MD4445C1 - Procedeu de cultivare a tulpinii de fungi Trichoderma koningii CNMN-FD-15 - Google Patents

Abstract

Invenţia se referă la biotehnologie, şi anume la un procedeu de cultivare a tulpinii de fungi Trichoderma koningii CNMN-FD-15.Procedeul, conform invenţiei, prevede obţinerea suspensiei de spori a tulpinii crescute timp de 12…14 zile pe un mediu de malţ-agar înclinat, adăugarea în condiţii sterile a nanoparticulelor de ZnO cu dimensiunile de 29 nm în concentraţie de 0,005% cu agitare în decurs de 1…2 min, inocularea suspensiei într-un mediu nutritiv în concentraţie de 10% vol. şi cultivarea submersă la temperatura de 28…30°C cu agitare continuă la 180…200 rot/min în decurs de 240 ore, totodată mediul nutritiv conţine, g/L: tărâţe de grâu - 2,0, făină de soia - 1,0, CaCO3 - 0,2, (NH4)2 SO4 - 0,1 şi apă potabilă restul.

Description

Invenţia se referă la biotehnologie, şi anume la un procedeu de cultivare a tulpinii de fungi Trichoderma koningii CNMN-FD-15.

Cultivarea submersă a tulpinii de fungi Trichoderma koningii Oudemans CNMN-FD-15 cu însuşirea distinctivă de a sintetiza simultan toate trei tipuri de proteaze (acide, neutre şi alcaline), precum şi amilaze - în calitate de enzime secundare, asigură hidroliza spontană a polimerilor proteici şi a polizaharidelor amidonoase. Procedeul poate fi utilizat pentru obţinerea proteazelor, cu potenţial de aplicare în procesele tehnologice de prelucrare a materiei prime de diferită provenienţă, bogată în proteine şi polizaharide amidonoase (industria alimentară, de pielărie şi blănuri, farmaceutică, oenologie, în producerea berii şi alcoolului, detergenţilor ş.a.).

În tehnologia de cultivare a tulpinilor fungice producătoare de enzime proteolitice, în scopul sporirii biosintezei metaboliţilor secundari se utilizează diverse proceduri, inclusiv: modificarea componenţei mediului de cultivare, selectarea inductorilor specifici ai sintezei proteazelor (ingrediente naturale cu conţinut înalt de proteine), aplicarea, în dependenţă de particularităţile fiziologo-biochimice ale tulpinii, a diferitor agenţi fizico-chimici cu efect stimulator - compuşi coordinativi ai metalelor de tranziţie, precum şi a radiaţiei electromagnetice în diapazon milimetric.

Se cunoaşte mediul, ce conţine borhot de sfeclă, azotat de amoniu, dihidrofosfat de potasiu, malţ şi tărâţe de grâu [1].

Se cunoaşte, de asemenea, mediul nutritiv pentru cultivarea tulpinii de fungi, ce conţine: faină de porumb, faină de soia, CaCO3, (NH4)2SO4, [Co(DH)2·(Thio)2]F[PF6]·nH2O şi apă, având pH-ul 6,25 [2].

Recent s-a demonstrat eficacitatea nanocompozitelor în ameliorarea bioproceselor. Însuşirile nanomaterialelor se deosebesc principial de însuşirile particulelor brute cu aceeaşi compoziţie chimică, prezentând efectiv o punte de legătură între materialele brute şi structurile atomice şi moleculare. La scala nano proprietăţi dependente de mărime sunt deseori observate, dimensiunea constituind un parametru-cheie ce determină însuşirile fizice şi chimice ale nanoparticulelor [3, 4].

În calitate de cea mai apropiată soluţie serveşte procedeul de cultivare clasică a tulpinii Trichoderma koningii Oudemans CNMN-FD-15 în cultură submersă cu utilizarea mediului selectat anterior cu următoarea componenţă (%): tărâţe de grâu - 2,0, făină de soia - 1,0, CaCO3 - 0,2, (NH4)2SO4 - 0,1, apă potabilă până la 1L, pH 6,25 realizat în baloane Erlenmayer, pe agitatoare rotative (180…200 rot/min) la temperatura de 28…30°C în decurs de 240 ore [5].

Dezavantajul acestui procedeu constă în faptul că nu asigură realizarea pe deplin a potenţialului biosintetic al tulpinii, iar biosinteza enzimelor proteolitice nu atinge valoarea maximă.

Problema pe care o rezolvă prezenta invenţie constă în elaborarea unui procedeu de cultivare submersă a tulpinii de fungi Trichoderma koningii Oudemans CNMN-FD-15, aplicarea căruia asigură sporirea biosintezei proteazelor acide şi neutre, ce contribuie la hidroliza mai profundă a substanţelor proteice şi la lărgirea sferei de aplicare practică a preparatului.

Procedeul de cultivare a tulpinii de fungi Trichoderma koningii CNMN-FD-15 prevede obţinerea suspensiei de spori prin cultivarea acesteia pe un mediu de malţ-agar înclinat timp de 12…14 zile, adăugarea în condiţii sterile a nanoparticulelor de ZnO cu dimensiunile de 29 nm în concentraţie de 0,005% cu agitare în decurs de 1…2 min, inocularea suspensiei într-un mediu nutritiv în cantitate de 10% vol. şi cultivarea submersă la temperatura de 28…30°C cu agitare continuă la 180…200 rot/min în decurs de 240 ore, totodată mediul nutritiv conţine, g/L: tărâţe de grâu - 2,0, făină de soia - 1,0, CaCO3 - 0,2, (NH4)2SO4 - 0,1 şi apă potabilă restul.

Rezultatul invenţiei constă în sporirea nivelului de biosinteză a două tipuri de proteaze sintetizate de micromiceta Trichoderma koningii CNMN-FD-15: a proteazelor acide cu 83,7...87,6% ( cca de 2x), a celor neutre cu 342,7...350,8% (de 4,4...4,5x), precum şi păstrarea activităţii proteazelor alcaline şi amilazelor satelit la nivelul celei mai apropiate soluţii.

Efectul biostimulator al nanoparticulelor se datorează însuşirilor distincte unice în dependenţă de dimensiuni la scala nano, exprimate în viteză mare de mişcare, capacitate excepţională de penetrare a peretelui şi membranelor celulare, suprafaţă specifică mare la o unitate de masă ce sporeşte capacitatea de adsorbţie, reactivitatea chimică şi potenţialul catalitic, ce oferă o platformă deosebită în modelarea proceselor de biosinteză a principiilor bioactive la fungii miceliali.

Exemple de realizare a invenţiei

Exemplul 1

Suspensia de spori a culturii de Trichoderma koningii CNMN-FD-15, crescută timp de 12…14 zile pe suprafeţe oblice de malţ-agar şi pregătită prin spălarea cu apă distilată sterilă, se supune în condiţii sterile tratării cu nanoparticule de oxid de zinc - nano ZnO (29 nm) în cantitate de 0,005% cu agitare riguroasă timp de 1…2 min manual sau pe agitator.

Ulterior, materialul semincer tratat, în concentraţie de 10% V/V, se inoculează în mediul nutritiv steril cu următoarea componenţă (%): tărâţe de grâu - 2,0, făină de soia - 1,0, CaCO3 - 0,2, (NH4)2SO4 - 0,1, apă potabilă până la 1 L, pH 6,25. Cultivarea tulpinii se realizează în baloane Erlenmayer de 0,75 L cu 0,2 L mediu nutritiv, în condiţii de agitare continuă, pe agitatoare rotative (180…200 rot/min) la temperatura de 28°C, durata cultivării 240 ore.

Activitatea maximă a proteazelor acide (pH 3,6) şi neutre (pH 7,4), determinată prin metoda Anson după acţiunea asupra cazeinatului de sodiu, în condiţiile enunţate a fost înregistrată la concentraţia de 50 mg de nano-ZnO cu dimensiunile de 29 nm şi constituie 49,42 u/mL şi, respectiv, 283,68 u/mL, fiind cu 83,7% (cca 2x) şi 442,7% (4,4x) superioară variantei de control (26,90 u/mL şi 64,08 u/mL) (vezi tabelul).

Tabel

Modificarea activităţii proteazelor acide şi neutre la micromiceta Trichoderma koningii Oudemans CNMN-FD-15 în funcţie de concentraţia nano-ZnO (29 ± 5 nm)

Variante Concentraţia,% Proteaze acide Proteaze neutre u/mL % u/mL % Nano-ZnO* (29 nm) 0,001 30,34 112,8 76,83 119,9 0,005 49,42 183,7 283,68 442,7 0,010 46,48 172,8 265,35 414,1 Cea mai apropiată soluţie - 26,90 100 64,08 100;*Sinteza sonochimică a nanoparticulelor ZnO/PVP.

Pentru efectuarea sintezei nanoparticulelor de ZnO/PVP în prealabil au fost pregătite două soluţii: 0,44 g (0,02 mol) Zn (CH3COOH)2 ·2H2O dizolvate în 30 mL de metanol şi 0,08 g PVP Ms PVP = 8000 dizolvate în 20 mL de metanol, care apoi au fost amestecate şi agitate timp de 10 min cu ajutorul unui agitator magnetic. După aceasta amestecul a fost plasat într-un pahar Erlenmayer cu condensator de reflux, apoi, prin picurare, în amestec s-au introdus 10 mL de soluţie (0,04 moli) de KOH în metanol. Sinteza s-a efectuat la temperatura de 60°C timp de 14 ore sub influenţa constantă a ultrasunetului (38 kHz). Precipitatul alb, format în urma sintezei, a fost centrifugat la 2000 rot/min, spălat repetat cu etanol şi acetonă, apoi uscat la temperatura de 100 °C. Randamentul sintezei este de 66%.

Produsul obţinut a fost examinat prin diverse metode: difracţia de raze X (DRX), spectroscopia IR, analiza de absorbţie atomică.

Compoziţia chimică a fost determinată prin analiza absorbţiei atomice

Pentru ZnO/PVP:

Găsit, %: Zn - 79,75, O - 19,78, C - 0,32, N - 0,070, H - 0,049.

Calculat, %: Zn - 79,84, O - 19,65, C - 0,39, N - 0,075, H - 0,049.

Analiza de fază a pulberii de ZnO a fost efectuată cu ajutorul difractometrului DRON-UM (metoda Θ - 2Θ, Fe-Kα - radiaţia, λ = 1,93604 Å). Au fost observate următoarele picuri de difracţie pentru 2 Θ = 40,19°, 43,64°, 46,05°, 60,80°, 73,04° şi 81,90° ce corespund fazei hexagonale a nanoparticulelor de ZnO grupa spaţială P63mc, a = 3,249 Å, c = 5,206 Å). Dimensiunile nanoparticulelor de ZnO calculate după semilărgimea picurilor de difracţie sunt de 29 ± 5 nm.

În spectrele IR a fost observată o deplasare a benzii de absorbţie a grupului carbonilic C = O de la 1645 cm-1 pentru PVP pur la 1559,9 cm-1 pentru sistemul ZnO/PVP (Ms = 8000). Acest lucru poate fi rezultatul interacţiunii dintre oxigenul grupului carbonilic şi ionii de zinc. De asemenea s-a observat o schimbare şi pentru banda 1341 cm-1 responsabilă pentru legătura N-C, care se deplasează spre lungimi de undă mai scurte în ZnO/PVP (Ms = 8000). Picul îngust de absorbţie centrat la 1409 cm-1 se referă la conexiunea C-H în PVP.

Activitatea proteazelor alcaline (pH 9,0) a constituit 60,4 u/mL; activitatea α-amilazelor, determinată după gradul de hidroliză a amidonului a constituit 20,5 u/mL pentru amilazele acidulabile (pH 4,7) şi 38,2 u/mL pentru cele acidstabile (pH 2,5), aceste valori se înscriu în limitele nivelului celei mai apropiate soluţii.

Exemplul 2

Tulpina Trichoderma koningii Oudemans CNMN-FD-15 a fost cultivată în baloane Erlenmayer cu capacitatea de 0,5 L, cu 0,1 L mediu nutritiv la temperatura de 30°C, celelalte condiţii fiind echivalente cu cele din exemplul 1.

Activitatea maximă a proteazelor acide (pH 3,6) şi neutre (pH 7,4), determinată prin metoda Anson după acţiunea asupra cazeinatului de sodiu, în condiţiile enunţate pentru 0,005% de nano-ZnO cu dimensiunile de 29 nm a constituit 52,90 u/mL şi, respectiv, 295,73 u/mL, ce este cu 87,6% (cca 2x) şi 350,8% (4,5x) superioară variantei celei mai apropiate soluţii (28,2 u/mL şi 65,6 u/mL).

1. Грачева И. М. Технология ферментных препаратов. 1975, Москва, Агропромиздат, р. 325-327

2. MD 4234 B1 2013.06.30

3. Robert Walisko, Rainer Krull. Microparticle based morphology engineering of filamentous microorganism for industrial bio-production. Biotechnol Lett. 2012, 34:1975-1982 DOI 10 1007/s10529-012-0997-1

4. Habib Driouch, Andreas Roth, Petra Dersch, Christoph Wittmann. Optimized bioprocess for production of fructofuranosidase by recombinant Aspergillus niger. Appl Microbiol Biotechnol (2010) 87:2011-2024 DOI 10.1007/s00253-010-2661-9

5. MD 4285 B1 2014.05.31

Claims (1)

1. Procedeu de cultivare a tulpinii de fungi Trichoderma koningii CNMN-FD-15, care prevede obţinerea suspensiei de spori a tulpinii crescute timp de 12…14 zile pe un mediu de malţ-agar înclinat, adăugarea în condiţii sterile a nanoparticulelor de ZnO cu dimensiunile de 29 nm în concentraţie de 0,005% cu agitare în decurs de 1…2 min, inocularea suspensiei într-un mediu nutritiv în concentraţie de 10% vol. şi cultivarea submersă la temperatura de 28…30°C cu agitare continuă la 180…200 rot/min în decurs de 240 ore, totodată mediul nutritiv conţine, g/L: tărâţe de grâu - 2,0, făină de soia - 1,0, CaCO3 - 0,2, (NH4)2 SO4 - 0,1 şi apă potabilă restul.