MX2013001182A - Acido nucleico que comprende o codifica para una secuencia de tallo-asa de histona y poli (a) o una señal de poliadenilacion para incrementar la expresion de una proteina codificada. - Google Patents

Acido nucleico que comprende o codifica para una secuencia de tallo-asa de histona y poli (a) o una señal de poliadenilacion para incrementar la expresion de una proteina codificada.

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Abstract

La presente solicitud describe una secuencia de ácido nucleico de codificación, particularmente un ARN mensajero (ARNm), que comprende o codifica para un tallo-asa de histona y una secuencia poli(A) o una señal de poliadenilación y el uso de las mismas para incrementar la expresión de una proteína codificada. También describe su uso en la preparación de una composición farmacéutica, especialmente una vacuna, por ejemplo, para su uso en el tratamiento de tumores y enfermedades cancerosas, enfermedades cardiovasculares, enfermedades infecciosas, enfermedades autoinmunes o enfermedades genéticas, o en terapia génica. La presente invención describe además un método de transcripción in vitro, métodos in vitro para incrementar la expresión de una proteína usando el ácido nucleico que comprende o codifica para un tallo-asa de histona y una secuencia poli(A) o una señal de poliadenilación y un método ex vivo e in vivo.

Description

ACIDO NUCLEICO QUE COMPRENDE O CODIFICA PARA UNA SECUENCIA DE TALLO-ASA DE HISTONA Y POLKA) O UNA SEÑAL DE POLI ADENIL ACION PARA INCREMENTAR LA EXPRESION DE UNA PROTEINA CODIFICADA DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente solicitud describe una secuencia de ácido nucleico de codificación, particularmente un ARN mensaj ero (ARNm), que comprende o codifica para una secuencia de tallo-asa de histona y poli(A) o una señal de poliadenilación y al uso de la misma para incrementar la expresión de una proteína codificada. También describe su uso en la composición de una composición farmacéutica, especialmente una vacuna, por ej emplo para usarse en el tratamiento de tumores y enfermedades cancerosas, enfermedades cardiovasculares, enfermedades infecciosas, enfermedades autoinmunes o enfermedades genéticas, o en terapia génica. La presente invención describe además un método de transcripción in vitro, métodos in vitro para incrementar la expresión de una proteína usando el ácido nucleico que comprende o codifica para una secuencia de tallo-asa y poli(A) de histona o una señal de poliadenilación y un método ex vivo e in vivo.
Aparte de las enfermedades cardiovasculares y enfermedades infecciosas, la ocurrencia de tumores y enfermedades cancerosas es una de las causas de muerte más frecuentes en la sociedad moderna y en la mayoría de los casos está asociada con costos considerables en términos de terapia y medidas de rehabilitación subsecuentes. El tratamiento de tumores y enfermedades cancerosas depende ampliamente, por ejemplo, del tipo de tumor que se presente, de la edad, la distribución de las células cancerosas en el paciente que será tratado, etc. La terapia del cáncer se lleva a cabo actualmente en forma convencional mediante el uso de terapia de radiación o quimioterapia además de operaciones invasivas. Sin embargo, estas terapias convencionales típicamente ponen estrés extraordinario en el sistema inmunológico y pueden usarse en algunos casos sólo en un grado limitado. Además, la mayoría de estas terapias convencionales requieren largos intervalos entre los tratamientos individuales para permitir regeneración del sistema inmunológico.
Por lo tanto, se han investigado en años recientes estrategias complementarias además de estos "tratamientos convencionales" para evitar o al menos reducir el impacto en el sistema inmunológico de estos tratamientos. Uno de estos tratamientos complementarios incluye en particular enfoques de terapia génica o vacunación genética, que ya se ha encontrado que son altamente promisorios para el tratamiento o para soportar estas terapias convencionales.
La terapia génica y vacunación genética son métodos de medición molecular que ya han sido probados en la terapia y prevención de enfermedades y exhiben generalmente un efecto considerable en la práctica médica diaria, en particular en el tratamiento de enfermedades como las mencionadas arriba. La terapia génica también se usa en campos de medicina adicionales, por ejemplo, en el caso de enfermedades genéticas, es decir enfermedades (heredadas), que son causadas por un defecto génico definido y se heredan de acuerdo con las leyes de Mendel . Las representaciones más conocidas de estas enfermedades genéticas incluyen entre otras mucoviscidosis (fibrosis quística) y anemia de células falciformes. Ambos métodos, terapia génica y vacunación genética, se basan en la introducción de ácidos nucleicos en las células o tej ido del paciente y procesamiento subsecuente de la información codificada por el ácido nucleico que ha sido introducido en las células o tejido, es decir la expresión (proteínica) de polipéptidos deseados.
En los enfoques de terapia génica, típicamente ADN se usa incluso a pesar de que el ARN también se conoce en desarrollos recientes. En forma importante, en todos estos enfoques de terapia génica el ARNm funciona como mensaj ero para la información de secuencia de la proteína codificada, no obstante si se usa ADN, ARN viral o ARNm.
En general el ARN se considera una molécul a inestable. Las RNasas son ubicuas y notoriamente difíciles de inactivar. Además, ARN también es químicamente más lábil que ADN. Así, tal vez es sorprendente que el "estado preestablecido" de un ARNm en una célula eucariótica se caracteriza por una estabilidad relativa y se requieren señales específicas para acelerar el decaimiento de las moléculas de ARNm individuales. La principal razón de este descubrimiento parece ser que el decaimiento de ARNm dentro de las células es catalizado casi exclusivamente por exonucleasas. Sin embargo, los extremos de las moléculas de ARNm eucarióticas se protegen contra estas enzimas por estructuras terminales específicas y sus proteínas asociadas : una m7GpppN CAP en el extremo 5 ' y típicamente una secuencia poli(A) en el extremo 3 ' . La remoción de estas dos modificaciones terminales se considera entonces limitadora de velocidad para el decaimiento de ARNm. Aunque un elemento estabilizador ha sido caracterizado en el 3 ' UTR del ARNm de alfa-globina, secuencias de ARN que afectan el cambio de moléculas de ARNm eucarióticas actúan típicamente como un promotor de decaimiento normalmente al acelerar la desadenilación (revisado en Meyer, S . , C. Temme, et al. (2004), Crit Rev Biochem Mol Biol 39(4) : 1 97-216).
Como se mencionó arriba, los extremos 5 ' de las moléculas de ARNm eucarióticas son típicamente modificados después de la transcripción para llevar una estructura CAP metilada, por ej emplo, m7GpppN. Aparte de los papeles en el empalme, estabilización y transporte de ARN, la estructura CAP incrementa significativamente el reclutamiento de la subunidad ribosómica 40S al extremo 5 ' del ARNm durante el inicio de la traducción. Esta última función requiere el reconocimiento de la estructura CAP por el complejo de factor de inicio eucariótico eIF4F. La secuencia poli(A) además estimula la traducción por medio del reclutamiento de subunidad 40S incrementado a moléculas de ARNm, un efecto que requiere la intervención de proteína de unión poli(A) (PABP). PABP, a su vez, demostró recientemente interactuar físicamente con eIF4G, que es parte del complej o eIF4F unido a CAP . De esta manera, un modelo de asa cerrada de inicio de traducción en moléculas de ARNm poliadeniladas de extremos bloqueados fue postulado (Michel, Y. M., D. Poncet, et al (2000), J Biol Chem 275(41 ) : 32268-76) .
Casi todas las moléculas de ARNm eucarióticas concluyen con esta secuencia poli(A) que se añade a su extremo 3 ' por la maquinaria ubicua de corte/poliadenilación. La presencia de una secuencia poli(A) en el extremo 3 ' es una de las características más reconocibles de las moléculas de ARN eucarióticas. Después del corte, la mayoría de las pre-moléculas de ARNm, con excepción de los transcriptos de histona dependientes de replicación, adquieren una cola poliadenilada. En este contexto, el procesamiento del extremo 3 ' es un proceso co-transcripcional nuclear que promueve el transporte de moléculas de ARNm del núcleo al citoplasma y afecta la estabilidad y la traducción de moléculas de ARNm. La formación de este extremo 3 ' ocurre en una reacción de dos etapas dirigida por la maquinaria de corte/poliadenilación y depende de la presencia de dos elementos de secuencia en precursores de ARNm (pre-ARNms); un hexanucleótido altamente conservado AAUAAA (señal de poliadenilación) y una secuencia rica en G/U hacia el extremo 3 ' . En una primera etapa, moléculas de pre-ARNm son cortadas entre estos dos elementos. En una segunda etapa estrechamente acoplada a la primera etapa el extremo 3 ' recién formado es extendido por la adición de una secuencia poli(A) que consiste en 200-250 adenilatos que afecta posteriormente todos los aspectos del metabolismo de ARNm, incluyendo exportación, estabilidad y traducción de ARNm (Dominski, Z. y W. F. Marzluff (2007), Gene 396(2): 373-90).
La única excepción conocida a esta regla son las moléculas de ARNm de histona dependientes de replicación que concluyen con un tallo-asa de histona en lugar de una secuencia poli(A). Las secuencias de tallo-asa de histona ejemplares se describen en López et al. (Dávila López, M., & Samuelsson, T. (2008), RNA (Nueva York, N. Y.), 14(1), 1-10. Doi:10.1261/rna.782308).
Las estructuras de tallo-asa en pre-moléculas de ARNm de histona van seguidas típicamente por una secuencia rica en purina conocida como el elemento hacia el extremo 3' de histona (HDE). Estas pre-moléculas de ARNm son procesadas en el núcleo por un solo corte endonucleolítico aproximadamente 5 nucleótidos hacia el extremo 3' del tallo-asa, catalizado por el snRNP U7 a través de apareo de bases del U7 snARN con el HDE.
Debido a la necesidad de empacar ADN recién sintetizado en cromatina, la síntesis de histona es regulada en conjunto con el ciclo celular. Una síntesis incrementada de proteínas de histona durante la fase S se logra por la activación transcripcional de genes de histona así como regulación post-transcripcional de los niveles de ARN de histona. Podría demostrarse que el tallo-asa de histona es esencial para todas las etapas post-transcripcionales de regulación de expresión de histona. Es necesario para un procesamiento eficiente, exportación de la molécula de ARNm en el citoplasma, carga en polirribosomas y regulación de la estabilidad de ARNm.
En el contexto anterior, se identificó una proteína de 32 kDa, la cual está asociada con el tallo-asa de histona en el extremo 3 ' de los mensajes de histona tanto en el núcleo como en el citoplasma. El nivel de expresión de esta proteína de unión a tallo-asa (SLBP) es regulado en ciclo celular y es el más alto durante la fase S cuando los niveles de ARNm de histona son incrementados. SLBP es necesaria para un procesamiento de extremo 3 ' eficiente de pre-ARNm de histona por el U7 snRNP. Después de la conclusión del procesamiento, SLBP permanece asociada con el tallo-asa en el extremo de moléculas de ARNm de histona maduras y estimula su traducción en proteínas de histona en el citoplasma. (Dominski, Z. y W. F. Marzluff (2007), Gene 396(2) : 373 -90). En forma interesante, el dominio de unión a ARN de SLBP se conserva a través de metazoarios y protozoarios (Dávila López, M. , y Samuelsson, T. (2008), RNA (Nueva York, N. Y.), 14( 1 ), 1 - 1 0. Doi : 10. 1261 /ma.782308) y podría mostrarse que su unión a la secuencia de tallo-asa de histona depende de la estructura de tallo-asa y que el sitio de unión mínimo contiene al menos 3 nucleótidos 5 ' y 2 nucleótidos 3 ' del tallo-asa (Pandey, N. B . , et al. , ( 1994), Molecular and Cellular Biology, 14(3 ), 1 709- 1 720 y Williams, A. S ., y Marzluff, W. F. , ( 1995), Nucleic Acids Research, 25(4), 654-662).
Incluso a pesar de que los genes de hi stona generalmente se clasifican ya sea como "dependientes de replicación", dando origen a que ARNm concluya en un tallo-asa de histona, o "tipo de reemplazo", dando origen a ARNm que portan una cola poli(A) en lugar de ello, las moléculas de ARNm de origen natural que contienen tanto tallo-asa de histona como poli(A) u oligo(A) 3 ' de las mismas han sido identificadas en algunos casos muy raros. Sánchez et al. examinaron el efecto de colas oligo(A) de origen natural anexas 3 ' del tallo-asa de histona de ARNm de histona durante oogénesis de Xenopus usando luciferasa como una proteína reportera y encontraron que la cola oligo(A) es una parte activa del mecanismo de represión de traducción que silencia el ARNm de histona durante oogénesis y su remoción es parte del mecanismo que activa la traducción de moléculas de ARNm de histona (Sánchez, R. y W. F. Marzluff (2004), Mol Cell Biol 24(6) : 25 1 3 -25).
Más aún, los requisitos para la regulación de histonas dependientes de replicación al nivel de procesamiento de pre-ARNm y estabilidad de ARNm han sido investigados usando construcciones artificiales que codifican para la proteína marcadora alfa globina, tomando ventaj a del hecho de que el gen de globina contiene intrones a diferencia de los genes de histona de menos intrones. Para este fin, se generaron construcciones en las cuales la secuencia de codificación de alfa globina fue seguida por una señal de tallo-asa de histona (tallo-asa de histona seguida por el elemento hacia el extremo 3 ' de histona) y una señal de poliadenilación (Whitelaw, E., et al., (1986). Nucleic Acids Research, 14(17), 7059-7070; Pandey, N. B., y Marzluff, W. F. (1987). Molecular and Cellular Biology, 7(12), 4557-4559; Pandey, N. B., et al., (1990). Nucleic Acids Research, 18(11), 3161-3170).
En otro enfoque Lüscher et al. investigaron la regulación dependiente de ciclo celular de un gen H4 de histona recombinante. Se generaron construcciones en las cuales la secuencia de codificación de H4 fue seguida por una señal de tallo-asa de histona y una señal de poliadenilación, las dos señales de procesamiento incidentalmente separadas por una secuencia de codificación de galactocinasa (Lüscher, B. et al, (1985). Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 82(13), 4389-4393).
Además, Stauber et al. identificaron la secuencia mínima requerida para conferir regulación de ciclo celular en los niveles de ARNm de histona H4. Para estas investigaciones se usaron construcciones, que comprendían una secuencia de codificación para el marcador de selección Xantina:guanina fosforribosiltransferasa (GPT) que precede una señal de tallo-asa de histona seguida por una señal de poliadenilación (Stauber, C. et al, (1986). EMBO J, 5(12), 3297-3303).
Al examinar el procesamiento de pre-ARNm de histona Wagner et al. identificaron factores requeridos para el corte de moléculas de pre-ARNm de histona usando una construcción reportera que ponía a EGFP entre una señal de tallo-asa de histona y una señal de poliadenilación, de tal manera que EGFP fuera expresada sólo en caso de que el procesamiento de pre-ARNm de histona fuera interrumpido (Wagner, E. J. et al. (2007), Mol Cell 28(4), 692-9).
Debe mencionarse que la traducción de ARNm poliadenilado normalmente requiere que la secuencia poli(A) 3 ' sea puesta en proximidad de la CAP 5 ' . Esto es mediado a través de interacción proteína-proteína entre la proteína de unión poli(A) y el factor de inicio eucariótico eIF4G. Con respecto a moléculas de ARNm de histona dependientes de replicación, se ha descubierto un mecanismo análogo. En este contexto, Gallie et al. muestran que el tallo-asa de histona es funcionalmente similar a una secuencia poli(A) toda vez que incrementa la eficiencia de traducción y es co-dependiente de un 5 ' -CAP para poder establecer un nivel de traducción eficiente. Demostraron que el tallo-asa de histona es suficiente y necesario para incrementar la traducción de un ARNm reportero en células de ovario de hámster Chino transfectadas pero debe colocarse en el extremo 3 ' para funcionar óptimamente. Por lo tanto, en forma similar a la cola poli(A) en otras moléculas de ARNm, el extremo 3 ' de estas moléculas de ARNm de histona parecen ser esencial para la traducción in vivo y es funcionalmente análogo a una cola poli(A) (Gallie, D . R. , Lewis, N. J. , y Marzluff, W. F. ( 1996), Nucleic Acids Research, 24( 10), 1 954- 1 962).
Además, podría mostrarse que SLBP se une al ARNm de histona citoplásmico y se requiere para su traducción. Incluso a pesar de que SLBP no interactúa directamente con eIF4G, el dominio requerido para la traducción de ARNm de histona interactúa con la proteína SLIP 1 recientemente identificada. En un paso más, SLIP 1 interactúa con eIF4G y permite circularizar ARNm de histona y soportar una traducción eficiente de ARNm de histona por un mecanismo similar a la traducción de moléculas de ARNm poliadeniladas.
Como se mencionó arriba, los enfoques de terapia génica normalmente usan ADN para transferir la información de codificación en la célula que luego es transcrita en ARNm, llevando los elementos de origen natural de un ARNm, particularmente la estructura 5 ' -CAP y la secuencia 3 ' poli(A) para asegurar la expresión de la proteína terapéutica codificada.
Sin embargo, en muchos casos sistemas de expresión a base de la introducción de estos ácidos nucleicos en las células o tejido del paciente y la expresión subsecuente de los polipéptidos deseados codificados por estos ácidos nucleicos no exhiben el nivel deseado o incluso requerido de expresión que puede permitir una terapia eficiente, no obstante de si se usa ADN o ARN.
En la técnica anterior, se han hecho hasta la fecha diferentes intentos por incrementar la producción de la expresión de una proteína codificada, en particular mediante el uso de sistemas de expresión mejorados, tanto in vitro y/o in vivo. Los métodos para incrementar la expresión descritos generalmente en la técnica anterior se basan convencionalmente en el uso de vectores o casetes de expresión que contienen promotores específicos y elementos de regulación correspondientes. Ya que estos vectores de expresión o casetes están típicamente limitados a sistemas celulares particulares, estos sistemas de expresión tienen que ser adaptados para usarse en diferentes sistemas de células. Estos vectores o casetes de expresión adaptados son luego transfectados normalmente en las células y tratados típicamente dependiendo de la línea celular específica. Por lo tanto, se da preferencia principalmente a las moléculas de ácido nucleico que son capaces de expresar las proteínas codificadas en una célula objetivo por sistemas inherentes en la célula, independientemente de promotores y elementos de regulación que son específicos para tipos de células particulares. En este contexto, se puede distinguir entre elementos de estabilización de ARN y elementos que incrementan la eficiencia de traducción del ARNm.
Las moléculas de ARNm que son optimizadas en su secuencia de codificación y que en general son adecuadas para este propósito se describen en la solicitud WO 02/098443 (CureVac GmbH). Por ejemplo, WO 02/098443 describe moléculas de ARNm que son estabilizadas en forma general y optimizadas para traducción en sus regiones de codificación. WO 02/098443 describe además un método para determinar modificaciones de secuencia. WO 02/098443 describe además posibilidades para sustituir nucleótidos de adenina y uracilo en secuencias de ARNm para poder incrementar el contenido de guanina/citocina (G/C) de las secuencias. De acuerdo con WO 02/098443 , estas sustituciones y adaptaciones para incrementar el contenido de G/C pueden usarse para aplicaciones de terapia génica pero también vacunas genéticas en el tratamiento de cáncer o enfermedades infecciosas. En este contexto, WO 02/098443 menciona generalmente secuencias como una secuencia base para estas modificaciones, en las cuales el ARNm modificado codifica para al menos un péptido o polipéptido biológicamente activo, que es traducido en el paciente que será tratado, por ejemplo, ya sea no en absoluto o inadecuadamente o con fallas. Como alternativa, WO 02/098443 propone moléculas de ARNm que codifican para antígenos, por ej emplo, antígenos tumorales o antígenos virales como una secuencia base para estas modificaciones.
En un enfoque más para incrementar la expresión de una proteína codificada la solicitud WO 2007/036366 describe el efecto positivo de secuencias poli(A) largas (particularmente más largas que 1 20 bp) y la combinación de al menos dos regiones no traducidas 3 ' del gen de beta globina en estabilidad y actividad de traducción de ARNm.
Sin embargo, incluso a pesar de que todos estos documentos de la técnica anterior ya intentaron proporcionar herramientas bastante eficientes para enfoques de terapia génica y además mejoraron la estabilidad y actividad de traducción de ARNm, sigue habiendo el problema de una estabilidad generalmente más baj a de aplicaciones a base de ARN contra vacunas de ADN y enfoques terapéuticos genéticos a base de ADN. En consecuencia, sigue habiendo la necesidad en la técnica por proporcionar herramientas mejoradas para enfoques de terapia génica y vacunación genética o como una terapia complementaria para tratamientos convencionales como los descritos arriba, que permitan una mejor provisión de proteínas codificadas in vivo, por ejemplo, por medio de una actividad de traducción y/o estabilidad de ARNm mejorada, preferiblemente para terapia génica.
El obj etivo debajo de la presente invención es por lo tanto proporcionar métodos adicionales y/o alternativos para incrementar la expresión de una proteína codificada, de preferencia por medio de estabilización adicional del ARNm y/o un incremento de la eficiencia de traducción de este ARNm con respecto a tales ácidos nucleicos conocidos de la técnica anterior para el uso en aplicaciones terapéuticas (por ej emplo, terapia génica y vacunación genética) .
Este obj etivo se resuelve por la materia de las reivindicaciones anexas. Particularmente, el obj etivo debaj o de la presente invención se resuelve de acuerdo con una primera modalidad por una secuencia de ácido nucleico inventiva que comprende o codifica para a) una región de codificación, que codifica de preferencia para un péptido o proteína; b) al menos un tallo-asa de histona, y c) opcionalmente una secuencia poli(A) o una señal de poliadenilación, de preferencia para incrementar el nivel de expresión de una proteína codificada, en donde la proteína codificada de preferencia no es proteína de histona, no es proteína reportera (por ej emplo luciferasa, GFP, EGFP, /3-galactosidasa, particularmente EGFP) y no es proteína marcadora o de selección (por ejemplo, alfa-globina, galactocinasa y xantina:guanina fosforribosil transferasa (GPT)).
En este contexto se prefiere particularmente que el ácido nucleico de la invención de acuerdo con la primera modalidad de la presente invención se produzca al menos parcialmente por síntesis de ADN o ARN o sea un ácido nucleico aislado.
La presente invención se basa en el sorprendente descubrimiento de los presentes inventores, de que la combinación de una secuencia poli(A) o señal de poliadenilación y al menos un tallo-asa de histona, incluso a pesar de que ambos representen mecanismos alternativos en la naturaleza, actúa sinérgicamente porque esta combinación incrementa la expresión de proteínas muchas veces por arriba del nivel observado con cualquiera de los elementos individuales. El efecto sinérgico de la combinación de poli(A) y al menos un tallo-asa de histona se observa no obstante el orden de poli(A) y tallo-asa de histona y no obstante la longitud de la secuencia poli(A) .
Por lo tanto se prefiere particularmente que la molécula de ácido nucleico de la invención comprenda o codifique para a) una región de codificación, que codifique de preferencia para un péptido o proteína; b) al menos un talo-asa de histona, y c) una secuencia poli(A) o secuencia de poliadenilación; de preferencia para incrementar el nivel de expresión de una proteína codificada, en donde la proteína codificada de preferencia no es proteína de histona, no es proteína reportera (por ej emplo luciferasa, GFP, EGFP, /3-galactosidasa, particularmente EGFP) y no es proteína marcadora o de selección (por ej emplo, alfa-globina, galactocinasa y xantinar guanina fosforribosil transferasa (GPT)) .
En un aspecto alternativo más de la primera modalidad de la presente invención el ácido nucleico de la invención no comprende elemento hacia el extremo 3 ' de histona (HDE).
En este contexto se prefiere particularmente que el ácido nucleico de la invención comprenda o codifique en la dirección 5 ' a 3 ' : a) para una región de codificación, de preferencia que codifique para un péptido o proteína; b) para al menos un tallo-asa de histona, opcionalmente sin un elemento hacia el extremo 3 ' de histona 3 ' al tallo-asa de histona c) una secuencia poli(A) o una señal de poliadenilación.
El término "elemento hacia el extremo 3 ' de histona (HDE)" se refiere a un tramo de polinucleótido rico en purina de aproximadamente 1 5 a 20 nucleótidos 3 ' de tallos-asas de origen natural, que represente el sitio de unión para el U7 snRNA implicado en el procesamiento de pre-ARN de histona en el ARN de histona maduro. Por ejemplo en erizos de mar el HD es CAAGAAAGA (Dominski, Z. y W. F. Marzluff (2007), Gene 396(2): 373 -90).
Más aún, es preferible que el ácido nucleico de la invención de acuerdo con la primera modalidad de la presente invención no comprenda un intrón.
En otra modalidad preferida particular, la secuencia de ácido nucleico de la invención de acuerdo con la primera modalidad de la presente invención comprende o codifica para desde 5 ' a 3 ' : a) una región de codificación, que codifica de preferencia para un péptido o proteína; c) una secuencia poli(A); y b) al menos un tallo-asa de histona.
La secuencia de ácido nucleico de la invención de acuerdo con la primera modalidad de la presente invención comprende cualquier ácido nucleico adecuado, seleccionado por ej emplo de cualquier ADN (hebra individual o doble hebra), de preferencia, sin estar limitado al mismo, por ej emplo, ADN genómico, moléculas de ADN de una sola hebra, moléculas de ADN de doble hebra o puede seleccionarse por ej emplo de cualquier PNA (ácido nucleico péptido) o puede seleccionarse, por ej emplo, de cualquier ARN (de una sola hebra o doble hebra), de preferencia un ARN mensajero (ARNm); etc. La molécula de ácido nucleico de la invención también puede comprender un ARN viral (vARN). Sin embargo, la secuencia de ácido nucleico de la invención puede no ser un ARN viral o puede no contener un ARN viral. Más específicamente, la secuencia de ácido nucleico de la invención puede no contener elementos de secuencia virales, por ej emplo, potenciadores virales o promotores virales (por ej emplo, ningún promotor viral inactivado o elemento de secuencia, más específicamente no activado por estrategias de reemplazo), u otros elementos de secuencia viral, o secuencias de ácido nucleico virales o retrovirales. Más específicamente, la secuencia de ácido nucleico de la invención puede no ser un vector retroviral o viral o un vector retroviral o viral modificado.
En, cualquier caso, la secuencia de ácido nucleico de la invención puede o no contener una secuencia potenciadora y/o promotora, que puede modificarse o no o la cual puede activarse o no. El potenciador y/o promotor puede ser expresable o no expresable en eucariontes y/o expresable o no expresable en procariontes. La molécula de ácido nucleico de la invención puede contener una secuencia que codifique para una ribozima (de auto-empalme) o no.
De preferencia, la molécula de ácido nucleico de la invención es un ARN .
En aspectos particulares de la primera modalidad de la presente invención, el ácido nucleico de la invención es una secuencia de ácido nucleico comprendida en un ácido nucleico adecuado para transcripción in vitro, particularmente en un vector de transcripción in vitro adecuado (por ej emplo, un plásmido o una secuencia de ácido nucleico lineal que comprende promotores específicos para transcripción in vitro tales como promotores T3 , T7 o Sp6).
En aspectos preferidos particulares adicionales de la primera modalidad de la presente invención, el ácido nucleico de la invención que está comprendido en un ácido nucleico adecuado para transcripción y/o traducción en un sistema de expresión (por ejemplo, en un vector o plásmido de expresión), particularmente un sistema de expresión procariótico (por ejemplo, bacterias tales como E. coli) o eucariótico (por ej emplo, células de mamífero tales como células CHO, células de levadura o células de inserto u organismos entero tales como plantas o animales).
El término "sistema de expresión" significa un sistema (cultivo de células u organismos enteros) que es adecuado para la producción de péptidos, proteínas o ARN particularmente ARNm.
La secuencia de ácido nucleico de la invención de acuerdo con la primera modalidad de la presente invención comprende o codifica para al menos un tallo-asa de histona. En el contexto de la presente invención, este tallo-asa de histona se deriva típicamente de genes de histona y comprende un apareo de bases intramolecular de dos secuencias complementari as completa o parcialmente inversas adyacentes, formando así un tallo-asa. Un tallo-asa puede presentarse en ADN de una sola hebra o, más comúnmente, en ARN. La estructura también se conoce como un pasador u horquilla y asa y consiste normalmente en un tallo y un asa (terminal) dentro de una secuencia consecutiva, en donde el tallo se forma por dos secuencias complementarias completa o parcialmente inversas adyacentes separadas por una secuencia corta como un tipo de separador, que construye el asa de la estructura de tallo-asa. Las dos secuencias complementarias completa o parcialmente inversas adyacentes pueden definirse como por ej emplo elementos de tallo y asa stem l y stem2. El tallo asa se forma cuando éstas dos secuencias complementarias inversas completa o parcialmente adyacentes, por ej emplo, elementos de tallo asa stem l y stem2, forman pares de bases entre sí, llevando a una secuencia de ácido nucleico de doble hebra que comprende un asa no apareada en su extremo terminal formada por la secuencia corta ubicada entre los elementos de tallo asa stem l y stem2 en la secuencia consecutiva. El asa no apareada representa de esta manera típicamente una región del ácido nucleico que no es capaz del apareo de bases con cualquiera de estos elementos de tallo y asa. La estructura en forma de paleta resultante es un bloque de construcción clave de muchas estructuras secundarias de ARN. La formación de una estructura de tallo-asa depende entonces de la estabilidad de las regiones de tallo y asa resultantes, en donde el primer prerrequisito es típicamente la presencia de una secuencia que pueda plegarse sobre sí misma para formar una doble hebra apareada. La estabilidad de los elementos de tallo y asa apareados se determina por la longitud, el número de no coincidencias o bultos que contiene (un pequeño número de no coincidencias es típicamente tolerable, especialmente en una larga doble hebra), y la composición de base de la región apareada. En el contexto de la presente invención, la longitud de asa óptima es 3- 10 bases, muy preferiblemente 3 a 8, 3 a 7, 3 a 6 o incluso más preferiblemente 4 a 5 bases, y demasiado preferiblemente 4 bases.
De acuerdo con la presente invención la secuencia de tallo y asa de histona de acuerdo con el componente (b) de la reivindicación 1 puede no derivarse de una proteína de histona de ratón. Más específicamente, la secuencia de tallo y asa de histona puede no derivarse del gen de histona de ratón H2A614. Asimismo, el ácido nucleico de la invención puede no contener ni una secuencia de tallo y asa de histona de ratón ni contener un gen de histona de ratón H2A614. Además, la secuencia de ácido nucleico de la invención puede no contener una señal de procesamiento de tallo-asa, más específicamente, una señal de procesamiento de histona de ratón y, más específicamente, puede no contener señal de procesamiento de tallo asa de ratón H2kA614. Asimismo, si la molécula de ácido nucleico de la invención puede contener al menos un gen de histona de mamífero. Sin embargo, el por lo menos un gen de histona de mamífero puede no ser Seq. ID No. 7 de WO 01 / 12824.
De acuerdo con un aspecto preferido de la primera modalidad inventiva, la secuencia de ácido nucleico de la invención comprende o codifica para al menos una secuencia de tallo-asa de histona, de preferencia con al menos una de las siguientes fórmulas (I) o (II), en donde la palabra stem se refiere al tallo y la palabra loop se refiere al asa: Fórmula (I) (secuencia de tallo-asa sin elementos de borde de tallo) : steml loop stem2 Fórmula (II) (secuencia de tallo-asa con elementos de borde de tallo) : ^ [No.2GN3-5] [N0.4(U T)N0.4] [N3. 6 steml steml loop stem2 stem2 elemento de borde elemento de borde en donde: en los elementos de borde stem l o stem2 Ni - son una secuencia consecutiva de 1 a 6, de preferencia de 2 a 6, muy preferiblemente de 2 a 5, aún más preferiblemente de 3 a 5 , demasiado preferiblemente de 4 a 5 ó 5 N, en donde cada N es independientemente de la otra seleccionada de un nucleótido seleccionado de A, U, T, G y C, o un análogo de nucleótido del mismo. stem l [No-2GN3 -5] es complementario inverso o complementario parcialmente inverso con el elemento stem2, y es una secuencia consecutiva de entre 5 a 7 nucleótidos; en donde N0 -2 es una secuencia consecutiva de 0 a 2, de preferencia de 0 a 1 , muy preferiblemente de 1 N, en donde cada N es independientemente del otro seleccionado de un nucleótido seleccionado de A, U, T, G y C o un análogo de nucleótido del mismo; en donde N3 -5 es una secuencia consecutiva de 3 a 5 , de preferencia de 4 a 5 , muy preferiblemente de 4 N, en donde cada N es independientemente del otro seleccionado de un nucleótido seleccionado de A, U, T, G y C o un análogo de nucleótido del mismo, y en donde G es guanosina o un análogo de la misma, y puede ser reemplazado opcionalmente por una citidina o un análogo de la misma, siempre que su citidina de nucleótido complementaria en stem2 sea reemplazada por guanosina; secuencia de asa [No-4(U/T)N0-4] se ubica entre los elementos stem l y stem2, y es una secuencia consecutiva de 3 a 5 nucleótidos, muy preferiblemente de 4 nucleótidos; en donde cada ?0-4 es independientemente de la otra una secuencia consecutiva de 0 a 4, de preferenci a de 1 a 3 , muy preferiblemente de 1 a 2 N, en donde cada N es independientemente del otro seleccionado de un nucleótido seleccionado de A, U, T, G y C o un análogo de nucleótido del mismo; y en donde U/T representa uridina, u opcionalmente timidina; stem2 [N3 -5CN0.2] es complementario inverso o parcialmente complementario inverso con el elemento stem l , y es una secuencia consecutiva de entre 5 a 7 nucleótidos; en donde N3 -5 es una secuencia consecutiva de 3 a 5, de preferencia de 4 a 5 , muy preferiblemente de 4 N, en donde cada N es independientemente del otro seleccionado de un nucleótido seleccionado de A, U, T, G y C o un análogo de nucleótido del mismo; en donde N0-2 es una secuencia consecutiva de 0 a 2, de preferencia de 0 a 1 , muy preferiblemente de 1 N, en donde cada N es independientemente del otro seleccionado de un nucleótido seleccionado de A, U, T, G o C o un análogo de nucleótido del mi smo; y en donde C es citidina o un análogo del mismo, y puede ser reemplazado opcionalmente por una guanosina o un análogo de la misma siempre que su guanosina de nucleótido complementaria en stem l sea reemplazada por citidina; en donde stem l y stem2 son capaces del apareo de bases entre sí formando una secuencia complementaria inversa, en donde el apareo de bases puede ocurrir entre stem l y stem2, por ej emplo, por apareo de bases de Watson-Crick de nucleótidos A y U/T o G y C o por apareo de bases no de Watson-Crick, por ejemplo, apareo de bases vobulado, apareo de bases de Watson-Crick inverso, apareo de bases de Hoogsteen, apareo de bases de Hoogsteen inverso o son capaces del apareo de bases entre sí formando una secuencia complementaria parcialmente inversa, en donde un apareo de bases incompleto puede ocurrir entre stem l y stem2, con base en que una o más bases en un tallo no tengan una base complementaria en la secuencia complementaria inversa del otro tallo.
En el contexto anterior, un apareo de bases vobulado es típicamente un apareo de bases no de Watson-Crick entre dos nucleótidos. Los cuatro pares de bases vobulados principales en el presente contexto, que pueden usarse son guanosina-uridina, inosina-uridina, inosina-adenosina, inosina-citidina (G-U/T, I-U/T, I-A e I-C) y adenosina-citidina (A-C).
En consecuencia, en el contexto de la presente invención, una base vobulada es una base que forma un par de base vobulado con una base adicional como la descrita arriba. Por lo tanto, el apareo de bases no de Watson-Crick, por ej emplo apareo de bases de vobulado puede ocurrir en el tallo de la estructura de tallo-asa de histona de acuerdo con la presente invención.
En el contexto anterior una secuencia complementaria parcialmente inversa comprende máximamente 2, de preferencia sólo una no coincidencia en la estructura de tallo de la secuencia de tallo-asa formada por el apareo de bases de stem l y stem2. En otras palabras, stem l y stem2 son de preferencia capaces del apareo de bases (completo) entre sí a través de la secuencia completa de stem l y stem2 ( 100% de apáreos de bases de Watson-Crick o no Watson-Crick correctos posibles), formando así una secuencia complementaria inversa, en donde cada base tiene su base de Watson-Crick o no Watson-Crick correcta pendiente como un socio de unión complementario. Como alternativa, steml y stem2 son de preferencia capaces del apareo de bases parcial entre sí a lo largo de la secuencia completa de stem l y stem2, en donde al menos aproximadamente 70%, 75 %, 80%, 85%, 90% o 95% del 100% de los apáreos de bases de Watson-Crick o no de Watson-Crick correctos posibles son ocupados con los apáreos de bases de Watson-Crick o no de Watson-Crick correctos y cuando mucho aproximadamente 30%, 25 %, 20%, 1 5%, 1 0% o 5% de las bases restantes no son apareadas.
De acuerdo con un aspecto preferido de la primera modalidad de la invención, la por lo menos una secuencia de tallo-asa de histona (con elementos de borde de tallo) de la secuencia de ácido nucleico de la invención como la definida aquí comprende una longitud de aproximadamente 1 5 a alrededor de 25 nucleótidos, de preferencia una longitud de aproximadamente 1 5 a alrededor de 45 nucleótidos, de preferencia una longitud de aproximadamente 1 5 a alrededor de 40 nucleótidos, de preferencia una longitud de aproximadamente 1 5 a alrededor de 35 nucleótidos, de preferencia una longitud de aproximadamente 1 5 a alrededor de 30 nucleótidos y aún más preferiblemente una longitud de aproximadamente 20 a alrededor de 30 nucleótidos, y aún más preferiblemente una longitud de aproximadamente 24 a alrededor de 28 nucleótidos.
De acuerdo con un aspecto preferido más de la primera modalidad de la invención, la por lo menos una secuencia de tallo-asa de histona (sin elementos de borde de tallo) de la secuencia de ácido nucleico de la invención como la definida en la presente comprende una longitud de alrededor de 10 a aproximadamente 30 nucleótidos, preferiblemente una longitud de alrededor de 10 a aproximadamente 20 nucleótidos, más preferiblemente una longitud de alrededor de 12 a aproximadamente 20 nucleótidos, muy preferiblemente una longitud de alrededor de 14 a aproximadamente 20 nucleótidos, y aún más preferiblemente una longitud de alrededor de 1 6 a aproximadamente 17 y aún más preferiblemente una longitud de alrededor de 16 nucleótidos.
De acuerdo con un aspecto preferido más de la primera modalidad de la invención, la secuencia de ácido nucleico de la invención de acuerdo con la primera modalidad de la presente invención puede comprender o codificar para al menos una secuencia de tallo-asa de histona de acuerdo con por lo menos una de las siguientes fórmulas específicas (la) o (Ha), en donde la palabra stem se refiere al tallo y la palabra loop se refiere al asa: Fórmula (la) (secuencia de tallo-asa sin elementos de borde de tallo) : [N0.1GN3.5] [N^U/DN^] [N3_5Cr> steml loop stem2 Fórmula (Ha) (secuencia de tallo-asa con elementos de borde de tallo) : elemento de borde elemento de borde en donde: N, C, G, T y U son como se definió arriba.
De acuerdo con un aspecto más particularmente preferido adicional de la presente modalidad, la secuencia de ácido nucleico de la invención puede comprender o codificar para al menos una secuencia de tallo-asa de histona de acuerdo con al menos una de las siguientes fórmulas específicas (Ib) o (Ilb), en donde la palabra stem se refiere al tallo y la palabra loop se refiere al asa: Fórmula (Ib) (secuencia de tallo-asa sin elementos de borde de tallo) : [NT G NJ [N2(U ON1] [N4CN,] * y " y " . ' steml loop stem2 Fórmula (Ilb) (secuencia de tallo-asa con elementos de borde de tallo) : N^s [N T G NJ [?2(?/?) ? ? ] [NJZN steml steml loop stem2 stem2 elemento de borde elemento de borde en donde : N, C, G, T y U son como se definió arriba.
De acuerdo con un aspecto todavía más preferido de la primera modalidad de la invención, la secuencia de ácido nucleico de la invención de acuerdo con la primera modalidad de la presente invención puede comprender o codificar para al menos una secuencia de tallo-asa de histona de acuerdo con por lo menos una de las siguientes fórmulas específicas (Ic) a (Ih) o (IIc) a (Ilh), mostradas como alternativa en su estructura de tallo-asa y como una secuencia lineal que representa secuencias de tallo-asa de histona como las generadas de acuerdo con el ej emplo 1 : Fórmula (Ic) : (secuencia de consenso de tallo-asa de histona de metazoarios y protozoarios sin elementos de borde del tallo) : N U N N N-N N-N N-N N-N G-C N-N (estructura de tallo-asa) NGNNNNNNUNNNNNCN (secuencia lineal) (SEQ ID NO: 1 ) Fórmula (IIc) : (secuencia de consenso de tallo-asa de histona de metazoarios y protozoarios con elementos de borde de tallo) : N U N N N-N N-N N-N N-N G-C N*N*NNNN-NNNN*N*N* (estructura de tallo-asa) N*N*NNNNGNNNNNNUNNNNNCNNNN*N*N* (secuencia lineal) (SEQ ID NO: 2) Fórmula (Id) : (sin elementos de borde de tallo) : N U N N N-N N-N N-N N-N C-G N-N (estructura de tallo-asa) NCNNNNNNUNNNNNGN (secuencia lineal) (SEQ ID NO: 3) Fórmula (lid) : (con elementos de borde de tallo) N U N N N-N N-N N-N N-N C-G N*N*NNNN-NNNN*N*N* (estructura de tallo-asa) N*N*NNNNCNNNNNNUNNNNNGNNNN*N*N* (secuencia lineal) (SEQ ID NO: 4) Fórmula (le) : (secuencia de consenso de tallo-asa de histona de protozoarios sin elementos de borde de tallo) N U N N N-N N-N N-N N-N G-C D-H (estructura de tallo-asa) DGNNNNNNUNNNNNCH (secuencia lineal) > (SEQ ID NO: 5) Fórmula (He) : (secuencia de consenso de tallo-asa de histona de protozoarios con elementos de borde de tallo) N U N N N-N N-N N-N N-N G-C N*N*NNND-HNNN*N*N* (estructura de tallo-asa) N*N*NNNDGNNNNNNUNNNNNCHNNN*N*N* (secuencia lineal) (SEQ ID NO: 6) Fórmula (If) : (secuencia de consenso de tallo-asa de histona de metazoarios sin elementos de borde de tallo) N U N N Y-V Y-N B-D N-N G-C N-N (estructura de tallo-asa) NGNBYYNNUNVNDNCN (secuencia lineal) (SEQ ID NO: 7) Fórmula (Ilf) : (secuencia consenso de tallo-asa de histona de metazoarios con elementos de borde de tallo) N U N N Y-V Y-N B-D N-N G-C N*N*NNNN-NNNN*N*N* (estructura de tallo-asa) N*N*NNNNGNBYYNNUNVNDNCNNNN*N*N* (secuencia lineal) (SEQ ID NO: 8) Fórmula (Ig) : (secuencia de consenso de tallo-asa de histona de vertebrados sin elementos de borde de tallo) N U D H Y-A Y"B Y-R H-D G-C N-N (estructura de tallo-asa) NGHYYYDNUHABRDCN (secuencia lineal) (SEQ ID NO: 9) Fórmula (Ilg) : (secuencia de consenso de tallo-asa de histona de vertebrados con elementos de borde de tallo) N U D H Y-A Y-B Y-R H-D G-C N*N*HNNN-NNNN*N*H* (estructura de tallo-asa) N*N*HNNNGHYYYDNUHABRDCNNNN*N*H* (secuencia lineal) (SEQ ID NO: 10) Fórmula (Ih): (secuencia de consenso de tallo-asa de histona humana (Homo sapiens) sin elementos de borde de tallo) Y U D H U-A C-S Y-R H-R G-C D-C (estructura de tallo-asa) DGHYCUDYUHASRRCC (secuencia lineal) (SEQ ID NO: 1 1 ) Fórmula (Ilh) : (secuencia de consenso de tallo-asa de histona humana (Homo sapiens) con elementos de borde de tallo) Y U D H U-A C-S Y-R H-R G-C N*H*AAHD-CVHB*N*H* (estructura de tallo-asa) N*H*AAHDGHYCUDYUHASRRCCVHB*N*H* (secuencia lineal) (SEQ ID NO: 12) en donde en cada una de las anteriores fórmulas (Ic) a (Ih) o (Ilc) a (IIh) : N, C, G, A, T y U son como se definió arriba; cada U puede ser reemplazada por T; cada G o C (altamente) conservada en los elementos de tallo 1 y 2 puede ser reemplazada por su base de nucleótido C o G complementaria, siempre y cuando este nucleótido complementario en el tallo correspondiente sea reemplazado por su nucleótido complementario en paralelo ; y/o G, A, T, U, C, R, Y, M, K, S, W, H, B, V, D y N son bases de nucleótidos como las definidas en la siguiente tabla: En este contexto se prefiere particularmente que la secuencia de tallo-asa de histona de acuerdo con al menos una de las fórmulas (I) o (la) a (Ih) o (II) o (Ha) a (Ilh) de la presente invención se seleccione de una secuencia de tallo y asa de histona de origen natural, muy particularmente preferida de secuencia de tallo-asa de histona de protozoarios o metazoarios, y de una manera todavía más particularmente preferible de secuencia de tallo-asa de histona de vertebrados y demasiado preferiblemente de mamíferos, especialmente de secuencias de tallo-asa de histona de humanos.
De acuerdo con un aspecto particularmente preferido de la presente modalidad, la secuencia de tallo-asa de histona de acuerdo con por lo menos una de las siguientes fórmulas específicas (I) o (la) a (Ih) o (II) o (lia) a (Ilh) de la presente invención es una secuencia de tallo-asa de histona que comprende en cada posición de nucleótido el nucleótido de más frecuentemente ocurrencia, o cualquiera del nucleótido más frecuentemente o el segundo más frecuentemente ocurrente de secuencias de tallo-asa de histona de origen natural en metazoarios y protozoarios (figura 1 ), protozoarios (figura 2), metazoarios (figura 3), vertebrados (figura 4) y humanos (figura 5) como se muestra en la figura 1 -5. En este contexto se prefiere particularmente que al menos 80%, de preferencia al menos 85% o muy preferiblemente al menos 90% de todos los nucleótidos correspondan al nucleótido que ocurra más frecuentemente de las secuencias de tallo-asa de histona de origen natural.
En un aspecto particular adicional de la primera modalidad, la secuencia de tallo-asa de histona de acuerdo con al menos una de las fórmulas específicas (I) o (la) a (Ih) de la presente invención se selecciona de las siguientes secuencias de tallo-asa de histona (sin elementos de borde de tallo) que representa secuencias de tallo-asa de histona como las generadas de acuerdo con el ejemplo 1 : VGYYYYHHTHRVVRCB (SEQ ID NO : 1 3 de acuerdo a la fórmula (Ic)) SGYYYTTYTMARRRCS (SEQ ID NO : 14 de acuerdo a la fórmula (Ic)) SGYYCTTTTMAGRRCS (SEQ ID NO: 1 5 de acuerdo a la fórmula (Ic)) DGNNNBNNTHVNNNCH (SEQ ID NO: 1 6 de acuerdo a la fórmula (le)) RGNNNYHBTHRDNNCY (SEQ ID NO : 17 de acuerdo a la fórmula (le)) RGNDBYHYTHRDHNCY (SEQ ID NO : 1 8 de acuerdo a la fórmula (le)) VGYYYTYHTHRVRRCB (SEQ ID NO : 1 9 de acuerdo a la fórmula (If)) SGYYCTTYTMAGRRCS (SEQ ID NO: 20 de acuerdo a la fórmula (If)) SGYYCTTTTMAGRRCS (SEQ ID NO: 21 de acuerdo a la fórmula (If)) GGYYCTTYTHAGRRCC (SEQ ID NO : 22 de acuerdo a la fórmula (Ig)) GGYCTTYTMAGRGCC (SEQ ID NO : 23 de acuerdo a la fórmula (Ig)) GGCTCTTTTMAGRGCC (SEQ ID NO : 24 de acuerdo a la fórmula (Ig)) DGHYCTDYTHASRRCC (SEQ ID NO : 25 de acuerdo a la fórmula (Ih)) GGCYCTTTTHAGRGCC (SEQ ID NO : 26 de acuerdo a la fórmula (Ih)) GGCYCTTTTMAGRGCC (SEQ ID NO : 27 de acuerdo a la fórmula (Ih)) Más aún, en este contexto las siguientes secuencias de tallo-asa de histona (con elementos de borde de tallo) generadas de acuerdo con el ej emplo 1 de acuerdo con el ej emplo 1 de acuerdo con una de las fórmulas específicas (II) o (lía) a (Ilh) son particularmente preferidas : H *H*HHVVGYYYYHHTHRVVRCBVHH*N*N* (SEQ ID NO: 28 de acuerdo con la fórmula (He)) M*H *MHMSGYYYTTYTMARRRCSMCH*H*H * (SEQ ID NO: 29 de acuerdo con la fórmula (lie)) M*M*MMMSGYYCTTTTMAGRRCSACH *M* H* (SEQ ID NO: 30 de acuerdo con la fórmula (lie)) N*N*NNNDGNNNBNNTHVNNNCHNHN*N*N* (SEQ ID NO: 3 1 de acuerdo con la fórmula (He)) N*N*HHNRGNNNYHBTHRDNNCYDHH*N*N* (SEQ ID NO: 32 de acuerdo con la fórmula (He)) N*H *HHVRGNDBYHYTHRDHNCYRHH*H* H* (SEQ ID NO: 33 de acuerdo con la fórmula (He)) H* H *MHMVGYYYTYHTHRVRRCBVMH*H*N * (SEQ ID NO: 34 de acuerdo con la fórmula (Ilf)) M*M*MMMSGYYCTTYTMAGRRCSMCH*H *H * (SEQ ID NO: 35 de acuerdo con la fórmula (Ilf)) M*M*MMMSGYY'CTTTTMAGRRCSACH*M* H* (SEQ ID NO: 36 de acuerdo con la fórmula (Ilf)) H*H *MAMGGYYCTTYTHAGRRCCVHN*N*M* (SEQ ID NO: 37 de acuerdo con la fórmula (Hg)) H*H*AAMGGCYCTTYTMAGRGCCVCH *H*M* (SEQ ID No: 38 de acuerdo con la fórmula (Ilg)) M*M*AAMGGCTCTTTTMAGRGCCMCY*M*M* (SEQ ID NO: 39 de acuerdo con la fórmula (Ilg)) N*H*AAHDGHYCTDYTHASRRCCVHB *N*H * (SEQ ID NO: 40 de acuerdo con la fórmula (Ilh) H*H*AAMGGCYCTTTTHAGRGCCVMY*N*M* (SEQ ID NO: 41 de acuerdo con la fórmula (Ilh)) H*M*AAAGGCYCTTTTMAGRGCCRMY*H *M* (SEQ ID NO: 42 de acuerdo con la fórmula (Ilh)) De acuerdo con un aspecto preferido más de la primera modalidad inventiva, la secuencia de ácido nucleico de la invención comprende o codifica para por lo menos una secuencia de tallo-asa de histona que muestra al menos aproximadamente 80%, de preferencia al menos alrededor de 85%, muy preferiblemente por lo menos aproximadamente 90% o todavía más preferiblemente al menos alrededor de 95% de identidad de secuencia con los no al 1 00% nucleótidos conservados en las secuencias de tallo-asa de histona de acuerdo con por lo menos una de las fórmulas específicas (I) o (la) a (Ih) o (II) o (Ha) o (Ilh) o con una secuencia de tallo-asa de histona de origen natural.
La secuencia de ácido nucleico de la invención de acuerdo con la primera modalidad de la presente invención puede comprender opcionalmente o codificar para una secuencia pol i(A). Cuando está presente, esta secuencia poli(A) comprende una secuencia de alrededor de 25 a aproximadamente 400 nucleótidos de adenosina, de preferencia una secuencia de alrededor de 50 a aproximadamente 400 nucleótidos de adenosina, muy preferiblemente una secuencia de alrededor de 50 a aproximadamente 300 nucleótidos de adenosina, aún más preferiblemente una secuencia de alrededor de 50 a aproximadamente 250 nucleótidos de adenosina, todavía más preferiblemente una secuencia de alrededor de 60 a alrededor de 250 nucleótidos de adenosina. En este contexto el término "aproximadamente" se refiere a una desviación de ± 1 0% de los valores a los que se adhiere.
En forma preferible, el ácido nucleico de la presente invención no contiene uno o dos o al menos uno o todos pero uno o todos de los componentes del grupo que consiste en: una secuencia que codifica para una ribozima (de preferencia una ribozima de auto-empalme), una secuencia de ácido nucleico viral, una señal de procesamiento de tallo-asa de histona, en particular una secuencia de procesamiento de tallo-asa de histona derivada de gen H2A614 de histona de ratón, un gen Neo, una secuencia promotora inactivada y una secuencia mejoradora inactivada. De manera aún más preferible, el ácido nucleico de acuerdo con esta invención no contiene una ribozima, de preferencia una ribozima de auto-empalme, y uno del grupo que consiste en: un gen Neo, una secuencia promotora inactivada, una secuencia mejoradora inactivada, una secuencia de procesamiento de tallo-asa de histona, en particular una secuencia de procesamiento de tallo-asa de histona derivada del gen H2A614 de histona de ratón. En consecuencia, el ácido nucleico en una modalidad preferida no puede contener ni una ribozima, de preferencia una ribozima de auto-empalme, ni un gen Neo o, como alternativa, ni una ribozima, de preferencia una ribozima de auto-empalme, ni ningún gen de resistencia (por ej emplo, aplicado normalmente para selección). En otra modalidad preferida, el ácido nucleico de la invención no puede ni contener una ribozima, de preferencia una ribozima de auto-empalme ni una señal de procesamiento de tallo-asa de histona, en particular una secuencia de procesamiento de tallo-asa de histona derivada de gen H2A614 de histona de ratón.
Como alternativa, de acuerdo con la primera modalidad de la presente invención, la secuencia de ácido nuclei co de la invención comprende opcionalmente una señal de poliadenilación que se define en la presente como una señal que transmite poliadenilación a un ARNm (transcrito) por factores de proteína específicos (por ej emplo, factor de especificidad de corte y poliadenilación (CPSF), factor de estimulación de corte (CstF), factores de corte I y II (CF I y CF II), poli(A) polimerasa (PAP)) . En este contexto se prefiere una señal de poliadenilación de consenso que comprende la secuencia de consenso NNUANA. En un aspecto preferido particular la señal de poliadenilación comprende una de las siguientes secuencias : AAUAAA o AUUAAA.
La secuencia de ácido nucleico de la invención de acuerdo con la primera modalidad de la presente invención codifica además para una proteína o un péptido, que se puede seleccionar, sin estar restringido a los mismos, por ejemplo, de proteínas o péptidos terapéuticamente activos, incluyendo proteínas adyuvantes, de antígenos, por ej emplo, antígenos tumorales, antígenos patógenos (por ejemplo, seleccionados de antígenos animales, de antígenos virales, de antígenos de protozoarios, de antígenos bacterianos), antígenos alergénicos, antígenos autoinmunes o antígenos adicionales, de alérgenos, de anticuerpos, de proteínas o péptidos inmunoestimuladores, de receptores de células T específicos de antígenos o de cualquier otra proteína o péptido adecuado para una aplicación (terapéutica) específica, en donde el ácido nucleico de la invención puede ser transportado en una célula (por ej emplo, una célula hospedera de expresión o una célula somática), un tejido o un organismo y la proteína puede ser expresada posteriormente en esta célula, tejido u organismo.
La región de codificación del ácido nucleico de la invención de acuerdo con l a primera modalidad de la presente invención se puede presentar como un ácido nucleico mono-, di- o incluso multicistrónico, es decir, un ácido nucleico que porte las secuencias de codificación de uno, dos o más proteínas o péptidos . Estas secuencias de codificación en ácidos nucleicos di-, o incluso multicistrónicos pueden separarse por al menos una secuencia de sitio de entrada de ribosoma interna (IRES), por ej emplo, como la definida en la presente o por péptidos de señal que induzcan el corte del polipéptido resultante que comprenda varias proteínas o péptidos.
En aspectos particularmente preferidos de la primera modalidad de la presente invención los péptidos o proteínas codificados se seleccionan de proteínas o péptidos humanos, virales, bacterianos y protozoarios.
En el contexto de la presente invención, las proteínas terapéuticamente activas, codificadas por la molécula de ácido nucleico de la invención se pueden seleccionar, sin estar restringidas a las mismas, de proteínas que tengan un efecto en sanación, prevengan profilácticamente o traten terapéuticamente una enfermedad, preferiblemente como la definida en la presente, o sean proteínas de las cuales un individuo esté en necesidad. Estas proteínas se pueden seleccionar de cualquier proteína recombinante o aislada que se diseñe sintéticamente o de origen natural conocida por una persona experta en la técnica. Sin estar restringidas a las mismas las proteínas terapéuticamente activas pueden comprender proteínas, capaces de estimular o inhibir la transducción de señales en la célula, por ej emplo, citocinas, linfocinas, monocinas, factores de crecimiento, receptores, moléculas de transducción de señales, factores de transcripción, etc. ; anticoagulantes; antitrombinas; proteínas antialérgicas; factores apoptósicos o proteínas relacionadas con apoptosis, enzimas terapéuticas activas y cualquier proteína relacionada con cualquier enfermedad adquirida o cualquier enfermedad hereditaria.
De preferencia, una proteína terapéuticamente activa, la cual puede ser codificada por la molécula de ácido nucleico de la invención, también puede ser una proteína adyuvante. En este contexto, una proteína adyuvante se debe entender de preferencia como cualquier proteína que sea capaz de desarrollar una respuesta inmune innata como la definida en la presente. Preferiblemente, esta respuesta inmune innata comprende la activación de un receptor de reconocimiento de patrones, tal como por ej emplo un receptor seleccionado de la familia de receptores tipo Toll (TLR), incluyendo por ej emplo, un receptor tipo Toll seleccionado de TLR 1 a TLR 10 humano o de receptores tipo Toll de murino TLR 1 a TLR1 3. Más preferiblemente, la proteína adyuvante se selecciona de proteínas adyuvantes humanas o de proteínas adyuvantes patógenas, seleccionadas del grupo que consiste en, sin estar limitados a los mismos, proteínas bacterianas, proteínas protozoarias, proteínas virales o proteínas fúngicas, proteínas animales, en particular de proteínas adyuvantes bacterianas. Además, los ácidos nucleicos que codifican para proteínas humanas implicadas en efectos adyuvantes (por ej emplo, ligandos de receptores de reconocimiento de patrones, receptores de reconocimiento de patrones, proteínas de las vías de transducción de señales, factores de transcripción o citocinas) pueden usarse también.
La molécula de ácido nucleico de la invención puede como alternativa codificar para un antígeno . De acuerdo con la presente invención, el término "antígeno" se refiere a una sustancia que es reconocida por el sistema inmunológico y es capaz de desencadenar una respuesta inmunológica específica de antígenos, por ej emplo, mediante la formación de anticuerpos o células T específicas de antígenos como parte de la respuesta inmunológica adaptiva.
En este contexto un epítopo antigénico, fragmento o péptido de una proteína significa particularmente epítopos de células B y células T que pueden ser reconocidos por células B , anticuerpos o células T respectivamente.
En el contexto de la presente invención, los antígenos que pueden ser codificados por la molécula de ácido nucl eico de la invención comprenden típicamente cualquier antígeno, epítopo antigénico, fragmento antigénico o péptido antigénico, que esté bajo la anterior definición, más preferiblemente antígenos de proteínas y péptidos, por ej emplo, antígenos tumorales, antígenos al ergénicos o alérgenos, auto-antígenos autoinmunes, antígenos patógenos, etc.
En particular los antígenos como los codificados por la molécula de ácido nucleico de la invención pueden ser antígenos generados fuera de la célula, más típicamente antígenos no derivados del propio organismo anfitrión (por ej emplo un humano) (es decir no auto-antígenos) sino más bien derivados de células hospederas fuera del organismo anfitrión, por ejemplo, antígenos virales, antígenos bacterianos, antígenos fúngicos, antígenos protozoológicos, antígenos animales, antígenos alergénicos, etc. Los antígenos alergénicos (antígenos de alergias o alérgenos) son típicamente antígenos que causan una alergia en un humano y pueden derivarse ya sea de un humano u otras fuentes. Además, los antígenos como los codificados por la molécula de ácido nucleico de la invención pueden ser además antígenos generados dentro de la célula, el tejido o el cuerpo. Estos antígenos incluyen antígenos derivados del propio organismo anfitrión (por ej emplo, un humano), por ej emplo antígenos tumorales, antígenos propios o auto-antígenos, tales como antígenos propios autoinmunes; pero también (no auto) antígenos como los definidos aquí, los cuales se hayan derivado originalmente de células hospederas fuera del organismo anfitrión, pero los cuales sean fragmentados o degradados dentro del cuerpo, tej ido o célula, por ej emplo, mediante degradación, metabolismo (proteasas), etc.
Una clase de antígenos que pueden ser codificados por la molécula de ácido nucleico de la invención comprende antígenos tumorales. Los "antígenos tumorales" se ubican de preferencia sobre la superficie de la célula (tumor). Los antígenos tumorales también se pueden seleccionar de proteínas que sean sobre-expresadas en células tumorales en comparación con una célula normal. Más aún, los antígenos tumorales también incluyen antígenos expresados en células que a su vez no son (fueron) (u originalmente no ellas mismas) degeneradas sino que están asociadas con el tumor supuesto . Los antígenos que están relacionados con los vasos de suministro de tumores o reformación de los mismos, en particular aquellos antígenos que están asociados con neovascularización, por ej emplo, factores de crecimiento, tales como VEGF, bFGF, etc. , también se incluyen en la presente. Los antígenos relacionados con un tumor incluyen además antígenos de células o tejidos, típicamente que infiltran el tumor. Además, algunas sustancias (normalmente proteínas o péptidos) son expresados en pacientes que sufren (con conocimiento o sin conocimiento) de una enfermedad cancerosa y se presentan en concentraciones incrementadas en los fluidos corporales de dichos pacientes. Estas sustancias también se conocen como "antígenos tumorales", sin embargo no son antígenos en el estricto significado de una sustancia inductora de respuesta inmunológica. La clase de antígenos tumorales puede dividirse más en antígenos específicos de tumor (TSAs) y antígenos asociados con tumor (TAAs) . Los TSAs sólo pueden presentarse por células tumorales y nunca por células "saludables" normales. Típicamente resultan de una mutación específica de tumor. Los TAAs, los cuales son más comunes, se presentan normalmente tanto por células tumorales como saludables. Estos antígenos son reconocidos y la célula presentadora de antígenos puede ser destruida por células T citotóxicas. Además, los antígenos tumorales también se pueden presentar sobre la superficie del tumor en forma de, por ej emplo, un receptor mutado. En este caso, pueden ser reconocidos por anticuerpos.
De acuerdo con otra alternativa, una clase más de antígenos que pueden ser codificados por la molécula de ácido nucleico de la invención comprende antígenos alergénicos. Estos antígenos alergénicos se pueden seleccionar de antígenos derivados de diferentes fuentes, por ejemplo, de animales, plantas, hongos, bacterias, etc. Los alérgenos en este contexto incluyen por ejemplo céspedes, pólenes, mohos, fármacos o numerosos activadores ambientales, etc. Los antígenos alergénicos pertenecen típicamente a diferentes clases de compuestos, tales como ácidos nucleicos y sus fragmentos, proteínas o péptidos y sus fragmentos, carbohidratos, polisacáridos, azúcares, lípidos, fosfolípidos, etc. De particular interés en el contexto de la presente invención son los antígenos, los cuales pueden ser codificados por la molécula de ácido nucleico de la invención como l a definida en la presente, es decir, antígenos de proteínas o péptidos y sus fragmentos o epítopos, o ácidos nucleicos y sus fragmentos, particularmente ácidos nucleicos y sus fragmentos, que codifican para estos antígenos de proteínas o péptidos y sus fragmentos o epítopos.
De acuerdo con una alternativa más, la molécula de ácido nucleico de la invención puede codificar para un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo . De acuerdo con la presente invención, este anticuerpo se puede seleccionar de cualquier anticuerpo, por ej emplo, cualquier anticuerpo de origen natural o producido recombinantemente, como se usa en la técnica, en particular anticuerpos adecuados para propósitos terapéuticos, de diagnóstico o científicos, o anticuerpos que hayan sido identificados con relación a enfermedades cancerosas específicas. Aquí, el término "anticuerpo" se usa en su sentido más amplio y cubre específicamente anticuerpos monoclonales y policlonales (incluyendo anticuerpos agonistas, antagonistas y de bloqueo o neutralización) y especies de anticuerpos con especificidad poliepitópica. De acuerdo con la invención, el término "anticuerpo" comprende típicamente cualquier anticuerpo conocido en la técnica (por ejemplo, anticuerpos IgM, IgD, IgG, IgA e IgE), tales como anticuerpos de origen natural, anticuerpos generados por inmunización en un organismo anfitrión, anticuerpos que fueron aislados e identificados a partir de anticuerpos de origen natural o anticuerpos generados por inmunización en un organismo anfitrión y producidos recombinantemente por métodos biomoleculares conocidos en la técnica, así como anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanos, anticuerpos humanizados, anticuerpos biespecíficos, intracuerpos, es decir, anticuerpos expresados en células y ubicados opcionalmente en compartimientos celulares específicos, y fragmentos y variantes de los anticuerpos mencionados arriba. En general, un anticuerpo consiste en una cadena ligera y una cadena pesada que ambas tienen dominios variables y constantes. La cadena ligera consiste en un dominio variable N-terminal, VL, y un dominio constante C-terminal, C L- En contraste, la cadena pesada del anticuerpo IgG, por ej emplo, comprende un dominio variable N-terminal, VH, y tres dominios constantes, C H I , C H y C H 3 .
En el contexto de la presente invención, los anticuerpos codificados por la molécula de ácido nucleico de la invención pueden comprender de preferencia anticuerpos de longitud completa, es decir, anticuerpos compuestos de las cadenas pesada y ligera completas, como se describió arriba. Sin embargo, derivados de anticuerpos tales como fragmentos de anticuerpo, variantes o aducios también pueden ser codificados por la molécula de ácido nucleico de la invención. Los fragmentos de anticuerpo se seleccionan de preferenci a de fragmentos Fab, Fab ' , F(ab ')2, Fe, Facb, pFc' , Fd y Fv de los anticuerpos (de longitud completa) mencionados arriba. En general, los fragmentos de anticuerpo se conocen en la técnica. Por ej emplo, un fragmento Fab ("fragmento, unión a antígeno") está compuesto de un dominio constante y uno variable de cada una de las cadenas pesada y ligera. Los dos dominios variables se unen al epítopo en antígenos diferentes. Las dos cadenas son conectadas por medio de un enlace de disulfuro . Un fragmento scFv ("fragmento variable de cadena individual"), consiste típicamente en los dominios variables de las cadenas ligera y pesada. Los dominios están enlazados por un enlace artificial, en general un enlace de polipéptidos tal como un péptido compuesto de 1 5-25 residuos de glicina, prolina y/o serina.
En el presente contexto es preferible que las diferentes cadenas del anticuerpo o fragmento de anticuerpo sean codificadas por una molécula de ácido nucleico multicistrónica. Como alternativa, las diferentes cepas del anticuerpo o fragmento de anticuerpo son codificadas por varias (secuencias) de ácido nucleico monocistrónicas.
De acuerdo con la primera modalidad de la presente invención, la secuencia de ácido nucleico de la invención comprende una región de codificación, de preferencia que codifica para un péptido o proteína. Preferiblemente, la proteína codificada no es proteína histona. En el contexto de la presente invención esta proteína de histona típicamente es una proteína fuertemente alcalina encontrada en núcleos de células eucarióticas, que empacan y ordenan al ADN en unidades estructurales llamadas nucleosomas. Las proteínas de histona son los componentes proteínicos clave de cromatina, actúan como carretes alrededor de los cuales se devana el ADN, y juegan un papel en la regulación génica. Sin histonas, el ADN desdevanado en cromosomas sería muy largo (una relación longitud a ancho de más de 10 millones a uno en ADN humano). Por ej emplo, cada células humana tiene aproximadamente 1 .8 metros de ADN, pero devanados en las histonas tiene aproximadamente 90 milímetros de cromatina, la cual, cuando se duplica y condensa durante mitosis, se traduce en aproximadamente 120 mieras de cromosomas. Muy preferiblemente, en el contexto de la presente invención esta proteína de histona se define típicamente como una proteína altamente conservada seleccionada de una de las siguientes cinco clases principales de histonas: H1/H5, H2A, H2B, H3 y H4", de preferencia seleccionadas de histona de mamífero, muy preferiblemente de histonas de humanos o proteínas de histona. Estas histonas o proteínas de histona se organizan típicamente en dos súper clases definidas como histonas de núcleo, que comprenden las histonas H2A, H2B, H3 y H4, e histonas enlazadoras, que comprenden las histonas Hl y H5.
En este contexto, las histonas enlazadoras, excluidas de preferencia del alcance de protección de la invención pendiente, de preferencia histonas enlazadoras de mamífero, muy preferiblemente histonas enlazadoras de humanos, se seleccionan típicamente de Hl, incluyendo Hl F, incluyendo particularmente H1F0, HIFNT, HIFOO, HIFX y H1H1, incluyendo particularmente HIST1H1A, HIST1H1B, HIST1H1C, HIST1H1D, HIST1H1E, HIST1H1T.
Además, las histonas nucleares, excluidas de preferencia del alcance de protección de la invención pendiente, de preferencia histonas de núcleo de mamífero, muy preferiblemente histonas nucleares de humano, se seleccionan típicamente de H2A, incluyendo H2AF, incluyendo particularmente H2AFB1, H2AFB2, H2AFB3, H2AFJ, H2AFV, H2AFX, H2AFY, H2AFY2, H2AFZ y H2A1, incluyendo particularmente HIST1H2AA, HIST1H2AB, HIST1H2AC, HIST1H2AD, HIST1H2AE, HIST1H2AG, HIST1H2AI, HIST1H2AJ, HIST1H2AK, HIST1H2AL, HIST1H2AM y H2A2, incluyendo particularmente HIST2HAA3, HIST2H2AC; H2B, incluyendo H2BF, incluyendo particularmente H2BFM, H2BFO, H2BFS, H2BFWT H2B1, incluyendo particularmente HIST1H2BA, HIST1H2BB, HIST1H2BC, HIST1H2BD, HIST1H2BE, HIST1H2BF, HIST1H2BG, HIST1H2BH, HIST1H2BI, HIST1H2BJ, HIST1H2BK, HIST1H2BL, HIST1H2BM, HIST1H2BN, HIST1H2BO y H2B2, incluyendo particularmente HIST2H2BE; H3, incluyendo H3A1, incluyendo particularmente HIST1H3 A, HIST1H3B, HIST1H3C, HIST1H3D, HIST1H3E, HIST1H3F, HIST1H3G, HIST1H3H, HIST1H3I, HIST1H3J y H3A2, incluyendo particularmente HIST2H3C, y H3A3, incluyendo particularmente HIST3H3; H4, incluyendo H41, incluyendo particularmente HIST1H4A, HIST1H4B, HIST1H4C, HIST1H4D, HIST1H4E, HIST1H4F, HIST1H4G, HISTH4H, HIST1H4I, HIST1H4J, HIST1H4K, HIST1H4L y H44, incluyendo particularmente HIST4H4 y H5.
De acuerdo con la primera modalidad de la presente invención, la secuencia de ácido nucleico de la invención comprende una región de codificación, que codifica de preferencia para un péptido o proteína. Preferiblemente, la proteína codificada no es una proteína reportera (por ejemplo, luciferasa, Proteína Fluorescente Verde (GFP), Proteína Fluorescente Verde Mejorada (EGFP), -galactosidasa) y ninguna proteína marcadora o de selección (por ejemplo, alfa-globina, galactosidasa y xantina: guanina fosforribosil transferasa (GPT)). De preferencia, la secuencia de ácido nucleico de la invención no conti ene una secuencia de gen Neo (bacteriana) (gen de resistencia a neomicina).
El ácido nucleico de la invención como el definido arriba, comprende o codificada para a) una región de codificación, que codifica de preferencia para un péptido o proteína; b) al menos un tallo-asa de histona, y c) opcionalmente una secuencia poli(A) o señal de poliadenilación; de preferencia para incrementar el nivel de expresión de una proteína codificada, en donde la proteína codificada de preferencia no es una proteína de histona, no es una proteína reportera y/o no es una proteína marcadora o de selección, como las definidas arriba. Los elementos b) a c) del ácido nucleico de la invención se pueden presentar en el ácido nucleico de la invención en cualquier orden, es decir, los elementos a), b) e c) pueden presentarse en el orden a), b) y c) o a), c) y b) de la dirección 5 ' a 3 ' en l a secuencia de ácido nucleico de la invención, en donde elementos adicionales como los descritos en la presente también pueden estar contenidos, tales como una estructura 5 '-CAP, una secuencia poli(C), secuencias de estabilización, secuencias IRES, etc. Cada uno de los elementos a) a c) del ácido nucleico de la invención, particularmente a) en construcciones di- o multicistrónicas y/o cada uno de los elementos b) y c), muy preferiblemente elemento b) también puede repetirse al menos una vez, de preferencia dos veces o más en el ácido nucleico de la invención. Como un ejemplo, el ácido nucleico de la invención puede mostrar sus elementos de secuencia a), b) y opcionalmente c) por ejemplo en el siguiente orden: 5'-región de codificación-tallo-asa de histona-3'; o 5'-región de codificación-región de codificación-tallo-asa de histona-3'; o 5'-región de codificación-IRES-región de codificación-tallo-asa de histona-3'; o 5'-región de codificación-tallo-asa de histona-secuencia poli(A)-3'; o 5'-región de codificación-tallo-asa de histona-señal de poliadenilación-3'; o 5'-región de codificación-región de codificación-tallo-asa de histona-señal de poliadenilación-3'; o 5'-región de codificación-tallo-asa de histona-tallo-asa de histona-3'; o 5'-región de codificación-tallo-asa de histona-tallo-asa de histona-secuencia poli(A)-3'; o 5'-región de codificación-tallo-asa de histona-tallo-asa de histona-señal de poliadenilación-3'; o 5'-región de codificación-tallo-asa de histona-secuencia poli(A)-tallo-asa de histona-3'; o 5'-región de codificación-secuencia poli(A)-tallo-asa de histona-3 '; o 5 ' -región de codificación-secuencia poli(A)-tallo-asa de histona-tallo-asa de histona-3 ' ; etc.
En este contexto se prefiere particularmente que la molécula de ácido nucleico de la invención comprenda o codifique para a) una región de codificación, que codifique de preferencia para un péptido o proteína; b) al menos un tallo-asa de histona y c) una secuencia poli(A) o secuencia de poliadenilación; de preferencia para incrementar el nivel de expresión de una proteína codificada, en donde la proteína codificada de preferencia no es proteína de histona, no es proteína reportera (por ej emplo, luciferasa, GFP, EGFP, /3-galactosidasa, particularmente EGFP) y/o no es proteína marcadora o de selección (por ej emplo, alfa-globina, galactosidasa y xantina:guanina fosforribosil transferasa (GPT)).
En un aspecto preferido más de la primera modalidad de la molécula de ácido nucleico de la invención como la definida en la presente también se puede presentar en forma de un ácido nucleico modificado .
De acuerdo con un aspecto de la primera modalidad, la molécula de ácido nucleico de la invención como la definida aquí puede ser provista como un "ácido nucleico estabilizado", de preferencia como un ARN estabilizado, muy preferiblemente como un ARN que es esencialmente resistente a degradación in vivo (por ej emplo, por una exo o endo-nucleasa).
En este contexto, la molécula de ácido nucleico de la invención como la definida en la presente puede contener análogos/modificaciones de nucleótidos, por ejemplo, modificaciones de esqueleto, modificaciones de azúcar o modificaciones de bases. Una modificación de esqueleto en relación con la presente invención es una modificación en la cual los fosfatos del esqueleto de los nucleótidos contenidos en la molécula de ácido nucleico de la invención como la definida aquí se modifican químicamente. Una modificación de azúcar en relación con la presente invención es una modificación química del azúcar de los nucleótidos de la molécula de ácido nucleico de la invención como la definida aquí. Además, una modificación de base en relación con la presente invención es una modificación química de la porción de base de los nucleótidos de la molécula de ácido nucleico de la molécula de ácido nucleico de la invención. En este contexto análogos o modificaciones de nucleótidos se seleccionan de preferencia de análogo de nucleótidos que son aplicables para transcripción y/o traducción.
En un aspecto preferido particular de la primera modalidad de la presente invención los análogos/modificaciones de nucleótidos definidos aquí se seleccionan de modificaciones de bases que incrementan además la expresión de la proteína codificada y que se seleccionan de preferencia de 2-amino-6-cloropurinribósido-5 ' -trifosfato, 2-aminoadenosin-5 ' -trifosfato, 2-tiocitidin-5 ' -trifosfato, 2-tiouridin-5 ' -trifosfato, 4-tiouridin-5 ' -trifosfato, 5 -aminoalilcitidin- 5 ' -trifosfato, 5 -aminoaliluridin-5 ' -trisofato, 5-bromocitidin-5 ' -trifosfato, 5-bromouridin-5 ' -trifosfato, 5-yodocitidin-5 ' -trifosfato, 5-yodouridin-5 ' -trifosfato, 5-metilcitidin-5 ' -tyrifosfato, 5 ' -metiluridin-5 ' -trifosfato, 6-azacitidin-5 '-trifosfato, 6-azauiridin-5 ' -trisofato, 5 ' -metiluridin-5 ' -trifosfato, 6-azacitidin-5 ' -trifosfato, 6- azauridin-5 ' -trifosfato, 6-cloropurinribósido-5 ' -trifosfato, 7-desazaadenosin-5 ' -trifosfato, 7-desazaguanosin-5 ' -trifosfato, 8-azaadenosin-5 ' -trifosfato, 8 -azidoadenosin-5 ' -trifosfato, bencimidazol-ribosido-5 ' -trifosfato, N l -metiladenosin-5 ' -trifosfato, N l -metilguanosin-5 '-trifosfato, N6-metiladenosin-5 ' -trifosfato, 06-metilguanosin-5 ' -trifosfato, pseudouridin-5 ' -trifosfato, o puromicin-5 ' -trifosfato, xantosin-5 ' -trifosfato. Se da particular preferencia a nucleótidos para modificaciones de bases seleccionados del grupo de nucleótidos modificados en base que consisten en 5-metilcitidin-5 ' -trifosfato, 7-desazaguanosin-5 ' -trifosfato, 5-bromocitidin-5 ' -trifosfato y pseudouridin-5 '-trifosfato .
De acuerdo con un aspecto más, la molécula de ácido nucleico de la invención como la definida aquí puede contener una modificación de lípidos. Este ácido nucleico modificado en lípidos comprende típicamente un ácido nucleico como el definido en la presente. Esta molécula de ácido nucleico modificada en lípidos de la molécula de ácido nucleico de la invención como la definida aquí comprende típicamente además por lo menos un enlazador enlazado covalentemente a esa molécula de ácido nucleico, y al menos un lípido enlazado covalentemente con el enlazador respectivo. Como alternativa, la molécula de ácido nucleico modificada por lípidos comprende al menos una molécula de ácido nucleico como la definida aquí y por lo menos un lípido (bifuncional) enlazado covalentemente (sin un enlazador) con esa molécula de ácido nucleico . De acuerdo con una tercera alternativa, la molécula de ácido nucleico modificada por Hpidos comprende una molécula de ácido nucleico como la definida aquí, al menos un enlazador enlazado covalentemente con la molécula de ácido nucleico, y al menos un lípido enlazado covalentemente con el enlazador respectivo, y también por lo menos un lípido (bifuncional) enlazado covalentemente (sin un enlazador) con esa molécula de ácido nucleico . En este contexto se prefiere particularmente que la modificación de lípido esté presente en los extremos terminales de una secuencia de ácido nucleico de la invención lineal.
De acuerdo con otro aspecto preferido de la primera modalidad de la invención, la molécula de ácido nucleico de la invención como la definida aquí, particularmente si es provista como un ARN(m), puede por lo tanto ser estabilizada contra degradación por RNasas mediante la adición de una llamada estructura "5 ' CAP".
De acuerdo con un aspecto preferido más de la primera modalidad de la invención, la molécula de ácido nucleico de la invención como la definida aquí se puede modificar por una secuencia de al menos 1 0 citidinas, de preferenci a al menos 20 citidinas, muy preferiblemente al menos 30 citidinas (la llamada "secuencia poli(C)"). Particularmente, la molécula de ácido nucleico de la invención puede contener o codificar para una secuencia poli(C) típicamente de alrededor de 10 a 200 nucleótidos de citidina, de preferencia aproximadamente 10 a 100 nucleótidos de citidina, muy preferiblemente alrededor de 1 0 a 70 nucleótidos de citidina o todavía más preferiblemente alrededor de 20 a 50 o incluso 20 a 30 nucleótidos de citidina. Esta secuencia poli(C) se ubica de preferencia 3 ' de la región de codificación comprendida en el ácido nucleico de la invención de acuerdo con la primera modalidad de la presente invención.
De acuerdo con otro aspecto preferido de la primera modalidad de la invención, la molécula de ácido nucleico de la invención como la definida aquí, tiene de preferencia al menos una secuencia de estabilización 5 ' y/o 3 ' . Estas secuencias de estabilización en las regiones no traducidas 5 ' y/o 3 ' tienen el efecto de incrementar la vida media del ácido nucleico del citosol. Estas secuencias estabilizadoras pueden tener 100% de identidad de secuencia con secuencias de origen natural que se presentan en virus, bacterias y eucariontes, pero también pueden ser parcial o completamente sintéticas. Las secuencias no traducidas (UT ) del gen de (alfa)-globina, por ej emplo, de Homo sapiens o Xenopus Laevis pueden mencionarse como un ejemplo de secuencias estabilizadoras que pueden usarse en la presente invención para un ácido nucleico estabilizado. Otro ej emplo de una secuencia estabilizadora tiene la fórmula general (C/U)CCAN,CCC(U/A)PyxUC(C/U)CC (SEQ ID NO: 55), la cual está contenida en las 3 ' -UTRs de las moléculas de ARN muy estables que codifican para (alfa)-globina, colágeno tipo(I), 1 5-lipooxigenasa o para tirosina hidroxilasa (véase Holcik et al. , Proc. Nati . Acad. Sci. E.U.A. 1 997, 94: 241 0 a 2414). Estas secuencias estabilizadoras pueden por supuesto usarse individualmente o en combinación unas con otras y también en combinación con otras secuencias estabilizadoras conocidas por una persona experta en la técnica. En este contexto se prefiere particularmente que la secuencia 3 ' UTR del gen de alfa-globina se ubique 3 ' de la secuencia de codificación comprendida en el ácido nucleico de la invención de acuerdo con l a primera modalidad de la presente invención.
Sustituciones, adiciones o eliminaciones de b ases se llevan a cabo de preferencia con la molécula de ácido nucleico de la invención como la definida aquí , usando la matriz de ADN para la preparación de l a molécula de ácido nucleico mediante técnicas de la mutagénesis dirigida a sitio bien conocida o con una estrategia de ligación de oligonucleótidos (véase, por ej emplo , Maniatis et al. , Molecular Cl oning : A Laboratory Manual , Cold Spring Harbor Laboratory Press, 3a edición, Cold Spring Harbor, NY, 2001 ) . En ese proceso, para la preparación de la molécula de ácido nucleico de la invención como la definida aquí, especialmente si el ácido nucleico está en forma de un ARNm, una molécul a de ADN correspondiente puede ser transcrita in vitro . Esta matriz de ADN comprende de preferencia un promotor adecuado , por ej emplo , un promotor T7 o SP6, para transcripción in vitro , el cual es seguido por la secuencia de nucleótidos deseada para la molécula de ácido nu cleico , por ej emplo , ARNm, que se preparará y una señal de terminación para la transcripción in vitro . La molécul a de ADN que forma la matriz del por lo menos un ARN de interés, puede prepararse mediante proliferación fermentativa y po sterior a aislamiento como parte de un plásmido que puede ser replicado en bacterias . Los plásmidos que pueden mencionarse como adecuados para la presente invención son, por ejemplo, los plásmidos pT7Ts (número de registro GenBank U26404; Lai et al , Development 1 995 , 121 : 2349 a 2360), la serie pGEM®, por ej emplo pGEM®- l (número de registro GenB ank X65300; de Promega) y pSP64 (número de registro GenBank X65327); véase también Mezei y Storts, Purification of PCR Products, in: Griffin and Griffin (ed.), PCR Technology: Current Innovation, CRC Press, Boca Ratón, FL, 2001 .
Las moléculas de ácido nucleico usadas de acuerdo con la presente invención como las definidas aquí pueden prepararse usando cualquier método conocido en la técnica, incluyendo métodos sintéticos tales como, por ej emplo, síntesis en fase sólida, así como métodos in vitro, tales como reacciones de transcripción in vitro o reacciones in vivo, tal como propagación in vivo de plásmidos de ADN en bacterias.
Cualquiera de las modificaciones anteriores puede aplicarse a la molécula de ácido nucleico de la invención como la definida aquí y además a cualquier ácido nucleico según se usa en el contexto de la presente invención y puede ser, si es adecuado o necesario, combinadas entre sí en cualquier combinación, siempre y cuando estas combinaciones de modificaciones no interfieran unas con otras en el ácido nucleico respectivo . Una persona experta en la técnica será capaz de adoptar esta elección en consecuencia.
La molécula de ácido nucleico de la invención como la definida aquí así como proteínas o péptidos como los codificados por esta molécula de ácido nucleico pueden comprender fragmentos o variantes de esas secuencias. Esos fragmentos o variantes pueden comprender típicamente una secuencia que tenga una identidad de secuencia con uno de los ácidos nucleicos mencionados arriba, o con una de las proteínas o péptidos o secuencias, si son codificados por la por lo menos una molécula de ácido nucleico, de al menos 5 %, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, preferiblemente al menos 70%, muy preferiblemente al menos 80%, igualmente muy preferiblemente al menos 85%, aún más preferiblemente al menos 90% y demasiado preferiblemente por lo menos 95% o incluso 97%, 98% o 99%, con la secuencia tipo silvestre completa, ya sea a nivel de ácido nucleico o a nivel de aminoácidos.
En un aspecto preferido más de la primera modalidad de la presente invención la secuencia de ácido nucleico de la invención está asociada con un vehículo, agente de transfección o formación de complejos para incrementar la eficiencia de transfección de la secuencia de ácido nucleico de la invención. Los agentes particularmente preferidos en este contexto adecuados para incrementar la eficiencia de transfección son compuestos catiónicos o policatiónicos, incluyendo protamina, nucleolina, espermina o espermidina, u otros péptidos o proteínas catiónicos, tal es como poli-L-lisina (PLL), poli-arginina, polipéptidos básicos, péptidos penetradores de células (CPPs), incluyendo péptidos de unión a VIH, VIH- 1 Tat (VIH), péptidos derivados de Tat, penetratina, péptidos derivados de VP22 o análogos, VP22 de HSV (herpes simple), MAP, KALA o dominios de transducción de proteínas (PTDs), PpT620, péptidos ricos en prolina, péptidos ricos en arginina, péptidos ricos en lisina, MPG-péptidos, Pep- 1 , L-oligómeros, péptidos de calcitonina, péptidos derivados de antenapedia (particularmente de Drosophila antennapedia), pAntp, plsl, FGF, lactoferrina, Transportan, Buforin-2, Bac71 5-24, SynB, Synb( l ), pVEC, péptidos derivados de hCT, SAP, o histonas. Las proteínas o péptidos catiónicos o policatiónicos preferidos adicionalmente pueden seleccionarse de las siguientes proteínas o péptidos que tienen la siguiente fórmula total : (Arg)i; (Lys)m; (His)n; (Orn)0; (Xaa)x, en donde l + m + n + o + x = 8- 1 5 y 1, m, n u o independientemente unos de otros pueden ser cualquier número seleccionado de 0, 1 , 2, 3 , 4,, 5 , 6, 7, 8, 9, 1 0, 1 1 , 12, 1 3 , 14 ó 1 5 , siempre y que el contenido total de Arg, Lys, His y Orn representa al menso 50% de todos los aminoácidos del oligopéptido, y Xaa puede ser cualquier aminoácido seleccionado de aminoácidos nativos (= de origen natural) o no nativos excepto de Arg, Lys, His u Orn; y x puede ser cualquier número seleccionado de 0, 1 , 2, 3 ó 4, siempre y cuando el contenido total de Xaa no exceda 50% de todos los aminoácidos del oligopéptido. Los péptidos catiónicos que se prefieren particularmente en este contexto son, por ej emplo, Arg7, Arg8, Arg9, H3R9> R9H3, H3R9H3, YSSR9SSY, (RKH)4, Y(RKH)2R, etc. Compuestos catiónicos o policatiónicos preferidos adicionales que se pueden usar como agente de transfección pueden incluir polisacáridos catiónicos, por ejemplo, quitosan, polibreno, polímeros catiónicos, por ejemplo, polietilenimina (PEI), lípidos catiónicos, por ej emplo, DOTMA : cloruro de [ l -(2,3 -sioleiloxi)propil)]-N,N,N-trimetilamonio, DM IE, di-C 14-amidina, DOTIM, SAINT, DC-Chol, BGTC, CTAP, DOPC, DODAP, DOPE : dioleil fosfatidiletanol-amina, DOSPA, DODAB, DOIC, DMEPC, DOGS : dioctadecilamidoglicilespermin, DIMRI: bromuro de amonio de dimiristo-oxipropildimetilhidroxietilo, DOTAP : dioleiloxi-3 -(trimetilamonio)propano, DC-6- 14 : cloruro de ?,?-ditetradecanoil-N-(o!-trimetilamonioacetil)dietanolamina, CLIP I : cloruro de rac-[(2,3 -dioctadeciloxipropil)(2-hidroxietil)] -dimetilamonio, CLIP 9 : rac-[2(2,3 -dihexadeciloxipropil-oxisucciniloxi)etil] -trimetilamonio, oligofectamina o polímeros catiónicos o policatiónicos, por ejemplo, poliaminoácidos modificados, tales como polímeros de /3-aminoácidos o poliamidas inversas, etc. , polietilenos modificados, tales como bromuro de PVP (bromuro de poli(N-etil-4-vinilpiridinio)), etc. , acrilatos modificados, tales como tales como pDMAEMA (metacrilato de poli(dimetilaminoetilo), etc., amidoaminas modificadas tales como pAMAM (poli(amidoamina)), etc., polibetaaminoéster modificado (PBAE), tal como polímeros de acrilato de 1 ,4-butanodiol-co-5 -amino- l -pentanol modificados en el extremo con diamina, etc. , dendrímeros, tales como dendrímeros de polipropilamina o dendrímeros a base de pAMAM, etc. , poliiminas tales como PEI: poli (etilenimina), poli(propilenimina), etc. , polialilamina, polímeros a base de esqueleto de azúcar, tales como polímeros a base de ciclodextrina, polímeros a base de dextrano, quitosan, etc. , polímeros a base de esqueleto de silano, tales como copolímeros PMOXA-PDMS, etc. , polímeros de bloques que consisten en una combinación de uno o más bloques catiónicos (por ej emplo seleccionados de un polímero catiónico como el mencionado arriba) y de uno o más bloques hidrófilos o hidrófobos (por ejemplo, polietilenglicol); etc.
Se prefiere que la secuencia de ácido nuclei co de la invención sea provista ya sea en forma desnuda o acomplej ada, por ej emplo, por compuestos policatióicos de cualquier estructura química, de preferencia polipéptidos policatiónicos o compuestos policatiónicos sintéticos. Preferiblemente, la secuencia de ácido nucleico no se proporciona junto con una célula de empaque.
De acuerdo con una modalidad más, la presente invención también proporciona un método para incrementar el nivel de expresión de una proteína/péptido codificado que comprende las etapas de, por ejemplo, a) proporcionar el ácido nucleico de la invención como el definido aquí, b) aplicar o administrar el ácido nucleico de la invención que codifique para una proteína o péptido como el definido en la presente a un sistema de expresión, por ej emplo, a un sistema de expresión libre de células, una célula (por ej emplo, una célula hospedera de expresión o una célula somática), un tejido o un organismo. El método puede ser aplicado para laboratorio, para investigación, para diagnóstico, para producción comercial de péptidos o proteínas y/o para efectos terapéuticos. En este contexto, típicamente después de preparar el ácido nucleico de la invención como el definido aquí, se aplica o administra típicamente a un sistema de expresión libre de células, una célula (por ej emplo, una célula hospedera de expresión o una célula somática), un tejido o un organismo, de preferencia en forma desnuda o como una composición farmacéutica o vacuna como se describe aquí, preferiblemente por medio de transfección o usando cualquiera de los modos de administración descritos aquí. El método se puede llevar a cabo in vitro, in vivo o ex vivo. El método se puede llevar a cabo además en el contexto del tratamiento de una enfermedad específica, de preferencia como la definida aquí .
En este contexto, in vitro se define en la presente como la transfección o transducción del ácido nucleico de la invención en células en cultivo fuera de un organismo; in vivo se define aquí como transfección o traducción del ácido nucleico de la invención en células mediante la aplicación del ácido nucleico de la invención al organismo o individuo completo, y ex vivo se define aquí como transfección o transducción del ácido nucleico de la invención en células fuera de un organismo o individuo y la aplicación subsecuente de las células transfectadas al organismo o individuo .
Asimismo, de acuerdo con otra modalidad, la presente invención también proporciona el uso del ácido nucleico de la invención como el definido aquí, de preferencia para efectos de diagnóstico o terapéuticos, para incrementar el nivel de expresión de una proteína/péptido codificada, por ej emplo, al aplicar o administrar el ácido nucleico de la invención que codifica para una proteína o péptido como el definido aquí, por ej emplo, un sistema de expresión libre de células, una célula (por ej emplo una célula hospedera de expresión o una célula somática) un tejido o un organismo. El uso se puede aplicar para propósitos de laboratorio, investigación, diagnóstico para producción comercial de péptidos o proteínas y/o terapéuticos. En este contexto, típicamente después de preparar el ácido nucleico de la invención como el definido aquí, se aplica o administra típicamente a un sistema de expresión libre de células, una célula (por ejemplo, una célula hospedera de expresión o una célula somática), un tejido o un organismo, de preferencia en forma desnuda o en forma acomplej ada, o como una composición farmacéutica o vacuna como la descrita aquí, preferiblemente por medio de transfección o al usar cualquiera de los modos de administración como los descritos en la presente. El uso se puede llevar a cabo in vitro, in vivo o ex vivo. El uso puede llevarse a cabo además en el contexto del tratamiento de una enfermedad específica, preferiblemente como la definida aquí.
En otra modalidad más la presente invención se refiere también a un sistema de expresión de la invención que comprende un ácido nuclei co o vector de expresión o plásmido de la invención de acuerdo con la primera modalidad de la presente invención. En este contexto el sistema de expresión puede ser un sistema de expresión libre de células (por ejemplo, un sistema de transcripción/traducción in vitro), un sistema de expresión celular (por ej emplo, células de mamífero tales como células CHO, células de insecto, células de levadura, células bacterianas tales como E. coli) u organi smos usados para expresión de péptidos o proteínas (por ej emplo, plantas o animales tales como vacas) .
Además, de acuerdo con otra modalidad, la presente invención se refiere también al uso del ácido nucleico de la invención como el definido en la presente, en la preparación de una composición farmacéutica para incrementar el nivel de expresión de una proteína/péptido codificado, por ej emplo, para tratar una enfermedad como la definida aquí, por ej emplo al aplicar o administrar el ácido nucleico de la invención como el definido aquí a una célula (por ej emplo, una célula hospedera de expresión o una célula somática), un tej ido o un organismo, de preferencia en forma desnuda o forma acomplej ada o como una composición farmacéutica o vacuna como la descrita en la presente, muy preferiblemente usando cualquiera de los modos de administración como los descritos aquí .
En consecuencia, en una modalidad preferida particular, la presente invención también proporciona una composición farmacéutica que comprende el ácido nucleico de la invención como el definido en la presente y opcionalmente un portador y/o vehículo farmacéuticamente aceptable.
Como un primer ingrediente, la composición farmacéutica de la invención comprende el ácido nucleico de la invención como el definido aquí.
Como un segundo ingrediente la composición farmacéutica de la invención puede comprender al menos un componente farmacéuticamente activo adicional . Un componente farmacéuticamente activo en este contexto es un compuesto que tiene un efecto terapéutico para sanar, disminuir o prevenir una indicación o enfermedad particular como la mencionada en la presente, de preferencia enfermedades cancerosas, enfermedades autoinmunes, alergias o enfermedades infecciosas, enfermedades cardiovasculares, enfermedades del sistema respiratorio, enfermedades del sistema digestivo, enfermedades de la piel, trastornos musculoesqueléticos, trastornos del tej ido conectivo, neoplasmas, deficiencias inmunológicas, enfermedades endocrinas, nutri cionales y metabólicas, enfermedades neurales, enfermedades oculares, enfermedades ópticas y enfermedades hereditarias. Estos compuestos incluyen, sin implicar ninguna limitación, péptidos o proteínas, de preferencia como los definidos aquí, ácidos nucleicos, de preferencia como los definidos en la presente, compuestos orgánicos o inorgánicos de baj o peso molecular (terapéuticamente activos) (peso molecular de menos de 5 ,000, de preferencia menos de 1 ,000), azúcares, antígenos o anticuerpos, de preferencia como los definidos en la presente, agentes terapéuticos ya conocidos en la técnica anterior, células antigénicas, fragmentos celulares antigénicos, fracciones celulares; componentes de pared celular (por ej emplo, polisacáridos), patógenos modificados, atenuados o desactivados (por ej emplo, químicamente o por irradiación) (virus, bacterias, etc.), adyuvantes, de preferencia como los definidos en la presente, etc.
Además, la composición farmacéutica de la invención puede comprender un portador y/o vehículo farmacéuticamente aceptable. En el contexto de la presente invención, un portador farmacéuticamente aceptable incluye típicamente la base líquida o no líquida de la composición farmacéutica de la invención. Si la composición farmacéutica de la invención se proporciona en forma líquida, el portador típicamente será agua libre de pirógenos; solución salina isotónica o soluciones de pH regulado (acuosas), por ej emplo, soluciones de pH regulado con fosfato, citrato, etc. El regulador de pH de inyección puede ser hipertónico, isotónico o hipotónico con referencia al medio de referencia específico, es decir, el regulador de pH puede tener un contenido de sal más alto, idéntico o más bajo con referencia al medio de referencia específico, en donde de preferencia estas concentraciones de las sales mencionadas antes pueden usarse, las cuales no lleven al daño de células debido a osmosis u otros efectos de concentración. Los medios de referencia son, por ej emplo, líquidos que se presentan en métodos "in vivo", tales como sangre, linfa, líquidos citosólicos u otros líquidos corporales, por ej emplo, líquidos que pueden usarse como medios de referencia en métodos "in vitro", tales como reguladores de pH o líquidos comunes. Estos reguladores de pH o líquidos comunes se conocen por una persona capacitada. La solución de lactato de Ringer se prefiere particularmente como una base líquida.
Sin embargo, una o más cargas o diluyentes o compuestos encapsulantes sólidos o líquidos compatibles pueden usarse también para la composición farmacéutica de la invención, los cuales sean adecuados para su administración a un paciente que será tratado . El término "compatible" según se usa en la presente significa que estos constituyentes de la composición farmacéutica de la invención son capaces de ser mezclados con el ácido nucleico de la invención como el definido aquí de tal manera que no ocurra una interacción que pudiera reducir sustancialmente la efectividad farmacéutica de la composición farmacéutica de la invención bajo condiciones de uso típicas.
De acuerdo con un aspecto específico, la composición farmacéutica de la invención puede comprender un adyuvante. En este contexto, un adyuvante puede entenderse como cualquier compuesto que sea adecuado para iniciar o incrementar una respuesta inmunológica del sistema inmunológico innato, es decir, una respuesta inmunológica no específica. En otras palabras, cuando se administra, la composición farmacéutica de la invención desarrolla preferiblemente una respuesta inmunológica innata gracias al adyuvante contenido opcionalmente en la misma. De preferencia, ese adyuvante puede seleccionarse de un adyuvante conocido por una persona experta y adecuado para el presente caso, es decir, soportar la inducción de una respuesta inmunológica innata en un mamífero, por ej emplo, una proteína adyuvante como la definida arriba o un adyuvante como el definido a continuación.
Se prefieren particularmente como adyuvantes adecuados para depósito y suministro los compuestos catiónicos o policatiónicos como los definidos arriba para la secuencia de ácido nucleico de la invención como vehículo, agente de transfección o formación de complej os.
La composición farmacéutica de la invención puede contener además una o más sustancias auxiliares para incrementar así su inmunogenicidad o capacidad inmunoestimuladora, si se desea. Una acción sinérgica del ácido nucleico de la invención como el definido aquí y de una sustancia auxiliar, que puede estar contenido opcionalmente en la composición farmacéutica de la invención, se logra de preferencia de esta manera. Dependiendo de los diferentes tipos de sustancias auxiliares, varios mecanismos pueden entrar en consideración a este respecto . Por ej emplo, compuestos que permitan la maduración de células dendríticas (DCs), por ej emplo lipopolisacáridos, TNF-alfa o ligando CD40, forman una primera clase de sustancias auxiliares adecuadas. En general, es posible usar como sustancia auxiliar cualquier agente que influencie el sistema inmunológico de la manera de una "señal de peligro" (LPS, GP96, etc.) o citocinas, tales como GM-CFS, que permitan que se incremente y/o influencie una respuesta inmunológica de una manera seleccionada. Las sustancias auxiliares particularmente preferidas son citocinas, tales como monocinas, linfocinas, interleucinas o quimiocinas, que promueven más la respuesta inmunológica innata, tales como IL- 1 , IL-2, IL-3, IL-4, IL-5 , IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL- 1 0, IL- 12, IL- 1 3 , IL- 14, IL- 1 5 , IL- 16, IL- 1 7, IL- 1 8, IL- 1 9, IL-20, IL-21 , IL-22 , IL-23 , IL-24, IL-25, IL-26, IL-27, IL-28 , IL-29, IL-30, IL-3 1 , IL-32, IL-33 , IFN-alfa, IFN-beta, IFN-gamma, GM-CSF, G-CSF, M-CSF, LT-beta o TNF-afla, factores de crecimiento, tales como hGH.
Aditivos adicionales que pueden incluirse en la composición farmacéutica de la invención son emulsionantes, tales como, por ejemplo, Tween®; agentes humectantes, tales como, por ej emplo, lauril sulfato de sodio ; agentes colorantes; agentes de impartición de sabor, portadores farmacéuticos; agentes formadores de tableta; estabilizadores; antioxidantes y conservadores.
La composición farmacéutica de la invención también puede contener además cualquier compuesto adicional que se sepa sea inmunoestimulador gracias a su afinidad de unión (como ligandos) a receptores tipo Toll humanos TLR l , TLR2, TLR3 , TLR4, TLR5 , TLR6, TLR7, TLR8 , TLR9, TLR 10, o gracias a su afinidad de unión (como ligandos) a receptores tipo Toll de murino TLRl , TLR2, TLR3 , TLR4, TLR5 , TLR6, TLR7, TLR8 , TLR9, TLR 10, TLR l 1 , TLR 12 o TLR 1 3.
La composición farmacéutica de la invención se puede administrar oralmente, parenteralmente, por spray de inhalación, tópicamente, rectalmente, nasalmente, bucalmente, vaginalmente, o por medio de un depósito implantado. El término parenteral según se usa aquí incluye técnicas de inyección o infusión subcutánea, intravenosa, intramuscular, intraarticular, intrasinovial, intraesternal, intratecal, intrahepática, intralesional, intracraneal, transdémica, intradérmica, intrapulmonar, intraperitoneal , intracardiaca, intraarterial y sublingual.
De preferencia, la composición farmacéutica de la invención puede administrarse mediante inyección parenteral, muy preferiblemente mediante técnicas de inyección subcutánea, intravenosa, intramuscular, intra-articular, intra-sinovial, intraesternal, intratecal, intrahepática, intralesional, intracranial, transdérmica, intradérmica, intrapulmonar, intraperitoneal, intracardiaca, intra-arterial y sublingual o por medio de técnicas de infusión.
Se prefiere particularmente la inyección transdérmica e intramuscular. Formas inyectables estériles de las composiciones farmacéuticas de la invención pueden ser suspensión acuosa u oleaginosa. Estas suspensiones pueden formularse de acuerdo con técnicas conocidas en la técnica usando agentes de dispersión o humectación adecuados y agentes de suspensión.
La composición farmacéutica de la invención como la definida aquí también se puede administrar oralmente en cualquier forma de dosificación oralmente aceptable incluyendo, pero no limitada a, cápsulas, tabletas, suspensiones o soluciones acuosas.
La composición farmacéutica de la invención también se puede administrar tópicamente, especialmente cuando el obj etivo de tratamiento incluya áreas u órganos fácilmente accesibles mediante aplicación tópica, por ej emplo, incluyendo enfermedades de la piel o de cualquier otro tej ido epitelial accesible. Las formulaciones tópicas adecuadas se preparan fácilmente para cada una de estas áreas u órganos. Para aplicaciones tópicas, la composición farmacéutica de la invención puede formularse en una pomada adecuada, que contenga el ácido nucleico de la invención como el definido aquí suspendido o disuelto en uno o más portadores.
La composición farmacéutica de la invención comprende típicamente una "cantidad segura y efectiva" de los componentes de la composición farmacéutica de la invención, particularmente del ácido nucleico de la invención como el definido aquí. Según se usa en la presente, una "cantidad segura y efectiva" significa una cantidad del ácido nucleico de la invención como el definido en la presente de tal manera que sea suficiente para reducir significativamente una modificación significativa de una enfermedad o trastorno como el definido aquí. Al mismo tiempo, sin embargo, una "cantidad segura y efectiva" es lo suficientemente pequeña como para evitar serios efectos secundarios y permitir una relación sensible entre ventaj a y riesgo. La determinación de estos límites se encuentra típicamente dentro del alcance del juicio médico sensible.
La composición farmacéutica de la invención puede usarse para propósitos médicos humanos y también veterinarios, de preferencia para propósitos médicos en humanos, como una composición farmacéutica en general o como una vacuna.
De acuerdo con otra modalidad particularmente preferida, la composición farmacéutica de la invención (o el ácido nucleico de la invención como el definido aquí) puede ser provista o usada como una vacuna. Típicamente, esta vacuna es como se definió arriba para composiciones farmacéuticas.
Además, esta vacuna contiene típicamente el ácido nucleico de la invención como el definido en la presente, el cual codifica de preferencia para un antígeno como el definido arriba. Como alternativa, esta vacuna puede contener el ácido nucleico de la invención como el definido aquí y un antígeno adicional, de preferencia como una proteína o péptido o como un ácido nucleico que codifique para un antígeno, por ej emplo, como se define en la presente, o como cualquier formato antigénico como el definido en la presente o todas las combinaciones posibles de los mismos.
La vacuna de la invención también puede comprender un portador, adyuvante y/o vehículo farmacéuticamente aceptable como el definido en la presente para la composición farmacéutica de la invención. En el contexto específico de la vacuna de la invención, la opción de un portador farmacéuticamente aceptable se determina en principio por la manera en la cual la vacuna de la invención se administre. La vacuna de la invención puede administrarse, por ej emplo, sistémicamente o localmente. Las rutas para administración sistémica en general incluyen, por ejemplo, rutas transdérmica, oral, parenteral, incluyendo inyecciones subcutáneas, intravenosas, intramusculares, intraarteriales, intradérmicas e intraperitoneales y/o rutas de administración intranasal . Las rutas para administración local en general incluyen, por ej emplo, rutas de administración tópica pero también inyecciones intradérmicas, transdérmicas, subcutáneas o intramusculares o inyecciones intralesionales, intracraneales, intrapulmonares, intracardiacas y sublinguales. Muy preferiblemente, las vacunas pueden administrarse por una ruta intradérmica, subcutánea o intramuscular. Las vacunas de la invención se formulan por lo tanto de preferencia en forma líquida (o algunas veces en sólida).
La vacuna de la invención puede contener además una o más sustancias auxiliares para incrementar su inmunogenicidad o capacidad inmunoestimuladora, si se desea. Se prefieren particularmente adyuvantes como sustancias auxiliares o aditivos como los definidos para la composición farmacéutica.
La presente invención proporciona además varias aplicaciones y usos del ácido nucleico de la invención como el definido aquí, la composición farmacéutica de la invención, la vacuna de la invención, ambos comprendiendo el ácido nucleico de la invención como el definido en la presente o de kits que comprenden los mismos.
De acuerdo con una modalidad específica, la presente invención está dirigida al primer uso médico del ácido nucleico de la invención como el definido en la presente como un medicamento, de preferencia como un agente inmunoestimulador, adyuvante o vacuna o en el campo de terapia génica.
De acuerdo con otra modalidad, la presente invención está dirigida al segundo uso médico del ácido nucleico como el definido en la presente, para el tratamiento de enfermedades como las definidas aquí, de preferencia al uso del ácido nucleico de la invención como el definido en la presente, de una composición farmacéutica o vacuna que comprende el mismo o de kits que comprenden al mismo en la preparación de un medicamento para la profilaxis, tratamiento y/o reducción de varias enfermedades como las definidas en la presente. De preferencia, la composición farmacéutica o vacuna se usa o se administrará a un paciente que la requiera para este propósito .
Preferiblemente, las enfermedades mencionadas en la presente se seleccionan de cáncer o enfermedades tumorales, enfermedades infecciosas, de preferencia enfermedades infecciosas (virales, bacterianas o protozoológicas), enfermedades autoinmunes, alergias o enfermedades alérgicas, enfermedades monogenéticas, es decir, enfermedades (hereditarias), o enfermedades genéticas en general, enfermedades que tengan un antecedente genético heredado y que sean causadas típicamente por un defecto génico definido y se hereden de acuerdo con las leyes de Mendel, enfermedades cardiovasculares, enfermedades neuronales, enfermedades del sistema respiratorio, enfermedades del sistema digestivo, enfermedades de la piel, trastornos musculoesqueléticos, trastornos del tejido conectivo, neoplasmas, deficiencias inmunológicas, enfermedades endocrinas, nutricionales y metabólicas, enfermedades oculares, enfermedades ópticas y cualquier enfermedad que pueda ser influenciada por la presente invención.
Las enfermedades cancerosas o tumorales como las mencionadas arriba incluyen de preferencia por ej emplo carcinomas de colon, melanomas, carcinomas renales, linfomas, leucemia mieloide aguda (AML), leucemia linfoide aguda (ALL), leucemia mieloide crónica (CML), leucemia linfocítica crónica (CLL), tumores gastrointestinales, carcinomas pulmonares, gliomas, tumores de tiroides, carcinomas mamarios, tumores de próstata, hepatomas, varios tumores inducidos por virus tales como, por ej emplo, carcinomas inducidos por virus de papiloma (por ej emplo, carcinoma cervical), adenocarcinomas, tumores inducidos por virus del herpes (por ej emplo, linfoma de Burkitt, linfoma de células B inducido por EBV), tumores inducidos por hepatitis B (carcinoma hepatocelular), linfomas inducidos por HTLV- 1 y HTLV-2, neuromas/neurinomas acústicos, cáncer cervical, cáncer pulmonar, cáncer faríngeo, carcinomas anales, glioblastomas, linfomas, carcinomas rectales, astrocitomas, tumores cerebrales, cáncer de estómago, retinoblastomas, basaliomas, metástasis cerebrales, meduloblastomas, cáncer vaginal, cáncer pancreático, cáncer testicular, melanomas, carcinomas de tiroides, cáncer de vejiga, síndrome de Hodgkin, meningiomas, enfermedad de Schneeberger, carcinomas bronquiales, tumor de hipófisis, micosis fungoides, cáncer esofágico, cáncer de mama, carcinoides, neurinomas, espinaliomas, linfomas de Burkitt, cáncer de laringe, cáncer renal, timomas, carcinomas de cuerpo, cáncer de hueso, linfomas no Hodgkin, cáncer uretral, síndrome CUP, tumores de cuello/cabeza, oligodendrogliomas, cáncer vulvar, cáncer intestinal, carcinomas de colon, carcinomas esofágicos, implicaciones de verrugas, tumores del intestino delgado, craniofaringeomas, carcinomas ováricos, tumores/sarcomas de tej idos blandos, cáncer ovárico, cáncer hepático, carcinomas pancreáticos, carcinomas cervicales, carcinomas endometriales, metástasis de hígado, cáncer penil, cáncer de lengua, cáncer de vesícula biliar, leucemia, plasmocitomas, cáncer uterino, tumor de párpado, cáncer de próstata, etc.
Además, en el contexto anterior, las enfermedades infecciosas se seleccionan de preferencia de influenza, malaria, SARS, fiebreamarilla, SIDA, borreliosis de Lyme, Leishmaniasis, meningitis por ántrax, enfermedades infecciosas virales tales como SIDA, condiloma acuminata, verrugas huecas, fiebre de Dengue, fiebre de tres días, virus del Ébola, resfriado, meningoencefalitis deverano temprana (FSME), gripe, herpes zóster, hepatitis, herpes simple tipo I, herpes simple tipo II, herpes zoster, influenza, encefalitis Japonesa, fiebre de Lassa, virus de Marburg, sarampión, enfermedad de fiebre aptosa, mononucleosis, paperas, infección por virus de Norwalk, fiebre glandular de Pfeiffer, viruela, polio (coj era en la niñez), pseudo-crup, enfermedad quinta, rabia, verrugas, fiebre del Nilo Occidental, viruela, virus citomegálico (CMV), enfermedades infecciosas bacterianas tales como aborto (inflamación de la próstata), ántrax, apendicitis, borreliosis, botulismo, Camphylobacter, Chlamydia trachomatis (inflamación de la uretra, conjuntivitis), cólera, difteria, donavanosis, epiglotitis, fiebre de tifo, gangrena gaseosa, gonorrea, fiebre de conej o, Heliobacter pylori, tos silvante, bubo climático, osteomielitis, enfermedad del Legionario, lepra, listeriosis, neumonía, meningitis, meningitis bacteriana, ántrax, otitis media, micoplasma hominis, sepsis neonatal (corioamnionitis), noma, paratifo, plaga, síndrome de Reiter, fiebre manchada de las Montañas Rocallosas, paratifo por salmonella, tifo por salmonella, fiebre escarlata, sífilis, tétanos, enfermedad de tsutsugamushi, tuberculosis, tifus, vaginitis (colpitis), chancro suave y de enfermedades infecciosas causadas por parásitos, protozoarios u hongos, tales como amibiásis, bilharziosis, enfermedad de Chagas, pie de atleta, machas por hongos de levadura, escabies, malaria, oncocercosis (ceguera de río) o enfermedades fúngicas, toxoplasmosis, tricomoniasis, tripanosomiasis (enfermedad del sueño), Leishmaniosis visceral, dermatitis por braga/pañal, esquistosomiasis, envenenamiento por pescado (Ciguatera), candidosis, Leishmaniosis cutánea, lambliasis (giardiasis) o enfermedad del sueño, o de enfermedades infecciosas causadas por equinococos, tenia de pescado, tenia de zorro, tenia de caninos, pioj os, tenia de bovino, tenia de porcina, teni a en miniatura.
Además, en el contexto anterior, las alergias resultan normalmente en una respuesta inflamatoria local o sistémica a estos antígenos o alérgenos y lleva a inmunidad en el cuerpo contra estos alérgenos. Los alérgenos en este contexto incluyen, por ej emplo, céspedes, pólenes, mohos, fármacos o numerosos desencadenadores ambientales, etc. Sin estar limitados a teoría, varios mecanismos de enfermedad diferentes se supone que están implicados en el desarrollo de alergias. De acuerdo con un esquema de clasificación por P. Gell y R. Coombs la palabra "alergia" fue restringida a hipersensibilidades tipo I, las cuales son causadas por el mecanismo IgE clásico. La hipersensibilidad tipo I se caracteriza por excesiva activación de mastocitos y basófilos por IgE, dando como resultado en la respuesta inflamatoria sistémica que puede traducirse en síntomas tan benignos como una nariz irritada, hasta un choque anafiláctico que amenace la vida y la propia muerte. Los tipos conocidos de alergia se incluyen, sin estar limitados a éstos, asma alérgica (que lleva a hinchazón de la mucosa nasal), conjuntivitis alérgica (que lleva a enrojecimiento y comezón de la conjuntiva), rinitis alérgica ("fiebre del heno"), anafilaxis, angioderma, dermatitis atópica (eczema), urticaria, eosinofilia, alergias a picaduras de insectos, alergias de la piel (que llevan a e incluyen varias erupciones, tales como eczema, urticaria y dermatitis por contacto), alergias a alimentos, alergias a medicinas, etc. Con respecto a la presente invención, por ejemplo, un ácido nucleico de la invención, se proporciona una composición farmacéutica o vacuna que codifica o contiene un alérgeno (por ejemplo, de un alérgeno de gato, un alérgeno de polvo, un antígeno de ácaros, un antígeno vegetal (por ej emplo, un antígeno de abedul), etc.), ya sea como una proteína, un ácido nucleico que codifica para ese alérgeno de proteína en combinación con un ácido nucleico de la invención como el definido arriba o como un ácido nucleico de la invención. Una composición farmacéutica de la presente invención puede desplazar la respuesta inmunológica (excedente) a una respuesta TH 1 más fuerte, de esta manera suprimiendo o atenuando la respuesta IgE indeseada.
Además, las enfermedades autoinmunes pueden dividirse ampliamente en trastornos autoinmunes sistémicos y específicos de órganos o localizados, dependiendo de las características clínico-patológicas principales de cada enfermedad. Enfermedades autoinmunes pueden dividirse en las categorías de síndromes sistémicos, incluyendo LES, síndrome de Sjógren, escleroderma, artritis reumatoide y polimiositis o síndromes locales que puedan ser endocrinológicos (DM tipo 1 , tiroiditis de Hashimoto, enfermedad de Addison), dermatológicas (pénfigo vulgar), hematológicas (anemia hemolítica autoinmune), neurales (esclerosis múltiple) o pueden incluir casi cualquier masa circunscrita de tej ido corporal. Las enfermedades autoinmunes que serán tratadas pueden seleccionarse del grupo que consiste en enfermedades autoinmunes tipo I o enfermedades autoinmunes tipo II o enfermedades autoinmunes tipo III o enfermedades autoinmunes tipo IV, tales como, por ej emplo, esclerosis múltiple (MS), artritis reumatoide, diabetes, diabetes tipo I (diabetes mellitus), lupus eritematoso sistémico (LES), poliartritis crónica, enfermedad de Basedow, formas autoinmunes de hepatitis crónica, colitis ulcerosa, enfermedades de alergia tipo I, enfermedades de alergia tipo II, enfermedades de alergias tipo III, enfermedades de alergias tipo IV, fibromialgia, caída de pelo, enfermedad de Bechterew, enfermedad de Crohn, miastenia grave, neurodermitis, polimialgia reumática, esclerosis sistémica progresiva (P S S), psoriasis, síndrome de eiter, artritis reumática, psoriasis, vasculitis, etc. , o diabetes tipo II. Aunque el modo exacto de cómo induce el sistema inmunológico una reacción inmune contra autoantígenos a un ácido elucidado hasta el momento, existen varios descubrimientos con respecto a la etiología. En consecuencia, la autorreacción puede deberse a una derivación de células T. Un sistema inmunológico normal requiere la activación de células B por células T antes de que las primeras puedan producir anticuerpos en grandes cantidades. Este requerimiento de una célula T puede ser derivado en raros casos, tales como infección por organismos que produzcan superantígenos, los cuales sean capaces de iniciar la activación policlonal de células B, o incluso de células T, al unirse directamente a una subunidad de receptores de células T de una forma no específica. Otra explicación deduce enfermedades autoinmunes a partir de un mimetismo molecular. Un antígeno exógeno puede compartir similitudes estructurales con ciertos antígenos hospederos ; así, cualquier anticuerpo producido contra este antígeno (que imite a los auto-antígenos) también puede, en teoría, unirse a los antígenos hospederos y amplificar la respuesta inmunológica. La forma más desconcertante de mimetismo molecular se observa en los estreptococos beta-hemolíticos del grupo A, los cuales comparten antígenos con miocardio humano, y son responsables de las manifestaciones cardiacas de fiebre reumática. La presente invención permite por lo tanto la provisión de un ácido nucleico o composición farmacéutica o vacuna como los definidos en la presente que codifican o contienen por ej emplo un autoantígeno (como proteína, ARNm o ADN que codifica para una proteína de autoantígeno) que permite típicamente que el sistema inmunlógico sea desensibilizado .
De acuerdo con una modalidad más, la presente invención está dirigida al segundo uso médico del ácido nucleico de la invención como el definido en la presente, para el tratamiento de enfermedades como las definidas aquí por medio de terapia génica.
En una modalidad que se prefiere más, el ácido nucleico de la invención puede usarse para la preparación de una composición farmacéutica o una vacuna, particularmente para propósitos como los definidos en la presente.
La composición farmacéutica o vacuna de la invención se puede usar además para el tratamiento de una enfermedad o un trastorno como el definido aquí.
De acuerdo con una modalidad final, la presente invención proporciona también kits, particularmente kits de partes. Estos kits, particularmente kits de partes, comprenden típicamente como componentes solos o en combinación con componentes adicionales como los definidos aquí, por lo menos un ácido nucleico inventivo como el definido en la presente, la composición farmacéutica o vacuna de la invención que comprende el ácido nucleico de la invención. El por lo menos un ácido nucleico de la invención como el definido aquí, opcionalmente en combinación con componentes adicionales como los definidos en la presente, la composición farmacéutica de la invención y/o la vacuna de la invención se pueden presentar en una o diferentes partes del kit. Como un ej emplo, por lo menos al menos una parte del kit puede comprender al menos un ácido nucleico de la invención como el definido aquí, y por lo menos una parte adicional del kit por lo menos otro componente como el definido aquí, por ejemplo, al menos otra parte del kit puede comprender por lo menos una composición farmacéutica o vacuna o una parte de la misma, por ej emplo, al menos una parte del kit puede comprender el ácido nucleico de la invención como el definido en la presente, al menos una parte adicional del kit por lo menos otro componente como el definido en la presente, al menos una parte adicional del kit por lo menos un componente de la composición farmacéutica o vacuna de la invención o la composición farmacéutica o vacuna de la invención completa, y al menos una parte adicional del kit, por ejemplo, al menos un antígeno, por lo menos un portador o vehículo farmacéutico, etc. El kit o partes del kit pueden contener además instrucciones técnicas con información sobre la administración y dosis del ácido nucleico de la invención, de la composición farmacéutica de la invención o la vacuna de la invención o de cualquiera de sus componentes o partes, por ej emplo, si el kit se prepara como un kit de partes.
En la presente invención, si no se indica lo contrario, las características diferentes de alternativas y modalidades pueden combinarse unas con otras. Además, el término "que comprende" no se deberá considerar como significando "que consiste en", si no se menciona específicamente. Sin embargo, en el contexto de la presente invención, el término "que comprende" puede sustituirse con el término "que consiste en", cuando sea aplicable.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Las siguientes figuras intentar ilustrar la invención más y no deberán considerarse como limitativas de la presente invención a la misma.
La figura 1 muestra la secuencia de consenso de tallo-asa de histona generada a partir de secuencias de tallo y asa de metazoarios y protozoarios (como se reporta por Dávila López, M. , y Samuelsson, T. (2008), RNA (Nueva York, N.Y.), 14( 1 ), 1 - 1 0. doi : 10. 1261 /rna.782308). 4,001 Secuencias de tallo-asa de histona de metazoarios y protozoarios fueron alineadas y la cantidad de los nucleótidos que se presentaban se indica para cada posición en la secuencia de tallo-asa. La secuencia de consenso generada que representa todos los nucleótidos presentes en las secuencias analizadas se da usando el código de nucleótido de una sola letra. Además de la secuencia de consenso, las secuencias se muestran representando al menos 99%, 95% y 90% de los nucleótidos presentes en las secuencias analizadas.
La figura 2 muestra la secuencia de consenso de tallo-asa de histona generada a partir de secuencias de tallo y asa de protozoarios (como se reporta por Dávila López, M. , y Samuelsson, T. (2008), RNA (Nueva York, N.Y .), 14( 1 ), 1 - 10: doi: 10.1261 /rna.782308). 1 3 1 Secuencias de tallo-asa de histona de protozoarios fueron alineadas y la cantidad de los nucleótidos que se presentan se indican para cada posición en la secuencia de tallo-asa. La secuencia de consenso generada que representa todos los nucleótidos presentes en las secuencias analizadas se da usando el código de nucleótido de una sola letra. Además de la secuencia de consenso, las secuencias que se muestran representando al menos 99%, 95 % y 90% de los nucleótidos presentes en las secuencias analizadas.
La figura 3 muestra la secuencia de consenso de tallo-asa de histona generada a partir de secuencias de tallo y asa de metazoarios (como se reporta por Dávila López, M. , y Samuelsson, T. (2008), RNA (Nueva York, N.Y.), 14( 1 ), 1 - 1 0. doi : 10. 1261 /ma.782308). 3 ,870 Secuencias de tallo-asa de histona de metazoarios fueron alineadas y la cantidad de los nucleótidos que se presentaban se indica para cada posición en la secuencia de tallo-asa. La secuencia de consenso generada que representa todos los nucleótidos presentes en las secuencias analizadas se da usando el códi go de nucleótidos de letra individual. Además de la secuencia de consenso, se muestran secuencias que representan al menos 99%, 95% y 90% de los nucleótidos presentes en las secuencias analizadas.
La figura 4 muestra la secuencia de consenso de tallo-asa de histona generada a partir de secuencias de tallo-asa de vertebrados (como se reporta por Dávila López, M. , y Samuelsson, T. (2008), RNA (Nueva York, N.Y.), 14( 1 ), 1 - 10. doi : 10. 1261 /ma.782308). 3 ,870 Secuencias de tallo-asa de histona de vertebrados fueron alineadas y la cantidad de los nucleótidos que se presentaban se indica para cada posición en la secuencia de tallo-asa. La secuencia de consenso generada que representa todos los nucleótidos presentes en las secuencias analizadas se da usando el código de nucleótidos de letra individual. Además de la secuencia de consenso, se muestran secuencias que representan al menos 99%, 95% y 90% de los nucleótidos presentes en las secuencias analizadas.
La figura 5 muestra la secuencia de consenso de tallo-asa de histona generada a partir de secuencias de tallo y asa de humano (Homo sapiens) (como se reporta por Dávila López, M., y S amuelsson, T. (2008), RNA (Nueva York, N.Y.), 14( 1 ), 1 - 10. doi : 1 0.1 261 /ma.782308). 3 ,870 Secuencias de tallo-asa de histona de humanos fueron alineadas y la cantidad de los nucleótidos que se presentaban se indica para cada posición en la secuencia de tallo-asa. La secuencia de consenso generada que representa todos los nucleótidos presentes en las secuencias analizadas se da usando el código de nucleótidos de letra individual. Además de la secuencia de consenso, se muestran secuencias que representan al menos 99%, 95% y 90% de los nucleótidos presentes en las secuencias analizadas.
Las figuras 6 a 17 muestran moléculas de ARNm de transcripción in vitro .
Dada la designación y la secuencia de las moléculas de ARNm obtenidas mediante transcripción in vitro. Se usan las siguientes abreviaturas : ppLuc (GC) : secuencia de ARNm enriquecida con GC que codifica para luciferasa de Photinus pyralis ag: región no traducida 3 ' (UTR) del gen de alfa globina A64: secuencia poli(A) con 64 adenilados A 120 : secuencia poli(A) con 120 adenilados histonaS L: tallo-asa de histona aCPSL: tallo y asa que ha sido seleccionado de una biblioteca para su unión específica a la proteína aCP-2KL polioCL: hoj a de trébol 5 ' del ARN genómico del virus de la polio G30: secuencia poli(G) con 30 guanilados U30: secuencia poli(U) con 3 e0 uridilados SL: tallo-asa no específico/artificial N32 : secuencia no específica de 32 nucleótidos dentro de las secuencias, los siguientes elementos son resaltados: ppLuc(GC) ORF (letras mayúsculas, ag (negritas), histonaSL (subrayado), secuencias probadas distintas adicionales (cursivas).
La figura 6 muestra la secuencia de ARNm de ppLuc(GC)-ag (SEQ ID NO : 43).
Mediante linearización del vector original en el sitio de restricción inmediatamente después del 3 ' -UTR (ag), de alfa-globina, se obtiene ARNm que carece de una secuencia poli(A).
La figura 7 muestra la secuencia de ARNm de ppLuc(GC)-ag-A64 (SEQ ID NO: 44).
Mediante linearización del vector original en el sitio de restricción inmediatamente después de la secuencia poli(A) A64, se obtiene ARNm que concluye con una secuencia poli(A) A64.
La figura 8 muestra la secuencia de ARNm de ppLuc(GC)-ag-histonaSL (SEO ID NO: 45).
La secuencia poli(A) A64 se reemplazó por una histonaSL. La secuencia de tallo-asa de histona usada en los ej emplos se obtuvo de Cakmakci et al , (2008). Molecular and Cellular Biology. 28(3 ), 1 1 82- 1 1 94.
La figura 9 muestra la secuencia de ARNm de ppLuc(GC)-ag-A64-histonaSL (SEQ ID NO: 46).
La histonaSL se anexó 3 ' de A64 poli(A).
La figura 10 muestra la secuencia de ARNm de ppLuc(GC)-ag-A 120 (SEQ ID NO : 47).
La secuencia A64 poli(A) se reemplazó por una secuencia A l 20 poli(A).
La figura 1 1 muestra la secuencia de ARNm de ppLuc(GC)-ag-A64-ae (SEQ ID NO : 48).
Una segunda 3 ' -UTR de alfa-globina se anexó 3 ' de A64 poli(A).
La figura 12 muestra la secuencia de ARNm de ppLuc( GO-ag-A64-aCPSL (SEQ ID NO : 49) .
Un tallo y asa se anexó 3' de A64 poli(A). El tallo y asa ha sido seleccionado de una biblioteca para su unión específica de la proteína aCP-2KL (Thisted et al., (2001), The Journal of Biological Chemistry, 276(20), 17484-17496). «CP-2KL Es una isoforma de aCP-2, la proteína CO más fuertemente expresada (proteína de unión a poli(C) de ARNm de alfa-globina) (Makeyev et al, (2000), Genomics, 67(3), 301-316), un grupo de proteínas de unión a ARN que se unen a 3'-UTR de alfa-globina (Chkheidze et al., (1999), Molecular and Cellular Biology, 19(7), 4572-4581).
La figura 13 muestra la secuencia de ARNm de ppLuc(GC)-ag-A64-PolioCL (SEQ ID NO: 50).
La hoja de trébol de 5' del ARN genómico del virus de la polio se anexó 3' de A64 poli(A).
La figura 14 muestra la secuencia de ARNm de ppLuc(GC)-ag-A64-G30 (SEQ ID NO: 51).
Un tramo de 30 guanilados se anexó 3' de A64 poli(A).
La figura 15 muestra la secuencia de ARNm de ppLuc(GC -ag-A64-U30 (SEQ ID NO: 52).
Un tramo de 30 uridilados se anexó 3' de A64 poli(A).
La figura 16 muestra la secuencia de ARNm deppLuc(GC)-ag-A64-SL (SEQ ID NO: 53).
Un tallo y asa se anexaron 3' de A64 poli(A). La parte superior del tallo y asa se tomaron de (Babendure et al., (2006), RNA (Nueva York, N. Y. ), 12(5), 85 1 -861 ). El tallo y asa consiste en un tallo rico en CG de 1 7 pares de bases de largo y un asa de 6 pares de bases de largo.
La figura 1 7 muestra ppLUc(GQ-ag-A64-N32 (SEQ ID NO: 54).
Mediante linearización del vector original en el sitio de restricción alternativo, se obtuvo ARNm con 32 nucleótidos adicionales después del poli(A).
La figura 18 muestra que la combinación de poli(A) e histonaSL incrementa la expresión de proteínas a partir de ARNm de una manera sinérgica.
El efecto de la secuencia kpoli(A), histonaSL y la combinación de poli(A)¦ e histonaSL en la expresión de luciferasa de ARNm fue examinado. Por lo tanto, diferentes moléculas de ARNm fueron electroporadas en células HeLa. Los niveles de luciferasa se midieron 6, 24 y 48 horas después de la transfección. Poca luciferasa se expresa a partir de ARNm que no tiene ni la secuencia poli(A) ni histonaSL: Tanto la secuencia poli(A) como la histonaSL incrementan el nivel de luciferasa. Sorprendentemente, sin embargo, la combinación de poli(A) e histonaS L incrementa más fuertemente el nivel de luciferasa, varias veces por arriba del nivel observado con cualquiera de los elementos individuales, actuando así sinérgicamente. Los datos se grafican como media RLU ± SD (unidades de luz relativas ± SD (unidades de luz relativas ± desviación estándar) para transfecciones triplicadas. RLU Específicas se resumen en el ej emplo 1 1 .2.
La figura 19 muestra que la combinación de poli(A) e histonaSL incrementa la expresión de proteínas a partir de ARNm sin importar su orden.
Se examinaron el efecto de la secuencia poli(A), histonaSL, la combinación de kpoli(A) e histonaSL, y su orden en la expresión de luciferasa de ARNm. Por lo tanto, diferentes moléculas de ARNm fueron lipofectadas usando células HeLa. Los niveles de luciferasa se midieron 6, 24 y 48 horas después del inicio de la transfección. Tanto una secuencia A64 poli(A) como la histonaSL dieron origen a niveles de luciferasa comparables. Incrementar la longitud de la secuencia poli(A) de A64 a A 120 o a A300 incrementa el nivel de luciferasa moderadamente. En contraste, la combinación de poli(A) e histonaSL incrementa el nivel de luciferasa mucho más que el alargamiento de la secuencia poli(A). La combinación de poli(A) e histonaS L actúa sinérgicamente toda vez que incrementa el nivel de luciferasa varias veces por arriba del nivel observado con cualquiera de los elementos individuales. El efecto sinérgico de la combinación de poli(A) e histonaSL se ve no obstante del orden de poli(A) e histonaSL y no obstante la longitud de poli(A) con ARNm de histonaSL A64 o histonaSL A250. Se grafican los datos como RLU media ± SD para transfecciones triplicadas. Las RLU especificas se resumen en el ej emplo 1 1 .3.
La figura 20 muestra que la elevación en la expresión de proteínas por la combinación de poli(A) e histonaSL es específica.
Se estudiaron el efecto de combinar poli(A) e histonaSL o poli(A) y secuencias alternativas en la expresión de luciferasa de ARNm. Por lo tanto, diferentes moléculas de ARN fueron electroporadas en células HeLa. Los niveles de luciferasa se midieron 6, 24 y 48 horas después de la transfección. Tanto una secuencia poli(A) como la histonaSL dieron origen a niveles de luciferasa comparables. La combinación de poli(A) e histonaSL incrementa fuertemente el nivel de luciferasa, varias veces por arriba del nivel observado con cualquiera de los elementos individuales, actuando así sinérgicamente. En contraste, combinar poli(A) con cualquiera de las demás secuencias no tiene efectos en el nivel de luciferasa en comparación con ARNm que contiene sólo una secuencia poli(A) . Así , la combinación de poli(A) e histonaSL actúa específicamente y sinérgicamente. Se grafican los datos como media RLU ± SD para transfecciones triplicadas. Las RLU específicas se resumen en el ej emplo 1 1 .4.
La figura 21 muestra que la combinación de poli(A) e histonaSL incrementa la expresión de proteínas a partir de ARNm de una manera sinérgica in vivo.
Se estudiaron el efecto de la secuencia poli(A), histonaSL y la combinación de poli(A) e histonaSL en la expresión de luciferasa de ARNm in vivo . Por lo tanto, diferentes moléculas de ARNm se inyectaron intradérmicamente en ratones. Los ratones se sacrificaron 1 6 horas después de la inyección y los niveles de luciferasa en los sitios de inyección fueron medidos. La luciferasa es expresada a partir de ARNm que tiene ya sea una histonaSL o una secuencia poli(A) . Sorprendentemente, sin embargo, la combinación de poli(A) e histonaSL incrementa fuertemente el nivel de luciferasa, varias veces por arriba del nivel observado con cualquiera de los elementos individuales, actuando así sinérgicamente. Se grafican los datos como RLU media ± SEM (unidades de luz relativas ± error estándar de la media). Las RLU específicas se resumen en el ejemplo 1 1 .5.
La figura 22 muestra que la combinación de poli(A) e histonaSL incrementa la expresión de proteínas NY-ESO- 1 a partir de ARNm.
Se estudiaron el efecto de secuencia poli(A) y la combinación de poli(A) e histonaSL en la expresión de NY-ESO- 1 de ARNm. Por lo tanto, diferentes moléculas de ARNm fueron electroporadas en células HeLa. Los niveles de NY-ESO- 1 fueron medidos 24 horas después de la transfección mediante citometría de fluj o. NY-ESO- 1 se expresa a partir de ARNm que sólo tiene un secuencia poli(A). Sorprendentemente, sin embargo, la combinación de poli(A) e histonaSL incrementa fuertemente el nivel de NY-ESO-1 , varias veces por arriba del nivel observado sólo con una secuencia poli(A) . Los datos se grafican como recuentos contra intensidad de fluorescencia. Las intensidades de fluorescencia medias (MFI) se resumen en el ej emplo 1 1 .6.
La figura 23 muestra que la combinación de poli(A) e histonaSL incrementa el nivel de anticuerpos desarrollados por vacunación con ARNm.
Se estudiaron el efecto de secuencia poli(A) y la combinación de poli(A) e histonaSL en la inducción de anticuerpos anti NY-ESO- 1 desarrollados por vacunación con ARNm. Por lo tanto, ratones C57BL/6 fueron vacunados intradérmicamente con diferentes moléculas de ARNm complej adas con protamina. El nivel de anticuerpos específicos para NY-ESO- 1 en los ratones vacunados y de control se analizan por ELISA con varias diluciones de sueros. Anti-NY-ESO- 1 IgG2a[b] se induce por ARNm que tiene sólo una secuencia poli(A). Sorprendentemente, sin embargo, la combinación de poli(A) e histonaSL incrementa fuertemente el nivel de anti NY-ESO- 1 IgG2a[b] , varias veces por arriba del nivel observado sólo con una secuencia poli(A). Los datos se grafican como los títulos de criterio promedio. Los títulos de criterio promedio se resumen en el ejemplo 1 1 .7.
EJEMPLOS Los siguientes ejemplos intentan ilustrar la invención más y no deberá considerarse que limitan la presente invención a los mismos. 1. Generación de secuencias de consenso de histona-tallo-asa Antes de los experimentos, secuencias de consenso de histona de tallo-asa fueron determinadas con base en las secuencias de tallo-asa de histona de metazoarios y protozoarios. Las secuencias se tomaron del suplemento proporcionado por López et al. (Dávila López, M., y Samuelsson, T. (2008), RNA (Nueva York, N. Y.), 14( 1 ), 1 - 1 0. doi : 1 0. 1261 /rna.782308), quien identificó un gran número de secuencias de tallo-asa de histona naturales al investigar secuencias genómicas y marcadores de secuencia expresados. Primero, todas las secuencias de metazoarios y protozoarios (4,001 secuencias), o todas las secuencias de protozoarios ( 1 3 1 secuencias) o como alternativa de metazoarios (3 ,870 secuencias), o de vertebrados ( 1 ,333 secuencias) o de humanos (84 secuencias) se agruparon y alinearon. Luego, la cantidad de los nucleótidos que se originaban fue determinada para cada posición. Con base en las tablas así obtenidas, se generaron secuencias de consenso para los 5 grupos de secuencias diferentes que representaban todos los nucleótidos presentes en las secuencias analizadas. Además, también se obtuvieron secuencias de consenso más restrictivas, enfatizando cada vez más los nucleótidos conservados. 2. Preparación de plantillas de ADN Se construyó un vector para transcripción in vitro que contenía un promotor T7 seguido por una secuencia enriquecida GC que codificaba para luciferasa de Photinus pyralis (ppLUc(GC)), la parte central de la región 3 ' no traducida (UTR) de alfa-globina (ag), y una secuencia poli(A). La secuencia poli(A) fue inmediatamente seguida por un sitio de restricción usado para linearlización del vector antes de la transcripción in vitro para obtener así ARNm que concluía en una secuencia A64 poli(A). ARNm obtenido de este vector en consecuencia por transcripción in vitro se designa como "ppLuc(GC)-ag-A64".
La linearización de este vector en sitios de restricción alternativos antes de la transcripción in vitro permitió obtener ARNm ya sea extendido por nucleótidos adicionales 3 ' de A64 o que carecían de A64. Además, el vector original se modificó para incluir secuencias alternativas. En resumen, las siguientes secuencias de ARNm fueron obtenidas de estos vectores mediante transcripción in vitro (las secuencias de ARNm se dan en las figuras 6 a 17) : ppLUc(GC)-ag (SEQ ID NO : 43) ppLuc(GC)-ag-A64 (SEQ ID NO : 44) ppLuc(GC)-ag-histonaSL (SEQ ID NO : 45) ppLuc(GC)-ag-A64-histonaSL (SEQ ID NO: 46) ppLuc(GC)-ag-A 120 (SEQ ID NO : 47) ppLuc(GC)-ag-A64-ag (SEQ ID NO : 48) ppLuc(GC)-ag-A64-Acpsl (SEQ ID NO : 49) ppLuc(GC)-ag-A64-PolioCL (SEQ ID NO : 50) ppLuc(GC)-ag-A64-G30 (SEQ ID NO: 5 1 ) ppLuc(GC)-ag-A64-U30 (SEQ ID NO: 52) ppLuc(GC)-ag-A64-SL (SEQ ID NO : 53 ) ppLuc(GC)-ag-A64-N32 (SEQ ID NO : 54) 3. Transcripción in vitro La plantilla de ADN de acuerdo con el ejemplo 2 se linearizó y transcribió in vitro usando T7-plimerasa. La plantilla de ADN se digirió después mediante tratamiento con DNasa. Todos los transcriptos de ARNm contenían una estructura 5 ' -CAP obtenida al añadir un exceso de N7-metil-guanosin-5 ' -trifosfato-5 ' -guanosina a la reacción de transcripción. El ARNm así obtenido se purificó y resuspendió en agua. 4. Adenilación enzimática de ARNm Se adenilaron enzimáticamente dos moléculas de ARNm: ppLuc(GC)-ag-A64 y ppLuc(GC)-ag-histonaSL.
Para este fin, ARN se incubó con el E. coli Poly(A)-polimerase and ATP (Poly(A) Polimerase Tailing Kit, Epicentre, Madison, E.U.A.) siguiendo las instrucciones del fabricante. ARNm con secuencia poli(A) extendida se purificó y resuspendió en agua. La longitud de la secuencia poli(A) se determinó mediante electroforesis en gel de agarosa. Las moléculas de ARN partidas se extendieron en aproximadamente 250 adenilados, las moléculas de ARN obtenidas se designan como ppLUc(GC)-ag-A300 y ppLuc(GC)-ag-histonaSL-A250, respectivamente. 5. Expresión de luciferasa por electroporación de ARNm Células HeLa fueron tripsinizadas y lavadas en opti-MEM. l x l O5 células en 200 µ? de opti-MEM cada una fueron electroporadas con 0.5 µg de ARNm que codificaba para ppLuc. Como un control, ARNm que no codificaba para ppLUc fue electroporado por separado . Las células electroporadas fueron sembradas en placas de 24 pocilios en 1 mi de medio RPMI 1 640. 6, 24 ó 48 Horas después de la transfección, el medio fue aspirado y las células fueron lisadas en 200 µ? de regulador de pH de lisis (25 mM de Tris, pH 7.5 (HC1), 2 mM de EDTA, 10% de glicerol, 1 % de Tritón X- 1 00, 2 mM de DTT, 1 mM de PMSF). Los Usados se almacenaron a -20°C hasta que se midiera la actividad ppLUc. 6. Expresión de luiciferasa por lipofección de ARNm Células HeLa fueron sembradas en placas de 96 pocilios a una densidad de 2x l 04 células por pocilio. Al día siguiente, las células fueron lavadas en opti-MEM y luego transfectadas con 0.25 µg de ARNm que codificaba para ppLuc acomplej ado a lipofectina en 1 50 µ? de opti-MEM. Como un control, ARNm que no codificaba para ppLuc fue lipofectado por separado. En algunos pocilios, opti-MEMfue aspirado y las células fueron lisadas en 200 µ? de regulador de pH de lisis 6 horas después del inicio de la transfección. En los pocilios restantes, el opti-MEM se cambió por medio RPMI 1 640 en ese momento. En estos pocilios, el medio fue aspirado y las células fueron lisadas en 200 µ? de regulador de pH de lisis 24 ó 48 horas después del inicio de la transfección. Los Usados se almacenaron a -20°C hasta que se midiera la actividad ppLuc. 7. Medición de luciferasa La actividad ppLUc se midió como unidades de luz relativas (RLU) en un lector de placa BioTek SynergyHT a 5 segundos de tiempo de medición usando 50 µ? de Usado y 200 µ? de regulador de pH de luciferina (25 mM de glicilglicina, pH 7.8 (NaOH), 1 5 mM de MgS04, 2 mM de ATP, 75 µ? de luciferina). Las RLU específicas fueron calculadas al restar RLU del ARN de control a partir de RLU total. 8. Expresión de luciferasa por inyección de ARNm intradérmica (expresión de luciferasa in vivo) Se anestesiaron ratones con una mezcla de Rompun y Ketavet. Cada ARNm que codificaba para ppLuc se inyectó intradérmicamente(0.5 µg de ARNm en 50 µ? por inyección). Como un control, ARNm que no codificaba kpara ppLuc se inyectó por separado. 16 Horas después de la inyección, los ratones fueron sacrificados y los tejidos recolectados. Las muestras de tejido fueron congeladas rápidamente en nitrógeno líquido y lisadas en un lisador de tejidos (Qiagen) en 800 µ? de regulador de pH de lisis (25 mM de Tris, pH 7.5 (HCl), 2 mM de EDTA, 10% de glicerol, 1 % de Tritón X- 100, 2 mM de DTT, 1 mM de PMSF). Posteriormente las muestras se centrifugaron a 13 ,500 rpm a 4°C durante 1 0 minutos. Los lisados se almacenaron a -80°C hasta que se midiera la actividad ppLuc (véase 7. medición de luciferasa). 9. Expresión de NY-ESO-1 por electroporación de ARNm Células HeLa fueron tripsinizadas y lavadas con opti-MEM. 2x l 05 células en 200 µ? de opti-MEM fueron electroporadas con 10 µg de ARNm que codificaba para NY-ESO- 1 . Células de las tres electroporaciones fueron combinadas y sembradas en una placa de 6 pocilios en 2 mi de medio RPMI 1640. 24 Horas después de la transfección, las células fueron cosechadas y transfectadas en una placa de fondo en V de 96 pocilios (2 pocilios por ARNm) . Las células fueron lavadas con solución salina de pH regulado con fosfato (PBS) y permeabilizadas con 200 µ? por pocilio de Cytofix/Cytoperm (Becton Dickinson (BD)). Después de 1 5 minutos, las células fueron lavadas con PermWash (BD). Luego, las células fueron incubadas durante 1 hora a temperatura ambiente ya sea con IgG l anti-NY-ESO- 1 de ratón o un control de isotipo (20 µg/ml). Las células fueron lavadas dos veces con PermWash de nuevo. Después, las células fueron incubadas durante 1 hora a 4°C con una dilución 1 : 500 de Alexa-647 acoplada a IgG de anti-ratón de cabra. Finalmente, las células fueron lavadas dos veces con PermWash. Las células fueron resuspendidas en 200 µ? de regulador de pH (PBS, 2% de FCS, 2 mM de EDTA, 0.01 % de azida de sodio). La expresión de NY-ESO- 1 se cuantificó mediante citometría de flujo como intensidad de fluorescencia media (MFI). 10. Inducción de anticuerpos anti NY-ESO-1 por vacunación con ARNm Ratones C57BL/6 fueron vacunados intradérmicamente con ARNm que codificaba para NY-ESO- 1 complej ado con protamina (5 veces en 14 días) . Los ratones de control fueron tratados con regulador de pH. El nivel de anticuerpos específicos para NY-ESO- 1 en ratones de control vacunados y de control se analizó 8 días después de la última vacunación mediante ELISA: Placas por ELISA de 96 pocilios (Nunc) fueron recubiertas con 100 µ? por pocilio de 1 0 µg/ml de proteína NY-ESO- 1 recombinante durante 1 6 horas a 4°C. Las placas se lavaron dos veces con regulador de pH de lavado (PBS, 0.05% de Tween-20) . Para bloquear la unión no específica, las placas se incubaron después durante 2 horas a 37°C con regulador de pH de bloqueo (PB S , 0.05 % de Tween-20, 1 % de B SA). Después del bloqueo, 1 00 µ? por pocilio de suero de ratón diluidos en serie se añadieron e incubaron durante 4 horas a temperatura ambiente. Las placas se lavaron después tres veces con regulador de pH de lavado. Después, 100 µ? por pocilio de anticuerpo de detección IgG2a[b] anti-ratón de rata biotinilado (BD Biosciences) diluido 1 : 600 en regulador de pH de bloqueo se dejó unir durante 1 hora a temperatura ambiente. Las placas se lavaron de nuevo tres veces con regulador de pH de lavado, seguidas por incubación durante 30 minutos a temperatura ambiente con 100 µ? por pocilio de estreptavidina acoplada a peroxidasa de rábano. Después de cuatro lavados con regulador de pH de lavado, 100 µ? por pocilio de 3 ,3 ' ,5 ,5 ' -tetrametilbencidina (Thermo Scientific) . Después del cambio de color resultante se añadieron 100 µ? por pocilio de ácido sulfúrico al 20%. La absorbancia se midió a 405 nm. 11. RESULTADOS 11.1 Secuencias de tallo-asa de histona : Para poder caracterizar secuencias de tallo-asa de histona, secuencias de metazoarios y protozoarios (4,001 secuencias), o de protozoarios ( 13 1 secuencias) o como alternativa de metazoarios (3870 secuencias), o de vertebrados ( 1 333 secuencias) o de humanos (84 secuencias) fueron agrupadas y alineadas . Luego, se determinó la cantidad de los nucleótidos que se presentaban para cada posición. Con base en las tablas así obtenidas, secuencias de consenso para los 5 grupos diferentes de secuencias fueron generadas que representaban todos los nucleótidos presentes en las secuencias analizadas. Dentro de la secuencia de consenso de metozoarios y protozoarios combinadas, se conservan tres nucleótidos, un T/U en el asa y un G y un C en el tallo, formando un par de bases. Estructuralmente, típicamente un tallo de 6 pares de bases y un asa de 4 nucleótidos se forma. Sin embargo, las estructuras que se desvían son comunes : de 84 tallos-asas de histona humanos, dos contienen un tallo de sólo 5 nucleótidos que comprenden 4 pares de bases y una no coincidencia. Otro tallo-asa de histona humano contiene un tallo de sólo 5 pares de bases. Cuatro tallos-asa de histona humanos adicionales contienen un tallo de 6 nucleótidos de largo, pero incluyen una no coincidencia en las tres posiciones diferentes, respectivamente. Además, cuatro tallos-asa de histona humanos contienen un par de bases vobulado en dos posiciones diferentes, respectivamente. Con respecto al asa, una longitud de 4 nucleótidos parece no requerirse estrictamente, ya que se ha identificado un asa de 5 nucleótidos en D. discoideum.
Además de las secuencias de consenso que representan todos los nucleótidos presentes en las secuencias analizadas, también se obtuvieron secuencias de consenso más restrictivas, que enfatizaban cada vez más los nucleótidos conservados. En resumen, se obtuvieron las siguientes secuencias: (Cons) : representa todos los nucleótidos presentes (99%) : representa al menos 99% de todos los nucleótidos presentes (95): representa al menos 95% de todos los nucleótidos presentes (90%) : representa al menos 90% de todos los nucleótidos presentes Los resultados del análisis de secuencias de tallo-asa de histona se resumen en las siguientes tablas 1 a 5 (véase también figuras 1 a 5) : Tabla 1 Secuencia de consenso de tallo-asa de histona de metazoarios y protozoarios (con base en una alineación de 4001 secuencias de tallo-asa de histona de metazoarios y protozoarios) (véase también figura 1) Tabla 2 Secuencia de consenso de tallo-asa de histona de protozoarios ; (con base en una alineación de 131 secuencias de tallo-asa de histona de protozoarios) (véase también figura 2) Tabla 3 Secuencia de consenso de tallo-asa de histona de metazoarios (con base en una alineación de 3870 (incluyendo 1333 secuencias de vertebrados) secuencias de tallo-asa de histona de metazoarios (véase también figura 31 Tabla 4 Secuencia de consenso de tallo-asa de histona de vertebrados: (con base en una alineación de 1333 secuencias de tallo-asa de histona de vertebrados) (véase también figura 4) Tabla 5 Secuencia de consenso de tallo-asa de histona de Homo sapiens: (con base en una alineación de 84 secuencias de tallo-asa de histona humana) En donde las abreviaturas usadas se definen como sigue: 11.2 La combinación de poli(A) e histonaSL incrementa la expresión de proteína a partir de ARNm de una manera sinérgica Para investigar el efecto de la combinación de poli(A) e histonaSL en la expresión de proteínas a partir de ARNm, moléculas de ARNm con diferentes secuencias 3 ' de la 3 ' -UTR de alfa-globina fueron sintetizadas : moléculas de ARNm ya sea que concluyeron justo a 3 ' de la 3 ' -UTR, careciendo entonces de la secuencia poli(A) e histonaSL, o contenía ya sea una secuencia A64 poli(A) o una histonaSL en lugar, pero ambas A64 poli(A) e histonaSL 3 ' de la 3 ' -UTR. Moléculas de ARNm que codificaban para luciferasa o ARNm de control se electroporaron en células HeLa. Los niveles de luciferasa se midieron 6, 24 y 48 horas después de la transfección (véase la siguiente tabla 6 y figura 1 8).
Tabla 6 Poca luciferasa fue expresada a partir de ARNm que no tenía ni secuencia poli(A) ni histonaSL. Tanto una secuencia poli(A) como la histonaSL incrementaron el nivel de luciferasa a un grado similar. Cada ARNm dio origen a un nivel de luciferasa más alto que el ARNm que carecía tanto de poli(A) como de histonaSL. Sorprendentemente, sin embargo, la combinación de poli(A) e histonaSL incrementó fuertemente más el nivel de luciferasa, varias veces por arriba del nivel observado con cualquiera de los elementos individuales. La magnitud de la elevación en el nivel de luciferasa debido a la combinación de poli(A) e histonaSL en el mismo ARNm demuestra que actúan sinérgicamente.
La sinergia entre poli(A) e histonaSL se cuantificó al dividir la señal de poli(A)-histonaSL ARNm (+/+) entre la suma de las señales de histonaSL ARNm (-/+) más poli(A) ARNm (+/-) (véase la siguiente tabla 7).
Tabla 7 El factor así calculado especifica qué tan alto el nivel de luciferasa de ARNm que combina poli(A) e histonaSL es de lo que seria esperado si los efectos de poli(A) e histonaSL fueran puramente aditivos.
El nivel de luciferasa a partir de ARNm que combina poli(A) e histonaSL fue hasta 1 6.6 veces más alto que si sus efectos fueran puramente aditivos.
Este resultado confirma que la combinación de poli(A) e histonaS L efectúa un incremento marcadamente sinérgico en la expresión de proteínas. 11.3 La combinación de poli(A) e histonaSL incrementa la expresión de proteínas a partir de ARNm no obstante de su orden El efecto de la combinación de poli(A) e histonaSL podría depender de la longitud de la secuencia poli(A) y el orden de la poli(A) e histonaS L. Así, moléculas de ARNm con longitud de secuencia poli(A) cada vez más alta y ARNm con poli(A) e histonaSL en orden inverso fueron sintetizadas. Dos moléculas de ARNm contenían 3 ' de la 3 ' -UTR una secuencia poli(A) ya sea A 120 o A300. Una ARNm adicional contenía 3 ' del 3 ' -UTR primero una histonaS L seguida por una secuencia A250 poli(A). Las moléculas de ARNm que codificaban para luciferasa o ARNm de control fueron lipofectadas en células HeLa. Los niveles de luciferasa se midieron 6, 24 y 48 horas después del inicio de la transfección (véase la siguiente tabla 8 y figura 19).
Tabla 8 Tanto una secuencia A64 poli(A) como la histonaSL dieron origen a niveles de luciferasa comparables. De acuerdo con el experimento anterior la combinación de A64 e histonaSL sí incrementó fuertemente el nivel de luciferasa, varias veces por arriba del nivel observado con cualquiera de los elementos individuales. La magnitud de la elevación en el nivel de luciferasa debido a combinar poli(A) e histonaSL en el mismo ARNm demuestra que están actuando sinérgicamente. La sinergia entre A64 e histonaSL se cuantificó como antes con base en los niveles de luciferasa de ARNm de A64-histonaSL, A64 e histonaSL (véase la siguiente tabla 9). El nivel de luciferasa de ARNm que combinaba A64 e histonaSL fue hasta 61 .7 veces más alto que si los efectos de poli(A) e histonaS L fueran puramente aditivos.
Tabla 9 En contraste, incrementar la longitud de la secuencia poli(A) de A64 a A 120 o a A300 incrementó el nivel de luciferasa sólo moderadamente (véase tabla 8 y figura 19). ARNm Con la secuenci a poli(A) más larga, A300, también se comparó con ARNm en el cual una secuencia poli(A) de longitud similar se combinó con la histonaSL, histonaS L-A250. Además de tener una larga secuencia poli(A), el orden de histonaSL y poli(A) se invierte en este ARNm con relación al ARNm de A64-histonaS L. La combinación de A250 e histonaSL fuertemente incrementó el nivel de luciferasa, varias veces por arriba del nivel observado ya sea con histonaS L o A300. De nuevo, la sinergia entre A250 e histonaSL fue cuantificada como antes comparando RLU de ARMNm de histonaSL-A250 con RLU de ARNm de A300 más ARNm de histonaSL (véase la si guiente tabla 1 0). El nivel de luciferasa de ARNm que combinaba A250 e histonaSL fue hasta 1 7.0 veces más alto que si los efectos de poli(A) e histonaS L fueron puramente aditivos.
Tabla 10 En resumen, un efecto altamente sinérgico de la combinación de histonaSL y poli(A) en la expresión de proteínas de ARNm ha sido demostrado para longitudes sustancialmente diferentes de poli(A) y no obstante el orden de poli(A) e histonaS L. 11.4 La elevación en la expresión de proteínas por la combinación de poli(A) e histonaSL es específica Para investigar si el efecto de la combinación de poli(A) e histonaSL en la expresión de proteínas de ARNm es específico, moléculas de ARNm con secuencias alternativas en combinación con poli(A) fueron sintetizadas : Estas moléculas de ARNm contenían 3 ' de A64 una de siete secuencias distintas, respectivamente. Moléculas de ARNm que codificaban para luciferasa o ARNm de control fueron electroporadas en células HeLa. Los niveles de luciferasa se midieron a 6, 24 y 48 horas después de la transfección (véase la siguiente tabla 1 1 y figura 20).
Tabla 11 Tanto una secuencia poli(A) como la histonaSL dieron origen a niveles de luciferasa comparables. De nuevo, la combinación de poli(A) e histonaSL incrementó fuertemente el nivel de luciferasa, varias veces por arriba del nivel observado con cualquiera de los elementos individuales, actuando así sinérgicamente. En contraste, combinar poli(A) con cualquiera de las secuencias alternativas no tuvo efecto en el nivel de luciferasa en comparación con ARNm que contenía sólo una secuencia poli(A). Así, la combinación de poli(A) e histona SL incrementan la expresión de proteínas de ARNm de una manera sinérgica, y su efecto es específico. 11.5 La combinación de poli(A) e histonaSL incrementa la expresión de proteínas a partir de ARNm de una manera sinérgica /'// vivo Para investigar el efecto de la combinación de poli(A) e histonaSL en la expresión de proteínas de ARNm ;'n vivo, moléculas de ARNm que codificaban para luciferasa con diferentes secuencias 3 ' de la 3 ' -UTR de alfa-globina o ARNm de control se inyectaron intradérmicamente en ratones : las moléculas de ARNm contenían ya sea una secuencia A64 poli(A) o una histonaSL en su lugar, o tanto una A64 poli(A) como histonaSL 3 ' de la 3 ' -UTR. Los niveles de luciferasa se midieron 1 6 horas después de la inyección (véase la siguiente tabla 1 2 y fifugra 21 ).
Tabla 12 La luciferasa fue expresada a partir de ARNm que tenía ya sea una histonaSL o una secuencia poli(A). Sorprendentemente, sin embargo, la combinación de poli(A) e histonaSL incrementó más fuertemente el nivel de luciferasa, varias veces por arriba del nivel observado con cualquiera de los elementos individuales. La magnitud de la elevación en el nivel de luciferasa debido a la combinación de poli(A) e histona SL en el mismo ARNm demuestra que están actuando sinérgicamente.
La sinergia entre poli(A) e histonaSL se cuantificó al dividir la señal de poli(A)-histonaSL ARNm (+/+) entre la suma de las señales de ARNm de histonaSL (-/+) más ARNm de poli(A) (+/-) (véase la siguiente tabla 13 ).
Tabla 13 El factor así calculado especifica qué tan alto es el nivel de luciferasa a partir de ARNm que combina poli(A) e histonaSL de lo que se esperaría si los efectos de poli(A) e histonaSL fueran puramente aditivos. El nivel de luciferasa de ARNm que combinaba poli(A) e histonaSL fue ocho veces más alto que si sus efectos fueran puramente aditivos. Este resultado confirma que la combinación de poli(A) e histonaSL efectúa un incremento marcadamente sinérgico en l a expresión de proteínas in vivo . 11.6 La combinación de poli(A) e histonaSL incrementan la expresión de proteína NY-ESO-1 a partir de ARNm Para investigar el efecto de la combinación de poli(A) e histonaS L en la expresión de proteínas a partir de ARNm, moléculas de ARNm que codificaban para NY-ESO- 1 con diferentes secuencias 3 ' de la 3 ' -UTR de alfa-globina fueron sintetizadas : moléculas de ARNm que contenían ya sea una secuencia A64 poli(A) o tanto A64 poli(A) como histonaSL 3 ' de la 3 ' -UTR. Moléculas de ARNm que codificaban para NY-ESO- 1 fueron electroporadas en células HeLa. Los niveles de NY-ES O- 1 se midieron 24 horas después de la transfeccion mediante citometría de fluj o (véase la siguiente tabla 14 y figura 22).
Tabla 14 NY-ESO- 1 fue expresada a partir de ARNm que tenía sólo una secuencia poli(A). Sorprendentemente, sin embargo, la combinación de poli(A) e histonaSL incrementó fuertemente el nivel de NY-ESO- 1 , varias veces por arriba del nivel observado sólo con una secuencia poli(A) . 11.7 La combinación de poli(A) e histonaSL incrementa el nivel de anticuerpos desarrollados por vacunación con ARNm Para investigar el efecto de la combinación de poli(A) e histonaSL en la inducción de anticuerpos desarrollados por vacunación con ARNm, ratones C57BL/6 fueron vacunados intradérmicamente con moléculas de ARNm que codificaban para NY-ESO- 1 acomplej adas a protamina con diferentes secuencias 3 ' de la 3 ' -UTR de alfa-globina. Las moléculas de ARNm contenían ya sea una secuencia A64 poli(A) o tanto A64 poli(A) como histonaSL 3 ' de la 3 ' -UTR. El nivel de anticuerpos específicos para NY-ESO- 1 en ratones vacunados y de control se analizó por ELISA con diluciones en sueros en serie (véase la siguiente tabla 1 5 y figura 23).
Tabla 15 IgG2a[b] anti NY-ESO- 1 se indujo por ARNm que sólo tenía una secuencia poli(A) : Sorprendentemente, sin embargo, l a combinación de poli(A) e histonaSL incrementó fuertemente el nivel de IgG2a[b] anti-NY-SO- 1 , muchas veces por arriba del nivel observado sólo con una secuencia poli(A).

Claims (14)

REIVINDICACIONES
1 . Una secuencia de ácido nucleico caracterizada porque comprende o codifica para a) una región de codificación, que codifica de preferencia para un péptido o proteína; siempre que la región de codificación no codifique para proteínas de histona, proteínas reporteras seleccionadas de EGFP y luciferasa y proteínas marcadoras o de selección seleccionadas de alfa-globina, galactocinasa y xantina: guanina fosforribosil transferasa (GPT), b) al menos un tallo-asa de histona, y c) una secuencia poli(A) o una señal de poliadenilación.
2. El ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado porque el ácido nucleico no contiene uno o dos o por lo menos uno o todos pero uno o todos de los componentes del grupo que consiste en: una secuencia que codifica para una ribozima (de preferencia una ribozima de auto-empalme), una secuencia de ácido nucleico, una secuencia de procesamiento de tallo-asa de histona, en particular una secuencia de procesamiento de tallo y asa de histona derivado de gen H2A614 de histona de ratón, un gen Neo, una secuencia promotora inactivada y una secuencia potenciadora inactivada.
3. El ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque el ácido nucleico no contiene una ribozima, de preferencia una ribozima de auto-empalme, y uno del grupo que consiste en : un gen Neo, una secuencia promotora inactivada, una secuencia potenciadora inactivada, una secuencia de procesamiento de tallo-asa de histona, en particular una secuencia de procesamiento de tallo y asa de histona derivada de gen H2A 14 de histona de ratón.
4. El ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 1 a 3 , caracterizado porque el ácido nucleico es un ARN, de preferencia un ARNm.
5. El ácido nucleico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque el por lo menos un tallo de un asa de histona se selecciona de las siguientes fórmulas (I) o (II), en donde la palabra stem se refiere al tallo y la palabra loop se refiere al asa: fórmula (I) (secuencia de tallo-asa sin elementos de borde de tallo) : steml loop stem2 fórmula (II) (secuencia de tallo-asa con el ementos de borde de tallo) : ^ [No.2GN3-5] [N0.4(Un-)N0.4] [N3.5CN0.J N,¦6 , steml steml loop stem2 stem2 elemento de borde elemento de borde en donde: los elementos de borde stem l o stem2 N i -6 es una secuencia consecutiva de 1 a 6, de preferencia de 2 a 6, muy preferiblemente de 2 a 5, aún más preferiblemente de 3 a 5 , demasiado preferiblemente de 4 a 5 o 5 N, en donde cada N es independientemente del otro seleccionado de un nucleótido seleccionado de A, U, T, G y C, o un análogo de nucleótido del mismo; stem l [No-2GN3 - 5 ] es complementario inverso o complementario inverso parcialmente con el elemento stem2, y es una secuencia consecutiva de entre 5 a 7 nucleótidos; en donde N0-2 es una secuencia consecutiva de 0 a 2, de preferencia de 0 a 1 , muy preferiblemente de 1 N, en donde cada N es independientemente del otro seleccionado de un nucleótido seleccionado de A, U, T, G y C o un análogo de nucleótido de los mismos; en donde N3 -5 es una secuencia consecutiva de 3 a 5 , de preferencia de 4 a 5, muy preferiblemente de 4 N, en donde cada N es independientemente del otro seleccionado de un nucleótido seleccionado de A, U, T, G y C o un análogo de nucleótido del mismo, y en donde G es guanosina o un análogo de la misma, y puede ser reemplazado opcionalmente por una citidina o un análogo de la misma, siempre que su citidina de nucleótido complementaria en stem2 sea reemplazada por guanosina; la secuencia de asa [N0-4(U/T)N0-4] se ubica entre los elementos stem l y stem2, y es una secuencia consecutiva de 3 a 5 nucleótidos, muy preferiblemente de 4 nucleótidos; en donde cada N0-4 es independientemente del otro una secuencia consecutiva de 0 a 4, de preferencia de 1 a 3 , muy preferiblemente de 1 a 2 N, en donde cada N es independientemente del otro seleccionado de un nucleótido seleccionado de A, U, T, G y C o un análogo de nucleótido del mismo; y en donde U/T representa uridina, u opcionalmente timidina; stem2 [N3 -5CNo-2] es complementario inverso o complementario inverso parcialmente con el elemento stem l , y es una secuencia consecutiva de entre 5 a 7 nucleótidos; en donde N3-5 es una secuencia consecutiva de 3 a 5, de preferencia de 4 a 5, muy preferiblemente de 4 N, en donde cada N es independientemente del otro seleccionado de un nucleótido seleccionado de A, U, T, G y C o un análogo de nucleótido del mismo; en donde N0-2 es una secuencia consecutiva de 0 a 2, de preferencia de 0 a 1 , muy preferiblemente de 1 N, en donde cada N es independientemente del otro seleccionado de un nucleótido seleccionado de A, U, T, G y C o un análogo de nucleótido del mismo; y en donde C es citidina o un análogo de la misma, y puede ser reemplazado opcionalmente por una guanosina o un análogo de la misma siempre y cuando su nucleótido de guanosina complementario en stem l sea reemplazado por citidina; en donde stem l y stem2 son capaces de apareo de bases entre sí formando una secuencia complementaria inversa, en donde cualquier apareo de bases puede presentarse entre stem l y stem2, o formando una secuencia complementaria parcialmente inversa, en donde un apareo de bases incompleto puede presentarse entre stem l y stem2.
6. El ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque el por lo menos un tallo-asa de histona se selecciona de al menos una de las siguientes fórmulas (la) o (Ha), en donde la palabra stem se refiere al tallo y la palabra loop se refiere al asa: Fórmula (la) (secuencia de tallo-asa sin elementos de borde de tallo) N2-5 [N0-1GN3-5] [NL^U DNM] [N^CN N2.5 . ' G v ' steml steml loop stem2 stem2 elemento de borde elemento de borde Fórmula (Ha) (secuencia de tallo-asa con elementos de borde de tallo).
7. El ácido nucleico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque la secuencia poli(A) comprende una secuencia de aproximadamente 25 a alrededor de 400 nucleótidos de adenosina, de preferencia una secuencia de alrededor de 50 a aproximadamente 400 nucleótidos de adenosina, muy preferiblemente una secuencia de alrededor de 50 a aproximadamente 300 nucleótidos de adenosina, aún más preferiblemente una secuencia de alrededor de 50 a aproximadamente 250 nucleótidos de adenosina, todavía más preferiblemente una secuencia de alrededor de 60 a aproximadamente 250 nucleótidos de adenosina.
8. El ácido nucleico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque la señal de poliadenilación comprende la secuencia de consenso NNUANA, de preferencia AAUAAA o AUUAAA.
9. El ácido nucleico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque el ácido nucleico codifica para una proteína o péptido terapéuticamente activo, una proteína adyuvante, un antígeno, un antígeno tumoral, un antígeno patógeno, un antígeno animal, un antígeno viral, un antígeno de protozoarios, un antígeno bacteriano, un antígeno alergénico, un antígeno autoinmune, un alérgeno, un anticuerpo, una proteína o péptido inmunoestimulador o un receptor de células T específico de antígeno.
1 0. El ácido nucleico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque el ácido nucleico es un ácido nucleico monocistrónico, bicistrónico o incluso multicistrónico.
1 1 . Uso del ácido nucleico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 para incrementar el nivel de expresión de un péptido o proteína codificado.
12. El ácido nucleico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 1 0, caracterizado porque es para usarse como un medicamento.
1 3. Una composición farmacéutica caracterizada porque comprende el ácido nucleico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 y opcionalmente un portador farmacéuticamente aceptable.
14. Una vacuna caracterizada porque comprende el ácido nucleico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 1 0, que codifica para un antígeno o que comprende un antígeno . 1 5. La vacuna de conformidad con la reivindicación 14, caracterizada porque el antígeno se selecciona de antígenos tumorales, antígenos alergénicos, auto-antígenos autoinmunes, antígenos patógenos, antígenos virales, antígenos bacterianos, antígenos fúngicos, antígenos protozoológicos, antígenos animales o antígenos alergénicos. 1 6. Uso del ácido nucleico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 para incrementar la expresión de una proteína en el tratamiento de cáncer o enfermedades tumorales, enfermedades infecciosas, de preferencia enfermedades infecciosas (virales, bacterianas o protozoológicas), enfermedades autoinmunes, alergias o enfermedades alérgicas, enfermedades monogenéticas, es decir, enfermedades (hereditarias), o enfermedades genéticas en general, enfermedades que tengan un antecedente genético heredado y que sean causadas típicamente por un defecto génico definido y sean heredadas de acuerdo con las leyes de Mendel, enfermedades cardiovasculares, enfermedades neuronales, enfermedades del sistema respiratorio, enfermedades del sistema digestivo, enfermedades de la piel, trastornos musculoesqueléticos, trastornos del tejido conectivo, neoplasmas, deficiencias inmunológicas, enfermedades endocrinas, nutricionales y metabólicas, enfermedades oculares o enfermedades ópticas. 1 7. Un método in vitro o ex vivo para incrementar la expresión de una proteína, caracterizado porque comprende las etapas de: a) proporcionar el ácido nucleico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, b) aplicar o administrar el ácido nucleico a un sistema de expresión libre de células, una célula (por ej emplo, una célula hospedera de expresión o una célula somática), un tejido o un organismo.
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