KR960012064B1

KR960012064B1 - 인터로이킨-2-조성물의 제조방법

Info

Publication number: KR960012064B1
Application number: KR1019870000056A
Authority: KR
Inventors: 알. 대처 데이비드; 가즈히로 시마
Original assignee: 시오노기세이야꾸 가부시끼가이샤; 요시또시 가즈오
Priority date: 1986-01-07
Filing date: 1987-01-07
Publication date: 1996-09-12
Also published as: JPS62164631A; DE3782828T2; DE3782828D1; GR3006807T3; EP0229016A2; CA1288340C; JPH0645551B2; EP0229016B1; DE229016T1; EP0229016A3; ATE82857T1; KR870006901A; ES2043609T3

Abstract

내용없음

Description

인터로이킨 -2-조성물의 제조방법

본 발명은 의약으로서 매우 유용한 인터로이킨-2-조성물의 제조방법에 관한 것이다.

인터로이킨-2(이하, IL-2라 약칭한다)라 불리는 화합물은 T 세포성장 활성, NK 세포(Natural Killer cell) 성장활성 등의 활성을 갖는 일종의 단백질이다. 이 화합물은 각종의 암이나, 면역결핍증 및 최근에는 후천성 면역 결핍증(AIDS : Acquired Immune deficiency Syndrome)의 치료약으로 크게 기대되고 있다.

IL-2는 통상의 보존 상태에서는 불안정하므로 각종의 안정화 방법이 연구되었다. 예를들면, 환원제를 함유하는 IL-2 조성물(일본국 특개소 제60-215631호), 인간 혈청 알부민(이하, HSA라 약칭한다)을 함유하고, 용액상태에서 pH3 내지 6을 나타내는 IL-2 조성물(이하, 일본국 특개소 60-222424호), 개량된 젤라틴과 결합된 생리 활성 물질의 조성물(일본국 특개소 제60-228422호) 등이 개시되어 있다.

본 발명은 용액상태에서 pH 6.1 내지 9인 혈청 알부민을 함유하는 IL-2 조성물의 제조방법에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 본 발명은 1중량부의 인터로이킨-2 및 1∼500중량부의 혈청 알부민 및 필요하다면, 약학적으로 허용 가능한 담체를 함유하는 용액을 염기로 pH 8∼11, 더욱 바람직하게는 pH 9∼11로 조절한후, 즉시 산으로 pH 6.1∼9로 조절함을 특징으로 하거나 ; 상기 용액을 산으로 pH 2∼6, 더욱 바람직하게는 2∼4로 조절한후, 즉시 염기로 pH 6.1∼9로 조절함을 특징으로 하는 인터로이킨-2 조성물의 제조방법에 관한 것이다.

전술한 바와 같이, IL-2의 안정화 및 용해화의(solubilization) 개선을 위해 많은 방법이 시도되어 왔다.

IL-2는 특히 거의 중성 조건하에서 물에 비교적 난용성이고, 등전점(pH 약 7.6)에서 응집되기 때문에 용해도가 급격히 감소한다. 따라서, 공지의 기술로는 동결 건조된 조성물을 제조하기가 어렵고, 실질적으로 사용할때 이들 조성물의 용해도가 낮기 때문에 중성의 lL-2 조성물을 제조하기가 어렵다.

그러나, 주세자가 동·정맥내, 근육내, 피하 또는 피내에 투여되는 사실을 고려하면 생리적으로 적절한 pH 범위가 되도록 조성물이 제조되는 것이 바람직하다. 예를들면, 산성 조성물은 때때로 주사된 부위를 자극하여, 국소자극, 염증 등의 바람직하지 못한 국소 작용이 예상된다. 바람직하지 못한 효과들을 피하기 위하여 새로운 조성물을 개발하기 위한 연구를 수행하여 생리적으로 pH 값 부근에서 조절되는 IL-2 조성물을 제조하는데 성공하였다.

본 발명에 의해 제조된 조성물은 동결 건조전의 용액상태 및 동결 건조후의 보존 상태에서의 IL-2의 안정성은 물론이거니와 재용해시의 용액의 상태 및 안정성 등이 탁월하다.

본 발명은 용액 상태에서, pH 6.1∼9인 혈청 알부민(SA)를 함유하는 IL-2 조성물의 제조방법에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 본 발명은 염기로 IL-2 용액을 pH 8∼11, 더욱 바람직하게는 9∼11, 가장 바람직하게는 9.5∼10.5로 조절한후, 산으로 즉시 중화시키거나; 산으로 상기 용액을 pH 2∼6, 더욱 바람직하게는 2∼4, 가장 바람직하게는 2∼3으로 조절한후, 염기로 즉시 중화시키고; 최종적으로 pH 6.1∼9, 더욱 바람직하기로는 pH 6.1∼8, 가장 바람직하기로는 pH 6.5∼7.5로 조절하여 제조되는 IL-2 조성물의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명에서는 모든 천연산 IL-2를 사용할 수 있고, 유전자 전환 인간 IL-2를 사용하는 것이 가장 바람직하다.

본 발명에 따른 IL-2의 활성은 다음 방법에 따라 수행된다.³H-티미딘이 함입된 CTLL-2(IL-2-의존성 뮤린 세포주)를 결정하여 측정한다. IL-2 활성의 단위는 매분당 최대 함입량의 50%를 나타내는 희석농도의 역수를 구하여 유카트 유도성 IL-2(Jurkat : 인간 T 세포 백혈병 세균주)의 BRMP 표준품(Lot. No. ISDP-841: 국립 암연구소 제공)을 사용하여 유카트 단위(이하, 'JU'라 약칭한다)로 보정한다.

특별히 기재하지 않는한 하기 실시예에서는 (1.4±0.2)×10⁷JU/mg의 비활성(specific activity)을 갖는 IL-2를 사용한다.

본 발명에 있어서, SA란 보바인 혈청 알부민(BSA) 포르신 혈청 알부민(PSA), HSA 등의 온혈 동물로부터 유도되는 혈청 알부민 전부가 사용되고, 사용 목적에 따라서 바람직한 종류를 선택할 수 있다. 예를들어, 인체 투여용 조성물을 제조할때에는 HSA를 사용하는 것이 바람직하다. SA의 첨가는 IL-2의 활성저하 방지나 기벽에의 흡착방지에 유용하다. SA는 IL-2 단위 중량부에 대하여 1∼500중량부, 바람직하기로는 10∼200중량부를 첨가한다.

본 발명의 염기로는 생리적으로 허용되는 염기는 모두 사용할 수 있고, 바람직하기로는 N-메틸글루카민, 모노에탄올아민, 디에탄올아민 및 트리에탄올아민과 같은 알코올아민류; 모노-, 디-, 트리-에틸아민과 같은 알킬아민류 ; 아르기닌, 리신 및 히스티딘과 같은 염기성 아미노산류; 탄산나트륨과 같은 무기염기류 등을 예로 들 수 있고, 이들은 단독으로 또는 이들의 혼합물로 사용할 수 있다. 특히, N-메틸글루카민, 디에탄올아민, 트리에탄올아민 및 아르기닌이 바람직하고, 이들은 단독 또는 혼합하여 사용된다. 무기염기를 사용할메는 아민 또는 아미드를 함께 사용하는 것이 적절하다. 이와 같이 사용된 염기의 양은 염기의 종류에 따라 변화되지만, 일반적으로 IL-2 단위 중량부당 일반적으로 10∼500중량부, 더욱 바람직하게는 50∼200중량부를 사용한다.

본 발명에 있어서 산으로는 생리적으로 허용되는 한 모든 종류의 산을 사용할 수 있다. 예를들어, 아세트산, 젖산, 숙신산, 타로타르산, 시트르산 등과 같은 유기산 ; 염산, 인산 등과 같은 무기산이다. 더우기, 생리적으로 허용 가능한 염을 사용할 수 있고, 단독 또는 결합하여 사용할 수 있다. 특히, 시트르산과 타르타르산이 바람직하다. 비록 사용되는 산의 함량은 산의 종류에 따라 변화되나 조성물을 원하는 pH 값으로 조절하는데 필요한 양을 사용할 수 있다. 이는 IL-2 단위 중량부에 대하여 일반적으로 5∼250중량부, 더욱 바람직하기로는 20∼100중량부이다.

본 발명에 있어서, 당 또는 당 알코올류를 IL-2의 안정화 또는 용해 보조제 또는 부형제로서 사용하는 것이 좋다. 당류로는 단당류, 다당류 또는 수용성 글루칸류이고, 플룩토오스, 글루코오스, 만노오스, 소르보오스, 크실로오스, 말토오스, 락토오스, 슈크로오스, 덱스트란, 플루란, 댁스트린, 시클로덱스트린, 가용성 전분, 히드록시 에틸전분, 카르복시메틸셀룰로오스-Na 등이다. 특히, 말토오스가 가장 바람직하다. 당 알코올은 만니톨, 소르비톨, 이노시톨, 둘루시톨, 크실리톨, 아라비톨 등의 C₄∼C₈의 당 알코올이다. 특히, 만니톨이 가장 바람직하다. 상기 당이나 당 알코올류는 단독 또는 결합하여 사용할 수 있다. 사용량은 제한되어 있지는 않고, 필요하다면 조제액에 용해되는 한 최대로 사용할 수 있다. 실질적으로 약 10 내지 약 100mg/ml의 비율로 사용할 수 있다.

본 발명에서 제조시나 재용해시 용액의 pH 범위를 극소화하기 위하여 완충액을 사용하는 것이 적절하다. 본 발명에서 생리적으로 허용 가능한 임의의 완충액을 사용할 수 있고, 필요한 완충액의 함량은 원하는 pH값으로 용액을 유지하도록 사용된다. 예를들면, 포스페이트계나 시트레이트계 완충액을 사용할 수 있다.

계면활성제를 용액에 첨가할 수 있다. 계면활성제의 첨가는 본 발명의 조성물에 양호한 효과를 주는데, 예를들면 제조시 또는 재용해시 용액이 더욱 맑아지고, 기벽에 IL-2의 흡착율을 감소시킨다. 특히, 이와 같은 목적으로 폴리옥시에틸렌(POE) 수소화 캐스테 유계, PEG 300, PEG 400 등의 폴리에틸렌글리콜류(PEG), 폴리옥시에틸렌소르비탄 지방족 에스테르와 같은 비이온성 계면활성제가 바람직하다. 이들은 조제액 1ml에 대하여 약 0.lmg 내지 약 1mg의 양으로 사용된다.

본 발명의 조성물을 제조하는 방법의 일 예를들면 다음과 같다

HSA와 말토오스가 용해된 증류수에 IL-2와 원한다면 계면활성제를 가한다. 이와 같이 제조된 용액을 디에탄올아민으로 pH가 약 10이 되게 조절하고, 완충액을 가한다음, 즉시 시트르산으로 pH 약 7이 되게 조절한다. 필요한 양의 증류수를 가하여 용액이 적절한 양으로 되게 하고, 무균여과, 분주 및 동결건조한다. 본 조작중에서, 먼저 HSA를 한 부분으로 전량 사용하거나, 두 부분으로 나누어 한 부분을 먼저 가하고, pH 약 7로 조절한후, 나머지 부분을 가할 수도 있다.

최종적으로 생성된 용액의 pH를 6 이상으로 조절하면, IL-2는 안정화되고 제조시나 재용해시에도 용액이 투명하다. 따라서, 본 발명에 있어서 최종 pH 값의 상한은 없으나 pH 6.1∼9에서 바람직한 조성물이 된다. 주사용으로 사용될때는 조성물은 생리적 pH 값이나 그 부근의 값으로 조절하는 것이 바람직하다. 이와 같은 경우에 최종 pH 값은 6.1 내지 8이고, 더욱 바람직하기로는 6.5 내지 7.5이다. 상기 하한 이하의 산성범위에서는 재용해된 용액의 상이 투명해지기가 매우 어렵다. 상한 이상의 알칼리 범위에서는 조성물이 안정되고, 용액에서도 투명하지만 피부나 혈관에 자극을 주므로 이러한 조성물은 바람직하지 못하다. 이와 같이 수용액으로 제조된 IL-2 조성물을 그 자체로 사용할 수 있고, 하기 방법에 따라 동결 건조된 제제로 전환시킨후 사용하는 것이 더욱 바람직하다.

동결 건조된 조성물이 필요하면 하기의 통상적인 방법을 사용하는 것이 바람직하다.

용기중에서 상기 수용액을 냉각시키고, 약 -60℃ 내지 약 -10℃, 더욱 바람직하기로는 약 -40℃ 내지 약 -25℃로 즉시 동결시키고 ; 0.005 내지 1mb의 감압에서 5∼72시간동안, 필요하다면 승화열을 공급하면서 수분의 함량이 예정된 값을 갖도록 승화시킨다. 용기를 질소와 같은 비활성 기체나 무수 기체로 채우고, 필요하다면, 완전히 밀봉한다.

본 발명은 상술한 바와 같이 수용액, 상기 용액의 동결 또는 동결 건조된 조성물과 적절한 매질에 재용해 되는 동결 건조된 조성물의 용액을 제공하는데 있다. 본 발명에 따라 제조된 조성물은 제조시와 보존시에 IL-2가 실질적으로 손실되지 않을 뿐만 아니라 IL-2의 비활성이 거의 감소되지 않는 장점을 갖고 있다. 특히, 동결 건조된 조성물은 재용해된 용액의 투명성이 유지되고 기벽내에 IL-2의 흡착이 거의 없는 탁월한 장점을 갖고 있다. 더우기, 이들 조성물은 생리적 pH 범위에서 제조되었기 때문에 인체 투여시에 거의 자극이 없고, 그 결과, 주사시 동통, 주사 부위의 염증 등과 같은 바람직하지 못한 국부 작용이 거의 없다.

본 발명에 의해 제조된 조성물의 사용 방법은 특별히 제한되어 있지 않으나, 비경구 투여하는 것이 바람직하다. 주사용으로 사용할때에는 증류수, 생리식염수, 또는 적당한 점적 용수액 등에 용해시켜 정맥내, 근육내, 피하내 또는 피부내에 투여한다. 당연한 것으로서, 본 조성물은 적당한 담체, 부형제 등을 가하여 구강, 비강, 이 강내와 같은 국소 투여용 제제로 제조할 수 있다.

본 발명은 하기 실시예 및 시험예로 더욱 상세히 설명되나, 본 발명이 이들 범위로 한정되는 것은 아님을 명백히 하고자 한다.

(실시예)

(수용성 조제액의 일반적 제조법)

- A법 -

HSA의 전량 또는 일부를 필요하다면, 당 또는 당 알코올과 함께, 증류수에 용해한후, IL-2 필요하다면, 계면활성제를 가한다. 이어서, 이 용액에 염기를 가하여, pH 8∼11로 하고, 계면활성제를 가하기 전후에 산을 가하여, pH 6.1∼9로 한다. 또한 필요하다면, HSA을 가한다. 이와 같이하여 얻어진 조제액은 소망한다면, 무균 여과하여 주사용 바이얼 분주용의 무균 조제액으로 할 수도 있다.

- B법 -

HSA의 전량 또는 일부를 필요하다면 당 또는 당 알코올과 함께 증류수에 용해한후,IL-2 필요하다면 또한 계면활성제를 가한다. 이어서, 이 용액에 산을 가하여, pH 2∼6으로 하고, 계면활성제를 첨가하기 전후에 염기를 가하여 pH 6.1∼9로 한다. 또한 필요하다면, HSA을 가한다. 이와 같이하여 얻어진 조제액은 소망한다면, 무균 여과하여 주사용 바이얼 분주용의 무균 조제액으로 할 수도 있다.

(일반적 동결 건조법)

상기 수용액을 급냉하여, 약 -60∼약 -10℃, 바람직하기는, 약 -40∼약 -25℃에서 동결한다. 필요하다면, 승화열을 공급하면서, 5∼72시간, 0.005∼1mb로 유지하여 소정 함수량이 될때까지 수분을 승화, 제거한다. 필요하다면, 질소 등 블활성기제 또는 건조 공기를 층전하여 밀봉한다.

(실시예 1)

1.0mg의 HSA, 25mg의 만니톨 및 0.lmg의 IL-2를, 1ml의 주사용 증류수에 용해한 용액에 10mg의 N-메틸글루카민을 가하여, pH 약 10.1로 한다. 이어서, 0.2M 모노소디움 타르타레이트 완충액을 가하여, 이 용액을 pH 약 7.0으로 조절한다(전량 약 1.2ml)

얻어진 용액을 적당한 막 여과기를 사용하여, 여과하여, 무균용액을 얻는다. 이 용액을 바이얼에 주입한후, -35℃ 이하에서, 충분히 동결시켜 온도를 -25℃ 이하로 유지하면서 일반적 동결 건조법에 따라서, 동결 건조를 행하여 동결 건조제제를 얻는다.

(실시예 2)

6.25mg의 HSA 및 250mg의 말토오스를 6.5ml의 주사용 증류수에 용해한 용액에 250μg의 IL-2를 용해한다. 이 용액에 27mg의 디에탄올아민을 가하여, pH 약 10.5로 한다. 1 25ml의 0.2M 소디움 포스페이트 완충액(pH 6.9)을 가한후, 0.16ml의 10% 시트르산을 다시 가하여 생성된 용액을 pH 약 7.0으로 하고, 여기에 6.25mg의 HSA를 용해한다. 주사용 증류수를 가하여, 전량을 10ml로 하고, 얻어진 용액을 막 여과기로 여과하여 무균용액을 얻고, 무균용액을 각 2ml씩 바이얼에 주입한다. 이를 -35℃ 이하에서 충분히 동결시켜 온도를 -25℃ 이하로 유지하면서 일반적 동결 건조법에 따라서, 동결 건조를 행하여 동결 건조제제를 얻는다.

(실시예 3)

6.25mg의 HSA 및 250mg의 말토오스를 6.5ml의 주사용 증류수에 용해한 용액에 250μg의 IL-2를 용해한다. 이 용액에 0.16ml의 10% 시트르산을 가하여, pH 약 2.5로 조절한다. 38.5mg의 트리에탄올아민을 가한후, 1.25ml의 0.2M 소디움 포스페이트 완충액(pH 6.9)을 가하여, 용액을 pH 약 7.0으로 한후, 6.25mg의 HSA를 용해한다. 주사용 증류수를 가하여, 전량을 10ml로 하고, 이하, 실시예 2와 같이하여 동결 건조제제를 얻는다.

(실시예 4∼20)

상기와 동일한 방법으로 하기 조성물을 제조하였다.

표 1에 있어서의 각 성분의 양은 조제액 1.2ml 또는 2ml중에 대한 첨가량을 나타낸다. 표 0은 조제액을 소망의 pH로 조절하는데 필요한 계산량의 산이 사용된 것을 나타낸다.

[표 1-1]

[표 1-2]

(시험예 1)

대조로서 염기 및 산을 사용하여 중성으로 미리 조절된 용액에 IL-2를 첨가하여 조성물(A)를 제조한다.

조성물(A)

6.5ml의 주사용 증류수에 용해시킨 6.25mg의 HSA 및 250mg의 말토오스 용액을 디에탄올아민 27mg으로 pH를 약 10.5로 조절한후, 1.25ml의 0.2M 소디움 포스페이트 완충액(pH 6.9)을 첨가하면서 0.16ml의 10% 시트르산으로 pH 약 7.0으로 조절한다. 계속해서 용액에 6.25mg의 HSA를 용해시키고, 250μg의 IL-2를 가한다. 주사용 중류수로 용액의 최종부과가 10ml가 되게 한다.

상기 절차에 의한 조성물 A는 IL-2가 거의 용해되지 않기 때문에 실용적이지 못하다.

(시험예 2)

용액의 최종 pH 값이 동결 건조된 조성물의 재용해시 외관에 어떤 영향을 미치는지 설명하기 위하여 조성물(B), (C) 및 (D)를 제조한다.

하기 실시예에서, 주사용 증류수 1.0ml를 동결 건조된 조성물의 재용해에 사용한다.

조성물(B)

6.5ml의 주사용 증류수에 6.25mg의 HSA 및 250mg의 말토오스를 용해시킨 용액에 250μg의 IL-2를 용해시킨다. 용액의 pH를 27mg의 디에탄올아민으로 pH 약 10.1로 조절한 다음, 1.25ml의 0.2M 소디움 포스페이트 완충액(pH 6.9)를 첨가한후 0.67ml의 10% 시트르산으로 pH 4.0으로 조절하고, 여기에 6.25mg의 HSA를 가한다. 필요한 양의 주사용 증류수를 첨가하여 전체가 10ml가 되게 한다. 생성된 용액을 막 여과기로 여과하여 무균 용액을 얻고, 각각 2ml씩 바이알에 분배한다. 이를 약 -35℃ 이하로 잘 동결시킨다. 바이알에서 동결된 조성물을 -25℃를 유지하면서 통상의 동결 건조용 승화법에 따라 승화시켜 동결 건조된 조성물(B)를 얻는다.

조성물(C) 및 (D)

조성물(B)의 제법과 동일한 방법으로 pH 약 5.0 및 5.6으로 각각 조절된 용액을 동결 건조시켜 동결 건조된 조성물(C)와 (D)를 제조한다.

대조 조성물 및 본 발명의 조성물의 외관을 재용해된 용액에서 각각 비교한다.(표 2) 표의 조성물을 실시예 번호로 표시된다. 표에서 명백하듯이, 최종 pH 6.1 이하의 용액에서 제조된 조성물은 재용해된 용액의 흐림으로 인하여 바람직하지 못하다.

(시험예 3)

본 발명의 동결 건조된 조성물의 재용해된 용액의 외관은 표 3에서 볼 수 있다.

표 2 내지 4에서 사용된 부호 (-) 또는 (±)는 용액이 투명 또는 실질적으로 투명한 것을 의미한다. 또한, 부호 (+) 내지 (+++)은 약간 흐림 내지 매우 흐림을 나타낸다.

[표 2]

[표 3-1]

[표 3-2]

[표 3-3]

[표 3-4]

(시험예 4)

본 발명의 대표적인 조성물로 가속 조건하에서 안정성 시험을 행한다. 결과는 표 4와 같다.

표에서 용어 외관변화란 동결 건조 조성물의 착색, 수축 및 고결 동의 변화를 나타내고 ; 혼탁도란 상기 조성물을 주사용 증류수 각각 1ml에 용해시킬때의 용액의 변화를나타낸다. 용어 %활성은 막 제조된 동결 건조된 조성물의 IL-2 활성이 100%라 할때 잔존 활성율(%)을 의미한다.

[표 4]

Claims

인터로이킨-2 조성물의 제조방법에 있어서, 1중량부의 인터로이킨-2와 l∼500중량부의 혈청 알부민을 함유하여 약학적으로 허용 가능한 담체를 함유할 수도 있는 용액에 염기를 가하여 pH 8∼11로 조절한후, 즉시 산을 가하여 pH 6.1∼9로 조절하거나; 상기 용액에 산을 가하여 pH 2∼6로 조절한후, 즉시 염기를 가하여 pH 6.1∼9로 조절함을 특징으로 하는 인터로이킨-2 조성물의 제조방법.
제1항에 있어서, 담체가 당 또는 당 알코올 또는 이들의 혼합물인 인터로이킨-2 조성물의 제조방법.
제1항에 있어서, 혈청 알부민이 인간 혈청 알부민인 인터로이킨-2 조성물의 제조방법.
제l항에 있어서, 용액에 계면활성제를 첨가하는 인터로이킨-2 조성물의 제조방법.
제1항에있어서, 염기가 N-메틸글루카민, 모노에탄올아민, 디에탄올아민, 트리에탄올아민 또는 아르기닌 또는 이들의 혼합물이고, 산이 시트르산, 타르타르산, 젖산 또는 포스포르산 또는 이들의 혼합물인 인터로이킨-2 조성물의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 용액에 염기를 가형 pH 9∼11로 조절한후, 즉시 산을 가하여 pH 6.1∼9로 조절함을 특징으로 하는 인터로이킨-2 조성물의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 용액에 산을 가하여 pH 2∼4로 조절한후, 즉시 염기를 가하여 pH 6.1∼9로 조절함을 특징으로 하는 인터로이킨-2 조성물의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 용액에 염기를 가하여 pH 9∼11로 조절한후, 즉시 산을 가하여 pH 6.1∼9로 조절하거나; 상기 용액에 산을 가하여 pH 2∼4로 조절한후, 즉시 염기를 가하여 pH 6.1∼9로 조절함을 특징으로 하는 인터로이킨-2 조성물의 제조방법.