KR20230119253A - 튜닝가능한 광 특성을 갖는 하이드로겔 입자 및 이를사용하기 위한 방법 - Google Patents

튜닝가능한 광 특성을 갖는 하이드로겔 입자 및 이를사용하기 위한 방법 Download PDF

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Abstract

하이드로겔 입자 및 세포 측정 응용분야에서 이들의 용도가 기술된다. 본원에 기술된 하이드로겔 입자는 표적 세포의 적어도 하나의 광학 특성과 실질적으로 유사한 적어도 하나의 광학 특성을 갖도록 선택적으로 튜닝가능하다. 이와 관련하여, 한 양태에서, 본원에 제공된 하이드로겔 입자는 샘플 중 표적 세포의 검출을 위한 보정 시약으로서 사용된다.

Description

튜닝가능한 광 특성을 갖는 하이드로겔 입자 및 이를 사용하기 위한 방법 {HYDROGEL PARTICLES WITH TUNABLE OPTICAL PROPERTIES AND METHODS FOR USING THE SAME}
관련 출원의 상호 참조
본 출원은 2015년 2월 9일에 출원된 미국 가출원 제 62/114,004 호 및 2015년 6월 24일자로 출원된 미국 가출원 제 62/184,192 호의 우선권을 청구하며, 이들 각각의 개시는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
유세포 측정은 개별 세포의 신속한 분리, 계수 및 특징 규명을 허용하는 기법으로 다양한 응용 분야의 임상 및 실험 환경에서 관례적으로 이용된다. 이 기법은 액체의 유체역학적으로 집중된 스트림으로 라이트 빔을 향하게 하는 것에 좌우된다. 그런 다음 스트림이 라이트 빔을 통과하는 지점으로 많은 검출기가 겨냥하게 된다: 하나는 라이트 빔과 일렬이고 (전방 산란 (Forward Scatter) 또는 FSC), 다수 개는 이에 직각임 (측방 산란 (Side Scatter) 또는 SSC). FSC는 세포 부피와 상관관계가 있으며, SSC는 입자의 내부 복잡성 (예를 들어, 핵의 형상, 세포질 과립의 양 및 타입 또는 막 거칠기)에 의존적이다. 이러한 상관관계의 결과로서, 상이한 특이적 세포 유형은 상이한 FSC 및 SSC를 나타내며, 이는 유세포 측정으로 세포 유형이 구별되게 한다.
그러나 특정 세포 유형을 식별할 수 있는 능력은 기구의 적절한 보정 즉, 관심 세포 타입의 정제된 세포의 사용에 의존적인 공정에 의존적이다. 이러한 정제된 세포를 수득하는 것은 배치-대-배치 변형이 발생하기 쉬운 고비용의 힘든 절차를 필요로 할 수 있다. 따라서, 유세포 측정기와 같은 장치에서 특정 세포 타입을 모방할 수 있는 튜닝가능한 광학 특성을 갖는 합성 조성물이 당업계에 필요하다.
발명의 개요
본 발명의 한 양태에서, 중합된 모노머를 포함하고 적어도 하나의 표면을 갖는 하이드로겔 입자가 제공된다. 하이드로겔 입자는 표적 세포의 적어도 하나의 광학 특성과 실질적으로 유사한 적어도 하나의 광학 특성을 갖는다. 한 구체예에서, 광학 특성은 측방 산란 프로파일 (SSC), 전방 산란 프로파일 (FSC), 형광 방출 프로파일 또는 이들의 조합이다. 표적 세포는 사용자가 지정하는 임의의 표적 세포일 수 있다. 예를 들어, 한 구체예에서, 표적 세포는 면역 세포, 줄기 세포 또는 암 세포이다.
또 다른 양태에서, 표적 세포의 분석을 위해 세포 측정 장치를 교정하는 방법이 제공된다. 한 구체예에서, 상기 방법은 표적 세포와 실질적으로 유사한 적어도 하나의 광학 특성을 갖는 하이드로겔 입자를 상기 장치에 삽입하는 것을 포함하며, 상기 하이드로겔 입자는 중합된 모노머를 포함하고 적어도 하나의 표면을 갖는다. 상기 방법은 세포 측정 장치를 사용하여 하이드로겔 입자의 적어도 하나의 광학 특성을 측정하는 것을 추가로 포함한다. 한 구체예에서, 적어도 하나의 광학 특성은 샘플에서 표적 세포를 검출하기 위한 기준으로서 사용된다.
추가의 또 다른 양태에서, 샘플에서 표적 세포를 검출하는 방법이 제공된다. 방법은 표적 세포와 실질적으로 유사한 적어도 하나의 광학 특성을 갖는 하이드로겔 입자를 상기 장치에 삽입하는 것을 포함하며, 상기 하이드로겔 입자는 중합된 모노머를 포함한다. 상기 방법은 세포 측정 장치를 사용하여 하이드로겔 입자의 적어도 하나의 광학 특성을 측정하는 것을 추가로 포함한다. 복수의 세포를 포함하는 샘플을 세포 측정 장치에 삽입하고, 복수의 세포 중 개별 세포의 적어도 하나의 광학 특성을 측정한다. 최종적으로, 광학 특성 측정에 기초하여, 표적 세포 또는 복수의 표적 세포가 샘플에 존재하는지의 여부가 결정된다.
본원에서 제공된 방법의 한 구체예에서, 하이드로겔 입자는 생분해성 모노머를 포함한다. 추가의 구체예에서, 생분해성 모노머는 모노사카라이드, 디사카라이드, 폴리사카라이드, 펩티드, 단백질 또는 단백질 도메인이다. 심지어 추가의 구체예에서, 생분해성 모노머는 아크릴아미드 또는 아크릴레이트로 작용기화된다.
도 1은 폴리스티렌 비드와 비교하여 기재된 하이드로겔 입자의 광학 특성을 예시한다.
도 2는 본 기재내용의 라벨링된 하이드로겔 입자를 생성하는 방법을 묘사한다.
도 3은 본 기재내용의 라벨링된 하이드로겔 입자의 명시야 및 형광 이미지를 제공한다.
도 4는 다양한 광학 산란 특성을 나타내는 세포 타입에 대한 칼리브런트(calibrant)로서의 본 기재내용의 하이드로겔 입자의 용도를 예시한다.
도 5는 유세포 측정기의 내부-드롭(drop) 지연과 하이드로겔 입자 직경의 상관관계를 보여주는 데이팅을 제공한다.
도 6은 중국 햄스터 난소 세포 (6a 및 6b) 및 본 기재내용의 하이드로겔 입자 (6c 및 6d)의 명시야 (도 6a 및 6c) 및 형광 (6b 및 6d) 이미지를 제공한다.
도 7은 형광-활성화된 세포 분류 (FACS)에 의해 측정된 바와 같은, 다양한 양의 DNA를 캡슐화시키는 하이드로겔 입자 대비 인간 협측 세포의 비교를 보여주는 데이터를 제공한다.
도 8은 다양한 농도의 나노입자를 캡슐화시키는 하이드로겔 입자에 대한 데이터를 제공하며, 이는 전방향 산란에 독립적인 측방향 산란의 튜닝을 입증한다.
도 9는 다양한 백분율의 폴리머로 생성된 하이드로겔 입자에 대한 데이터를 제공하며, 이는 전방향 산란에 의해 측정된 굴절률의 튜닝을 입증한다.
도 10은 요망되는 세포 군집 메트릭(metric)과 매칭되고/거나 이를 모방하기 위한 하이드로겔 파라미터 튜닝의 한 구체예를 보여준다.
도 11 및 12는 전방향 산란, 측방향 산란 및 하이드로겔 입자의 표면 특성을 조절하는 방법의 구체예를 보여주는 도면이다.
도 13은 다양한 하이드로겔 입자 (a) 및 (b) 및 시중의 혈액 샘플 (c)에 대한 산란 플롯이다.
발명의 상세한 설명
부정 관사 및 정관사는 이들이 사용되는 문맥이 달리 명확히 나타내지 않는 한 단수 및 복수 둘 모두를 포함하는 것으로 의도된다.
"적어도 하나" 및 "하나 이상"은 물품이 기록된 요소 중 하나 또는 하나 초과를 포함할 수 있음을 의미하는 것으로 상호교환적으로 사용된다.
달리 나타내지 않는 한, 본 명세서 및 청구범위에 사용된 성분의 양, 비 및 수치적 성질을 나타내는 모든 수, 반응 조건 및 기타 등등은 용어 "약"에 의해 모든 경우에서 변경될 수 있는 것으로 고려되는 것으로 이해해야 한다.
유세포 측정기에 대한 몇 가지 중요한 보정 측정은 레이저 간의 오프셋 시간 설정 및 대상체의 검출과 분류 사이의 지연 시간 계산과 같은 정확한 시간 분해를 필요로 한다. 장비 내부의 유동 조건으로 인해, 이러한 타이밍 파라미터의 정확한 설정은 분석될 세포와 동일한 크기의 보정 입자의 사용을 필요로 한다. 타이밍 보정은 전형적으로, 여기 소스의 반응을 보정하고 레이저 간 타이밍 지연 및 분류 지연을 설정하기 위한 가변 형광 강도를 갖는 폴리스티렌 비드를 사용하여 수행된다. 유세포 측정기는 또한, 표적 샘플의 크기 및 입도 또는 복잡성의 일반적인 척도인 전방향 및 측방향 산란 신호를 사용하여 보정될 수 있다. 이러한 보정은 세포측정기의 정확한 성능 및 세포 군집의 임의의 다운스트림 분석 또는 분류에 중요하다. 기재된 하이드로겔 입자는 튜닝된 산란 특성을 나타내며 다양한 포유동물 또는 박테리아 세포 타입에 대한 보정 시약으로서 사용하기에 적합하다. 산란은 임상, 식품 안전, 및 연구 목적을 위한 이종 혼합물에서 세포 타입을 구별하기 위한 표준 측정 기준이다.
폴리스티렌 입자가 일부 응용 분야에서 레이저 간 및 분류 지연을 설정하는데 사용될 수 있지만, 많은 진핵 세포 타입은 시중에서 입수가능한 폴리스티렌 입자 (1-20μm) 크기 범위를 벗어나며, 이는 이러한 표적에 대한 유세포 측정을 정확하게 보정하는 것을 거의 불가능하게 한다. 또한, 도 1에 도시된 바와 같이, 폴리스티렌 입자는 세포 복잡성의 일반적인 척도인 측방 산란과 같은 보유할 수 있는 광학 특성이 근본적으로 제한된다. 따라서, 폴리스티렌 입자는 유세포 측정에 사용된 2개의 가장 중요한 수동 광학 측정으로 제한된다: 각각 표적의 크기 및 복잡성을 측정하는 FSC (전방 산란), 및 SSC (측방 산란). 폴리스티렌의 이러한 제한으로 인해, 사용자는 실험을 위한 형광 강도, 레이저 간 지연, 분류 지연, 크기 및 세포 복잡성을 보정하기 위해서 정제된 세포주에 의존해야 한다. 이는 유세포 측정 변동 및 연구 파이프라인의 비용을 현저하게 증가시키는 길고 노동-집약적인 공정이다. 더욱 중요하게는, 이러한 보정 세포주는 생물학적 변동을 일으켜 데이터 해석의 차이를 초래한다.
게다가, 유세포 측정의 보정을 위한 질 관리 (QC)는 또한, 이러한 기구가 임상 분야 예를 들어, 다운스트림 세포 치료를 위한 인간 T-조절 세포 또는 줄기 세포를 분리하는데 사용되는 경우, 중요한 고려사항이다. FDA는 환자에 투여하기 전에 세포 요법 생성물의 무균성, 정체, 순도, 및 효능이 입증되어야 함을 규정하고 있다 (Riley et al. (2009). Immunity 30, pp. 656-665). 따라서, 폴리스티렌 QC 입자로의 세포 군집의 오염은 폴리스티렌이 특정 암에 연루되기 때문에 문제가 될 수 있다. 또한, 환자로의 투여 후 효소에 의해 분해되거나 내부적으로 소화되는 QC 표준물로 오염되는 세포 군집은 오염 문제가 발생하더라도 잠재적으로 이를 극복한다.
본 발명은 하기 논의된 바와 같이 이러한 및 다른 요건을 다룬다.
한 양태에서, 복수의 하이드로겔 입자를 포함하는 조성물이 제공되며, 이때 하이드로겔 입자 중 복수의 개별 하이드로겔 입자 각각은 표적 세포의 하나 이상의 광학 특성과 실질적으로 유사한 하나 이상의 광학 특성을 갖는다. 복수의 하이드로겔 입자 중 개별 하이드로겔 입자 각각은 독립적으로 하이드로겔을 포함하며, 이는 즉 호모폴리머 또는 코폴리머를 형성하기 위해 하나 이상의 모노머를 중합시킴으로써 합성된다. 추가로 하기 논의된 바와 같이, 이작용성 모노머의 사용은 예를 들어, 형광 염료, 세포 표면 마커 또는 이의 에피토프 결합 단편, 또는 이들의 조합물로 하이드로겔을 추가로 유도체화시키는 것을 허용한다. 요망되는 세포 하위군집 메트릭을 충족/매칭시키기 위한 하이드로겔 파라미터 튜닝의 예는 도 10에 제공된다. 하이드로겔의 특성을 튜닝하기 위한 방법은 본원에 기재되어 있다. 하이드로겔 성분 및 이의 농도를 포함하는 다양한 파라미터를 조절하는 능력은 광범위한 세포 예를 들어, 본원에 기재된 세포 타입 중 하나를 모방하도록 입자를 튜닝하는 능력을 허용한다.
상기 제공된 바와 같이, 한 양태에서, 본 발명은 표적 세포의 하나 이상의 광학 특성과 실질적으로 유사한 하나 이상의 광학 특성을 갖는 개별적 하이드로겔 입자를 각각 제공한다. 한 구체예에서, 하나 이상의 광학 특성은 측방 산란 프로파일, 전방 산란 프로파일 또는 이차 마커 프로파일 예컨대, 형광 마커 프로파일 예를 들어, 하이드로겔 입자의 표면에 결합하는 형광-라벨링된 항체의 형광-마커 프로파일이다. 본원에 사용된 바와 같은 "실질적으로 유사한"은 적어도 40% 유사, 적어도 50% 유사, 적어도 60% 유사, 적어도 70% 유사, 적어도 80% 유사, 적어도 90% 유사, 적어도 95% 유사, 적어도 96% 유사, 적어도 97% 유사, 적어도 98% 유사 또는 적어도 99% 유사를 의미한다.
본 발명은 부분적으로, 하이드로겔 입자의 하나 이상의 광학 특성이 하이드로겔 입자의 조성을 변경함으로써, 예를 들어, 조성물에서 초기 모노머 (또는 코-모노머)의 양을 변경시킴으로써, 표면 작용기화를 변경시킴으로써, 중합 개시제의 양을 변경시킴으로써 또는 가교제의 양을 변경함으로써 독립적으로 조절될 수 있다는 예상치 못한 발견에 기초한다. 예를 들어, 측방 산란 (SSC)은 전방 산란 (FSC)에 실질적으로 영향을 미치지 않고 조절될 수 있으며, 그 반대의 경우도 마찬가지이다. 또한, 하이드로겔 입자의 광학 특성 (예를 들어, 굴절률)은 입자 밀도에 실질적인 영향을 미치지 않으면서 튜닝될 수 있다. 이는 유세포 측정 또는 (형광-활성화된 세포 분류) FACS와 같은 세포 측정 방법에서 세포에 대한 대용물로서 작용하는 하이드로겔 입자가 이러한 검정에서 기능하기 위해서 최소 밀도를 필요로 하기 때문에 놀랍고 유용한 특징이다.
또 다른 양태에서, 하이드로겔 입자를 생성하기 위한 방법이 제공되며, 여기에서 하이드로겔 입자는 하나 이상의 표적 세포의 광학 특성과 실질적으로 유사한 하나 이상의 광학 특성을 갖는다. 한 구체예에서, 하이드로겔 입자는 소정의 광학 특성을 갖는다. 한 구체예에서, 광학 특성은 SSC, FSC, 형광 방출 또는 이들의 조합이다.
추가의 또 다른 양태에서, 표적 세포의 분석을 위해 세포 측정 장치를 보정하는 방법이 제공된다. 한 구체예에서, 상기 방법은 (a) 표적 세포의 광학 특성과 실질적으로 유사한 광학 특성을 갖는 하이드로겔 입자를 장치 내로 삽입하고; b) 세포 측정 장치를 사용하여 하이드로겔 입자의 광학 특성을 측정함으로써 표적 세포의 분석을 위한 세포 측정 장치를 보정하는 것을 포함한다. 세포 측정 장치는 당업계에 공지되어 있으며, 유세포 측정 및 FACS를 수행하기 위한 시중에서 입수가능한 장치를 포함한다.
상기 제공된 바와 같이, 본 발명의 한 양태에서, 복수의 하이드로겔 입자를 포함하는 조성물이 제공된다. 하이드로겔은 마크로분자 삼차원 네트워크를 포함하는 물질이며, 이는 물이 존재할 경우 팽창되고 물의 부재하에 (또는 이의 양의 감소에 의해) 줄어드나 물에서는 용해되지 않는다. 팽창 즉, 물의 흡수는 마크로분자 네트워크 내에 분산되거나 이에 부착된 친수성 작용기의 존재의 결과이다. 인접한 마크로분자 사이의 가교는 이러한 하이드로겔의 불수용성을 초래한다. 가교는 화학적 (즉, 공유) 또는 물리적 (즉, 반데르 발스 힘, 수소- 결합, 이온력, 등) 결합으로 인한 것일 수 있다. 합성으로 제조된 하이드로겔은 모노머 물질을 중합시켜 백본을 형성시키고 백본을 가교제로 가교시킴으로써 제조될 수 있다. 본원에 언급된 바와 같이, 용어 "하이드로겔"은 탈수된 상태이든지 수화된 상태이든지 마크로분자 물질을 지칭한다. 특정 가치가 있는 하이드로겔의 특성은 물질이 탈수화되든지 수화되든지 일반적인 형상을 유지한다는 것이다. 따라서, 하이드로겔이 탈수된 상태에서 대략 구형인 경우, 이는 수화된 상태에서 구형일 것이다.
한 구체예에서, 본원에 기재된 하이드로겔 입자는 약 30% 초과, 약 40% 초과, 약 50% 초과, 약 55% 초과, 약 60% 초과, 약 65% 초과, 약 70% 초과, 약 75% 초과, 약 80% 초과, 약 85% 초과, 약 90% 초과 또는 약 95% 초과의 물을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 하이드로겔 입자는 약 10 중량% 내지 약 95 중량%, 또는 약 20 중량% 내지 약 95 중량%, 또는 약 30 중량% 내지 약 95 중량% 또는 약 40 중량% 내지 약 95 중량%, 또는 약 50 중량% 내지 약 95 중량%, 또는 약 60 중량% 내지 약 95 중량%, 또는 약 70 중량% 내지 약 95 중량% 중량, 또는 약 80 중량% 내지 약 95 중량%의 물 함량을 갖는다.
입자 형태의 본원에 제공된 하이드로겔은 본원에 제공된 모노머 중 하나 이상을 중합함으로써 합성된다. 합성이 수행되어 개별적인 하이드로겔 입자를 형성한다. 한 구체예에서, 모노머 물질 (모노머)은 호모폴리머를 형성하도록 중합된다. 그러나, 또 다른 구체예에서, 다양한 모노머 단위체 (즉, 코-모노머)의 코폴리머가 합성되고 본원에 제공된 방법에 사용된다. 한 구체예에서, 본원에 기재된 방법 및 조성물에 사용된 모노머 또는 코-모노머는 이작용성 모노머이거나 이작용성 모노머를 포함한다 (코-모노머가 사용되는 경우). 한 구체예에서, 하이드로겔은 가교제의 존재하에 합성된다. 추가의 구체예에서, 하이드로겔은 중합 개시제의 존재하에 합성된다.
모노머의 양은 예를 들어, 표적 세포의 것과 실질적으로 유사한 특정 광학 특성을 얻기 위해 본 발명의 사용자에 의해 변화될 수 있다. 한 구체예에서, 모노머 성분(들) (즉, 모노머, 코-모노머, 이작용성 모노머, 또는 이들의 조합물 예를 들어, 다양한 가교 비의 비스/아크릴아미드, 알릴 아민 또는 이차 라벨링/컨쥬게이션 또는 알기네이트를 위한 화학 작용기를 제공하는 기타 코-모노머)은 하이드로겔의 약 10 중량% 내지 약 95 중량%로 존재한다. 추가의 구체예에서, 모노머 성분(들)은 하이드로겔의 약 15 중량% 내지 약 90 중량%, 또는 하이드로겔의 약 20 중량% 내지 약 90 중량%로 존재한다.
본 발명에 사용하는데 이용 가능한 다양한 모노머 및 가교 화학물질의 예는 문헌 [Thermo Scientific Crosslinking Technical Handbook entitled “Easy molecular bonding crosslinking technology”]에 제공된다 (모든 목적에 있어서 그 기재내용이 전체가 참조로 통합된 tools.lifetechnologies.com/content/sfs/brochures/1602163-Crosslinking-Reagents-Handbook.pdf에서 입수가능). 예를 들어, 하이드라진 (예를 들어, NHS 에스테르 화합물과 함께) 또는 EDC 커플링 반응 (예를 들어, 말레이미드 화합물과 함께)을 이용하여 본 발명의 하이드로겔을 구성할 수 있다.
한 구체예에서, 본원에서 제공되는 하이드로겔에 사용하기 위한 모노머는 락트산, 글리콜산, 아크릴산, 1-하이드록시에틸 메타크릴레이트, 에틸 메타크릴레이트, 2-하이드록시에틸 메타크릴레이트 (HEMA), 프로필렌 글리콜 메타크릴레이트, 아크릴아미드, N-비닐피롤리돈 (NVP), 메틸 메타크릴레이트, 글리시딜 메타크릴레이트, 글리세롤 메타크릴레이트 (GMA), 글리콜 메타크릴레이트, 에틸렌 글리콜, 푸마르산, 이들의 유도체화된 버젼 또는 이들의 조합물이다.
한 구체예에서, 하기 모노머 중 하나 이상이 본 발명의 하이드로겔을 형성하기 위해 본원에서 사용된다: 2-하이드록시에틸 메타크릴레이트, 하이드록시에톡시에틸 메타크릴레이트, 하이드록시디에톡시에틸 메타크릴레이트, 메톡시에틸 메타크릴레이트, 메톡시에톡시에틸 메타크릴레이트, 메톡시디에톡시에틸 메타크릴레이트, 폴리(에틸렌 글리콜) 메타크릴레이트, 메톡시-폴리(에틸렌 글리콜) 메타크릴레이트, 메타크릴산, 소듐 메타크릴레이트, 글리세롤 메타크릴레이트, 하이드록시프로필 메타크릴레이트, 하이드록시부틸 메타크릴레이트 또는 이들의 조합물.
또 다른 구체예에서, 하기 모노머 중 하나 이상이 튜닝가능한 하이드로겔을 형성하기 위해 본원에서 사용된다: 모든 목적에 있어서 그 전문이 본원에 참조로서 통합된 미국 특허 번호 6,657,030에 기술된 바와 같은, 페닐 아크릴레이트, 페닐 메타크릴레이트, 벤질 아크릴레이트, 벤질 메타크릴레이트, 2-페닐에틸 아크릴레이트, 2-페닐에틸 메타크릴레이트, 2-페녹시에틸 아크릴레이트, 2-페녹시에틸 메타크릴레이트, 페닐티오에틸 아크릴레이트, 페닐티오에틸 메타크릴레이트, 2,4,6-트리브로모페닐 아크릴레이트, 2,4,6-트리브로모페닐 메타크릴레이트, 펜타브로모페닐 아크릴레이트, 펜타브로모페닐 메타크릴레이트, 펜타클로로페닐 아크릴레이트, 펜타클로로페닐 메타크릴레이트, 2,3-디브로모프로필 아크릴레이트, 2,3-디브로모프로필 메타크릴레이트, 2-나프틸 아크릴레이트, 2-나프틸 메타크릴레이트, 4-메톡시벤질 아크릴레이트, 4-메톡시벤질 메타크릴레이트, 2-벤질옥시에틸 아크릴레이트, 2-벤질옥시에틸 메타크릴레이트, 4-클로로페녹시에틸 아크릴레이트, 4-클로로페녹시에틸 메타크릴레이트, 2-페녹시에톡시에틸 아크릴레이트, 2-페녹시에톡시에틸 메타크릴레이트, N-페닐 아크릴아미드, N-페닐 메타크릴아미드, N-벤질 아크릴아미드, N-벤질 메타크릴아미드, N,N-디벤질 아크릴아미드, N,N-디벤질 메타크릴아미드, N-디페닐메틸 아크릴아미드 N-(4-메틸페닐)메틸 아크릴아미드, N-1-나프틸 아크릴아미드, N-4-니트로페닐 아크릴아미드, N-(2-페닐에틸)아크릴아미드, N-트리페닐메틸 아크릴아미드, N-(4-하이드록시페닐)아크릴아미드, N,N-메틸페닐 아크릴아미드, N,N-페닐 페닐에틸 아크릴아미드, N-디페닐메틸 메타크릴아미드, N-(4-메틸 페닐)메틸 메타크릴아미드, N-1-나프틸 메타크릴아미드, N-4-니트로페닐 메타크릴아미드, N-(2-페닐에틸)메타크릴아미드, N-트리페닐메틸 메타크릴아미드, N-(4-하이드록시페닐)메타크릴아미드, N,N-메틸페닐 메타크릴아미드, N,N'-페닐 페닐에틸 메타크릴아미드, N-비닐카르바졸, 4-비닐피리딘, 2-비닐피리딘.
합성 모노머 및 바이오-모노머 둘 모두가 합성 성분 및 바이오-성분 (예를 들어, 생체분자에 존재하는 펩티드, 단백질, 모노사카라이드, 디사카라이드, 폴리사카라이드, 일차 아민 설프히드릴, 카르보닐, 탄수화물, 카르복실산)을 포함하는 합성 하이드로겔, 바이오-하이드로겔 또는 하이브리드 하이드로겔을 형성하기 위해 본원에 제공된 하이드로겔에 사용될 수 있다. 예를 들어, 단백질, 펩티드 또는 탄수화물은 화학적으로 적합한 코-모노머 및 가교 화학물질과 조합되어 합성 모노머 (또는 폴리머)를 포함하거나 포함하지 않는 하이드로겔을 형성하기 위한 개별 모노머로서 사용될 수 있다 (예를 들어, 모든 목적에 있어서 그 기재내용이 전체가 참조로 통합되고 또한, tools.lifetechnologies.com/content/sfs/brochures/1602163-Crosslinking-Reagents-Handbook.pdf에서도 입수가능한 문헌[Thermo Scientific Crosslinking Technical Handbook entitled “Easy molecular bonding crosslinking technology”] 참조). 적합한 가교 화학물질은 비제한적으로, 아민, 카르복실 및 기타 반응성 화학 측 기를 포함한다. 본원에 기재된 하이드로겔 및 모노머에 사용할 수 있는 대표적인 반응기는 하기 표 1에 제공된다.
일반적으로, 당업자에게 일반적으로 공지된 임의의 형태의 중합 화학물질/방법이 폴리머를 형성하는데 사용될 수 있다. 일부 구체예에서, 중합은 자외선-유도된 라디칼 형성 및 반응 진행에 의해 촉매될 수 있다. 기타 구체예에서, 본 기재내용의 하이드로겔 입자는 아크릴아미드의 중합 또는 아크릴레이트의 중합에 의해 생성된다. 예를 들어, 한 구체예에서, 아크릴아미드는, 그 기재내용이 모든 목적에 있어서 그 전체가 참조로 통합된 미국 특허 번호 6,107,365에 기술된 바와 같은 중합가능한 탄수화물 유도체화된 아크릴아미드이다. 상기 특허에 기술되고 당업자에게 공지된 바와 같이, 아크릴아미드 기의 당으로의 특이적 부착은 다양한 모노사카라이드 및 고등 등급의 폴리사카라이드 예를 들어, 합성 폴리사카라이드 또는 천연 공급원으로부터 유래된 폴리사카라이드 예컨대, 혈청 또는 조직에서 발견된 글리코단백질에 용이하게 적용된다.
한 구체예에서, 아크릴레이트-작용기화된 폴리(에틸렌) 글리콜 모노머는 하이드로겔 모노머로서 사용된다. 예를 들어, 한 구체예에서 PEG는 아크릴레이트 또는 아크릴아미드 작용기화된 PEG이다.
일부 구체예에서, 하이드로겔 입자는 적어도 하나의 이작용성 모노머와 중합된 일작용성 모노머를 포함한다. 한 예는 비제한적으로, 아크릴아미드 및 비스-아크릴아미드 (이작용성 모노머)를 사용한 폴리-아크릴아미드 폴리머의 형성을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 본원에 제공된 하이드로겔 입자는 제 2의 이작용성 모노머와 중합된 이작용성 모노머를 포함한다. 한 예는 비제한적으로, 광범위한 추가적인 화학물질을 함유하는 아크릴아미드, 비스-아크릴아미드, 및 비스-아크릴아미드 구조적 동류물과 같은 적합한 화학물질을 함유하는 혼합된 조성물과의 폴리머의 형성을 포함한다. 화학적으로 적합한 모노머, 이작용성 모노머, 및 혼합된 조성물의 범위는 당업자에게는 자명하며 당업자에게 공지된 화학 반응 원리에 따른다. (문헌 [Thermo handbook and acrylamide polymerization handbook] 참조). 예를 들어, 각각의 기재내용이 모든 목적에 있어서 그 전체가 참조로 통합된 문헌 [the Thermo Scientific Crosslinking Technical Handbook entitled “Easy molecular bonding crosslinking technology”] (tools.lifetechnologies.com/content/sfs/brochures/1602163-Crosslinking-Reagents-Handbook.pdf에서 입수가능) 및 문헌 [the Polyacrylamide Emulsions Handbook ] (SNF Floerger, snf.com.au/downloads/Emulsion_Handbook_E.pdf에서 입수가능) 참조.
한 구체예에서, 본원에 제공된 하이드로겔 입자는 중합가능한 일작용성 모노머를 포함하며, 일작용성 아크릴 모노머이다. 본원에 사용하기 위한 일작용성 아크릴 모노머의 비제한적 예는 아크릴아미드; 메타크릴아미드; N-알킬아크릴아미드 예컨대, N-에틸아크릴아미드, N-이소프로필아크릴아미드 또는 N-3차부틸아크릴아미드; N-알킬메타크릴아미드 예컨대, N-에틸메타크릴아미드 또는 N이소프로필메타크릴아미드; N,N-디알킬아크릴아미드 예컨대, N,N-디메틸아크릴아미드 및 N,N-디에틸-아크릴아미드; N-[(디알킬아미노)알킬] 아크릴아미드 예컨대, N-[3디메틸아미노) 프로필]아크릴아미드 또는 N-[3-(디에틸아미노)프로필] 아크릴아미드; N-[(디알킬아미노) 알킬] 메타크릴아미드 예컨대, N-[3-디메틸아미노)프로필] 메타크릴아미드 또는 N-[3-(디에틸아미노) 프로필] 메타크릴아미드; (디알킬아미노)알킬 아크릴레이트 예컨대, 2-(디메틸아미노)에틸 아크릴레이트, 2-(디메틸아미노)프로필 아크릴레이트, 또는 2-(디에틸아미노)에틸 아크릴레이트; 및 (디알킬아미노) 알킬 메타크릴레이트 예컨대, 2-(디메틸아미노) 에틸 메타크릴레이트이다.
이작용성 모노머는 본 기재내용의 일작용성 모노머와 중합되어 제 2 반응 예를 들어, 형광단 또는 세포 표면 수용체 (또는 이의 도메인)의 컨쥬게이션에 참여할 수 있는 제 2 작용기를 추가로 함유하는 본원에 기술된 바와 같은 하이드로겔을 형성할 수 있는 임의의 모노머이다.
일부 구체예에서, 이작용성 모노머는 알릴 아민, 알릴 알콜, 알릴 이소티오시아네이트, 알릴 클로라이드, 및 알릴 말레이미드로 구성된 군으로부터 선택된다.
이작용성 모노머는 이작용성 아크릴 모노머일 수 있다. 이작용성 아크릴 모노머의 비제한적 예는 N,N'-메틸렌비스아크릴아미드, N,N'메틸렌비스메타크릴아미드, N,N'-에틸렌 비스아크릴아미드, N,N'-에틸렌 비스메타크릴아미드, N,N'프로필렌비스아크릴아미드 및 N,N'-(1,2-디하이드록시에틸렌)비스아크릴아미드이다.
고등급의 분지된 사슬 및 선형 코-모노머는 모든 목적에 있어서 그 전체가 본원에 참조로 통합된 미국 특허 번호 6,657,030에 기술된 바와 같이, 폴리머 믹스에서 치환되어 폴리머 밀도를 유지하면서 굴절률을 조절할 수 있다.
일부 구체예에서, 하이드로겔은 하이드로겔의 광학 특성을 조절하는 분자를 포함한다. 하이드로겔의 광학 특성을 변경할 수 있는 분자는 추가로 하기에서 논의된다.
한 구체예에서, 개별적 하이드로겔 입자 또는 이의 복수는 하이드로겔 모노머로서 생분해성 폴리머를 포함한다. 한 구체예에서, 생분해성 폴리머는 폴리락트디 (PLA), 폴리글리콜리드 (PGA), 폴리카프로락톤 (PCL), 및 이들의 코폴리머를 기반으로 하는 폴리(에스테르)이다. 한 구체예에서, 생분해성 폴리머는 탄수화물 또는 단백질, 또는 이들의 조합물이다. 예를 들어, 한 구체예에서, 모노사카라이드, 디사카라이드 또는 폴리사카라이드 (예를 들어, 글루코스, 수크로스, 또는 말토덱스트린) 펩티드, 단백질 (또는 이들의 도메인)이 하이드로겔 모노머로서 사용된다. 기타 생분해성 폴리머는 PHB-PHV 부류의 폴리(하이드록시알카노에이트), 추가의 폴리(에스테르), 및 천연 폴리머 예를 들어, 변형된 폴리(사카라이드), 예를 들어, 전분, 셀룰로스 및 키토산을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 생체적합성 폴리머는 접착 단백질, 셀룰로스, 탄수화물, 전분 (예를 들어, 말토덱스트린, 2-하이드록시에틸 전분, 알긴산), 덱스트란, 리그닌, 폴리아미노산, 아미노산, 또는 키틴이다. 이러한 생분해성 폴리머는 시중에서 예를 들어, Sigma Aldrich (St. Louis, MO)로부터 입수가능하다.
한 구체예에서, 단백질은 단지 천연 아미노산만을 포함한다. 그러나, 본 발명은 이에 한정되지 않는다. 예를 들어, 자가-어셈블링 인공 단백질 및 비-천연 아미노산을 갖는 단백질 (예를 들어, 합성 접근법을 통해 합성에 의해 도입되거나 비-리보좀 펩티드 내로 혼입된 아미노산, 예를 들어, 그 기재내용이 모든 목적에 있어서 그 전체가 참조로 통합된 문헌 [Zhang et al. (2013). Current Opinion in Structural Biology 23, pp. 581-587] 참조), 또는 이의 단백질 도메인이 또한, 하이드로겔 모노머로서 사용될 수 있다. 이러한 조성물 내로 혼입될 수 있는 비-천연 (비자연적) 아미노산의 범위는 당업자에게 널리 공지되어 있다 (Zhang et al. (2013). Current Opinion in Structural Biology 23, pp. 581-587; 모든 목적에 있어서 그 전체가 참조로 포함됨). 한 구체예에서 생분해성 폴리머는 코-모노머로서 즉, 모노머의 혼합물에 사용된다. 한 구체예에서 생분해성 폴리머는 이작용성 모노머이다.
한 구체예에서, 바이오모노머는 아크릴아미드 또는 아크릴레이트로 작용기화된다. 예를 들어, 한 구체예에서, 중합성 아크릴아미드 작용기화된 생체분자는 아크릴아미드 또는 아크릴레이트 작용기화된 단백질 (예를 들어, 아크릴아미드 작용기화된 콜라겐 또는 작용기화된 콜라겐 도메인), 아크릴아미드 또는 아크릴레이트 작용기화된 펩티드, 또는 아크릴아미드 또는 아크릴레이트 작용기화된 모노사카라이드, 디사카라이드 또는 폴리사카라이드이다.
임의의 모노사카라이드, 디사카라이드 또는 폴리사카라이드 (작용기화되든 그렇지 않든)는 하이드로겔 모노머로서 사용될 수 있다. 한 구체예에서, 아크릴아미드 또는 아크릴레이트 작용기화된 모노사카라이드, 디사카라이드 또는 폴리사카라이드는 중합성 하이드로겔 모노머로서 사용된다. 한 구체예에서, 구조적 폴리사카라이드는 중합성 하이드로겔 모노머로서 사용된다. 추가의 구체예에서, 구조적 폴리사카라이드는 아라비녹실란, 셀룰로스, 키틴 또는 펙틴이다. 또 다른 구체예에서, 알긴산 (알기네이트)은 중합성 하이드로겔 모노머로서 사용된다. 추가의 또 다른 구체예에서, 글리코사미노글리칸 (GAG)이 본원에 제공된 하이드로겔에서 중합성 모노머로서 사용된다. 추가의 구체예에서, GAG는 콘드로이틴 설페이트, 데르마탄 설페이트, 케라틴 설페이트, 헤파린, 헤파린 설페이트 또는 히알루론산 (또한 히알루론 또는 히알루로네이트로서 당업계에서 불림)이며 중합성 하이드로겔 모노머로서 사용된다. 적합한 바이오모노머 및 이들의 반응성 화학물질의 추가적인 범위는 당업자에게 공지되어 있으며 일반적인 화학 반응성 원리에 따른다.
혼입될 수 있는 추가적인 범위의 생체적합성 모노머는 당업계에 공지되어 있다 (예를 들어, 모든 목적에 있어서 그 전체가 본원에 참조로 통합된 문헌 [Shastri (2003). Current Pharmaceutical Biotechnology 4, pp. 331-337]에 기재된 비-생분해성 생체적합한 모노머 참조). 기타 모노머는 그 기재내용 각각이 이들의 전체가 본원에 참조로 통합된 문헌 [de Moraes Porto (2012). Polymer Biocompatibility, Polymerization, Dr. Ailton De Souza Gomes (Ed.), ISBN: 978-953-51-0745-3; InTech, DOI: 10.5772/47786; Heller et al. (2010). Journal of Polymer Science Part A: Polymer Chemistry 49, pp. 650-661; Final Report for Biocompatible Materials (2004), The Board of the Biocompatible Materials and the Molecular Engineering in Polymer Science programmes, ISBN 91-631-4985-0]에 제공된다.
한 구체예에서, 본원에 기술된 하이드로겔에 사용하기 위한 생체적합성 모노머는 에틸글리콜 디메타크릴레이트 (EGDMA), 2-하이드록시에틸 메타크릴레이트 (HEMA), 메틸메타크릴레이트 (MMA), 메타크릴옥시메틸트리메틸실란 (TMS-MA), N-비닐-2-피롤리돈 (N-VP), 스티렌, 또는 이들의 조합물을 포함한다.
본 발명에 유용한 천연 발생 하이드로겔은 천연 공급원 예컨대, 식물, 조류, 진균류, 효모, 해양 무척추동물 및 절지 동물로부터 입수가능한 다양한 폴리사카라이드를 포함한다. 비제한적 예는 아가로스, 덱스트란, 키틴, 셀룰로스-기반 화합물, 전분, 유도체화된 전분, 및 기타 등등을 포함한다. 이들은 일반적으로, 폴리사카라이드 백본의 주요 부분으로서 반복 글루코스 단위를 가질 것이다. 이러한 폴리사카라이드에 대한 가교 화학물질은 당업계에 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Thermo Scientific Crosslinking Technical Handbook entitled “Easy molecular bonding crosslinking technology”] 참조) (tools.lifetechnologies.com/content/sfs/brochures/1602163-Crosslinking-Reagents-Handbook.pdf에서 또한 입수가능).
한 구체예에서, 히알루로난은 하이드로겔 모노머 (단일 모노머 또는 코-모노머로서)로서 사용된다. 한 구체예에서, 히알루로난은 예를 들어, 아크릴레이트 또는 아크릴아미드로 작용기화된다. 히알루로난은 교차 β-1,4 및 β-1,3 글리코시드 결합을 통해 함께 연결된 글루쿠론산 및 N-아세틸글루코사민의 디사카라이드 반복 단위로 구성된 고분자량 GAG이다. 인체에서, 히알루로네이트는 피부, 탯줄, 활액, 및 유리체액을 포함하는 여러 연성 결합 조직에서 발견된다. 따라서, 한 구체예에서, 피부 세포, 제대 세포 또는 유리체액 세포의 하나 이상의 광학 특성이 모방되는 것이 바람직한 경우, 한 구체예에서, 히알루로난이 하이드로겔 모노머로서 사용된다. 하이드로겔 입자를 제작하는 방법은 그 기재내용이 모든 목적에 있어서 그 전체가 참조로 통합된 문헌 [Xu et al. (2012). Soft Matter. 8, pp. 3280-3294]에 기술되어 있다. 상기 문헌에 기술된 바와 같이, 히알루로난은 요망되는 가교 화학물질 및 하이드로겔 입자를 형성하는데 사용된 기타 모노머에 따라 다양한 반응성 핸들로 유도체화될 수 있다.
추가의 기타 구체예에서, 무작위로 분포된 β-(1-4)-연결된 D-글루코사민 (탈아세틸화된 단위) 및 N-아세틸-D-글루코사민 (아세틸화된 단위)로 구성된 선형의 폴리사카라이드인 키토산은 하이드로겔 모노머로서 (단일 모노머 또는 코-모노머로서) 사용된다.
하이드로겔 모노머 또는 코-모노머로서 사용하기 위한 기타 폴리사카라이드는 비제한적으로, 아가, 아가로스, 알긴산, 알구론산, 알파 글루칸, 아밀로펙틴, 아밀로스, 아라비녹실란, 베타-글루칸, 칼로스, 캡술란, 카라기난 폴리사카라이드 (예를 들어, 카파, 이오타 또는 람다 부류), 셀로덱스트린, 셀룰린, 셀룰로스, 키틴, 키토산, 크리솔아미나린, 쿠르들란, 사이클로덱스트린, 알파-사이클로덱스트린, 덱스트린, 피콜, 프룩탄, 푸코이단, 갈락토글루코만난, 갈락토만난, 갈락토사미노갈락탄, 겔란 검, 글루칸, 글루코마난, 글루코루녹실란, 글리코칼릭스, 글리코겐, 헤미셀룰로스, 호모폴리사카라이드, 하이프로멜로스, 아이도덱스트린, 이눌린, 케피란, 라미나린, 렌티난, 레반 폴리사카라이드, 리케닌, 만난, 혼합-연결 글루칸, 파라밀론, 펙트산, 펙틴, 펜타스타치, 피토글리코겐, 플레우란, 폴리덱스트로스, 폴리사카라이드 펩티드, 포르피란, 풀루란, 쉬조필란, 시니스트린, 시조피란, 웰란 검, 잔탄 검, 자일란, 자일로글루칸, 자이모산, 또는 이들의 조합물을 포함한다. 전반적으로 기술된 바와 같이, 하이드로겔에 사용된 요망되는 가교 화학물질 및/또는 추가적인 코-모노머에 따라, 폴리사카라이드는 추가로 작용기화될 수 있다. 예를 들어, 한 구체예에서, 본원에 기재된 폴리사카라이드 중 하나 이상은 아크릴레이트 또는 아크릴아미드로 작용기화된다.
한 구체예에서, 개별 하이드로겔 입자 또는 이들의 복수는 하이드로겔 모노머 또는 이들의 복수로서 펩티드, 단백질, 단백질 도메인, 또는 이들의 조합물을 포함한다. 추가의 구체예에서, 단백질은 구조 단백질, 또는 이의 구체예, 예를 들어, 예컨대, 실크, 엘라스틴, 티틴 또는 콜라겐, 또는 이들의 도메인이다. 한 구체예에서, 단백질은 세포외 기질 (ECM) 성분 (예를 들어, 콜라겐, 엘라스틴, 프로테오글리칸)이다. 심지어 추가의 구체예에서, 구조 단백질은 콜라겐이다. 추가의 구체예에서, 콜라겐은 콜라겐 타입 I, 콜라겐 타입 II 또는 콜라겐 타입 III 또는 이들의 조합물이다. 또 다른 구체예에서, 하이드로겔 모노머는 프로테오글리칸을 포함한다. 추가의 구체예에서, 프로테오글리칸은 데코린, 바이글리칸, 테스티칸, 비쿠닌, 피브로모듈린, 루미칸, 또는 이들의 도메인이다.
또 다른 구체예에서, 아크릴레이트-작용기화된 구조 단백질 하이드로겔 모노머는 본원에 제공된 하이드로겔의 성분으로서 사용된다 (예를 들어, 아크릴레이트 작용기화된 단백질 또는 단백질 도메인, 예를 들어, 실크, 엘라스틴, 티틴, 콜라겐, 프로테오글리칸, 또는 이의 작용기화된 도메인). 추가의 구체예에서, 아크릴레이트 작용기화된 구조 단백질 하이드로겔 모노머는 프로테오글리칸 예를 들어, 데코린, 바이글리칸, 테스티칸, 바이쿠닌, 피브로모둘린, 루미칸, 또는 이의 도메인을 포함한다.
한 구체예에서, 세포외 기질 단백질을 모방하는 올리고펩티드 및 PEG 모노머가 모든 목적에 있어서 그 전체가 참조로 통합된 문헌 [Lutolf et al. (2003). Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 5413-5418]에 기술된 바와 같은 예를 들어, 비닐 설폰-작용기화된 멀티암 PEG, 인테그린 결합 펩티드 및 비스-시스테인 기질 메탈로프로테이나제 펩티드를 갖는 본원에 제공된 하이드로겔에 사용된다. 이러한 특정 구체예에서, 하이드로겔은 PEG 상의 비닐 설폰 기와 디-티올화된 올리고펩티드 사이의 마이클-타입 부가 반응에 의해 형성된다. 여기에 혼입될 수 있는 추가적인 적합한 화학물질의 범위는 당업자에게 자명하며 일반적 화학 반응성 원리에 따른다 (예를 들어, 문헌 [Thermo Scientific Crosslinking Technical Handbook entitled “Easy molecular bonding crosslinking technology”] 참조 (tools.lifetechnologies.com/content/sfs/brochures/1602163-Crosslinking-Reagents-Handbook.pdf에서 입수가능)).
천연 단백질에서 기타 생활성 도메인은 또한 하이드로겔 모노머 또는 이의 일부로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 세포-접착성 인테그린 결합 도메인, 제어된 방출 친화성 결합 도메인 또는 트랜스글루타미나제 가교 도메인이 본원에 제공된 하이드로겔에 사용될 수 있다. 이러한 하이드로겔 생성에 대한 상세한 내용은 모든 목적에 있어서 그 전체가 참조로 각각 통합된 문헌 [Martino et al. (2009). Biomaterials 30, 1089; Martino et al. (2011). Sci. Trans. Med. 3, 100ra89; Hu and Messersmith (2003). J. Am. Chem. Soc. 125, 14298]에서 발견될 수 있다.
한 구체예에서, 재조합 DNA 방법은 모든 목적에 있어서 그 전체가 참조로 통합된 문헌 [Petka et al. (1998). Science 281, pp. 389-392]에 기술된 방법에 의해 예를 들어, pH 또는 온도의 변화에 반응하여 겔로 고안된 단백질을 생성하는데 사용된다. 간단히 말하면, 단백질은 수용성 고분자전해질 세그먼트에 측면 인접한 말단 류신 지퍼 도메인으로 구성된다. 거의 중성인 수용액에서, 말단 도메인의 코일드-코일 응집체는 3-차원 하이드로겔 폴리머 네트워크를 형성한다.
본원에 제공된 하이드로겔을 가교하는데 사용될 수 있는 통상의 가교제는 비제한적으로, 에틸렌 글리콜 디메타크릴레이트 (EGDMA), 테트라에틸렌 글리콜 디메타크릴레이트, 및 N,N'-15 메틸렌비스아크릴아미드를 포함한다. 사용될 수 있는 추가적인 가교 화학물질의 범위는 당업자에게 자명하며 일반적 화학 반응성 원리에 따른다 (예를 들어, 문헌 [Thermo Scientific Crosslinking Technical Handbook entitled “Easy molecular bonding crosslinking technology”] 참조 (tools.lifetechnologies.com/content/sfs/brochures/1602163-Crosslinking-Reagents-Handbook.pdf에서 입수가능)).
한 구체예에서, 하이드로겔의 중합은 라디칼 형성을 촉매하는 퍼설페이트 또는 동등한 개시제에 의해 개시된다. 적합한 개시제의 범위는 당업자에게 공지되어 있으며 일반적 화학 반응성 원리에 따른다 (예를 들어, 문헌 [Thermo Scientific Crosslinking Technical Handbook entitled “Easy molecular bonding crosslinking technology”] 참조 (tools.lifetechnologies.com/content/sfs/brochures/1602163-Crosslinking-Reagents-Handbook.pdf에서 입수가능)). 퍼설페이트는 임의의 수용성 퍼설페이트일 수 있다. 수용성 퍼설페이트의 비제한적 예는 암모늄 퍼설페이트 및 알칼리 금속 퍼설페이트이다. 알칼리 금속은 리튬, 소듐 및 포타슘을 포함한다. 일부 구체예에서, 퍼설페이트는 암모늄 퍼설페이트 또는 포타슘 퍼설페이트이다. 추가의 구체예에서, 본원에 제공된 하이드로겔의 중합은 암모늄 퍼설페이트에 의해 개시된다.
하이드로겔의 중합은 중합-불안정성 화학적 측 기의 형성을 촉매할 수 있는 촉진제에 의해 가속화될 수 있다. 가능한 촉진제의 범위는 당업자에게 공지되어 있으며 일반적 화학 반응성 원리에 따른다 (예를 들어, 문헌 [Thermo Scientific Crosslinking Technical Handbook entitled “Easy molecular bonding crosslinking technology”] 참조 (tools.lifetechnologies.com/content/sfs/brochures/1602163-Crosslinking-Reagents-Handbook.pdf에서 입수가능)). 한 구체예에서 촉진제는 3차 아민이다. 3차 아민은 임의의 수용성 3차 아민일 수 있다. 한 구체예에서, 촉진제는 중합 반응에 사용되며, N,N,N',N'테트라메틸에틸렌디아민, 3-디메틸아미노)프로피오니트릴, 또는 N,N,N',N'테트라메틸에틸렌디아민 (TEMED)이다. 또 다른 구체예에서, 촉진제가 중합 반응 및 이사조비스(이소부티로니트릴) (AIBN)에 사용된다.
상기 논의된 바와 같이, 본원에 기재된 조성물 및 방법에 사용하기 위한 하이드로겔은 본원에 기재된 바와 같은 임의의 모노머 단위 및 가교제를 포함할 수 있으며, 한 양태에서, 소적을 중합시킴으로써 하이드로겔 입자로서 생성된다 (예를 들어, 도 2 참조). 유동성 및 강직성 소적을 포함하는 복수의 소적을 생성하는 미세유체 방법은 당업자에게 공지되어 있으며 모든 목적에 있어서 그 전체가 본원에 각각 참조로 통합된 미국 특허 공개 번호 2011/0218123 및 미국 특허 번호 7,294,503에 기재되어 있다. 이러한 방법은 제 1 유체를 함유하며 제 2 유체에 의해 실질적으로 둘러싸인 복수의 소적을 제공하며, 여기에서 제 1 유체와 제 2 유체는 실질적으로 비혼화성이다 (예를 들어, 수성-기반 액체를 함유하는 소적은 실질적으로 오일 기반 액체에 의해 둘러싸인다).
복수의 유동성 소적 (예를 들어, 미세유체 장치를 사용하여 제조됨)은 다분산될 수 있거나 (예를 들어, 다양한 상이한 크기를 가짐), 일부 경우에, 유동성 소적은 단일분산 또는 실질적으로 단일분산일 수 있으며 예를 들어, 균일한 직경 분포를 가져 예를 들어, 소적의 약 10%, 약 5%, 약 3%, 약 1%, 약 0.03%, 또는 약 0.01% 이하가 평균 직경의 약 10%, 약 5%, 약 3%, 약 1%, 약 0.03%, 또는 약 0.01%를 초과하는 평균 직경을 갖는다. 본원에 사용된 바와 같은 소적 군집의 평균 직경은 소적의 직경의 산술 평균을 나타낸다. 입자의 평균 직경은 예를 들어, 광 산란 기법에 의해 측정될 수 있다. 한 구체예에서, 하이드로겔 입자의 평균 직경은 미세유체 장치의 채널(들) 내부에서 제 1 및 제 2 유체의 유체 스트림의 유량을 변화시킴으로써 또는 미세유체 장치의 채널(들)의 부피를 변화시킴으로써 맞춰진다.
따라서, 본 기재내용은 복수의 하이드로겔 입자를 포함하는 하이드로겔 입자의 군집을 제공하며, 여기에서 하이드로겔 입자의 군집은 실질적으로 단일분산된다.
용어 미세유체는 1mm 미만의 단면 치수, 및 적어도 약 3:1의 길이 대 채널에 수직인 가장 큰 단면 치수의 비를 갖는 적어도 하나의 유체 채널을 포함하는 장치, 기구 또는 시스템을 나타낸다. 미세 유체 채널을 포함하는 미세 유체 장치는 특히 복수의 모노 분산 소적을 제조하는데 특히 매우 적합하다.
본 발명에 사용될 수 있는 미세유체 시스템의 비제한적인 예는 모든 목적에 있어서 그 전체가 각각 참조로서 본원에 통합된 미국 특허 출원 공개 번호 2006/0163385; 미국 특허 출원 공개 번호 2005/0172476; 미국 특허 출원 공개 번호 2007/000342; 국제 특허 출원 공개 번호 WO 2006/096571; 미국 특허 출원 공개 번호 2007/0054119; 미국 특허 번호 7,776,927; 및 국제 특허 출원 공개 번호 WO 2006/078841에 기재되어 있다.
소적 크기는 미세유체 채널 크기와 관련이 있다. 미세 유체 채널은 예를 들어, 약 5 mm 또는 2 mm 미만, 또는 약 1 mm 미만, 또는 약 500 μm 미만, 약 200 μm 미만, 약 100 μm 미만, 약 60 μm 미만, 약 50 μm 미만, 약 40 μm 미만, 약 30 μm 미만, 약 25 μm 미만, 약 10 μm 미만, 약 3 μm 미만, 약 1 μm 미만, 약 300 nm 미만, 약 100 nm 미만, 약 30 nm 미만, 또는 약 10 nm 미만의 유체 유동에 수직인 가장 큰 치수를 갖는 임의의 크기일 수 있다.
소적 크기는 상대 유량을 조정함으로써 튜닝될 수 있다. 일부 구체예에서, 드롭 직경은 채널의 폭과 동일하거나 채널 폭의 약 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100% 이내이다.
본 기재내용의 하이드로겔 입자의 치수는 하이드로겔 입자가 형성되는 소적과 실질적으로 유사하다. 따라서, 일부 구체예에서, 하이드로겔 입자는 약 1 μm, 2, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100 , 120, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 800 또는 1000 μm 미만의 직경을 가질 수 있다. 일부 구체예에서, 하이드로겔 입자는 약 1 μm, 2, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100 , 120, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 800 초과, 또는 1000 μm 초과의 직경을 갖는다. 한 구체예에서, 하이드로겔 입자는 5 μm 내지 100 μm 범위의 직경을 갖는다.
일부 구체예에서, 본 기재내용의 하이드로겔 입자는 구형 형상이다.
일부 구체예에서, 본 기재내용의 하이드로겔 입자는 아가로스를 포함하지 않는다.
한 구체예에서, 하이드로겔 입자는 당업계에서 또한 진주, 비드 또는 과립 중합으로 불리는 현탁 중합에 의해 운반된다 (문헌 [Elbert (2011). Acta Biomater. 7, pp. 31-56] 참조, 이는 모든 목적에 있어서 그 전체에 본원에 참조로 통합됨). 현탁 중합에서, 모노머는 연속상에서 불용성이며, 예를 들어, 연속 오일 상 중의 모노머 수용액이다. 현탁 중합에서, 중합 개시는 모노머-풍부 소적 내에서 임의의 시간에 소적당 하나 초과의 라디칼로 발생한다. 한 구체예에서, 모노머 상은 이작용성 모노머 또는 복수의 모노머 종 (코-모노머, 이는 복수의 이작용성 모노머일 수 있음)일 수 있는 모노머를 포함한다. 한 구체예에서 모노머 상은 개시제 및/또는 가교제를 포함한다.
에멀젼 중합은 또한 본원에 기재된 하이드로겔 입자를 형성하는데 사용될 수 있다. 에멀젼 중합에서, 모노머는 현탁 중합과 유사하게 연속 상 중의 불량한 용해도를 가지며, 그러나 중합 개시는 모노머 소적 밖에 발생한다 (문헌 [Elbert (2011). Acta Biomater. 7, pp. 31-56] 참조, 이는 모든 목적에 있어서 그 전체가 본원에 참조로 통합됨). 에멀젼 중합 구체예에서, 개시제는 계면활성제가 존재하는 경우 미셀에 함유된 모노머 또는 연속 상에 용해된 모노머 (또는 코-모노머)의 사슬 성장을 초래한다.
또 다른 구체예에서, 하이드로겔 입자는 예를 들어, 모든 목적에 있어서 그 전체가 본원에 참조로 통합된 문헌 [Elbert (2011). Acta Biomater. 7, pp. 31-56]에 기재된 바와 같이 침전 중합에 의해 형성된다. 침전 중합은 미세입자를 생성하기 위해 모노머 및 폴리머의 용해도 차이를 이용하는 기술이다. 특히, 더 큰 폴리머 사슬은 일반적으로 더 작은 것보다 더 낮은 용해도를 가짐이 공지되어 있다. 따라서, 특정 분자량 초과에서는 상 분리가 유리할 수 있다. 침전 중합은 초기에는 단일 상의 균질 시스템에서 용액 중합으로서 처음에 시작된다. 한 구체예에서, 중합 시작 직후 비교적 고농도의 폴리머 사슬이 존재하여 핵형성에 의해 상 분리가 유리하다. 중합이 진행됨에 따라, 폴리머 사슬의 농도가 낮아지며 존재하는 입자는 새로운 입자의 핵형성이 발생할 수 있기 전에 사슬을 포획한다. 따라서, 입자의 핵형성은 반응 시작 직후 단기간 동안에만 발생하며, 이는 한 구체예에서, 입자의 좁은 크기 분포를 발생시킨다. 추가의 방법은 비제한적으로, 리소그래피 입자 형성 (모든 목적에 있어서 그 전체가 본원에 참고로 통합된 문헌 [Helgeson et al. (2011), Curr. Opin. Colloid. Interface Sci.16, pp.106-117]), 멤브레인 에멀젼화 (예를 들어, 나노미 B.V. (Nanomi BV (네덜란드))에 의해 기술된 마이크로체 에멀젼화 기법 기술) 및 마이크로채널 에멀젼화 (그 전체가 본원에 참고로 통합된 문헌 [Sugiura et al. (2002). Languimir 18, pp. 5708-5712]), 및 벌크 에멀젼화 (SNF Floerger, 그 전체가 본원에 참조로 통합된 snf.com.au/downloads/Emulsion_Handbook_E.pdf에서 입수가능)를 포함한다.
한 구체예에서, 하이드로겔 입자는 모노머 수용액의 중심 스트림에 초점을 맞추는 2개의 오일 채널을 갖는 미세유체 장치 내에 형성된다. 이러한 구체예에서, 소적은 2개의 채널과 중심 스트림의 계면에 형성되어 유중수 에멀젼에서 소적을 파괴한다. 일단 소적이 형성되면, 한 구체예에서, 이들은 예를 들어, 오일 상에 계면활성제를 첨가함으로써 중합 전에 안정화된다. 그러나, 또 다른 구체예에서, 소적은 중합 전에 안정화되지 않는다. 한 구체예에서 모노머의 중합은 개시 소적이 형성된 후 오일 채널 중 하나 또는 둘 모두에 촉진제 (예를 들어, N,N,N',N'테트라메틸에틸렌디아민)를 첨가함으로써 촉발된다.
상기 제공된 바와 같이 모노머 수용액은 단일 모노머 종 또는 복수의 모노머 종을 포함할 수 있다. 모노머 수용액은 코-모노머, 이작용성 모노머 또는 이들의 조합물을 포함할 수 있다. 한 구체예에서, 모노머 또는 복수의 모노머는 이작용성 모노머, 예를 들어, 상기 기술된 모노머 중 하나를 포함할 수 있다. 하기 기술된 바와 같이, 코-모노머는 예를 들어, 하이드로겔 입자의 굴절률을 조정함으로써 전방 산란 또는 측방 산란을 조절하는데 사용될 수 있다.
한 구체예에서, 모노머 수용액의 중심 스트림은 가교제 예를 들어, N,N'-비스아크릴아미드를 포함한다. 추가의 구체예에서, 모노머 수용액의 중심 스트림은 모노머 이외에 가교제 및 촉진제를 포함한다. 추가의 또 다른 구체예에서, 모노머 수용액은 개시제, 예를 들어, 산화제 예컨대, 암모늄 퍼설페이트를 포함한다.
전방 산란은 코모노머 알릴 아크릴레이트 및 알릴 메타크릴레이트를 첨가함으로써 겔의 굴절률을 조정함으로써 조절되었다 (또한, 도 11 및 도 12 참조). 전방 산란은 또한, 비제한적으로 실리카 및/또는 PMMA 입자의 더 높은 밀도의 콜로이드 현탁액을 포함하는 충분한 광학 해상도/크기/밀도를 함유하는 측방 산란 나노입자로 조절될 수 있다. 소적의 측방 산란은 중합 전에 실리카 나노입자 및/또는 PMMA (폴리(메틸 메타크릴레이트)) 입자 (~100 nm)의 콜로이드 현탁액을 중심 수성 상에 첨가함으로써 튜닝되었다 (도 11 및 12).
한 구체예에서, 비드, 복수의 비드, 생체분자, 또는 복수의 생체분자가 하이드로겔 입자 내부에 매립 (캡슐화)된다. 한 구체예에서, 캡슐화된 비드 또는 생체분자는 입자를 에워싼 후에 표적 세포 또는 세포의 하나 이상의 세포내 소기관을 모방하기 위해 사용된다. 한 구체예에서, 비드 또는 생체분자의 캡슐화 또는 매립은 하이드로겔 입자 형성시에 달성된다. 예를 들어, 비드는 적절한 농도로 현탁될 수 있어서 평균 1개의 비드가 단일 하이드로겔 입자 내에 매립/캡슐화되게 한다. 비드 현탁액은 예를 들어, 모노머 수용액 내에 포함될 수 있다. 유사하게는, 생체분자 또는 생체분자의 혼합물은 생체분자 또는 생체분자들을 캡슐화하기 위해 모노머 수용액에 혼입될 수 있다.
대안적으로, 예를 들어, 일단 상기 기술된 방법에 의해 하이드로겔 입자가 형성되면, 한 구체예에서, 이는 예를 들어, 비드, 복수의 비드, 생체분자 또는 복수의 생체분자를 하이드로겔 입자 내에 매립함으로써 추가로 조작될 수 있다.
따라서, 본 발명의 한 양태에서, 매립된 물질을 포함하는 하이드로겔이 제공된다.
한 구체예에서, 매립된 물질은 매립된 분자, 예를 들어, 생체분자이다. 생체분자는 단일 종 또는 복수의 상이한 종일 수 있다. 예를 들어, 단백질, 펩티드, 탄수화물, 핵산 또는 이들의 조합물은 본 발명의 하이드로겔 입자 내에 캡슐화될 수 있다. 게다가, 다양한 핵산 분자 (예를 들어, 가변 서열 또는 핵산 타입 예컨대, 게놈 DNA, 메신저 RNA 또는 DNA-RNA 하이브리드)는 본 발명의 하이드로겔 입자에 의해 캡슐화될 수 있다. 이들은 임의의 단백질 또는 핵산으로 구성될 수 있는데, 생물학적 물질의 두 형태 모두가 불안정한 화학 측-기를 함유하기 때문이다 (또는 시중의 벤더(vendor) (예를 들어, Integrated DNA Technology 화학적 측 기 변형에 의해 변형될 수 있음). 이러한 측-기는 코-모노머 조성물에서 일반적으로 발견되는 반응 화학물질 (예를 들어, 아크릴레이트 화학물질, NHS-에스테르, 1차 아민, 구리 촉매된 클릭 화학물질 (Sharpless))과 양립가능하다. 양립가능한 화합물질을 함유하는 가능한 매립된 분자의 범위는 당업자에 의해 이해된다.
한 구체예에서, 각각 상이한 농도의 생체분자를 갖는 하이드로겔 입자의 다양한 하위집단이 제작된다. 추가의 구체예에서, 생체분자는 핵산, 단백질, 세포내 이온, 예컨대, 칼슘 산 (또는 사용자가 선택한 기타 생체분자 예를 들어, 칼슘)이다. 또 다른 구체예에서, 각각 상이한 농도의 약물 물질을 갖는 하이드로겔 입자의 다양한 하위군집이 제조된다. 한 구체예에서, 약물 물질은 생체분자 (즉, 생물학적 제제, 항체, 항체 약물 컨쥬게이트, 단백질/효소, 펩티드, 비-리보솜 펩티드, 또는 관련 분자) 또는 소분자 합성 약물 (예를 들어, 타입 I/II/III 폴리케티드, 생활성 특성을 갖는 비-리보솜 펩티드, 또는 일반적으로 당업자에 의해 분류된 다른 소분자 실체)이다.
이와 관련하여, 본 발명은 세포가 이들의 각각의 핵산 또는 단백질 함량에 대해 염색되는 분석 해상도를 결정하는데 특히 유용하다. 한 구체예에서, 본원에 제공된 하이드로겔 입자의 다양한 군집이 알려진 상이한 양의 세포내 물질 예를 들어, 핵산 또는 단백질로 캡슐화된다. 개별적 하이드로겔 입자는 세포내 물질에 대해 염색되고 형광은 다양한 군집의 개별 하이드로겔에 대한 세포측정 장치를 통해 측정된다. 이는 세포내 검정의 감수성 및 동적 범위를 확립하기 위해 표준 곡선의 생성을 허용한다. 일단 확립되면, 샘플은 세포측정기를 통해 진행되어 존재하는 경우 표적 세포(들)를 검출하고 각 표적 세포(들) 중의 세포내 물질의 양을 정량화할 수 있다. 한 구체예에서, 매립된 물질은 감염성 질환 바이오마커, 예를 들어, Infectious Disease Biomarker Database (IDBD, 예를 들어, 모든 목적에 있어서 그 전체가 참조로 통합된 문헌 [Yang et al. (2008) IDBD: Infectious Disease Biomarker Database. Nucleic Acid Res. 36, pp. D455-D460] 참조)에서 감염성 질환 마이오마커 중 하나이다. 추가의 구체예에서, 감염성 질환 바이오마커는 위장관 감염, 호흡기 감염, 신경 감염, 비뇨생식기 감염, 바이러스 감염, 출혈열, 인수 전염증, 아르보바이러스, 항생제 내성 또는 생물학테러의 바이오마커이다. 추가의 구체예에서, 바이러스 감염은 에볼라 감염이다.
한 구체예에서, 본원에 제공된 방법은 세포 핵산 정량 검정의 감수성 및/또는 동적 범위를 결정하는데 사용된다. 이러한 구체예에서, 샘플은 샘플 내부에서 세포 타입 (존재하는 경우), 및 세포 내부의 세포 핵산의 양에 대해 조사된다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 세포내 단백질 정량 검정의 분해능 및/또는 감수성을 측정하기 위한 수단을 제공한다. 한 구체예에서, 하이드로겔 입자는 다양한 농도에서 공지된 양의 단백질을 캡슐화시키며, 후속하여 적절한 단백질 항체로 염색된다. 다양한 입자에 대한 형광을 측정하여 검정의 감수성 및/또는 동적 범위를 결정한다. 이어서, 형광 값을 샘플 중의 세포로부터 수득된 값과 비교하여, 표적 세포가 존재하는지의 여부 및 세포내 단백질을 함유하는 지의 여부 및 단백질의 양을 결정한다.
한 구체예에서, 개별 하이드로겔 입자는 모체 혈액에 존재하는 순환 종양 세포 또는 태아 세포와 실질적으로 유사한 적어도 하나의 광학 특성을 갖도록 튜닝된다. 개별 입자는 알려진 양의 관심 생체분자로 매립된다. 입자는 특정 세포 타입에 대한 생체분자 검출 검정에 대한 표준 곡선을 생성하는데 사용된다.
상기 제공된 바와 같이, 본 발명의 한 양태에서, 매립된 물질을 포함하는 하이드로겔이 제공된다. 한 구체예에서, 매립된 물질은 비드 또는 복수의 비드이다. 한 구체예에서, 하이드로겔 입자에 단일 비드가 매립된다. 또 다른 구체예에서, 개별 하이드로겔에서 복수의 하이드로겔 입자에 매립된 비드의 평균 수는 1이다.
비드 또는 복수의 비드가 하이드로겔 입자 내에 매립되는 경우, 한 구체예에서, 비드 또는 복수의 비드의 광학 특성은 유세포 측정 검정의 질 관리를 위한 하이드로겔 입자의 FSC 및 SSC 특성과 조합되어 사용된다. 예를 들어, 한 구체예에서, 매립된 비드는 대조군으로서 사용되어 레이저 공급원, 광학 및 유동 스트림을 포함하는 유세포 측정 시스템을 보정한다. 또 다른 구체예에서, 매립된 비드는 샘플 예를 들어, 특정 세포에서 형광의 양을 정량화하기 위한 수단으로서 사용된다. 이와 관련하여, 다양한 강도의 매립된 비드가 사용되어 세포가 특정 마커를 발현하는 지의 여부 및 발현 수준을 결정하기 위한 표준 형광 곡선을 생성시킬 수 있다.
한 구체예에서, 약 1 μm 내지 약 3 μm, 약 2 μm 내지 약 4 μm 또는 약 3 μm 내지 약 7 μm의 직경을 갖는 비드가 본원에 제공된 하이드로겔에 매립된다. 예를 들어, 한 구체예에서, 비드는 약 3 μm 내지 약 3.5 μm의 직경을 갖는다. 추가의 구체예에서, 비드는 형광 비드이다. 또 다른 구체예에서, 비드는 약 1 μm 내지 약 2.5 μm 또는 약 1.5 μm 내지 약 3 μm의 직경을 갖는다. 추가의 구체예에서, 비드는 형광 비드이며, 내부 또는 이의 표면 중 어느 하나에서 염색될 수 있다. 더욱 추가의 구체예에서, 형광 비드는 내부적으로 염색된다. 이론에 제한되기를 희망하지 않으면서, 내부 염색이 가변 형광 출력을 초래할 수 있는 환경적 상호작용으로부터 형광단을 격리하는 것으로 생각된다.
상기 제공된 바와 같이, 한 구체예에서, 매립된 비드는 형광 비드이며, 추가의 구체예에서, 형광 비드는 내부에서 염색된다. 매립된 비드와 함께 사용하기 위한 적절한 형광단을 선택하는 것은 당업계의 기술 범위 내에 있다. 한 구체예에서, 비드는 하기 형광 염료 중 하나 이상으로 유도체화된다: 6-카르복시-4',5'-디클로로-2',7'-디메톡시플루오레세인 석신이미딜에스테르; 5-(및-6)-카르복시에오신; 5-카르복시플루오레세인; 6 카르복시플루오레세인; 5-(및-6)-카르복시플루오레세인; S-카르복시플루오레세인-비스-(5-카르복시메톡시-2-니트로벤질)에테르, -알라닌-카르복사미드, 또는 석신이미딜 에스테르; 5-카르복시 플루오레세인 석신이미딜 에스테르; 6-카르복시플루오레세인 석신이미딜 에스테르; 5-(및-6)-카르복시플루오레세인 석신이미딜 에스테르; 5-(4,6-디클로로트리아지닐) 아미노 플루오레세인; 2',7'-디플루오로 플루오레세인; 에오신-5-이소티오시아네이트; 에리트로신 5-이소티오시아네이트; 6-(플루오레세인-5-카르복사미도) 헥사노익산 또는 석신이미딜 에스테르; 6-(플루오레세인-5-(및-6)-카르복사미도) 헥사노익산 또는 석신이미딜에스테르; 플루오레세인-S-EX 석신이미딜 에스테르; 플루오레세인-5-이소티오시아네이트; 플루오레세인-6-이소티오시아네이트; OregonGreen® 488 카르복실산, 또는 석신이미딜 에스테르; Oregon Green® 488 이소티오시아네이트; Oregon Green® 488-X 석신이미딜 에스테르; Oregon Green® 500 카르복실산; Oregon Green® 500 카르복실산, 석신이미딜에스테르 또는 트리에틸암모늄 염; Oregon Green® 514 카르복실산; Oregon Green® 514 카르복실산 또는 석신이미딜 에스테르; RhodamineGreen™ 카르복실산, 석신이미딜 에스테르 또는 하이드로클로라이드; Rhodamine Green™ 카르복실산, 트리플루오로아세트아미드 또는 석신이미딜에스테르; 로다민 Green™-X 석신이미딜 에스테르 또는 하이드로클로라이드; RhodolGreen™ 카르복실산, N,O-비스-(트리플루오로아세틸) 또는 석신이미딜에스테르; 비스-(4-카르복시피페리디닐) 설폰로다민 또는 디(석신이미딜에스테르); 5-(및-6)카르복시나프토 플루오레세인, 5-(및-6)카르복시나프토플루오레세인 석신이미딜 에스테르; 5-카르복시로다민 6G 하이드로클로라이드; 6-카르복시로다민6G하이드로클로라이드, 5-카르복시로다민 6G 석신이미딜 에스테르; 6-카르복시로다민 6G 석신이미딜 에스테르; 5-(및-6)-카르복시로다민6G 석신이미딜 에스테르; 5-카르복시-2',4',5',7'-테트라브로모설폰플루오레세인 석신이미딜 에스테르 또는 비스-(디이소프로필에틸암모늄) 염; 5-카르복시테트라메틸로다민; 6-카르복시테트라메틸로다민; 5-(및-6)-카르복시테트라메틸로다민; 5-카르복시테트라메틸로다민 석신이미딜 에스테르; 6-카르복시테트라메틸로다민석신이미딜 에스테르; 5-(및-6)-카르복시테트라메틸로다민 석신이미딜 에스테르; 6-카르복시-X-로다민; 5-카르복시-X-로다민 석신이미딜 에스테르; 6-카르복시-X로다민 석신이미딜 에스테르; 5-(및-6)-카르복시-X로다민석신이미딜 에스테르; 5-카르복시-X-로다민 트리에틸암모늄 염; LissamineTM 로다민 B 설포닐 클로라이드; 말라카이트 그린; 이소티오시아네이트; NANOGOLD® 모노(설포석신이미딜 에스테르); QSY® 21카르복실산 또는 석신이미딜 에스테르; QSY® 7 카르복실산 또는 석신이미딜 에스테르; 로다민 RedTM-X 석신이미딜 에스테르; 6-(테트라메틸로다민-5-(및-6)-카르복사미도) 헥사노익산; 석신이미딜 에스테르; 테트라메틸로다민-5-이소티오시아네이트; 테트라메틸로다민-6-이소티오시아네이트; 테트라메틸로다민-5-(및-6)-이소티오시아네이트; Texas Red® 설포닐; Texas Red® 설포닐 클로라이드; Texas Red®-X STP 에스테르 또는 소듐 염; Texas Red®-X 석신이미딜 에스테르; Texas Red®-X 석신이미딜 에스테르; 및 X-로다민-5-(및-6) 이소티오시아네이트, 비제한적으로 BODIPY® FL을 포함하는 Invitrogen으로부터 시중에서 입수가능한 BODIPY® 염료; BODIPY® TMR STP 에스테르; BODIPY® TR-X STP 에스테르; BODIPY® 630/650-X STP에스테르; BODIPY® 650/665-X STP 에스테르; 6-디브로모-4, 4-디플루오로-5,7-디메틸-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3-프로피오닉산 석신이미딜 에스테르; 4,4-디플루오로-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3,5-디프로피오닉산; 4,4-디플루오로-5,7-디메틸-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3-펜타노익산; 4,4-디플루오로-5,7-디메틸-4-보라3a,4a-디아자-s-인다센-3-펜타노익산 석신이미딜 에스테르; 4,4-디플루오로-5,7-디메필-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3프로피오닉산; 4,4-디플루오로-5,7-디메틸-4-보라- 3a,4a디아자-s-인다센-3-프로피오닉산 석신이미딜 에스테르; 4,4디플루오로-5,7-디메필-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3프로피오닉산; 설포석신이미딜 에스테르 또는 소듐 염; 6-((4,4-디플루오로-5,7-디메틸-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3프로피오닐)아미노)헥사노익산; 6-((4,4-디플루오로-5,7 디메틸-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3-프로피오닐)아미노)헥사노익산 또는 석신이미딜 에스테르; N-(4,4-디플루오로 5,7-디메틸-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3-프로피오닐) 시스테익산, 석신이미딜 에스테르 또는 트리에틸암모늄 염; 6-4,4-디플루오로-1,3-디메틸-5-(4-메톡시페닐)-4-보라3a,4a4,4-디플루오로-5,7-디페닐-4-보라-3a,4a-디아자-s인다센-3-프로피오닉산; 4,4-디플루오로-5,7-디페닐-4-보라3a,4a-디아자-s-인다센-3-프로피오닉산 석신이미딜 에스테르; 4,4-디플루오로-5-페닐-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3-프로피오닉산; 석신이미딜 에스테르; 6-((4,4-디플루오로-5-페닐-4 보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3-프로피오닐)아미노)헥사노익산 또는 석신이미딜 에스테르; 4,4-디플루오로-5-(4-페닐-1,3부타디에닐)-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3-프로피오닉산 석신이미딜 에스테르; 4,4-디플루오로-5-(2-피롤릴)-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3-프로피오닉산 석신이미딜 에스테르; 6-(((4,4-디플루오로-5-(2-피롤릴)-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3-일)스티릴옥시)아세틸)아미노헥사노익산 또는 석신이미딜 에스테르; 4,4-디플루오로-5-스티릴-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3-프로피오닉산; 4,4-디플루오로-5-스티릴-4-보라-3a,4a-디아자-s인다센-3-프로피오닉산; 석신이미딜 에스테르; 4,4-디플루오로-1,3,5,7-테트라메틸-4-보라-3a,4a디아자-s-인다센-8-프로피오닉산; 4,4-디플루오로-1,3,5,7-테트라메틸-4보라-3a,4a-디아자-s인다센-8-프로피오닉산 석신이미딜 에스테르; 4,4-디플루오로-5-(2-티에닐)-4-보라-3a,4a-디아자-s인다센-3-프로피오닉산 석신이미딜 에스테르; 6-(((4-(4,4-디플루오로-5-(2-티에닐)-4-보라-3a,4a디아자s-인다센-3-일)페녹시)아세틸)아미노)헥사노익산 또는 석신이미딜 에스테르; 및 6-(((4,4-디플루오로-5-(2-티에닐)-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3-일)스티릴옥시)아세틸)아미노헥사노익산 또는 석신이미딜 에스테르, 비제한적으로, Alexa Fluor® 350 카르복실산을 포함하는 Invitrogen으로부터 시중에서 입수가능한 Alexa 플루오르 염료; Alexa Fluor® 430 카르복실산; Alexa Fluor® 488 카르복실산; Alexa Fluor® 532 카르복실산; Alexa Fluor® 546 카르복실산; Alexa Fluor® 555 카르복실산; Alexa Fluor® 568 카르복실산; Alexa Fluor® 594 카르복실산; Alexa Fluor® 633 카르복실산; Alexa Fluor® 64 7 카르복실산; Alexa Fluor® 660 카르복실산; 및 Alexa Fluor® 680 카르복실산, 비제한적으로 Cy3 NHS 에스테르를 포함하는 Amersham-Pharmacia Biotech로부터 시중에서 입수가능한 시아닌 염료; Cy 5 NHS 에스테르; Cy5.5 NHS에스테르; 및 Cy7 NHS 에스테르.
본 발명에서 사용하기에 적합한 다른 형광단을 하기 표 2에 제공한다.
비제한적으로, Bangs Laboratories, Inc, Sperhotech Inc., Thermo Scientific, Inc. 및 동등한 공급업자에 의해 판매되는 것을 포함하는 시중에서 입수가능한 비드가 본원에 기술된 하이드로겔 입자와 조합되어 사용될 수 있다. 검정법에 따라, 적절한 비드 직경, 형광 방출 및/또는 여기 스펙트럼 및/또는 형광 강도를 갖는 비드를 선택하는 것은 당업계의 통상적인 지식 범위내에 있다. 예를 들어, 청색, 적색 또는 UV 레이저와 함께 사용되는 질 관리 비드는 본원에 제공된 하나 이상의 하이드로겔 입자 내로 매립될 수 있다. 예를 들어, 청색 레이저 (카탈로그 번호. A-16500 (2.5 μm), A-16503 (6.0 μm)), 적색 레이저 (카탈로그 번호. A-16501 (2.5 μm), A-16504 (6.0 μm)) 또는 UV 레이저 (카탈로그 번호. A-16502 (2.5 μm), A-16505 (6.0 μm))에 대한 Alignflow™ 유세포 측정 정렬 비드가 본원에 제공된 하이드로겔 입자 중 하나 이상에 매립될 수 있다.
한 구체예에서, 365 nm - 650 nm의 임의의 파장에서 여기될 수 있는 형광 비드가 하이드로겔 입자에 매립된다. 한 구체예에서, 비드는 형광단 예를 들어, 4 형광단, 5 형광단, 6 형광단, 7 형광단 또는 8 형광단의 혼합물을 함유하는 "무지개 입자"이다. 이와 관련하여, 사용자는 조사되는 형광단에 따라 입자를 여기시키는 파장을 선택한다. 무지개 입자는 예를 들어, BD Biosciences (카탈로그 번호. 556298 (중간 범위 FL1 형광), 556286 (6 색상, 3.0-3.4 μm), 556288 (6 색상, 6.0-6.4 μm), 559123 (8 색상)) 및 다양한 직경의 Spherotech (예를 들어, 카탈로그 번호. RCP20-5 (4 색상), RCP-30-5 (6 피크), RCP-30-5A (8 피크)로부터 시중에서 입수가능하다.
세포 분류 셋-업 비드는 본원에 제공된 하이드로겔 입자 중 하나 이상에 매립될 수 있다. 한 구체예에서, 세포 분류 셋-업 비드는 생물학적 샘플의 크기, 방출 파장, 및 강도를 비슷하게 하고, 레이저 소스, 광학, 및 스트림 유동을 포함하는 유세포 측정기의 세포 분류 시스템을 보정하는데 사용될 수 있다. 한 구체예에서, 세포 분류 셋-업 비드는 하나 이상의 하이드로겔 입자에 매립되며, UV, 청색, 녹색/황색 또는 적색 레이저와 함께 사용하기 용이하다. 녹색 레이저가 사용되는 경우, 한 구체예에서, 매립된 비드는 570 nm에서 여기되며 575 nm에서 방출되나, 또한 488 nm에서 배출될 수 있다. 시중에서 입수가능한 세포 분류 셋-업 비드는 예를 들어, Life Technologies (카탈로그 번호. C-16506 (UV 레이저), C-16508 (청색 레이저), C-16509 (녹색-황색 레이저), C-16507 (적색 레이저))로부터 입수가능하다.
보상 제어 비드는 또한, 본원에 제공된 하이드로겔 입자 중 하나 이상에 매립될 수 있다. 정확한 보상은 유세포 측정에서 효과적인 다중 색상 분석을 위한 중요한 파라미터이다. 그러나, 세포-기반 보상 제어는 많은 항원이 고도로 발현되지 않으며 흐릿하게 염색된 세포는 부정확한 보상 세팅을 초래할 수 있기 때문에 완전하게 효과적이지 않다.
한 구체예에서, 보상 제어 비드는 형광 항체 컨쥬게이트 포획 용량 (양성 보상 비드)을 포함하거나 비활성 (음성 보상 비드)이다. 보상 비드는 형광단-컨쥬게이팅된 인간, 마우스, 래트, 햄스터, 또는 토끼 항체와 혼합되며; 두 성분은 별개의 고-신호 양성 대조군에 적합한 음성 군집을 제공하며 이는 이어서 실제 실험에서 세포의 밀도와 무관하게 적절하게 보상을 설정하는데 사용될 수 있다. 일단 항체가 비드와 혼합되면, 이는 본원에 제공된 하이드로겔 입자 중 하나 이상에 매립된다. 시중에서 입수가능한 보상 비드는 예를 들어, Life Technologies (카탈로그 번호. A-10344, A-10389, A10497, A10513) 및 Spherotech (카탈로그 번호. CMIg-P-08-2K, CMIg-P-30-2K, CMIg-P-50-3K, CMIg-P-70-3K)로부터 입수가능하다.
한 구체예에서, 매립된/캡슐화된 비드를 갖는 하이드로겔 입자는 세포 검정 예를 들어, 식균작용 검정, 세포독성 검정, 운동성 검정, 생존력 검정 등에 대한 기준으로 사용된다. 식균작용은 세포가 고체 입자를 에워싸서 식포로서 공지된 내부 소포체를 형성하는 과정이다. 이와 관련하여, 하이드로겔 입자는 포식세포가 입자를 에워싸기 전 및 후에 포식세포와 실질적으로 유사한 하나 이상의 광학 특성을 갖도록 튜닝될 수 있다. 따라서, 한 구체예에서, 본원에 제공된 하이드로겔 입자는 식균작용 검정을 위한 대조군 입자로서 사용된다. 추가의 구체예에서, (i) 하이드로겔 입자의 광학 특성 중 하나 이상은 입자 흡수 전의 포식세포와 실질적으로 유사하며, (ii) 제 2 하이드로겔 입자의 광학 특성 중 하나 이상은 입자 흡수 후의 포식세포와 실질적으로 유사하다. 이와 관련하여, 대조군은 포식세포에 의한 입자 흡수를 측정하기 위해 생성된다.
한 구체예에서, 포식세포는 전문 포식세포이다. 또 다른 구체예에서, 포식세포는 비-전문 포식세포 (즉, 죽은 세포 및 이종 유기체를 소비하는 세포)이다. 추가의 구체예에서, 비-전문 포식세포는 상피 세포, 내피 세포, 섬유아세포 또는 중간엽 세포이다. 한 구체예에서, 하이드로겔 입자는 하기 표 3에 제시된 전문 포식세포와 실질적으로 유사한 하나 이상의 광학 특성을 갖도록 튜닝된다 (입자 흡수 전 및/또는 후).
한 구체예에서, 물질 예컨대, 핵산 또는 비드가 매립된 본 발명의 복수의 하이드로겔 입자는 게놈 세포 측정 검정을 위한 대조군 시약으로서 사용된다. 이와 관련하여, 특정 크로모좀, RNA 서열 및/또는 DNA 서열의 특정 수의 복사체는 매립된 물질에 의해 모방될 수 있다. 이어서 하이드로겔 입자는 유전자 정보 예컨대, 크로모좀 복사체의 수, RNA 서열 복사체의 수 및/또는 RNA 서열 복사체의 수에 대해 프로빙되는 샘플에 대한 대조군으로서 사용될 수 있다.
유세포 측정을 위한 디콘볼루션(deconvolution)의 3가지 주요 모드는 입자의 2개의 수동적 광학 특성 (굴절률 또는 RI에 상응하는 전방 산란 FSC; 및 측방 산란, SSC) 및 주어진 세포 타입의 표면 상에 존재하는 마이오마커이다. 따라서, 본 기재내용의 하이드로겔 입자가 이러한 3가지 모드와 관련하여 특정 세포 타입을 모방하도록 허용하는 조성물은 유세포 측정을 위한 합성의 견고한 칼리브란트를 제공하는데 유용하다.
한 구체예에서, 기재된 하이드로겔 입자의 굴절률 (RI)은 약 1.10 초과, 약 1.15 초과, 약 1.20 초과, 약 1.25 초과, 약 1.30 초과, 약 1.35 초과, 약 1.40 초과, 약 1.45 초과, 약 1.50 초과, 약 1.55 초과, 약 1.60 초과, 약 1.65 초과, 약 1.70 초과, 약 1.75 초과, 약 1.80 초과, 약 1.85 초과, 약 1.90 초과, 약 1.95 초과, 약 2.00 초과, 약 2.10 초과, 약 2.20 초과, 약 2.30 초과, 약 2.40 초과, 약 2.50 초과, 약 2.60 초과, 약 2.70 초과, 약 2.80, 또는 약 2.90 초과이다.
또 다른 구체예에서, 기재된 하이드로겔 입자의 굴절률 (RI)은 약 1.10 내지 약 3.0, 또는 약 1.15 내지 약 3.0, 또는 약 1.20 내지 약 3.0, 또는 약 1.25 내지 약 3.0, 또는 약 1.30 내지 약 3.0 또는 약 1.35 내지 약 3.0, 또는 약 1.4 내지 약 3.0, 또는 약 1.45 내지 약 3.0, 또는 약 1.50 내지 약 3.0, 또는 약 1.6 내지 약 3.0, 또는 약 1.7 내지 약 3.0, 또는 약 1.8 내지 약 3.0, 또는 약 1.9 내지 약 3.0, 또는 약 2.0 내지 약 3.0이다.
일부 구체예에서, 기재된 하이드로겔 입자의 굴절률 (RI)은 약 1.10 미만, 약 1.15 미만, 약 1.20 미만, 약 1.25 미만, 약 1.30 미만, 약 1.35 미만, 약 1.40 미만, 약 1.45 미만, 약 1.50 미만, 약 1.55 미만, 약 1.60 미만, 약 1.65 미만, 약 1.70 미만, 약 1.75 미만, 약 1.80 미만, 약 1.85 미만, 약 1.90 미만, 약 1.95 미만, 약 2.00 미만, 약 2.10 미만, 약 2.20 미만, 약 2.30 미만, 약 2.40 미만, 약 2.50 미만, 약 2.60 미만, 약 2.70 미만, 약 2.80, 또는 약 2.90 미만이다.
기재된 하이드로겔 입자의 SSC는 표적 세포의 것과 비교하여 가장 의미있게 측정된다. 일부 구체예에서, 기재된 하이드로겔 입자는 세포 측정 장치에 의해 측정되는 경우 표적 세포의 것의 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5% 또는 1% 이내의 SSC를 갖는다.
한 구체예에서, 하이드로겔 입자의 SSC는 하이드로겔에 고-굴절률 분자 (또는 이들의 복수)를 혼입시킴으로써 조절된다. 한 구체예에서, 고-굴절률 분자가 하이드로겔 입자에 제공되며, 추가의 구체예에서, 고-굴절률 분자는 콜로이드 실리카, 알킬 아크릴레이트, 알킬 메타크릴레이트 또는 이들의 조합물이다. 따라서, 일부 구체예에서, 본 기재내용의 하이드로겔 입자는 알킬 아크릴레이트 및/또는 알킬 메타크릴레이트를 포함한다. 한 구체예에서 모노머의 농도는 하이드로겔 입자의 굴절률을 추가로 조정하도록 조정된다.
알킬 아크릴레이트 또는 알킬 메타크릴레이트는 알킬 기 예컨대, 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, 이소부틸 또는 3차부틸, 2-에틸헥실, 헵틸 또는 옥틸 기에서 1 내지 18개, 1 내지 8개, 또는 2 내지 8개 탄소 원자를 함유할 수 있다. 알킬 기는 분지형 또는 선형일 수 있다.
고-굴절률 분자는 또한, 방향족 고리에서 알킬기, 예컨대, 메틸, 에틸 또는 3차-부틸 또는 할로겐, 예컨대, 클로로스티렌으로 선택적으로 치환된 비닐아렌 예컨대, 스티렌 및 메틸스티렌을 포함할 수 있다.
일부 구체예에서, FSC는 조성물 중에 존재하는 모노머의 백분율을 조정함으로써 조절되어, 하이드로겔 형성 동안 존재하는 수분 함량이 변경된다. 한 구체예에서, 모노머 및 코-모노머가 사용되는 경우, 모노머 및 코-모노머의 비율은 하이드로겔 입자의 전방 산란 특성을 변화시키도록 조정된다. 이는 도 11 및 도 12 둘 모두에 도시되어 있다.
기재된 하이드로겔 입자의 FSC는 표적 세포의 것과 비교하여 가장 의미있게 측정된다. 일부 구체예에서, 기재된 하이드로겔 입자는 세포 측정 장치에 의해 측정되는 경우 표적 세포의 것의 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5% 또는 1% 이내의 FSC를 갖는다.
FSC는 입자 부피와 관련되며, 따라서 본원에 기재된 바와 같이 입자 직경을 변경함으로써 조절될 수 있다. 일반적으로, 큰 물체가 작은 물체보다 더 많은 광을 굴절시켜 높은 전방 산란 신호로 이어짐이 관찰되었다 (그 반대도 또한 마찬가지임). 따라서, 한 구체예에서 입자 직경은 하이드로겔 입자의 FSC 특성을 조절하도록 변경된다. 예를 들어, 하이드로겔 입자 직경은 한 구체예에서 증가되며, 입자 형성 동안 더 큰 미세유체 채널을 경화시킴으로써 변경된다.
SSC는 표적 세포에서 세포소기관을 모방하도록 하이드로겔 내부에 나노입자를 캡슐화시킴으로써 조작될 수 있다. 일부 구체예에서, 본 기재내용의 하이드로겔 입자는 폴리메틸 메타크릴레이트 (PMMA) 나노입자, 폴리스티렌 (PS) 나노입자, 및 실리카 나노입자로 구성된 군으로부터 선택된 나노입자 중 하나 이상을 포함한다. 다양한 농도의 나노입자의 첨가가 입자의 측방 산란의 조절을 허용함을 보여주는 도 11 및 12를 또한 참조. 이론에 구속되기를 희망하지 않으면서, 본원에 기술된 바와 같이 하이드로겔의 전방 및 측방 산란 둘 모두를 선택적으로 튜닝하는 능력은 견고한 플랫폼이 광범위한 세포 타입을 모방할 수 있게 한다.
본 발명은 광학 특성의 변형과 관련하여 주로 기술되어 있지만, 본 발명은 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 하이드로겔 입자가 제조되고 입자의 용량을 튜닝하도록 예를 들어, 콜터 계수기를 보정하도록 조정될 수 있다. 한 구체예에서, 하이드로겔 입자의 용량은 조성물 중 하이드로겔 모노머의 양을 변경함으로써 조정된다. 예를 들어, 폴리아날린, 폴리아세틸렌; 폴리페닐렌 비닐렌; 폴리피롤 (X = NH) 및 폴리티오펜 (X = S) 코-모노머; 및 폴리아닐린 (X = NH/N) 및 폴리페닐렌 설파이드 (X = S) 코-모노머 농도가 용량을 변경하도록 모두 조정될 수 있다. 한 구체예에서, 이러한 모노머 중 하나 이상의 농도가 증가되어 하이드로겔 입자의 용량을 증가시킨다.
일부 구체예에서, 본 기재내용의 하이드로겔 입자는 동일한 직경의 폴리스티렌 비드와 비교하여 표적 세포의 물질 계수 특성 (예를 들어, 탄성)과 더욱 밀접하게 유사한 물질 계수 특성을 갖는다.
하이드로겔 입자가 형성된 후, 입자 표면의 하나 이상은 작용기화되어 예를 들어, 표적 세포 또는 라벨링된 표적 세포의 하나 이상의 광학 특성을 모방할 수 있다. 작용기화된 하이드로겔 입자는 또한 매립된 비드 또는 물질 예컨대, 상기 기술된 바와 같은 생체분자를 포함할 수 있다. 한 구체예에서, 하나 이상의 하이드로겔 입자는 하나 이상의 형광 염료, 하나 이상의 세포 표면 마커 (또는 이의 에피토프 결합 영역), 또는 이들의 조합물로 작용기화된다. 한 구체예에서, 하이드로겔 입자는 적어도 하나의 이작용성 모노머를 중합시킴으로써 형성되며, 형성 후, 하이드로겔 입자는 세포 표면 마커, 세포 표면 마커의 에피토프 결합 영역, 형광 염료, 또는 이들의 조합물의 추가적 부착에 사용될 수 있는 하나 이상의 작용기를 포함한다. 한 구체예에서, 자유 작용기는 아민 기, 카르복실 기, 하이드록실 기 또는 이들의 조합물이다. 요망되는 작용기화에 따라, 다중 이작용성 모노머는 예를 들어, 다양한 화학물질을 사용하여 다양한 분자로 입자를 작용기화시킬 수 있음을 이해해야 한다.
하이드로겔 입자는 모든 목적에 있어서 그 전체가 본원에 참조로 통합된 문헌 [The MolecularProbes® Handbook-A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies]에 기록된 형광 염료를 포함하는 당해분야에 공지된 임의의 형광 염료로 작용기화될 수 있다. 작용기화는 상기 논의된 바와 같이 하이드로겔을 형성하기 위해 사용된 이작용성 모노머로 혼입될 수 있는 자유 아민 기 예를 들어, 알릴아민을 포함하는 화합물에 의해 매개될 수 있다.
본원에 기술된 하이드로겔 입자의 표면을 작용기화시키는데 사용될 수 있는 공지된 형광 염료의 비제한적 예는 하기를 포함한다: 6-카르복시-4',5'-디클로로- 2',7'-디메톡시플루오레세인 석신이미딜에스테르; 5-(및-6)-카르복시에오신; 5- 카르복시플루오레세인; 6 카르복시플루오레세인; 5-(및-6)-카르복시플루오레세인; S-카르복시플루오레세인-비스-(5-카르복시메톡시-2-니트로벤질)에테르, -알라닌-카르복사미드, 또는 석신이미딜 에스테르; 5-카르복시플루오레세인석신이미딜 에스테르; 6-카르복시플루오레세인 석신이미딜 에스테르; 5-(및-6)-카르복시플루오레세인 석신이미딜 에스테르; 5-(4,6-디클로로트리아지닐) 아미노 플루오레세인; 2',7'-디플루오로 플루오레세인; 에오신-5-이소티오시아네이트; 에리트로신 5-이소티오시아네이트; 6-(플루오레세인-5-카르복사미도) 헥사노익산 또는 석신이미딜 에스테르; 6-(플루오레세인-5-(및-6)-카르복사미도)헥사노익산 또는 석신이미딜에스테르; 플루오레세인-S-EX 석신이미딜 에스테르; 플루오레세인-5-이소티오시아네이트; 플루오레세인-6-이소티오시아네이트; OregonGreen® 488 카르복실산, 또는 석신이미딜 에스테르; Oregon Green® 488 이소티오시아네이트; Oregon Green® 488-X 석신이미딜 에스테르; Oregon Green® 500 카르복실산; Oregon Green® 500 카르복실산, 석신이미딜에스테르 또는 트리에틸암모늄 염; Oregon Green® 514 카르복실산; Oregon Green® 514 카르복실산 또는 석신이미딜 에스테르; RhodamineGreen™ 카르복실산, 석신이미딜 에스테르 또는 하이드로클로라이드; Rhodamine Green™ 카르복실산, 트리플루오로아세트아미드 또는 석신이미딜에스테르; Rhodamine Green™-X 석신이미딜 에스테르 또는 하이드로클로라이드; RhodolGreen™ 카르복실산, N,O-비스-(트리플루오로아세틸) 또는 석신이미딜에스테르; 비스-(4-카르복시피페리디닐) 설폰로다민 또는 디(석신이미딜에스테르); 5-(및-6)카르복시나프토 플루오레세인, 5-(및-6)카르복시나프토플루오레세인 석신이미딜 에스테르; 5-카르복시로다민 6G 하이드로클로라이드; 6-카르복시로다민6G하이드로클로라이드, 5-카르복시로다민 6G 석신이미딜 에스테르; 6-카르복시로다민 6G 석신이미딜 에스테르; 5-(및-6)-카르복시로다민6G 석신이미딜 에스테르; 5-카르복시-2',4',5',7'-테트라브로모설폰플루오레세인 석신이미딜 에스테르 또는 비스-(디이소프로필에틸암모늄) 염; 5-카르복시테트라메틸로다민; 6-카르복시테트라메틸로다민; 5-(및-6)-카르복시테트라메틸로다민;5-카르복시테트라메틸로다민 석신이미딜 에스테르; 6-카르복시테트라메틸로다민석신이미딜 에스테르; 5-(및-6)-카르복시테트라메틸로다민 석신이미딜 에스테르; 6-카르복시-X-로다민; 5-카르복시-X-로다민 석신이미딜 에스테르;6-카르복시-X로다민 석신이미딜 에스테르; 5-(및-6)-카르복시-X로다민석신이미딜 에스테르; 5-카르복시-X-로다민 트리에틸암모늄 염; LissamineTM 로다민 B 설포닐 클로라이드; 말라카이트 그린; 이소티오시아네이트; NANOGOLD® 모노(설포석신이미딜 에스테르); QSY® 21카르복실산 또는 석신이미딜 에스테르; QSY® 7 카르복실산 또는 석신이미딜 에스테르; 로다민 RedTM-X 석신이미딜 에스테르; 6-(테트라메틸로다민-5-(및-6)-카르복사미도)헥사노익산; 석신이미딜 에스테르; 테트라메틸로다민-5-이소티오시아네이트;테트라메틸로다민-6-이소티오시아네이트; 테트라메틸로다민-5-(및-6)-이소티오시아네이트; Texas Red® 설포닐; Texas Red® 설포닐 클로라이드; Texas Red®-X STP 에스테르 또는 소듐 염; Texas Red®-X 석신이미딜 에스테르; Texas Red®-X 석신이미딜 에스테르; 및 X-로다민-5-(및-6) 이소티오시아네이트.
본원에 기술된 하이드로겔 입자와 사용하여 형광 염료의 기타 예는 비제한적으로, 하기를 포함한다: 비제한적으로, BODIPY® FL; BODIPY® TMR STP 에스테르; BODIPY® TR-X STP 에스테르; BODIPY® 630/650-X STP에스테르; BODIPY® 650/665-X STP 에스테르를 포함하는 Invitrogen으로부터 시중에서 입수가능한 BODIPY® 염료; 6-디브로모-4,4-디플루오로-5,7-디메틸-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3-프로피오닉산 석신이미딜 에스테르; 4,4-디플루오로-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3,5-디프로피오닉산;4,4- 디플루오로-5,7-디메틸-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3-펜타노익산; 4,4-디플루오로-5,7-디메틸-4-보라3a,4a-디아자-s-인다센-3-펜타노익산 석신이미딜 에스테르; 4,4-디플루오로-5,7-디메필-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3프로피오닉산; 4,4-디플루오로-5,7-디메틸-4-보라-3a,4a디아자-s-인다센-3-프로피오닉산 석신이미딜 에스테르; 4,4디플루오로-5,7-디메필-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3프로피오닉산; 설포석신이미딜 에스테르 또는 소듐 염; 6-((4,4- 디플루오로-5,7-디메틸-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3프로피오닐)아미노)헥사노익산; 6-((4,4-디플루오로-5,7디메틸-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3-프로피오닐)아미노) 헥사노익산 또는 석신이미딜 에스테르; N-(4,4-디플루오로 5,7-디메틸-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3-프로피오닐) 시스테익산, 석신이미딜 에스테르 또는 트리에틸암모늄 염; 6-4,4-디플루오로-1,3-디메틸-5-(4-메톡시페닐)-4-보라3a,4a4,4-디플루오로-5,7-디페닐-4-보라-3a,4a-디아자-s인다센-3-프로피오닉산; 4,4-디플루오로-5,7-디페닐-4-보라3 a,4a-디아자-s-인다센-3- 프로피오닉산 석신이미딜 에스테르; 4,4-디플루오로-5-페닐-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3-프로피오닉산; 석신이미딜 에스테르; 6-((4,4-디플루오로-5-페닐-4보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3-프로피오닐)아미노)헥사노익산 또는 석신이미딜 에스테르; 4,4-디플루오로-5-(4-페닐-1,3부타디에닐)-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3-프로피오닉산 석신이미딜 에스테르; 4,4-디플루오로-5-(2-피롤릴)-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3-프로피오닉산 석신이미딜 에스테르; 6-(((4,4-디플루오로-5-(2-피롤릴)-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3-일)스티릴옥시)아세틸)아미노헥사노익산 또는 석신이미딜 에스테르; 4,4-디플루오로-5-스티릴-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3-프로피오닉산; 4,4-디플루오로-5 -스티릴-4-보라-3a,4a-디아자-s인다센-3-프로피오닉산; 석신이미딜 에스테르; 4,4-디플루오로-1,3,5,7-테트라메틸-4-보라-3a,4a디아자-s-인다센-8-프로피오닉산; 4,4-디플루오로-1,3,5,7-테트라메틸-4보라-3a,4a-디아자-s인다센-8-프로피오닉산 석신이미딜 에스테르; 4,4-디플루오로-5-(2-티에닐)-4-보라-3a,4a-디아자-s인다센-3-프로피오닉산 석신이미딜 에스테르; 6-(((4-(4,4-디플루오로-5-(2-티에닐)-4-보라-3a,4a디아자s-인다센-3-일)페녹시)아세틸)아미노)헥사노익산 또는 석신이미딜 에스테르; 및 6-(((4,4-디플루오로-5-(2-티에닐)-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3-일)스티릴옥시)아세틸)아미노헥사노익산 또는 석신이미딜 에스테르.
한 구체예에서 하나 이상의 하이드로겔 입자의 표면의 유도체화를 위한 형광 염료는 비제한적으로, Alexa Fluor® 350 카르복실산; Alexa Fluor® 430 카르복실산; Alexa Fluor® 488 카르복실산; Alexa Fluor® 532 카르복실산; Alexa Fluor® 546 카르복실산; Alexa Fluor® 555 카르복실산; Alexa Fluor® 568 카르복실산; Alexa Fluor® 594 카르복실산; Alexa Fluor® 633 카르복실산; Alexa Fluor® 64 7 카르복실산; Alexa Fluor® 660 카르복실산; 및 Alexa Fluor® 680 카르복실산을 비제한적으로 포함하는 Invitrogen으로부터 시중에서 입수가능한 Alexa 플루오르 염료를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 본원에 기술된 방법 및 하이드로겔 입자에 사용하기 위한 형광 염료는 Cy3 NHS 에스테르; Cy 5 NHS 에스테르; Cy5.5 NHS에스테르; 및 Cy7 NHS 에스테르를 비제한적으로 포함하는 Amersham-Pharmacia Biotech로부터 시중에서 입수가능한 시아닌 염료를 포함한다.
하이드로겔 입자의 요망되는 스펙트럼 여기 및 방출 특성을 기반으로 하는 적합한 염료 또는 염료들을 선택하는 것은 당해의 일반적인 기술 범위 내에 있다.
한 구체예에서, 하이드로겔 입자는 예를 들어, 하나 이상의 세포 표면 마커, 이의 세포외 부분 또는 리간드 결합 영역을 하이드로겔 입자의 표면 상에 존재하는 자유 아민, 자유 카르복실 및/또는 자유 하이드록실 기를 통해 입자에 부착시킴으로써 하나 이상의 세포 표면 마커 (예를 들어, 표 4 및 7-8 참조), 또는 이의 단편 예를 들어, 트랜스멤브레인 단백질의 경우, 이의 세포외 부분으로 작용기화된다. 염료 또는 세포 표면 분자로의 하이드로겔 입자의 작용기화는 또한 링커 예를 들어, 스트렙타비딘/바이오틴 컨쥬게이트를 통해 발생할 수 있다.
표적 세포에 따라, 개별적인 하이드로겔 입자는 트랜스멤브레인 단백질의 경우, 하나 이상의 세포 표면 마커, 또는 이의 단편, 예를 들어, 이의 세포외 부분으로 유도체화되어 표적 세포의 구조 특성을 추가로 모방할 수 있다. 하기 제공된 표 4 및 7-8은 표적 세포에 따라 하이드로겔 입자를 유도체화시키는데 사용될 수 있는 세포 표면 마커의 비제한적 목록을 제시한다. 세포 표면 마커가 제공되지만, 세포 표면 마커의 일부 예를 들어, 마커의 수용체 결합 부분, 리간드 결합 부분, 또는 세포외 부분은 하이드로겔 입자를 유도체화시키는데 사용될 수 있다 (상기 기술된 바와 같이 자유 작용기에서). 또한, FSC 및/또는 SSC의 선택적 튜닝과 함께 예를 들어, 세포 표면 수용체로의 하이드로겔 표면 변형은 요망되는 특징(들)을 갖는 하이드로겔 입자의 제조를 허용함을 보여주는 도 11 및 12 참조.
비제한적으로 다양한 세포주 예컨대, CHO, HEK-293, BHK-21, NS0, MDCK, VERO, MRC-S, W1-38 및 Sp2/0 Mouse Myeloma (하이브리도마)를 포함하는 세포 타입. 표 5 및 표 6은 각각 본원에 기재된 하이드로겔 입자에 사용하기 위한 다른 세포 타입을 제공한다.
한 구체예에서, 복수의 하이드로겔 입자는 표적 세포의 군집 상에 특정 세포 표면 마커 또는 이들의 조합물의 검출의 동적 범위 및/또는 감수성을 결정하는데 사용된다. 예를 들어, 하이드로겔 입자의 군집은 표적 세포의 SSC 및/또는 FSC 프로파일을 갖도록 튜닝될 수 있으며, 하이드로겔 입자의 하위군집은 특정 수의 세포 표면 마커의 복사체 예를 들어, 세포 표면 수용체, 또는 이들의 도메인 예를 들어, 이들의 에피토프 결합 영역으로 유도체화된다. 예를 들어, 하이드로겔 입자의 개별 하위군집은 독특한 수의 복사체를 갖도록 각각 유도체화될 수 있으며, 예를 들어, 한 하위군집은 세포 표면 마커의 100개 복사체를 함유할 것이며, 제 2 하위군집은 동일한 세포 표면 마커의 1,000개 복사체를 함유할 것이며, 제 3 하위군집은 동일한 세포 표면 마커의 10,000개 복사체를 함유할 것이며, 기타 등등일 수 있다. 하이드로겔 입자의 군집은 각 세포 표면 마커에 대해 형광으로 염색되며, 형광은 각 하위군집에서 하이드로겔 입자에 대해 검출된다. 이와 관련하여, 하이드로겔 입자의 하위군집은 각 세포 마커를 갖는 표적 세포에 대한 형광 방출의 표준 곡선을 발생시키는데 사용될 수 있다. 세포 표면 마커는 이들의 제공된 세포 표면 마커, 또는 이들의 결합 영역, 또는 당업자에게 공지된 세포 표면 마커 중 임의의 것일 수 있다.
본 기재내용의 하이드로겔 입자는 절차에서 예컨대, 유동 세포측정 또는 FACS에 의한 염색 및 분석에서 표적 세포와 유사하게 행동한다. 예를 들어, 한 구체예에서, 하이드로겔 입자는 표 1, 표 2 또는 표 3에 제시된 세포 타입 중 하나와 실질적으로 유사한 하나 이상의 광학 특성을 갖는다.
일부 구체예에서, 표적 세포는 면역 세포이다. 면역 세포의 비제한적인 예로는 B 림프구, 또한, 소위 B 세포, T 림프구, 또한, 소위 T 세포, 자연 살해 (NK) 세포, 림포킨-활성화된 살해 (LAK) 세포, 단핵구, 대식세포, 중성구, 과립구, 비만 세포, 혈소판, 랑게르한스 세포, 줄기 세포, 수지상 세포, 말초 혈액 모노뉴클레어 세포, 종야 여과 (TIL) 세포, 하이브리도마를 포함하는 유전자 변형된 면역 세포, 약물 변형된 면역 세포, 및 본원에 기록된 세포 타입 중 어느 하나의 유도체, 전구체 또는 프로제니터(progenitor)를 포함한다.
일부 구체예에서, 표적 세포는 공유 특성을 갖는 특정 부류의 세포의 모든 세포를 포함한다. 예를 들어, 표적 세포는 NK 세포, T 세포 및 B 세포를 포함한 림프구일 수 있다. 표적 세포는 활성화된 림프구일 수 있다.
일부 구체예에서, 표적 세포는 일차 세포, 배양된 세포, 확립된 세포, 정상 세포, 형질전환 세포, 감염 세포, 안정하게 형질감염된 세포, 일시적 형질감염 세포, 증식 세포, 또는 말초 분화된 세포이다.
한 구체예에서, 표적 세포는 일차 뉴론 세포이다. 다양한 뉴론이 표적 세포일 수 있다. 비제한적 예로서, 표적 세포는 일차 뉴론; 확립 뉴론; 형질전환 뉴론; 안정하게 형질감염된 뉴론; 또는 모터 또는 감각 뉴론일 수 있다.
기타 구체예에서, 표적 세포는 일차 림프구, 단핵구 및 과립구로 구성된 군으로부터 선택된다.
표적 세포는 원핵 세포 및 진핵 세포를 포함하여 거의 모든 타입의 세포 일 수 있다.
적합한 원핵 표적 세포는 비제한적으로, 박테리아 예컨대, E. 콜라이, 다양한 바실러스 종, 및 극한 박테리아 예컨대, 써모필을 포함한다.
적절한 진핵생물 표적 세포는 비제한적으로, 진균류 예컨대, 사카로마이세스(Saccharomyces), 아스퍼길루스(Aspergillus), 트리코더마(Trichoderma) 및 뉴로스포라(Neurospora)의 종을 포함하는 효모 및 사상 균류; 콤(com), 사탕수수, 타바코, 카놀라, 콩, 면화, 토마토, 감자, 알팔파, 해바라기 등의 것을 포함하는 식물 세포; 및 물고기, 새, 및 포유동물을 포함한 동물 세포를 포함한다. 적절한 어류 세포는 비제한적으로, 연어, 송어, 틸라피아, 참치, 잉어, 넙치, 광어, 황새치, 대구 및 제브라 피쉬의 종으로부터의 세포를 포함한다. 적절한 조류 세포는 비제한적으로, 닭, 오리, 메추라기, 꿩 및 칠면조, 및 기타 정글 파울 또는 게임 조류의 세포를 포함한다. 적절한 포유 동물 세포는 비제한적으로, 말, 소, 버팔로, 사슴, 양, 토끼, 설치류, 예컨대, 마우스, 래트, 햄스터 및 기니 피그, 염소, 돼지, 영장류, 돌고래 및 고래를 포함한 해양 포유동물로부터의 세포, 뿐만 아니라 세포주 예컨대, 임의의 조직 또는 줄기 세포 타입의 인간 세포주, 및 다능성 및 비-다능성을 포함하는 줄기 세포 및 비-인간 접합체를 포함한다.
적합한 세포는 또한 광범위의 질환 상태에서 심지어, 비-질환 상태에 연루된 세포 타입을 포함한다. 따라서, 적합한 진핵생물 세포 타입은 비제한적으로, 모든 타입의 종양 세포 (예를 들어, 흑색종, 골수성 류케미아, 폐, 유방, 난소, 대장, 신장, 전립선, 췌장 및 고환의 암종), 심근세포, 수지상 세포, 내피 세포, 상피 세포, 림프구 (T-세포 및 B-세포), 비만 세포, 호산구, 혈관 내막 세포, 대식세포, 자연 살해 세포, 적혈구, 간세포, 단핵 백혈구를 포함하는 백혈구, (분화 및 탈-분화 인자를 스크리닝하는데 사용하기 위한) 줄기 세포 예컨대, 조혈, 신경, 피부, 폐, 신장, 간 및 미오사이트 줄기 세포, 파골세포, 연골세포 및 기타 연결조직 세포, 각질세포, 멜라닌 세포, 간 세포, 신장 세포, 및 지방 세포를 포함한다. 특정 구체예에서, 세포는 원발성 질환 상태 세포 예컨대, 1차 종양 세포이다. 적합한 세포는 또한, 비제한적으로, Jurkat T 세포, NIH3T3 세포, CHO, COS, 등을 포함하는 공지된 연구 세포를 포함한다. 참조로 본원에 명백히 인용된 ATCC 세포주 카탈로그 참조.
일부 구체예에서, 표적 세포는 종양 미세수포 또는 종양 거대수포이다. 종양-분비된 미세소포 또는 종양-분비된 엑소좀으로서 또한 공지된 종양 미세소포는 순환 혈액에서 찾아볼 수 있으며 면역-억제 활성을 가질 수 있다. 종양 미세소포는 전형적으로 30-200 nm 직경의 크기의 범위이다. 더 큰 종양 미세 소포는 종양 거대 소포로서 언급될 수 있으며, 3- 10 μm 직경의 크기의 범위일 수 있다.
본원에 기재된 하이드로겔 입자는 당업자에게 공지된 임의의 유세포 측정기에 사용될 수 있다. 예를 들어, 표 9에 제공된 유세포 측정기 중 하나 이상은 본원에 기재된 하이드로겔 및 검정에 이용하기 용이하다.
실시예
본 발명은 하기 실시예를 참조로 추가로 설명된다. 그러나, 상기 기술된 구체예와 마찬가지로 이러한 실시예는 예시적인 것이며 어떤 방식으로든 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안됨이 주지되어야 한다.
실시예 1: 하이드로겔 입자의 생성
UV 리소그래피용 포토마스크는 CADart Services Inc.에서 공급 받았으며 AutoCad (AutoDesk, Inc.)를 사용하여 설계되었다. SU-8 포토 레지스트 (Microchem, Inc.)는 마이크로유체 장치 제작을 위한 마스터를 만들기 위해 시준된 UV 광원 (OAI, Inc.)을 사용하여 4" 실리콘 웨이퍼에서 광 가교되었다. PDMS (폴리디메틸실록산, Sigma Aldrich, Inc.)는 소프트 리소그래피 및 미세 유체 장치 제작을 위한 표준 공개 방법을 사용하여 제조되고 형성되었다 (McDonald JC, et al., 2000, Electrophoresis 21: 27-40 참조).
소적은 유중수 에멀젼 (water-in-oil emulsion)에서 소적을 떨어뜨리기 위해 2개의 오일 채널이 모노머 수용액의 중심 스트림에 집중되는 유동-초점 기하학을 이용하여 형성되었다. 플루오로카본-오일 (Novec 7500 3M, Inc.)을 소적 형성을 위한 외부 연속상 액체로 사용하였다. 중합 전에 소적을 안정화시키기 위해, 계면활성제를 0.5% w/w로 오일 상에 첨가하였다 (Krytox 157 FSH (Dupont)의 암모늄 카르복실레이트 염). 기본 폴리아크릴아미드 겔 입자를 제조하기 위해, N-아크릴아미드 (1-20% w/v), 가교제 (N,N'-비스아크릴아미드, 0.05-1% w/v), 촉진제, 및 암모늄 퍼설페이트 (1% w/v)를 함유하는 모노머 수용액의 중심 상을 사용하였다. 소적 형성 후 하이드로겔 입자 중합을 촉발시키기 위해 오일-상에 촉진제 (N,N,N',N'-테트라메틸에틸렌디아민 (2% vol%)을 첨가하였다.
수개의 코-모노머를 기본 겔 포뮬레이션에 첨가하여 작용성을 부가하였다. 알릴-아민은 겔 형성 후 2차 라벨링을 위한 1차 아민 기를 제공하였다. 본 발명자는 코-모노머 알릴 아크릴레이트 및 알릴 메타크릴레이트를 첨가함으로써 겔의 굴절률을 조정함으로써 전방 산란을 조절하였다. 소적의 측방 산란은 중합 전에 중앙 수성 상에 실리카 나노입자 및/또는 PMMA (폴리(메틸 메타크릴레이트))입자 (~100nm)의 콜로이드 현탁액을 첨가하여 튜닝하였다.
2차 라벨링을 위한 화학적으로 직교하는 측 기 (아민, 카르복실, 말레이미드, 에폭시드, 알킨 등)를 함유하는 코-모노머를 사용함으로써 하이드로겔 입자의 화학량론적 다중화를 달성하였다.
소적이 5 kHz의 평균 속도로 형성되었으며 플루오로카본 오일 상에서 수집하였다. 중합은 50℃에서 30분 동안 완료되었으며, 생성된 하이드로겔 입자는 오일로부터 수용액으로 세척하였다.
실시예 2 : 12 11m 하이드로겔 입자의 생성 및 가시화
5% 아크릴아미드, 0.25% 비스아크릴아미드, 0.05% 알릴 아민, 및 0.1% 암모늄 퍼설페이트를 함유하는 물을 중앙 채널을 통해 흐르게 하고 10 마이크론 노즐을 통해 0.1% TEMED를 함유하는 오일에 의해 집중시켜 도 3a에 도시된 바와 같이 10 μm 하이드로겔 입자를 생성하였다. 중합 후, 입자를 물에 세척하고, 도 3b에 도시하고, 관심 염료에 컨쥬게이션하였다. 형광 하이드로겔 입자를 도 3c에 도시된 형광 현미경으로 가시화시켰다.
실시예 3: 하이드로겔 입자 광학 특성의 다차원 튜닝
도 4에 묘사된 바와 같이, 하이드로겔 입자를 다차원으로 튜닝시켜 폴리스티렌 비드와 달리 특정 세포 타입과 매칭시켰다. 세포는 광학 파라미터 예컨대, FSC 및 SSC (도 4a) 또는 2차 마커의 조합을 사용하여 역감쇠 (deconvolved)된다. 하이드로겔 입자를 크기 (FSC) 및 측방 산란(도 4b)이 제한되는 폴리스티렌 비드 (갈색)와 달리 특정 세포 타입의 SSC 및 FSC에 매칭되도록 튜닝하였다. 하이드로겔 입자를 특정 화학적 측-기 및 2차 라벨의 화학량론적으로 튜닝된 비율로 추가로 작용기화시켰으며, 이는 세포 타입이 고정된 세포주가 그러는 것과 같은 생물학적 노이즈로부터 방해받지 않으면서 정확하게 매칭되게 한다 (도 4c).
실시예 4: 하이드로겔 입자 직경의 함수로서 유세포 측정 지연 시간
도 5에 도시된 바와 같이, 유세포 측정기에 대한 내부-드롭 지연은 하이드로겔 입자 직경과 정확하게 관련될 수 있다. 70 내지 100 μm의 유세포 측정기 노즐 크기를 사용하여 3, 6, 10, 32, 및 50 μm 직경의 하이드로겔 입자에 대한 데이터가 표시된다.
실시예 5: 캡슐화된 DNA를 갖는 하이드로겔 입자 대 세포의 비교
캡슐화된 DNA를 갖는 하이드로겔 입자를 형성하기 위해, 40 μg/mL-1000 μg/mL의 재구성된 송아지 가슴샘 DNA를 물 중의 0.1% 알릴 아민 및 20% 19:1(아크릴아미드:비스-아크릴아미드)를 함유하는 폴리머 믹스에 첨가하였다. 0.4% 암모늄퍼설페이트를 소적 형성 전에 믹스에 첨가하였다. 하이드로겔 입자를 실시예 1에 기술된 바와 같이 형성시켰다. 200 μg/mL의 캡슐화된 송아지 가슴샘 DNA를 갖는 하이드로겔 입자는 시중의 이미징 세포측정기를 사용하여 가시화시킬 경우 프로피듐 아이오다이드를 사용하여 세포-유사 염색을 나타냈으며 동일한 절차를 사용하여 염색된 중국 햄스터 난소 세포와 비교하였다. 이미지는 Nexcelom Cellometer™를 사용하여 수득하였다 (도 6).
협측 면봉에서 획득한 세포를 PBS로 세척하고 프로피듐 아이오다이드로 염색하였다. 병행하여, 다양한 DNA 농도를 함유하는 하이드로겔 입자의 군집을 동일한 방식으로 또한 염색하였다. 세포 및 입자 현탁액 둘 모두를 유세포 측정기 (488/590 nm 여기/방출)에서 분석하였다. 뺨 세포 및 동일한 범위의 캡슐화된 DNA 입자의 유동 세포측정 분석은 입자가 다양한 세포-유사 형광 특성을 나타냄을 보여주었다 (도 7, 왼쪽 패널). 염색 강도는 유세포 측정에 의해 측정되는 바와 같이 중간 강도와 선형 상관관계를 보여준다 (도 7, 오른쪽 패널).
실시예 6: 하이드로겔 입자 측방 산란 튜닝
콜로이드 실리카를 폴리머 믹스의 수성 분획에 12.5%, 6.25%, 3.125% 및 0%로 첨가하고, 하이드로겔 입자를 실시예 1에 기술된 바와 같이 형성하였다. 전방 및 측방 산란 데이터를 유세포 측정기를 사용하여 획득하였다. 결과는 측방 산란 신호 (도 8, 왼쪽 패널)가 더 높은 백분율의 캡슐화된 나노입자로 증가된 반면, 전방 산란 (도 8, 오른쪽 패널)은 일반적으로 변화되지 않은 채 유지되었으며, 이는 측방 산란 및 전방 산란의 독립적 튜닝을 입증한다는 것을 보여주었다.
실시예 7: 하이드로겔 입자 측방 산란의 튜닝
이 실험에서, 하이드로겔 조성물 중의 아크릴아미드:비스-아크릴아미드의 백분율은 유세포 측정기에서 전방 산란에 의해 측정되는 바와 같이 하이드로겔 입자의 굴절률을 튜닝하기 위해 10 내지 40%에서 변화시켰다. 도 9에 도시된 바와 같이, 전방 산란은 물의 분획으로서 아크릴아미드:비스아크릴아미드의 백분율이 증가함에 따라 증가되었다.
실시예 8: 하이드로겔 입자 광학 특성의 튜닝
요망되는 세포 서브타입의 광학 특성을 매칭하기 위한 하이드로겔 입자 튜닝의 예. 코/모노머를 나노입자와 조합하여, 유세포 측정기에서 수동 광학 측정을 사용하여 하이드로겔의 전방 및 측방 산란 특성 둘 모두를 튜닝할 수 있다. 이러한 특성을 화학적으로 불안정한 코-모노머 (예를 들어, 알릴 아민, 아크릴산)와 조합함으로써, 산란 특성 이외에 세포 하위군집 염색을 매칭하기 위해 추가적인 형광단/단백질/생물학적 측 기가 첨가되고 (요망되는 경우) 라벨링될 수 있다. 유세포 측정을 사용하여 세포를 식별하는 세 가지 기본 척도가 존재한다. 추가적인 측 기 예컨대, 중금속을 함유하는 측기는 예를 들어, Cy-TOF (세포측정, 비행시간 질량 분석기) 보정에 사용될 수 있다. 최종적으로, 생체적합성 물질은 준세포 세포기관 염색을 모방하도록 캡슐화될 수 있다.
실시예 9: 하이드로겔 입자 광학 특성의 튜닝
50 nm 나노입자 콜로이드 현탁액을 림프구 및 단핵구의 광학 특성을 모방하도록 하이드로겔 매트릭스 내로 혼입하였다 (도 13a 및 13b). 현탁액의 퍼센트 조성물은 혈액 샘플 대조군 (Streck)으로부터 혈액 세포 하위군집과 매칭되도록 조정되었다 (도 13c).
특히, 하이드로겔 입자의 아크릴아미드 모노머 (0.7 - 0.8M)의 농도를 입자의 전방 산란을 증가하도록 조정하여 혈액 세포 하위군집과 매칭시켰다. 비스아크릴아미드 가교제의 백분율은 또한, 전방 산란 (1-5%)에 영향을 미치도록 변화될 수 있다. 실리카 나노입자를 조성물 중에 5% 또는 10%로 사용하여 측방 산란을 조정하였다. 이 실험의 결과를 표 13에 나타낸다.
본 출원 전반에 걸쳐 언급된 모든 문헌, 특허, 특허 출원, 공개, 제품 설명, 및 프로토콜은 모든 목적에 있어서 그 전체가 참조로 본원에 통합된다.
본 명세서에 예시되고 논의된 구체예는 단지 본 발명을 실시하고 사용하기 위해 발명자가 알고 있는 최선의 방법을 당업자에게 교시하기 위한 것으로 의도된다. 본 발명의 상기 기술된 구체예의 변경 및 변형은, 상기 교시의 관점에서 당업자에게 자명한 바와 같이, 본 발명으로부터 벗어나지 않으면서 가능하다. 따라서, 청구범위 및 이의 등가물 내에서 본 발명이 특정하게 기술된 것과 다르게 실시될 수 있음이 이해된다.

Claims (40)

  1. 표적 세포 분석을 위한 세포 측정 장치(cytometric device)를 보정하는 방법으로서,
    표적 세포와 실질적으로 유사한 적어도 하나의 광학 특성을 갖는 하이드로겔 입자를 장치 내로 삽입하는 단계로서, 하이드로겔 입자는 중합된 모노머를 포함하며 적어도 하나의 표면을 갖는 단계;
    세포 측정 장치를 사용하여 하이드로겔 입자의 적어도 하나의 광학 특성을 측정하는 단계를 포함하는 방법.
  2. 샘플에서 표적 세포를 검출하는 방법으로서,
    표적 세포와 실질적으로 유사한 적어도 하나의 광학 특성을 갖는 하이드로겔 입자를 장치 내로 삽입하는 단계로서, 하이드로겔 입자는 중합된 모노머를 포함하는 단계;
    세포 측정 장치를 사용하여 하이드로겔 입자의 적어도 하나의 광학 특성을 측정하는 단계;
    복수의 세포를 포함하는 세포 측정 장치에서 샘플을 삽입하는 단계;
    복수의 세포 중 개별 세포의 적어도 하나의 광학 특성을 측정하는 단계;
    광학 특성 측정에 기초하여 표적 세포 또는 복수의 표적 세포가 샘플 중에 존재하는 지의 여부를 결정하는 단계를 포함하는 방법.
  3. 제 2항에 있어서, 표적 세포 또는 복수의 표적 세포를 샘플 중에 존재하는 경우 별도의 용기로 분류하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  4. 제 1항 내지 제 3항 중의 어느 한 항에 있어서, 복수의 하이드로겔 입자를 세포 측정 장치 내로 삽입시키는 것을 추가로 포함하며, 하이드로겔 입자 각각은 표적 세포와 실질적으로 유사한 적어도 하나의 광학 특성을 갖는 방법.
  5. 제 4항에 있어서, 적어도 하나의 광학 특성이 복수의 하이드로겔 입자 각각에 있어서 동일한 방법.
  6. 제 1항 내지 제 5항 중의 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 광학 특성이 측방 산란 (SSC)인 방법.
  7. 제 1항 내지 제 4항 중의 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 광학 특성이 전방 산란 (FSC)인 방법.
  8. 제 1항 내지 제 4항 중의 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 광학 특성이 형광 방출인 방법.
  9. 제 1항 내지 제 5항 중의 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 광학 특성이 FSC 및 SSC인 방법.
  10. 제 1항 내지 제 6항 중의 어느 한 항에 있어서, 모노머가 하이드록시에틸 메타크릴레이트, 에틸 메타크릴레이트, 2-하이드록시에틸 메타크릴레이트 (HEMA), 프로필렌 글리콜 메타크릴레이트, 아크릴아미드, N-비닐피롤리돈 (NVP), 메틸 메타크릴레이트, 글리시딜 메타크릴레이트, 글리세롤 메타크릴레이트 (GMA), 글리콜 메타크릴레이트, 에틸렌 글리콜, 푸마르산, 2-하이드록시에틸 메타크릴레이트, 하이드록시에톡시에틸 메타크릴레이트, 하이드록시디에톡시에틸 메타크릴레이트, 메톡시에틸 메타크릴레이트, 메톡시에톡시에틸 메타크릴레이트, 메톡시디에톡시에틸 메타크릴레이트, 폴리(에틸렌 글리콜) 메타크릴레이트, 메톡시-폴리(에틸렌 글리콜) 메타크릴레이트, 메타크릴산, 소듐 메타크릴레이트, 글리세롤 메타크릴레이트, 하이드록시프로필 메타크릴레이트, 하이드록시부틸 메타크릴레이트, 페닐 아크릴레이트, 페닐 메타크릴레이트, 벤질 아크릴레이트, 벤질 메타크릴레이트, 2-페닐에틸 아크릴레이트, 2-페닐에틸 메타크릴레이트, 2-페녹시에틸 아크릴레이트, 2-페녹시에틸 메타크릴레이트, 페닐티오에틸 아크릴레이트, 페닐티오에틸 메타크릴레이트, 2,4,6-트리브로모페닐 아크릴레이트, 2,4,6-트리브로모페닐 메타크릴레이트, 펜타브로모페닐 아크릴레이트, 펜타브로모페닐 메타크릴레이트, 펜타클로로페닐 아크릴레이트, 펜타클로로페닐 메타크릴레이트, 2,3-디브로모프로필 아크릴레이트, 2,3-디브로모프로필 메타크릴레이트, 2-나프틸 아크릴레이트, 2-나프틸 메타크릴레이트, 4-메톡시벤질 아크릴레이트, 4-메톡시벤질 메타크릴레이트, 2-벤질옥시에틸 아크릴레이트, 2-벤질옥시에틸 메타크릴레이트, 4-클로로페녹시에틸 아크릴레이트, 4-클로로페녹시에틸 메타크릴레이트, 2-페녹시에톡시에틸 아크릴레이트, 2-페녹시에톡시에틸 메타크릴레이트, N-페닐 아크릴아미드, N-페닐 메타크릴아미드, N-벤질 아크릴아미드, N-벤질 메타크릴아미드, N,N-디벤질 아크릴아미드, N,N-디벤질 메타크릴아미드, N-디페닐메틸 아크릴아미드 N-(4-메틸페닐)메틸 아크릴아미드, N-1-나프틸 아크릴아미드, N-4-니트로페닐 아크릴아미드, N-(2-페닐에틸)아크릴아미드, N-트리페닐메틸 아크릴아미드, N-(4-하이드록시페닐)아크릴아미드, N,N-메틸페닐 아크릴아미드, N,N-페닐 페닐에틸 아크릴아미드, N-디페닐메틸 메타크릴아미드, N-(4-메틸 페닐)메틸 메타크릴아미드, N-1-나프틸 메타크릴아미드, N-4-니트로페닐 메타크릴아미드, N-(2-페닐에틸)메타크릴아미드, N-트리페닐메틸 메타크릴아미드, N-(4-하이드록시페닐)메타크릴아미드, N,N-메틸페닐 메타크릴아미드, N,N'-페닐 페닐에틸 메타크릴아미드, N-비닐카르바졸, 4-비닐피리딘, 2-비닐피리딘, 또는 이들의 조합물로부터 선택되는 방법.
  11. 제 1항 내지 제 9항 중의 어느 한 항에 있어서, 모노머가 생분해성 모노머인 방법.
  12. 제 11항에 있어서, 생분해성 모노머가 모노사카라이드, 디사카라이드, 폴리사카라이드, 펩티드, 단백질 또는 단백질 도메인인 방법.
  13. 제 12항에 있어서, 생분해성 모노머가 적어도 하나의 비천연 아미노산을 포함하는 단백질 또는 단백질 도메인인 방법.
  14. 제 11항에 있어서, 생분해성 모노머가 구조 폴리사카라이드인 방법.
  15. 제 11항에 있어서, 생분해성 모노머가 아가(agar), 아가로스(agarose), 알긴산(alginic acid), 알구론산(alguronic acid), 알파 글루칸(alpha glucan), 아밀로펙틴(amylopectin), 아밀로스(amylose), 아라비녹실란(arabinoxylan), 베타-글루칸(beta-glucan), 칼로스(callose), 캡술란(capsullan), 카라기난(carrageenan) 폴리사카라이드, 셀로덱스트린(cellodextrin), 셀룰린(cellulin), 셀룰로스, 키틴(chitin), 키토산(chitosan), 크리솔아미나린(chrysolaminarin), 쿠르들란(curdlan), 사이클로덱스트린(cyclodextrin), 알파-사이클로덱스트린, 덱스트린, 덱스트란(dextran), 피콜(ficoll), 프룩탄(fructan), 푸코이단(fucoidan), 갈락토글루코만난(galactoglucomannan), 갈락토만난(galactomannan), 갈락토사미노오갈락탄(galactosaminoogalactan), 겔란 검(gellan gum), 글루칸(glucan), 글루코만난(glucomannan), 글루코루녹실란(glucorunoxylan), 글리코칼릭스(glycocalyx), 글리코겐(glycogen), 헤미셀룰로스(hemicellulose), 호모폴리사카라이드, 하이프로멜로스(hypromellose), 아이코덱스트린(icodextrin), 이눌린(inulin), 케피란(kefiran), 라미나린(laminarin), 렌티난(lentinan), 레반(levan) 폴리사카라이드, 리케닌(lichenin), 만난, 혼합-연결 글루칸(mixed-linkage glucan), 파라밀론(paramylon), 펙트산(pectic acid), 펙틴(pectin), 펜타스타치(pentastarch), 피토글리코겐(phytoglycogen), 플레우란(pleuran), 폴리덱스트로스, 폴리사카라이드 펩티드, 포르피란(porphyran), 풀루란(pullulan), 쉬조필란(schizophyllan), 시니스트린(sinistrin), 시조피란(sizofiran), 웰란 검(welan gum), 잔탄 검(xanthan gum), 자일란(xylan), 자일로글루칸(xyloglucan), 자이모산(zymosan), 또는 이들의 조합물인 방법.
  16. 제 11항에 있어서, 생분해성 모노머가 키토산 또는 히알루로난인 방법.
  17. 제 12항에 있어서, 단백질이 구조 단백질, 이의 도메인 또는 이들의 조합물인 방법.
  18. 제 12항에 있어서, 단백질이 프로테오글리칸, 이의 도메인, 또는 이들의 조합물인 방법.
  19. 제 12항에 있어서, 단백질이 세포외 기질 성분인 방법.
  20. 제 18항에 있어서, 프로테오글리칸이 데코린(decorin), 바이글리칸(biglycan), 테스티칸(testican), 바이쿠닌(bikunin), 피브로모둘린(fibromodulin), 루미칸(lumican), 이의 도메인, 또는 이들의 조합물인 방법.
  21. 제 19항에 있어서, 단백질이 콜라겐, 엘라스틴 또는 프로테오글리칸인 방법.
  22. 제 21항에 있어서, 단백질이 콜라겐인 방법.
  23. 제 22항에 있어서, 콜라겐이 콜라겐 타입 I, 콜라겐 타입 II, 콜라겐 타입 III, 이들의 도메인 또는 이들의 조합물인 방법.
  24. 제 1항 내지 제 23항 중의 어느 한 항에 있어서, 모노머가 작용기화되는 방법.
  25. 제 24항에 있어서, 모노머가 아크릴레이트 또는 아크릴아미드로 작용기화되는 방법.
  26. 제 1항 내지 제 25항 중의 어느 한 항에 있어서, 모노머가 이작용성 모노머인 방법.
  27. 제 1항 내지 제 26항 중의 어느 한 항에 있어서, 하이드로겔 입자가 적어도 하나의 표면 상에서 작용기화되는 방법.
  28. 제 27항에 있어서, 하이드로겔 입자가 항체 또는 이의 단편으로 작용기화되는 방법.
  29. 제 27항에 있어서, 하이드로겔이 적어도 하나의 세포 표면 마커로 작용기화되는 방법.
  30. 제 29항에 있어서, 세포 표면 마커가 표 2에 제시된 세포 표면 마커 또는 이들의 조합물 중 하나인 방법.
  31. 제 27항에 있어서, 하이드로겔 입자가 적어도 하나의 표면 상에서 형광단으로 작용기화되는 방법.
  32. 제 1항 내지 제 31항 중의 어느 한 항에 있어서, 물질이 하이드로겔 입자에 의해 캡슐화되는 방법.
  33. 제 32항에 있어서, 물질이 비드인 방법.
  34. 제 33항에 있어서, 비드가 형광 비드인 방법.
  35. 제 34항에 있어서, 형광 비드가 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 9개 파장에서 형광을 방출하는 방법.
  36. 제 33항 내지 제 35항 중의 어느 한 항에 있어서, 비드가 약 500 nm 내지 약 10 μm의 직경을 갖는 방법.
  37. 제 32항에 있어서, 물질이 생체분자인 방법.
  38. 제 37항에 있어서, 생체분자가 핵산, 단백질, 펩티드, 탄수화물 또는 이들의 조합물인 방법.
  39. 제 33항 내지 제 36항 중의 어느 한 항에 있어서, 세포 측정 장치의 하나 이상의 특성을 하이드로겔 입자로 보정하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  40. 제 39항에 있어서, 세포 측정 장치의 하나 이상의 특성이 세포 분류 시스템, 레이저 소스, 광학, 스트림 흐름 또는 이들의 조합인 방법.
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