FI98601C

FI98601C - Menetelmä glykosyloimattoman t-PA-johdannaisen K1K2P farmaseuttisen valmisteen valmistamiseksi

Info

Publication number: FI98601C
Application number: FI913906A
Authority: FI
Inventors: Rainer Rudolph; Ulrich Kohnert
Original assignee: Boehringer Mannheim Gmbh
Priority date: 1989-12-20
Filing date: 1991-08-19
Publication date: 1997-07-25
Also published as: JPH0657662B2; AU7046191A; HU912741D0; ATE121948T1; NO913119L; NO913119D0; KR920700685A; FI913906A0; WO1991008763A1; CA2046930C; EP0458949B1; HU208638B; CA2046930A1; DK0458949T3; JPH04502606A; DE59009025D1; FI98601B; EP0458949A1; HUT59611A; AU624761B2

Description

Menetelmä glykosyloimattoman t-PA-johdannaisen K1K2P farmaseuttisen valmis teen valmistamiseksi 98601 5 Ihmisen kudosplasminogeeniaktivaattorilla (t-PA) on suuri terapeuttinen merkitys verihyytymien liuottamisessa, esimerkiksi sydäninfarkteissa. t-PA aikaansaa veri-hyytymien liukenemisen plasminogeenin aktivoinnilla plasmiiniksi. Plasmiini vuorostaan liuottaa fibriiniä, hyytyneen veren proteiinimatriisin pääkomponenttia.

10 Luonnollinen t-PA koostuu useammasta funktionaalisesta alueesta F, E, ΚΙ, K2 ja P. Alue P sisältää proteolyyttisesti aktiivisen keskuksen, joka aikaansaa plasminogeenin lohkeamisen plasmiiniksi. On jo tunnettua valmistaa eukarioottisissa ja pro-karioottisissa soluissa geeniteknologisesti t-PA:ta tai erilaisia t-PA-mutaatioita, joissa 1 tai useita alueista F, E, K1 ja K2 on deletoitu. Tällöin t-PA-johdannaisia 15 syntetisoituu prokariooteista luonnolliselle t-PA:lle vastakohtana ei-glykosyloidus-sa muodossa.

Edelleen on tunnettua, että sokeriosalla on huomattava vaikutus proteiinien liukoisuuteen ja aggregoitumiseen (J. Biol. Chem. 263 (1988), 8832-8837). Nyt on kek-20 sitty, että glykosyloimaton t-PA on olennaisesti huonoliukoisempi kuin glykosyloi-tu t-PA.

K1K2P pro ei liukene proteiinien liuottamiseen tavallisesti käytettyihin puskureihin kuten esimerkiksi 50 mmol/1 Na-sitraattiin, 50 mmol/1 fosfaattiin tai fysiologiseen 25 NaCl-liuokseen. K1K2P pro.lla pitäisi terapeuttisena vaikuttavana aineena käyttöä varten kuitenkin olla suurempi entsymaattinen aktiivisuus ainakin 0,4 MU/ml, edullisesti 0,4-10 MU/ml. Aktiivisuus on tällöin määritelty laitoksen WHO, National Institute for Biological Standards and Control (vertaa: H. Lill; ZGIMAL 42 (1987), 478-486) mukaisesti.

30 EP-patenttijulkaisusta A-0 217 379 on tunnettua korottaa prokarioottisista organismeista saadun t-PA:n (tPA pro) liukoisuutta neutraaleilla tai hieman aikalisillä argi-niiniformuloinneilla. Eräs tämän menetelmän haitta on kuitenkin, että t-PA pro.n hyviä liukoisuuksia voidaan saavuttaa vain hyvin korkeilla arginiinikonsentraati-35 oilla.

2 98601

Siten keksinnön tehtävänä on kehittää farmaseuttisia valmisteita, jotka sisältävät K1K2P pro:ta aktiivisuudella yli 0,4 MU/ml, jolloin t-PA-johdannaisen on oltava stabiilia pitemmän ajanjakson.

5 Keksinnön mukainen tehtävä ratkaistaan glykosyloimattoman t-PA-johdannaisen K1K2P pro:n farmaseuttisella valmisteella, jonka entsymaattinen aktiivisuus on ainakin 0,4 MU/ml pH-arvolla 4,5-6, jolloin tämä koostumus sisältää sitraattia ja ainakin yhtä yhdistettä joukosta a) askorbiinihappo, 10 b) EDTA, c) aminoyhdisteet, joilla on kaava

r!r2N - R - X

15 jossa X = S03H, CH(NH2)-C02H, C02H, H, NH2 tai OH, R = C1 -C9-alkyleeni, C3-C6-sykloalkyleeni tai bentsylideeni, ja Rl ja R2 ovat toisistaan riippumatta H tai Ci-C3*alkyyli, d) guanidinovoihappo, e) dimetyylibiguanidi, 20 f) arginiini, g) glukosamiini, fruktoosi, h) pyrimidiininukleosidit ja pyrimidiininukleotidit, i) yhdellä tai usealla hydroksi-, keto- tai/ja muilla karboksiryhmillä substituoidut karboksyylihapot.

25

Keksinnön oleelliset tunnusmerkit on esitetty oheisissa patenttivaatimuksissa.

K1K2P pro :11a ymmärretään tämän keksinnön mukaisesti glykosyloimatonta t-PA-johdannaista, joka alkaa aminohapoista 85 -92 ja loppuu aminohappoon 527 (Pro). 30 K1K2P pro voi lisäksi sisältää vielä kokonaan tai osaksi aminohapot -3(Gly) - +5(Ile). Tällöin edullinen on proteiini, joka alkaa aminohaposta 87(Asp) ja sisältää mahdollisesti eteenkytkettynä alueesta -3 - +5 mahdollisesti vielä aminohapot Ser, Tyr, Gin, Väljä Ile (nimeäminen: Harris; Protein Engineering, nide 1 (1987) 449-458). t-PA-johdannainen K1K2P pro on saatavissa DE-patenttijulkaisussa 35 39 233391 kuvatulla menetelmällä.

K1K2P pro:n liuottamiseen on erityisen sopiva sitraattipuskuri. Sitraatti-ionien konsentraation on oltava ainakin 5 mmol/1, edullisesti 5-100 mmol/1, erityisen edul-

II

3 986U1 lisesti sitraatti-ionien konsentraatio on 50 mmol/1. pH-arvo säädetään kulloinkin käytetyn yhdisteen emäksisyyden mukaan edullisesti HCl:llä tai emäksellä kuten esimerkiksi NaOH tai KOH.

5 Yllättäen todettiin, että glykosyloimattoman KlK2P:n liukoisuus muissa puskuri-järjestelmissä, esimerkiksi fosfaattipuskurissa, on olennaisesti vähäisempi samalla ionivahvuudella ja samalla pH-arvolla. On osoittautunut sopivaksi säätää alkalisten sitraattiliuosten pH-arvo HCkllä, ts., että koostumus sisältää lisäksi vielä kloridi-ioneja. K1K2P pro:n erittäin konsentroidut liuokset ovat nimittäin kloridi-ionien 10 läsnä ollessa yllättäen olennaisesti stabiilimpia kuin esimerkiksi fosfaatti-ionien läsnä ollessa. Happamien sitraattiliuosten pH-arvo säädetään kulloiseenkin pH-ar-voon tavallisesti NaOH:lla.

Keksinnön mukaiselle koostumukselle sopiva on pH-arvo välillä 4,5 ja 6,5, edulli-15 nen on pH-arvo 6.

Keksinnön mukaisessa koostumuksessa aminoyhdisteinä edullisesti käytettyjä ovat tauriini, 4-aminobutanoli-l, 5-aminopentanoli-l, 6-aminoheksanoli-l, 1,9-diamino-nonaani, 1,8-diamino-oktaani, 1,7-diaminoheptaani, 1,6-diaminoheksaani, 1,5-di-20 aminopentaani, 1,4-aminobutaani, 1,3-aminopropaani, lysiini, omitiini, 8-amino-oktaanihappo, 7-aminoheptaanihappo, ε-aminokapronihappo, δ-aminovaleriaana-happo, γ-aminovoihappo, traneksaamihappo tai p-aminometyylibentsoehappo. Tauriinin ja analogisten yhdisteiden edullinen konsentraatio on 0,1-0,5 mol/1, erityisen edullisesti 0,1-0,3 mol/1. 4-aminobutanoli-1 itä, 5-aminopentanoli-l:tä, 6-25 aminoheksanoli-1 :tä, 1,9-diaminononaania, 1,8-diamino-oktaania, 1,7-diaminohep-taania, 1,6-diaminoheksaania, 1,5-diaminopentaania, 1,4-diaminobutaaniatai 1,3-diaminopropaania käytetään edullisesti tasolla 10-100 mmol/1. Lysiiniä, omitiinia, 8-amino-oktaanihappoa, 7-aminoheptaanihappoa, ε-aminokapronihappoa, δ-amino-valeriaanahappoa, γ-aminovoihappoa, traneksaamihappoa tai p-aminometyylibent-30 soehappoa käytetään edullisesti tasolla 0,5-20 mmol/1, erityisen edullisesti 1-10 mmol/1.

Yhdellä tai usealla hydroksi-, keto- tai/ja muilla karboksiryhmillä substituoituna karboksyylihappona käytetään esimerkiksi omenahappoa, maitohappoa, fumaari-35 happoa tai oksoglutaarihappoa. Näitä aineita käytetään edullisesti tasolla 1-1000 mmol/1, erityisen edullisesti 10-500 mmol/1.

4 98601

Guanidinovoihappoa tai arginiinia käytetään edullisesti tasolla 10-200 mmol/1, erityisen edullisesti 50-100 mmol/1. Dimetyylibiguanidin konsentraatio on 50-400 mmol/1, edullisesti 100-300 mmol/1.

5 EDTA:ta käytetään edullisesti tasolla 1-100 mmol/1, erityisen edullisesti 10-100 mmol/1. Askorbiinihappoa käytetään edullisesti tasolla 0,1-1 mol/1, erityisen edullisesti 0,2-0,3 mol/1.

Glukosamiinia ja fruktoosia käytetään edullisesti konsentraatioissa 1-500 mmol/1, 10 erityisen edullisesti 10-300 mmol/1.

Pyrimidiininukleosideina ja pyrimidiininukleotideina ovat sopivia esimerkiksi tymi-diini, sytosiini ja uridiini tai vastaavat nukleotidit. Niitä käytetään edullisesti konsentraatioissa 1-300 mmol/1, erityisen edullisesti 10-300 mmol/1.

15

Edelleen keksintö koskee keksinnön mukaista koostumusta, joka sisältää lisäksi yhtä tai useaa aminohappoa, erityisesti histidiiniä.

Seuraavassa esitetään joukko erityisen edullisia keksinnön mukaisia valmisteita.

20

Eräs formulaatio sisältää 50 mmol/1 Na-sitraattia, pH 6, ja 0,1-0,3 mol/1 tauriinia. Edullinen on myös formulaatio, jossa on 50 mmol/1 Na-sitraattia, pH 6, ja 0,2-0,3 mol/1 askorbiinihappoa.

25 Edelleen edullinen on formulaatio, joka sisältää 50 mmol/1 Na-sitraatti/HCl:ää, pH 6, ja 1-10 mmol/1 7-aminoheptaanihappoa, 8-amino-oktaanihappoa, p-aminometyy-libentsoehappoa, ε-aminokapronihappoa, δ-aminovaleriaanahappoa, γ-aminovoi-happoa, traneksaamihappoa, lysiiniä tai omitiinia.

30 Edelleen erityisen edullisia ovat myös formulaatiot, jotka sisältävät 50 mmol/1 Na-sitraatti/HCl:ää, pH 6,0, ja 50-100 mmol/1 guanidinovoihappoa tai arginiinia.

Edullinen on myös formulaatio, joka sisältää 50 mmol/1 Na-sitraattia, pH 6, ja ΙΟΙ 00 mmol/1 EDTA:ta. Eräs toinen formulaatio sisältää puolestaan 50 mmol/1 Na-35 sitraatti/HCl:ää, pH 6, ja 100-300 mmol/1 dimetyylibiguanidia.

Edelleen eräs formulaatio sisältää 50 mmol/1 Na-sitraatti/HCl:ää, pH 6, ja 10-300 mmol/1 tymidiiniä, sytosiinia tai uridiinia. Eräs toinen formulaatio sisältää puoles-

II

5 98601 taan 50 mmol/1 Na-sitraatti/HCl:ää, pH 6, ja 10-100 mmol/1 4-aminobutanoli-1 :tä, 5-aminopentanoli-1 :tä, 6-aminoheksanoli-1 :tä, 1,9-diaminononaania, 1,8-diamino-oktaania, 1,7-diaminoheptaania, 1,6-diaminoheksaania, 1,5-diaminopentaania, 1,4-diaminobutaania tai 1,3-diaminopropaania. Edelleen eräs formulaatio sisältää 50 5 mmol/1 Na-sitraatti/HCl:ää, pH 6, ja 10-300 mmol/1 fruktoosia tai glukosamiinia.

Lopuksi sisältää edelleen eräs formulaatio 50 mmol/1 Na-sitraattia, pH 6, ja 10-500 mmol/1 omenahappoa, maitohappoa, fumaarihappoa tai 2-oksoglutaarihappoa.

10 Myös useamman edellä mainitun yhdisteen yhdistelmät sitraatin kanssa saavat aikaan t-PA-aktiivisuutta omaavien proteiinien erittäin hyvän liukoisuuden.

Keksintö koskee lopuksi myös lääkettä vaikuttavana aineena t-PA-aktiivisuutta omaavan proteiinin pohjalta liuoksessa tai lyofilisaattina ilmoitettujen vaikuttavien 15 aineiden ja mahdollisesti myös muiden farmaseuttisesti yhteensopivien lisä-, apu-, kantaja- ja täyteaineiden kanssa.

Keksinnön mukaisia farmaseuttisia valmisteita käytetään edullisesti injektio- ja in-fuusioliuoksina. Tämä voi tapahtua siten, että saatetaan käyttöön jo injektioon 20 valmis liuos, joka sisältää keksinnön mukaista koostumusta. On kuitenkin myös mahdollista saattaa farmaseuttiset valmisteet käyttöön lyofilisaattien muodossa. Nämä voidaan sitten muodostaa uudelleen sinänsä tunnetuilla, injektiotarkoituksiin sopivilla aineilla tai liuoksilla. Injektioväliaineena käytetään edullisesti vettä, joka sisältää injektioliuoksissa tavallisia lisäaineita kuten stabilointiaineita, liuoksenvä-25 littäjiä, puskureita ja isotonisia lisäaineita, esimerkiksi fysiologisen NaCl-konsent-raation. Tällaisia lisäaineita ovat esimerkiksi mannitoli, tartraatti- tai sitraattipus-kuri, etanoli, kompleksinmuodostajat kuten esimerkiksi etyleenidiamiinitetraetikka-happo ja sen ei-toksiset suolat, samoin kuin suurimolekyyliset polymeerit, kuten nestemäinen polyetyleenioksidi viskositeetin säätöön. Injektioliuoksiin tarkoitettu-30 jen nestemäisten kantajien on oltava steriilejä, ja ne täytetään edullisesti ampulleihin.

Lopuksi keksintöön kuuluu myös K1K2P pro.n käyttö keksinnön mukaisten farmaseuttisten valmisteiden valmistukseen.

Seuraavat esimerkit kuvaavat keksinnön konkreettista suorittamista vielä edelleen.

35 6 98601

Esimerkki 1 K1K2P pro:n liukoisuus

Puhdistettua K1K2P pro:ta (liuotettuna 0,5 mol/1 arginiini/H3P04:ssä, pH 7,2) konsentroidaan ultrasuodatuksella YM 10-membraanilla (Amicon). 0,5 ml konsent-5 raattia (aktiivisuus: 3,5 MU/ml) dialysoidaan kulloinkin taulukossa 1 esitettyjä puskureita vastaan. Näytteiden sentrifugoinnin jälkeen mitataan päällä olevan kirkkaan kerroksen entsymaattinen aktiivisuus.

Entsymaattinen aktiivisuus esitetään tilavuusyksikkönä yksikössä MU/ml ja koko-10 naisaktiivisuutena yksikössä MU.

tPA-aktiivisuuden mittaus voi tällöin tapahtua tavallisella tavalla kromogeenisen substraatin lohkaisemisella (H. Lill, ZGIMAL 42 (1987), 478-486). Yksikkö U on aktiivisuuden yksikkö laitoksen WHO, National Institute for Biological Standards 15 and Control määritelmän mukaan.

Il 98601 7

Taulukko 1

Puskuri Aktiivisuus

5 MU/ml MU

50 mmol/1 Na-sitraatti/HCl, pH 6 0,08 0,05 50 mmol/1 Na-sitraatti/HCl, pH 6 1,20 0,84 10 10 mmol/1 ε-aminokapronihappo 50 mmol/1 Na-sitraatti/NaOH, pH 6 1,56 0,94 0,3 mol/1 askorbiinihappo 15 50 mmol/1 Na-sitraatti/HCl, pH 6 0,81 0,49 10 mmol/1 lysiini 50 mmol/1 Na-sitraatti/HCl, pH 6 0,71 0,46 50 mmol/1 arginiini 20

Na-sitraatti/HCl, pH 6 1,10 0,77 50 mmol/1 guanidinovoihappo 50 mmol/1 Na-sitraatti/NaOH, pH 6 0,80 0,56

25 100 mmol/1 EDTA

50 mmol/1 Na-sitraatti/NaOH, pH 6 0,45 0,22 0,3 mol/1 2-oksoglutaarihappo 30 50 mmol/1 Na-sitraatti/HCl, pH 6 0,49 0,37 0,3 mol/1 glukosamiini 50 mmol/1 Na-sitraatti/NaOH, pH 6 0,56 0,36 0,3 mol/1 fumaarihappo 35 50 mmol/1 Na-sitraatti/HCl, pH 6 1,20 0,60 0,3 mol/1 uridiini 50 mmol/1 Na-sitraatti/NaOH, pH 6 1,68 1,34 40 0,3 mol/1 tauriini 50 mmol/1 Na-sitraatti/HCl, pH 6 0,42 0,27 0,1 mol/1 tymidiini

Claims

98601

1. Menetelmä glykosyloimattoman t-PA-johdannaisen K1K2P farmaseuttisen valmisteen, jolla on entsymaattinen aktiivisuus ainakin 0,4 MU/ml ja pH-arvo 4,5- 6,5, valmistamiseksi, tunnettu siitä, että glykosyloimaton t-PA-johdannainen

2. Förfarande enligt patentkrav 1, kännetecknat av att aminoföreningen är tau-10 rin, 4-aminobutanol-l, 5-aminopentanol-l, 6-aminohexanol-l, 1,9-diaminononan, 1,8-diaminooktan, 1,7-diaminoheptan, 1,6-diaminohexan, 1,5-diaminopentan, 1,4-aminobutan, 1,3-aminopropan, lysin, omitin, 8-aminooktansyra, 7-aminoheptan-syra, ε-aminokapronsyra, δ-aminovaleriansyra, γ-aminosmörsyra, tranexamsyra eller p-aminometylbensoesyra. 15

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että aminoyhdiste 25 ontauriini, 4-aminobutanoli-l, 5-aminopentanoli-l, 6-aminoheksanoli-l, 1,9-di- aminononaani, 1,8-diamino-oktaani, 1,7-diaminoheptaani, 1,6-diaminoheksaani, 1,5-diaminopentaani, 1,4-aminobutaani, 1,3-aminopropaani, lysiini, omitiini, 8-amino-oktaanihappo, 7-aminoheptaanihappo, ε-aminokapronihappo, δ-aminovaleri-aanahappo, γ-aminovoihappo, traneksaamihappo tai p-aminometyylibentsoehappo. 30

3. Förfarande enligt patentkrav 1, kännetecknat av att karboxylsyran substitue-rad med en eller flera hydroxi-, keto- och/eller annan karboxigrupp är äppelsyra, mjölksyra, fumarsyra eller 2-oxoglutarsyra. 20 4. Förfarande enligt patentkrav 1, kännetecknat av att man tillsätter en eller flera aminosyror.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että yhdellä tai usealla hydroksi-, keto- tai/ja muulla karboksiryhmällä substituoitu karboksyyli-happo on omenahappo, maitohappo, fumaarihappo tai 2-oksoglutaarihappo.

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että lisätään li säksi yksi tai useita aminohappoja. I! 98601

5. Förfarande enligt nägot av patentkraven 1-4, kännetecknat av att citratkon-centrationen är 5-100 mmol/1, företrädesvis 50 mmol/1. 25

5. Jonkin patenttivaatimuksen 1-4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että sit-raattikonsentraatio on 5-100 mmol/1, edullisesti 50 mmol/1.

5 K1K2P pro liuotetaan sitraatin ja vähintään yhden seuraavista yhdisteistä kanssa: a) askorbiinihappo, b) EDTA, c) aminoyhdisteet, joilla on kaava

6. Förfarande enligt nägot av patentkraven 1-5, kännetecknat av att man vidare tillsätter kloridjoner.

6. Jonkin patenttivaatimuksen 1-5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että lisä-5 tään lisäksi kloridi-ioneja.

7. Förfarande enligt patentkrav 1, kännetecknat av att man använder 50 mmol/I 30 Na-citrat, pH 6, och 0,1-1 mol/1, företrädesvis 0,2-0,3 mol/1, askorbinsyra.

7. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että käytetään 50 mmol/1 Na-sitraattia, pH 6, ja 0,1-1 mol/1, edullisesti 0,2-0,3 mol/1, askorbiinihap-poa. 10

8. Förfarande enligt patentkrav 1, kännetecknat av att man använder 50 mmol/1 Na-citrat, pH 6, och 1-200 mmol/1, företrädesvis 10-100 mmol/1, EDTA. 35 9. Förfarande enligt patentkrav 1, kännetecknat av att man använder 50 mmol/1 Na-citrat, pH 6, och 0,1-0,5 mol/1, företrädesvis 0,1-0,3 mol/1, taurin. 986C1

8. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että käytetään 50 mmol/1 Na-sitraattia, pH 6, ja 1-200 mmol/1, edullisesti 10-100 mmol/1, EDTA.ta.

9. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että käytetään 50 15 mmol/1 Na-sitraattia, pH 6, ja 0,1 -0,5 mol/1, edullisesti 0,1-0,3 mol/1, tauriinia.

10. Förfarande enligt patentkrav 1, kännetecknat av att man använder 50 mmol/1 Na-citrat/HCl, pH 6, och 0,5-20 mmol/1 lysin, omitin, 8-aminooktansyra, 7-amino-heptansyra, ε-aminokapronsyra, δ-aminovaleriansyra, γ-aminosmörsyra, tranexam-syra eller p-aminometylbensoesyra. 5

10. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että käytetään 50 mmol/1 Na-sitraatti/HCl.ää, pH 6, ja 0,5-20 mmol/1 lysiiniä, omitiinia, 8-amino-oktaanihappoa, 7-aminoheptaanihappoa, ε-aminokapronihappoa, 6-aminovaleriaa- 20 nahappoa, γ-aminovoihappoa, traneksaamihappoa tai p-aminometyylibentsoehap-poa.

10 R^N-R-X jossa X = S03H, CH(NH2)-C02H, C02H, H, NH2 tai OH, R = Ci-C9-alkyleeni, C3-C6-sykloalkyleeni tai bentsylideeni, ja R* ja R2 ovat toisistaan riippumatta H tai Ci-C3*alkyyli, 15 d) guanidinovoihappo, e) dimetyylibiguanidi, f) arginiini, g) glukosamiini, fruktoosi, h) pyrimidiininukleosidit ja pyrimidiininukleotidit, 20 i) yhdellä tai usealla hydroksi-, keto- tai/ja muulla karboksiryhmällä substituoidut karboksyylihapot, ja saatu liuos saatetaan sopivaan farmaseuttiseen antomuotoon.

11. Förfarande enligt patentkrav 1, kännetecknat av att man använder 50 mmol/1 Na-citrat/HCl, pH 6, och 10-100 mmol/14-aminobutanol-l, 5-aminopentanol-l, 6-aminohexanol-1, 1,3-diaminopropan, 1,4-diaminobutan, 1,5-diaminopentan, 1,6-di-aminohexan, 1,7-diaminoheptan, 1,8-diaminooktan eller 1,9-diaminononan. 10

11. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että käytetään 50 mmol/1 Na-sitraatti/HCl.ää, pH 6, ja 10-100 mmol/1 4-aminobutanoli-1 :tä, 5-amino- 25 pentanoli-1 :tä, 6-aminoheksanoli-l:tä, 1,3-diaminopropaania, 1,4-diaminobutaania, 1,5-diaminopentaania, 1,6-diaminoheksaania, 1,7-diaminoheptaania, 1,8-diamino-oktaaniatai 1,9-diaminononaania.

12. Förfarande enligt patentkrav 1, kännetecknat av att man använder 50 mmol/1 Na-citrat/HCl, pH 6, och 10-200 mmol/1, företrädesvis 50-100 mmol/1, guanidino-smörsyra eller arginin. 15 13. Förfarande enligt patentkrav 1, kännetecknat av att man använder 50 mmol/1 Na-citrat/HCl och 50-400 mmol/1, företrädesvis 100-300 mmol/1, dimetylbiguanid.

12. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että käytetään 50 30 mmol/1 Na-sitraatti/HCl.ää, pH 6, ja 10-200 mmol/1, edullisesti 50-100 mmol/l, guanidinovoihappoa tai arginiinia.

13. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että käytetään 50 mmol/1 Na-sitraatti/HCl:ää ja 50-400 mmol/1, edullisesti 100-300 mmol/1, dimetyy- 35 libiguanidia. 98601 ίο

14. Förfarande enligt patentkrav 1, kännetecknat av att man använder 50 mmol/1 Na-citrat/HCl, pH 6, och 1-500 mmol/1, företrädesvis 10-300 mmol/1, glukosamin 20 eller fruktos.

14. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että käytetään 50 mmol/1 Na-sitraatti/HCl:ää, pH 6, ja 1-500 mmol/1, edullisesti 10-300 mmol/1, glu-kosamiinia tai fruktoosia.

15. Förfarande enligt patentkrav 1, kännetecknat av att man använder 50 mmol/1 Na-citrat/HCl, pH 6, och 1-300 mmol/1, företrädesvis 10-300 mmol/1, tymidin, cy-tosin eller uridin. 25

15. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että käytetään 50 mmol/1 Na-sitraatti/HCl:ää, pH 6, ja 1-300 mmol/1, edullisesti 10-300 mmol/1, ty-midiiniä, sytosiinia tai uridiinia.

16. Förfarande enligt patentkrav 1, kännetecknat av att man använder 50 mmol/1 Na-citrat, pH 6, och 0,001-1 mol/1, företrädesvis 0,01-0,5 mol/1, äppelsyra, mjölk-syra, fumarsyra eller 2-oxoglutarsyra. 30 17. Förfarande enligt patentkrav 1, kännetecknat av att man använder 50 mmol/1 Na-citrat, pH 6, och en kombination av ämnen av grupper a) - i) i patentkrav 1.

16. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että käytetään 50 10 mmol/1 Na-sitraattia, pH 6, ja 0,001 -1 mol/1, edullisesti 0,01-0,5 mol/1, omenahap- poa, maitohappoa, fumaarihappoa tai 2-oksoglutaarihappoa.

17. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että käytetään 50 mmol/1 Na-sitraattia, pH 6, ja yhdistelmää patenttivaatimuksen 1 ryhmien a) - i) ai- 15 neista.

18. Förfarande enligt nägot av patentkraven 1-17, kännetecknat av att tili sam-mansättningen tillsätts vidare konventionella farmaceutiska tillsats-, hjälp- och/eller 35 bärarämne.

18. Jonkin patenttivaatimuksen 1-17 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että koostumukseen lisätään lisäksi tavallista farmaseuttista lisä-, apu- tai/ja kantaja-ainetta. 20

19. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että farmaseuttinen antomuoto on injektioliuos tai lyofilisaatti. 25 1. Förfarande för framställning av ett farmaceutiskt preparat av oglykosylerad t-PA-derivat K1K2P med ett enzymatiskt aktivitet minst 0,4 MU/ml och pH-värde 4,5-6,5, kännetecknat av att det oglykosylerade t-PA-derivatet K1K2P pro loses med citrat och ätminstone ett av följande ämnen: a) askorbinsyra, 30 b) EDTA, c) aminoföreningar med formeln r1r2n-R-X 35 van X = S03H, CH(NH2)-C02H, C02H, H, NH2 eller OH, R = Ci-C9-alkylen, C3-C6-cykloalkylen eller bensyliden, och Rl och R^ är oberoende av varandra H eller Cj-C3-alkyl, d) guanidinosmörsyra, II 98601 e) dimetylbiguanid, f) arginin, g) glukosamin, fruktos, h) pyrimidinnukleosider och pyrimidinnukleotider, 5 i) karboxylsyror substituerade med en eller flera hydroxi-, keto- och/eller annan karboxigrupp, och erhällen lösning bringas i en lämplig farmaceutisk doseringsform.

19. Förfarande enligt patentkrav 1, kännetecknat av att den farmaceutiska dose-ringsformen är en injektionlösning eller lyofilisat. Il