cítrico se adicionó al termentador .
La mezcla se trató con calor a 80°C durante 30 minutos, luego se enfrió a 37 °C. Se probaron tres conjuntos diferentes de condiciones de fermentación. Todas las fermentaciones se terminaron después de 16 horas, un tiempo que coincidió con el fin del crecimiento de fase logarítmica.
EXPERIMENTO #1: El L. paracasei CBA-L74 se adicionó a la solución de cereal tratada con calor a una concentración final de 2.3 x 106 CFU/ml y se incubó con agitación a 37 °C. Después de 16 horas de placa de conteo en MRS fue de 7.6 x 108 UFC/ml (bacterias de ácido láctico) ; contaminantes medidos en PCA, MC y SB estuvieron abajo de 1000 UFC/ml. El pH final fue de 3.8. Después de 20 horas el conteo de placa en MRS fue 1.2 x 108 UFC/ml (bacterias de ácido láctico); estuvieron ausentes contaminantes. Después de 24 horas de conteo en placa en MRS fue 5 x 108 UFC/ml (bacterias de ácido láctico); estuvieron ausentes contaminantes. Debido a que la fase logarítmica se detuvo después de 16 horas, fue preferible terminar las fermentaciones en 16 horas.
EXPERIMENTO #2:(pH estabilizado). Esta fermentación se llevó a cabo al mantener el pH en 4 utilizando NaOH 2N. El L. paracasei CBA-L74 se adicionó a la solución de cereal tratada con calor a una concentración final 2.1 x 106 CFU/ml y se encubó con agitación a 37°C. Después de 16 horas del conteo en placa en MRS fue de 7.5 x 108 UFC/ml (bacterias de ácido láctico) ; los contaminantes medidos en PCA, MC y SB estuvieron abajo de 1000 UFC/ml.
EXPERIMENTO #3:(pH estabilizado). Esta fermentación se llevó a cabo al mantener el pH en 4 utilizando NaOH 2N. El L. paracasei se adicionó a la solución de cereal tratada con calor a una concentración final de 5.1 x 106 CFU/ml y se encubó con agitación a 37°C. Después de 16 horas del conteo en placa en MRS fue de 2.1 x 109 UFC/ml (bacterias de ácido láctico) ; los contaminantes medidos en PCA, MC y SB estuvieron abajo de 1000 UFC/ml.
EXPERIMENTO # : Preparación de harina de arroz y de trigo fermentada con L. paracasei CBA L74 Los inventores prepararon una solución de un litro de 15% peso/volumen de arroz al combinar 150 g de arroz y 900 mi de agua. La mezcla se preparó a temperatura ambiente y se mezcló al agitar durante varios minutos a 1000-1300 rpm. La mezcla de arroz se trató mediante tindalización mediante el calentamiento de la mezcla dentro del instrumento a 70 °C, subalimentación a 70°C por 20-30 minutos, enfriamiento a 30-37°C, subalimentación a 30-37°C por 20-30 minutos, calentamiento a 70°C, subalimentación a 70°C por 20-30 minutos, enfriamiento a la temperatura de fermentación (37°C) mientras que se agita a 150-600 rpm.
El L. paracasei CBA L74 se adicionó a partir de una muestra secada por congelación a una concentración final de 1 x 106 CFU/ml. La muestra secada por congelación se resuspendió en agua y se incubó brevemente a 37 °C para activar las bacterias. Después de la inoculación, la mezcla se homogenizó al agitar brevemente a 300-600 rpm; durante la fermentación la solución se agitó a 150 rpm. La fermentación se llevó a cabo a 37 °C durante 24 horas en un p02 de < 15%. Las alícuotas se recolectaron en el momento de inoculación (T0) , en 16 horas (T16) , 18 horas (T18), 21 horas (T21) y en 24 horas (T24). Después de la fermentación, el cereal se calentó a 50°C con mezclado continuo. El cereal calentado luego se secó por rocío a T airedentro 80°C, T airefuera 210°C. El contenido de humedad final fue 6%.
Las muestras se analizaron sobre agar Rogosa agar (+ vancomicina 12 microgr./ml) (48 h a 37°C), para la cuantificación del L. paracaseí CBA-174), sobre PCA para aerobios totales (24 h a 37°C), sobre agar McConkay para coliformes y agar RCM para Clostridia.
Los resultados de esta fermentación fueron como sigue : Inoculo ( L . paracasei CBA-174) : 1 xlO6 ( +/- ½ log) CFU/ml (sobre el instrumento).
La concentración de L. paracasei CBA L74 después de 24 horas de fermentación: 1 x 108 (+/- ½ log) CFU/ml.
Contaminantes sobre PCA antes del inoculo :< 104 CFU/ml.
Contaminantes sobre McConkay antes del inoculo :< 104 CFU/ml.
Contaminantes sobre RCM antes del inoculo :< 10 CFU/ml.
Contaminantes sobre PCA después del inoculo :< 104 CFU/ml.
Contaminantes sobre PCA después de 24 horas de fermentación : < 104 CFU/ml. pH antes de la adición del inoculo: 6 (+/- 0.20). pH en 16-18 horas: 3.70 (+/-0.20). pH en 24 horas: 3.60 (+/-0.20).
Ejemplo 5: Efectos del L. paracasei CBA L74 sobre células dendriticas en un sistema de co-cultivo de células Caco2 Los inventores analizaron el efecto del L. paracasei CBA L74 vivo y no replicante en un co-cultivo de células epiteliales intestinales (células Caco2) y células dendriticas humanas (DCs) . Las células Caco2 se sembraron en una membrana transwell y después de aproximadamente 3 semanas, cuando fue adecuada la resistencia trans-epitelial, se suplementaron con L. paracasei CBA L74 durante 96 horas. Las DCs humanas se diferenciaron de los monocitos de sangre periférica y se sembraron en el compartimiento basal de la cámara de co-cultivo. La resistencia trans-epitelial permaneció constante durante el experimento.
Para caracterizar el fenotipo de DCs, los inventores inspeccionaron la expresión de superficies de células DC de la moléculas co-estimuladoras (CD80 and CD86), MHC-II y moléculas de adhesión (CD40) mediante el análisis citofluorimétrico . Para determinar el perfil de citoquina producido por las DCs co-cultivadas con células epiteliales intestinales expuesta a L. paracasei CBA L74, los inventores recolectaron el medio de cultivo y cuantificaron IL-10 y IL-12p70 mediante ELISA. Para verificar la habilidad de las células Caco2 expuestas a L. paracasei CBA L74 para condicionar las DCs para promover la proliferación de células T los inventores realizaron el análisis FACS y mezclaron los cultivos de linfocitos.
Como se muestra en la Tabla en la Figura 1 la incubación de células Caco2 durante 24 horas con L. paracasei CBA L74 vivo o inactivado (inactivación térmica) modificó el fenotipo de las células dendriticas co-cultivadas . Además, la presencia de L. paracasei CBA L74 moduló los cambios mediados por LPS en el fenotipo DC .
Los inventores luego cuantificaron las citoquinas liberadas de la DC co-cultivada con células Caco2 acondicionadas con L. paracasei (vivo o inactivado) . Como se muestra en la Figura 2a, las DCs co-cultivadas con Caco2 expuestas a L. paracasei CBA L74 vivo o inactivado mostraron incremento estadísticamente significativo en la producción de IL-10. Los inventores no observaron un incremento significativo en la producción de IL-12 en la ausencia de LPS (Figura 2b) . Sin embargo, las DCs retuvieron la habilidad para responder a la estimulación de LPS mediante la producción de IL-12 aumentada, sugiriendo que la exposición a L. paracasei CBA L74 no afectó la habilidad global de las DCs para responder a los patógenos.
Los inventores luego condujeron un ensayo funcional para verificar la habilidad de la DC expuesta a las células CaCo2 cultivadas en la presencia del medio o el medio suplementado con L. paracasei CBA L74 para modular la habilidad de las células T para proliferar después de un reacción de linfocito mezclado. Como se muestra en la Figura 3, los inventores no observaron diferencias significativas en la habilidad de DCs co-cultivadas con células Caco2 para modificar la proliferación de las células T.
Tomados conjuntamente, los datos in vitro indican que L. paracasei CBA L74, vivo o inactivado con calor, puede influenciar el ambiente generado por la células epiteliales intestinales que a su vez modula la actividad de otras células inmunes tales como DC. La imagen total indica que las DCs expuestas al medio acondicionado con Caco2 reduce la expresión de los marcadores de activación, produce citoquinas anti-inflamatorias como IL-10 mientras que retiene la habilidad para responder a LPS al aumentar la producción de IL-12.
Ejemplo 6: Efectos del L. paracasei CBA L74 sobre la morfología, expresión de citoquina e inmunidad innata en la mucosa intestinal completa.
Los inventores examinaron los efectos in vivo al administrar L. paracasei CBA L74 (vivo e inactivado con calor) como un suplemento dietético en ratones. Después de dos semanas de suplementación, los animales se sacrificaron y se analizó la mucosa intestinal completa.
Morfología de la mucosa: Los inventores realizaron un manchado con hematoxilina y eosina de secciones ileales incrustadas en parafina. Ninguno de los suplementos tuvo efectos significativos sobre la arquitectura intestinal o causo un infiltrado de células inflamatorias.
Expresión de citoquina e IgA: Inventores luego determinaron si la administración de L. paracasei CBA L74 (vivo o inactivado) afecto el nivel de citoquinas anti-y pro-inflamatorias en la mucosa intestinal. Como se muestra en la Figura 4, la administración de L. paracasei CBA L74 vivo o inactivado significativamente disminuyó el nivel de IL-?ß, un mediador pro-inflamatorio potente, en la mucosa intestinal de los ratones. Como se muestra en la Figura 5, los inventores también observaron una reducción en el nivel de IL-4 de la mucosa basal después de la administración de L. paracasei CBA L74 vivo o inactivado. Finalmente, los inventores determinaron el efecto de la diferente suplementación de régimen sobre el nivel de IgA de la mucosa. Después de dos semanas de suplementación de dieta con L. paracasei CBA L74, los animales se sacrificaron y la mucosa intestinal se recolectó y se homogenizó. El IgA total luego se midió mediante ELISA y los valores se normalizaron a las proteínas de la mucosa totales. Como se muestra en la Figura 6, . paracasei CBA L74 es terminado con calor significativamente incrementó la IgA de la mucosa.
Inmunidad innata: Los inventores analizaron el efecto de la suplementación dietética sobre los niveles de los Receptores Similares a Toll 2, 4 y 9. Estos receptores están involucrados en el reconocimiento de estructuras bacterianas conservadas y de esta manera desempeñan una función clave en modular la reactividad de las células inmunes y no inmunes hacia las estructuras conservadas microbianas. Como se muestra en la Figura 7, la suplementación dietética con L. paracasei CBA L74, vivo o inactivado con calor, incrementó los niveles de la expresión de proteina de TLR2 y TLR4. Los inventores también ensayaron el efecto de la suplementación dietética sobre los niveles de PPARy en la mucosa. Como se muestra en Figura 8, L. paracasei CBA L74 vivo significativamente incrementó los niveles de PPARy.
Ejemplo 7: Efectos del . paracasei CBA L74 sobre los niveles de citoquina circulantes Para estimar si los suplementos de dieta fueron capaces de modificar el nivel de las citoquinas circulantes, los inventores midieron los efectos de la administración dietética de la cepa (viva o inactivada) sobre el nivel de citoquinas anti- y pro-inflamatorias en el suero. Como se muestra en las Figuras 9a y 9b, para L. paracasei CBA L74 vivo indujo una disminución estadísticamente significativa IL-?ß y un incremento moderado en el IL-4 circulante, respectivamente .
Ejemplo 8: Efectos del L. paracasei CBA L74 sobre la célula dendritica y la actividad de linfocito T Los inventores enseguida se enfocaron en el impacto en la suplementación dietética con L. paracasei CBA L74 sobre las células inmunes relevantes a la actividad del sistema inmune asociado con la mucosa, específicamente células dendríticas y linfocitos. Los inventores evaluaron el fenotipo de DCs con los Parches de Peyers (PP) , puesto que estas células son instrumentales en establecer el destino de un antígeno y contribuir al ambiente que determinará la naturaleza de la respuesta inmune adaptiva.
Como se muestra en la Tabla en la Figura 10, la suplementación con L. paracasei CBA L74 (vivo o inactivado) disminuyó la expresión de la molécula co-estimuladora CD80 y de la molécula de adhesión CD40 mientras que se reguló hacia arriba la expresión MHCII. Estos datos sugirieron que la DCs de animales suplementados con L. paracasei CBA L74 se observó menos fácil para interactuar con las células T y para montar una respuesta inmune pero se preservó su habilidad para procesar y presentar antígenos.
Los inventores luego determinaron la habilidad de la suplementación de dieta con L . paracasei C1BA L74 para modificar la reactividad de DCs a estímulos pro-inflamatorios (tal como LPS o CpG bacterianos) . La exposición del DCs de los ratones de control LPS o CpG indujo una fuerte regulación hacia arriba de CD80 en las DCs de control. La suplementación con L. paracasei CBA L74 inactivado con calor de DC no modificó la reactividad a los estímulos inflamatorios. La suplementacion con bacterias vivas significativamente redujo la regulación hacia arriba de CD80 inducida por LPS y CpG.
Finalmente, los inventores investigaron si la suplementacion dietética con L. paracasei CBA L74 (vivo o inactivado) afecto los linfocitos T intestinales (ya sea CD4+ y CD8+ ) con polarización hacia un fenotipo Thl o Th2. Para estos estudios, los Parches de Peyer se expusieron a PHA, un fuerte estimulo no especifico y luego la polarización de linfocitos se evaluó mediante el manchado con intraquina para IL-4 e IFN-?. Como se muestra en la Figura lia, en la ausencia de PHA (la "condición basal") en linfocitos CD4+, IL-4 y IFN estuvieron casi en equilibrio. Aproximadamente 10-12% de las células fueron positivas para estas citoquinas. Como se muestra en la Figura 11b, para linfocitos CD8+ en la condición basal, hubo una ligera predominancia de IL-4 sobre la células que expresan IFN. La exposición de ya sea los linfocitos CD4+ o CD8+ a PHA causó un fuerte incremento en el manchado intracelular para IL-4 y IFN-? con desviación hacia la producción de IFN-?.
En células CD4+, la suplementacion dietética con L. paracasei CBA L74 vivo incrementó los niveles de IFN-? en la condición basal. Después a la exposición a PHA no hubo diferencias significativas en la respuesta entré los grupos suplementados (Figura lia) . En los linfocitos CD8+, la suplementacion oral con L. paracasei CBA L74 inactivado favoreció un perfil de Th2 con una estimulación de producción de IL-4 sobre la producción de IFN-? (Figura 11b) . El perfil anti-inflamatorio es además soportado por la respuesta aguda a PHA. Una tendencia similar fue evidente también en los linfocitos CD8+ aislados de ratones suplementados con L. paracasei CBA-L74 vivo, aunque menos pronunciada.
Ejemplo 9: Efectos de la leche fermentada por L. paraca.se! CBA L74 sobre los marcadores del sistema inmune en la mucosa intestinal Los ratones se suplementaron dos veces al día durante dos semanas con ya sea: 1) Control (PBS); 2) Leche descremada (no fermentada); 3) Leche descremada fermentada con L. paracasei CBA L74 (lxlO8 cfu/ml) ; 4) Leche descremada fermentada con S. thermophilus (6.7xl06 cfu/ml); 5) Leche descremada fermentada con L. paracasei CBA L74 (lxlO8 cfu/ml) y S. thermophilus (1.18xl07 cfu/ml); 6) Leche descremada fermentada con L. paracasei CBA L74 (1.9xl09 cfu/die) y S. thermophilus (2.2xl08 cfu/ml). Al final del tratamiento los animales se sacrificaron y la mucosa intestinal y los Parches de Peyer se colectaron y se procesaron para el análisis como es descrito enseguida.
Niveles de citoquinas en la mucosa intestinal. Como se muestra en la Figura 12, la suplementación con leche descremada fermentada con L. paracasei CBA L74 ocasionó un incremento significativo de los niveles de IL-10 en la mucosa intestinal. La administración de leche descremada fermentada con S. thermophilus indujo una ligera reducción como es comparado con los controles. La administración de leche fermentada con ambas cepas en dosificación más alta indujo un incremento de 2.1 veces en el IL-10 de la mucosa. Ninguno de los tratamientos tuvo algún efecto significativo sobre la IL-?ß de la mucosa aunque la suplementación con leche descremada fermentada con L. paracasei CBA L74 ocasionó un ligero incremento de los niveles de la mucosa de esta citoquina.
Actividad de mieloperoxidasa en la mucosa intestinal . La actividad de mieloperoxidasa (MPO) se ensayó en homogenados de mucosa. La administración de leche no fermentada o fermentada con diferentes bacterias no indujo diferencias estadísticamente significativas en la actividad de mieloperoxidasa, aunque hubo un ligero incremento en la actividad MPO observada en la mucosa de animales que reciben leche no fermentada.
Niveles de IgA en la mucosa intestinal. Como se muestra en la Figura 14, la suplementación con leche descremada no fermentada causó un incremento significativo en la IgA de la mucosa intestinal. Este incremento no se observó en animales suplementados con leche descremada fermentada con ya sea L. paracasei CBA L74 o S. thermophilus solo. La administración leche descremada fermentada con ambas cepas en dosificación más alta indujo un incremento en la IgA de la mucosa .
Niveles de TLR2, TLR4 , TLR9 y PPARy en la mucosa intestinal . Los inventores enseguida determinaron por Wb los niveles de la mucosa de receptores clave del sistema inmune innato. Como se muestra en la Figura 15, ninguno de los tratamientos tuvo algún efecto significativo en la expresión del receptor de TLR . La leche no fermentada causó un incremento moderado en TLR2. La administración de leche descremada fermentada con ya sea L . paracasei CBA L74 o S. thermophilus solo o en combinación en la dosis inferior previno este efecto. Un incremento moderado, comparable con la leche sola, en TLR2 también fue evidente en ratones que reciben leche fermentada con ambas cepas en dosificación más alta. La administración de leche descremada sola tuvo efectos profundos en los niveles de TLR9, mientras que la administración de leche fermentada con ambas cepas reestableció los niveles de la mucosa comparables con los controles. Como se muestra en la Figura 15, la administración de leche no fermentada per se causó un fuerte incremento en PPARy de la mucosa. Un efecto similar fue evidente en los ratones suplementados con leche descremada fermentada con L. paracasei CBA L74 y la dosis inferior de leche fermentada con ambas cepas.
Niveles de pNF-kB y IKB en la mucosa intestinal.
Los inventores determinaron el estado de activación de NF- KB , un factor de transcripción clave involucrado en tanto la inflamación intestinal como la supervivencia de la célula epitelial. Como se muestra en Figura 1 6 , NF- KB activado (pNF-??) fue detectable en el control, la mucosa normal. Después de los diferentes tratamientos, los inventores observaron solamente un ligero incremento en los niveles de pNF-kB en la mucosa de ratones tratados con leche descremada fermentada con ya sea L. paracasei CBA L74 o S. thermophilus solo, mientras que en ratones que reciben leche descremada fermentada con ambas cepas, pNF-?? fue comparable a los controles. El incremento en pNF-?? estuvo paralelo a la desaparición de la subunidad inhibidora de NF-??, IKB, que no fue detectable en la mucosa de ratones suplementados con leche descremada fermentada con ya sea L. paracasei CBA L7 4 o S. thermophilus solo. Los ratones que reciben leche descremada fermentada con ambas cepas mostraron niveles de IkB comparables con los controles.
Ejemplo 10: Efecto de la leche fermentada por L. paracasei CBA L7 sobre el fenotipo de célula dendritica en la mucosa intestinal Fenotipo de células dendriticas extraídas de Parches de Peyer. Los inventores examinaron el efecto de la suplementación de dietas sobre el fenotipo de DCs intestinales. Los resultados de este análisis se muestran en la Figura 17. La administración de leche fermentada con L. paracasei solo asi como con L. paracasei y S. thermophilus en dosis más bajas y más altas produjo una disminución estadísticamente significativa en la expresión CD80 y CD86 como es comparado con los ratones de control (* significa p<0.05 contra control), mientras que los niveles de HLAII y CD40 globales permanecieron estables. Los datos en Figura 17 se expresan como media+S.E. de tres experimentos separados.
Respuestas de células dendríticas expuestas a LPS/CpG. Los inventores determinaron la habilidad de la suplementación de dieta para modificar la reactividad de DCs a estímulos pro-inflamatorios (tal como LPS y CpG bacteriano) . Como se muestra en Figura 18, la exposición de las DCs aisladas de animales de control a LPS y CpG causó un incremento significante en la expresión CD80 (* significa p<0.05 contra DCs no estimuladas de ratones de control). Un efecto similar se observó en las DCs purificadas de ratones que reciben leche no fermentada (° significa p<0.05 contra DCs no estimuladas de ratones tratados con leche no fermentada) . La administración de leche descremada fermentada con L. paracasei solo completamente previno los efectos mediados por LPS en ratones tratados con leche no fermentada, aunque fue menos efectivo en la regulación hacia arriba de CD80 inducida por CpG. La leche descremada fermentada con S. thermophilus solo previno los efectos de LPS y CpG y redujo la expresión CD80. Finalmente, la administración de leche descremada fermentada con ambas cepas previno la regulación hacia arriba de CD80 inducida por LPS- y CpG- y mantuvo la expresión CD80 en niveles básales. Los datos en la Figura 18, se expresan como media±S.E. de tres experimentos separados. Ejemplo 11: Efecto de la leche fermentada por L. pa.raca.sel CBA L74 sobre el fenotipo del linfocito T en la mucosa intestinal La respuesta de los linfocitos intestinales CD4+ y CD8+ expusieron a PHA. Los inventores cuestionaron si la suplementación dietética con leche (ya sea fermentada o no fermentada) afectaría la polarización de los linfocitos T intestinales (CD4+ y CD8+ ) hacia un fenotipo Thl o Th2. Los Parches de Peyer derivados de linfocitos se expusieron a PHA, y luego se evaluó la polarización de linfocito al manchar para IL-4 e IFN-?.
Como se muestra en la Figura 19, la expresión a PHA significativamente incrementó la producción de IL4 y IFNy en los linfocitos CD4+ de los ratones de control (* significa p<0.05 contra linfocitos no estimulados de los ratones de control) . Esta inducción no se observó en ratones tratados con ya sea leche no fermentada o fermentada. Después de la suplementación con leche no fermentada, los linfocitos CD4+ mostraron niveles básales incrementados de IL4 y IFN-? como es comparado con los animales de control (° significa p<0.05 contra linfocitos no estimulados de los ratones de control) . Estos datos sugieren que la suplementación con leche fermentada previno la activación no especifica y mantuvo la producción de IL4 y IFN-? en niveles básales.
Como se muestra en la Figura 20, la exposición a PHA en linfocitos intestinales CD8+ de los ratones de control incrementó la producción de IL4 e IFNy (* significa p<0.05 contra linfocitos no estimulados de los ratones de control) . Esta inducción no se observó en ratones tratados con leche ya sea leche no fermentada o fermentada. La administración de leche fermentada con L. paracasei y S. thermophilus en dosis más alta disminuirá la producción basal de IL4 mientras que después de la estimulación con PHA, se redujeron los niveles de tanto IL4 como IFNy como es comparado con los linfocitos estimulados de los ratones de control (§ significa p<0.05) .
Ejemplo 12: Efecto de la leche fermentada por L. paracasei CBA L74 sobre la histología de la mucosa intestinal Para determinar la distribución de células proliferantes en la mucosa intestinal, los inventores realizaron un análisis inmunohistoquimico de expresión de Ki67, un antigeno expresado por las células divisorias. En los ratones de control hubo una inmunoreactividad clara en los criptos intestinales, mientras que no hubo manchado en las vellosidades. En el tejido de los ratones que reciben leche no fermentada hubo una expresión más fuerte en los criptos, aunque no hubo expresión ectópica del antigeno. En las torres que reciben la diferente clase de leche fermentada los inventores observaron patrones de machado comparables. Los inventores han realizado una evaluación histológica de la mucosa ileal de los diferentes grupos experimentales. Los resultados de este estudio se muestran en la Figura 21. La administración de leche no fermentada redujo el número y la longitud de las vellosidades intestinales, mientras que la morfología intestinal se preservó en los animales que reciben las diversas formas de leche fermentada.
Ejemplo 13: Efecto del arroz fermentado por L. paracasei CBA L74 sobre los marcadores del sistema inmune en la mucosa intestinal Estos experimentos se diseñaron para evaluar las propiedades inmunomoduladoras de los cereales fermentados con L. paracasei CBA-L74. Los estudios incluyeron la administración intragástrica diaria durante dos semanas de 1) Arroz no fermentado; 2) Arroz fermentado (con L. paracasei CBA L74) 100 mg día (correspondiente a 2 xlO8 cfu/L de L. paracasei CBA-L74) y 3) Arroz fermentado (con L. paracasei CBA L74) 500 mg día (correspondiente a 109 cfu/L de i. paracasei CBA-L74). Los ratones durante el periodo de tratamiento no mostraron algún signo de afección o diarrea. Al final del tratamiento los ratones se mataron y los Parches de Peyer (PP) se colectaron asépticamente. Las células epiteliales se removieron del PP mediante incubación HBSS sin Ca2+ EDTA y luego los tejidos se sometieron a la digestión enzimática. La única cada suspensión de células se lavó, se resuspendió en RMPI frío y se utilizó para las siguientes pruebas.
Los inventores inicialmente examinaron el efecto de diferentes suplementos de dieta sobre la mucosa intestinal completa. Primero, los inventores realizaron el manchado con hematoxilina y eosina de secciones ileales incrustadas en parafina. Ninguno de los suplementos de dieta utilizados tuvo efectos significativos sobre la arquitectura intestinal o causo un infiltrado de células inflamatorias.
Los inventores luego determinaron si la administración del arroz fermentado con L. paracasei CBA L74 afectó el nivel de citoquina anti- y pro-inflamatorias en la mucosa intestinal. Coma se muestra en la Figura 22, la administración de arroz o arroz fermentado incrementó tanto IL-?ß como IL-4 de la mucosa. La suplementación con arroz fermentado en la dosis más alta causó una reducción en IL-10 como se muestra en la Figura 23.
Los inventores luego determinaron el efecto de la suplementación de régimen diferente sobre el nivel de IgA de la mucosa. Después de dos semanas de suplementación de dieta los animales se sacrificaron y la mucosa intestinal se recolectó y se homogenizó. La IgA total se midió mediante ELISA y los valores se normalizaron a las proteínas de la mucosa totales. Ninguno de los suplementos tuvo efectos significativos sobre el IgA de la mucosa.
Los inventores analizaron los efectos del arroz o el arroz fermentado con L. paracasei CBA L74 sobre la inmunidad innata de la mucosa intestinal. Como se muestra en la Figura 24, la suplementacion de dieta con arroz y arroz fermentado (baja dosis) tuvo únicamente efectos moderados sobre TLRs de la mucosa. Como se muestra en la Figura 25a, la suplementacion de dieta con arroz no fermentado notablemente incrementó los niveles de PPARy de la mucosa. Altas dosis de arroz fermentado también incrementaron los niveles de PPARy de la mucosa. Como se muestra en la Figura 25b, dos semanas de suplementacion de dieta con arroz no fermentado redujo la activación de NF-?? e incrementó IKB en la mucosa. La suplementacion con arroz fermentado en bajas dosis no tuvo efecto comparado con el control, mientras que la dosis más alta tuvo efectos comparables a aquellos observados con el arroz no fermentado.
Los inventores también midieron los efectos de la administración dietética sobre el nivel de citoquinas anti- y pro-inflamatorias en el suero. La suplementacion dietética con ya sea arroz o arroz fermentado (baja dosis) no tuvo influencia en los niveles de IL-?ß y IL-4 en el suero.
Ejemplo 14: Efecto del arroz fermentado por L. paracasei CBA L74 sobre el fenotipo de célula dendritica en la mucosa intestinal Los reinventores enseguida se enfocaron en el impacto de la suplementación dietética con arroz no fermentado o arroz fermentado con L. paracasei CBA L74 sobre células inmunes relevante a la actividad del sistema inmune asociado con la mucosa, específicamente células dendríticas y linfocitos. Primero los inventores marcaron la suspensión de células individuales con anti-CDl (para identificar DC) y con ya sea anti CD-80 y CD-86, MHC-II y CD-40 para determinar el nivel de actividad y madurez de la DC intestinal en estos órganos linfoides. Como se muestra en la tabla en la Figura 26, los inventores observaron un efecto significativo del arroz fermentado en una alta dosis sobre el fenotipo de DCs . La suplementación de arroz no fermentado (en estos experimentos los inventores utilizaron dos diferentes dosis) no tuvo efecto, mientras que los efectos del arroz fermentado son el nivel de CD80, CD40 y MHC-II fueron evidentes en 100 mg/día y más pronunciado en 500 mg/día.
Los inventores enseguida determinaron la habilidad de la suplementación de dieta con arroz o arroz fermentado con L. paracasei CBA L74 para modificar la reactividad DCs a los estímulos pro-inflamatorios (tal como LPS y CpG bacteriano) . Como se muestra en la tabla en la Figura 27, la exposición de DCs de los ratones de control a LPS o CpG indujo una regulación hacia arriba de CD80 en la DCs de control. La suplementación con arroz no fermentado no modificó la reactividad a los estímulos inflamatorios. La suplementación con la dosis probada de arroz fermentado redujo la regulación hacia arriba de CD80 inducida por LPS y CpG.
Ejemplo 15: Efecto del arroz fermentado por L. paracasei CBA L74 sobre el fenotipo de linfocito T en la mucosa intestinal Los inventores investigaron si la suplementación dietética con arroz o arroz fermentado con L. paracasei CBA L74 sobre fue capaz de influenciar la polarización del linfocito T intestinal (ya sea CD4+ y CD8+) hacia un fenotipo Thl o Th2. Los Parches de Peyer derivados de linfocitos se expusieron a PHA y luego se evaluó la polarización de linfocito mediante el manchado con intraquina para IL-4 y IFN-?.
Los resultados de este experimento para los linfocitos CD4+ y CD8+ se muestran en las Figuras 28 y 29, respectivamente. Como se muestra en la Figura 28, en la condición basal, en linfocitos CD4+ IL-4 y IFNy estuvieron casi en equilibrio desde aproximadamente 10-12% de las células son positivas para estas citoquinas. Como se muestra en la Figura 29, el CD8+ , en la condición basal hubo una ligera predominancia de IL-4 sobre las células que expresan IFNy. La exposición de los linfocitos ya sea CD4+ o CD8+ a PHA causó un fuerte incremento en el manchado intracelular para IL-4 e IFNy, con una predominancia de producción de IFNy.
En ratones que reciben arroz no fermentado, los inventores observaron una preponderancia de producción de IL-4 (fenotipo Th2) ya sea en la condición basal y después de la estimulación de PHA para los linfocitos tanto CD4+ y CD8+. Sin embargo, la producción de IL-4 se asoció a una persistencia de producción IFNy en la condición basal y, después de la estimulación de PHA los inventores observaron una expresión incrementada de esta citoquina aunque la respuesta fue aguda como se compara a la respuesta en las células de control. En ratones que reciben el arroz fermentado en la condición basal, los inventores observaron una preponderancia de células positivas de IFNy sobre IL-4, aunque en la condición basal el porcentaje fue comparable (para CD4+) o ligeramente inferior (para CD8+) como es comparado con los controles. Después de la estimulación de PHA, en ambas poblaciones celulares la respuesta de citoquina se agudizó como es comparado con los ratones de control, aunque dirigido a un fenotipo Thl (preponderancia de células positivas de IFNy) .
Ejemplo 16: Efecto de L. paracasei CBA L74 sobre la producción de IL-10 en células dendriticas derivadas de monoc tos (MoDCs) en la presencia de Salmonella typhimurium Los inventores probaron la habilidad de tanto las células L. paracasei CBA L74 como los sobrenadantes de células L. paracasei CBA L74 para inducir la producción de la citoquina anti-inflamatoria, IL-10, en MoDCs humanas en la presencia del patógeno bacteriano, Salmonella typhimurium. Las MoDCs humanas se obtuvieron de por lo menos cuatro, en algunos casos, siete donadores. Como se muestra en la Figura 30, Salmonella typhimurium ("FB62") , la cepa de Lactobacíllus de control, L. paracasei 21060 ("B21060") y las células de L . paracasei CBA L74 ("CBAL74") todas indujeron la producción de IL-10. En contraste, aunque el sobrenadante de Salmonella typhimurium ("sn fb62") indujo la producción de IL-10, los sobrenadantes de ambos Lactobacilli , cepa de Lactobacíllus, L. paracasei 21060 ("sn b21060") y L . paracasei CBA L74 ("sn cbal74") no lo hicieron. La co-incubación del sobrenadante de L. paracasei CBA L74 con Salmonella typhimurium ("sn cbal74 + FB62") indujo IL-10 a niveles sobre y arriba de aquel observado con Salmonella typhimurium solo ("sn fb62 + FB62") . De manera interesante, se observe un efecto similar aun si las MoDCs se preacondicionaron con el sobrenadante de L. paracasei CBA L74 por únicamente una hora y luego se lavaron para remover el sobrenadante ("lh sn cbal74 + FB62") .
Ejemplo 17: Efecto de L. paracasei CBA L74 sobre la producción de IL-12p70 en células dendrí icas derivadas de monoci os (MoDCs) en la presencia de Salmonella typhimuriuin Los inventores probaron la habilidad de tanto las células de L. paracasei CBA L74 como los sobrenadantes de células de L. paracasei CBA L74 para inducir la producción de la citoquina pro-inflamatoria, IL-12p70, en MoDCs humanas en la presencia del patógeno bacteriano, Salmonella typhimurium. Las MoDCs humanas se obtuvieron de por lo menos cuatro, en algunos casos, siete donadores. Los resultados de estos experimentos se muestran en la Figura 31. En contraste a los resultados obtenidos en el Ejemplo 16 para la citoquina anti-inflamatoria, los inventores encontraron que Salmonella typhimurium ("FB62") indujo altos niveles de IL-12p70 mientras que la cepa de Lactobacillus de control, L. paracasei 21060 (B21060") y las células de L. paracasei CBA L74 ("CBAL74") indujeron únicamente bajos niveles de IL-12p70. Aquí nuevamente, el sobrenadante de Salmonella typhimurium ("sn fb62") indujo la producción de IL-12p70, pero los sobrenadantes de ambas cepas de Lactobacillus , L. paracasei 21060 ("sn b21060") y L. paracasei CBA L74 ("sn cbal74") no lo hicieron. La co-incubación del sobrenadante de L. paracasei CBA L74 con Salmonella typhimurium ("sn cbal74 + FB62") causó una reducción acentuada en la producción de IL-12p70. El efecto se observó aun si la MoDCs preacondicionaron con el sobrenadante de L. paracasei CBA L74 durante únicamente una hora y luego se lavaron para remover el sobrenadante ("lh sn cbal74 + FB62") . Esta reducción excedió aquella observada para el Lactobacillus de control, L. paracasei 21060 ("lh sn b21060 + FB62") . Estos datos sugieren que tanto L. paracasei CBA L74 como el sobrenadante de cultivo de L. paracasei CBA L74 tienen propiedades antiinflamatorias que pueden mitigar la inflamación inducida por el patógeno bacteriano, Salmonella typhimurium.
Ejemplo 18: Efecto de la leche fermentada con L. paracasei CBA L74 sobre la producción de IL-10 en células dendri icas derivadas de monocitos (MoDCs) en la presencia de Salmonella. typhimurium Los inventores probaron la habilidad de la leche fermentada con L . paracasei CBA L74 para inducir la producción de la citoquina anti-inflamatoria, IL-10, en MoDCs humanas en la presencia del patógeno bacteriano, Salmonella typhimurium. Los resultados de estos experimentos se muestran en la Figura 32. Aunque las MoDCs inactivadas usualmente no producen IL-10, los inventores encontraron que la incubación de MoDCs con leche fermentada con L. paracasei CBA L74 indujo la producción de IL-10 dependiente de dosis (ver "matrice CBAL7 1.4 lgr/ 1 OOml " y "matrice CBAL74 0.14gr/100ml" ) . La capacidad se retuvo aun en la presencia de Salmonella typhimurium (ver "matrice CBAL74 1.41gr/100ml + FB62" y "matrice CBAL74 0.14gr/100ml + FB62") .
La Figura 32 tambié muestra que L. paracasei CBA L74 que se ha activado por calor ("6.3*106 CFU CBA74 hervidos"), tratamiento con paraformaldehido ("6.3*106 CFU CBA74 PFA") o congelación-descongelación ("6.3*106 CFU CBA74 F&ampT") retuvo la habilidad para inducir IL-10.
Como los inventores observaron para el medio de cultivo de L. paracasei CBA L74, la leche fermentada con L . paracasei CBA L74 son una reducción dependiente de dosis, significativa en la producción de IL-12p70 inducida por Salmonella typhimurium (Figura 33) . La leche fermentada con S. thermophiles causó un incremento en la producción de IL-12p70 en la presencia de Salmonella typhimurium. Sin embargo, la leche fermentada por L. paracasei CBA L74 no estimulo la producción IL-I2p70, consistente con las propiedades antiinflamatorias de L. paracasei CBA L74. Estos datos sugieren que L. paracasei CBA L74 retuvo sus propiedades antiinflamatorias aun en la presencia de especies más pro-inflamatorias .
Ejemplo 19: Efecto de los sobrenadantes de células de L. paracasei CBA L74 sobre la producción de IL-10 e IL12p70 en células dendriticas derivadas de monocitos (MoDCs) en la presencia de £7nteroJactex sakazaki Los inventores probaron la habilidad de los sobrenadantes de células L. paracasei CBA L74 para inducir la producción anti-inflamatoria, IL-10 y la citoquina pro-inflamatoria, IL-12p70 en MoDCs humanas en la presencia del patógeno bacteriano, Enterobacter sakazaki. Los inventores probaron dos cepas de E. sakazaki, N9 y N13. E. sakazaki indujo la producción de tanto IL-10 como IL-12p70 en MoDCs humanas. La adición de sobrenadantes de células de L. paracasei CBA L74 dio por resultado un incremento de IL-10 y una disminución significativa en IL-12p70.
Ejemplo 20: Efecto del arroz fermentado con L. paracasei CBA L74 sobre la producción de citoquina en un modelo de explanta de tejido en la presencia de Salmonella typhimurivan Epitelio intestinal de ratón se utilizó para ajustar el sistema de co-cultivo tridimensional como es descrito en Abud (Exp. Cell Res. 303: 252-262 (2005)). Las explantas de tejido se cultivaron durante 24 horas en la presencia de O2 al 100% con una presión de una atmósfera. La cámara inferior contuvo 1 mi de hEC DME mas ITS-X y EGF. La cámara superior contuvo 200 mi del medio más ya sea S. typhimurium, arroz fermentado con L. paracasei CBA L74, o una combinación de 5. typhimurium y arroz fermentado con L. paracasei CBA L74. Los sobrenadantes se recolectaron y los niveles de IL-?ß, TNF-a, y IL-10 se ensayaron mediante ELISA. Como se muestra en la Figura 33, la adición de arroz fermentado significativamente redujo la producción de la citoquinas pro-inflamatorias, IL-?ß y TNF-a en la presencia de S. typhimurium, con únicamente un efecto moderado sobre los niveles de la citoquina antiinflamatoria, IL-10.
Se va a entender que la presente invención por ningún medio es limitada únicamente a las construcciones particulares descritas en la presente y mostradas en los dibujos, sino que también comprende cualquiera de las modificaciones o equivalentes dentro del alcance de las reivindicaciones.

Claims (68)

REIVINDICACIONES
1. Una composición, caracterizada porque comprende un producto alimenticio fermentado, en donde el producto alimenticio se ha fermentado por la bacteria probiótica, Lactobacillus paracasei CBA L74, Acceso Depositario Internacional Número L G P-24778.
2. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el producto alimenticio es un producto lácteo o un producto de cereal.
3. La composición de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque el producto lácteo es leche, yogurt, requesón, queso o una fórmula infantil.
4. La composición de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque el producto de cereal es arroz, trigo, avenas, cebada, maíz, centeno, sorgo, mijo o triticale .
5. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, caracterizada porque el producto alimenticio es secado.
6. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-5, caracterizada porque el producto alimenticio seco es rehidratado.
7. La composición de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada porque el producto alimenticio rehidratado, seco es inmunomodulador .
8. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-7, caracterizada porque la bacteria probiótica es no replicante.
9. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-8, caracterizada porque el producto alimenticio comprende de aproximadamente lxlO2 cfu/g a aproximadamente 1012 cfu/g de bacterias probióticas por gramo de peso seco.
10. Una composición, caracterizada porque comprende la bacteria probiótica, Lactobacillus paracasei CBA L74, Acceso Depositario Internacional Número L G P-24778 y un portador fisiológicamente aceptable.
11. La composición de conformidad con la reivindicación 10, caracterizada porque el portador fisiológicamente aceptable es un producto alimenticio.
12. La composición de conformidad con la reivindicación 11, caracterizada porque el producto alimenticio es un producto lácteo o un producto de cereal.
13. La composición de conformidad con la reivindicación 12, caracterizada porque el producto lácteo es leche, yogurt, requesón, queso o una fórmula infantil.
14. La composición de conformidad con la reivindicación 12, caracterizada porque el producto de cereal es arroz, trigo, avenas, cebada, maiz, centeno, sorgo, mijo o triticale.
15. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-14, caracterizada porque el producto alimenticio es secado.
16. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-15, caracterizada porque el producto alimenticio seco es rehidratado.
17. La composición de conformidad con la reivindicación 16, caracterizada porque el producto alimenticio rehidratado, seco es inmunomodulador .
18. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-17, caracterizada porque la bacteria probiótica es no replicante.
19. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-18, caracterizada porque el producto alimenticio comprende de aproximadamente lxlO2 cfu/g a aproximadamente 1012 cfu/g de bacterias probióticas por gramo de peso seco.
20. La composición de conformidad con la reivindicación 10, caracterizada porque el portador fisiológicamente aceptable es un portador farmacéuticamente aceptable .
21. La composición de conformidad con la reivindicación 20, caracterizada porque el portador farmacéuticamente aceptable comprende un coloide a base de lipido o a base de polímero.
22. La composición de conformidad con la reivindicación 21, caracterizada porque el coloide es un liposoma, un hidrogel, una microparticula, una nanoparticula o una micela de copolimero de bloque.
23. La composición de conformidad con la reivindicación 21, caracterizada porque el coloide a base de polímero es una cápsula.
24. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 20-23, caracterizada porque la bacteria probiótica es no replicante.
25. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 20-24, caracterizada porque la bacteria probiótica está en una forma de dosificación unitaria de aproximadamente lxlO2 cfu/g a aproximadamente 1 xlO12 cfu/g de peso seco.
26. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 20-25, caracterizada porque la composición se formula para administración oral.
27. Un método para hacer una composición nutricional, el método caracterizado porque comprende: a) proporcionar un producto alimenticio; b) combinar el producto alimenticio con una cantidad efectiva de la bacteria probiótica, Lactobacillus paracasei CBA L74, Acceso Depositario Internacional Número LMG P-24778, y, opcionalmente, un co-inóculo, para formar una mezcla; c) incubar la mezcla a una temperatura y durante un tiempo suficiente para que ocurra la fermentación.
28. El método de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado porque el producto alimenticio es un producto lácteo o un producto de cereal.
29. El método de conformidad con la reivindicación 27 o 28, caracterizado porque la cantidad de la bacteria probiótica es de aproximadamente 1 xlO6 cfu/ml a aproximadamente 5 xlO6 cfu/ml.
30. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 27-29, caracterizado porque el co-inóculo es Streptococcus thermophilus .
31. El método de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado porque la cantidad del co-inóculo es de aproximadamente 1 xlO4 cfu/ml a aproximadamente 1 xlO5 cfu/ml.
32. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 27-31, caracterizado porque la etapa de incubación continua hasta que el nivel de bacterias probióticas en la mezcla alcanza aproximadamente 1 xlO8 cfu/ml a aproximadamente 1 xlO10 cfu/ml.
33. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 27-32, caracterizado porque además comprende secar la composición nutricional.
34. El método de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado porque la etapa de secado es el secado por rocío .
35. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 27-34, caracterizado porque la composición nutricional además se combina con uno o más productos alimenticios adicionales.
36. El método de conformidad con la reivindicación 35, caracterizado porque el producto alimenticio adicional comprende un producto lácteo, un producto de cereal, un producto a base de vegetal, un producto a base de fruta o un producto a base de proteína.
37. El método de conformidad con la reivindicación 36, caracterizado porque el producto a base de fruta comprende un producto de tomate.
38. Un método para modular el sistema inmune en un sujeto, el método caracterizado porque comprende: a) identificar a un sujeto en necesidad de la modulación del sistema inmune; b) administrar una cantidad efectiva de una composición que comprende un producto alimenticio en donde el producto alimenticio se ha fermentado por la bacteria probiótica, Lactobacillus paracasei CBA L74, Acceso Depositario Internacional Número LMG P-24778.
39. El método de conformidad con la reivindicación 38, caracterizado porque el producto alimenticio comprende el producto alimenticio de cualquiera de las reivindicaciones 1-19.
40. El método de conformidad con la reivindicación 38 o 39, caracterizado porque el sujeto es un infante humano.
41. Un método para tratar a un sujeto en riesgo por desarrollar un. trastorno gastrointestinal, el método caracterizado porque comprende: a) identificar a un sujeto en riesgo por un trastorno gastrointestinal; b) administrar una cantidad efectiva de una composición que comprende un producto alimenticio en donde el producto alimenticio se ha fermentado por la bacteria probiótica Lactobacillus paracasei CB L74, Acceso Depositario Internacional Número LMG P-24778.
42. El método de conformidad con la reivindicación 41, caracterizado porque el producto alimenticio comprende el producto alimenticio de cualquiera de las reivindicaciones 1-19.
43. El método de conformidad con la reivindicación 41, caracterizado porque el trastorno gastrointestinal es un déficit del sistema inmune de la mucosa, una alergia a alimentos, un trastorno asociado con diarrea, una infección bacteriana o viral, síndrome de intestino irritable, enfermedad de intestino inflamatorio, enfermedad de Crohn, enfermedad celiaca o enterocolitis necrotizante .
44. El método de conformidad con la reivindicación 43, caracterizado porque el déficit del sistema inmune de la mucosa es un sistema inmune inmaduro.
45. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 41-44, caracterizado porque el sujeto es un infante humano.
46. Un método para tratar a un sujeto que tiene un trastorno gastrointestinal, el método caracterizado porque comprende : a) identificar a un sujeto que tiene un trastorno gastrointestinal ; b) administrar una cantidad efectiva de una composición que comprende un producto alimenticio, en donde el producto alimenticio se ha fermentado por la bacteria probiótica, Lactobacillus paracasei CBA L74, Acceso Depositario Internacional Número LMG P-24778.
47. El método de conformidad con la reivindicación 46, caracterizado porque el producto alimenticio comprende el producto alimenticio de cualquiera de las reivindicaciones 1-19.
48. El método de conformidad con la reivindicación 46, caracterizado porque el trastorno gastrointestinal es un déficit del sistema inmune de la mucosa, una alergia a alimentos, un trastorno asociado con diarrea, una infección bacteriana o viral, síndrome de intestino irritable, enfermedad de intestino inflamatorio, enfermedad de Crohn, enfermedad celiaca o enterocolitis necrotizante .
49. El método de conformidad con la reivindicación 48, caracterizado porque el déficit del sistema inmune de la mucosa es un sistema inmune inmaduro.
50. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 46-49, caracterizado porque el sujeto es un infante humano.
51. Un método para tratar a un sujeto que tiene un trastorno gastrointestinal, el método caracterizado porque comprende : a) identificar a un sujeto que tiene un trastorno gastrointestinal ; b) administrar una cantidad efectiva de una composición farmacéutica que comprende la bacteria probiótica, Lactobacillus paracasei CBA L74, Acceso Depositario Internacional Número LMG P-24778.
52. El método de conformidad con la reivindicación 51, caracterizado porque la composición farmacéutica comprende la composición de cualquiera de las reivindicaciones 20-26.
53. El método de conformidad con la reivindicación 51, caracterizado porque el trastorno gastrointestinal es un déficit del sistema inmune de la mucosa, una alergia a alimentos, un trastorno asociado con diarrea, una infección bacteriana o viral, síndrome de intestino irritable, enfermedad de intestino inflamatorio, enfermedad de Crohn, enfermedad celiaca o enterocolitis necrotizante .
54. El método de conformidad con la reivindicación 53, caracterizado porque el déficit del sistema inmune de la mucosa es un sistema inmune inmaduro.
55. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 51-54, caracterizado porque el sujeto es un infante humano.
56. Uso de la bacteria probiótica, Lactobacillus paracasei CBA L74, Acceso Depositario Internacional Número LMG P-24778, caracterizado porque es para la preparación de un producto alimenticio para el tratamiento de un trastorno gastrointestinal .
57. El uso de conformidad con la reivindicación 56, caracterizado porque el producto alimenticio comprende el producto alimenticio de cualquiera de las reivindicaciones 1-19.
58. El método de conformidad con las reivindicaciones 56 o 57, caracterizado porque el trastorno gastrointestinal es un déficit del sistema inmune de la mucosa, una alergia a alimentos, un trastorno asociado con diarrea, una infección bacteriana o viral, síndrome de intestino irritable, enfermedad de intestino inflamatorio, enfermedad de Crohn, enfermedad celiaca o enterocolitis necrotizante .
59. El uso de conformidad con la reivindicación 58, caracterizado porque el déficit del sistema inmune de la mucosa es un sistema inmune inmaduro.
60. El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 56-59, caracterizado porque el sujeto es un infante humano.
61. Uso de la bacteria probiótica, Lactobacillus paracasei CBA L74, Acceso Depositario Internacional Número LMG P-24778, caracterizado porque es para la preparación de un medicamento para el tratamiento de un trastorno gastrointestinal .
62. El uso de conformidad con la reivindicación 61, caracterizado porque la composición farmacéutica comprende la composición de cualquiera de las reivindicaciones 20-26.
63. El uso de conformidad con la reivindicación 61, caracterizado porque el trastorno gastrointestinal es un déficit del sistema inmune de la mucosa, una alergia a alimentos, un trastorno asociado con diarrea, una infección bacteriana o viral, síndrome de intestino irritable, enfermedad de intestino inflamatorio, enfermedad de Crohn, enfermedad celiaca o enterocolitis necrotizante.
64. El uso de conformidad con la reivindicación 63, caracterizado porque el déficit del sistema inmune de la mucosa es un sistema inmune inmaduro.
65. El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 61-64, caracterizado porque el sujeto es un infante humano.
66. La composición nutricional, caracterizada porque se hace por el método de cualquiera de las reivindicaciones 27-37.
67. Un equipo, caracterizado porque comprende una cantidad medida de una composición nutricional que comprende un producto alimenticio fermentado, en donde el producto alimenticio se ha fermentado por la bacteria probiótica, Lactobacillus paracasei CBA L74, Acceso Depositario Internacional Número LMG P-24778, y uno o más artículos seleccionados del grupo que consiste de material de empaquetamiento, un inserto de paquete que comprende instrucciones para uso, un fluido estéril, una jeringa y un recipiente estéril.
68. Un equipo, caracterizado porque comprende una cantidad medida de una composición farmacéutica que comprende Lactobacillus paracasei CBA L74, Acceso Depositario Internacional Número LMG P-24778, y uno o más artículos seleccionados del grupo que consiste de material de empaquetamiento, un inserto de paquete que comprende instrucciones para uso, un fluido estéril, una jeringa y un recipiente estéril.
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