MX2007009277A - Conjugacion de sacarido capsular estreptococico. - Google Patents

Conjugacion de sacarido capsular estreptococico.

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Abstract

Tres metodos de conjugacion para el uso con el sacarido capsular de estreptococus agalactiae. En el primer metodo, se usa animacion reductiva de cadenas laterales de residuos oxidados de acido sialico, pero se aminan primero los grupos aldehido y luego la amina se acopla a un portador mediante un ligador. En el segundo metodo, los residuos de acido sialico y/o los residuos de N-acetil-glucosamina se N-acetilan para dar grupos amina, y los grupos amina se acoplas a una proteina portadora mediante un ligador. En el tercer metodo el enlace es mediante residuos de galactosa en el sacarido capsular en lugar de residuos de acido sialico, que se puede lograr de manera conveniente usando galactosa-oxidasa.

Description

CONJUGACIÓN DE SACARIDO CAPSULAR ESTREPTOCOCICO Campo de la Invención Esta invención esta en el campo de la conjugación de sacáridos capsulares bacterianos a portadores a fin de formar glicoconjugados . Los glicoconjugados son útiles para inmunización.
Antecedentes de la Invención Los sacáridos capsulares de bacterias son usados durante muchos años en vacunas contra bacterias encapsuladas. Puesto que los sacáridos son antígenos T-independientes, sin embargo, son pobremente inmunogénicos. La conjugación a un portador puede convertir los antígenos T- independientes a antígenos T dependientes, mejorando de este modo la respuesta de memoria y permitiendo que se desarrolle inmunidad protectora. Las vacunas de sacárido son más efectivas por lo tanto se basan en glicoconjugados, y la vacuna de conjugado de prototipo fue contra el tipo b de Haemophilus influenzae ( "Hib" ) [ver, por ejemplo, capítulo 14 de referencia 78] . En otra bacteria para la cual se han descrito vacunas de conjugados es Streptococcus agalactiae, también conocida como "estreptococo del grupo B" , o simplemente como "GBS" . Mucho de este trabajo se ha realizado por Dennis REF: 185120 Kasper y colaboradores, y se describen documentos tal como las referencias 1 a 9. El proceso de Kasper para la conjugación de sacáridos de GBS comprende típicamente la aminación reductiva de un sacárido purificado a una proteína portadora tal como el toxoide de tétano (TT) o CRM197 [2] . La aminación reductiva comprende un grupo amina en la cadena lateral de un aminoácido en el portador y un grupo aldehido en el sacárido. Puesto que los sacáridos capsulares de GBS no incluyen un grupo aldehido en su forma natural entonces este se genera antes de la conjugación por oxidación con periodato de una porción de los residuos de ácido siálico del sacárido, como se muestra en la Figura 1 [2, 10] . Aunque se ha mostrado que las vacunas de conjugados preparadas de esta manera para cada uno de los serotipos IA, IB, II, III y V de GBS son seguras e inmunogénicas en humanos [11] , permanece la necesidad de manera adicionales y mejores para preparar conjugados de sacáridos capsulares de GBS .
Breve Descripción de la Invención La invención se basa en tres métodos de conjugación que se pueden usar en lugar de laminación reductiva directa descrita en la técnica anterior, todos los cuales tienen como finalidad (a) retener los residuos de ácido siálico retener los residuos de ácido siálico en una forma que esta más cercana que la técnica anterior a la forma vista en el polisacárido nativo, y (b) permitir el uso de un ligador en la acción de conjugación, a fin de mejorar el acoplamiento a portadores: - En el primer método, se usa aminación reductiva de las cadenas laterales en los residuos de ácido siálico oxidados, pero se aminan primero los grupos aldehido, y luego la amina se acopla a un portador mediante un ligador. Este método se ilustra en la "ruta A" de la Figura 2. - En el segundo método, los residuos de ácido siálico y/o residuos de N-acetil-glucosamina se des-N-acetilan para dar grupos amina, y los grupos amina se acoplan a una proteína portadora mediante un ligador. Este método se ilustra en la "ruta B" de la Figura 2. - En el tercer método, el enlace es mediante residuos de galactosa en el sacárido capsular en lugar de residuos de ácido siálico. Este método evita la interrupción de los epítopos claves formados por los residuos de ácido siálico. En un primer aspecto, por lo tanto, la invención proporciona un proceso para preparar un conjugado de un sacárido capsular de S. agalactiae y una molécula portadora, que comprende los pasos de: (a) oxidar un sacárido capsular de S. agalactiae a fin de introducir un grupo aldehido en al menos un residuo terminal de ácido siálico en el sacárido; (b) someter el grupo de aldehido aminación reductiva con amoniaco o una amina primaria, para dar una amina -CH2-enlazada; (c) hacer reaccionar la amina-CH2-enlazada con un ligador bifuncional, para dar un sacárido activado; y (d) hacer reaccionar el sacárido activado con una molécula portadora, dando de este modo el conjugado. La invención también proporciona un conjugado, en donde el conjugado comprende una porción del sacárido capsular de S. agalactiae unida a un portador mediante una porción ligadora, y en donde la porción ligadora se une a un residuo de ácido siálico en la porción del sacárido capsular. En un segundo aspecto, la invención proporciona un proceso para preparar un conjugado de un sacárido capsular de S. agalactiae y una molécula portadora, que comprende los pasos de des-N-acetilar el sacárido capsular, para dar un sacárido des-N-acetilado; (b) hacer reaccionar el sacárido des-N-acetilado con un ligador bifuncional, para dar un sacárido activado; y (c) hacer reaccionar el sacárido activado con una molécula portadora, dando de este modo el conjugado. Entre los pasos (a) y (b) , el proceso puede comprender un paso de re-N-acetilación parcial del sacárido. En un tercer aspecto, la invención proporciona un proceso para preparar un conjugado para un sacárido capsular y una molécula portadora, que comprende los pasos de: (a) oxidar un sacárido capsular a fin de introducir un grupo aldehido en al menos un residuo de galactosa en el sacárido, para dar un residuo modificado de galactosa; y (b) acoplar el residuo modificado de galactosa a una molécula portadora. El acoplamiento en el paso (b) puede ser directo, o puede ser mediante una molécula ligadora. La invención también proporciona un conjugado, en donde el conjugado comprende una porción del sacárido capsular unida a un portador mediante una porción ligadora, y en donde la porción ligadora esta unida a un residuo de galactosa en la porción del sacárido capsular. La oxidación de los residuos de galactosa es particularmente útil para la conjugación de los sacáridos capsulares de S . agalactiae, pero también es adecuada para el uso con otras bacterias que tienen sacáridos capsulares que contienen galactosa, por ejemplo, en Neisseria meningitidis (serogrupo 135) Vibrio Cholerae (incluyendo 0139) , Klebsiella pneumoniae (incluyendo K21) Escherichia coli (incluyendo K52) , Streptococcus pneumoniae (incluyendo tipo 18C) , etc. Este proceso, también se puede usar con lipopolisacáridos que contienen galactosa y lipooligosacáridos . Es particularmente útil donde la galactosa es un residuo terminal del sacárido.
El Sacárido Capsular La invención se basa en el sacárido capsular de Streptococcus agalactiae . El polisacárido capsular se enlaza covalentemente a la estructura peptidoglicano de GBS, y es distinto del antígeno del grupo B, que es otro sacárido que esta unido a la estructura de péptidoglicano. Los polisacáridos capsulares de GBS están químicamente relacionados, pero son antigénicamente muy diferentes. Todos los polisacáridos capsulares de GBS comparten el siguiente núcleo de trisacárido: ß-D-GlcpNAc(l?3)ß-D-Galp(l?4)ß-D-Glcp Los varios serotipos de GBS difieren por la manera en la cual se modifica este núcleo. La diferencia entre los serotipos la y III, por ejemplo, surge el uso de ya sea el GlcNAc (la) o el Gal (III) en este núcleo para enlazar núcleos consecutivos de tri-sacárido (Figura 4) . Los serotipos la y Ib tienen ambos un disacárido [a-D-NeupNAc (2->3) ß-D-Galp- (l->] enlazado al GlcNAc en el núcleo, pero el enlace es 1—>4(la) o 1— >3 (Ib) . Las enfermedades relacionadas a GBS surgen principalmente de los serotipos la, Ib, II, III, IV, V, VI, VII y VIII, con más de 90 % que se provocan por los cinco serotipos: la, Ilb, III y V. La invención usa de manera preferente un sacárido de uno de estos cinco serotipos. Como se muestra en la Figura 3 , los sacáridos capsulares de cada uno de estos serotipos incluyen: (a) un residuo de ácido N-acetil-neuramínico (NeuNAc) terminal (referido comúnmente como ácido siálico) , que en todos los casos esta enlazado 2—>3 a un residuo de galactosa; y (b) un residuo de N-acetil-glucosamina (GlcNAc) dentro del núcleo de trisacárido. Los cinco sacáridos incluyen residuos de galactosa dentro del núcleo de trisacárido, pero los serotipos la, Ib, II y III también contienen residuos adicionales de galactosa en cada unidad de repetición, con el sacárido del serotipo II que contiene tres residuos de galactosa por unidad de repetición. En el tercer aspecto de la invención, los residuos de galactosa comprendidos en las reacciones de conjugación pueden ser un residuo en el núcleo de trisacárido o residuo fuera del núcleo de trisacárido. Donde una molécula individual de sacáridos se enlaza a múltiples moléculas portadoras, se prefiere que los enlaces comprendan la galactosa en la misma posición en las varias unidades de repetición enlazadas, pero también es posible enlazarse a residuos de galactosa en diferentes posiciones en diferentes unidades de repetición. Los sacáridos usados de acuerdo con la invención pueden estar en su forma nativa, o puede haber sido modificados. Por ejemplo, un sacárido puede ser mas corto que el sacárido capsular nativo, o puede estar químicamente modificado. De esta manera, el sacárido usado de acuerdo con la invención puede ser un polisacárido capsular de longitud sustancialmente completa, como se muestra en la naturaleza, o puede ser más corto que la longitud natural. Los polisacáridos de longitud completa se pueden despolimerizar para dar fragmentos más cortos para el uso con la invención, por ejemplo por hidrólisis en ácido suave, por calentamiento, por cromatografía de exclusión de tamaño, etc . Se ha reportado que la longitud de cadena afecta la inmunogenicidad de los sacáridos de GBS en conejos [4] . La despolimerización del sacárido capsular del serotipo III por endo-ß-galactosidasa se ha reportado entre [referencias 1 y 4-6] , incluyendo el uso de material despolimerizado para formar conjugados con un portador de toxoide de tétano. También se ha usado la ozonolisis de polisacáridos capsulares de los serotipos II, III y VIII de GBS para despolimerización [12] . Se prefiere usar sacáridos con peso molecular >30 kDa, y se pueden usar polisacáridos capsulares de longitud sustancialmente completa. Para el serotipo la, se prefiere usar polisacáridos con un peso molecular de hasta ~ 145 kDa. Para el serotipo Ib, se prefiere usar polisacáridos con un peso molecular de hasta aproximadamente 50 kDa. Para el serotipo III, se prefiere usar polisacáridos con un peso molecular de ~50kDa. Estas masas moleculares se pueden medir por filtración en gel con relación a las normas de dextrano, tal como aquellas disponibles de Polymer Standard Service [13] . El sacárido se puede modificar químicamente con relación al sacárido capsular como se encuentra en la naturaleza. Por ejemplo, el sacárido se puede des-O-acetilar (parcial o completamente) , des-N-acetilado (parcial o completamente), N-propionar (parcial o completamente), etc. La des-acetilación puede presentarse antes, durante o después de la conjugación, pero de manera preferente se presenta antes de la conjugación. Dependiendo del sacárido particular, la des-acetilación puede afectar o no la inmunogenesidad, por ejemplo, la vacuna NeisVac-C" usa un sacárido des-O-acetilado, en tanto que Menjugate1 esta acetilada, pero ambas vacunas son efectivas. La pertinencia de la O-acetilación en los sacáridos de GBS en los varios serotipos en la lista de la referencia 14, y se prefiere retener la O-acetilación de los residuos de ácido siálico en las posiciones 7, 8 y/o 9 antes, durante y después de la conjugación, por ejemplo, por protección/desprotección, por re-acetilación, etc. El efecto de la des-acetilación, etc., se puede valorar por ensayos de rutina. Se pueden purificar sacáridos capsulares por técnicas conocidas, como se describe en las referencias de la presente. Un proceso típico comprende la extracción con base, centrifugación, filtración, tratamiento con RNasa/DNasa, tratamiento con proteasa, concentración, cromatografía de exclusión y tamaño, ultrafiltración, cromatografía de intercambio aniónico, y ultrafiltración adicional. También es útil el tratamiento de las células de GBS con la enzima mutanolisina, que escinde la pared celular bacteriana para liberar los componentes de la pared celular. Como una alternativa, se puede usar el proceso de purificación descrito en la referencia 15. Comprende la extracción con base, tratamiento con etanol/CaCl2, precipitación con CTAB y re-solubilización. La invención no se limita a los sacáridos purificados de fuentes naturales, sin embargo, los sacáridos se pueden obtener por otros métodos, tal como síntesis parcial o total.
El portador La invención comprende el uso de moléculas portadoras, que son típicamente proteínas. En general, la conjugación covalente de sacáridos o portadores mejora la inmunogenicidad de los sacáridos puesto que los convierte de antígenos T- independientes a antígeno T-dependientes, permitiendo de esta manera el cebado para memoria inmunólógica . La conjugación es particularmente útil para vacunas pediátricas [por ejemplo referencia 16] y es una técnica bien conocida [por ejemplo en referencias 17 a 25] . Las proteínas portadoras preferidas son toxinas o toxoides bacterianos, tal como toxoide de difteria o toxoide de tétano. El mutante CRM197 de la toxina de difteria [26- 27] es un portador particularmente preferido, puesto que es un toxoide de difteria. Otras proteínas portadoras adecuadas incluyen la proteína de membrana exterior de N. meningi tidis
[29] , péptidos sintéticos [30, 31] , proteína de choque térmico [32, 33], proteínas de tos ferina [34, 35] citocinas
[36] , limfocinas [36] , hormonas [36] , factores de crecimiento [36] , albúmina de suero humano (preferentemente recombinante) , proteínas artificiales que comprenden múltiples epítopos de células T CD4+ humanas de varios antígenos derivados de patógenos [37] tal como ?19 [38] , proteína D de H. influenzae [39, 40] , proteína de superficie pneumococal PspA [41] , pneumolisina [42] , proteínas de captación de hierro [43] , toxina A o B de C. difficile [44] , una proteína de GBS (ver posteriormente; particularmente GBS67) [195] , etc. La unión al portador es preferentemente mediante un grupo -?H2 por ejemplo en la cadena lateral de un residuo de lisina en una proteína portadora, o de un residuo de arginina. Donde un sacárido tiene un grupo aldehido libre entonces este puede reaccionar con una amina en el portador para formar un conjugado por aminación reductiva. El tercer aspecto de la invención se puede basar en aminación reductiva que comprende una galactosa oxidada en el sacárido (del cual se forma un aldehido) y una amina en el portador o en el ligador. La unión también puede ser mediante un grupo -SH, por ejemplo, en la cadena lateral de un residuo de cisteina. Es posible usar más de una proteína portadora, por ejemplo para reducir el riesgo de la supresión del portador. De esta manera, se pueden usar diferentes proteínas portadoras para diferentes serotipos de GBS, por ejemplo, los sacáridos del serotipo la se pueden conjugar a CRM197 en tanto que los sacáridos del serotipo Ib se pueden conjugar a toxoide de tétano. También es posible usar más de una proteína portadora para un antígeno particular de sacárido, por ejemplo, los sacáridos del serotipo III pueden estar en dos grupos, con algunos conjugados a CRM197 y otros conjugados a toxoide de tétanos. En general, sin embargo, se prefiere usar la misma proteína portadora para todos los sacáridos . Una proteína portadora individual puede tener más de un antígeno de sacárido [45, 46] . Por ejemplo, una proteína portadora puede tener conjugada a la misma sacáridos de los serotipos la y Ib. Para lograr este objetivo, se pueden mezclar diferentes sacáridos antes de la reacción de conjugación. En general, sin embargo, se prefiere tener conjugados separados para cada serogrupo, con los diferentes sacáridos que se mezclan después de la conjugación. Los conjugados separados se pueden basar en el mismo portador. Los conjugados con una relación del sacárido: proteína (p/p) de entre 1:5 (es decir, exceso de proteínas) y 5:1 (es decir, exceso de sacáridos) se prefieren. Se prefieren las relaciones entre 1:2 y 5:1, puesto que son relaciones entre 1:1.25 y 1:2.5. También se prefieren las relaciones entre 1:1 y 4:1. Con cadenas más largas de sacáridos, es típico un peso en exceso de sacárido. Como se muestra en los ejemplos, se puede lograr fácilmente una relación en peso entre 1:1 y 4:1, y particularmente 1:1 y 3:1. En general, la invención proporciona un conjugado, en donde el conjugado comprende una porción de sacárido capsular S. agalactiae unida conjuntamente a un portador, en donde la relación en peso del sacárido: portador es al menos 2:1. Las composiciones pueden incluir una pequeña cantidad de portador libre [47] . Cuando una proteína portadora determinada esta presente tanto en la forma libre como conjugada en una composición de la invención, la forma no conjugada no es preferentemente más de 5 % de la cantidad total de la proteína portadora en la composición como una totalidad, y de manera más preferente esta presente en al menos 2 % en peso. Después de la conjugación, se pueden separar los conjugados libres y conjugados. Hay muchos métodos adecuados, que incluyen cromatografía hidrófoba, ultrafiltración tangencial, diafiltración, etc., [ver también referencias 48 y 49, etc.] . Donde la composición de la invención incluye un oligosacárido despolimerizado, se refiere que la despolimerización preceda la conjugación.
Introducción de Grupos Aldehido El primer aspecto de la invención comprende la oxidación de ácido siálico para formar un aldehido, y el tercer aspecto comprende la oxidación de galactosa para formar un aldehido. El aldehido entonces se puede usar para reacciones tal como aminación reductiva. La oxidación de los hidroxilos para dar aldehidos se puede lograr de manera química o enzimática. Estas reacciones tomarán lugar típicamente en condiciones acuosas . Los métodos para oxidación de ácidos siálicos en sacáridos de GBS a fin de introducir grupo aldehido para aminación reductiva reconocen en la técnica [por ejemplo, referencia 50] . Las reacciones típicas para producir aldehidos en ácidos siálicos incluyen el uso de sales de periodato, y particularmente meta-periodatos (por ejemplo, meta-periodatos de sodio o potasio, por ejemplo, NaI04) , para oxidar hidróxidos vecinales [10] . Se ha reportado la oxidación de periodato para al menos los serogrupos II [3, 50] , III [2] y V [50] . Se pueden usar otras condiciones de oxidación, por ejemplo, el uso de tetraóxido de osmio, etc. En el tercer aspecto de la invención, el -OH que se oxida es preferentemente el -OH primario (es decir, -OH secundarios o anoméricos) , que están unidos a C-6. De esta manera, se prefiere convertir galactosa en galactohexodialosa. Esto se puede lograr de manera conveniente usando una enzima de galactosa-oxidasa, de cualquier fuente adecuada (por ejemplo del hongo Fusarium, o Dactylium dendroides) . La enzima se puede usar de forma recombinante, o purificar de su fuente nativa. La enzima de lactosa-oxidasa tiene un número EC 1.1.3.9 y también se conoce como D-Galactosa: oxígeno- 6-oxidoreductasa. La enzima usa un co-factor de ion de cobre y se puede inhibir por cianuro, dietilditiocarbamato, azida e hidroxilamina, de modo que se evita de manera preferente el uso de estos reactivos antes de la oxidación. El pH óptimo para el D. dendroides es alrededor de neutral, que de esta manera es el pH preferido para la oxidación. Un producto de la reacción enzimática es H202 (oxígeno reducido) , y la concentración de este producto se puede controlar por ejemplo si la presencia esta dañando al sacárido. Tanto para ácido siálico como para galactosa, por lo tanto, las reacciones preferidas de oxidación comprenden los átomos de carbono terminales en los monosacáridos, es decir, los carbonos de más alta numeración por la nomenclatura normal. La proporción de subunidades de monosacárido en una cadena de sacárido que se convierten para incluir un grupo aldehido se pueden controlar al variar las condiciones de reacción. Por ejemplo, la referencia 50 reporta que la oxidación controlada de periodato del polisacárido de GBS de serotipo II dio por resultado la modificación de 7 % de los residuos de ácido siálico como se determina por análisis por cromatografía de gas-espectrometría de masa, con un mayor porcentaje que se ve para el polisacárido de GBS del serotipo V. La referencia 2 reporta 25 % de conversión para el serotipo III. Se pueden realizar estudios preliminares de las condiciones de reacción (por ejemplo, tiempo, temperatura, concentraciones, etc.) para encontrar las condiciones óptimas para cualquier resultado final deseado. En general, es típico introducir grupos aldehido en entre 5 % y 50 % (por ejemplo, 10-40 %, de manera preferente entre 15 % - 30 %; o entre 5 % y 20 %) de las unidades totales de ácido siálico o monosacárido de galactosa dentro de un sacárido. Mayores porcentajes conducen a que los sacáridos sean más difíciles de manejar, sin ningún incremento correspondiente en la inmunogenicidad.
Aminación Reductiva En el primer aspecto de la invención, se usa aminación reductiva del nuevo grupo aldehido para dar un grupo para la unión del ligador. También se puede usar aminación reductiva en el tercer aspecto de la invención después de que se ha producido el grupo aldehido, ya sea para unir un ligador o para el enlace directo a un portador. La aminación reductiva es una técnica normal en química orgánica, y se ha usado extensivamente en la producción de conjugados de sacáridos capsulares para uso en vacunas. En el primer aspecto, la aminación reductiva comprende ya sea amoniaco o una amina primaria (NH2R) . Esto se puede lograr de manera conveniente al usar una sal de amonio (por ejemplo, cloruro de amonio) en combinación con un agente reductor apropiado (por ejemplo, cianoborohidruros, tal como cianoborohidruro de sodio, NaBH3CN; borano-piridina; triacetoxiborohidruro de sodio; resina de intercambio de borohidruro; etc.). El resultado de la aminación reductiva es que C-8 en el ácido siálico tiene -NHR en lugar de =0. Este grupo entonces se puede usar para la unión de un ligador bifuncional para la conjugación. En el tercer aspecto, la galactosa oxidada tiene un grupo aldehido en C-6. Este grupo se puede acoplar a un ligador bifuncional por aminación reductiva de la misma manera como se describe anteriormente, es decir que comprende amoniaco o una amina primaria. Como una alternativa, se puede usar aminación reductiva para enlazar el aldehido a un portador directamente, sin el uso de un ligador, al utilizar un grupo amina en el portador. La aminación reductiva se llevará a cabo en general en un solvente prótico polar, tal como agua o alcohol .
Ligador Bifuncional El primero y segundo aspecto de la invención (y, opcionalmente, el tercer aspecto) comprenden el uso de un ligador bifuncional. Se usa un ligador bifuncional para proporcionar un primer grupo para acoplamiento a un grupo amina en el sacárido capsular modificado y un segundo grupo para acoplamiento al portador (típicamente para acoplamiento a una amina del portador) . El primer grupo en el ligador bifuncional es de esta manera capaz de reaccionar con el grupo amina (-NHR) en el residuo de ácido siálico modificado (o galactosa) . La reacción comprenderá típicamente una sustitución hidrófila del hidrógeno de la amina. El segundo grupo en el ligador bifuncional es capaz de reaccionar con el grupo amina en el portador. Esta reacción nuevamente comprenderá de forma típica una sustitución electrofila de la amina. La invención puede usar tanto ligadores heterobifuncionales como ligadores homobifuncionales . Donde las reacciones tanto con el sacárido como con el portador comprenden aminas entonces se prefieren usar un ligador bifuncional de la fórmula X-L-X, donde: los dos grupos X son los mismos entre sí y pueden reaccionar con las aminas; y donde L es una porción de enlace en el ligador. Un grupo X preferido es N-oxisuccinimida. L tiene de manera preferente la fórmula -L'-L2-L'-, donde L' es carbonilo. Los grupos L2 preferidos son alquilos de cadena recta con 1 a 10 átomos de carbono (por ejemplo, Clf C2, C3, C4, C5, C6, C7, C8, C9, C10) , por ejemplo -(CH2)4-. Un ligador preferido es de esta manera diéster de N-hidroxisuccinimida de ácido adípico (SIDEA) : Otros grupos X son aquellos que forman esteres cuando se combinan con HO-L-OH, tal como norborano, ácido p-nitrobenzoico, y sulfo-N-hidroxisuccinimida. Los ligadores bifuncionales adicionales reactivos con aminas para el uso con la invención incluyen haluros de acriloilo (por ejemplo cloruro) [54] , haluros de haloacilo
[55] , glutarato de disuccinimidilo, suberato de disuccinimidilo, bis [succinimidilsuccinato] de etilenglicol, etc . El ligador se adicionará en general en un exceso molar al sacárido modificado. La reacción del ligador/sacárido tomará lugar en general n un solvente aprótico (por ejemplo, DMSO, acetato de etanol, etc.), puesto que los ligadores son típicamente insolubles en agua. Donde se usan ligadores solubles en agua, sin embargo, entonces esta disponible un intervalo más amplio de solventes, que incluyen solventes próticos tal como agua. Los ligadores adecuados incluyen formas sulfonadas, tal como SIDEA sulfonadas: Des-N-Acetilación y N-Acetilación Los residuos de ácido siálico en los sacáridos capsulares de GBS están N-acetilados, puesto que son los residuos de glucosamina dentro del núcleo de trisacárido. En tanto que el primer aspecto de la presente invención introduce grupos de amina en C-8 del acido siálico mediante un compuesto intermedio de aldehido, el segundo aspecto de la invención no usa grupos amina producidos por des-N- acetilación del ácido siálico y/o residuos de N-acetil-glucosamina. Los esquemas de reacción para aminas producidas de esta manera en general son los mismos como se describe para el primer aspecto de la invención. La des-N-acetilación de los sacáridos de GBS se puede lograr de manera conveniente al tratar el sacárido con una base. Puesto que los sacáridos de GBS se pueden purificar por un proceso que comprende la extracción con base [51] entonces la des-N-acetilación puede ser una reacción secundaria durante la purificación. Debido a que los grupos N-acetilo pueden ser parte de epítopos importantes en los sacáridos de GBS, no puede ser deseable la des-N-acetilación completa, pero este proceso es difícil de controlar. Si el grado de des-N-acetilación es mayor que lo deseado, por lo tanto, la invención puede comprender un paso de re-N-acetilación controlada. La des-N-acetilación se puede realizar de manera conveniente usando un reactivo tal como anhídrido acético (CH3CO)20 por ejemplo en bicarbonato de amonio al 5 % [52] . En lugar de usar re-N-acetilación, sin embargo, los inventores han encontrado que la extracción con base del sacárido de la bacteria puede, si se realiza de una manera suficientemente rápida sin almacenamiento prologado del sacárido, dar un sacárido con menos de 25 % de des-N-acetilación.
El resultado de la des-N-acetilación y la re-N-acetilación opcional es un sacárido en el cual al menos un residuo de ácido siálico o glucosamina esta des-N-acetilado. Típicamente, al menos 60 % de los residuos de ácido siálico y los residuos de glucosamina en el sacárido de GBS están N-acetilados, por ejemplo, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, etc. Los grupos des-N-acetilados restantes (es decir, grupos -NH2) se pueden usar para conjugación de la misma manera como se describe en el primer aspecto de la invención, excepto que el -NH- en el conjugado final se derivará del sacárido original en lugar de ser adicionado durante la reacción de conjugación. Estas reacciones de des y re-acetilación se puede realizar en condiciones acuosas. En modalidades del primer y tercer aspecto de la invención, donde se amina reductivamente el aldehido, se prefiere que el sacárido se re-N-acetile de • una manera sustancialmente completa antes de la aminación reductiva (de manera preferente antes de la oxidación de galactosa en el tercer aspecto) , a fin de evitar la presencia de grupos amina libres en ácidos siálicos que de otro modo ofrecerán grupos de enlace alternativos al aldehido laminado.
El Conjugado Los conjugados de la invención se forman al mezclar el sacárido modificado de GBS con el portador bajo condiciones adecuadas de reacción. En general se pueden hacer dos tipos de conjugados, como se muestra en la Figura 5: (a) un conjugado donde se une un sacárido individual a un portador individual, por ejemplo a través de su término reductor; y (b) un conjugado donde se une un sacárido individual a múltiples portadores por ejemplo debido a que están reactivas varias subunidades de monosacárido. En ambas situaciones, una proteína portadora individual puede enlazarse a múltiples moléculas de sacárido debido a que pueden tener múltiples cadenas laterales de lisina expuestas . Los conjugados del tipo (b) son más típicos en la presente invención, debido a que los residuos modificados de ácido siálico o galactosa de la invención se presentan en múltiples sitios a lo largo de un sacárido individual [50] . En conjugados preferidos de la invención, por lo tanto, se acopla una molécula individual de sacárido en promedio a más de una molécula portadora. En el primer y tercer métodos de la invención, donde se usan sacáridos oxidados para conjugación, el número de moléculas portadoras unidas de un sacárido dependerá de un número de grupos aldehido libres que están presentes . Como se menciona anteriormente, se prefiere que estén oxidados 5-50 % de los residuos de ácido siálico (primer método) o de galactosa (tercer método) en el sacárido. En el primero y segundo aspectos de la invención, (y opcionalmente en el tercero) los conjugados incluirán una porción ligadora. La porción ligadora no se origina al sacárido ni en el portador, sino es una tercer molécula usada durante la preparación del conjugado, y se puede distinguir fácilmente tanto del sacárido como de la proteína portadora en un producto conjugado final. La porción ligadora puede incluir átomos tal como carbono, hidrógeno, oxígeno y/o nitrógeno. Los ligadores que pueden comprender carbono e hidrógeno se prefieren, y también se prefieren los ligadores que comprenden además oxígeno y/o nitrógeno. Los ligadores que incluyen átomos de nitrógeno pueden incluir un átomo de carbono unido a un átomo de nitrógeno, que a su vez se une a un segundo átomo de carbono (-C-N-C-) . Los ligadores que incluyen un átomo de oxígeno incluyen un átomo de oxígeno lo incluyen de manera preferente como parte de un grupo carbonilo. Las porciones ligadoras con un peso molecular de entre 30-500 Da se prefieren. Se prefieren ligadores que contienen dos grupos carbonilo. Una porción ligadora particularmente preferida es -NH-C(O) - (CH2)n-C(0) -, en donde n es 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10. El valor de n es preferentemente 4. La terminal -NH-en este ligador se une de manera preferente un átomo de carbono desde la porción del sacárido. La terminal -C(0)-se une de manera preferente a un átomo de nitrógeno en una cadena lateral de aminoácidos en el portador. La porción portadora preferida se puede introducir de manera conveniente y por un proceso que comprende: aminación reductiva de un aldehido en un ácido siálico oxidado; reacción del grupo -NH2 resultante con un ligador bifuncional que es un diéster (por ejemplo, éster de disuccinimidilo) de un ácido dioico (por ejemplo, de ácido adípico, HOOC- (CH2) 4-COOH) ; y aminación reductiva del producto (ver Figura 6 [53] ) . Otras químicas que se pueden usar para unir un ligador a una terminal -NH2 en un sacárido que se puede haber introducido (como en el primer aspecto de la invención) o puede ser parte en un residuo de monosacárido des-N-acetilado (como en el segundo aspecto de la invención) , incluyen: acriloilación (por ejemplo por reacción con cloruro de acriloilo) , seguido por adición tipo Michael a ya sea el e-NH2 de una cadena lateral de aminoácidos o a un -SH de una cadena lateral de cisteina [54] . El ligador resultante es -NH-C (O) - (CH2) 2- (propionamido) , como se muestra en la Figura 8, o -C (0) - (CH2) 2- si una -NH2 existente toma parte en la reacción. - reacción con un haloacilhaluro, seguida por reacción con el e-NH2 de una cadena lateral de aminoácidos o a un -SH de una cadena lateral de cisteina [55] . El ligador es -NH-C(O) -CH2- (como se muestra en la Figura 9) o -C(0)- CH2-, dependiendo de si un -NH2 existente o adicionado toma 5 parte de la reacción. Otra porción ligadora preferida es -C(0) - (CH2)n- C0- , en donde n es l, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10. El valor de n es de manera preferente 4. Una terminal -C(O)- en este ligador se une de manera preferente a un átomo de carbono e hidrógeno de la porción del sacárido, y la otra terminal - C(O)- se une de manera preferente a un átomo de nitrógeno en una cadena lateral de aminoácidos en el portador. La porción ligadora preferida se puede introducir de manera conveniente por un proceso que comprende : reacción de un grupo -NH2 en la unidad de monosacárido des-N-acetilada con un ligador bifuncional que es un diéster (por ejemplo, un éster de di-succinimidilo) de un ácido dioico (por ejemplo, de ácido adípico, HOOC- (CH2) 4-C00H) ; y aminación reductiva del producto (Figura 7) . 20 Otras opciones incluyen conjugar mediante grupos hidroxilo en el sacárido. Se pueden activar hidroxilos (por ejemplo, por CNBr o CDAP) y luego someter a conjugación.
Combinaciones de Conjugados y Otros Antígenos _-. Así como la provisión de conjugados individuales como se describe anteriormente, la invención proporciona una composición que comprende un conjugado de la invención y uno o más antígenos adicionales. Los antígenos adicionales pueden comprender conjugados adicionales de la invención, y de esta manera la invención proporciona una composición que comprende más de un conjugado de la invención. Los antígenos adicionales pueden ser conjugados de sacáridos de GBS preparados por los métodos diferentes de aquéllos de la invención, y de este modo, la invención proporciona una composición que comprende un primer conjugado de sacárido de GBS y un segundo conjugado de sacárido de GBS, en donde el primer conjugado es un conjugado de la invención y el segundo conjugado no es un conjugado de la invención. Los diferentes conjugados de GBS pueden incluir diferentes tipos de conjugados del mismo serotipo de GBS y/o conjugados de diferentes serotipos de GBS. Por ejemplo, la invención proporciona una composición que comprende conjugados de dos o tres de los serotipos la, Ib y III. La composición se producirá al preparar conjugados separados (por ejemplo, un diferente conjugado para cada serotipo) y luego combinar los conjugados. Los antígenos adicionales pueden comprender secuencias de aminoácidos de GBS, como se expone posteriormente . Los antígenos adicionales pueden comprender antígenos de patógenos no de GBS. De esta manera, las composiciones de la invención pueden comprender adicionalmente uno o más antígenos no de GBS, que incluyen antígenos bacterianos, virales o parásitos adicionales. Estos se pueden seleccionar de lo siguiente: - Un antígeno de proteína del serogrupo B de N. meningitidis, tal como aquéllos en las referencias 56 a 62, con la proteína "287" (ver posteriormente) y derivados (por ejemplo, "?G287") que son particularmente preferidos. Una preparación de vesículas de membrana exterior (OMV) del serogrupo B de N. meningi tidis, tal como aquéllos descritos en las referencias 63, 64, 65, 66, etc. - Un antígeno de sacárido del serogrupo A, C, W135 y/o Y, de N. meningi tidis, tal como el oligosacárido descrito en la referencia 67 del serogrupo C o los oligosacáridos de la referencia 68. Un antígeno de sacárido de Streptococcus pneumoniae [por ejemplo, referencias 69-71; capítulos 22 y 23 de referencia 78] . - Un antígeno del virus de hepatitis A, tal como virus inactivado [por ejemplo, 72, 73; capítulo 15 de referencia 78] . - Un antígeno del virus de hepatitis B, tal como los antígenos de superficie y/o núcleo [por ejemplo, 73, 74; capítulo 16 de referencia 78] . - Un antígeno del virus de hepatitis C [por ejemplo, 75] . - Un antígeno de Bordetella pertussis, tal como holotoxina de tos ferina (PT) y hemaglutinina filamentosa (FHA) de B . pertussis, opcionalmente también en combinación con pertactina y/o aglutinógenos 2 y 3 [por ejemplo, referencias 76 y 77; capítulo 21 de referencia 78] . - Un antígeno de difteria, tal como un toxoide de difteria [por ejemplo, capítulo 13 de referencia 78] . - Un antígeno de tétano, tal como un toxoide de tétano [por ejemplo, capítulo 27 de referencia 78] . Un antígeno de sacárido de Haemophilus influenzae B [por ejemplo, capítulo 14 de referencia 78] . - Un antígeno de N. gonorrhoeae [por ejemplo, 56, 57, 58] . Un antígeno de Chlamydia pneumoniae [por ejemplo, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85] . Un antígeno de Chlamydia tracho atis [por ejemplo, 86] . Un antígeno de Porphyromonas gingivalis [por ejemplo, 87] , Antígenos de polio [por ejemplo, 88, 89; capítulo 24 de referencia 78] tal como IPV. - Antígenos de rabia [por ejemplo, 90] tal como virus inactivado liofilizado [por ejemplo, 91, RabAvertMR] . - Antígenos de sarampión, paperas y/o rubéola [por ejemplo, capítulos 19, 20 y 26 de referencia 78] .
- Antígenos de influenza [por ejemplo, capítulos 17 y 18 de referencia 78] , tal como proteínas de superficie de hemaglutinina y/o neuraminidasa. Un antígeno de Moraxella catarrhalis [por ejemplo, 92] . Un antígeno de Streptococcus pyogenes (estreptococo de grupo A) [por ejemplo, 93, 94, 95] . Un antígeno de Staphylococcus aureus [por ejemplo, 96] . Donde se usa un antígeno de sacárido o carbohidrato, se conjuga de manera preferente un portador a fin de mejorar la inmunogenicidad. Es bien conocida la conjugación de antígenos de sacárido de H. influenzae B, meningococales y pneumococales . Los antígenos tóxicos de proteína se pueden destoxificar donde es necesario (por ejemplo, destoxificación de la toxina de tos ferina por medios químicos y/o genéticos [77] ) . Donde se incluye un antígeno de difteria en la composición, se prefiere también incluir antígeno de tétano y antígeno de tos ferina. De manera similar, donde se incluye un antígeno de tétano se prefiere también incluir antígenos de difteria y tos ferina. De manera similar, donde se incluye un antígeno de tos ferina se prefiere también incluir antígenos de difteria y tétano. Se pueden adsorber los antígenos a una sal de aluminio. Un tipo de composición preferida incluye antígenos adicionales de patógenos que transmiten de forma sexual, tal como: virus de herpes; N. gonorrhoeae; virus de papiloma; C. trachomatis,- etc. Otro tipo de composición preferida incluye antígenos adicionales que afectan los pacientes de edad avanzada y/o los inmunocomprometidos, y de este modo los antígenos de GBS de la invención se pueden combinar con uno o más antígenos de los siguientes patógenos no de GBS: virus de influenza, Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermis, Pseudomonas aeruginosa, Legionella pneumophila, Listeria monocytogenes, Neisseria meningi tidis, y virus de parainfluenza. Los antígenos en la composición estarán presentes típicamente a una concentración de al menos 1 µg/ml cada uno. En general, la concentración de cualquier antígeno determinado será suficiente para producir una respuesta inmunitaria contra ese antígeno. Como una alternativa a usar antígenos de proteínas en la composición de la invención, se puede usar ácido nucleico que codifica para el antígeno [por ejemplo, referencias 97 a 105] . De esta manera, los componentes de proteína de las composiciones de la invención se pueden reemplazar por ácido nucleico (de manera preferente, AD?, por ejemplo, en la forma de un plásmido) que codifica para la proteína.
En términos prácticos, puede haber un límite superior al número de antígenos incluidos en las composiciones de la invención. El número de antígenos (incluyendo antígenos de GBS) en una composición de la invención puede ser menos de 20, menos de 19, menos de 18, menos de 17, menos de 16, menos de 15, menos de 14, menos de 13, menos de 12, menos de 11, menos de 10, menos de 9, menos de 8 , menos de 7 , menos de 6 , menos de 5 , menos de 4 , o menos de 3. El número de antígenos de GBS en una composición de la invención puede ser menos de 6, menos de 5 , o menos de 4.
Composiciones Farmacéuticas y Métodos La invención proporciona una composición farmacéutica que comprende (a) un conjugado de la invención y (b) un portador farmacéuticamente aceptable. Los "portadores farmacéuticamente aceptables" típicos incluyen cualquier portador que no induzca por sí mismo la producción de anticuerpos dañinos al individuo que recibe la composición. Los portadores adecuados son típicamente macromoléculas grandes lentamente metabolizadas tal como proteínas, polisacáridos, ácidos polilácticos, ácidos poliglicólicos, aminoácidos poliméricos, copolímeros de aminoácido, sacarosa [106] , trehalosa [107] , lactosa, y agregados de lípidos (tal como gotas de aceite o liposomas) . Estos portadores son bien conocidos por aquéllos expertos en la técnica. Las vacunas también pueden contener diluyentes, tal como agua, solución salina, glicerol, etc. Adicionalmente, pueden estar presentes sustancias adicionales, tal como agentes humectantes o emulsionantes, sustancias amortiguadoras del pH, y similares. La solución salina fisiológica, amortiguada con fosfato, libre de pirógenos, estéril, es un portador típico. Un análisis completo de los excipientes farmacéuticamente aceptables está disponible en la referencia 108. Las composiciones de la invención pueden estar en forma acuosa (es decir, soluciones o suspensiones) o en una forma seca (por ejemplo, liofilizada) . Si se usa una vacuna seca, entonces se reconstituirá en un medio líquido antes de la inyección. La liofilización de vacunas de conjugados se conoce en la técnica, por ejemplo, el producto MenjugateMR se presenta en forma liofilizada, en tanto que NeisVac-C"* y MeningitecMR se presentan en forma acuosa. Para estabilizar los conjugados durante la liofilización, se puede preferir incluir un alcohol de azúcar (por ejemplo, mannitol) o un disacárido (por ejemplo, sacarosa o trehalosa) , por ejemplo a entre 1 mg/ml y 30 mg/ml (por ejemplo cerca de 25 mg/ml) en la composición. Las composiciones se pueden presentar en frascos, o se pueden presentar en jeringas ya rellenas. Las jeringas se pueden suministrar con o sin agujas. Una jeringa incluirá una dosis individual de la composición, en tanto que un frasco puede incluir una dosis individual o múltiples dosis . También son adecuadas las composiciones acuosas de la invención para reconstituir otras vacunas de una forma liofilizada. Donde se va a usar una composición de la invención para esta reconstitución extemporánea, la invención proporciona un equipo, que puede comprender dos frascos, o puede comprender una jeringa ya rellena y un frasco, con los contenidos de la jeringa que se usan para reactivar los contenidos del frasco antes de la inyección. Las composiciones de la invención se pueden envasar en una forma de dosis unitaria o en una forma de múltiples dosis. Para las formas de múltiples dosis, se prefieren frascos a las jeringas pre-rellenas . Los volúmenes de dosis efectivos se pueden establecer por rutina, pero una dosis típica para humanos de la composición tiene un volumen de 0.5 ml, por ejemplo para inyección intramuscular . El pH de la composición está de manera preferente entre 6 y 8, de manera preferente cerca de 7. Se puede mantener el pH estable por el uso de un amortiguador. Si una composición comprende una sal de hidróxido de aluminio, se prefiere usar un amortiguador de histidina [109] . La composición puede ser estéril y/o estar libre de pirógenos. Las composiciones de la invención pueden ser isotónicas con respecto a los humanos.
Las composiciones de la invención son inmunogénicas , y son de manera más preferente composiciones de vacuna. Las vacunas de acuerdo a la invención pueden ser ya sea profilácticas (es decir, para prevenir la infección) o terapéuticas (es decir, para tratar la infección) , pero típicamente serán profilácticas. Las composiciones inmunogénicas usadas como vacunas comprenden una cantidad inmunológicamente efectiva de los antígenos, así como cualquier otro componente, como sea necesario. Para "cantidad inmunológicamente efectiva", se quiere decir que la administración de esa cantidad a un individuo, ya sea en una dosis individual o como parte de una serie, es efectiva para el tratamiento o prevención. Esta cantidad varía dependiendo de la salud y condición física de individuo que se va a tratar, la edad, el grupo taxonómico del individuo que se trata (por ejemplo, primate no humano, primate, etc.), la capacidad del sistema inmunitario del individuo para sintetizar anticuerpos, el grado de protección deseado, la formulación de la vacuna, la valoración de la situación médica por el doctor que trata, y otros factores pertinentes . Se espera que la cantidad caerá en un intervalo relativamente amplio que se puede determinar a través de ensayos de rutina. Dentro de cada dosis, la cantidad de un antígeno de sacárido individual estará en general entre 1-50 µg (como se mida como masa de sacáridos) por ejemplo cerca de 1 µg, aproximadamente 2.5 µg, aproximadamente 4 µg, aproximadamente 5 µg, o aproximadamente 10 µg. El GBS afecta varias áreas del cuerpo y de este modo las composiciones de la invención se pueden preparar en varias formas. Por ejemplo, las composiciones se pueden preparar como productos inyectables, ya sea como soluciones o suspensiones líquidas. La composición se puede preparar para administración pulmonar, por ejemplo como un inhalador, usando un polvo fino o una aspersión. La composición se puede preparar como un supositorio o pesario. La composición se puede preparar para administración nasal, aural u ocular, por ejemplo, como aspersión, gotas, gel o polvo [por ejemplo, referencias 110 y 111] . El éxito con la administración nasal de los sacáridos pneumococales [112, 113] , sacáridos de Hib [114] , sacáridos de MenC [115] , y mezclas de conjugados de sacáridos de Hib y MenC [116] se ha reportado . Las composiciones de la invención pueden incluir un antimicrobiano, particularmente cuando se envasa en un formato de múltiples dosis. Las composiciones de la invención pueden comprender detergente, por ejemplo, Tween (polisorbato) , tal como Tween 80. En general estarán presentes los detergentes a niveles bajo, por ejemplo < 0.01 %. Las composiciones de la invención pueden incluir sales sódicas (por ejemplo, cloruro de sodio) para dar tonicidad. Es típica una concentración de 10 ± 2 mg/ml de NaCl. Las composiciones de la invención incluirán en general un amortiguador. Es típico un amortiguador de fosfato. Las composiciones de la invención se administrarán en general en unión con otros agentes inmunorreguladores . En particular, las composiciones incluirán usualmente uno o más adyuvantes. Estos adyuvantes incluyen, pero no se limitan a: A. Composición que Contienen Minerales Las composiciones que contienen minerales adecuadas para el uso como adyuvantes de la invención incluyen sales minerales, tal como sales de aluminio y sales de calcio. La invención incluye sales minerales tal como hidróxidos (por ejemplo, oxihidróxidos) , fosfatos (por ejemplo, hidroxifosfatos, ortofosfatos) , sulfatos, etc. [por ejemplo, ver capítulos 8 y 9 de referencia 117] , o mezclas de diferentes compuestos minerales (por ejemplo, una mezcla de un fosfato y un adyuvante de hidróxido, opcionalmente con un exceso del fosfato) , con los compuestos que toman cualquier forma adecuada (por ejemplo, gel, cristalina, amorfa, etc.), y con adsorción a las sales que se prefieran. Las composiciones que contienen minerales también se pueden formular como una partícula de la sal metálica [118] .
Se pueden incluir sales de aluminio en las vacunas de la invención tal que la dosis de Al3+ está entre 0.2 y 1.0 mg por dosis. Un adyuvante de fosfato de aluminio es hidroxifosfato de aluminio amorfo con una relación molar de P04/A1 entre 0.84 y 0.92, incluido a 0.6 mg de Al3+/ml . La adsorción con una dosis baja de fosfato de aluminio se puede usar, por ejemplo entre 50 y 100 µg de Al3+ por conjugado por dosis . Donde se usa un fosfato de aluminio y no se desea adsorber un antígeno al adyuvante, esto se favorece al incluir iones libres de fosfato en solución (por ejemplo, por el uso de un amortiguador de fosfato) .
B. Emulsiones de Aceite Las composiciones de emulsión de aceite adecuadas para el uso como adyuvante en la invención incluyen emulsiones de escualeno-agua, tal como MF59 (5 % de escualeno, 0.5 % de Tween 80, y 0.5 % de Span 85, formulados en partículas de submicrones usando un microfluidizador) [capítulo 10 de referencia 117; ver también referencias 119-121] . Se usa MF59 como adyuvante en la vacuna de subunidades trivalentes de virus de influenza FLUADMR. Los adyuvantes particularmente preferidos para el uso en las composiciones son emulsiones de aceite en agua de submicrones. Las emulsiones de aceite en agua preferidas de submicrones para el uso en la presente son emulsiones de escualeno/agua que contienen opcionalmente cantidades variables de MTP-PE, tal como emulsión de aceite en agua de submicrones que contienen 4-5 % p/v de escualeno, 0.25-1.0 % p/v de Tween 80 (mono-oleato de polioxietilensorbitano) , y/o 0.25-1.0 % de Span 85 (trioleato de sorbitan), y opcionalmente, N-acetilmuramil-L-alanil-D-isoglutaminil-L-alanina-2- (1 ' -2 ' -dipalmitoil-sn-glicero-3-hidroxifosfoforiloxi) -etilamina (MTP-PE) . Las emulsiones de aceite en agua de submicrones, los métodos para hacer las mismas y los agentes inmunoestimuladores, tal como péptidos de muramilo, para el uso en las composiciones, se describen en detalle en las referencias 119 y 122-123. También se pueden usar el adyuvante completo de Freund (CFA) y el adyuvante incompleto de Freund (IFA) como adyuvantes en la invención.
C. Formulaciones de Saponina [Capítulo 22 de Referencia 117] También se pueden usar formulaciones de saponina como adyuvantes en la invención. Las saponinas son un grupo heterólogo de glicósidos de esterol y glicósidos triterpenoides que se encuentran en la corteza, hojas, tallos, raíces y aún flores de una amplia variedad de especies de planta. Las saponinas aisladas de la corteza del árbol de Molina Quillaza saponaria se han estudiado ampliamente como adyuvantes. También se pueden obtener comercialmente las saponinas a partir de Smilax ornata (sarsaprilla) , Gypsophilla paniculata (velo de novia) , y Saponaria officianalis ( raíz de jabón) . Las formulaciones de adyuvante de saponina incluyen formulaciones purificadas, tal como QS21, así como formulaciones de lípidos, tal como ISCOM. Se han purificado composiciones de saponina usando HPLC y RP-HPLC. Se han identificado las fracciones purificadas específicas usando estas técnicas, incluyendo QS7, QS17, QS18, QS21, QH-A, QH-B y QH-C. De manera preferente, la saponina es QS21. Un método de producción de QS21 se describe en la referencia 124. Las formulaciones de saponina también pueden comprender un esterol, tal como colesterol [125] . Se pueden usar combinaciones de saponinas y colesteroles para formar partículas únicas llamadas complejos inmunoestimuladores (ISCOM) [capítulo 23 de referencia 117] . Los ISCOM también incluyen típicamente un fosfolípido tal como fosfatidiletanolamina o fosfatidilcolina. Se puede usar cualquier saponina conocida en los ISCOM. De manera preferente, el ISCOM incluye uno o más de QuilA, QHA y QHC. Se describen adicionalmente los ISCOM en las referencias 127-127. Opcionalmente, los ISCOM pueden estar desprovistos de detergentes adicionales [128] . Se puede encontrar, en las referencias 129 y 130 una revisión del desarrollo de los adyuvantes basados en saponinas.
D. Virosomas y Partículas Tipo Virus También se pueden usar, como adyuvantes en la invención, virosomas y partículas tipo virus (VLP) . Estas estructuras contienen en general una o más proteínas de un virus, opcionalmente combinadas o formuladas con un fosfolípido. En general, son no patógenos, no replicadores y en general no contienen nada del genoma viral nativo. Las proteínas virales se pueden producir de manera recombinante o aislar de los virus enteros. Estas proteínas virales adecuadas para el uso en los virosomas o VLP incluyen proteínas derivadas del virus de influenza (tal como HA o NA) , virus de Hepatitis B (tal como proteínas de núcleo o cápside) , virus de Hepatitis E, virus de sarampión, virus de Sindbis, rotavirus, virus de la enfermedad de pies y boca, retrovirus, virus de Norwalk, virus de papiloma humano, VIH, ARN-fagos, Qß-fago (tal como proteínas de cubierta) , GA-fago, fr-fago, fago AP205, y Ty (tal como proteína pl de Ty retrotransposon) . Las VLP se analizan adicionalmente en las referencias 131-136. Se analizan los virosomas adicionalmente por ejemplo en la referencia 137.
E . Derivados Bacterianos o Microbianos Los adyuvantes adecuados para el uso en la invención incluyen derivados bacterianos o microbianos tal como derivados no tóxicos de lipopolisacárido enterobacteriano (LPS) , derivados de lípido A, oligonucleótidos inmunoestimuladores y toxinas ADP-ribosilantes y derivados destoxificados de los mismos. Los derivados no tóxicos de LPS incluyen monofosforil- lípido A (MPL) y MPL 3-O-desacilado (3dMPL) . El 3dMPL es una mezcla de 3 monofosforil-lípido A des-0-acilado con 4, 5 ó 6 cadenas aciladas. Una forma preferida de "partícula pequeña" de 3 monofosforil-lípido A des-O-acilado se describe en la referencia 138. Estas "partículas pequeñas" de 3dMPL son suficientemente pequeñas para ser filtradas estériles a través de una membrana de 0.22 µm [138] . Otros derivados de LPS no tóxicos incluyen imitadores de monofosforil-lípido A, tal como derivados de fosfato de aminoalquil-glucosaminida, por ejemplo TC-529 [139, 140] . Los derivados del lípido A incluyen derivados del lípido A de Escherichia coli tal como OM-174. OM-174 se describe por ejemplo en las referencias 141 y 142. Los oligonucleótidos inmunoestimuladores adecuados para el uso como adyuvantes en la invención incluyen secuencias de nucleótidos que contienen un motivo de CpG (una secuencia de dinucleótidos que contiene una citosina no metilada enlazada por un enlace de fosfato a una guanosina) . Los ARN de doble hebra y los oligonucleótidos que contienen secuencias palindrómicas o poli (dG) también se ha mostrado que son inmunoestimuladores. Los CpG pueden incluir modificaciones/análogos de nucleótidos tal como modificaciones de fosforotioato y pueden ser de doble hebra o de hebra individual . Las referencias 143, 144 y 145 describen posibles sustituciones análogas, por ejemplo, reemplazo de guanosina con 2'-desoxi-7-desazaguanosina. El efecto adyuvante de los oligonucleótidos de CpG se analiza adicionalmente en las referencias 146-151. La secuencia de CpG se puede dirigir a TLR9, tal como el motivo GTCGTT o TTCGTT [153] . La secuencia de CpG puede ser específica para inducir una respuesta inmunitaria de Thl, tal como un ODN de CpG-A, o puede ser más específica para inducir una respuesta de células B, tal como ODN de CpG-B. Los ODN de CpG-A y CpG-B se analizan en las referencias 153-155. De manera preferente, el CpG es un ODN de CpG-A. De manera preferente, el oligonucleótido de CpG se construye de modo que el extremo 5 ' sea accesible para el reconocimiento del receptor. Opcionalmente, se pueden unir dos secuencias de oligonucleótidos de CpG en sus extremos 3 ' para formar " inmunómetros" . Ver, por ejemplo, referencias 152 y 156-158. Las toxinas ADP-ribosilantes bacterianas y los derivados destoxificados de los mismos se pueden usar como adyuvantes en la invención. De manera preferente, la proteína se deriva de E. coli (enterotoxina "LT" térmicamente lábil de E. coli) , cólera ("CTAB"), tos ferina ("PT"). El uso de toxinas destoxificados ado-ribosilantes como adyuvantes mucosales se describen en la referencia 159 y como adyuvantes parenterales en la referencia 160. La toxina o el toxoide están preferentemente en la forma de una halotoxina, que comprende tanto subunidades A y B. De manera preferente, la subunidad A contiene una mutación destoxificante; de manera preferente, la subunidad B no está mutada. De manera preferente, el adyuvante es un mutante de LT destoxificado tal como LT-K63, LT-R72, y LT-G192. El uso de toxinas ADP-ribosilantes y derivados destoxificados de las mismas, particularmente LT-K63 y LT-R72, como adyuvantes se pueden encontrar en las referencias 161-168. La referencia numérica para las sustituciones de aminoácidos se basa de manera preferente en alineaciones de las subunidades A y B de las toxinas ADP-ribosilantes se encuentran en la referencia 169, incorporada específicamente en la presente como referencia en su totalidad.
F. Inmunomoduladores Humanos Los inmunomoduladores humanos adecuados para el uso como adyuvantes en la invención incluyen citocinas, tal como interleucinas (por ejemplo, IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-12 [170], etc.) [171], interferones (por ejemplo, interferon-?) , factor estimulador de colonias de macrófagos, y factor de necrosis tumoral.
G. Bioadhesivos y Mucoadhesivos También se pueden usar bioadhesivos y mucoadhesivos como adyuvantes en la invención. Los bioadhesivos adecuados incluyen microesferas esterificadas de ácido hialurónico [172] o mucoadhesivos tal como derivados reticulados de poli (ácido acrílico), alcohol polivinílico, polivinil-pirolidona, polisacáridos y carboximetilcelulosa. También se pueden usar quitosan y derivados del mismo como adyuvantes en la invención [173] .
H. Micropartículas También se pueden usar micropartículas como adyuvantes en la invención. Las micropartículas (es decir, una partícula de ~ 100 nm a ~ 150 µm de diámetro, de manera más preferente ~ 200 nm a ~ 300 µm de diámetro, y de manera más preferente -500 nm a ~ 10 µm de diámetro) formadas de materiales que son biodegradables y no tóxicos (por ejemplo, un poli (ácido a-hidroxi) , un ácido polihidroxibutírico, un poliortoéster, un polianhídrido, una policaprolactona, etc.), con poli (láctido-co-glicólido) se prefieren, opcionalmente tratadas para tener una superficie negativamente cargada (por ejemplo con SDS) o una superficie positivamente cargada (por ejemplo, con un detergente catiónico, tal como CTAB) .
I. Liposomas (Capítulos 13 y 14 de Referencia 117) Los ejemplos de formulaciones de liposomas adecuadas para el uso como adyuvantes se describen en las referencias 174-176.
J. Formulaciones de Polioxietilen-Éter y Polioxietilen-Éster Los adyuvantes adecuados para el uso en la invención incluyen polioxietilen-éteres y polioxietilen-ésteres [177] . Estas formulaciones incluyen además agentes tensioactivos de polioxietilen-sorbitan-éster en combinación con un octoxinol [178] así como agentes tensioactivos de polioxietilen-alquil-éteres o esteres en combinación con al menos un agente tensioactivo no iónico adicional tal como un octoxinol [179] . Los polioxietilen-eteres preferidos se seleccionan del siguiente grupo: polioxietilen-9-lauril-éter (laureth 9) , polioxietilen-9-esteoril-éter, polioxietilen-8-esteoril-éter, polioxietilen-4-lauril-éter, polioxietilen-35-lauril-éter, y polioxietilen-23-lauril-éter .
K. Polifosfaceno (PCPP) Se describen formulaciones de PCPP, por ejemplo, en referencias 180 y 181. L. Péptidos de Muramilo Los ejemplos de péptidos de muramilo adecuados para el uso como adyuvantes en la invención incluyen N-acetil-muramil-L-treonil-D-isoglutamina (thr-MDP) , N-acetil- normuramil-L-alanil-D-isoglutamina (nor-MDP) , y N-acetilmuramil-L-alanil-D-isoglutaminil-L-alanina-2- (1 ' -2 ' -dipalmitoil-sn-glicero-3-hidroxifosforiloxi) -etilamina MTP-PE) .
M. Compuestos de Imidazoquinolona Los ejemplos de compuestos de imidazoquinolona adecuados para el uso como adyuvantes en la invención incluyen Imiquamod y sus homólogos (por ejemplo, "resiquimod 3M"), descrito adicionalmente en las referencias 182 y 183.
N. Compuestos de Tiosemicarbazona Los ejemplos de compuestos de tiosemicarbazona, así como métodos para formular, elaborar y detectar compuestos, todos adecuados para el uso como adyuvantes en la invención incluyen aquéllos descritos en la referencia 184. Las tiosemicarbazonas son particularmente efectivas en la estimulación de las células mononucleares de sangre periférica humana para la producción de citocinas, tal como TNF-a.
O. Compuestos de Triptantrina Los ejemplos de compuestos de triptantrina, así como métodos para formular, elaborar y detectar compuestos todos adecuados para el uso como adyuvantes en la invención incluyen aquéllos descritos en la referencia 185. Los compuestos de triptantrina son particularmente efectivos en la estimulación de células mononucleares de sangre periférica humana para la producción de citocinas, tal como TNF-a. La invención también puede comprender combinaciones de aspectos de uno o más de los adyuvantes identificados anteriormente. Por ejemplo, se pueden usar las siguientes combinaciones como composiciones adyuvantes en la invención: (1) una saponina y una emulsión de aceite en agua [186] ; (2) una saponina (por ejemplo, QS21) + un derivado no tóxico de LPS (por ejemplo, 3dMPL) [187] ; (3) una saponina (por ejemplo, QS21) + un derivado no tóxico de LPS (por ejemplo, 3dMPL) + un colesterol; (4) una saponina (por ejemplo, QS21) + 3dMPL + IL-12 (opcionalmente + un esterol) [188] M (5) combinaciones de 3dMPL con, por ejemplo, QS21 y/o emulsiones de aceite en agua [189] ; (6) SAF, que contiene 10 % de escualeno, 0.4 % de Tween 80MR, 5 % de polímero de bloque plurónico L121, y thr-MDP, ya sea microfluidizado en una emulsión de submicrones o sometido a vórtice para generar una emulsión de tamaño más grande de partícula. (7) Sistema adyuvante RibiR (RAS), (Ribi Immunochem) que contiene 2 % de escualeno, 0.2 % de Tween 80, y uno o más componentes de pared de célula bacteriana del grupo que consiste de monofosforil-lípido A (MPL) , dimicolato de trehalosa (TDM) , y la estructura de la pared celular (CWS) , de manera preferente MPL + CWS (DetoxR) ; y (8) una o más sales minerales (tal como sal de aluminio) + un derivado no tóxico de LPS (tal como 3dMPL) . En el capítulo 7 de la referencia 117 se describen otras sustancias que actúan como agentes inmunoestimuladores . El uso de adyuvantes de sales de aluminio se prefiere de manera particular, y en general se adsorben los antígenos a estas sales. Los conjugados MenjugateMR y NeisVac-CMR usan un adyuvante de hidróxido, en tanto que MeningitecMR usa un adyuvante de fosfato. Es posible en composiciones de la invención adsorber algunos antígenos a un hidróxido de aluminio pero tiene otros antígenos en asociación con un fosfato de aluminio. En general, sin embargo, se prefiere usar sólo una sal individual, por ejemplo, un hidróxido o un fosfato, pero no ambos. No todos los conjugados necesitan ser adsorbidos, es decir, algunos o todos pueden ser libres en la solución.
Métodos de Tratamiento La invención también proporciona un método para formular una respuesta inmunitaria en un mamífero, que comprende administrar una composición farmacéutica de la invención al mamífero. La respuesta inmunitaria es preferentemente protectora y comprende de manera preferente anticuerpos. El método puede formular una respuesta de refuerzo.
El mamífero es preferentemente un humano. Donde la vacuna es para uso profiláctico, el humano es preferentemente un niño (por ejemplo, un niño que empieza a andar o un bebé) o un adolescente; donde la vacuna es para uso terapéutico, el humano es preferentemente un adulto. También se puede administrar una vacuna propuesta para niños a adultos, por ejemplo, para valorar la seguridad, dosis, inmunogenicidad, etc. Una clase preferida de humanos para el tratamiento son mujeres en la edad de tener niños (por ejemplo adolescentes y mayores) . Otra clase preferida son mujeres embarazadas. La invención también proporciona una composición de la invención para el uso como un medicamento. El medicamento es capaz de manera preferente de formular una respuesta inmunitaria en un mamífero (es decir, es una composición inmunogénica) y es de manera más preferente una vacuna . La invención también proporciona el uso de un conjugado de la invención en la elaboración de un medicamento para formular una respuesta inmunitaria en un mamífero. Estos usos y métodos son de manera preferente para la prevención y/o tratamiento de una enfermedad provocada por S. agalactiae, por ejemplo, sepsis neonatal o bacteremia, pneumonía neonatal, meningitis neonatal, endometritis, osteomielitis, artritis séptica, etc. El sujeto en el cual se previene la enfermedad no puede ser el mismo como el sujeto que recibe el conjugado de la invención. Por ejemplo, se puede administrar un conjugado a una mujer (antes o durante la preñez) a fin de proteger a la criatura (llamada "inmunización maternal" [190-192] ) . Una manera de verificar la eficacia del tratamiento terapéutico comprende monitorizar la infección de GBS después de la administración de la composición de la invención. Una manera para verificar la eficacia del tratamiento profiláctico comprende monitorizar las respuestas inmunitarias contra los antígenos de GBS después de la administración de la composición. Las composiciones preferidas de la invención pueden conferir un título de anticuerpos en un paciente que es superior a los criterios para seroprotección para cada componente antigénico para un porcentaje aceptable de sujetos humanos. Los antígenos con un título asociado de anticuerpos por arriba del cual un hospedador se considera que está seroconvertido contra el antígeno son bien conocidos, y estos títulos se publican por organizaciones tal como la HO. De manera preferente, más del 80 % de una muestra estadísticamente significativa de sujetos se seroconvierte, de manera más preferente más de 90 %, de manera aún más preferente más de 93 % y de manera más preferente 96-100 %. Las composiciones de la invención se administrarán en general directamente a un paciente. Se puede lograr la distribución directa por inyección parenteral (por ejemplo de manera subcutánea, intraperitonealmente, de manera intravenosa, intramuscularmente, o en el espacio intersticial de un tejido), o por administración rectal, oral, vaginal, tópica, transdérmica, intranasal, ocular, aural, pulmonar u otra mucosal. La administración intramuscular al muslo o el brazo superior se prefiere. La inyección puede ser mediante una aguja (por ejemplo, una aguja hipodérmica) , pero se puede usar de manera alternativa inyección libre de aguja. Una dosis intramuscular típica es de 0.5 ml . La invención se puede usar para producir inmunidad sistémica y/o mucosal. El tratamiento de dosificación puede ser un programa de dosis individual o un programa de múltiples dosis. Se pueden usar múltiples dosis en un programa de inmunización primaria y/o en un programa de inmunización de refuerzo. Se puede seguir un programa de dosis primaria por un programa de dosis de refuerzo. Se puede determinar por rutina la sincronización adecuada entre la dosis de cebadura (por ejemplo, entre 4-16 semanas) , y entre la cebadura el refuerzo.
Antígenos de Proteína de GBS Como se menciona anteriormente, las proteínas de GBS se pueden incluir en composiciones de la invención. Éstas se pueden usar como proteínas portadoras para conjugados de la invención, proteínas portadoras para otros conjugados, o como antígenos no conjugados de proteína. Los antígenos de proteína de GBS para el uso con la invención incluyen aquéllos descritos en las referencias 94 y 107-109. Se conocen cinco antígenos preferidos de proteína de GBS para el uso con la invención como: GBS67; GBS80; GBS104; GBS276; y GBS322 [ver referencia 94] . Se dan más adelante los detalles adicionales de estos cinco antígenos . Las secuencias de longitud completa para estas cinco proteínas de GBS son SEQ ID NOs 1 a 5 en la presente. Las composiciones de la invención de esta manera pueden incluir (a) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NOs 1 a 5, y/o (b) un polipéptido que comprende (i) una secuencia de aminoácidos que tiene la identidad de secuencia a una o más de SEQ ID NOs 1 a 5 y/o (ii) un fragmento de SEQ ID NOs 1 a 5. Dependiendo del SEQ ID NO particular, el grado de identidad de secuencia en (i) es preferentemente mayor de 50% (por ejemplo, 60 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más) .
Estos polipéptidos incluyen homólogos, ortólogos, variantes alélicas y mutantes funcionales. Típicamente, 50 % de identidad o más entre dos secuencias de polipéptido se considera que es una indicación de equivalencia funcional. De manera preferente se determina la identidad entre los polipéptidos por el algoritmo de búsqueda de homología de Smith-Waterman como se implementa en el programa MPSRCH (Oxford Molecular) , usando una búsqueda de separación de afinidad con parámetros penalidad por abertura de separación = 12 y penalidad por extensión de separación = 1. Dependiendo del SEQ ID NO particular, los fragmentos de (ii) deben comprender al menos n aminoácidos consecutivos de las secuencias, y dependiendo de la secuencia particular, n es 7 o más (por ejemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100 o más) . El fragmento puede comprender a menos una célula T, o de manera preferente, un epítopo de célula B de la secuencia. Los epítopos de células T y B se pueden identificar empíricamente (por ejemplo usando PEPSCAN [110, 111] o métodos similares) , o se pueden predecir (por ejemplo, usando el índice antigénico de Jameson-Wolf [112] , planteamientos basados en matriz [113] , TEPITOPE [114] , redes neurales [115] , OptiMer y EpiMer [116, 117] , ADEPT [118] , Tsites [119] , hidrofilicidad [120] , índice antigénico [121] o los métodos descritos en la referencia 122, etc.).
Otros fragmentos preferidos son SEQ ID NOs 1 a 5 sin su residuo de aminoácido N-terminal o sin su péptido de señal N-terminal. La remoción de uno o más dominios, tal como una región de secuencia de señal o guía, una región transmembrana, una región citoplásmica o una porción de fijación a pared celular se pueden usar. Los fragmentos preferidos se dan a continuación (SEQ ID NOs 6 a 19) . Estos polipéptidos pueden incluir, en comparación a SEQ ID NOs 1 a 5, uno o más (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, etc.) reemplazos conservadores de aminoácidos, es decir, reemplazos de un aminoácido con otro que tiene una cadena lateral relacionada. Los aminoácidos genéticamente codificados se dividen en general en cuatro familias: (1) acida, es decir, aspartato, glutamato; (2) básica, es decir, lisina, arginina, histidina; (3) no polar, es decir, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano; y (4) polar no cargada, es decir, glicina, asparagina, glutamina, cistina, serina, treonina, tirosina. La fenilalanina, triptofano y tirosina algunas veces se clasifican conjuntamente como aminoácidos aromáticos. En general, la sustitución de aminoácidos individuales dentro de estas familias no tiene un efecto mayor en la actividad biológica. Los polipéptidos también pueden incluir una o más (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, etc.) supresiones individuales de aminoácidos con relación a SEQ ID NOs 1 a 5. Los polipéptidos también pueden incluir uno o más (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, etc.) inserciones (por ejemplo, cada uno de 1, 2, 3, 4 ó 5 aminoácidos) con relación a SEQ ID NOs 1 a 5. Los polipéptidos de la invención se pueden preparar de muchas maneras, por ejemplo, por síntesis química (en totalidad o en parte) , al digerir los polipéptidos más largos usando proteasas, por traducción de ARN, por purificación del cultivo celular (por ejemplo, de la expresión recombinante) , del organismo mismo (por ejemplo, después del cultivo bacteriano, o directo de pacientes), etc. Un método preferido para la producción de péptidos < 40 aminoácidos de largo comprende la síntesis química in vi tro [123, 124] . La síntesis de péptidos de fase sólida se prefiere de manera particular, tal como métodos basados en la química de tBoc o Fmoc [125] . La síntesis enzimática [126] también se puede usar en parte o en totalidad. Como una alternativa a la síntesis química, se puede usar síntesis biológica, por ejemplo, los polipéptidos se pueden producir por traducción. Esto se puede llevar a cabo in vi tro o in vivo. Los métodos biológicos se restringen en general a la producción de polipéptidos en base a L-aminoácidos, pero se puede usar manipulación de maquinaria de traducción (por ejemplo, de moléculas de ARNt de aminoacilo) para permitir la introducción de D-aminoácidos (o de otros aminoácidos no naturales, tal como yodotirosina o metilfenilalanina, azidohomoalanina, etc.) [127]. Donde se incluyen D-aminoácidos, sin embargo, se prefiere usar síntesis química. Los polipéptidos de la invención pueden tener modificaciones covalentes en el C-término y/o N-término. Si estas proteínas de GBS se incluyen en composiciones de la invención entonces pueden tomar varias formar (por ejemplo, nativa, fusiones, glicosiladas, no glicosiladas, lapidadas, no lapidadas, fosforiladas, no fosforiladas, miristoiladas, no miristoiladas, monoméricas, multiméricas, en partículas, desnaturalizadas, etc.). De manera preferente, se usan en forma purificada o sustancialmente purificada, es decir, sustancialmente libre de otros polipéptidos (por ejemplo, libre de polipéptidos que se presentan de forma natural) , particularmente de otros polipéptidos de GBS o de células hospedadoras) .
GBS67 La secuencia de nucleótidos y aminoácidos de GBS67 secuenciada de la cepa 2603 V/R del serotipo V se exponen en la referencia 94 como SEQ ID NOs 3745 y 3746. La secuencia de aminoácidos es SEQ ID NO: 1 en la presente: MRBYQKFSKI TLS FC SQIPLNTNVLGESTVPENGAKGKLWKKTDDQNKPLSKATFVLKTTAHPESKIEKVTAELT GEATFDN IPGDYT SEETAPEGYKKTNQT QVKVESNGKTTIQNSGDKNSTIGQNQEELDKQYPPTGIYEDTKESYK EHVKGSVPNGKSEA AVNPYSSEGEHIREIPEGTLSKRISEVGDLAHNKYKIELTVSGKTIVKPVDKQKPLDWFV DN SNSMNNDGPNFQRHNKAKKAAEA GTAVKDI GANSDNRVALVTYGSDIFDGRSVDWKGFKEDDKYYGLQTKFTIQTE NYSHKQLTNNAEEIIKRIPTEAPKAK GSTTNGLTPEQQKEYYLS VGETFTMKAFMEADDILSQV RNSQKIIVHVTD GVPTRSYAINNFKLGASYESQFEQ KKNGY NKSNFLLTDKPEDIKGNGESYFLFPLDSYQTQIISGNLQ HYLDLNL NYPKGTIYRNGPVKEHGTPTKLYINS KQK YDIFNFGIDISGFRQVYNEEYKKNQDGTFQKLKEEAFKLSDGEITE RSFSSKPEYY?PIVTSADTSNNEI SKIQQQFETI TKENSIV GTIEDPMGDKIN1QLGNGQTLQPSDYTLQGNDGSV MKDGIATGGPNNDGGI KGVKLEYIGNKLYVRGLNLGEGQKVTLTYDVKLDDSFISNKFYDTNGRTTLNPKSEDPNTLR DFPIPKIRDVREYPTITIKNEKK GEIEFIKVDKDNNK LLKGATFELQEFNEDYK YLPIKNNNSKWTGENGKISYK DLKDGKYQ IEAVSPEDYQKITNKPILTFEWKGSIKNIIAVNKQISEYHEEGDKHLITNTHIPPKGIIEWTGGKGILS r- FILIGGAMMSIAGGIYI KRYKKSSDMSIK D D GBS67 contiene una región transmembrana de C- término que se indica por la región subrayada más cercana al C-término de SEQ ID NO: 1 anterior. Se pueden remover uno o más aminoácidos de la región de transmembrana, o el 0 aminoácido se puede truncar antes de la región de transmembrana. Un ejemplo de este fragmento de GBS67 se expone a continuación con SEQ ID NO: 18. MRKYQKFSKI TISLFC SQIP NTNVLGESTVPENGAKGK WKKTDDQNKPLSKATFVLKTTAHPESKIE?CV AELT GEATFDNLIPGDYT SEETAPEGYKKTNQTWQVKVESNGKTTIQNSGDKNSTIGQNQEE DKQYPPTGIYEDTKESYKL EHVKGSVPNGKSEAKAVNPYSSEGEHIREIPEGTLSKRISEVGDLAHNKYKIELTVSGKTIVKPVDKQKPLDWFV1DN SNSMNNDGPNFQRHNKAKKAAEALGTAVKDILGANSDNRVALVTYGSDIFDGRSVDWKGFKEDDKYYGLQTKFTIQTE NYSHKQLTNNAEEIIKRIP'TEAPKAKWGSTTNG TPEQQKEYYLSKVGETFTMKAF EADDI SQVNRNSQKIIVHVTD GVPTRSYAINNFKLGASYESQFEQMKK GYLNKSNFLLTDKPEDIKGNGESYFLFPLDSYQTQIISGNLQKLHY D NL 5 NYPKGTIYRNGPVKEHGTPTKLYINSLKQKNYDIFNFGIDISGFRQVYNEEYKKNQDGTFQKIJKEEAFKLSDGEITE M RSFSSKPEY^TPIVTSADTSNNEILSKIQQQFETILTKENSIVNGTIEDPMGDKINLQLGNGQT QPSDYTLQGNDGSV MKDGIATGGPNNDGGILKGVKLEYIGNKLYVRGLN GEGQKVTLTYDVK DDSFISNKFYDTNGRTTLNPKSEDPNTLR DFPIPKIRDVREYPTITIKNEKKGEIEFIKVDKDNNKLLLKGATFE QEFNEDYK YLPIÍCNNNSKWTGENGKISYK DLKDGPYQLXEAVSPEDYQKITNKPI TFEWKGSIKNIIAVNKQISEYHEEGDKHLITNTHIPPKGIIPMTGGKGI S GBS67 contiene un motivo de aminoácidos indicativo de un ancla en pared celular, mostrado en letras itálicas en 0 SEQ ID NO: 1 anterior. En algunos sistemas de células hospedadoras recombinantes, puede ser preferible remover este motivo para facilitar la secreción de una proteína recombinante de GBS67 de la célula hospedadora. Por consiguiente, en un fragmento preferido de GBS67 para el uso 5 en la invención, la transmembrana y el motivo de ancla de pared celular se remueven de GBS67. Un ejemplo de este fragmento de GBS67 se expone posteriormente como SEQ ID NO: 19. MR YQKFSKI TLS FC SQIP NTNV GESTVPENGAKGKLWKKTDDQNKPLSKATFVLK TAHPESKIEKVTAELT GEATFDNLIPGDYT SEETAPEGYKKTNQTWQVKVESNGKTTIQNSGDKNSTIGQNQEELDKQYPPTGIYEDTKESYKL EHVKGSVPNGKSEAKAVNPYSSEGEHIREIPEGTLSKRISEVGDLAHN YKIE TVSGKTIVKPVDKQKPLD VFVLDN SNSMNNDGP'NFQRHNKAKKAAEALGTAVKDI GANSDNRVALVTYGSDIFDGRSVDWKGFKEDDKYYGLQTKFTIQTE NYSHKQLTNNAEEIIKRIPTEAPKAKWGSTTNGLTPEQQKEYYLSKVGETFTMKAFMEADDILSQVNRNSQKIIVHVTD GVPTRSYAINNFKLGASYESQFEQMKK GY NKSNF TDKPEDIKGNGESYFLFPLDSYQTQIISGNLQKLHYLD NL NYPKGTIYRNGPVKEHGTPTKLYIUS KQKNYDIFNFGIDISGFRQVYNEEY KNQDGTFQKLKEEAFKLSDGEITELM RSFSSKPEYYTPIVTSADTSNNEILSKIQQQFETILTKENSIVNGTIEDPMGDKIN Q GNGQTLQPSDYT QGNDGSV MKDGIATGGPNNDGGI KGVK EYIGNK YVRGLNLGEGQKVTLTYDV DDSFISNKFYDTNGRTTLNPKSEDPNTLR DFPIPKIRDVREYPTITIKNEKKLGEIEFIKVDKDNNK LLKGATFELQEFNEDYKLYLPIKNNNSKWTGENGKISYK DLKDGKYQLIEAVSPEDYQ ITNKPI TFEWKGSIKNIIAVNKQISEYHEEGDKHLITNTHIPPKGI GBS80 GBS80 se refiere a una proteína putativa de la familia de ancla de superficie de pared celular. Las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos de GBS80 secuenciadas de la cepa 2603 V/R aislada del serotipo V se exponen en la referencia 94 como SEQ ID NOs 8779 y 8780. La secuencia de aminoácidos se expone posteriormente como SEQ ID NO: 2. MKLSKKL FSAAV TMVAGSTVEPVAQFATGMSIVRAAEVSQERPAKTTVNIYK QADSYKSEITSNGGIENKDGEVIS NYAK GDNVKGLQGVQFKRYKVKTDISVDELKKLTTVEAADAKVGTILEEGVSLPQKTNAQG WDALDSKSNVRY YV EDLKNSPSNITKAYAVPFV ELPVANSTGTGFLSEINIYPKNWTDEPKTDKDVKKLGQDDAGYTIGEEFEWFLKSTIP ANLGDYEKFEITDKFADGLTYKSVGKIKIGSKTLNRDEHYTIDEPTVDNQNTLKITFKPEKFKEIAELL GMT VKNQD ALDKATANTDDAAFLEIPVASTINEKAVLGKAIENTFELQYDHTPDKADNP PSNPPRKPEVHTGGKRFVKKDSTETQT LGGAEFDLLASDGTAVKWTDA IKANTNK YIAGEAVTGQPIKLKSHTDGTFEIKGLAYAVDANAEGTAVTYK KETKA PEGYVIPDKEIEFTVSQTSYNTKPTDITVDSADATPDTIKNNKRPSIPWGGGIGTAIFVAIG?AVMAF?VKGMKRRTKD GBS80 contiene una región de secuencia de señal o guía N-terminal que se indica por la secuencia subrayada anterior. Uno o más aminoácidos de la región de secuencia de señal o guía de GBS80 se pueden remover. Un ejemplo de este fragmento de GBS80 se expone a continuación como SEQ ID NO : 6 : AEVSQERPAKTTVNIYKLQADSYKSEITSNGGIENKDGEVISNYAKLGDNVKGLQGVQFKRYKVKTDISVDELKK TTV EAADAKVGTILEEGVSLPQKTNAQGLWDALDSKSNVRYLYVED K SPSNITKAYAVPFV E PVANSTGTGFLSEIN I PKNWTDEPKTDKDVKKLGQDDAGYTIGEEFK FLKSTIPANLGDYEKFEITDKFADGLTYKSVGKIKIGSKTLNRD EHYTIDEPTVDNQNT KITFKPEKFKEIAELLKGMTLVKNQDALDKATANTDDAAF EIPVASTINEKAVLGKAIENTF ELQYDHTPDKADNPKPSNPPRKPEVKTGGKRFVKKDSTETQTLGGAEFD LA?DGTAVKWTDALIKANTNK YIAG?AV TGQPI KSHTDGTFEIKGLAYAVDANAEGTAVTYKLKETKAPEGYVI PDKEIEFTVSQTSYNTKPTDITVDSADATPD TIKNNKRPSIPNTGGIGTAIFVAIGAAVMAFAVKGMKRRTKDN GBS80 contiene una región transmembrana C- terminal que se indica por la secuencia subrayada cerca del extremo de SEQ ID NO : 2 anterior . Se pueden remover uno o más aminoácidos de la región transmembrana y/o una región citoplásmica . Un ej emplo de este fragmento se expone a continuación como SEQ ID NO : 7 . MKLSKK LFSAAVLTMVAGSTVEPVAQFATGMSIVRAAEVSQERPAKTTVNIYKLQADSYKSEITSNGGIENKDGEVIS NYAK GDNVKG QGVQFKRYKVKTDISVDE KK TTVEAADAKVGTILEEGVSLPQKTNAQG WDA DSKSNVRYLYV EDLK SPSNITKAYAVPFV ELPVANSTGTGFLSEINIYP NWTDEPKTDKDVKKLGQDDAGYTIGEEFKWFLKSTIP AN GDYEKFEITDKFADG TYKSVGKIKIGSKTLNRDEHYTI DEPTVDNQNTLKITFKPEKFKEIAELLKGMTLVKNQD ALDKATA TDD?AFLEIPVASTINEÍCAVLGKAIENTFELQYDHTPDKADNPKPSNPPRKPEVHTGGKRFVKKDSTETQT GGAEFD LASDGTAVKWTDALIKANTNKNYIAGEAVTGQPIKLKSHTDGTFEIKGLAY?VDANAEGTAVTYKLKETKA PEGYVIPDKEIEFTVSQTSYNTKPTDITVDSADATPDTIKNNKRPSIPNGG GBS80 contiene un motivo de aminoácidos indicativo de un ancla de pared celular, mostrado en letras itálicas en SEQ ID NO: 2 anterior. En algunos sistemas de células hospedadoras recombinantes, puede ser preferible remover este motivo para facilitar la secreción de una proteína recombinante de GBS80 de la célula hospedadora. De esta manera, las regiones transmembrana y/o citoplásmicas y el motivo de ancla de pared celular se pueden remover de GBS80. Un ejemplo de este fragmento se expone a continuación como SEQ ID NO: 8.
K SKI LFSAAVLTMVAGSTVEPVAQFATGMSIVRAAEVSQERPAKTTV IYKLQADSYKSEITSNGGIENKDGEVIS NYAK GDNVKG QGVQFKRYKVKTDISVDELKK TTVEAADA VGTILEEGVSLPQKTNAQG VVDALDSKSNVRY YV EDLKNSPSNITKAYAVPFV ELPVANSTGTGFLSEINIYPKNWTDEPK DKDVKK GQDDAGYTIGEEFK FLKSTIP ANLGDYEKFEITDKFADG TY SVGKIKIGSKTLNRDEHYTIDEPTVDNQNTLKITFKPEKFKEIAELLKGMT VKNQD ALDKATANTDDAAF EIPVASTINEKAV GKAIENTFELQYDHTPDKADNPKPSNPPRKPEVHTGGKRFVKKDSTETQT LGGAEFD LASDGTAVK TDALIKANTNKNYIAGEAVTGQPIKLKSHTDGTFEIKG AYAVDANAEGTAVTYKLKETKA PEGYVIPDKEIEFTVSQTSYNTKPTDITVDSADATPDTIKNNKRPS De manera alternativa, en algunos sistemas de células hospedadoras recombinantes, puede ser preferible usar el motivo de ancla de pared celular para anclar la proteína recombinantemente expresada a la pared celular. El dominio extracelular de la proteína expresada se puede escindir durante la purificación o la proteína recombinante se puede dejar anclada a ya sea las células hospedadoras inactivadas o a las membranas celulares en la composición final . En una modalidad, la región de secuencia de señal o guía, las regiones transmembranas y citoplásmicas y el motivo de ancla de pared celular se remueven de la secuencia de GBS80. Un ejemplo de este fragmento de GBS80 se expone a continuación como SEQ ID NO: 9: AEVSQERPA TTVNIYK QADSYKSEITSNGGIENKDGEVISNYAKLGDNVKG QGVQFKRYÍVKTDISVDELKKLTTV EAADAKVGTILEEGVSLPQKTN?QGLWDALDSKSNVRY YVEDLKNSPSNITKAYAVPFV E PVANSTGTGFLSEIN IYPKNVVTDEPKTDKDVKKLGQDDAGYTIGEE?< F KSTIPAN GDYEKFEITDKFADGLTYKSVGKIKIGSKT NRD EH YT I DEPT VDNQNT KIT FKPEKFKEI AE KGMTLVKNQDAL DKATANT DDAAFLE I PVAST INEKAVLG AI ENTF ELQYDHTPDKADNPKPSNPPRKPEVHTGGKRFVKKDSTETQT GGAEFDL ASDGTAVK TDA IKANTNKNYIAGEAV TGQPIKLKSHTDGTFEIKGLAYAVDANA?GTAVTYK KETKAPEGYVIPDKEIEFTVSQTSYNTKPTDITVDSADATPD TIKNNKRPS Un fragmento particularmente inmunogénico de GBS80 se indica hacia el N-término de la proteína, y se da en la presente como SEQ ID NO: 10: AEVSQERPAKTTVNIYKLQADSY SEITSNGGIENKDGEVISNY?KLGDNVKGLQGVQFKRYKVKTDISVDELKKLTTV E?ADAKVGTILEEGVSLPQKTNAQGLVVDA DSKSNVRYLYVEDLKNSPSNITKAYAVPFVLELPVANSTGTGF SEIN I PK WTDEPKTDKDVKKLGQDDAGYTIGEEFK FLKSTIPANLGDYEKFETTDKFADGLTYKSVGKIKIGSKTLNRD EHYTIDEPTVDNQNTLKITFKPEKFKEIAE KG GBS104 GBS104 se refiere a una proteína putativa de la familia de ancla de superficie de pared celular. Se ha referido como emaA. Las secuencias de nucleótido y de aminoácidos de GBS104 secuenciadas de la cepa 2603 V/R aislada del serotipo V se exponen en la referencia 94 como SEQ ID NO: 8777 y SEQ ID NO: 8778. La secuencia de aminoácidos es SEQ ID NO: 3 en la presente: KKRQKIWRGLSVTLLILSQIPFGI VOGETQDTNQA GKVIVKKTGDNATP GKATFVLKNDNDKSETSHETV?GSGE ATFENIKPGDYTLREETAPIGYKKTDKT KVKVADNGATIIEGMDADKAEKRKEV NAQYPKSAIYEDTKENYP V VE GSKVGEQYKA NPINGKDGRREIAEG LSKKITGVNDLDKNKYKIE TVEGKTTVETKE NQP DVVV LDNSNSMNNE RAN SQRA KAGEAVEK IDKITSNKDNRVA VTYASTIFDGTEATVSKGVADQNGKALNDSVS DYHKTTFTATTHNY SYLNLTNDANEVNILKSRIPKEAEHINGDRTLYQFGATFTQKALMKANEILETQSSNARKKLIFHVTDGVPTMSYAINF NPYISTSYQNQFNSFLNKIPDRSGI QEDFIINGDDYQIVKGDGESFKLFSDRKVPVTGGTTQAAYRVPQNQLSVMSNE GYAINSGYIY Y RDYNWVYPFDPK'KKVSATKQIKTHGEPTT YFNGNIRPKGYDrFTVGIGVMGDPGATPLEAEKFM QSISSKTENYTNVDDTNKIYDELNKYFKTIVEEKHSIVDGNVTDPMGEMIEFQLKNGQSFTHDDYVLVGNDGSQLKNGV A GGPNSDGGIL DVTVTYDKTSQTIKINH NI.GSGQKW TYDVRLKDNYISNKFYNTNNRTTLSPKSEKEPNTIRDF PIPKIRDVREFPVLTISNQKKMGEVEFI VNKDKHSESLLGAKFQLQIEKDFSGYKQFVPEGSDV TKNDGKIYFKALQ DGNYKLYEISSPDGYIEVKTKPWTFTIQNGEVTNLKADPNANKNQIGY EGNGKHI,ITNTPKRPPGVFPKTGGIGTIV YILVGSTFMJ TICSFRRKQI.
GBS104 contiene una región de secuencia de señal o guía N-terminal que se indica con la secuencia subrayada al comienzo de SEQ ID NO: 3 anterior. Se pueden remover uno o más aminoácidos de la región de secuencia de señal o guía de GBS104. Un ejemplo de este fragmento de GBS104 se expone a continuación como SEQ ID NO: 11. GETQDTNQA GKVIVKKTGDNATPLGKATFV KNDND SETSHETVEGSGEATFENIKPGDYTLREETAPIGYKKTDKT KVKVADNGATIIEGMDADKAE RKEV NAQYPKSAIYEDTKENYPLVNVEGSKVGEQYKALNPINGKDGRREIAEG L SKKITGVND.ÜDKNKYKIELTVEGKTTVETKELNQP DVW LDNSNSM NERANNSQRALKAGEAVEK IDKITSNKDN RVALVTYASTIFDGTEATVSKGVADQNGKA NDSVSWDYHKTTFTATTHNYSY NLTNDANEVNILKSRIPKEAEHING DRTLYQFGATFTQKA MKANEI ETQSSNARKKLIFHVTDGVPT SYAINFNPYISTSYQNQFNSFLNKIPDRSGILQE DFIINGDDYQIVKGDGESFK FSDRKVPVTGGTTQAAYRVPQNQ SVMSNEGYAINSGYIYLYWRDYNWVYPFDPKTKK VSATKQIKTSGEPTTLYFNGNIRP GYDIFTVGIGVNGDPGATPLEAEKFMQSISS TENYTNVDDTNKIYDELNKYFK TIVEEKHSIVDGNVTDPMGEMIEFQLKNGQSFTHDDYVLVGNDGSQ KNGVALGGPNSDGGILKDVTVTYDKTSQTIKI NH N GSGQ VV TYDVRLKDNYISNKFYNTNNRTTLSPKSEKEPNTIRDFPIPKIRDVREFPVLTISNQKKMGEVEFI KVNKDKHSESLLGAKFQ QIEKDFSGYKQFVPEGSDVTTKNDGKIYFKALQDGNYK YEISSPDGYIEVKTKPWTFTI QNGEVTNLKADPNANKNQIGY EGNGKHLITNTPKRPPGVFPK GGIGTIVYI VGSTFMILTICSFRR Q GBS104 contiene una región transmembrana y/o citoplásmica C-terminal que se indica por la región subrayada cerca del extremo de SEQ ID NO: 3 anterior. Se pueden _ remover uno o más aminoácidos de las regiones transmembrana o citoplásmica. Un ejemplo de este fragmento de GBS104 se expone a continuación como SEQ ID NO: 12: MKKRQKIWRGLSVTLLILSQIPFGILVQGETQDTNQALGKVIVKKTGDNATPLGKATFVLKNDNDKSETSHETVEGSGE ATFENIKPGDYTLREETAPIGYKKTDK KVKVADNGATIIEGMDADKAEKRKEV NAQYPKSAIYEDTKENYP VNVE GSBVGEQYKALNPINGKDGRREIAEG ISKKITGVNDLDKNKYKIELTVEGKTTVETKE NQPLDWV LD SNSMNNE RANK?QRALKAGEAVEKLIDKITSNKDNRVALVTYASTIFDGTEATVSKGVADQNGKALNDSVS DYHKTTFTATTHNY SYLNLTNDANEVNILKSRIPKEAEHINGDRTLYQFGATFTQKA MKANEILETQSSNARKK IFHVTDGVPTMSYAINF NPYISTSYQNQFNSFLNKIPDRSGILQEDFIINGDDYQIVKGDGESFKLFSDRKVPVTGGTTQAAYRVPQNQ SVMSNE GYAINSGYIY Y RDYNWVYPFDPKTKKVSATKQIKTHGEPTTLYFNGNIRPKGYDIFTVGIGWGDPGATP EAEKFM QSISSKTENYTNVDDTNKIYDE NKYFKTIVEEKHSIVDGNVTDPMGEMIEFQ KNGQSFTHDDYVLVGNDGSQLKNGV ALGGPNSDGGI KDVTVTYDKTSQTIKINHLNLGSGQKW TYDVR KDNYISNKFYNTNNRTTLSPKSEKEPNTIRDF PIPKIRDVRÉFPVLTISNQKKMGEVEFIKVNKD HSESLLGAKFQiQIEKDFSGYKQFVPEGSDVTTKNDGKIYFKALQ DGNYKLYEISSPDGYIEVKTKPW FTIQNGEVTNLKADPNANKNQIGYLEGNGKHLITNT Se puede remover uno o más aminoácidos de la región de secuencia de señal o guía y uno o más aminoácidos de las regiones transmembrana o citoplásmica. Un ejemplo de este fragmento de GBS104 se expone a continuación como SEQ ID NO: 13: GETQDTNQA G VIVKKTGDNATP GKATFV KNDNDKSE SHETVEGSGE?TFENIKPGDYTLREETAPIGYKKTDKT WKVKVADNGA IIEGMDADKAEKRKEV NAQYPKSAIYEDTKENYPLVNVEGSKVGEQYKALNPINGKDGRREIAEGW SKKITGVNDLDKNKYKIELTVEGKTTVETKELNQP DWV DNSNSMNNERANNSQRALKAGEAVEKI.IDKITSNKDS RVALVTYASTIFDGTEATVSKGVADQNGKALNDSVS DYHKTTFTATTHNYSYLNLTNDANEVNI KSRIPKEAEHING DRTLYQFGATFTQKA MKANEILETQSSNARKK IFHVTDGVPT SYAINFNPYISTSYQNQFNSFLNKIPDRSGILQE DFIINGDDYQIVKGDGESF£LFSDRKVPVTGGTTQAAYRVPQNQ SVMSNEGYAINSGYI.Y Y RpYNWVYPFDPKTKK VSATKQIKTHGEPTTLYFNGNIRPKGYDIFTVGIGVNGDPGATPLEAEKFMQSISSKTENYTNVDDTNKIYDE NKYFK TIVEEKHSIVßGNVTDPMGEMIEFQ KNGQSFTHDDYVLVGNDGSQ KNGVA GGPNSDGGILKDVTVTYDKTSQTIKI NH N GSGQKWLTYDVRLKDNYISNKFY TNNRTT SPKSEKEPNTIRDFPIPKIRDVREFPVLTISNQKKMGEVEFI KVNKDKHSESL GAKFQLQIEKDFSGYKQFVPEGSDVTTKNDGKIYFKAT..QDGNYKLYEI.SSPDGYIEVKTKPWTFTI QNGEVTNLKADPNANKNQIGYLEGNGKHLITNT Los fragmentos adicionales de GBS104 incluyen un fragmento de 830 aminoácidos de GBS104 de los aminoácidos 28-858 (numerados por SEQ ID NO: 3) , un fragmento de 359 aminoácidos de GBS104 de los aminoácidos 28-387, un fragmento de 581 ácidos nucleicos de GBS104 de los aminoácidos 28-609 o un fragmento de 740 aminoácidos de GBS104 de los aminoácidos 28-768.
GBS276 GBS276 se refiere a una peptidasa de C5a. La descripción adicional de GBS276 se puede encontrar en las referencias 128-131. Las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos de GBS276 secuenciadas de la cepa 2603 V/R aislada del serotipo V se exponen en la referencia 94 como SEQ ID NOs 8941 y 8942. La secuencia de aminoácidos es SEQ ID NO: 4 en la presente: MRKKQKLPFDK AIA lSTSI LNAQSDIK?NTVTEDTPATEO?VEPPOPIAVSEESRSSKETKTSOTPSDVGKTV?Dn ANDLAPQAPPKTADTPATSKATIRDLNDPSHVETLQEKAGKGAGTVVAVIDAGFDKNHEA RLTDKTKARYQSKEN EK AKKEHGITYGE V DKVAYYHDYSKDGK AVDQEHGTHVSGI SGNAPSEMKEPYR EGAMPEAQ LLMRVE1VNGLAD YARNYAQAIRDAVNLGAKVINMSFGNAA AYA LPDETKKAFDYAKSKGVSIVTSAGNDSSFGGKPRLP ADHPDYGW GTPAAADSTLTVASYSPDKQLTETATVKTDDHQDKEMPVISTNRFEPNK?YDYAYANRGTKEDDFKDVEGKIALIERGD IDFKDKIANAKKAGAVGVLIYDNQDKGFPIELPNV[)QMPAAFISRRDG LKDNPPKTITFNATPKVLPTASGTiaiSRF SS G TADGMIKPDIAAPGQDILSSVANNKYAK SGTSMSAPLVAGIMGLLQKQYETQYPD TPSERLDLAKKV MSSA TA YDEDEKAYFSPRQQGAGAVDAKKASAATMYVTDKDN?SSKVH NNVSDKFEVTVTVHNKSDKPQELYYQVTVQTDK VDGKHFALAPKA1YETS QKITIPANSSKQVTVP1DASRFSKDLLAQMKNGYFLEGFVRFKQDPT EEL SIPYIGFRG DFGNLSALEKPI?DSKDGSSYYHEANSDAKDQLDGDGLQFYAL NNFTALTTESNPWTIIKAVKEGVENIEDIESSE1T ETIFAGTFAKQDDDSHYYIHRHANGKPYAAISPNGDGNRDYVQFQGTF RNAKN VAEVLDKEGNWWTSEVTEQWKN YNNDLASTLGSTRFEKTR DGKDKDGKVVANGTYTYRVRYTPISSGA EQHTDFDVIVDNTTPEVATSATFSTEDSRLT LASKPKTSQPVfRERIAYTYMDEDLPTTEYISPNEDGTFT PEEAETMEGATVPLKMSDFTYVVEDMAGNITYTPVTR'L EGHSNKPEQDGSDQAPDKKPEAKPEQDGSGQTPDKKKETKPEKDSSGQTPGKTPQKGQSSRT EKRSSKRALAT AST RDQLPTTNDKDTNRLHL K VMTTFFLG GBS276 contiene una región de secuencia de señal o guía N-terminal que se indica por la secuencia subrayada al comienzo de SEQ ID NO: 4 anterior. Se pueden remover uno o más aminoácidos de la región de secuencia de señal o guía de GBS276. Un ejemplo de este fragmento de GBS276 se expone posteriormente como SEQ ID NO: 14: QSDIKANTVTEDTPATEQAVEPPQPIAVSEESRSSKETKTSQTPSDVGETVADDANDLAPQAPAKTADTPATSKATIRD LNDPSHVKTLQEKAGKGAGTWAVIDAGFDK HEAWR TDKTKARYQSKENLEKAKKEHGITYGE VNDHVAYYHDYSK DGKNAVDQEHGTHVSGILSGNAPSEMKEPYRLEGAMPEAQL LMRVEIVNGLADYARNYAQAIRDAV LGAKVINMSFG NAALAYAN PDETKKAFDYAK3KGVSIVTSAGNDSSFGGKPR PLADHPDYGWGTPAAADSTLTVASYSPDKQLTETA TVKTDDHQDKEMPVISTNRFEPNKAYDYAYANRGTKEDDFKDVEGKIALIERGDIDFKDKIANAKKAGAVGVLIYDNQD KGFPIELPNVDQMPAAFISRRDG 1KDNPPKTITFNATPKVLPTASGTKLSRFSS GLTADGNIKPDIAAPGQDI SS VANNKYAKLSGTSMSAPLVAGIMG LQKQYETQYPDMTPSERLD AKKVLMSSATA YDEDEKAYFSPRQQGAGAVDAK KASAATMYVTDKDNTSSKVHLNNVSDKFEVTV VHNKSDKPQELYYQVTVQTDííVDGKHFA APKA YETSWQKITIPA NSSKQVTVPIDASRFSKD LAQMKNGYF EGFVRFKQDPTKEELMSIPYIGFRGDFGNLSA EKPIYDSKDGSSYYHEA NSDAKDQLDGDG QFYALKNNFTALTTESNPWTIIKAVKEGVENIEDIESSEITETIFAGTFAKQDDDSHYYIHRHANG KPYAAISPNGDGNRDYVQFQGTF RNAKNLVAEVLDEÍEGNWWTSEVTEQWK YNNDLASTLGSTRFEKTRWDGKDKD GKWANGTYTYRVRYTPISSGAKEQHTDFDVIVDNTTPEVATSATFSTEDSRLTLASKPKTSQPVYRERIAYTYMDEDL PTTEYISPNEDGTFT PEEAETMEGATVPLKMSDFTYWEDMAGNITYTPVTKLLEGHSNKPEQDGSDQAPDKKPEAKP EQDGSGQTPDKKKETKPEKDSSGQTPGKTPQ GQSSRTLEKRSSKRALATKASTRDQLPTTNDKDTNRLHLLK VMTTF FLG GBS276 contiene una región transmembrana y/o citoplásmica C-terminal que se indica por la secuencia subrayada cerca del extremo de SEQ ID NO: 4 anterior. Se pueden remover uno o más aminoácidos de las regiones transmembrana o citoplásmica de GBS276. Un ejemplo de este fragmento de GBS276 se expone posteriormente como SEQ ID NO: 15: MRKKQK PFDK AIA ISTSIL NAQSDIKANTVTEDTPATEQAVEPPQPIAVSEESRSSKETKTSQTPSDVGETVADD ANDLAPQAPAK ADTPATSKATIRD NDPSHVKTLQEKAGKGAGTWAVIDAGFDKNHEAWR TDKTKARYQSKEN EK AKKEHGITYGEWVNDKVAYYHDYSKDGKNAVDQEHGTHVSGILSGNAPSEMKEPYRLEGAMPEAQLLLMRVEIVNGLAD YARNYAQAIRDAVNLGAKVINMSFGNAA AYAN PDETKKAFDYAKSKGVSIVTSAGNDSSFGGKPRLPLADHPDYGW GTPAAAD?T TVASYSPDKQ TETATVKTDDHQDKEMPVISTNRFEPNKAYDYAYANRGTKEDDFKDVEGKIALIERGD IDFKDKIANAKKAGAVGVLIYDNQDKGFPIELPNVDQMPAAFISRRDGLLLKDNPPKTITFNATPKVLPTASGTKLSRF SSWG TADGNIKPDIAAPGQDILSSVANNKYAKLSGTSMSAPLVAGIMG LQKQYETQYPDMTPSER DLAKKVLMSSA TA YDEDEKAYFSPRQQGAGAVDAKKASAATMYVTDKDNTSS VH NNVSDKFEVTVTVHNKSDKPQELYYQVTVQTDK VDGKHFA APKALYETS QKITIPANSSKQVTVPIDASRFSKD LAQMKNGYF EGFVRFKQDPTíEELMSIPYIGFRG DFGN SA EKPIYDSKDGSSYYHEANSDAKDQ DGDG QFYALKNNFTALTTESNP TIIKAVKEGVENIEDIESSEIT ETIFAGTFAKQDDDSHYYIHRHANGKPYAAISPNGDGNRDYVQFQGTFLRNAKN VAEV D EGNWWTSEVTEQWKN YUNDLAST GSTRFEKTR DGKDKDGKWANGTYTYRVRYTPISSGAKEQHTDFDVIVDNTTPEVATSATFSTEDSRLT LASKPKTSQPVYRERIAYTYMDEDIiPTTEYI?PNEDGTFTLPEEAETMEGATVP KMSDFTYVVEDMAGNITYTPVTKL LEGHSNKPEQDGSDQAPDKKPEAKPEQDGSGQTPDKKKETKPEKDSSGQTPG TPQKGQSSRTLEKRSSKRA ATK Se puede remover uno o más aminoácidos de la región de secuencia de señal o guía y uno o más aminoácidos de las regiones transmembrana o citoplásmica de GBS276. Un ejemplo de este fragmento de GBS276 se expone como SEQ ID NO: 16: QSDIKANTVTEDTPATEQAVEPPQPIAVSEESRSSKETKTSQTPSDVGETVADDAND APQAPAKTADTPATSKATIRD LNDPSHVKTLQEKAGKGAGTWAVIDAGFDKNHEA RLTDKTKARYQSKENLEKAKKEHGITYGE VNDKVAYYHDYSK DGKNAVDQEHGTHVSGI SGNAPSEMKEPYR1EGAMPEAQLLLMRVEIVNGLADYARNYAQAIRDAVNLGAKVINMSFG NAALAYANLPDETKKAFDYAK?KGVSIVTSAGNDSSFGGKPRLP ADHPDYGWGTPAAADST TVASYSPDKQ TETA TVKTDDHQDKEMPVISTNRFEPNKAYDYAYANRGTKEDDFKDVEGKIA IERGDIDFKDKIANAKKAGAVGVLIYDNQD KGFPIELPNVDQMPAAFISRRDG LKDNPPKTITFNATPKVLPTASGTKBSRFSSJGLTADGNIKPDIAAPGQDILSS VANNKYAK SGTSMSAPLVAG1MGL QKQYETQYPD TPSERLDLAKKVLMSSATALYDEDEKAYFSPRQQGAGAVDAK KASAATMYVTDKDNTSSKVHLNNVSDKFEVTVTVHNKSDKPQELYYQVTVQTDKVDGKHFALAPKALYETSWQKITIPA NSSKQVTVPIDASRFSKD AQMKNGYFLEGFVRFKQDPTKEELMSIPYIGFRGDFGNLSALEKPIYDSKDGSSYYHEA NSDAKDQLDGDGLQFYALK NF ALTTESNP TIIKAVKEGVENIEDIESSEITETIFAGTFAKQDDDSHYYIHRHANG KPYAAISPNGDGNRDYVQFQGTFLRNAKNLVAEV DKEGNW TSEVTEQVVKNY ND ASTLGSTRFEKTR DGKDKD GECWANGTYTYRVRYTPISSGAKEQHTDFDVIVDNTTPEVATSATFSTEDSRLT A?KPKTSQPVYRERIAYTYMDED PTTEYISPNEDGTFT PEEAETMEGATVP KMSDFTYVVEDMAGNITYTPVTKL EGHSNKPEQDGSDQAPDKKPEAKP EQDGSGQTPDKKKETKPEKDSSGQTPGKTPQKGQSSRTLEKRSSKRALATK GBS322 GBS322 se refiere a una proteína inmunogénica de superficie, también referida como "sip". Las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos de GBS322 secuenciadas de la cepa aislada 2603 V/R del serotipo V se exponen en la referencia 94 como SEQ ID NOs 8539 y 8540. La secuencia de aminoácidos es SEQ ID NO: 5 en la presente: M KKV LTSTM.AASLLSVASVQAQETDTTWTARTVSEVK?DLVKQDNKSSYTVKYGDT SVISEAMSI DMNV AKINNI ADINLIYPETTLTVTYDQKSHTATSMKIE?PATNAAGQTTATVDLKTNQVSVADQKVS NTISEGMTPEAATTIVSPMK TYS?APALKSKEV AQEQAVSQAAANEQVSPAPVKSITSEVPAAKEEVKPTQTSVSQSTTVSPASVAA?TPAPVAKVAP VRTVAAPRVASVKWTPKVETGASPEHVSAPAVPVTTTSPATDSKLQATEVKSVPVAQKAPTATPVAQPASTTNAVAAH PENAGLQPHVAAYKEKVASTYGV EFSTYRAGDPGDHGKGLAVDFIVGTNQALGNKVAQYSTQNMAANNISYVI QQKF YSNTNSIYGPANTWNAMPDRGGVTANHYDHVHVSFNK GBS322 contiene una región de secuencia de señal o guía N-terminal que se indica por la secuencia subrayada cerca del comienzo de SEQ ID NO: 5. Se puede remover uno o más aminoácidos de la región de secuencia de señal o guía de GBS322. Un ejemplo de este fragmento de GBS322 se expone posteriormente como SEQ ID NO: 17: DLVKQDN SSYTVKYGDTLSVISEAMSIDMNV AKINNIADINLIYPETTLTVTYDQKSHTATS KIETP?TNAAGQTT ATVDLKTNQVSVADQKVS NTISEGMTPEAATTIVSPMKTYSSAPALKSKEV AQEQAVSQAAANEQVSPAPVKSITSE VPAAKEEVKPTQTSVSQSTTVSPASVAAETPAPVAKVAPVRTVAAPRVASVKWTPKVETGASPEHVSAPAVPVTTTSP ATDSKLQATEVKSVPVAQKAPTATPVAQPASTTNAVAAHPENAG QPHVAAYKEKVASTYGV EFSTYRAGDPGDHGKG LAVDFIVGTNQA GNKVAQYSTQNMAANNISYVIWQQKFYSNTNSIYGPANTWNAMPDRGGVTANHYDHVHVSFNK General El término "que comprende" abarca "que incluye" así como "que consiste" por ejemplo una composición "que comprende" X puede consistir exclusivamente de X o puede incluir algo adicional por ejemplo X + Y. El término "aproximadamente" en relación a un valor numérico x significa, por ejemplo, x ± 10 %. La palabra "sustancialmente" no excluye "completamente" por ejemplo, una composición que está "sustancialmente libre" de Y puede estar completamente libre de Y. Donde es necesario, se puede omitir la palabra "sustancialmente" de la definición de la invención . Donde la invención proporciona un proceso que comprende múltiples pasos secuenciales, la invención también puede proporcionar un proceso que comprende menos del número total de pasos. En el primer aspecto de la invención, por ejemplo, la invención proporciona un proceso que comprende los pasos de: (a) oxidar un sacárido capsular de GBS a fin de introducir un grupo aldehido en un residuo terminal de ácido siálico; y (b) someter el grupo aldehido a aminación reductiva. Los pasos (c) y (d) adicionales no se necesitan realizar a fin de caer dentro del alcance de la invención, puesto que el producto de los pasos (a) y (b) tiene utilidad como un compuesto intermedio en la preparación de conjugados, y se puede usar, almacenar, exportar, etc., para uso separado y posterior, por ejemplo en los pasos (c) y (d) . De manera similar, donde un material de sacárido de inicio se procesa ya parcialmente entonces la invención abarca procesos que comprenden sólo los últimos pasos de un método. En el tercer aspecto de la invención, por ejemplo, la invención abarca un proceso que comprende un paso de acoplar un residuo modificado de galactosa a una molécula portadora, en el cual el material de inicio para el proceso es un sacárido que se oxidó anteriormente para introducir un grupo aldehido en un residuo de galactosa. Estos diferentes pasos se pueden realizar en momentos muy diferentes por diferentes personas en diferentes lugares (por ejemplo, en diferentes países) . Se apreciará que los anillos de azúcar pueden existir en la forma abierta y cerrada y que, en tanto que se muestran, en las fórmulas estructurales en la presente las formas cerradas, también se abarcan por la invención las formas abiertas. De manera similar, se apreciara que los azúcares pueden existir en las formas de piranosa y furanosa y que, en tanto que se muestran las formas de piranosa en las fórmulas estructuras en la presente, también se abarcan las formas de furanosa. También se abarcan diferentes formas anoméricas de azúcares.
Se puede representar una amina primaria por la fórmula NH2R. El grupo R será de manera preferente donador de electrones, e incluye C?-8hidrocarbilo, de manera más preferente C?-8alquilo, especialmente metilo. R es de manera preferente -CH3, -C2H5 o -C3H7. el hidrocarbilo puede estar sustituido con uno o más grupos, tal como: halógeno (por ejemplo, Cl, Br, F, I), trihalometilo, -N02, -CN, -N+(C?-6alquil)20-, -S03H, -SOC?-6alquilo, -S02C?-6alquilo, -SO3C1-6alquilo, -OC (=0) OC?_6alquilo, -C(=0)H, -C (=0) C?-6alquilo, 0C(=0) C?-6alquilo, -N(C?-6alquil) 2/ C?-6alquilo, -N (C1-6alquil) 2, -C(=0)N(C?-6alquil)2, -N(C1-6alquil) C (=0) O (C?_ßalquil) , -N(C?-6alquil)C(=0)N(C?-6alquil)2, -C02H, -OC (=0) N(C?_6alquil) 2, N(C?-6alquil)C(=0)C?-6alquilo, -N (C?-6alquil) C (=S) C1-6alquilo, -N(C?-6alquil)S02N(C?.6alquil)a, -C02C1-6alquilo, -S02N(C_.-6alquil)2, -C(=0)NH2, -C (=S) N(C1-6alquil) 2, -N(C?-6alquil) S02C_._ 6alquilo, -N(C?-6alquil) C (=S) N(C?-salquil) 2, -NHC?-6alquilo, -S-C?-6alquilo, o -0-C?-6alquilo. El término "hidrocarbilo" incluye, grupos monovalentes lineales, ramificados o cíclicos que consisten de carbono e hidrógeno. Los grupos de hidrocarbilo incluyen de esta manera grupos alquilo, alquenilo y alquinilo, cicloalquio (incluyendo policicloalquilo) , grupos cicloalquenilo y arilo y combinaciones de los mismos, por ejemplo, grupos alquilcicloalquilo, alquilpolicicloalquilo, alquilarilo, alquenilarilo, cicloalquilarilo, cicloalquenilarilo, cicloalquilalquilo, policicloalquilalquilo, arilalquilo, arilalquenilo, arilcicloalquilo y arilcicloalquenilo. Los hidrocarbilos preferidos son C?-?4hidrocarbilo, de manera más preferente C?-8hidrocarbilo.
Breve Descripción de las Figuras La Figura 1 muestra la oxidación con periodato de un residuo terminal de ácido siálico. La Figura 2 ilustra el primero y segundo aspectos de la invención. La Figura 3 muestra las estructuras de repetición de los sacáridos capsulares en los serotipos la, Ib, II, III y V de GBS. La Figura 4 muestra la diferencia entre las estructuras de repetición en los serotipos la y III de GBS. La Figura 5 muestra dos tipos de conjugado que se pueden preparar. La Figura 6 muestra una reacción de conjugación preferida que usa el succinimidil-diéster de ácido adípico, de acuerdo al primer aspecto de la invención. La Figura 7 muestra una reacción preferida de conjugación que usa el succinimidil-diéster de ácido adípico, de acuerdo al segundo aspecto de la invención. Las figuras 8 y 9 muestran el uso de (8) acriloilación y (9) un haloacilhaluro, para preparar conjugados, después de la aminación reductiva de un aldehido formado por oxidación de un residuo terminal de ácido siálico.
Descripción Detallad de la Invención Se purificó sacárido capsular del serotipo Ib de GBS como se describe en la referencia 15 y luego se re-acetiló como se describe anteriormente. El sacárido se des-N-acetiló para proporcionar grupos amina para enlace. Estos grupos amina se usaron para conjugar covalentemente los sacáridos a toxoide de tétano monomérico (TT) ya sea por aminación reductiva directa (en C8 de ácido siálico, como se describe en la técnica anterior) o mediante un separador de SIDEA (como se describe para sacáridos meningococales en referencia 218) . Se determinó el contenido de ácido siálico en los conjugados y se realizó de acuerdo al método colorimétrico de la referencia 219. La cantidad total de sacárido se extrapoló del contenido de ácido siálico (ácidos siálicos son en promedio 31 % en peso del polímero) . Se determinó la concentración de proteína en el conjugado con el equipo de ensayo de proteína Micro BCA (Pierce) . Una relación en peso de polisacárido: proteína de entre 1 y 4 fue el objetivo, y los resultados fueron como sigue: Para investigar cómo puede afectar la relación de reticulación de los conjugados, se sometieron los sacáridos de la e Ib de GBS purificados a grados variables de oxidación y luego se conjugaron a CRM197. Los resultados fueron como sigue: Se usaron experimentos similares para estudiar diferentes portadores de proteína. Se usaron CRM197 y toxoide de tétano ambos como portadores para el sacárido del tipo III de GBS, y los resultados fueron: Se compararon tres diferentes portadores para los sacáridos del tipo II y V de GBS; toxoide de tétano; CRM197; y albúmina de suero humano. El grado de oxidación fue de 15.3 % para el sacárido de tipo V y de 6.9 % para el sacárido de tipo II. Los resultados fueron: Se probaron de manera separada albúmina de suero humano como un portador para los sacáridos del tipo la (6.7 % oxidado), Ib (8.2 % oxidado), y III (4.1 % oxidado): Se elaboraron conjugados del tipo la, Ib y III usando cuatro diferentes portadores: toxoide de tétano; CRM197; GBS80; y GBS67. Con los portadores de tétano y CRM, los %s de oxidación fueron 9.1 % para la, 14.2 % para Ib y 13 % para III; con los portadores de GBS, los %s fueron 8.2 %, 9.0 % y 7.9 %. Los animales inmunizados con los conjugados entonces se probaron para protección contra los tipos respectivos de GBS (es decir, estimulación homologa) , y los resultados fueron como sigue, expresado como el % de animales que sobreviven a estimulación letal: En experimentos paralelos, con estimulación por una cepa del tipo V de GBS pero sin estimulación con un sacárido del tipo V, los resultados fueron como sigue: De esta manera, los portadores de GBS fueron capaces de proporcionar alguna protección contra la cepa de tipo V, y de este modo el uso de proteínas de GBS como portadores ofrece un nivel de fondo de protección mediada por proteína que se puede complementar por los sacáridos conjugados a la proteína. El nivel de sacárido libre se probó para varios lotes de conjugados, y los resultados fueron como sigue: Se entenderá que la invención se ha descrito a manera de ejemplo únicamente y se pueden hacer modificaciones en tanto que permanecen dentro del alcance y espíritu de la invención.
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Claims (27)

  1. REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones : 1. Proceso para preparar un conjugado de un sacárido capsular de Streptococcus agalactiae, y una molécula portadora, caracterizado porque comprende los pasos de: (a) oxidar un sacárido capsular de S. agalactiae a fin de introducir un grupo aldehido en al menos un residuo terminal de ácido siálico en el sacárido; (b) someter el grupo aldehido a aminación reductiva con amoniaco o una amina primaria, para dar una amina -CH2-enlazada; (c) hacer reaccionar la amina -CH2- enlazada con un ligador bifuncional, para dar un sacárido activado; y (d) hacer reaccionar el sacárido activado con una molécula portadora, dando de este modo el conjugado.
  2. 2. Conjugado, caracterizado porque el conjugado comprende una porción de sacárido capsular de Streptococcus agalactiae, unida a un portador mediante una porción ligadora, y en donde la porción ligadora se une a un residuo de ácido siálico en la porción de sacárido capsular.
  3. 3. Conjugado de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque se puede obtener por el proceso de la reivindicación 1.
  4. 4. Conjugado o proceso de conformidad con cualquier reivindicación anterior, caracterizado porque el sacárido es de uno de los serotipos la, Ib, II, III o V de GBS.
  5. 5. Conjugado o proceso de conformidad con cualquier reivindicación anterior, caracterizado porque el sacárido tiene su forma nativa.
  6. 6. Conjugado o proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque el sacárido es más corto que el sacárido capsular nativo.
  7. 7. Conjugado o proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque el sacárido se modifica químicamente con relación al sacárido capsular nativo.
  8. 8. Conjugado o proceso de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque el sacárido está des-O-acetilado (parcial o completamente) .
  9. 9. Conjugado o proceso de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque el sacárido está des-N-acetilado (parcial o completamente) .
  10. 10. Conjugado o proceso de conformidad con cualquier reivindicación anterior, caracterizado porque el portador es toxoide de difteria, toxoide de tétano, CRM197, albúmina de suero humano, una proteína artificial que comprende múltiples epítopos de células T CDR+ humanas de varios antígenos derivados de patógenos, proteína D de H. influenzae, o una proteína de S. agalactiae .
  11. 11. Conjugado o proceso de conformidad con cualquier reivindicación anterior, caracterizado porque el portador está unido al sacárido mediante un grupo -NH2 en el portador .
  12. 12. Conjugado o proceso de conformidad con cualquier reivindicación anterior, caracterizado porque el conjugado tiene una relación de sacárido: proteína (p/p) de entre 1:5 y 5:1.
  13. 13. Conjugado o proceso de conformidad con cualquier reivindicación anterior, caracterizado porque se introducen grupos aldehidos entre 5 % y 50 % de las unidades totales de monosacárido de ácido siálico.
  14. 14. Proceso de conformidad con cualquier reivindicación anterior, caracterizado porque, después de la conjugación, se separan los sacáridos libres y conjugados.
  15. 15. Proceso de conformidad con cualquier reivindicación anterior, caracterizado porque el paso (a) introduce químicamente el aldehido.
  16. 16. Proceso de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque el paso (a) comprende el uso de una sal de periodato para oxidar hidróxidos vecinales .
  17. 17. Proceso de conformidad con cualquier reivindicación anterior, caracterizado porque la aminación reductiva comprende ya sea amoniaco o una amina primaria (NH2R) .
  18. 18. Proceso de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque la aminación reductiva comprende una sal de amonio en combinación con un agente reductor.
  19. 19. Proceso de conformidad con cualquier reivindicación anterior, caracterizado porque el ligador bifuncional es heterobifuncional.
  20. 20. Proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, caracterizado porque el ligador bifuncional es homobifuncional .
  21. 21. Proceso de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque las reacciones tanto con el sacárido como con el portador comprenden aminas, y en donde el ligador tiene la fórmula X-L-X, en donde: los dos grupos X son los mismos entre sí y pueden reaccionar con las aminas; y L es una porción ligadora en el ligador.
  22. 22. Proceso de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque X es N-oxisuccinimida.
  23. 23. Proceso de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque el ligador es N-hidroxisuccinimida-diéster de ácido adípico.
  24. 24. Proceso de conformidad con cualquier reivindicación anterior, caracterizado porque el sacárido está, si es necesario, sustancialmente re-N-acetilado totalmente antes de la aminación reductiva.
  25. 25. Proceso o conjugado de conformidad con cualquier reivindicación anterior, caracterizado porque un sacárido individual se une a múltiples portadores.
  26. 26. Proceso para preparar un conjugado de un sacárido capsular de Streptococcus agalactiae y una molécula portadora, caracterizado porque comprende los pasos de: (a) des-N-acetilar el sacárido capsular, para dar un sacárido des-N-acetilado; (b) hacer reaccionar el sacárido des-N-acetilado con un ligador bifuncional, para dar un sacárido activado; y(c) hacer reaccionar el sacárido activado con una molécula portadora, dando de este modo el conjugado.
  27. 27. Proceso para preparar un conjugado de un sacárido capsular y una molécula portadora, caracterizado porque comprende los pasos de: (a) oxidar un sacárido capsular a fin de introducir un grupo aldehido en al menos un residuo de galactosa en el sacárido, para dar un residuo modificado de galactosa; y (b) acoplar el residuo modificado de galactosa a una molécula portadora.
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