CN114630674A

CN114630674A - 抗微生物疫苗组合物

Info

Publication number: CN114630674A
Application number: CN202080075145.1A
Authority: CN
Inventors: R·达博拉; A·丁利; S·帕特尔; G·F·斯维士
Original assignee: Alopercy Ltd
Current assignee: Alopercy Ltd
Priority date: 2019-08-27
Filing date: 2020-08-27
Publication date: 2022-06-14
Also published as: US20220280629A1; AU2020336114A1; EP4021491A4; JP2022546812A; EP4021491A1; CA3152520A1; KR20220079534A; WO2021041721A1; WO2021041721A8; IL290868A

Abstract

本发明涉及包含寡糖β‑(1→6)‑氨基葡萄糖基团的抗微生物疫苗化合物和组合物，所述基团具有3至12个通过连接物基团连接至破伤风类毒素的氨基葡萄糖单元，其中所述类毒素主要以其单体形式存在。本发明还涉及疫苗组合物，其针对具有包含寡糖N‑乙酰基‑β‑(1→6)‑氨基葡萄糖(PNAG)结构的细胞壁结构的微生物提供天然免疫力。

Description

抗微生物疫苗组合物

相关申请的交叉引用

本申请要求于2019年8月27日提交的第62/892,400号美国临时申请的优先权，其全文通过引用并入本文。

技术领域

本发明涉及包含寡糖β-(1→6)-氨基葡萄糖基团的抗微生物疫苗化合物和组合物，所述基团具有3至12个通过连接物基团连接至破伤风类毒素的氨基葡萄糖单元，其中类毒素主要以其单体形式存在。本发明还涉及疫苗组合物，其针对具有包含寡糖N-乙酰基-β-(1→6)-氨基葡萄糖(PNAG)结构的细胞壁结构的微生物提供天然免疫力。

背景技术

已知附着于类毒素载体的寡糖抗原会产生弱免疫反应，尤其是在儿童和老年人中。当寡糖与类毒素载体结合形成疫苗时，希望在载体上附着或装载尽可能多的寡糖基团，以增强产生的整体免疫反应。一般来说，含有更多装载到载体上的寡糖抗原的疫苗会比含有较少寡糖抗原的类似疫苗产生更高的抗体滴度。

采用破伤风类毒素为载体并结合有多个寡糖拷贝的疫苗在本领域是已知的。通常，寡糖基团与类毒素的连接是通过耦合到类毒素上的反应性氨基基团(例如，在赖氨酸残基上发现的-NH₂)的连接物。虽然化学上已经很成熟，但在处理类毒素化学时也存在一些复杂因素。

首先，破伤风类毒素是通过用化学品(如甲醛)处理破伤风毒素而制备的，使得其在施用时无毒，但仍具有抗原性。甲醛与毒素上的反应性氨基基团反应，从而减少类毒素上对寡糖偶联有用的剩余的反应性氨基的数量。此外，经处理的类毒素上的反应性氨基基团的数量因制造商而异。其次，破伤风类毒素的制造过程也导致破伤风类毒素组合物中的低分子量污染。这些污染物包含与类毒素竞争寡糖偶联的低分子量反应性氨基官能团。

本领域先前已公开了包含与破伤风类毒素连接的五-β-(1→6)氨基葡萄糖基团的抗微生物疫苗，其中这些五-β-(1→6)氨基葡萄糖基团连接的载荷系数的范围从低至12到高达20–Gening等人，Infect.Immun.，78(2)：764-772(2010)。然而，这个载荷系数不太理想，显然是基于与类毒素和偶联化学相关的潜在合成问题。

因此，理想的是提供更高水平的破伤风类毒素载荷。

发明内容

本发明针对以下发现：能够实现在破伤风类毒素(具有至少25且优选31个反应性氨基官能团)上具有至少25且优选约31至约39寡糖β-(1→6)-氨基葡萄糖连接基团的载荷水平的疫苗化合物，条件是疫苗化合物中的类毒素组分包含至少85％的单体形式的类毒素。在一个实施方式中，疫苗化合物中的类毒素组分包含至少90％的单体形式的类毒素，或它们之间的任何子值或子范围。在一些实施方式中，类毒素包含至少90％至99.9％的单体形式的类毒素，和优选至少95％至99.9％的单体形式的类毒素，或它们之间的任何子值或子范围。在一个实施方式中，低分子量反应性氨基化合物的量相对于存在的类毒素的重量不超过3重量％。在另一个实施方式中，组合物中低分子量氨基化合物的量基于存在的类毒素的重量小于2重量％且优选小于1重量％，基于存在的类毒素的重量甚至更优选小于0.5重量％。在另一个优选实施方式中，例如，基于HPLC，单体的量超过99面积％。

因此，在一个实施方式中，本发明提供一种疫苗组合物，其包含通过连接物连接至破伤风类毒素载体的至少25个且优选约31至约39个寡糖-β-(1→6)-氨基葡萄糖基团连接单元，其中寡聚物包含3至12个重复的β-(1→6)-氨基葡萄糖单元，条件是这些单元的总数量的小于约40数量％被N-乙酰化，进而其中所述破伤风类毒素包含至少25个且优选至少31个反应性氨基官能团，且至少85％的类毒素组分为单体形式，或在一些实施方式中，至少90％的类毒素组分为单体形式。此类疫苗组合物为患者提供针对微生物感染的有效免疫力，其中所述微生物在其细胞壁中包含寡聚N-乙酰基-β-(1→6)-氨基葡萄糖结构。

在一个实施方式中，本发明提供一种由式I表示的化合物：

(A-B)_x-C I

其中A包含3至12个重复的β-(1→6)-氨基葡萄糖单元或其混合物，其具有下式：

B是下式：

其中上式的左侧与C相连，右侧与A相连；

且C是具有至少31个反应性氨基官能团的破伤风类毒素；

x是约31至约39的整数；

y是1至10的整数；且

R是氢或乙酰基，条件是不超过40％的R基团是乙酰基；

其中所述破伤风类毒素包含至少31个反应性氨基基团，且至少90数量％的类毒素为单体形式。

在一个实施方式中，本发明提供了一种可用于对抗微生物的疫苗组合物，所述微生物在其细胞壁中包含寡聚N-乙酰基-β-(1→6)-氨基葡萄糖结构，其中所述疫苗组合物包含药学上可接受的载体和有效量的式I表示的疫苗：

(A-B)_x-C I

其中A包含3至12个重复的β-(1→6)-氨基葡萄糖单元，其具有下式：

B是下式：

其中上式的左侧与C相连，右侧与A相连；

且C是具有至少31个反应性氨基官能团的破伤风类毒素；

x是约31至约39的整数；

y是1至10的整数；且

R是氢或乙酰基，条件是不超过40％的R基团是乙酰基；

其中所述破伤风类毒素包含至少31个反应性氨基基团，且至少90数量％的类毒素为单体形式。此类疫苗组合物为患者提供针对微生物感染的有效免疫力，其中所述微生物在其细胞壁中包含寡聚N-乙酰基-β-(1→6)-氨基葡萄糖结构。

在上式I的一个实施方式中，提供一种式II的化合物：

(A′-B)_x-C II

其中A′是下式的五-β-(1→6)-氨基葡萄糖(碳水化合物配体)基团：

B、C和x如上所定义，条件是至少85数量％的类毒素为单体形式，或在一些实施方式中，至少90％数量％的类毒素为单体形式。

在一个实施方式中，本发明提供一种对抗微生物的疫苗组合物，所述微生物在其细胞壁中包含寡聚N-乙酰基-β-(1→6)-氨基葡萄糖结构，其中所述疫苗组合物包含药学上可接受的载体和有效量的式II表示的疫苗

(A′-B)_x-C II

其中A′具有下式

B、C和x如上所定义，条件是至少85数量％的类毒素组分为单体形式，或在一些实施方式中，至少90％数量％的类毒素组分为单体形式。

在一个实施方式中，本发明提供一种为患者提供有效的微生物免疫的方法，所述微生物在其细胞壁中包含寡聚N-乙酰基-β-(1→6)-氨基葡萄糖基团，该方法包括施用上式I或II的化合物。

在一个实施方式中，本发明提供一种为患者提供有效的微生物免疫的方法，所述微生物在其细胞壁中包含寡聚N-乙酰基-β-(1→6)-氨基葡萄糖基团，该方法包括向所述患者施用如上所述的本发明的药物组合物。

在一个实施方式中，本发明的化合物包括其中x为33至39的那些。在另一个实施方式中，本发明的化合物包括其中x为35至38的那些。

本发明的代表性化合物如下表所示：

实例	Y	C	N-乙酰化百分比	x	单体百分比
						A	2	破伤风类毒素	0％	31	90％
B	3	破伤风类毒素	0％	36	95％
						C	6	破伤风类毒素	12.5％(1/8)	33	95％
D	10	破伤风类毒素	25％(3/12)	30	>95％
						E	3	破伤风类毒素	20％(1/5)	34	>95％
F	4	破伤风类毒素	33％(2/6)	33	90％
						G	3	破伤风类毒素	20％(2/5)	30	>90％
H	3	破伤风类毒素	0％	35	>99％

在一个实施方式中，基于式I或II的化合物的总重量，本发明的组合物包含不超过约3重量％的低分子量氨基基团。

在一个实施方式中，本发明提供一种为患者提供抵抗微生物的免疫力的方法，所述微生物在其细胞壁中包含寡糖β-(1→6)-氨基葡萄糖基团，该方法包括向所述患者施用有效量的由式I表示的化合物：

(A-B)_x-C I

其中A、B、C和x如上文和本文其他地方所定义。

在一个实施方式中，本发明提供为患者提供抵抗微生物的免疫力的方法，所述微生物在其细胞壁中包含N-乙酰基寡糖β-(1→6)-氨基葡萄糖基团，该方法包括向所述患者施用有效量的如上文和本文其他地方所定义的式I的化合物及其混合物，其中y是2、3或4。

在一个实施方式中，本发明提供为患者提供抵抗微生物的免疫力的方法，所述微生物在其细胞壁中包含N-乙酰基寡糖β-(1→6)-氨基葡萄糖基团，该方法包括向所述患者施用有效量的式II的化合物：

(A′-B)_x-C II

B、C和x如上文和本文其他地方所定义。

在一个实施方式中，本发明提供为受试者提供抵抗微生物的有效免疫力的方法，所述微生物在其细胞壁中包含N-乙酰基寡糖β-(1→6)-氨基葡萄糖基团，该方法包括向所述患者施用有效量的药学上可接受的稀释剂和有效量的式I的化合物的药物组合物：

(A-B)_x-C I

其中A、B、C和x如上文和本文其他地方所定义。

在一个实施方式中，本发明提供为受试者提供抵抗微生物的有效免疫力的方法，所述微生物在其细胞壁中包含N-乙酰基寡糖β-(1→6)-氨基葡萄糖基团，该方法包括向所述患者施用有效量的药学上可接受的稀释剂和有效量的如上文和本文其他地方所定义式I化合物(其中y是2、3或4)的药物组合物。

在一个实施方式中，本发明提供为受试者提供抵抗微生物的有效免疫力的方法，所述微生物在其细胞壁中包含N-乙酰基寡糖β-(1→6)-氨基葡萄糖基团，该方法包括向所述患者施用有效量的药学上可接受的稀释剂和有效量的式II化合物的药物组合物：

(A′-B)_x-C II

B、C和x如上文和本文其他地方所定义。

在一个实施方式中，本发明提供为受试者提供抵抗微生物的有效免疫力的方法，所述微生物在其细胞壁中包含N-乙酰基寡糖β-(1→6)-氨基葡萄糖基团，该方法包括向所述患者施用有效量上述化合物作为药物组合物(具有药学上可接受的稀释剂和有效量的化合物)，其中所述患者的白细胞计数为至少2,000。

在一些实施方式中，在上述一种或多种方法中，药物组合物可包含，例如不超过约3重量％的低分子量氨基化合物，或在替代性实施方式中，小于1重量％的低分子量氨基化合物，以及从3重量％到零的任何子值或子范围。

附图简要说明

图1显示了化合物17(如下所述)的¹H NMR。

图2显示了化合物17的¹³C NMR。

图3显示了破伤风类毒素单体与低聚物和低分子量氨基化合物分离的HPLC光谱。

图4提供了二硫化物(化合物16)转化为两当量单硫化物(化合物17)的HPLC示踪。

具体实施方式

本发明提供了抗微生物疫苗化合物和组合物，其中化合物包含至少25个且优选31至39个寡糖β-(1→6)-氨基葡萄糖基团，这些基团各自具有3至12个氨基葡萄糖单元，其中所述基团的中的每一个通过连接物与破伤风类毒素蛋白连接，其中不超过40％的单个氨基葡萄糖单元具有N-乙酰基基团，而且其中破伤风类毒素包含至少25个且优选至少31个反应性氨基基团，并且至少85数量％、90数量％、95数量％和99数量％的类毒素组分为单体形式，或85％至99％范围内的任何子值或子范围的类毒素组分为单体形式。

本文所述的疫苗组合物为患者提供对抗微生物感染的有效免疫力，其中所述微生物在其细胞壁中包含寡聚N-乙酰基-β-(1→6)-氨基葡萄糖结构。

在更详细地描述本发明之前，将首先定义以下术语。如果本文中使用的术语未定义，则其具有普遍接受的科学或医学意义。

本文中使用的术语仅用于描述特定实施方式的目的，并不旨在限制本发明。如本文所用，除非上下文另有明确指示，否则单数形式“一”、“一个/一种”和“该”也旨在包括复数形式。

“任选的”或“任选地”是指随后描述的事件或情况可能发生或可能不发生，并且描述包括事件或情况发生的实例和不发生的实例。

当在数字符号之前使用时，例如温度、时间、量、浓度等，包括范围，术语“约”表示近似值，其变化可能为(+)或(-)10％、5％、1％，或其间的任何子范围或子值。优选地，当关于剂量使用时，术语“约”意味着剂量可能会变化+/-10％。

“包括”或“包含”意指组合物和方法包括所述要素，但不排除其他要素。“基本上由……组成”用于定义组合物和方法时，应指排除对组合具有任何重要意义的其他要素，以达到所述目的。因此，基本上由本文定义的要素组成的组合物将不会排除不会实质性影响所要求保护的发明的一个或多个基本和新颖特征的其他材料或步骤。“由……组成”是指排除多于微量要素的其他成分和实质性方法步骤。由这些转换性术语中的每一个定义的实施方式都在本发明的范围内。

术语“β-(1→6)-氨基葡萄糖单元”或“氨基葡萄糖单元”是指如下所示的单个氨基葡萄糖结构：

其中6-羟基基团与在前的氨基葡萄糖单元的1羟基基团缩合，其中虚线表示与在前和在后的氨基葡萄糖单元的结合位点。当与另一个“β-(1→6)-氨基葡萄糖单元”结合时，得到的二糖具有以下结构：

术语“具有N-乙酰基基团的β-(1→6)-氨基葡萄糖单元”是指以下结构：

其中，第二单元的6-羟基基团与在前的氨基葡萄糖单元的1-羟基基团缩合。

术语“包含β-(1→6)-氨基葡萄糖基团的寡糖”是指化合物上模拟被定义为“寡糖β-(1→6)-氨基葡萄糖结构”(如下文所定义)的致病细菌细胞壁的一部分的基团。同样，此类基团仅限于3至12个β-(1→6)-氨基葡萄糖单元，其中最多40％的所述单元可具有N-乙酰基基团。在一个实施方式中，少于30％的所述β-(1→6)-氨基葡萄糖单元被N-乙酰化。在另一个实施方式中，少于20％的所述β-(1→6)-氨基葡萄糖单元被N-乙酰化。并且，在另一个实施方式中，少于10％的所述β-(1→6)-氨基葡萄糖单元被N-乙酰化。而且，在另一个实施方式中，所述β-(1→6)-氨基葡萄糖单元均未被N-乙酰化。

术语“包含N-乙酰基β-(1→6)-氨基葡萄糖结构的寡糖”或“包含N-乙酰基β-(1→6)-氨基葡萄糖结构的多糖”是指在微生物细胞壁中发现的那些结构。微生物壁包含大量这些结构，这些结构在许多微生物系中都是保守的。这些结构主要是N-乙酰基β-(1→6)-氨基葡萄糖，但包括由于酶(如聚-β-1,6-D-氨基葡萄糖-N-脱乙酰基酶)的作用所致的脱乙酰糖类区域。因此，本发明的疫苗产生的抗体包含靶向此类脱乙酰寡糖区域的抗体。在不受任何理论限制的情况下，针对此类脱乙酰糖类的抗体在体内对此类微生物具有细胞毒性。

本文使用的术语“疫苗组合物”是指包含上式I和式II化合物的组合物，该组合物包含佐剂和药物载体。这些组合物还可以包含有限量的低分子量氨基化合物，其中这些氨基化合物的量基于存在的类毒素的重量为不超过3重量％，优选地，小于2重量％，更优选地，小于1重量％。这些组合物提供针对任何微生物(在其细胞壁中包含具有N-乙酰基-β-(1→6)-氨基葡萄糖结构的寡糖/多糖)的有效免疫力。因此，与针对单一细菌接种的典型疫苗不同，本文所述的疫苗组合物能够针对具有本文所述的寡糖结构的任何微生物提供有效免疫力。此类微生物包括但不限于革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、抗生素耐药菌(例如耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus))、真菌等。

本文使用的术语“有效免疫力”是指限定量的疫苗组合物在体内产生足以治疗、预防或改善微生物感染的抗体反应的能力，其中所述微生物在其细胞壁中含有包含N-乙酰基-β-(1→6)-氨基葡萄糖的寡糖/多糖。

疫苗化合物指式I和式II的化合物。这些化合物可能以溶剂化物，尤其是水合物的形式存在。水合物可在化合物或包含化合物的组合物的制造过程中形成，或者由于化合物的吸湿性，水合物可随时间形成。本发明的化合物也可作为有机溶剂化物存在，包括DMF、醚和醇溶剂化物等。任何特定溶剂化物的识别和制备都在合成有机或药物化学的普通技术人员的技能范围内。

术语“类毒素”指单体和寡聚破伤风类毒素形式。寡聚破伤风类毒素组分的存在减少了暴露的反应性氨基基团的平均数量，因为寡聚物中每个单体类毒素的表面积因寡聚而减少。反过来，这会降低寡糖与类毒素结合的因子。

“受试者”是指哺乳动物。哺乳动物可以是人类或非人类哺乳动物，但优选是人类。

“治疗”或“治疗”受试者的疾病或病症是指1)预防疾病或病症发生在易感或尚未表现出该疾病或病症症状的受试者身上；2)抑制疾病或病症或阻止其发展；或3)改善疾病或病症或导致其消退。

“有效量”是指本发明的疫苗组合物的量，其足以治疗困扰受试者的疾病或病症，或防止所述受试者或患者出现该疾病或病症。

“反应性氨基官能团”是指在破伤风类毒素的赖氨酸和胍侧链上发现的伯氨基基团(-NH₂)，但不包括在肽键或破伤风类毒素的氨基侧链中发现的如在谷氨酰胺中发现的酰胺基基团(-NHC(O)-)。

“低分子量氨基化合物”指在破伤风类毒素组合物中作为污染物存在的含氨基化合物，包括类毒素片段、含氨基基团的缓冲液、反应猝灭剂(如赖氨酸、硫酸铵等)、毒素解毒剂(如福尔马林)，以及其他与破伤风类毒素接触的含氨基试剂。通常，此类低分子量反应性氨基化合物的分子量小于约10,000且优选小于1,000。在一个实施方式中，此类低分子量氨基化合物由图3中的洗脱峰确定。

一般合成方法

本发明的化合物可使用以下一般方法和程序由现成的起始材料制备。应理解，在给出典型或优选的工艺条件(即反应温度、时间、反应物摩尔比、溶剂、压力等)的情况下，也可使用其他工艺条件，除非另有说明。最佳反应条件可随所使用的特定反应物或溶剂而变化，但此类条件可由本领域技术人员通过常规优化程序确定。

另外，如对于本领域技术人员将显而易见的，可能需要常规保护基团来防止某些官能团发生不期望的反应。用于各种官能团的合适保护基团以及用于保护和脱保护特定官能团的合适条件在本领域是公知的。例如，众多保护基团见述于T.W.Greene和P.G.M.Wuts，Protecting Groups in Organic Synthesis，Third Edition，Wiley，New York，1999，以及本文中引用的参考文献。

用于以下反应的起始材料通常为已知化合物，或可通过已知程序或其明显修改制备。例如，许多起始材料可获自商业供应商，如SigmaAldrich(St.Louis，Missouri，USA)、Bachem(Torrance，California，USA)、Emka-Chemce(St.Louis，Missouri，USA)。其他可通过以下标准参考文本中描述的程序或其明显修改来制备，如Fieser and Fieser’s Reagentsfor Organic Synthesis，第1-15卷(John Wiley,and Sons,1991)、Rodd’s Chemistry ofCarbon Compounds，第1-5卷和Supplementals(Elsevier Science Publishers,1989)、Organic Reactions，第1-40卷(John Wiley,and Sons,1991)、March’s Advanced OrganicChemistry(John Wiley,and Sons，第5版，2001)以及Larock’s Comprehensive OrganicTransformations(VCH Publishers Inc.,1989)。

本发明代表性疫苗化合物的合成

本发明疫苗化合物的一般合成在本领域中是已知的，并且公开在美国专利申请序列号10/713,790以及美国申请专列号7,786,255和8,492,364中，其每一个均通过引用全文并入本文。

在一个实施方式中，对于本文所述的疫苗化合物，β-(1→6)-氨基葡萄糖基团限于4至6个单元，且优选5个单元，例如，在式I至III中y＝2至4。

在一些实施方式中，化合物是均质的，因为y是选自1至10(包括1至10)的单个整数。因此，本文公开的化合物可以设计为均质的，其中y＝至1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。在一些实施方式中，式I的化合物可以设计为异质的，其中y具有两个或更多个值，如y＝1和2、或y＝2和y＝3、或y＝3和y＝4、或y＝4和y＝5、或y＝5和y＝6、或y＝6和y＝7、或y＝7和y＝8、或y＝8和y＝9、或y＝9和y＝10的混合物。y的这种配对不必是连续的。因此，化合物可包括y＝1和y＝3、或y＝1和y＝4、或y＝2和y＝4、或y＝2和y＝5等的混合物，以及y的两个或更多个不同值任意组合的混合物。在一些实施方式中，化合物可能是异质的，y具有3个或更多个值，或y具有4个或更多个值，或y具有5个或更多个值，直至y具有全部10个不同的值。在一些实施方式中，在式I化合物中，y的每一次出现都是独立的。

在一些实施方式中，式I的两种或更多种化合物可用在药物组合物中，其中式I的每种单独的化合物就y而言是均质的，而式I的其他一种或多种化合物具有不同的y值。在这样的一个实施方式中，所使用的均质化合物以规定的重量百分比简单地混合在一起。例如，药物组合物可包含式I化合物(其中y＝1)与式I化合物(其中y为2)的混合物。当药物组合物或方法包含式I化合物的异质混合物时，该混合物可以是根据每种式I化合物的相对重量百分比定义的混合物。例如，混合物可包含50重量％的式I化合物(y等于1)和50重量％的式I化合物(y等于2)。可预期总计为100％的化合物的任何组合，例如，1、2、3、4、5或更多种具有不同y值的化合物可以总计100％的已知相对重量百分比混合。因此，可以在本文公开的药物组合物和方法中使用式I化合物的重量百分比的任意组合。因此，对于两种式I化合物的组合，百分比可以表示为两种化合物的比率，并且可以在0.1:99.9至99.9:0.1之间的任何范围内，包括0.1:99.9至99.9:0.1以及介于两者之间的任何值，如1:99、5:95、10:90、15:85、20:80等等，直到99:1，包括分数值。类似地，当在药物组合物中使用3、4、5或更多种式I化合物时，每种化合物的相对重量百分比可以在0.1重量％至最大99重量％之间变化，条件是不同的式I化合物的总量加起来为100％。

连接物基团的形成是通过本领域认可的合成技术实现的，这些合成技术例示于但不限于美国专利号8,492,364和以下实施例中发现的那些。在一个实施方式中，苷元的第一部分连接至还原β-(1→6)-氨基葡萄糖单元，保留巯基(-SH)基团，如下式III所示：

其中y是1至10的整数，且任选地不超过40％的氨基基团是N-乙酰基基团。

连接物的第二部分以如式IV所示的以下方式连接至破伤风类毒素。

该式中，破伤风类毒素的各个部分用弯曲线表示，并且只是说明性的，并不打算提供类毒素的完整结构。任何二硫化物桥由连接各部分的单线表示。为清楚起见，仅示出了连接物的单个第二部分，然而存在多个共价连接至在类毒素上发现的氨基基团的此类第二部分。

当连接物的第一和第二部分在偶联条件下结合时，形成硫醚键。该反应在惰性稀释剂中任选地在碱的存在下进行，以清除生成的酸。硫醚键将连接物的第一和第二部分连接起来，从而通过组合的连接物提供破伤风类毒素与寡糖β-(1→6)-氨基葡萄糖基团的共价键，如下对于疫苗化合物所示，其中y如本文所定义。

其中不超过40％的氨基基团任选地为N-乙酰基基团。

可以理解的是，连接至破伤风类毒素的β-(1→6)-氨基葡萄糖基团-连接物-基团的数量是化学计量控制的，因此约31至约39个这样的基团与类毒素结合，从而提供本发明的疫苗化合物。

方法、用途和药物组合物

本发明的疫苗组合物能够针对在其细胞壁中具有PNAG寡糖β-(1→6)-氨基葡萄糖结构的微生物启动有效的免疫反应。在对患者接种后，约4周后会产生有效的免疫反应。在产生有效的免疫反应后，患者可获得针对后续微生物感染的保护，其中致病微生物具有包含PNAG的细胞壁。

当如此使用时，对处于由此类微生物引起的微生物感染风险的患者施用本发明的疫苗组合物。仅作为示例，此类患者包括老年人、即将接受选定手术的人、前往爆发微生物感染的目的地的人等。疫苗通常与适当的佐剂通过肌肉注射的方式施用给具有免疫能力的患者，以增强免疫反应。潜伏期过后，患者获得了针对此类微生物的自然免疫力。这种具有免疫能力的患者具有有效的免疫系统，可以对抗原产生免疫反应。优选地，此类患者的活跃白细胞计数(WBC)为每微升至少约1000WBC，优选为每微升至少约1500WBC，更优选为每微升至少约2000WBC，甚至更优选地，每微生约3000WBC，且最优选地，每微生约4000WBC。

在另一个实施方式中，本发明的疫苗组合物可用于治疗，特别是当微生物感染为局限性和/或无生命威胁时。在这种情况下，本发明的疫苗组合物施用给患有由这种微生物引起的微生物感染的患者。疫苗通常与适当的佐剂通过肌肉注射的方式施用给具有免疫能力的患者，以增强免疫反应。施用后，在约4周内产生有效免疫力。如果患者仍患有感染，由疫苗产生的自然免疫力有助于恢复。

当如此使用时，本发明的疫苗组合物以治疗有效量通过用于提供类似用途的药剂的任何可接受的施用模式施用。本发明疫苗化合物(即活性成分)的实际量将取决于许多因素，例如待治疗疾病的严重程度、受试者的年龄和相对健康状况、所用疫苗化合物的效力、施用途径和形式，以及技术人员熟知的其他因素。

本发明疫苗化合物的有效量或治疗有效量是指产生足够滴度的抗体以改善受试者的症状或延长受试者生存期的疫苗化合物的量。此类疫苗化合物和疫苗组合物的毒性和治疗效果可通过细胞培养物或实验动物中的标准制药程序确定。

本文所述的疫苗组合物通常作为可注射无菌水性组合物施用，其包含一种或多种本领域公知的常规组分，仅作为示例，包括佐剂、稳定剂、防腐剂等。

组合

本发明的疫苗化合物和组合物可与主治临床医生认为合适的其他治疗性化合物或其他适当试剂结合使用。在选定的情况下，本发明的疫苗化合物可与用于治疗细菌感染的抗生素以及增强疫苗由所述化合物和/或组合物诱导的免疫反应的药剂同时施用。在抗生素的情况下，根据致病细菌的具体情况、细菌感染的程度、患者的年龄、体重以及其他相对健康状况，选择合适的抗生素或抗生素混合物以及施用给患者的量，完全在主治医师的能力范围内。在适当的情况下，主治医师可共同施用免疫增强药物或佐剂与本文所述疫苗的组合。

本发明的疫苗组合物可与增强患者对抗原的免疫反应的佐剂一起施用。佐剂包括但不限于铝化合物，如凝胶、氢氧化铝和磷酸铝，以及弗氏完全或不完全佐剂(例如，其中抗原并入稳定的石蜡油包水乳液的水相中)。显然，石蜡油可以用其他类型的油代替，如角鲨烯或花生油。其他具有佐剂性能的材料包括BCG(减毒结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis))磷酸钙、左旋咪唑、异丙氨酸、聚阴离子(例如polyA:U)、香菇多糖、百日咳毒素、脂质A、皂甙、QS-21和肽(例如胞壁酰二肽)以及免疫刺激性寡核苷酸(如CpG寡核苷酸)。稀土盐，例如镧和铈，也可用作佐剂。所使用的佐剂的量取决于所治疗的受试者和所使用的特定抗原，并且可以由本领域技术人员容易地确定。

实施例

通过参考以下实施例进一步理解本发明，这些实施例旨在纯粹作为本发明的示例。本发明的范围不受示例性实施方式的限制，这些示例性实施方式仅用于说明本发明的单个方面。功能等同的任何方法都在本发明的范围内。除了本文所描述的内容之外，本领域技术人员根据前述说明书和附图也将清楚本发明的各种修改。此类修改落入所附权利要求的范围内。

以下术语在本文中使用，并具有以下含义。如果未被限定，缩写词有其常规公认的定义。

＝埃

aq. ＝含水的

Biotage ＝Dyax公司旗下的Biotage,Charlottesville，Virginia，USA

bp ＝沸点

CAD ＝电雾式检测器

DCM ＝二氯甲烷

deg ＝度

DMSO ＝二甲亚砜

eq. ＝当量

EtOAc ＝乙酸乙酯

FEP ＝氟化乙丙烯

g ＝克

H1-NMR ＝质子核磁共振

h ＝小时

HDPE ＝高密度聚乙烯

HPLC ＝高效液相色谱法

MeCN ＝乙腈

kg ＝千克

mbar ＝毫巴

MeOH ＝甲醇

mg ＝毫克

mL ＝毫升

mM ＝毫摩尔

mmol ＝毫摩尔

N ＝正构

NBS ＝N-溴代琥珀酰亚胺

NIS ＝N-碘代琥珀酰亚胺

NMT ＝N-甲基色胺

PP ＝聚丙烯

qHNMR ＝定量质子核磁共振

RBF ＝圆底烧瓶

RO ＝反渗透

SEC HPLC ＝尺寸排除色谱法HPLC

SIM ＝二次离子质量

TCEP ＝三(2-羧乙基)膦

TLC ＝薄层色谱法

TMSOTf ＝1,1,1-三氟-甲磺酸三甲代甲硅烷基酯

TT ＝破伤风类毒素

μL ＝微升

μm ＝微米

w/w ＝重量比重量

w/v ＝重量比体积

实施例1–破伤风类毒素制备

对包含含有至少25个、优选至少31个游离氨基基团的单体类毒素的破伤风类毒素粗品样品进行浓缩并在

200尺寸排阻色谱柱上，使用两种不同的载量–柱床体积的0.6％和1.2％(商购获自SigmaAldrich，St.Louis Missouri，USA)进行色谱分析。洗脱曲线通过A280吸光度监测。如图3所示，观察到六个不同的峰(1至5号池和单体池)，所谓的单体分数代表最大的峰面积。根据对单个分数的分析性SEC-HPLC分析创建了池。破伤风类毒素粗品和每个单独的池通过SEC HPLC进行分析，结果总结在表1和图1中。

表1–Superdex 200池的分析性SEC HPLC分析/量化

单体池显示出单一的对称峰，洗脱体积与单体TT(99.9％面积)一致，未检测到额外的峰。由于柱载荷含有58.8面积％的单体，该数据证实了制备性Superdex纯化方案在这些条件下的有效性。当通过SEC HPLC监测时，与TT单体相比，Superdex 200柱的剩余部分主要含有较大分子量的物质(1号池和2号池)或较低分子量的物种(3至5号池)。整个过程的质量平衡通过蛋白质回收率(BCA)评估，结果总结在表2中。

表2–基于蛋白质回收的TT单体纯化-配制的质量平衡

可以理解的是，可以使用其他尺寸排除色谱程序来实现相同的结果。

旋转浓缩步骤的蛋白质回收率为83％，损失主要是由于通过过滤去除较小分子量的蛋白质/肽污染物(数据未显示)。通过制备性Superdex 200色谱纯化后，TT单体的产率为51％，剩余的蛋白质以较高分子量/聚集体和较小分子量分数回收。最后，在将缓冲液交换为反应缓冲液后，TT单体以87％的收率回收。在该实施例中，基于蛋白质回收率，从破伤风类毒素粗品到纯化/配制的TT单体的整个过程回收率为35％。

在pH 9.0(4℃或-70℃)或pH 7.5(-70℃)下储存长达4周后评估了纯化的TT单体的稳定性。具体而言，每周监测一次单体含量(SEC HPLC)和蛋白质浓度。在4℃(pH 9.0)保持或在-70℃(pH 7.5或9.0)冷冻4周后，TT单体的SEC指纹图谱或蛋白质浓度没有明显变化。由于本研究使用了一组有限的稳定性指示方法，因此决定在每次生产活动之前纯化TT单体，并将纯化的TT储存在4℃的反应缓冲液(50mM HEPES，pH 8.0)中，并在产生后7天内使用它。

实施例2-SBAP与TT单体的连接

步骤1：制备N-BABA：

市售β-丙氨酸，化合物1通过与至少化学计量量的商用溴乙酰溴反应转化为N-BABA(溴乙酰基-β-丙氨酸)，化合物2。在第一个容器中，β-丙氨酸与碳酸氢钠或其他合适的碱在水中结合，以清除将在反应过程中产生的酸。水溶液在约20±5℃混合，直到获得溶液。然后将溶液保持在约5±5℃。在单独的容器中，添加所需量的溴代乙酰溴，然后添加二氯甲烷。将两个容器的内容物组合在一起。反应完成后，加入6N HCl并混合至pH为约2。通过合适的溶剂(如乙酸乙酯)从溶液中萃取得到所得N-BABA。有机层在常规条件下浓缩，例如在高温(例如60℃)下的真空条件下。然后添加庚烷以沉淀N-BABA，然后将其收集在过滤器上，并在40℃的真空烘箱中干燥。该产物在下一步中按原样使用。

步骤2：制备SBAP：

N-BABA，化合物2，与N-羟基琥珀酰胺(NHS)在本领域公知的常规条件下反应以生成SBAP，化合物3。具体而言，N-BABA与至少化学计量量的NHS在适当的惰性溶剂(例如甲醇、乙醇、异丙醇等)中结合。所得溶液在约20±5℃搅拌，直到获得澄清溶液。然后将N-二异丙基碳二亚胺添加到反应混合物中，并与生成的固体混合。然后将系统冷却至0±5℃，并通过过滤提供所得SBAP。进一步纯化需要对异丙醇和庚烷的混合物进行预冷却，并洗涤滤饼，然后在约30℃的真空烘箱中干燥湿滤饼。所得SBAP按原样用于与TT单体的偶联反应。

作为选择，SBAP可以按照美国专利号5,286,846中阐述的方式制备，该专利通过引用全文并入本文。具体而言，其中所述的方法由以下合成方案提供：

步骤3–结合

如上所述，纯化的TT单体含有43个赖氨酸残基/摩尔，如通过游离胺分析进行量化的。TT单体与浓度从0摩尔当量增加到170摩尔当量的SBAP的反应导致在15摩尔当量至110摩尔当量的SBAP范围内的游离胺含量相应降低。在SBAP装载>110当量时实现了稳态转换。假设游离胺的损失与SBAP连接物的载荷量成正比，则饱和时的连接物密度估计为43摩尔SBAP/TT单体。还评估了连接物TT/单体中间体的单体/聚集体含量和每个滴定点的蛋白质浓度。在加入连接物之前，单体含量为99.7％，加入增大量的SBAP连接物不会显著改变单体水平(未检测到聚集体)。此外，不同滴定步骤的蛋白质回收率相似。基于该收集的数据，选择110摩尔当量的SBAP在环境温度下1小时的值作为所有后续合成的适当反应条件。

实施例3-寡糖合成

合成基础材料

下面的反应方案说明了用于制备下文详述的化合物3、5和8的合成步骤。

合成化合物D

将市售1,3,4,6-四-O-乙酰基-2-脱氧-2-N-苯二甲酰亚氨基-β-D-吡喃葡萄糖苷，化合物C(120.6g，252.6mmol)和甲苯(200mL)装入1L Büchi烧瓶中并在40℃旋转直到溶解(<5分钟)。蒸发溶剂，以提供泡沫。在烧瓶中装入甲苯(200mL)，并在40℃旋转，直到溶解(<5分钟)。再次蒸发溶剂至干。形成结晶固体，粘于壁上。在烧瓶中装入二氯甲烷(800mL)，并在室温下旋转，直到溶解；将所得深棕色溶液装入5L夹套反应器中，用额外的二氯甲烷(200mL)将烧瓶冲洗到反应中。加热/冷却夹套设定为20℃，并机械搅拌反应器内容物。将乙硫醇(EtSH)(40mL，540mmol)溶解在50mL二氯甲烷中并添加到容器中，用50mL二氯甲烷将烧瓶冲洗到容器中。将三氟化硼二乙醚络合物(NF₃-OEt₂)(50mL，390.1mmol)溶解在二氯甲烷(50mL)中，并添加到反应器中，用二氯甲烷(50mL)冲洗并添加到容器中。将混合物在20℃搅拌2小时。通过TLC检查反应中残留的C。流动相为甲苯：乙酸乙酯(3:1，v/v)，产物Rf～0.45，C Rf～0.3，用紫外可视化。如果存在大量C，则需要延长反应时间。

搅拌设置为高速并添加4M乙酸钠水溶液(1.25L，5100mmol)。各相充分混合30分钟。水层的pH用试纸检查，并确认为～pH＝7。关闭搅拌，将反应混合物静置70分钟。

将各层分离并收集。将有机层(底层，1.2L)和乙醇(840mL，14400mmol)装入反应器中。将夹套设置为60℃，并在大气压力下蒸馏溶剂(二氯甲烷沸点40℃，乙硫醇沸点35℃，冰浴中的接收瓶)。当蒸馏减慢时，将夹套温度升高至70℃。收集1300mL馏出物后，对容器内容物进行取样，并通过¹H-NMR测定二氯甲烷与乙醇的比率，确认为低于10摩尔％二氯甲烷。如果存在更多的二氯甲烷，则需要进一步蒸馏。添加额外的乙醇(400mL)，然后添加D的晶种。夹套在30分钟内冷却至5℃。将晶体浆料在5℃搅拌3天。在烧结漏斗上收集固体，并用石油醚(60℃至80℃)洗涤：1x500mL浆料，1x300mL塞料。将固体转移至500mL RBF中，并在旋转蒸发器(浴温45℃)上干燥至恒重(超过约4小时)，提供灰白色固体。预期收率：约86g(71％来自C)。

合成化合物1

将无水甲醇(33mL)装入50mL圆底烧瓶中。添加甲醇钠在甲醇中的溶液(30％溶液，25μL，0.135mmol)，并将所得溶液在室温下搅拌5分钟。在10分钟内，以允许固体在添加过程中溶解的速率，分批(约200mg)添加乙基3,4,6-四-O-乙酰基-2-脱氧-2-N-苯二甲酰亚氨基-β-硫代-D-吡喃葡萄糖苷(化合物D)(3.09g，6.44mmol)。反应在环境温度下搅拌2.5小时。TLC(EtOAc)显示化合物D完全消耗(Rf＝0.9)，并形成一个、多个极斑：Rf＝0.5。采集样品并通过HPLC进行反应完成IPC(2.5μL反应混合物在0.8mL乙腈和0.2mL水中)，通过条件为NMT 1.00面积％化合物D。添加乙酸(8μL，0.1397mmol)。用试纸检查pH，确认为～pH 5至6。将混合物在旋转蒸发器(50℃)上浓缩至接近干燥。添加EtOAc(15mL)并蒸发大部分。残渣在15mL EtOAc中溶解/成浆，并从旋转蒸发器中去除。添加2mL石油醚，并在环境温度下搅拌混合物。结晶浆液搅拌过夜。在烧结漏斗上收集固体，用汽油(2x10mL)洗涤，并在旋转蒸发器(45℃浴温)上干燥至恒重。预期收率：1.94克(85％来自化合物D)。

合成化合物2

将化合物1(2.040g)溶解在吡啶(Pyr)(28mL)中，并在旋转蒸发器中在40℃的浴温将溶液浓缩至约一半体积(约14mL)，以得到黄色溶液。添加更多吡啶(14mL)，然后再次以相同方式将溶液浓缩至约14mL。将溶液置于氩气下，在连接风冷冷凝器之前添加三苯甲基氯(TrCl)(2.299g，1.36当量)，并在搅拌下将溶液加热至50℃。4小时后，运行IPC(HPLC；5μL至800μL MeCN，残留化合物1NMT 3.00面积％)。一旦满足IPC，使反应冷却至10℃至15℃。在20分钟内滴加苯甲酰氯(BzCl)(1.60mL，2.34当量)，保持反应温度低于20℃。添加完成后，使反应升温至环境温度并搅拌至少3小时。此时进行IPC(HPLC；5μL至1500μL MeCN，化合物1NMT的残余单Bz衍生物总计3.00面积％)。一旦满足IPC后，将反应冷却至0℃，并通过缓慢添加甲醇(MeOH)(0.8mL)进行淬灭，确保反应温度保持为低于20℃。然后将淬灭的反应加热至环境温度。

产物混合物用甲苯(20mL)稀释，并在环境温度下搅拌1小时，然后通过烧结漏斗过滤去除沉淀物。然后用柠檬酸(20％w/w，4x20mL)洗涤甲苯溶液，随后用饱和NaHCO₃(9％w/v，20mL)洗涤，导致与存在的任何残留柠檬酸发生轻微反应。然后用盐水(20mL)洗涤甲苯层(上层)，之后在旋转蒸发器中在40℃的浴温蒸发，得到黄色/橙色糖浆剂(6.833g)。提供糖浆剂用于IPC(H¹ NMR，通过条件NMT 30重量％残留甲苯)。预期收率：约6.833克(147％)。

合成化合物3

冰醋酸(648mL)和超纯水(72mL)混合在一起，得到90％的醋酸溶液。将一部分醋酸溶液(710mL)连同搅拌棒一起添加到粗化合物2(111g)中。将风冷冷凝器连接至烧瓶，然后将混合物加热至70℃。由于2的粘性，直到1小时20分钟后，混合物才完全溶解，此时开始搅拌。2小时后，运行IPC(HPLC；5μL至800μL MeCN，残留化合物2NMT 3.00面积％)。一旦IPC符合规格，就使反应冷却至环境温度。将混合物转移到烧结漏斗中，并使用室内真空滤除沉淀的三苯甲醇(31.09g)。烧瓶用另一部分90％醋酸(40mL)冲洗，并将全部洗涤液转移到混合容器中。添加甲苯(700mL)和水(700mL)并充分混合。水(下)层为浑浊的白色溶液，并进行了pH测试(预计pH<2)。用水重复洗涤两次以上(2x700mL；pH分别为约2.4和约3，无色透明溶液)。将饱和的NaHCO₃(9％w/v，700mL)添加到容器中，导致轻微反应(气体释放)。甲苯(上)层然后用盐水(700mL)洗涤，之后在旋转蒸发器中在40℃的浴温蒸发，得到黄色/橙色固体/液体混合物(86g)。该混合物溶解在400mL甲苯(300mL+100mL洗涤液)中，并装入硅胶柱(450g二氧化硅)，该硅胶柱用3个柱体积(CV)的石油醚：甲苯(1:1，v:v)平衡。柱子使用阶式梯度洗脱，收集1CV(790mL)的组分。使用的梯度是：

4体积％乙酸乙酯，石油醚：甲苯中(1:1v:v，4CV)

8体积％乙酸乙酯，石油醚：甲苯中(1:1v:v，12CV)

15体积％乙酸乙酯，石油醚：甲苯中(1:1v:v，4CV)

20体积％乙酸乙酯，石油醚：甲苯中(1:1v:v，4CV)

30体积％乙酸乙酯，石油醚：甲苯中(1:1v:v，1CV)

产物洗脱出超过14个组分。采用TLC对含有各组分的产物进行定位。所有组分进行IPC(HPLC，10.14分钟时NMT为峰的1.50面积％，10.94分钟时NMT为峰的1.50面积％)。不符合IPC的组分被留出用于加工成化合物4。在旋转蒸发器中在45℃的浴温蒸发合并的组分，得到无色糖浆剂。预期收率：约60克(78％)。

合成化合物4

将粗化合物3(39.54g，含有约21g化合物3，约37mmol，在色谱法分离3之前提取)溶解在甲苯(7.2mL)中，并添加干燥吡啶(14.2mL，176mmol，约4.8当量)以得到均相溶液。添加7.2mL(76mmol，约2.1当量)乙酸酐(Ac₂O)，并在25℃搅拌混合物18小时。在反应过程中，固体沉淀，其中一些可能是化合物4。对反应进行取样用于IPC，如果检测到的化合物3的量>1.00面积％，则进一步添加干燥吡啶(1.4mL，17当量)，并继续反应，直到残留化合物3在液相中为≤1.00面积％。

反应用二氯甲烷(112mL)稀释，然后添加水(2.8mL)和甲醇(2.8mL)。混合物在25℃搅拌3小时。该搅拌时间足以淬灭过量的乙酸酐。混合物用柠檬酸一水合物/水20/80w/w(112mL)洗涤。水相用二氯甲烷(50mL)反萃取。将用于反萃取的二氯甲烷留出，并用于从剩余的柠檬酸洗涤液中反萃取水相。使主要的二氯甲烷萃取物返回容器，并重复柠檬酸洗涤过程，直到水相的pH为≤2(通常再洗涤两次)。合并的柠檬酸洗涤液被反萃取。然后将反萃取物和主要二氯甲烷萃取物合并。所得二氯甲烷溶液用5％w/v NaHCO₃(100mL)洗涤，取出二氯甲烷相，用水(100mL)洗涤。将二氯甲烷相转移到蒸发容器中，添加乙酸乙酯(50mL)，并将溶液浓缩成糖浆剂。

添加乙酸乙酯(150mL)，通过在搅拌下加热至55℃溶解产物。添加石油醚60-80(200mL)，将溶液重新加热至55℃并保持5分钟。将溶液冷却至45℃并添加晶种(30mg)，然后在搅拌下将其在3小时内冷却至18℃，并在18℃保持至少1小时。通过过滤收集晶体，并用乙酸乙酯/石油醚(1/2v/v，60mL)洗涤。在真空中干燥得到化合物4(16.04g，77％来自2)。预期收率：16.0克(77％来自化合物2)。

合成化合物3.1

将3-氨基丙烷-1-醇(7.01g，93mmol)溶解于DCM(70mL)中并冷却至0℃。将氯甲酸苄酯(5.40mL，32mmol)溶解于DCM(20mL)中并滴加，保持内部反应温度低于10℃。完成后，在室温下搅拌烧瓶2小时。取出样品的用于NMR(IPC：20L+0.6mL d6-DMSO)表明氯甲酸苄酯试剂已被消耗。产物混合物然后用柠檬酸(10％w/w，2x90mL)、水(90mL)和盐水(90mL)洗涤。然后将DCM(下)层在旋转蒸发器中在40℃的浴温蒸发，以得到略微浑浊的油/液体(6.455g)。将该油溶解在乙酸乙酯(7mL)中，必要时加热至40℃以溶解任何沉淀固体，然后冷却至室温。将石油醚(4mL)与晶种一起缓慢添加到搅拌溶液中，此时产物开始缓慢结晶。一旦大部分产物沉淀，然后缓慢添加石油醚的最终部分(17mL)(添加的总溶剂：乙酸乙酯：石油醚1:3，21mL)。产物然后在真空下过滤，并用石油醚(5mL)洗涤，得到白色细粉(4.72g)。预期收率：约4.7克(61％)。

合成化合物5

化合物4(1.05g，1.73mmol)在环境温度下溶解于干燥丙酮(12mL，0.06％w/w水)和水(39μL，2.15mmol，1.3当量)中。然后将溶液冷却至-10℃。一次性添加NBS(0.639g，3.59mmol，2.08当量)。预计会出现约+7℃的放热，然后立即将溶液重新冷却至-10℃。添加NBS 15分钟后，反应混合物用于进行IPC(HPLC，通过条件小于剩余化合物4的2.00％面积)。如果反应未完成，则一次性添加1.00当量的NBS(0.307g，1.73mmol，1.00当量)，然后在-10℃再将反应保持15分钟，并进一步进行IPC。通过添加含水NaHCO₃(5％w/v，5mL)使反应淬灭，停止冷却，并在以下添加过程中使混合物升温至10℃至20℃。搅拌3分钟至5分钟后，进一步添加含水NaHCO₃(5％w/v，5mL)，并继续搅拌5分钟。在搅拌下添加含水NaHCO₃(5％w/v，10mL)最后的等分试样，然后加入硫代硫酸钠(20％w/v，5mL)。混合物在10℃至20℃搅拌20分钟，然后通过过滤收集固体。用NaHCO₃(5％w/v，25mL)将容器冲洗到过滤垫上，然后滤除该冲洗液。然后用NaHCO₃(5％w/v，25mL)和水(25mL)相继冲洗滤饼。将(仍然潮湿的)滤饼溶解在DCM(20mL)中，用两批NaHCO₃(5％w/v，20mL)洗涤，然后用水(20mL)洗涤一次。二氯甲烷层通过旋转蒸发干燥，然后在65℃溶解在乙酸乙酯(36mL)中。然后在搅拌下缓慢添加石油醚60-80(10mL)，并将混合物冷却至45℃并在45℃搅拌30分钟。在搅拌下添加额外的石油醚60-80(22mL)，经搅拌的混合物在2小时内冷却至15℃。通过过滤收集产物，用石油醚/乙酸乙酯2/1v/v(20mL)洗涤，然后在真空下干燥，得到化合物5(0.805g，收率83％，通过HPLC测定α和β端基异构体的组合纯度为98％)。

合成化合物7

将化合物4(500mg)和中间体3.1(211mg，1.2当量)称重到干燥烧瓶中，添加甲苯(5mL)，并在旋转蒸发器(45℃浴温)上浓缩溶液。在从无水DCM(5mL)中浓缩起始材料之前，再次重复上述步骤。一旦去除所有溶剂，剩余固体在真空下干燥10分钟。干燥后，将起始材料置于氩气下，溶解在无水DCM(5.0mL)中，并添加活化的

分子筛(450mg，颗粒形式)。此时，将NIS试剂置于高真空下干燥。10分钟后，添加干燥的NIS(400mg，2.0当量)，并在室温下搅拌溶液30分钟。然后快速添加TMSOTf(8μL，5摩尔％)，使溶液从红色/橙色变为深红色/棕色。反应温度也从22℃上升至27℃。一旦加入TMSOTf，立即运行IPC，仅供参考(HPLC；10μL至1mL MeCN-H2O(8:2))。然后通过添加吡啶(20μL，0.245mmol)淬灭反应，并在环境温度下搅拌5分钟。过滤DCM溶液以去除分子筛，然后用10％的Na₂S₂O₃(3x5mL)和盐水(5mL)洗涤，然后在旋转蒸发器(40℃浴温)上浓缩，得到黄色泡沫状油(616mg)形式的粗化合物7。预期收率：约616mg(99％)。

合成化合物8

粗化合物7(16.6g)通过从甲苯(2x30mL)中蒸发，然后从无水DCM(30mL)中蒸发来干燥，生成黄色泡沫/油。然后将烧瓶置于氩气气氛下，之后添加无水DCM(100mL)和干燥甲醇(260mL)并搅拌混合物。然后将烧瓶冷却至0℃。在保持内部温度低于10℃的同时，滴加乙酰氯(AcCl)(3.30mL，2.0当量)。一旦添加完成，将混合物在环境温度下搅拌16小时。此时运行IPC(HPLC；20μL至1mL MeCN，残留化合物7不超过3面积％)。然后将烧瓶冷却至0℃，并通过添加N-甲基吗啉(总共需7.0mL)将产物溶液的pH调整至pH 6.5至7.5。产物混合物用DCM(50mL)稀释，并用H₂O(2x200mL)洗涤。第二次H₂O洗涤液是混浊的，通过TLC确认含有目标物质，因此使用DCM(50mL)进行反萃取。合并的DCM层然后用盐水(8mL)洗涤，之后在旋转蒸发器中在40℃的浴温蒸发，产生灰白色泡沫/油(约16.8g)。该混合物溶解在140mL甲苯(100mL+40mL洗涤液)中，并装入硅胶柱(85g二氧化硅)，该硅胶柱用3个柱体积(CV)的30体积％乙酸乙酯(石油醚中)平衡。柱子使用阶式梯度洗脱，收集1CV(140mL)的组分。使用的梯度是：

30体积％乙酸乙酯，石油醚中(3CV)

35体积％乙酸乙酯，石油醚中(4CV)

40体积％乙酸乙酯，石油醚中(9CV)

50体积％乙酸乙酯，石油醚中(4CV)

60体积％乙酸乙酯，石油醚中(3CV)

产物洗脱出超过12个组分。所有组分均用于IPC(HPLC，230nm处NMT为任何杂质峰的1.50面积％)。合并的组分在旋转蒸发器中在40℃的浴温蒸发，以产生灰白色泡沫，该泡沫固化以形成脆性固体形式的8(10.45g)。预期收率：10.45g(66％)。

实施例4–合成二硫化物(化合物17)

在下面的合成方案中描述了合成化合物17的整个合成程序。

合成化合物9

化合物5(1620g，1.18当量)和甲苯(18kg)按顺序装入50L Büchi碗中。将碗在50±10℃的水浴中加热30分钟。使用50±10℃的水浴温度在真空下蒸发，直到不再蒸馏出溶剂。将水浴冷却至20±10℃。将三氯乙腈(7.1kg，21当量)和干DCM(6.5kg)在氮气气氛下装入碗中。将氢化钠(5.6g，0.060当量)在干燥DCM(250g)中的悬浮液在氮气气氛下装入碗中。在20±10℃的水浴温度下，通过旋转使碗中的内容物混合1小时至2小时。化合物5在反应过程中溶解。对碗中的内容物进行取样，并用于反应完成IPC(H¹ NMR，相对于6.35ppm(起始物质)的三重峰在6.42ppm(产物)积分三重峰；通过条件≤5％残余起始材料)。按顺序将化合物3(1360g，2.35mol)、干燥DCM(12.3kg)和粉末分子筛

(136g)装入50L反应器中。使反应器内容物混合24小时。通过注射器过滤器对反应器内容物进行取样，并由Karl Fisher(AM-GEN-011，通过条件≤0.03％w/w)进行分析。达到水分阈值(约24小时)后，将反应器内容物调整至0±5℃。将Büchi碗的内容物按允许的体积转移到反应器集管中。将三甲基甲硅烷基三氟甲烷磺酸酯(100g，0.18当量)在干燥DCM(1250g)中的溶液在氮气气氛下装入反应器中。将集管内容物排放至反应器，在整个添加过程中使反应器内容物保持为0±10℃。添加需要15分钟至20分钟。将干燥DCM(1250g)装入Büchi碗中，然后转移至反应器集管。将集管内容物排放至反应器，在整个添加过程中使反应器内容物保持为0±10℃。反应器内容物在0±5℃搅拌60分钟。取样反应器内容物，使用IPC(HPLC，通过标准≤5％起始材料)完成反应。通过向反应器中装入N-甲基吗啉(85g，0.36当量)使反应淬灭。取样反应器内容物，使用IPC(湿pH纸，通过标准≥pH 7)完成淬灭。将硅胶(4.9千克)装入Büchi碗中。将反应器内容物转移至Büchi碗。使用40±10℃的水浴温度在真空下进行蒸发，直到不再蒸馏出溶剂。将硅胶(1.4kg)装入Büchi碗中，随后用二氯甲烷(7.0kg)冲洗反应器。旋转碗内容物，以确保固体不会粘附在碗的表面。使用40±10℃的水浴温度在真空下进行蒸发，直到不再蒸馏出溶剂。将碗内容物分成三部分进行硅胶色谱分析。在Biotage系统中安装150L KP-SIL滤筒。将乙酸乙酯(7.8kg)和石油醚(22kg)连同吸附在硅胶上的1/3反应混合物一起装入50L反应器中，充分混合，然后转移至Biotage储溶剂器。储溶剂器内容物通过柱洗脱，以调节柱子。将洗脱液收集在20L油罐中并丢弃。柱分三批运行，每批用乙酸乙酯/石油醚洗脱，如下所述：

a.将乙酸乙酯(1.6kg)和石油醚(4.4kg)装入Biotage储溶剂器中，充分混合，然后通过柱洗脱。柱径流收集在20L油罐中。

b.将乙酸乙酯(25kg)和石油醚(26kg)装入50L反应器中，充分混合，转移至两个Biotage储溶剂器，然后通过柱洗脱。柱径流收集在20L油罐中。

c.将乙酸乙酯(31kg)和石油醚(22kg)装入50L反应器中，充分混合，转移至两个Biotage储溶剂器，然后通过柱洗脱。柱径流收集在5L实验室用玻璃瓶中。

d.将乙酸乙酯(16kg)装入Biotage储溶剂器中，然后通过柱洗脱。柱径流收集在20L油罐中。

e.柱子如上所述重复，并制备剩余的两份干负载二氧化硅。

对柱组分进行取样用于确定产品纯度(TLC[10％丙酮在甲苯中，Rf0.5])，以识别产品中的组分。将接受的柱组分合并，并放入100L Büchi碗中。甲苯用于将任何结晶材料从接受的组分的容器冲洗到碗中。使用40±10℃的水浴温度在真空下进行蒸发，直到不再蒸馏出溶剂。将甲苯(1.7kg)装入碗中，并旋转内容物，直到固体溶解。在20分钟至40分钟内将叔丁基甲基醚(4.4kg)装入碗中。在20±5℃的温度下，将碗内容物旋转12小时至24小时。将碗内容物转移至6L Nutsche过滤器，并通过真空过滤去除溶剂。将叔丁基甲基醚(620g)装入碗中，转移至Nutsche过滤器，并通过滤饼。滤饼在过滤器中风干，然后转移至真空烘箱，并在30℃的设置下真空干燥，以去除残留溶剂。对固体进行取样以进行分析和保留。将固体转移至带螺旋盖的Nalgene容器中，并在≤-15℃时储存。预期收率：1.68kg至1.94kg化合物9(65％至75％)。

合成化合物10

试剂如下制备：N-碘代琥珀酰亚胺(241g，2.20当量)在设置为30℃的真空烘箱中在真空下干燥24小时。在5L实验瓶中制备氯化钠(300g)在水(3000g)中的溶液。在50L反应器中制备硫代硫酸钠(1100g)在水(6000g)中的溶液，并将其分为两部分。

将化合物8(355g，0.486mol)和化合物9(634g，1.10当量)装入20L的Büchi碗中，随后装入甲苯(1500g)，并在40±5℃加热，直至溶解。使用35±10℃的水浴温度在真空下进行蒸发，直到不再蒸馏出溶剂。将甲苯(1500g)装入Büchi碗中。使用35±10℃的水浴温度在真空下进行蒸发，直到不再蒸馏出溶剂。将干燥的二氯甲烷(4000g)装入Büchi碗中。将碗旋转，直到固体溶解，并将溶液转移至夹套温度为20℃±5℃的5L反应器。将干燥的二氯甲烷(710g)装入Büchi碗中。将碗旋转以冲洗碗的表面，并将溶液转移至5L反应器。对反应器内容物进行取样用于确定试剂比IPC(H¹ NMR)。干燥的N-碘代琥珀酰亚胺在氮气气氛下装入反应器中，并搅拌反应器5分钟至15分钟。将反应器内容物调节至20℃±3℃。在5分钟至15分钟内将在干燥DCM(60g)中的三甲基甲硅烷基三氟甲烷磺酸酯(5.94g，0.055当量)装入反应器中。将内容物温度保持为20℃±3℃。反应混合物在20℃±3℃搅拌20±3min。对反应器内容物进行取样以用于反应完成(HPLC)。将N-甲基吗啉(98g，2当量)装入反应器中并充分混合。将以上制备的硫代硫酸钠溶液的一部分装入50L反应器中。将5L反应器的内容物转移至含有硫代硫酸钠溶液的50L反应器，并彻底混合。底层被排至HDPE油罐中。

将DCM(570g)装入5L反应器(顶层来自50L反应器)中并充分混合。底层与HDPE油罐中的先前的底层合并。将顶层转移至单独的HDPE油罐中并保留，直到确认收率。将合并的有机相(底层)装入50L反应器中，然后装入另一部分硫代硫酸钠，并充分混合。底层排至HDPE油罐。将顶层保留在HDPE油罐中，直到确认收率。将氯化钠溶液与有机相(底层)一起装入50L反应器中，并充分混合。将硅胶(1300g)装入Büchi碗中，并安装旋转蒸发器。将反应器的底层装入Büchi碗中。旋转碗中的内容物以防止吸附到碗上，并在真空下使用40±5℃的水浴温度蒸发，直到不再蒸馏固体。碗的内容物被分成两等份。将硅胶(200g)装入Büchi碗中，然后装入二氯甲烷(700g)。旋转碗的内容物，以确保固体不会粘附在碗的表面。碗在40℃±10℃的水浴温度下在真空下进行蒸发，直到不再蒸馏溶剂。将碗的内容物分成两部分，并将一部分添加到之前的每个硅胶样品中。

使用以下程序在硅胶上单独纯化每一部分(样品储存在≤15℃，等待净化)：在Biotage系统中安装150L KP-SIL滤筒。将乙酸乙酯(15.5kg)和石油醚(16.5kg)装入50L反应器中，充分混合，然后转移至两个Biotage储溶剂器中。储溶剂器的内容物通过柱洗脱，以调节柱子。将洗脱液收集在20L油罐中并丢弃。将来自上面的一部分干负载二氧化硅装入Biotage样品注射模块(SIM)中，然后用乙酸乙酯/石油醚洗脱，如下所示：

a.将乙酸乙酯(6.2kg)和石油醚(6.6kg)装入50L反应器中，充分混合，然后转移至Biotage储溶剂器。柱径流收集在20L油罐中。

b.将乙酸乙酯(19.5kg)和石油醚(19.2kg)装入50L反应器中，充分混合，转移至两个Biotage储溶剂器，然后通过柱洗脱。柱径流收集在20L油罐中。

c.将乙酸乙酯(13.6kg)和石油醚(12.3kg)装入50L反应器中，充分混合，转移至两个Biotage储溶剂器，然后通过柱洗脱。柱径流收集在20L油罐中。

d.将乙酸乙酯(14.2kg)和石油醚(11.9kg)装入50L反应器中，充分混合，转移至两个Biotage储溶剂器，然后通过柱洗脱。柱径流收集在20L油罐中。

e.将乙酸乙酯(29.7kg)和石油醚(22.9kg)装入Biotage储溶剂器中，然后通过柱洗脱。柱径流收集在20L油罐中直到组分11，然后收集在5L HDPE油罐中。

f.将乙酸乙酯(15.5kg)和石油醚(11.0kg)装入Biotage储溶剂器中，然后通过柱洗脱。柱径流收集在5L HDPE油罐中。

g.将乙酸乙酯(29.7kg)和石油醚(13.2kg)装入Biotage储溶剂器中，然后通过柱洗脱。柱径流收集在5L HDPE油罐中。

h.将乙酸乙酯(15.5kg)装入Biotage储溶剂器中，然后通过柱洗脱。柱径流收集在5L HDPE油罐中。

对柱组分进行取样用于确定产品纯度(TLC确定产物中的各组分)。来自前两个柱的75面积％至95面积％化合物10的组分在装有硅胶(400g)的Büchi碗中合并，并在真空下使用40±10℃的水浴温度进行蒸发，直到不再蒸馏出溶剂。碗的内容物如下纯化：在Biotage系统中安装150L KP-SIL滤筒。将乙酸乙酯(15.5kg)和石油醚(11.9kg)装入50L反应器中，充分混合，转移至两个Biotage储溶剂器。储溶剂器的内容物通过柱洗脱，以调节柱子。将洗脱液收集在20L油罐中并丢弃。将碗的内容物装入Biotage样品注射模块(SIM)，然后用乙酸乙酯/石油醚洗脱，如下所示：

将来自所有三个柱的接受的柱组分在Büchi碗中合并，并在真空下使用温度为40℃±10℃的水浴进行蒸发，直到不再蒸馏出溶剂。对碗的内容物进行取样以进行分析和保留。将碗密封并转移，以在≤-15℃储存。预期收率：440kg至540kg(收率52％至64％)。

合成化合物11

将二氯甲烷装入含有化合物10(635g，0.345mol)(PN0699)的Büchi碗中，并在30±10℃加热直至溶解。将甲醇(3.2kg)装入碗中。将碗的内容物调节至0±3℃。将在二氯甲烷(660g)中的乙酰氯(54.1g，2当量)装入碗中，将内容物温度保持在0±10℃。将碗的内容物调节至20±3℃，并将混合物搅拌40小时至48小时。对碗的内容物进行取样，以进行反应完成IPC(HPLC，通过)。将碗的内容物调节至0±3℃。将N-甲基吗啉(139g，4当量)装入碗中并充分混合。对碗的内容物进行取样，以淬灭完成IPC(pH纸，通过≤pH 7)。采用35±10℃的水浴在真空下浓缩碗的内容物。将乙酸乙酯(4.8kg)和水(5.5kg)装入Büchi碗中并旋转以溶解碗的内容物。将碗的内容物转移至50L反应器，并充分混合。底层排至HDPE油罐中。将顶层转移至装有旋转蒸发器的Büchi碗中，采用35±10℃的水浴在真空下浓缩内容物。将来自HDPE油罐的底层与乙酸乙酯(1.5kg)装入50L反应器中，并充分混合。将底层排至HDPE油罐中并保留，直到确认了收率。将顶层转移至装有旋转蒸发器的Büchi碗，并采用35±10℃的水浴在真空下浓缩内容物。对碗的内容物进行取样以进行分析和保留。将碗密封并转移，以在≤-15℃储存。预期收率：518kg至633kg(收率90％至110％)。

合成化合物12

试剂如下制备：将两份N-碘代琥珀酰亚胺(143g，3.90当量)在温度设定为30℃的真空烘箱中在真空下干燥24小时。在5L实验瓶中制备氯化钠(420g)在水(1850g)中的溶液，并将其分为大约相等的2份。在5L实验室瓶中制备硫代硫酸钠(230g)在水中的溶液(2080g)，并将其分为大约相等的4份。

将化合物9(504g，1.30eq.)装入含有化合物11(607g，0.327mol)的50L Büchi碗中，随后装入甲苯(1500g)，并在40±5℃加热直至溶解。使用35±10℃的水浴温度在真空下进行蒸发，直到不再蒸馏出溶剂。将甲苯(1500g)装入Büchi碗中。使用35±10℃的水浴温度在真空下进行蒸发，直到不再蒸馏出溶剂。将干燥的DCM(2400g)装入Büchi碗中。将碗旋转，直到固体溶解，并将一半溶液转移至夹套温度为20℃±5℃的5L反应器。将溶液的后以半转移至5L实验瓶中。将干燥的DCM(710g)装入Büchi碗中。旋转碗以冲洗碗表面，并将一半溶液转移至5L反应器。将另一半装入以上的5L实验瓶中，并储存在氮气下以供第二批使用。将一部分干燥的N-碘代琥珀酰亚胺在氮气气氛下装入反应器中。将反应器内容物调整至-40℃±3℃。在15分钟内将在干燥二氯甲烷(90g)中的三甲基甲硅烷基三氟甲基磺酸酯(9.09g，0.25有效当量)装入反应器中。将内容物温度保持为-40℃±5℃。反应混合物在-40℃±3℃搅拌30±5分钟。然后调整至-30℃±3℃并搅拌150分钟。对反应器内容物进行取样以用于反应完成。将N-甲基吗啉(33.1g，2有效当量)装入反应器中，并充分混合。将上述制备的硫代硫酸钠溶液的一部分装入5L反应器中，并充分混合。底层被排至5L实验瓶中。将DCM(400g)装入5L反应器中，并充分混合。将底层与先前的底层在5L实验瓶中合并。将合并的有机相装入5L反应器中，随后装入另一部分硫代硫酸钠，并充分混合。将底层排至5L的实验瓶中。将一部分以上的氯化钠溶液装入反应器中，随后装入先前的实验瓶的内容物。将反应器中的底层装入Büchi，并使用40±10℃的水浴温度在真空下蒸发，直到不再蒸馏出溶剂。清洗并干燥反应器。

将化合物9和化合物11的第二部分装入反应器中，并与第一批进行相同的处理。第二批有机萃取后，反应混合物在反应器中合并。将一部分氯化钠溶液装入反应器中，并充分混合。将硅胶(1700克)装入Büchi碗中，并安装旋转蒸发器。将反应器中的底层装入Büchi中，并在真空下使用40±10℃的水浴温度蒸发，直到不再蒸馏出溶剂。碗的内容物分为两部分，分别在硅胶上纯化。在Biotage系统(可购自Dyax公司旗下的Biotage,Virginia,USA)中安装150L KP-SIL滤筒。将乙酸乙酯(7.7kg)和石油醚(22.0kg)装入50L反应器中，充分混合，然后转移至两个Biotage储溶剂器中。储溶剂器的内容物通过柱洗脱，以调节柱子。将洗脱液收集在20L油罐中并丢弃。将来自上面的一部分干负载二氧化硅装入Biotage样品注射模块(SIM)，然后用乙酸乙酯/石油醚洗脱，如下所示：

a.将乙酸乙酯(1.5kg)和石油醚(4.4kg)装入HDPE油罐中，充分混合，然后转移至Biotage储溶剂器。柱径流收集在20L油罐中。

b.将乙酸乙酯(18.6kg)和石油醚(8.8kg)装入50L反应器中，充分混合，转移至两个Biotage储溶剂器，然后通过柱洗脱。柱径流收集在20L油罐中。

c.将乙酸乙酯(19.2kg)和石油醚(8.4kg)装入50L反应器中，充分混合，转移至两个Biotage储溶剂器，然后通过柱洗脱。柱径流收集在20L油罐中。

d.将乙酸乙酯(29.7kg)和石油醚(11.9kg)装入50L反应器中，充分混合，转移至两个Biotage储溶剂器，然后通过柱洗脱。柱径流收集在20L油罐中。

e.将乙酸乙酯(15.5kg)装入Biotage储溶剂器中，然后通过柱洗脱。柱径流收集在5L实验室用玻璃瓶中。

对柱组分进行取样用于确定产品纯度(TLC确定产物中的各组分)。来自前两个柱的75面积％至95面积％化合物12的组分在装有硅胶(400g)的Büchi碗中合并，并使用40±10℃的水浴温度在真空下进行蒸发，直到不再蒸馏出溶剂。将乙酸乙酯(7.7kg)和石油醚(22.0kg)装入50L反应器中，充分混合，然后转移至两个Biotage储溶剂器。储溶剂器的内容物通过柱洗脱，以调节柱子。将洗脱液收集在20L油罐中并丢弃。将含有不纯产物的干负载二氧化硅装入Biotage样品注射模块(SIM)，然后洗脱，细节如下：

a.将乙酸乙酯(1.5kg)和石油醚(4.4kg)装入50L反应器中，充分混合，然后转移至Biotage储溶剂器。柱径流收集在20L油罐中。

b.将乙酸乙酯(19.2kg)和石油醚(8.4kg)装入50L反应器中，充分混合，转移至两个Biotage储溶剂器，然后通过柱洗脱。柱径流收集在20L油罐中。

c.将乙酸乙酯(18.6kg)和石油醚(8.8kg)装入50L反应器中，充分混合，转移至两个Biotage储溶剂器，然后通过柱洗脱。柱径流收集在20L油罐中。

对柱组分进行取样用于确定产品纯度(TLC确定产物中的各组分，HPLC通过标准≥95％化合物12，无单一杂质>2.5％)。将来自所有三个柱的接受的柱组分在Büchi碗中合并，并使用40℃±10℃的水浴温度在真空下进行蒸发，直到不再蒸馏出溶剂。对碗的内容物进行取样以进行分析和保留。将碗密封并转移，以在≤-15℃储存。预期收率：494kg至584kg(收率52％至64％)。

合成化合物13

将冰醋酸(7.5kg)和乙酸乙酯(6.5kg)合并在合适的容器中，并标记为“GAA/EA溶液”。将碳酸氢钠(0.5kg)溶解在RO水中(10kg)，并标记为“5％w/w碳酸氢钠溶液”。钯/活性炭(100g，特别是Johnson Matthey，Aliso Viejo，California，USA，产品牌号A402028-10)和GAA/EA溶液(335g)按顺序装入反应容器中。将化合物12(270g)溶解在GAA/EA溶液(1840g)中，并转移至50L反应容器。通过用氮气加压至10巴，清除溶液中的氧气，然后释放。该操作又重复两次。反应器内容物在氢气下加压至10巴，然后释放。反应混合物在20巴H₂下氢化1.5天。然后释放压力，通过用氮气加压至10巴清除溶液中的氢气，然后释放。该操作重复一次。反应混合物通过硅藻土垫(300g)过滤。用GAA/EA溶液(2x5.5kg)洗涤硅藻土滤饼。合并滤液并在真空(浴温40±5℃)下蒸发。残渣与乙酸乙酯(2.3kg)分两部分共蒸发。粗产物的预期重量为约316g。Biotage系统配备150M KP-SIL滤筒和5L样品注射模块(SIM)。将乙酸乙酯(10.6kg)和冰醋酸(1.4kg)装入50L反应器中，充分混合，然后转移至Biotage储溶剂器。储溶剂器的内容物通过柱洗脱，以调节柱子。将洗脱液丢弃。粗产物溶解在乙酸乙酯(422g)和冰醋酸(55g)中。将所得溶液装入SIM中并通过柱子。反应混合物如下进行色谱分析：

a.将乙酸乙酯(13.8kg)和石油醚(1.8kg)装入反应器中，充分混合，然后转移至Biotage储溶剂器。

b.储溶剂器的内容物通过SIM洗脱至柱上，洗脱液收集在20L油罐中。

c.将乙酸乙酯(10.3kg)、冰醋酸(1.3kg)和甲醇(206g)装入50L反应器中，充分混合，然后转移至Biotage储溶剂器。

d.储溶剂器的内容物通过柱洗脱，洗脱液收集在5L油罐中。

e.将乙酸乙酯(6.6kg)、冰醋酸(0.9kg)和甲醇(340g)装入50L反应器中，充分混合，然后转移至Biotage储溶剂器。

f.储溶剂器的内容物通过柱洗脱，洗脱液以约2.5L组分收集在5L油罐中。

g.将乙酸乙酯(31.4kg)、冰醋酸(4.1kg)和甲醇(3.4kg)装入50L反应器中，充分混合，然后转移至Biotage储溶剂器。

h.储溶剂器的内容物通过柱洗脱，洗脱液收集在5L油罐中。

将含有化合物13的组分合并并在真空下(浴温40±5℃)蒸发。残渣溶解在乙酸乙酯(3.1kg)中，并用5％w/w碳酸氢钠溶液(9.3kg)洗涤，确保水介质的pH为≥8。乙酸乙酯相在真空下(浴温40±5℃)蒸发。对碗的内容物取样以进行分析和保留。预期收率：182g至207g(71％至81％)。

合成化合物16

将干二氯甲烷(2.5kg)装入含有化合物13(211g，76.5mmol，1.00当量)的Büchi碗中，并在不加热的情况下旋转直到溶解。将(2,5-二氧吡咯烷-1-基)4-乙酰基硫基丁酸酯(25.8g，99.4mmol，1.30当量)在干燥二氯甲烷(200g)中的溶液添加到Büchi碗中。碗在环境温度下旋转1小时，然后采用40±5℃的水浴温度在真空下浓缩。将甲苯(0.8kg)添加到碗中，并采用40±5℃的水浴温度在真空下去除两次。将甲苯(0.8kg)添加残余物中溶解。将硅胶(557g)装入反应容器中，并采用40±5℃的水浴温度在真空下去除溶剂。Biotage系统配备具有5L样品注射模块(SIM)的150M KP-SIL滤筒。将甲苯(10.1kg)和丙酮(1.0kg)装入50L反应器中，充分混合，然后转移至Biotage储溶剂器(溶剂A)。反应混合物如下纯化：

a.溶剂A通过柱洗脱以调节柱子。将洗脱液丢弃。

b.将干负载硅胶转移至SIM。

c.将甲苯(9.6kg)和丙酮(1.5kg)装入50L反应器中，充分混合，然后转移至Biotage储溶剂器(溶剂B)。

d.溶剂B通过柱洗脱，洗脱液收集在5L油罐中。

e.将甲苯(53.6kg)和丙酮(12.2kg)加入50L反应器，充分混合，然后转移至Biotage储溶剂器(溶剂C)。

f.溶剂C通过柱洗脱，洗脱液收集在5L油罐中。

g.将甲苯(8.4kg)和丙酮(2.6kg)装入50L反应器中，充分混合，然后转移至Biotage储溶剂器(溶剂D)。

h.溶剂D通过柱洗脱，洗脱液收集在5L油罐中。

i.将甲苯(23.4kg)和丙酮(9.2kg)装入50L反应器中，充分混合，然后转移至Biotage储溶剂器(溶剂E)。

j.溶剂E通过柱洗脱，洗脱液收集在5L油罐中。

将含有化合物16的组分(通过标准≥90％的化合物16和无单一杂质>2.5％)合并并在真空(浴温40±5℃)下蒸发。将残余物溶解在四氢呋喃(4.4kg)中，并采用40±5℃的水浴温度在真空下浓缩。对碗中的内容物进行取样以进行分析和保留。预期收率：169g至192g(76％至86％)。

合成化合物17

在启动前，将反应器在2.5L、3.5L和3.9L水平处标记，并安装真空控制器。将二氯甲烷装入含有140g化合物16的Büchi碗中，并转移至Reactor Ready容器中。使用两次DCM(333g)冲洗，将Büchi碗的内容物转移至Reactor Ready容器中。将乙醇(2.50kg)添加到reactor ready中。将反应混合物浓缩至2.5L标记(目标真空250毫巴)。将乙醇(1.58kg)添加到reactor ready中，并将其浓缩至3.5L标记。反应用乙醇稀释至3.9L标记。通过施加部分真空并释放氮气，将反应器内容物置于惰性气体下。在反应过程中保持缓慢的氮气流。将肼一水合物(1.13kg，1.11L)在氮气气氛下，装入5L Reactor Ready容器中。温度梯度设置为：初始温度20℃，最终温度60℃，线性温度梯度超过50分钟(0.8度/min)，并对反应器的内容物进行主动控制。容器温度在60℃保持45分钟。冷却梯度温度设置为：-2度/min，最终温度为20℃。将内容物排放到合适的HDPE罐中，并测定重量。等量转移至8个带有FEP封装密封件的聚丙烯离心容器中。在每个离心机容器中装入乙醇(750g)，并在环境中搅拌动30分钟。对容器进行离心(5300RCF，15℃，30分钟)。在取出通风橱之前，先用丙酮然后用水冲洗瓶子外部，去除容器外部残留的肼。将离心机容器中的上清液倒出，将残余颗粒溶解在低内毒素水(LE水)(1960g)中，并转移至5L Reactor Ready容器中。以中速搅动内容物，同时每1.5小时使用分散管使空气鼓泡通过溶液约15分钟至20分钟。然后将反应在20℃的密闭容器中搅拌过夜。一旦IPC显示游离五聚体组合物低于3％(占报告总量的面积％)，则认为反应已完成。如果反应混合物中存在任何不溶性物质，则需要过滤(使用P3烧结玻璃漏斗和5L布氏烧瓶)。反应器内容物在2个Lyoguard托盘中冷冻干燥。将搁板温度设置为-0.5℃，持续16小时至20小时，然后设置为20℃直至干燥。将冻干产物溶解在LE水(840g)中，并在6个离心瓶之间等分。将丙酮(630g)添加到每个容器中，搅动15分钟。将异丙醇添加到每个容器中(每个容器630g)，并继续搅动20分钟。内容物在15℃下以5300RCF离心1小时。丢弃上清液，并通过向每个容器中添加LE水(140g)将每个颗粒溶解在水中，然后使用定轨振荡器在环境中搅动混合物，直到颗粒溶解。将丙酮(630g)添加到每个容器中，并搅动15分钟。将异丙醇(每个容器630g)添加到每个容器中，并继续搅拌20分钟。内容物在15℃下以5300RCF离心1小时。丢弃上清液，通过添加LE水(100g)将每个颗粒溶解在水中，然后在环境中搅动。将溶液转移至Lyoguard托盘，用更多的LE水(每次66g)冲洗瓶子，并将冲洗液转移至同一托盘。通过将搁板温度设置为-0.5℃，持续16小时至20小时，然后设置为20℃直至干燥来冷冻干燥产物。对冻干产物进行取样以进行分析和保留。Lyoguard托盘采用双袋包装，贴上标签并存放在冰箱中(≤-15℃)。使用qHNMR测定冻干产物的效力。该过程提供了粗五二聚体(Penta Dimer)17。预期收率：26.1g至35.5g(61％至83％)。

使用500MHz仪器，通过¹H和¹³C NMR识别化合物17。在D₂O中以25mg/mL制备叔丁醇参比溶液。在D₂O中以13mg/mL制备样品，并将参比溶液添加到样品中。最终测试样品的组成为10mg/mL五二聚体和5mg/mL叔丁醇。获得¹H和¹³C光谱并进行积分。所得化学位移通过与理论位移的比较来指定。¹H NMR和¹³C NMR光谱分别如图1和图2所示。

实施例5–五二聚体粗品转化为游离碱的形式

将Amberlite FPA91(1.46kg；40g/g五聚体粗品-校正效力)装入大柱中。通过将氢氧化钠(320g)加入在10L肖特瓶中的LE水(8.00kg)中来制备8L的1.0M NaOH溶液。在1小时的时间段内使该溶液通过Amberlite树脂。LE水(40.0kg)通过Amberlite树脂。树脂用额外的LE水(约10kg等分试样)冲洗，直到通流中的pH达到<8.0。使存储在Lyoguard托盘中的五二聚体粗品(49g，PN0704)升温至环境温度。将LE水(400g)添加到含有五二聚体粗品(49g)的Lyoguard托盘中，并使其充分溶解，之后转移至1L肖特瓶。托盘用另一批LE水(200g)冲洗，并将这些洗涤液添加至肖特瓶内容物。将五二聚体粗品溶液小心地倒在树脂顶部。用LE水(200克)冲洗1升肖特瓶，并将其装在树脂上。打开Amberlite阀门，使五二聚体粗品溶液在约5分钟内缓慢进入树脂中。关闭阀门，使材料留在树脂上约10分钟。将LE水倒在树脂顶部。打开阀门，用LE水洗脱，收集约16种组分(500mL)。每种组分通过TLC炭化(EtOH中的10％H₂SO₄)分析。将所有含碳水化合物的组分合并，并使用0.2μm尼龙滤膜通过Millipore过滤器过滤。溶液等分至5至6个托盘。过滤容器用LE水(100g)冲洗，并在各托盘之间分散。材料在托盘中冷冻干燥。将隔板温度设置为-10℃，持续16小时至20小时，然后设置为+10℃，直到材料干燥。在除一个Lyoguard托盘外的所有托盘中装入LE水(150g)，并将其转移至剩余的一个含有干燥材料的托盘中。每一个空托盘都用更多的LE水(100g)冲洗，并将该冲洗体积添加到最终的Lyoguard托盘中。最后的Lyoguard托盘被冷冻干燥。将隔板温度设置为-10℃，持续16小时至20小时，然后设置为+10℃，直到材料干燥。对产品进行取样以进行分析和保留。将干燥材料转移至HDPE或PP容器中，并储存于≤-15℃。预期收率：31g至34g(86％至94％)。

二聚体中二硫键的TCEP还原迅速且接近化学计量。使用TCEP进行化学计量还原，得到约2当量的氨基葡萄糖五糖单体。具体而言，将五糖二聚体溶解在含有1摩尔当量TCEP的反应缓冲液(50mM HEPES缓冲液(pH 8.0))中。在环境温度下1小时后，通过HPLC和CAD检测分析反应。在这些条件下，转化为五氨基葡萄糖单体(峰值为约10分钟)几乎完成(五氨基葡萄糖二聚体峰值为约11.5分钟)-见图4。其余未注释峰来自样品基质。基于平衡的化学方程式，添加的TCEP在很大程度上转化为TCEP氧化物，任何残留的TCEP都会在添加到结合反应之前抑制空气氧化回到二聚体。为简单起见，可以基于输入二聚体添加氨基葡萄糖五糖，并假设在这些条件下单体的转化率>95％。

使用500MHz仪器，通过¹H和¹³C NMR识别五二聚体。在D₂O中以25mg/mL制备叔丁醇参比溶液。在D₂O中以13mg/mL制备样品，并将参比溶液添加到样品中。最终测试样品的组成为10mg/mL五二聚体和5mg/mL叔丁醇。获得¹H和¹³C光谱并进行积分。所得化学位移通过与理论位移的比较来指定。¹H NMR和¹³C NMR光谱分别如图1和图2所示。

实施例5-用实施例2的TT连接物转化为实施例4的五糖单体，以提供本发明的疫苗 (化合物18)

将实施例2的TT单体连接物中间体与浓度增加的4至70五聚氨基葡萄糖摩尔当量(2至35五糖二聚体摩尔当量)在环境温度下反应4小时。通过30kDa MWCO膜进行分离来纯化每个滴定点的粗结合物。通过SEC-MALS分析每个纯化的结合物样品的蛋白质含量、有效载荷密度，并通过SEC-HPLC分析单体/聚集体含量。数据显示，在≥50五聚氨基葡萄糖当量时有效载荷密度达到饱和。基于SEC HPLC分析，聚集体含量随着五糖单体负载的增加而增加，从30个五聚氨基葡萄糖当量开始增加，似乎达到了约4％的稳态水平。基于这些结果，选择用于后续结合反应的五糖二聚体负载为25摩尔当量，对应于50摩尔当量的五聚氨基葡萄糖的理论负载。

按照上述方法准备了化合物18的一系列的三次试验合成以及随后的GMP合成。对所得产物中每一种的效力(通过ELISA分析)和有效载荷密度(五聚氨基葡萄糖与破伤风类毒素的摩尔比)进行评估。

下表提供了结果。

这些结果证明本发明化合物的载荷系数非常高。

前述描述仅用于说明本发明，并不意味着限制本发明。由于结合本发明的精神和实质的所述实施方式的修改对于本领域技术人员是可能会发生的，因此本发明应被广义地解释为包括权利要求及其等效物范围内的所有变化。