KR920008381B1

KR920008381B1 - 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰에 의한 라이신 제조방법

Info

Publication number: KR920008381B1
Application number: KR1019900022963A
Authority: KR
Inventors: 한종권; 오종원; 이현환; 정 스텐펜; 현형환
Original assignee: 제일제당 주식회사; 김정순
Priority date: 1990-12-31
Filing date: 1990-12-31
Publication date: 1992-09-26
Also published as: KR920012443A

Abstract

내용 없음.

Description

재조합 코리네박테리움 글루타미쿰에 의한 라이신 제조방법

제1도는 dap A 유전자 크로닝 개요도이다.

제2도는 라이신 생산균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 CS-755에 dap A 유전자 도입을 위한 셔틀벡터 pECCG 177 및 pECCG 122와의 복합 프라스미드 제작 개요도이다.

본 발명은 라이신 생산 균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 CS 755(KFCC-10672)의 dap A 유전자를 대장균 숙주를 사용하여 크로닝하고, 셔틀벡터인 pECCG 177 및 pECCG 122의 다발성 절단부위(multiple cloning site)에 도입한 뒤 다시 라이신을 생산하는 코리네박테리움 글루타미쿰 균주에 도입함으로서 디하이드로디피콜리네이트 신세타제(dap A) 효소활성을 10배 증가시키고 L-라이신 생산수율을 향상시키는 방법에 관한 것이다.

라이신 합성에 관여하는 여러 유전자를 오퍼론(operon)을 형성하지 않고 염색체상에 퍼져있는 것으로 대장균의 경우는 보고되고 있으며, 아미노산 및 핵산 생산에 산업적으로 널리 쓰이는 코리네형 세균이 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum), 브레비박테리움 프라붐(Brevibacterium flavum), 브레비박테리움 락토퍼멘텀(Brevibacterium lactofermentum)등의 라이신 합성에 관여하는 유전자의 정보 및 기타 유전 현상의 정보는 많이 있지 않은 실정이다. 그러나 최근 코리네형 세균에서 숙주-벡타계(host-vector system)가 개발됨에 따라 연구가 진행되어 가고 있으며 스레오닌 및 페닐알라닌등의 아미노산 생산 균주의 개발에 응용한 예가 보고되고 있다.

코리네박테리움 글루타미쿰에도 라이신 합성에 관여하는 유전자 중 lys A(diaminopimelate decearboxylase), dap A의 크로닝이 보고된 바 있으나 라이신 생산균주에서의 발현 및 라이신 생산수율의 증가 결과는 보고된 바 없다.

본 발명에서는 코리네박테리움 글루타미쿰 CS 755 염색체 DNA(chromosomal DNA)을 Sau3Ag로 부분절단(partial digestion)한 뒤 30-50kb 절편을 저융점 아가로스(low melting temperature agarose)젤에서 분리하고 정제한 뒤 BamH1 처리 및 카프 인테스틴 포스파타제(calf intestine phosphatase)처리한 코즈미드 벡터(cosmid vector) pHC 79와 T4 DNA 리가제(T4 DNA ligase)로 접합한 뒤 에스케리카아 콜리NM 544(r-,m+)에 감염(infection)시켜 형질전환체로부터 프라스미드를 분리하여 유전자 라이브러리(genomic library)를 제작하였다. 이를 사용하여 dap A 숙주인 대장균 AT 997을 사용하여 코리네박테리움 글루타미쿰 CS 755의 dap A 유전자를 크로닝하였다. 또한 서브크로닝(subcloning)후 최종 4.5kb 크기의 dap A 유전자를 지닌 Sal I 절편을 당사 개발 대장균, 코리네형 세균간 발현 가능한 셔틀벡터(shuttle vector)인 pECCG 122 및 pECCG 117에 옮긴 뒤 라이신 생산균주에 도입하여 이 유전자를 발견시키고 이에 따라 라이신 생산 수율을 향상시킴으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명에 사용된 균주와 프라스미드는 표 1과 같다. 또한 dap A 유전자를 지닌 재조합 프라스미드 pDHDP 5812를 지닌 코리네박테리움 글루타미쿰 LR2-2/pDHDP 5812를 1990년 12월 27일자로 한국 종균 협회에 기탁하였다(KFCC 10720).

[표 1]

대장균 및 코리네박테리움의 배양시에는 LB배지(1%트립톤, 0.5% 효모엑기스, 1% NaCl pH 7.0)를 전기장 충격법에 의한 형질전환후 발현(expression)시에는 SOC배지(2% 트립톤, 0.5% 효모엑기스, 10mM NaCl, 2.5mM KCl, 10mM MgCl₂, 10mM MgSO₄, 20mM 포도당)을 각각 사용하였다.

대장균용 최소배지로는 M9배지(NaHPO₄·7H₂O 12.89ℓ, KH₂PO₄3g/ℓ, NaCl 2.5g/ℓ, NH₄Cl 1g/ℓ, 포도당 5g/ℓ, pH7.0)를 사용하였다. 코리네박테리움 글루타미쿰 CS 755용 최소배지의 조성은 표 2와 같으며 로이신 100㎎/ℓ, 호모세린 200㎎/ℓ(혹은 메치오닌 스레오닌 각각 100㎎/ℓ)을 첨가하여 사용하였다. 대장균 AT 997 숙주의 성장을 위해서는 100㎎/ℓ의 다이아미노 피메릭산(diaminopimelic acid:DAP)을 LB배지 및 M9배지에 첨가하여 사용하였다.

또한 필요한 경우에 엠피실린 또는 카나마이신은 50ug/ml의 농도가 되도록 첨가하였다. 전기장 충격법(electroporation)에 의한 코리네박테리움 글루타미쿰의 형질 전환에는 BIO-RAD사 제품의 진펄서(Gene Pulser, 165-2076), 펄스조절기(pulse controller 165-2098), 0.2㎝간극의 진 펄서큐벳(Gene pulser cuvette, 165-2086)을 사용하였다.

[표 2]

본 발명의 상세한 내용은 아래의 실시예와 같다.

[실시예 1]

코즈미드벡터(Cosmid vector)를 사용한 코리네박테리움 글루타미쿰 CS 755의 dap A 유전자 크로닝

코리네박테리움 글루타미쿰 CS 755를 초기 휴지기까지 키운 뒤 세포를 거 뒤 10mM Tris-HCl(pH 8.0)으로 세척한 뒤 세포 침전물을 -70℃에서 냉동시켰다. 이들을 냉동시킨 뒤 40ml의 라이소자임(lysozyme)용액(10mM Tris-HCl, 5mM NaCl, 1mM EDTA, 0.5M Sucrose, 5㎎/ml 라이소자임)에 현탁시키고 37℃에서 약 1.5시간 처리하였다. 세포가 완전히 분해되지 않으면 60℃ 수조에서 세포현탁액을 가볍게 흔들어 주면서 완전히 분해시켰다. 여기서 CsCl을 ml당 0.96g이 되게 가하고 2ml의 에티디움 브로마이드 용액(10㎎ ml)을 넣어 섞어 주었다. 초고속 원심분리기(Beckman 70.1 Ti rotor)을 사용하여 15℃에서 50,000rpm으로 48시간 원심분리시킨 뒤 직경이 큰 주사기 바늘을 사용하여 염색체를 취했다.

아이소프로판올(isopropanol)로 3-4회 에티디움 브로마이드를 추출해낸후 TE 완충용액(10mM Tris-HCl, 1mM EDTA)하에서 3회 완충용액을 바꿔가며 24시간 투석한 뒤 다음 실험에 사용하였다. 얻은 코리네박테리움 글루타미쿰 CS 755의 염색체 DNA(chromosomal DNA)를 제한효소 Sau3A로 부분전달(partial digestion)시킨 뒤 저융점 아가로즈젤(low melting temperature agarose gel)에서 전기영동한 뒤 30-50kb크기의 DNA절편을 취하였다. 이를 68℃에서 10분간 수조에서 가열하여 젤을 녹인 뒤 동일 부피의 Tris-HCl 포화페놀을 넣고 섞어준 뒤 12,000rpm에서 10분간 원심분리하여 상등액을 취하고 다시 크로르포름 처리 및 에탄올 침전을 시켜 30-50kb크기의 유전자 단편을 취하였다.

제1도에 나타낸 것과 같이 코즈미드 벡타인 pHC 79를 제한효소 BamH 1으로 절단하고 카프 인테스틴 포스파타제(calf intestine phosphatase)를 처리한 뒤 30-50kb DNA절편과 T4 DNA 리가제(T4 DNA ligase)를 사용하여 접합시키고 생체외에서 페케이지(in vitro package)후 대장균 숙주 NM 554(r-,m+)에 감염시켜 5×10⁵이상의 엠피실린 내성콜로니(colony)를 획득하였다. 이들 콜로니로부터 프라스미드(plasmid)를 분리한 뒤 dap A 숙주인 대장균 AT 997에 감염(infection)시켜 12개의 클론(clone)을 엠피실린이 함유된 LB 한천 평판배지에서 얻었다. 이를 서브크로닝하여 4.5kb 크기의 dap A 유전자의 크로닝을 완성하였다.

[실시예 2]

디하이드로디콜리네이트 신세타제(dap A)효소 활성 비교

크로닝된 dap A 유전자의 발현을 확인하기 위해 효소 활성을 측정하였으며 비교를 위해 야생균주인 대장균 C-600을 사용하였다. 우선 에스케리키아 콜리 C 600, 에스케리키아 콜리 AT 997 및 에스케리키아 콜리 AAT 997/pCDH1를 LB, DAP이 함유된 LB 및 LB Am배지에서 각각 진탕배양하여 키운 뒤 대수증식기 증반에서 세포를 거두었다. 이를 TE 완충용액으로 세척한 뒤 다시 적은 부피의 TE 완충용액에 현탁시킨 뒤 초음파 분쇄(ultrasonication)로 세포를 파괴한 후, 20,000g에서 30분 원심분리시켜 상등액을 얻었으며 이를 조효소액(crude extract)으로 사용했다. 효소반응은 2M Tris-HCl 완충용액(pH 7.5) 45㎕, 10mM 소디움 파이루베이트(sodium puruvate) 45㎕, 10mM 아스파틱 세미알데히드(aspartic-β-semialde hyde) 60㎕, 중류수 250㎕, 조효소액 50㎕을 섞어 준 뒤 30℃에서 10분 반응시켰다. 여기에 45㎕의 1N HCl을 가하고 에탄올에 녹인 2% O-아미노벤즈 알데히드(O-aminobenzaldehyde)를 100㎕을 넣은 뒤 실온에서 50분 방치하였다. 5.000g에서 5분 원심분리 후 540nm 파장에서 흡광도를 측정하였다. 단백질의 정량은 로리 법(Lowry method)을 사용했으며 표준물질로는 소 혈청단백질(bovine serum albumin)을 사용하였다.

[표 3]

주) 1유니트는 분당 540nm파장에서 흡광도를 1단위 증가시키는데 필요한 단백질의 양으로 정하였다.

표 3에서 보듯이 코리넥박테리움 글루타미쿰 CS 755의 디하이드로피콜리네이트 신세타제는 라이신에 의해 저해를 받지 않으며 대장균 C 600은 10mM L-라이신에 의해 효소 활성이 크게 저해됨을 알 수 있다. 그러나 코리박테리운 글루타미쿰 dap A 유전자를 지닌 에스케리키아 콜리 AT 997/pCD H₁은 효소활성의 증가를 보이며 아울러 라이신에 의해 저해받지 않음을 알 수 있었다.

[실시예 3]

dap A 유전자의 에스케리키아 콜리/코리네박테리움 글루타미쿰 셔틀벡터 pECCG 122 및 pECCG 117에 도입 및 코리네박테리움 글루타미쿰 형질 전환.

제2도에 나타난 바와 같이 셔틀벡터 pECCG 122 및 pECCG 117의 다발성 절단부위(multiple cloning site)내 Sal I위치에 4.5kb크기의 dap A 유전자 함유 Sal I DNA 절편을 pCDH 1로부터 저융점 아가로즈 젤(low melting temperature agarose gel)을 사용하여 분리한 후 T4 DNA 리가제(ligase)를 사용하여 삽입시켰다. 접합된 프라스미드를 우선 에스케리키아 콜리 AT 997에 전기장 충격법(electroporation)으로 도입시킨 뒤 BKm배지나 M9 Km 한천 평판배지에서 카나마이신 내성 형질전환체를 얻었다. 프라스미드를 분리하고 제한효소 처리를 한 뒤 전기영동을 하여 dap A 유전자도입을 확인하였다. 얻은 dap A 유전자 함유 셔틀베터인 pDHDP 19 및 pDHDP 5812를 코리넥박테리움 글루타미쿰 CS 755에 전기장 충격법으로 도입하였다. 전기장 충격법에 의한 형질 전환법은 아래와 같이 수행하였다.

LB배지에서 14-15시간 배양한 코리네박테리움 글루타미쿰 CS 755를 1L LB배지에 초기 흡광도(600nm)가 0.07 내지 0.1이 되게 접종한 뒤 32℃에서 진탕배양하고 흡광도가 0.3에 달했을 때 페니실린 G를 최종 농도가 0.3u/ml이 되게 첨가한 뒤 흡광도 0.6이 될 때까지 배양하였다. 대장균의 경우는 페니실린 G처리 없이 흡광도 0.6이 될 때까지 배양한 뒤 사용하였다. 이 균체를 원심분리하 뒤 1L의 1mM HEPES[N-(2-하이드록시에틸)피페라진-N'-(2-에탄설폰 산)]완충용액에 현탁하여 재차 원심분리하고 다시 500ml의 차가운 멸균 탈이온 증류수에 현탁시켰다. 이를 다시 원심분리한 뒤 균체를 20ml의 10%글리세롤에 현탁시키고 원심분리한 뒤 최종 2-3ml의 10% 글리세롤 용액에 현탁하여 최종 균체농도를 2-4×10¹⁰ml로 조정하여 사용하였다. 이 세포 현탁액을 드라이아이스 에탄올로 냉동시킨 뒤 -70℃에 보관하며 약 1개월간 형질전환 빈도의 감소없이 사용할 수 있었다. 엘리쿼트(aliquots)로 보관된 세포현탁액 40ul를 얼음속에서 녹인 뒤 여기에 1ng-1ug의 프라스미드 DNA를 가해 섞은 뒤 0.2cm 간극의 진 펄서큐벳에 넣고 축전량(capacitance) 및 전기장의 세기를 24uF 및 12.5Kv/cm에 고정하고 200-400의 저항에서 1회의 전기장 충격을 가했다. 전기장 충격 후 즉시 1ml의 SOC배지를 넣어 섞은 뒤 멸균 시험관에 옮겨 32°에서 1시간 동안 진탕배양하였다. 이를 적절히 희석하여 LB Km 한천평판 배지에 도말하여 1-2일 후 형질전환체를 얻을 수 있었다.

[실시예 4]

코리네박테리움 글루타미쿰 CS 755에서 dap A의 유전자 발현 pDHDP 19 및 pDHDP 5812을 지닌 코리네박테리움 글루타미쿰 CS 755의 디하이드로디피콜네이트 신세타제 효소활성을 측정하였다. 조 효소액을 얻기 위해 형질 전환체는 LB Km 배지에서 코리네박테리움 글루타미쿰 CS 755은 LB1배지에서 대수증식기증기까지 키운 뒤 실시예 2와 같은 방법으로 효소 활성을 측정하였다.

[표 4]

pDHDP 19가 도입된 코리네박테리움 글루타미쿰 CS 755는 효소활성이 약 2배 증가되었으며 pDHDP 5812가 도입된 경우는 숙주보다 DHDP 신세타제 활성이 10배 증가되었다.

[실시예 5]

재조합 코리네박테리움 글루타미쿰을 설탕을 탄소원으로 하여 32℃에서 플라스크 회분 발효하여 코리네박테리움 글루타미쿰 숙주와의 L-라이신 생산성을 비교검토하였다. 발효배지는 L당 설탕 50-75g, 황산암모니움 20g, 효모엑기스 5g, 우레아 4g, NaCl 2.5g, MgSO₄·7H₂O 0.6g, 바이오틴 300ug, 치아민 500ug, CaCO₃40g 및 미량 원소로 구성된다. 필요한 경우 아미노산은 50-200㎎/L, 카나마이신은 50ug/ml 각각 첨가하여 사용하였다. 라이신의 양은 HPLC를 사용하여 정량하였다.

[표 5]

회분발효(batch fermentation)결과 재조합균주는 라이신 생산수율이 현저히 증가함을 볼 수 있었다.

Claims

코리네박테리움 글루타미쿰 dap A 유전자를 함유한 코리네박테리움 글루타미쿰 및 대장균에서 복제되고 발현되는 발현비히클 pDHDP 5812.
코리네박테리움 글루타미쿰 dap A 유전자를 함유한 코리네박테리움 글루타미쿰 및 대장균에서 복제되고 발현되는 발현비히클로 형질전환된 코리네박테리움 글루타미쿰.
제2항에 있어서, 형질전환된 코리박테리움 글루타미쿰이 S-(2-아미노에틸)-L-시스테인에 내성을 가지며 L-라이신을 생산함을 특징으로 하는 헝질전환된 코리네박테리움 글루타미쿰 KFCC 10720.
코리네박테리움 글루타미쿰 dap A 유전자를 함유한 코리네박테리움 글루타미쿰 및 대장균에서 복제되고 발현되는 발현비히클 pDHDP 5812로 형질전환된 코리네박테리움 글루타미쿰을 배양하여 라이신을 생산하는 방법.