KR950009843B1 - 이중 프로모터-유전자 시스템을 갖는 발현 벡터(pYD 21)를 이용한 사람 프로인슐린 융합 단백질의 생산 - Google Patents

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Abstract

내용 없음.

Description

이중 프로모터-유전자 시스템을 갖는 발현 벡터(pYD 21)를 이용한 사람 프로인슐린 융합 단백질의 생산
제1도는 사람 프로인슐린 발현 벡터인 pUC(8-(Thr)6-PI와 pYK10-9)제작 개요도이다.
제2도는 사람 프로인슐린 발현 벡터인 pYD21의 제작 개요도이다.
제3도는 사람 프로인슐린 유전자가 도입된 재조합 대장균으로부터 생성된 단백질의 SDS-pAGE 사진이다.
제4도는 pYD21 발현 벡터로 형질전환된 대장균 pop2136의 유가배양 발효그래프이다.
제5도는 pYD21을 함유한 대장균 pop2136을 열유도 후 시간경과에 따른 융합단백질 생성사진이다.
본 발명은 유전자 조작을 이용하여 대장균내에서 사람의 프로인슐린 융합단백질을 생산하는데 있어서 한 플라스미드내에 프로인슐린 융합단백질 유전자 뿐 아니라, 유전자의 조절기구인 프로모우터, lac 리보소옴결합부위, 종류유전자 등을 한 단위로 하여 두개 이상 조합하여, 프로인슐린 융합단백질의 발현율을 획기적으로 증가시키는 방법에 관한 것이다.
유전자 조작을 이용한 사람 인슐린의 합성은 두가지 방법 중의 하나로 이루어지게 된다. 그중 하나는 인슐린의 A사슬과 B사슬을 각각 클로닝하고 발현시켜 정제한 후, 다시 실험실에서 재구성하는 것으로서 (Goeddel 등, PNAS. 76. 106-110, 1979 ; Chance 등, Diabetes Care, 4 ; 149-154, 1981), 두가지의 유전자를 조작하는 어려움 뿐만 아니라 각 사슬의 재구성시 수율이 현저히 떨어지고 방법이 복잡하다는 단점이 있다. 또 다른 방법은 직접 생산하는 방법으로서, 연결된 두 사슬을 암호화하는 유전자를 다른 단백질유전자와 결합된 상태로 한 플라스미드에 클로닝하여 췌장에서 분비하는 것과 유사하게 대장균에서 합성하게 하는 방법이다(William 등, Science, 215 : 687-689 ; Frank 등, In ; Peptide(eds. Rich, P. H. and Gross, E.) Dierce Chemical Company, Rockford, IL. p. 729-738, 1981). 이들중 두번째 방법이 발효 및 정제공정이 단순하고 쉽게 인슐린 3차구조를 만들 수 있으므로 유용하다.
그러나 대장균 체내에서 프로인슐린과 같은 외부 단백질이 발현 정도는 목적하는 단백질 즉 프로인슐린과 연결되는 융합단백질의 크기와 반비례하기 때문에, 큰 크기의 융합단백질을 만드는 것은 바람직한 방법은 못된다. 또한, 프로인슐린 융합단백질의 대장균내에서의 안정성 및 정제공정을 단순화하기 위해서는 두가지를 다 고려한 융합된 유전자의 설계가 필요하다. 지난 10수년간 본 발명자들을 비롯한 다른 연구자들도 베타 갈락토시다제(β-galactosidase) 부분의 크기를 줄이려는 노력을 끊임없이 해왔으며(Guo 등, Gene, 29 ; 251-255, 1984 ; Yoon 등, In : Rocombinant DNA Techniques, J. W. Yoon editor, KOSCO Inc. Seoul, P93-115), 한편으로 융합되는 부분을 다른 짧은 펩타이드로 바꾸기도 하였다(Sung 등 PANS. 83 : 561-565, 1986). 또한 발현된 프로인슐린의 대장균내 안정성을 유지하기 위하여 여러가지 유전자가 조합된 프로인슐린을 만들거나, 생성된 프로인슐린의 대장균내에서의 분해를 막기 위해 단백질 분해효소가 결핍된 대장균을 숙주세포로 사용하기도 하였다. 그 결과 약간의 개선이 이루어지긴 하였으나, 여전히 (1) 융합되는 유전자의 크기를 줄이는 문제, (2) 발현 시간의 장기성, (3) 변형된 프로인슐린의 시험관에서의 정확한 재구성 및 (4) 낮은 수율 등의 문제가 남아 있었다.
이와 같은 문제를 해결하거나 최소화하기 위하여, 본 발명자들은 샐운 발현체계를 갖는 벡터를 개발하여 프로인슐린 융합단백질을 생산하는 재조합 플라스미드를 개발하였다. 프로인슐린 유전자의 5′말단 부위에 (Thr)6를 코딩하는 유전자를 포함한 올리고뉴크레오타이드를 부착함으로써 세포내에서 세균 단백질 분해효소의 표적에서 벗어나 세포내에서 분해를 방지할 수 있었으며, 한편 강력한 프로모우터인 PR프로모우터와 Lac 리보솜 결합부위를 사용함으로써 프로인슐린 융합단백질의 발현을 효과적으로 조절하게 되었다(pYK10-9, 기탁번호 KFCC-10760).
그러나 비록 융합단백질의 크기를 줄여, 인슐린 융합단백질의 세포내 안정성을 증가시키고, 강력한 프로모우터인 PR을 사용하였다 하더라도, 인슐린 제품을 대량으로 생산하기 위해서는 극복해야 할 몇가지 문제가 있다. 즉, 현재 사용중인 당뇨병 치료제인 인슐린의 1회 사용량은 용량(dose)당 40mg으로서 상당히 많은 양의 인슐린이 필요하며, 1회 접종후면 영구적으로 접종해야 하는 단점이 있고, 더구나 정제과정의 어려움으로 인해 대장균을 이용한 발현율이 획기적으로 증대되지 않으면 안된다. 이와같은 문제점을 극복하기 위하여 형질발현율을 제고시키기 위한 방법으로서는 종래의 여러가지 방법이 있다.
첫째, 본 발명자들이 사용한 PR프로모우터 같은 강력한 발현기구를 사용한다든지 둘째, 2개의 프로모우터를 연속으로 결합한 합성 프로모터를 사용하는 방법(tac 프로모우터 사용)등이 있으며, 셋째, 하나의 발현기구에 2개 이상의 유전자를 결합시키는 방법등이 있다. 그러나 강력한 프로모우터의 사용으로는 발현율을 제고시키는데 한계가 있다. 따라서 하나의 프로모우터에 여러개의 유전자를 연속적으로 삽입하는 경우를 생각할 수 있으나, 다음과 같은 문제점 때문에 사용하기가 매우 힘들다.
첫째, 단일유전자 발현기구에 즉, 하나의 프로모우터에 여러구조 유전자를 연속적으로 배치할 경우 단일 단백질이 1차원적으로 결합된 다중체(multimer)가 생성되기 때문에 활성이 있는 단일체(monomer) 상태로 만들기 위해서는 특별한 방법, 예를들어 CNBr 절단등을 시도해야 하나, 이 또한 CNBr 작용 부위가 메티오닌임을 생각할 때 별로 용이한 것은 아니다. 둘째, 단일체에 비해 상대적으로 분자량이 큰 단백질이 합성되기 때문에 실질적인 발현율의 향상은 기대하기 어렵게 된다. 더구나 가장 큰 문제점으로 각각의 유전자가 발현될 때, 전사, 해독 및 종료의 효과적인 조절방법의 부재로 인해 유전자 발현의 가장 기본 요건임과 동시에 산업용 균주 개발의 요건인 형질발현의 물리적 제어수단이 불가능하다.
따라서 이와같은 문제점을 해결하고자 본 발명자들은 프로인슐린 융합단백질 유전자, 프로모우터, 리보솜결합부위, 종료 유전자 등의 유전자들의 조합 2개를, 한 플라스미드내에 삽입하여 새로운 발현 벡터(pYD21)를 제조하였다(제2도). pYD21 벡터내의 프로인슐린 융합단백질을 코딩하는 유전자들은 각각의 형질 발현기구에 의해 독립적으로 발현되고 조절됨으로써 상기 언급한 단점들을 극복할 수 있다. 즉, 여러개의 인슐린 융합단백질이 연속적으로 결합된 다중체(multimer)를 이루지 않고, 각각 단일한 인슐린 융합단백질이 생성되기 때문에, 단일체를 만들기 위한 CNBr 등의 절단방법이 전혀 필요치 않으며, 더우기 독립된 강력한 프로모우터 여러개가 각각 작용하기 때문에 획기적인 발현율의 증대를 이룰 수 있는 것이다. 따라서 본 발명은 형질 발현기구에 관련된 프로모우터 및 조절유전자, 구조유전자 및 전사종결유전자 등을 한 단위로 하여 단일 플라스미드내에 2개 이상 연결시켜 발현율을 증가시키는 방법에 관한 것이다.
본 발명에 사용한 pYD21은, 다음과 같은 특징이 있다. ① 프로인슐린 융합단백질의 세포내 안정성을 도모하기 위해 Thr이 6개 포함된 17개의 전구체를 지니며, ② 강력한 형질 발현기구인 PR프로모우터, 적당한 간격을 가진 lac 리보소옴 결합부위 및 인슐린 구조유전자, 강력한 전사종결유전자(파지 fd 전사종료유전자와 합성 해독정지 코돈의 조합)등을 한 단위로 하여 2개가 연속적으로 결합되었으며, ③ 항생제 앰피실린에 저항성을 지니고 있고, ④ pYD21는 배양시 배양 세포내에서 대단히 안정하게 유지되며, ⑤ 복사(copy)수가 많아 형질발현이 획기적으로 증가된다.
따라서 본 발명은 프로인슐린 융합단백질의 형질발현을 획기적으로 향상시킨 벡터 pYD21의 제조에 관한 것이다.
pYD21을 pYK10-9와 동시에 배양시켜 형질발현율을 비교한 결과 표 6과 같이 pYD21의 건조균체 중량이 pYK10-9에 비해 2배 정도 낮음에도 불구하고 발현율은 28% 정도로서 오히려 많은 량의 인슐린을 회수할 수 있다. 이는 대규모 배양시 세포의 중량을 줄임으로써 정제수율을 극대화할 수 있는데, 특히 정제 단계에서의 세포파괴시에 세포의 중량이 작아짐으로 인해 정제를 수월하게 할 수 있는 장점이 있다. 따라서 본 발명은 pYD21을 대장균 pop2136에 형질전환시키고 이 형질전환체로부터 사람 인슐린 융합단백질을 기질의 제법보다 효율적으로 생산하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에서는 프로인슐린 융합단백질을 대장균에서 생산하기 위하여 다음의 벡터를 재조합하였다(제1도 및 제2도).
가) pUC8-(Thr)6-PI : 발현 벡터인 pUC8-(Thr)6-PI는 플라스미드 pUC8에 프로인슐린 유전자와 짧은 올리고펩타이드(oligopeptide) 유전자를 삽입하여 제조하였다(제1a도). 간단히 언급하면 무딘끝의 개시코돈과 3′말단에 돌출된 Hind Ⅲ 절단부위를 가진 프로인슐린 유전자를 Xba 1, 크레나우 중합효소, Hind Ⅲ 등을 처리하여 pUC8에 재클로닝하였다. 이 재조합 pUC8-PI를 EcoR Ⅰ으로 절단하여 선형화한 다음 (Thr)6를 코딩하는 유전자를 포함하는 올리고뉴크레오타이드를 삽입하였다. pUC8-(Thr)6-PI 벡터를 디데옥시사슬 종결법(dideoxy chain termination method)에 의해 DNA 염기서열을 확인하였다.
나) pYK10-9 : pYK 발현 벡터계는 pEX2 플라스미드에 결합된 PR프로모우터(promoter), Lac 리보솜결합부위(ribosome binding site), (Thr)6를 코딩하는 유전자 등으로 구성되어졌다(제1b도). 간단히 서술하면 PR프로모우터는 pEX2로부터 Hind Ⅲ 부분절단, Ba131 절단 Hind Ⅲ 완전절단에 의해 얻어졌다. 융합유전자는 Lac 리보솜 결합부위, (Thr)6을 코딩하는 유전자를 포함한 올리고뉴크레오타이드와 함께 pUC8-(Thr)6-PI 벡터를 Pvu Ⅱ, Lac 유전자의 Ba131에 의한 연쇄절단 및 Hind Ⅲ 절단등에 의해 얻어졌다. 얻어진 PR프로모우터를 Lac 리보솜 결합부위의 5′말단에 삽입되었으며, Lac 리보솜 결합부위와 PR모터모우터간의 다양한 간격을 지닌 pYK계 벡터가 제조되었다(기탁번호 KFCC-10760).
다) pYD21 : pYD계 발현 벡터는 pYK10-9로부터 유래되었다. pYK10-9를 제한효소 SspI으로 절단한후 에탄올 침전하였다. 이를 Aat Ⅱ로 절단한 후, 2.9Kb의 절편을 아가로스 전기영동으로 회수하였다. 동시에 발현 벡터 pYK10-9를 제한효소 Nde Ⅰ으로 절단하고, T4DNA 폴리머라지(polymerase)로 무딘 끝(blunted end)으로 만든 후 Aat Ⅱ로 다시 절단하여 1.2Kb의 절편을 회수하였다. 이 두 절편을 T4DNA 리가아제의 존재하여 결합시켜 대장균에 형질 전환시켰다. 이 벡터는 2개씩의 프로모우터, lac 리보소옴 결합부위, 인슐린 유전자, 터미네이터 등이 독립적으로 하나의 골격(backbone)에 존재한다.
본 발명에 사용된 균주는 대장균 JM103과 대장균 pop2136이다. 이중 대장균 pop2136은 염색체내에 온도민감성 cI 857 리프레서(cI 857 repressor) 유전자를 가지고 있어 플라스미드내의 PR프로모우터 작동조절이 가능하다.
본 발명에서 융합단백질의 형질발현은 pYK10-9 및 pYD21로 형질전환된 대장균 pop2136의 경우 포도당(lg/l)과 앰피실린(50㎍/ml)이 첨가된 2xTY 배지(1.6% 트립톤, 1% 효모엑기스, 0.5% NaCl, pH 7.0)에서 32℃ C로 배양하면서 580nm의 파장에서 흡광도과 1일때 42℃로 온도전이(shift)하여 발현을 유도하였다.
대장균 pop2136/pYK10-9 및 대장균 pop2136/pYD21의 유가배양(fed batch fermentation)용 발효배지와 성장제한 기질(growth-limiting substrate) 첨가배지는 표 1, 2와 같으며, 용존산소는 20%로 포화시켜 사용하였고, 온도는 32℃에서 42℃로 전이하며 새로운 배지(표 3)를 첨가하여 프로인슐린 융합단백질을 발현시켰다.
[표 1]
대장균 pop2136/pYK10-9의 유가배양용 발효배지 조성
[표 2]
성장 제한 기질(growth-limiting substrate) 첨가 배지
[표 3]
형질발현의 열 유도 후 첨가 배지
발현된 융합단백질의 양은 C-펩타이드 자기방사 면역법과 SDS-PAGE로 측정하였다. 재조합 대장균을 3,000rpm에서 원심분리하여 pH 7.8인 PBS 완충용액에 현탁시킨 후 초음파 분쇄기로 파쇄하였다. 파쇄된 균체를 냉장실에 방치하고 12,000rpm에서 5분간 원심분리하여 침전 융합단백질을 얻었다. 이 침전 융합단백질을 6M 구아니딘 염산염(guanidine-HCl)에 녹이고 PBS 완충용액으로 적절히 희석하여 Daiichi Radioisotope(Tokyo, Japan)의 C-펩타이드 자기방사 면역법에 따라 측정하였다. SDS-PAGE는 Laemmli(1970)의 방법에 의해 실시하였다. pYD21 및 pYK10-9 발현 벡터의 단백질을 분석할 때는 15%의 젤을 사용하였다. 원심분리한 균체에 시료완충용액(5% SDS, 73mM Tris, pH 6.8, 10nm DTT)을 넣고 95℃에서 2분간 열처리하여 단백질을 불활성화 하여 시료를 얻었다.
본 발명의 상세한 내용은 아래의 실시예와 같다.
[실시예 1]
[cDNA 클로닝 방법에 의한 사람 프로인슐린의 클로닝]
사람 췌장의 랑겔한스섬 조직을 분리하여 폴리트론 믹서(Polytron mixer)로 부순 다음 g당 5ml의 4M 구아니딘 이소씨오씨아네이트(guanidine-isothiociyanate) 용액을 첨가하고 18 게이지(gauge)가 부착된 주사기로 염색체 DNA를 파괴시켰다. 여기에 미리 60℃로 데워진 페놀/클로로포름 용액을 다량 첨가하여 단백질을 제거하고 이를 여러번 반복하여 단백질 분해효소 K(proteinase K)로 처리하였다. 단백질이 제거된 이 용액을 에탄올 침전하여 총 RNA를 얻었다. 얻어진 총 RNA에서 3′ 말단에 폴리(A)[Poly(A)]를 갖는 mRNA를 분리하기 위하여 올리고 d(T) 셀룰로즈[oligo d(T)-cellulose])컬럼을 사용하였다. 분리된 폴리(A)-mRNA에서 첫번째 가닥 cDNA의 합성은 올리고 d(T) 프라이머(oligo d(T)primer)를 사용하여 42℃에서 40분간 리버스 트랜스크립타제(reverse transcript-ase)로 반응하였다. 합성된 첫번째 cDNA 반응용액(cDNA/mRNA hybrid)에 대장균 리보뉴크리아제(ribonuclease) H를 첨가하여 mRNA를 절단하고 대장균 DNA 폴리머라제(polymerase) Ⅰ를 첨가하여 두번째 가닥 cDNA를 합성하였다. 합성된 두번째 가닥 cDNA의 3′말단은 T4DNA 중합요소(T4DNA polymerase)로 반응하여 제거하고 5′말단의 헤어핀 루프(hair-pin loop)는 S1 뉴크레아제(S1 unclease)로 반응하여 제거하였다. 이 두가닥 cDNA에 TdT(Terminal deoxynucleotidyl Transferase)를 반응하여 C-테일 cDNA를 제조하였다. 한편 클로닝 벡터는 pBR322를 사용하였다. 먼저 pBR322 벡터를 Pst Ⅰ으로 절단하고 TdT를 반응하여 G-테일링된 선형 pBR322를 제조하였다. C-테일 cDNA와 G-테일 pBR322를 T4DNA 리가아제(T4DNA ligase)로 접합하여 대장균에 형질전환하여 2x TY-테트라싸이클린(50㎍/ml) 평판배지에 도말하여 테트라사이클린 내성형질전환체를 얻었다. 이 형질전환체 중 콜로니 하이브리디제이션(hybridization) 방법을 사용하여 프리프로인슐린(preproinsulin) 유전자를 포함한 플라스미드를 갖는 콜로니를 얻었다. 이 플라스미드에서 프리프로인슐린 유전자를 분리하고 pTZ18R 벡터에 재클로닝하여 pTZ18-HI 플라스미드를 제조하여 인슐린 유전자의 염기서열을 확인하였다.
프리프로인슐린이 포함된 이 pTZ18-HI에서 특이적 절단 방법(site-specific gene trimming method)을 사용하여 프로인슐린만 포함된 pTZ18-PI을 제조하였다. 먼저 pTZ18-HHI의 한가닥 DNA(single stranded DNA)에 역 프라이머(reverse primer)를 부착하고 크레나우 중합효소로 부분적으로 두가닥 DNA(double stranded DNA)를 만들었다. 이 플라스미드를 EcoR Ⅰ으로 절단하고 염기성 젤 전기영동으로 선형한가닥(single stranded pTZ18-HI를 분리하였다. 이 DNA에 개시코돈(ATG)으로 시작하는 합성 프라이머(primer)를 부착, 크레나우 중합효소로 5′→3′ 합성과 3′→5′ 제거후 Hind Ⅲ로 절단하여 5′말단 무딘끝과 3′말단 Hind Ⅲ끝을 갖는 프로인슐린 유전자를 분리하였다. BamH Ⅰ으로 절단하고 크레나우 중합효소로 무딘끝을 만든 후, Hind Ⅲ으로 절단한 pTZ18R 벡터에 분리된 프로인슐린 유전자를 삽입하여 프로인슐린 유전자만을 포함하는 pTZ18-PI 벡터를 제조하였다. 이 pTZ18-PI 벡터는 pUC8-(THr)6-PI 발현 벡터의 제조에 사용되었다.
[실시예 2]
[pUC8-(THr)6-PI 발현 벡터의 재조합(제1a도)]
pUC8 플라스미드를 Xba Ⅰ(완충용액 : 10mM Tris-HCl, 10mM MgCl2, 50mM NaCl, 1mM DTT, 5㎛ BSA, pH 7.9)으로 절단하고, 크레나우 중합효소로 3′말단 Xba Ⅰ 끝을 3′말단 무딘끝으로 만들었다. 이 DNA를 에탄올 침전하여 Hind Ⅲ 완충용액(10mM Tris-HCl, 10mM MgCl2, 50mM NaCl, 1mM DTT, pH 7.9) 녹이고 Hind Ⅲ로 절단하였다. 이 DNA에 BAP(bacterial alkaline phosphatase)를 처리한 다음 큰 DNA 절편을 전기영동한 0.8% 이가로즈 젤상에서 회수 정제하였다. pTZ18-PI 플라스미드는 EcoR Ⅰ, Ba131으로 처리한 후 다시 Bau 3A Ⅰ(완충용액 : 10mM Bis Tris Propane, 10mM MgCl2, 1mM DTT, 50μM PSA, pH 7.0), S1 뉴크레아제(완충용액 : 30mM sodium acetate, 5mM NaCl, 1mM zinc acetate, 0.5mg/ml 열에 변성된 DNA, pH 4.6), Hind Ⅲ를 처리하여 프로인슐린 유전자를 분리 정제하였다. 이상에서 분리정제한 두 절편을 T4DNA 리가아제로 집합하여 대장균 JM103에 형질전환시켰다. 형질전환된 대장균에서 분리한 플라스미드 중 Xba Ⅰ 절단위치를 지닌 pUC8-PI 플라스미드를 얻었다. 이 pUC8-PI의 프로인슐린 유전자를 함유한 염기서열을 삽입하기 위해 pUC8-PI를 Xba Ⅰ, S1 뉴크레아제, EcoR Ⅰ, BAP등을 처리하여 큰 절편을 분리하였다. (Thr)6를 코딩하는 유전자를 함유한 염기서열은 화학합성이고, T4폴리뉴크레오타이드 키나제(polynucleotide kinase, 완충용액 : 70mM Tris-HCl, 10mM MgCl2, 0.1mM spermidine, 5mM DTT, 0.1mM EDTA. 60μM ATP, pH 7.6)를 처리하였다. 분리된 pUC8-PI의 큰 절편과 (Thr)6를 코딩하는 유전자를 포함하는 염기서열을 접합하고 대장균 JM103에 형질전환하여 pUC8-(THr)6-PI 발현 벡터를 얻었다. pUC8-(THr)6-PI의 부분을 pTZ18R에 삽입하여 pTZ18-(THr)6-PI 플라스미드를 얻고 이 플라스미드를 프로인슐린의 DNA 염기서열을 확인하였다.
[실시예 3]
[pYK계 발현 벡터의 재조합(제1b도)]
pEX2 벡터를 Hind Ⅲ로 부분 절단하고 에탄올 침전한 후, Ba131 완충용액(600mM NaCl, 12mM CaCl2, 12mM Tris-HCl, 1mM EDTA, pH 8.0)에 녹여 30℃에서 Ba131으로 시간별 처리하였다. Ba131 처리된 DNA를 에탄올 침전하여 Hind Ⅲ 완충용액에 녹인 후 Hind Ⅲ로 완전절단하여 강력 프로모우터인 람다 PR프로모우터를 포함하는 선형 DNA를 0.8% 아가로즈 전기영동에 의해 분리하였다. (Thr)6를 코딩하는유전자를 포함한 프로인슐린 유전자는 pTZ18-PI 플라스미드로부터 Pvu Ⅱ(완충용액 : 50mM Tris-HCl, 10mM MgCl2, 10mM NaCl, 1mM DTT, pH 7.9), Ba131을 처리하고 Hind Ⅲ로 절단하여 분리하였다. Lac 리보솜 결합부위 유전자를 (Thr)6-PI 유전자의 5′말단에 접합하고 이 접합 DNA를 PR프로모우터의 3′말단에 삽입하여 다양한 크기를 가진 pYK계 발현 벡터들을 제조하였다. 이 벡터를 대장균 pop2136에 형질전환하여 SDS-PAGE와 C-펩타이드 자기방사 면역법 등에 의해 프로인슐린 융합단백질의 발현이 가장 좋은 pYK10-9 발현 벡터를 얻을 수 있었다.
[실시예 4]
[pYD21의 발현 벡터의 재조합(제2도)]
사람의 프로인슐린 유전자를 포함하고 있는 발현 벡터 pYK10-9를 제한효소 Ssp Ⅰ(완충용액 : 50mM Tris-HCl, 10mM MgCl2, 100mM NaCl, 1mM DTT, pH 7.9)으로 절단하고 에탄올 침전하였다. 이 DNA를 Aat Ⅱ 완충용액(10mM Tris-HCl, 10mM MgCl2, 50mM KCl, 1mM DTT, pH 7.5)에 녹여 Aat Ⅱ로 절단한 후 2.9kb의 DNA 절편을 0.8% 아가로즈 젤 전기영동으로 분리하였다.
동시에 발현 벡터 pYK10-9를 제한효소 Nde Ⅰ(완충용액 : 50mM Tris-HCl, 10mM MgCl2, 100mM NaCl, 1mM DTT, pH 7.9)으로 절단하고, T4DNA폴리머라제 반응을 통하여 무딘말단끝을 만들었다. 이 DNA를 Aat Ⅱ로 절단하여 PR프로모우터, lac 리보솜 결합부위, 프로인슐린 유전자, 종료 유전자가 포함된 약 1.2kb의 DNA 절편을 0.8% 아가로즈 젤 전기영동으로 분리하였다.
이상에서 분리한 2.9kb DNA와 1.2kb DNA를 T4DNA 리가아제(완충용액 : 100mM Tris-HCl, 100mM MgCl2, 0.5mM ATP, pH 7.6)를 사용하여 접합시키고 대장균에 형질전환시켰다.
[실시예 5]
[pUC8-(Thr)6-PI 및 pYK10-9 발현 벡터의 프로인슐린 융합단백질의 형질발현]
클로닝된 네가지 발현 벡터의 프로인슐린 융합단백질 유전자 발현을 확인하기 위하여 형질발현 유도 후 SDS-PAGE나 C-펩타이드 자기방사 면역법을 사용하여 발현 정도를 확인하였다. 우선 대장균 JM103/pUC8-(Thr)6-PI를 1g/l의 포도당과 50㎍/ml의 앰피실린이 함유된 2x TY 배지에서 성장시켰다. 37℃에서 IPTG로 융합단백질의 발현을 유도하면서 배양하여 발현시켰다. 대장균 pop2136/pYK10-9도 상기의 배지에서 배양하였다. 배양은 32℃에서 하였으며 580nm의 파장에서 흡광도가 1정도일 때 배양온도를 42℃로 올려 PR프로모우터를 작동시켜 융합단백질의 발현을 유도하였다. 이상에서 형질발현된 균체에서 프로인슐린 융합단백질의 양은 SDS-PAGE로 측정하였고(제2도), 융합단백질 중 프로인슐린의 양은 C-펩타이드 자기방사 면역법으로 측정하였다.
첫번째 벡터인 pUC8-(Thr)6-PI의 최적 발현시간은 24시간이었고, 발현율은 약 20%이었다. 하지만 1리터당 생성된 총 프로인슐린의 양은 짧은 올리고펩타이드 유전자를 사용하였기 때문에 149mg이었다. 두번째 벡터인 pYK10-9의 최적 발현시간은 8시간으로 pUC8-(Thr)6-PI 벡터보다는 짧았다. pYK10-9를 갖는 대장균은 발현 단백질이 축적되면서도 성장을 할 수 있었다(제3도). pYK10-9의 발현율은 pUC8-(Thr)6-PI과 같은 20% 정도이나 1리터당 생성된 총 프로인슐린의 양은 249mg으로 pUC8-(Thr)6-PI보다 높았다. 이들 벡터의 특징을 요약하면 표 4와 같다.
[표 4]
프로인슐린 발현 벡터의 특징
* 발현율=융합단백질(Inclusion body)/총단백질(Total protein)×100(%)
[실시예 6]
[pYD21의 발현벡터의 회분배양법에 의한 형질발현]
재조합된 pYD21 발현 벡터의 형질발현은 회분배양으로 하였다. 먼저 500ml 플라스크내에 50ml의 종균배지(2x TY-포도당-앰피실린)에 재조합 대장균을 접종하여 34℃에서 13시간 배양하였다. 배양종균 20ml을 1L의 2x TY-포도당-앰피실린 배지가 담긴 2.5L 발효조에 접종하고 34℃에서 400rpm으로 공기 0.5L/분, pH 6.8의 조건하에서 배양하였다. 균체의 성장이 OD=4-5(at 580nm)일 때 온도를 42℃로 전이하여 발현을 유도하였다. 형질발현된 균체에서의 프로인슐린 융합단백질의 양은 SDS-PAGE 및 C-펩타이드 자기방사 면역법으로 측정하였다.
단일 프로모터-유전자 시스템을 갖는 pYK10-9의 경우 발현율이 20% 정도이고, 생성된 프로인슐린 양은 249mg/L였으나, 이중 프로모터-유전자 시스템을 갖는 pYD21의 경우 발현율이 28%정도이고, 생성된 프로인슐린 양은 328mg/L로 획기적으로 증가하였다. 또한 융합단백질의 발현시간도 단축되었다. pYK10-9와 pYD21의 형질발현 결과를 비교해 보면 표 5와 같다.
[표 5]
프로인슐린 발현 벡터의 특징
* 1 총 세포중량=건조 균체 중량
* 2 발현율=총 프로인슐린향/총 단백질량
[실시예 7]
[pYK10-9 및 pYD21의 발현벡터의 유가배양에 의한 융합단백질 형질발현 비교]
유가배양(Fed-batch fermentation)은 초기에 성장배지에서 회분배양(Batch fermentation)으로 시작하여 성장제한기질(growth limitng substrate)의 농도가 0에 이르렀을 때 성장제한 기질을 세포성장과 무게균형(Mass balance)을 수식으로 사전 예측하여 첨가하고 용존산소의 농도를 포화농도의 20% 이상으로 유지시키는 것을 특징으로 한다.
1차 종균은 15ml 배양튜브에 2ml의 종균배지(2x TY-포도당-앰피실린)에서 34℃에서 6시간 배양하였으며, 2차 종균은 1L 플라스크에 100ml의 종균배지에서 34℃에서 13시간 배양하였다. 배양된 2차 종균 40ml을 2L의 유가배양용 성장배지가 들어있는 5L 발효조에 접종하여 34℃에서 pH 6.8, 400rpm, 공기 5L/분(대기압)조건하에서 배양을 시작하였다. 균이 성장하여 배지의 포도당 농도가 0.1g/L에 도달하고 비생장속도(specific growth rate)가 0.4로 일정하게 되면 성장제한기질 첨가배지(표 2)를 페리스탈틱 핌프(peristaltic pump)를 통해 발효조내의 포도당 농도가 0.1g/L로 유지되도록 연속 첨가하였다. 균의 성장 OD가 580nm에서 45에 이르면 발효배지의 온도를 42℃로 올리고 첨가배지(표 3)를 일시에 넣고 발현을 유도하며 성장을 계속하였다. 균의 성장이 멈춘 발효액의 최종 흡광도, 건조 균체중량, 총단백질의 양, 프로인슐린 융합단백질의 생성량, 프로인슐린의 생성량, 발현율 등은 표 6과 같다. pYD21을 갖는 대장균에서 발현된 프로인슐린 융합단백질의 양은 4.76g/L, 프로인슐린의 양은 3.97g/L로 유가배양에 의해 현저히 증가함을 알 수 있었다.
반면 pYK10-9의 경우 융합단백질량은 2.70g/L, 프로인슐린양은 2.25g/L로서 pYD21의 그것보다 상대적으로 발현이 낮았다. 또한 전술한 바와같이 pYD21의 경우 최종 균체 OD가 55이면서, 발현율이 28%까지 육박하며, 건조균체 중량이 37.4g/L로서 75g/L의 pYK10-9에 비해 균체중량이 적어 세포파쇄 및 정제공정에 획기적 기여를 할 수 있는 것이 확인되었다.
pYK10-9와 pYD21을 함유한 대장균 pop2136의 유가배양 결과는 표 6과 같다. 표 6에서 보는 바와같이 각각의 독립된 형질 발현기구에 의해 조절되는 pYD21의 경우가 상기 언급한 여러가지 측면에서 훨씬 효율적임을 알 수 있다.
[표 6]
재조합 대장균 pop2136/pYD21과 pop2136/pYK10-9의 유가배양 발효결과 비교

Claims (4)

  1. 사람 프로인슐린 융합단백질 유전자를 대장균에서 발현시켜 사람 프로인슐린 융합단백질을 대량 생산함에 있어서, 사람 프로인슐린 융합단백질의 유전자를 Lac 리보솜 결합부위 유전자, (Thr)6를 코딩하는 유전자를 포함한 융합단백질 유전자 및 종료유전자와 함께 파지람다 PR프로모우터를 함유하는 대장균 발현 벡터에 삽입하여 제조한 발현 벡터 pYK10-9로부터 형질발현기구인 PR프로모우터와 인슐린 구조유전자, Lac 리보소옴 결합부위 유전자, (Thr)6를 코딩하는 유전자를 포함한 융합단백질 유전자 및 전사종료 터미네이터를 한 단위로 분리한 후, 이를 다시 pYK10-9에 삽입하여 각각의 독립적인 형질발현기구로부터 프로인슐린 융합단백질의 발현이 증가하도록 제조한 발현 벡터 pYD21를 대장균에 형질전환시킨 후, 그 형질전환된 대장균을 배양하여 사람 프로인슐린 융합단백질을 대장균내에서 발현시켜 생산 및 회수함을 특징으로 하는 사람 프로인슐린 융합단백질의 제조방법.
  2. 제1항에 있어서, 형질전환되는 대장균은 pop2136임을 특징으로 하는 사람 프로인슐린 융합단백질의 제조방법.
  3. PR프로모우터, Lac 리보소옴 결합부위, (Thr)6를 코딩하는 유전자를 포함하는 전구체 유전자를 가지는 인슐린 유전자 및 전사종료부위인 터미네이터를 한 단위로 두개 이상 단위를 포함하고 있는 대장균 발현 벡터.
  4. 제3항에 있어서, PR프로모우터, Lac 리보소옴 결합부위, (Thr)6를 코딩하는 유전자를 포함하는 전구체 유전자를 가지는 인슐린 유전자 및 전사종료부위인 터미네이터로 이루어진 단위 유전자를 두 단위 포함하고 있는 대장균 발현 벡터 pYD21.
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