KR20210109675A - 콜레스테롤 관련 질환을 치료 또는 예방하는 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 프로단백질 전환효소 서브틸리신/케신 유형 9 (PCSK9)에 대한 항체를 이용하여, 콜레스테롤 관련 질환, 예를 들면, 고콜레스테롤혈증, 고지질혈증 또는 이상지질혈증을 치료 또는 예방하는 방법에 관계한다. 제제 및 상기 제제를 생산하는 방법 역시 설명된다.

Description

콜레스테롤 관련 질환을 치료 또는 예방하는 방법{METHODS OF TREATING OR PREVENTING CHOLESTEROL RELATED DISORDERS}

본 출원은 2012년 5월 3일자 제출된 U.S. Provisional Application No. 61/642,363, 2012년 3월 22일자 제출된 U.S. Provisional Application No. 61/614,417, 2012년 2월 6일자 제출된 U.S. Provisional Application No. 61/595,526, 2011년 11월 21일자 제출된 U.S. Provisional Application No. 61/562,303, 2011년 5월 10일자 제출된 U.S. Provisional Application No. 61/484,610에 우선권을 주장하고, 이들 모두 본원에 참고문헌으로 편입된다.

서열 목록에 대한 참조

본 출원은 전자 형태의 서열 목록과 함께 제출된다. 서열 목록은 2012년 5월 10일자에 작성되고 A-1635-WO-PCT_Sequence_Listing.txt로 명명된 315 KB 크기의 파일로서 제공된다. 서열 목록의 전자 형태에서 정보는 본원에 전체로서 참고문헌으로 편입된다.

본 발명의 분야

본 발명은 프로단백질 전환효소 서브틸리신/케신 유형 9 (PCSK9)에 대한 항체를 비롯한 항원 결합 단백질을 이용하여, 콜레스테롤 관련 질환, 예를 들면, 고콜레스테롤혈증, 고지질혈증 또는 이상지질혈증을 치료 또는 예방하는 방법에 관계한다. 제약학적 제제 및 상기 제제를 생산하는 방법 역시 설명된다.

배경

"콜레스테롤 관련 질환" (이것은 "혈청 콜레스테롤 관련 질환"을 포함한다)은 하기 중에서 하나 또는 그 이상을 포함한다: 고콜레스테롤혈증, 과지질혈증, 심장 질환, 신진대사장애, 당뇨병, 관상동맥성 심장 질환, 뇌졸중, 심혈관 질환, 알츠하이머병, 그리고 일반적으로, 이상지질혈증, 이것은 예로써, 상승된 총 혈청 콜레스테롤, 상승된 LDL, 상승된 트리글리세리드, 상승된 VLDL, 및/또는 낮은 HDL에 의해 표현될 수 있다. 고콜레스테롤혈증은 실제로, 인간에서 관상동맥성 심장 질환 (CHD)에 대한 확립된 위험 인자이다. 저밀도 지방단백 콜레스테롤 (LDL-C)의 저하는 심혈관 위험의 감소를 유발하고 CHD에 대한 약물요법에서 일차적인 목적이다. 스타틴 (히드록시메틸글루타릴 조효소 A [HMG CoA] 환원효소 저해제)은 고콜레스테롤혈증에 대해 현재 선택되는 치료제이다. 하지만, 최근의 데이터는 고콜레스테롤혈증의 더욱 공격적인 치료가 CHD 사건에 대한 더욱 낮은 위험과 연관된다는 것을 지시한다. 이에 더하여, 환자의 부분집합은 스타틴 요법에 비내성이거나, 또는 적절하게 반응하지 않는다. 따라서 단독으로, 또는 LDL-C를 더욱 효과적으로 감소시키기 위해 기존 작용제와 공동으로 이용될 수 있는 신규한 요법이 유용할 수 있다.

간 세포 표면 저밀도 지방단백 수용체 (LDLR)의 재순환은 혈장 LDL-C 수준을 조절함으로써 세포와 전신 콜레스테롤 균형의 유지에서 결정적인 역할을 수행하는 것으로 널리 확립되어 있다. 더욱 최근에, 프로단백질 전환효소 서브틸리신/케신 유형 9 (PCSK9)는 LDLR의 재순환과 조절에서 중요한 역할을 수행하는 것으로 밝혀졌다. PCSK9는 세린 프로테아제의 서브틸리신 패밀리의 구성원이고 간에서 주로 발현된다. 분비 이후에, 이것은 LDLR에 직접적인 결합을 수반하는 기전에 의해, 간 세포 표면 LDLR의 번역후 하향 조절을 유발한다. 간 LDLR의 하향 조절은 차례로, 순환 LDL-C의 증가된 수준을 유발한다. 따라서 PCSK9는 고콜레스테롤혈증의 설정에서 신규한 치료제에 의한 저해를 위한 표적을 대표할 수 있다. 이런 접근법에 대한 강한 이론적 근거는 전임상 모델에서 연구로부터, 그리고 PCSK9 기능 상실 돌연변이를 갖는 인간이 정상보다 낮은 콜레스테롤 수준 및 CHD의 감소된 발생률을 갖는다는 조사결과로부터 가용하다.

다양한 구체예의 요약

본 발명의 일부 양상에서, PCSK9에 특이적으로 결합하는 적어도 하나의 단일클론 항체를 포함하는 안정된 제제가 제시되고, 여기서 PCSK9는 서열번호 1의 아미노산을 포함하고, 상기 안정된 제제는 약 40 mg/ml 내지 약 300 mg/ml의 양의 상기 단일클론 항체, 그리고 약 0.05 mM 내지 약 40 mM의 양의 제약학적으로 허용되는 완충제, 그리고 약 0.01% w/v 내지 약 20% w/v의 양의 제약학적으로 허용되는 계면활성제, 그리고 약 0.5% w/v 내지 약 10% w/v의 적어도 하나의 제약학적으로 허용되는 안정화제를 포함하고, 여기서 상기 안정된 제제는 약 4.0 내지 약 6.0의 pH를 갖는다. 일부 구체예에서, 상기 안정된 제제는 글루타민산염, 인산염, 인산염 완충 염수, 아세트산나트륨, 구연산나트륨, 그리고 Tris 완충제로 구성된 군에서 선택되는 제약학적으로 허용되는 완충제를 포함한다. 특정 구체예에서, 상기 안정된 제제의 제약학적으로 허용되는 완충제는 10-20 mM의 양으로 존재한다. 특정 구체예에서, 제약학적으로 허용되는 완충제는 10-20 mM의 양의 아세트산나트륨이다. 일부 구체예에서, 제약학적으로 허용되는 계면활성제는 약 0.004% w/v 내지 약 0.01% w/v의 양으로 존재한다. 특정 구체예에서, 상기 안정된 제제의 제약학적으로 허용되는 계면활성제는 폴리소르베이트 80 또는 폴리소르베이트 20이다. 추가의 구체예에서, 제약학적으로 허용되는 계면활성제는 약 0.004% w/v 내지 약 0.01% w/v의 양으로 존재하는 폴리소르베이트 80 또는 폴리소르베이트 20이다.

일부 구체예에서, 상기 안정된 제제의 제약학적으로 허용되는 안정화제는 폴리히드록시 탄화수소, 이당류, 폴리올, 프롤린, 아르기닌, 리신, 메티오닌, 타우린, 그리고 벤질 알코올로 구성된 군에서 선택된다. 일부 구체예에서, 제약학적으로 허용되는 안정화제는 소르비탈, 만니톨, 그리고 글리세롤로 구성된 군에서 선택되는 폴리히드록시 탄화수소이다. 특정 구체예에서, 상기 안정된 제제의 폴리히드록시 탄화수소는 소르비탈이다. 일부 구체예에서, 제약학적으로 허용되는 안정화제는 수크로오스, 말토오스, 락토오스, 프럭토오스, 및 트레할로스로 구성된 군에서 선택되는 이당류이다. 일부 구체예에서, 이당류 안정화제는 약 9% w/v의 양으로 존재한다. 일부 구체예에서, 상기 이당류는 수크로오스이다. 특정 구체예에서, 수크로오스는 상기 안정된 제제 내에 약 9% w/v의 양으로 존재한다. 일부 구체예에서, 안정화제는 프롤린, 아르기닌, 리신, 메티오닌, 그리고 타우린으로 구성군 군에서 선택되는 아미노산이다. 특정 구체예에서, 안정화제는 프롤린이다. 추가의 구체예에서, 프롤린은 상기 안정된 제제 내에 약 2% 내지 3% w/v의 양으로 존재한다. 일부 구체예에서, 상기 안정된 제제의 pH는 약 5.0 내지 약 5.5이다.

일부 구체예에서, 상기 안정된 제제는 하기를 포함하는 단일클론 항체를 포함한다: 서열번호 23의 아미노산 서열에 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 49의 아미노산 서열에 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 서열번호 12의 아미노산 서열에 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 67의 아미노산 서열에 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 서열번호 461의 아미노산 서열에 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 459의 아미노산 서열에 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 서열번호 465의 아미노산 서열에 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 463의 아미노산 서열에 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 또는 서열번호 485의 아미노산 서열에 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 483의 아미노산 서열에 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역.

일부 구체예에서, 상기 안정된 제제는 하기를 포함하는 단일클론 항체를 포함한다: 서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 49의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 67의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 서열번호 461의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 459의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 서열번호 465의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 463의 아미노산을 포함하는 중쇄 가변 영역, 또는 서열번호 485의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 483의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역.

일부 구체예에서, 상기 안정된 제제는 단일클론 항체 21B12, 31H4, 8A3, 11F1, 또는 8A1을 포함한다.

일부 구체예에서, 상기 안정된 제제는 25℃에서 30 cP 또는 그 이하의 점도를 포함한다. 특정 구체예에서, 상기 안정된 제제에서 단일클론 항체는 약 70 mg/ml 내지 약 150 mg/ml으로 존재하고, 그리고 안정된 제제는 25℃에서 12 cP 또는 그 이하의 점도를 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 안정된 제제는 약 250 mOsmol/kg 내지 약 350 mOsmol/kg의 삼투질 농도를 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 안정된 제제는 적어도 3, 6, 12 또는 24개월 동안 안정하게 유지된다.

특정 구체예에서, 상기 안정된 제제는 서열번호 465의 아미노산 서열에 적어도 90% 동일한 경쇄 가변 영역 및 서열번호 463의 아미노산 서열에 적어도 90% 동일한 중쇄 가변 영역을 갖는 단일클론 항체를 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 안정된 제제는 서열번호 465의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 463의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 갖는 단일클론 항체를 포함하고, 그리고 여기서 단일클론 항체의 양은 약 150 mg/ml이다.

일부 구체예에서, 상기 안정된 제제는 서열번호 23의 아미노산 서열에 적어도 90% 동일한 경쇄 가변 영역 및 서열번호 49의 아미노산 서열에 적어도 90% 동일한 중쇄 가변 영역을 갖는 항체를 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 안정된 제제는 서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 49의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 갖는 단일클론 항체를 포함하고, 그리고 여기서 단일클론 항체의 양은 약 120 mg/ml 또는 140 mg/ml이다.

특정 구체예에서, 상기 안정된 제제는 (a) 약 70 mg/ml 내지 약 200 mg/ml의 양의 단일클론 항체, 상기 단일클론 항체는 하기를 포함하고: 서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 49의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 67의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 서열번호 461의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 459의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 서열번호 465의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 463의 아미노산을 포함하는 중쇄 가변 영역, 또는 서열번호 485의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 483의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 그리고 약 10 mM 아세트산나트륨; 약 9.0% w/v 수크로오스; 약 0.004% 내지 약 0.01% w/v 폴리소르베이트 20 또는 폴리소르베이트 80, 그리고 약 5.2의 pH를 포함한다.

이러한 양상에서, 단일클론 항체는 21B12, 8A3, 11F1일 수 있다. 이러한 양상의 특정 구체예에서, 단일클론 항체는 21B12이고 상기 안정된 제제 내에 약 140 mg/ml의 양으로 존재한다. 이러한 양상의 추가의 구체예에서, 청구항의 안정된 제제는 약 0.004% 폴리소르베이트 20을 포함한다. 이러한 양상의 추가의 특정 구체예에서, 상기 안정된 제제는 약 150 mg/ml의 양으로 존재하는 단일클론 항체 8A3을 포함한다.

이러한 양상의 추가의 구체예에서, 상기 안정된 제제는 약 140, 150, 160. 170, 180, 190, 또는 200 mg/ml의 양의 단일클론 항체 11F1을 포함한다. 특정 구체예에서, 11F1을 포함하는 안정된 제제는 약 0.01% 폴리소르베이트 80 역시 포함한다.

추가의 구체예에서, 안정된 제제는 (a) 약 70 mg/ml 내지 약 200 mg/ml의 양의 단일클론 항체, 상기 단일클론 항체는 하기를 포함하고: 서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 49의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 67의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 서열번호 461의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 459의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 서열번호 465의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 463의 아미노산을 포함하는 중쇄 가변 영역, 또는 서열번호 485의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 483의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 그리고 약 10 mM 아세트산나트륨; 약 2.0% 내지 3.0% w/v 프롤린; 약 0.01% w/v 폴리소르베이트 20 또는 폴리소르베이트 80, 그리고 약 5.0의 pH를 포함한다. 이러한 양상의 일부 구체예에서, 안정된 제제는 단일클론 항체 21B12, 8A3 또는 11F1을 포함한다.

본 발명의 다른 양상에서, 안정된 제제는 약 70 mg/ml 내지 약 200 mg/ml의 양의 항-PCSK9 단일클론 항체, 상기 단일클론 항체는 하기를 포함하고: 서열번호 577의 서열에 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 576의 서열에 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 서열번호 577의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 576의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 서열번호 588의 서열에 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 589의 서열에 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 또는 서열번호 588의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 589의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 그리고 (b) 약 10 mM 아세트산나트륨; (c) 약 9.0% w/v 수크로오스; (d) 약 0.004% 내지 약 0.01% w/v 폴리소르베이트 20 또는 폴리소르베이트 80, 그리고 (e) 약 5.2의 pH를 포함한다.

본 발명의 다른 양상에서, 안정된 제제는 약 70 mg/ml 내지 약 200 mg/ml의 양의 항-PCSK9 단일클론 항체, 상기 단일클론 항체는 하기를 포함하고: 서열번호 577의 서열에 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 576의 서열에 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 서열번호 577의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 576의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 서열번호 588의 서열에 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 589의 서열에 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 또는 서열번호 588의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 589의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 그리고 (b) 약 10 mM 아세트산나트륨; (c) 약 2.0% 내지 3.0% w/v 프롤린; (d) 약 0.01% w/v 폴리소르베이트 20 또는 폴리소르베이트 80, 그리고 (e) 약 5.0의 pH를 포함한다.

일부 양상에서, 본 발명은 환자에서 혈청 LDL 콜레스테롤을 저하시키는 방법을 제시하고, 상기 방법은 적어도 하나의 항-PCSK9 항체를 이를 필요로 하는 환자에 약 10 mg 내지 약 3000 mg의 분량으로 투여하여, 환자에서 혈청 LDL 콜레스테롤의 투약전 수준과 비교하여 상기 혈청 LDL 콜레스테롤 수준을 적어도 약 15% 저하시키는 것을 포함한다. 본 발명의 이러한 양상의 일부 구체예에서, 상기 환자의 혈청 LDL 콜레스테롤 수준은 환자에서 혈청 LDL 콜레스테롤의 투약전 수준과 비교하여 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 또는 적어도 약 90% 저하된다.

본 발명의 이러한 양상의 일부 구체예에서, 항-PCSK9 항체는 약 35 mg 내지 약 3000 mg, 약 35 mg 내지 약 2800 mg, 약 35 mg 내지 약 2500 mg, 약 35 mg 내지 약 2000 mg, 약 35 mg 내지 약 1800 mg, 약 35 mg 내지 약 1400 mg, 약 25 mg 내지 약 1200 mg, 약 35 mg 내지 약 1000 mg, 약 35 mg 내지 약 700 mg, 약 45 mg 내지 약 700 mg, 약 45 mg 내지 약 600 mg, 약 45 mg 내지 약 450 mg, 약 70 mg 내지 약 450 mg, 약 105 mg 내지 약 420 mg, 약 120 mg 내지 약 200 mg, 약 140 mg 내지 약 200 mg, 약 140 mg 내지 약 180 mg, 또는 약 140 mg 내지 약 170 mg, 약 420 mg 내지 약 3000 mg, 약 700 mg 내지 약 3000 mg, 약 1000 mg 내지 약 3000 mg, 약 1200 내지 약 3000 mg, 약 1400 mg 내지 약 3000 mg, 약 1800 mg 내지 약 3000 mg, 약 2000 mg 내지 약 3000 mg, 약 2400 mg 내지 약 3000 mg, 또는 약 2800 mg 내지 약 3000 mg의 분량으로 환자에게 투여된다. 이러한 양상의 일부 구체예에서, 항-PCSK9 항체는 약 35 mg, 약 45 mg, 약 70 mg, 약 105 mg, 약 120 mg, 약 140 mg, 약 150 mg, 약 160 mg, 약 170 mg, 약 180 mg, 약 190 mg, 약 200 mg, 약 210 mg, 약 280 mg, 약 360 mg, 약 420 mg, 약 450 mg, 약 600 mg, 약 700 mg, 약 1200 mg, 약 1400 mg, 약 1800 mg, 약 2000 mg, 약 2500 mg, 약 2800 mg, 또는 약 3000 mg의 분량으로 환자에게 투여된다.

본 발명의 이러한 양상의 일부 구체예에서, 항-PCSK9 항체는 (1) 주 1회, (2) 2주마다 1회, (3) 월 1회, (4) 격월마다 1회, (5) 3개월마다 1회, (6) 6개월마다 1회, 그리고 (7) 12개월마다 1회로 구성된 군에서 선택되는 일정으로 환자에게 투여된다. 본 발명의 이러한 양상의 일부 구체예에서, 항-PCSK9 항체는 비경구 투여된다. 본 발명의 이러한 양상의 일부 구체예에서, 항-PCSK9 항체는 정맥내 투여된다. 본 발명의 이러한 양상의 일부 구체예에서, 항-PCSK9 항체는 피하 투여된다.

본 발명의 이러한 양상의 일부 구체예에서, 항-PCSK9 항체는 하기를 포함한다: 서열번호 23의 아미노산 서열에 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 49의 아미노산 서열에 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 서열번호 12의 아미노산 서열에 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 67의 아미노산 서열에 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 서열번호 461의 아미노산 서열에 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 459의 아미노산 서열에 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 서열번호 465의 아미노산 서열에 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 463의 아미노산 서열에 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 서열번호 485의 아미노산 서열에 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 483의 아미노산 서열에 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 또는 서열번호 582의 아미노산 서열에 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 583의 아미노산 서열에 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역. 본 발명의 이러한 양상의 일부 구체예에서, 항-PCSK9 항체는 하기를 포함한다: 서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역, 그리고 서열번호 49의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역, 그리고 서열번호 67의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 서열번호 461의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 459의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 서열번호 465의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 463의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 서열번호 485의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 483의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 또는 서열번호 582의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역, 그리고 서열번호 583의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역. 본 발명의 이러한 양상의 일부 구체예에서, 항-PCSK9 항체는 21B12, 31H4, 8A3, 11F1 및 8A1로 구성된 군에서 선택된다.

일부 양상에서, 본 발명은 혈청 LDL 콜레스테롤 수준을 갖는 환자에서 콜레스테롤 관련 질환을 치료 또는 예방하는 방법을 포함하고, 상기 방법은 적어도 하나의 항-PCSK9 항체를 이를 필요로 하는 환자에 약 10 mg 내지 약 3000 mg의 분량으로 투여하여 환자에서 콜레스테롤 관련 질환을 치료 또는 예방하는 것을 포함한다. 이러한 구체예의 한 양상에서, 치료되거나 예방되는 콜레스테롤 관련 질환은 이형 가족성 고콜레스테롤혈증 및 동질접합성 가족성 고콜레스테롤혈증을 비롯한 가족성 고콜레스테롤혈증, 비-가족성 고콜레스테롤혈증, 상승된 지단백 (a), 심장 질환, 신진대사장애, 당뇨병, 관상동맥성 심장 질환, 뇌졸중, 심혈관 질환, 알츠하이머병, 말초 동맥 질환, 고지질혈증 또는 이상지질혈증이다. 이러한 양상의 일부 구체예에서, 상기 환자의 혈청 LDL 콜레스테롤 수준은 상기 환자에서 혈청 LDL 콜레스테롤의 투약전 수준과 비교하여 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 또는 적어도 약 90% 저하된다.

본 발명의 이러한 양상의 일부 구체예에서, 항-PCSK9 항체는 약 35 mg 내지 약 3000 mg, 약 35 mg 내지 약 2800 mg, 약 35 mg 내지 약 2500 mg, 약 35 mg 내지 약 2000 mg, 약 35 mg 내지 약 1800 mg, 약 35 mg 내지 약 1400 mg, 약 25 mg 내지 약 1200 mg, 약 35 mg 내지 약 1000 mg, 약 35 mg 내지 약 700 mg, 약 45 mg 내지 약 700 mg, 약 45 mg 내지 약 600 mg, 약 45 mg 내지 약 450 mg, 약 70 mg 내지 약 450 mg, 약 105 mg 내지 약 420 mg, 약 120 mg 내지 약 200 mg, 약 140 mg 내지 약 200 mg, 약 140 mg 내지 약 180 mg, 또는 약 140 mg 내지 약 170 mg, 약 420 mg 내지 약 3000 mg, 약 700 mg 내지 약 3000 mg, 약 1000 mg 내지 약 3000 mg, 약 1200 내지 약 3000 mg, 약 1400 mg 내지 약 3000 mg, 약 1800 mg 내지 약 3000 mg, 약 2000 mg 내지 약 3000 mg, 약 2400 mg 내지 약 3000 mg, 또는 약 2800 mg 내지 약 3000 mg의 분량으로 환자에게 투여된다. 이러한 양상의 일부 구체예에서, 항-PCSK9 항체는 약 35 mg, 약 45 mg, 약 70 mg, 약 105 mg, 약 120 mg, 약 140 mg, 약 150 mg, 약 160 mg, 약 170 mg, 약 180 mg, 약 190 mg, 약 200 mg, 약 210 mg, 약 280 mg, 약 360 mg, 약 420 mg, 약 450 mg, 약 600 mg, 약 700 mg, 약 1200 mg, 약 1400 mg, 약 1800 mg, 약 2000 mg, 약 2500 mg, 약 2800 mg, 또는 약 3000 mg의 분량으로 환자에게 투여된다.

본 발명의 이러한 양상의 일부 구체예에서, 항-PCSK9 항체는 (1) 주 1회, (2) 2주마다 1회, (3) 월 1회, (4) 격월마다 1회, (5) 3개월마다 1회, (6) 6개월마다 1회, 그리고 (7) 12개월마다 1회로 구성된 군에서 선택되는 일정으로 환자에게 투여된다. 본 발명의 이러한 양상의 일부 구체예에서, 항-PCSK9 항체는 비경구 투여된다. 본 발명의 이러한 양상의 일부 구체예에서, 항-PCSK9 항체는 정맥내 투여된다. 본 발명의 이러한 양상의 일부 구체예에서, 항-PCSK9 항체는 피하 투여된다.

본 발명의 이러한 양상의 일부 구체예에서, 항-PCSK9 항체는 하기를 포함한다: 서열번호 23의 아미노산 서열에 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 49의 아미노산 서열에 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 서열번호 12의 아미노산 서열에 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 67의 아미노산 서열에 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 서열번호 461의 아미노산 서열에 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 459의 아미노산 서열에 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 서열번호 465의 아미노산 서열에 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 463의 아미노산 서열에 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 서열번호 485의 아미노산 서열에 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 483의 아미노산 서열에 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 또는 서열번호 582의 아미노산 서열에 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 583의 아미노산 서열에 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역. 본 발명의 이러한 양상의 일부 구체예에서, 항-PCSK9 항체는 하기를 포함한다: 서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역, 그리고 서열번호 49의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역, 그리고 서열번호 67의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 서열번호 461의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 459의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 서열번호 465의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 463의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 서열번호 485의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 483의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 또는 서열번호 582의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역, 그리고 서열번호 583의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역. 본 발명의 이러한 양상의 일부 구체예에서, 항-PCSK9 항체는 21B12, 31H4, 8A3, 11F1 및 8A1로 구성된 군에서 선택된다.

본 발명의 이러한 양상의 일부 구체예에서, 항-PCSK9 항체는 (1) 주 1회, (2) 2주마다 1회, (3) 월 1회, (4) 격월마다 1회, (5) 3개월마다 1회, (6) 6개월마다 1회, 그리고 (7) 12개월마다 1회로 구성된 군에서 선택되는 일정으로 환자에게 투여된다. 본 발명의 이러한 양상의 일부 구체예에서, 항-PCSK9 항체는 비경구 투여된다. 본 발명의 이러한 양상의 일부 구체예에서, 항-PCSK9 항체는 정맥내 투여된다. 본 발명의 이러한 양상의 일부 구체예에서, 항-PCSK9 항체는 피하 투여된다.

본 발명의 특정 구체예에서, 항-PCSK9 항체는 21B12 및 31H4이다. 일부 구체예에서, 항-PCSK9 항체는 하기를 포함한다: 서열번호 23의 아미노산 서열에 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 49의 아미노산 서열에 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역. 일부 구체예에서, 항-PCSK9 항체는 하기를 포함한다: 서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 49의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역. 일부 구체예에서, 항-PCSK9 항체는 21B12이다. 항-PCSK9 항체가 서열번호 23의 아미노산 서열에 적어도 90% 동일한 아미노산 서열 및 서열번호 49의 아미노산 서열에 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하거나, 또는 서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 49의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하거나, 또는 항체 21B12인 특정 구체예에서, 항-PCSK9 항체는 약 21 mg 내지 약 70 mg의 분량으로 환자에게 주 1회 피하 투여되고, 여기서 환자의 혈청 LDL 콜레스테롤 수준은 약 3-10일 동안 적어도 약 15-50% 저하되고; 약 21 mg의 분량으로 환자에게 주 1회 피하 투여되고, 여기서 환자의 혈청 LDL 콜레스테롤 수준은 약 3-10일 동안 적어도 약 15-50% 저하되고; 약 35 mg의 분량으로 환자에게 주 1회 피하 투여되고, 여기서 환자의 혈청 LDL 콜레스테롤 수준은 약 3-10일 동안 적어도 약 15-50% 저하되고; 약 70 mg의 분량으로 환자에게 주 1회 피하 투여되고, 여기서 환자의 혈청 LDL 콜레스테롤 수준은 약 3-10일 동안 적어도 약 15-50% 저하되고; 약 70 mg 내지 약 280 mg의 분량으로 환자에게 격주마다 1회 피하 투여되고, 여기서 환자의 혈청 LDL 콜레스테롤 수준은 약 7-14일 동안 적어도 약 15-50% 저하되고; 약 70 mg의 분량으로 환자에게 격주마다 1회 피하 투여되고, 여기서 환자의 혈청 LDL 콜레스테롤 수준은 약 7-14일 동안 적어도 약 15-50% 저하되고; 약 105 mg의 분량으로 환자에게 격주마다 1회 피하 투여되고, 여기서 환자의 혈청 LDL 콜레스테롤 수준은 약 7-14일 동안 적어도 약 15-50% 저하되고; 약 120 mg의 분량으로 환자에게 격주마다 1회 피하 투여되고, 여기서 환자의 혈청 LDL 콜레스테롤 수준은 약 7-14일 동안 적어도 약 15-50% 저하되고; 약 140 mg의 분량으로 환자에게 격주마다 1회 피하 투여되고, 여기서 환자의 혈청 LDL 콜레스테롤 수준은 약 7-14일 동안 적어도 약 15-50% 저하되고; 약 210 mg의 분량으로 환자에게 격주마다 1회 피하 투여되고, 여기서 환자의 혈청 LDL 콜레스테롤 수준은 약 7-14일 동안 적어도 약 15-50% 저하되고; 약 280 mg의 분량으로 환자에게 격주마다 1회 피하 투여되고, 여기서 환자의 혈청 LDL 콜레스테롤 수준은 약 7-14일 동안 적어도 약 15-50% 저하되고; 약 280 mg 내지 약 420 mg의 분량으로 환자에게 4주마다 1회 피하 투여되고, 여기서 환자의 혈청 LDL 콜레스테롤 수준은 약 21-31일 동안 적어도 약 15-50% 저하되고; 약 280 mg의 분량으로 환자에게 4주마다 1회 피하 투여되고, 여기서 환자의 혈청 LDL 콜레스테롤 수준은 약 21-31일 동안 적어도 약 15-50% 저하되고; 약 350 mg의 분량으로 환자에게 4주마다 1회 피하 투여되고, 여기서 환자의 혈청 LDL 콜레스테롤 수준은 약 21-31일 동안 적어도 약 15-50% 저하되고; 약 420 mg의 분량으로 환자에게 4주마다 피하 투여되고, 여기서 환자의 혈청 LDL 콜레스테롤 수준은 약 21-31일 동안 15-50% 저하된다.

항-PCSK9 항체가 서열번호 23의 아미노산 서열에 적어도 90% 동일한 아미노산 서열 및 서열번호 49의 아미노산 서열에 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하거나, 또는 서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 49의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하거나, 또는 항체 21B12인 다른 특정한 구체예에서, 항-PCSK9 항체는 약 420 mg 내지 약 3000 mg의 분량으로 환자에게 매주 정맥내 투여되고, 여기서 환자의 혈청 LDL 콜레스테롤 수준은 약 3-10일 동안 15-50% 저하되고; 약 700 mg의 분량으로 환자에게 매주 정맥내 투여되고, 여기서 환자의 혈청 LDL 콜레스테롤 수준은 약 3-10일 동안 15-50% 저하되고; 약 1200 mg의 분량으로 환자에게 매주 정맥내 투여되고, 여기서 환자의 혈청 LDL 콜레스테롤 수준은 약 3-10일 동안 15-50% 저하되고; 약 1200 mg 이상 내지 약 3000 mg의 분량으로 환자에게 매주 정맥내 투여되고, 여기서 환자의 혈청 LDL 콜레스테롤 수준은 약 3-10일 동안 15-50% 저하되고; 약 420 mg 내지 약 3000 mg의 분량으로 환자에게 격주마다 정맥내 투여되고, 여기서 환자의 혈청 LDL 콜레스테롤 수준은 약 7-14일 동안 15-50% 저하되고; 약 700 mg의 분량으로 환자에게 격주마다 정맥내 투여되고, 여기서 환자의 혈청 LDL 콜레스테롤 수준은 약 7-14일 동안 15-50% 저하되고; 약 1200 mg의 분량으로 환자에게 격주마다 정맥내 투여되고, 여기서 환자의 혈청 LDL 콜레스테롤 수준은 약 21-31일 동안 15-50% 저하되고; 약 1200 mg 이상 내지 약 3000 mg의 분량으로 환자에게 격주마다 정맥내 투여되고, 여기서 환자의 혈청 LDL 콜레스테롤 수준은 약 7-14일 동안 15-50% 저하되고; 약 420 mg 내지 약 3000 mg의 분량으로 환자에게 4주마다 정맥내 투여되고, 여기서 환자의 혈청 LDL 콜레스테롤 수준은 약 21-31일 동안 15-50% 저하되고; 약 700 mg의 분량으로 환자에게 4주마다 정맥내 투여되고, 여기서 환자의 혈청 LDL 콜레스테롤 수준은 약 21-31일 동안 15-50% 저하되고; 약 1200 mg의 분량으로 환자에게 4주마다 정맥내 투여되고, 여기서 환자의 혈청 LDL 콜레스테롤 수준은 약 21-31일 동안 15-50% 저하되고; 약 1200 mg 이상 내지 약 3000 mg의 분량으로 환자에게 4주마다 정맥내 투여되고, 여기서 환자의 혈청 LDL 콜레스테롤 수준은 약 21-31일 동안 15-50% 저하된다.

항-PCSK9 항체가 서열번호 23의 아미노산 서열에 적어도 90% 동일한 아미노산 서열 및 서열번호 49의 아미노산 서열에 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하거나, 또는 서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 49의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하거나, 또는 항체 21B12인 다른 특정 구체예에서, 항-PCSK9 항체는 약 21 mg의 분량으로 환자에게 주 1회 피하 투여되고, 여기서 환자의 혈청 LDL 콜레스테롤 수준은 약 7-10일 동안 적어도 약 30-50% 저하되고; 약 35 mg의 분량으로 환자에게 주 1회 피하 투여되고, 여기서 환자의 혈청 LDL 콜레스테롤 수준은 약 7-10일 동안 적어도 약 30-50% 저하되고; 약 70 mg의 분량으로 환자에게 주 1회 피하 투여되고, 여기서 환자의 혈청 LDL 콜레스테롤 수준은 약 7-10일 동안 적어도 약 30-50% 저하되고; 약 70 mg의 분량으로 환자에게 격주마다 1회 피하 투여되고, 여기서 환자의 혈청 LDL 콜레스테롤 수준은 약 10-14일 동안 적어도 약 30-50% 저하되고; 약 105 mg의 분량으로 환자에게 격주마다 1회 피하 투여되고, 여기서 환자의 혈청 LDL 콜레스테롤 수준은 약 10-14일 동안 적어도 약 30-50% 저하되고; 약 120 mg의 분량으로 환자에게 격주마다 1회 피하 투여되고, 여기서 환자의 혈청 LDL 콜레스테롤 수준은 약 10-14일 동안 적어도 약 30-50% 저하되고; 약 140 mg의 분량으로 환자에게 격주마다 1회 피하 투여되고, 여기서 환자의 혈청 LDL 콜레스테롤 수준은 약 10-14일 동안 적어도 약 30-50% 저하되고; 약 210 mg의 분량으로 환자에게 격주마다 1회 피하 투여되고, 여기서 환자의 혈청 LDL 콜레스테롤 수준은 약 10-14일 동안 적어도 약 30-50% 저하되고; 약 280 mg의 분량으로 환자에게 격주마다 1회 피하 투여되고, 여기서 환자의 혈청 LDL 콜레스테롤 수준은 약 10-14일 동안 적어도 약 30-50% 저하되고; 약 280 mg 내지 약 420 mg의 분량으로 환자에게 4주마다 1회 피하 투여되고, 여기서 환자의 혈청 LDL 콜레스테롤 수준은 약 24-28일 동안 적어도 약 30-50% 저하되고; 약 280 mg의 분량으로 환자에게 4주마다 1회 피하 투여되고, 여기서 환자의 혈청 LDL 콜레스테롤 수준은 약 24-28일 동안 적어도 약 30-50% 저하되고; 약 350 mg의 분량으로 환자에게 4주마다 1회 피하 투여되고, 여기서 환자의 혈청 LDL 콜레스테롤 수준은 약 24-28일 동안 적어도 약 30-50% 저하되고; 약 420 mg의 분량으로 환자에게 4주마다 피하 투여되고, 여기서 환자의 혈청 LDL 콜레스테롤 수준은 약 24-28일 동안 30-50% 저하된다.

항-PCSK9 항체가 서열번호 23의 아미노산 서열에 적어도 90% 동일한 아미노산 서열 및 서열번호 49의 아미노산 서열에 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하거나, 또는 서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 49의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하거나, 또는 항체 21B12인 다른 특정 구체예에서, 항-PCSK9 항체는 약 420 mg 내지 약 3000 mg의 분량으로 환자에게 매주 정맥내 투여되고, 여기서 환자의 혈청 LDL 콜레스테롤 수준은 약 7-10일 동안 30-50% 저하되고; 약 700 mg의 분량으로 환자에게 매주 정맥내 투여되고, 여기서 환자의 혈청 LDL 콜레스테롤 수준은 약 7-10일 동안 30-50% 저하되고; 약 1200 mg의 분량으로 환자에게 매주 정맥내 투여되고, 여기서 환자의 혈청 LDL 콜레스테롤 수준은 약 7-10일 동안 30-50% 저하되고; 약 1200 mg 이상 내지 약 3000 mg의 분량으로 환자에게 매주 정맥내 투여되고, 여기서 환자의 혈청 LDL 콜레스테롤 수준은 약 7-10일 동안 30-50% 저하되고; 약 420 mg 내지 약 3000 mg의 분량으로 환자에게 격주마다 정맥내 투여되고, 여기서 환자의 혈청 LDL 콜레스테롤 수준은 약 10-14일 동안 30-50% 저하되고; 약 700 mg의 분량으로 환자에게 격주마다 정맥내 투여되고, 여기서 환자의 혈청 LDL 콜레스테롤 수준은 약 10-14일 동안 30-50% 저하되고; 약 1200 mg의 분량으로 환자에게 격주마다 정맥내 투여되고, 여기서 환자의 혈청 LDL 콜레스테롤 수준은 약 10-14일 동안 30-50% 저하되고; 약 1200 mg 이상 내지 약 3000 mg의 분량으로 환자에게 격주마다 정맥내 투여되고, 여기서 환자의 혈청 LDL 콜레스테롤 수준은 약 10-14일 동안 30-50% 저하되고; 약 420 mg 내지 약 3000 mg의 분량으로 환자에게 4주마다 정맥내 투여되고, 여기서 환자의 혈청 LDL 콜레스테롤 수준은 약 24-28일 동안 30-50% 저하되고; 약 700 mg의 분량으로 환자에게 4주마다 정맥내 투여되고, 여기서 환자의 혈청 LDL 콜레스테롤 수준은 약 24-28일 동안 30-50% 저하되고; 약 1200 mg의 분량으로 환자에게 4주마다 정맥내 투여되고, 여기서 환자의 혈청 LDL 콜레스테롤 수준은 약 24-28일 동안 30-50% 저하되고; 약 1200 mg 이상 내지 약 3000 mg의 분량으로 환자에게 4주마다 정맥내 투여되고, 여기서 환자의 혈청 LDL 콜레스테롤 수준은 약 24-28일 동안 30-50% 저하된다.

본 발명의 특정 구체예에서, 항-PCSK9 항체는 8A3, 11F1 및 8A1이다. 일부 구체예에서, 항-PCSK9 항체는 하기를 포함한다: 서열번호 465의 아미노산 서열에 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 463의 아미노산 서열에 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역. 일부 구체예에서, 항-PCSK9 항체는 하기를 포함한다: 서열번호 465의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 463의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역. 일부 구체예에서, 항-PCSK9 항체는 11F1이다. 항-PCSK9 항체가 서열번호 465의 아미노산 서열에 적어도 90% 동일한 아미노산 서열 및 서열번호 463의 아미노산 서열에 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하거나, 또는 서열번호 465의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 463의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하거나, 또는 항체 11F1인 특정 구체예에서, 항-PCSK9 항체는 약 45 mg의 분량으로 환자에게 주 1회 피하 투여되고, 여기서 환자의 혈청 LDL 콜레스테롤 수준은 약 3-10일 동안 적어도 약 15-50% 저하되고; 약 150 mg의 분량으로 환자에게 격주마다 1회 피하 투여되고, 여기서 환자의 혈청 LDL 콜레스테롤 수준은 약 7-14일 동안 적어도 약 15-50% 저하되고; 약 150 mg의 분량으로 환자에게 4주마다 1회 피하 투여되고, 여기서 환자의 혈청 LDL 콜레스테롤 수준은 약 21-31일 동안 적어도 약 15-50% 저하되고; 약 150 mg 초과 내지 약 200 mg의 분량으로 환자에게 4주마다 1회 피하 투여되고, 여기서 환자의 혈청 LDL 콜레스테롤 수준은 약 21-31일 동안 적어도 약 15-50% 저하되고; 약 170 mg 내지 약 180 mg의 분량으로 환자에게 4주마다 1회 피하 투여되고, 여기서 환자의 혈청 LDL 콜레스테롤 수준은 약 21-31일 동안 적어도 약 15-50% 저하되고; 약 150 mg 내지 약 170 mg의 분량으로 환자에게 4주마다 1회 피하 투여되고, 여기서 환자의 혈청 LDL 콜레스테롤 수준은 약 21-31일 동안 적어도 약 15-50% 저하되고; 약 450 mg의 분량으로 환자에게 4주마다 1회 피하 투여되고, 여기서 환자의 혈청 LDL 콜레스테롤 수준은 약 21-31일 동안 적어도 약 15-50% 저하되고; 약 150 mg의 분량으로 환자에게 6주마다 1회 피하 투여되고, 여기서 환자의 혈청 LDL 콜레스테롤 수준은 약 31-42일 동안 적어도 약 15-50% 저하되고; 약 150 mg 초과 내지 약 200 mg의 분량으로 환자에게 6주마다 1회 피하 투여되고, 여기서 환자의 혈청 LDL 콜레스테롤 수준은 약 31-42일 동안 적어도 약 15-50% 저하되고; 약 170 mg 내지 약 180 mg의 분량으로 환자에게 6주마다 1회 피하 투여되고, 여기서 환자의 혈청 LDL 콜레스테롤 수준은 약 31-42일 동안 적어도 약 15-50% 저하되고; 약 150 mg 내지 약 170 mg의 분량으로 환자에게 6주마다 1회 피하 투여되고, 여기서 환자의 혈청 LDL 콜레스테롤 수준은 약 31-42일 동안 적어도 약 15-50% 저하되고; 약 450 mg의 분량으로 환자에게 6주마다 1회 피하 투여되고, 여기서 환자의 혈청 LDL 콜레스테롤 수준은 약 31-42일 동안 적어도 약 15-50% 저하되고; 약 140 mg 내지 약 200 mg의 분량으로 환자에게 8주마다 피하 투여되고, 여기서 환자의 혈청 LDL 콜레스테롤 수준은 약 45-56일 동안 15-50% 저하되고; 약 170 mg 내지 약 180 mg의 분량으로 환자에게 8주마다 피하 투여되고, 여기서 환자의 혈청 LDL 콜레스테롤 수준은 약 45-56일 동안 15-50% 저하되고; 약 150 mg 내지 약 170 mg의 분량으로 환자에게 8주마다 피하 투여되고, 여기서 환자의 혈청 LDL 콜레스테롤 수준은 약 45-56일 동안 15-50% 저하되고; 약 450 mg의 분량으로 환자에게 8주마다 피하 투여되고, 여기서 환자의 혈청 LDL 콜레스테롤 수준은 약 45-56일 동안 15-50% 저하되고; 약 600 mg의 분량에서 8주마다 1회 피하 투여되고, 여기서 환자의 혈청 LDL 콜레스테롤 수준은 약 45-56일 동안 적어도 약 15-50% 저하되고; 약 700 mg의 분량에서 8주마다 1회 피하 투여되고, 여기서 환자의 혈청 LDL 콜레스테롤 수준은 약 45-56일 동안 적어도 약 15-50% 저하되고; 약 600 mg의 분량에서 12주마다 1회 피하 투여되고, 여기서 환자의 혈청 LDL 콜레스테롤 수준은 약 74-84일 동안 적어도 약 15-50% 저하되고; 약 700 mg의 분량에서 12주마다 1회 피하 투여되고, 여기서 환자의 혈청 LDL 콜레스테롤 수준은 약 74-84일 동안 적어도 약 15-50% 저하되고; 약 600 mg의 분량에서 16주마다 1회 피하 투여되고, 여기서 환자의 혈청 LDL 콜레스테롤 수준은 약 100-112일 동안 적어도 약 15-50% 저하되고; 약 700 mg의 분량에서 16주마다 1회 피하 투여되고, 여기서 환자의 혈청 LDL 콜레스테롤 수준은 약 100-112일 동안 적어도 약 15-50% 저하된다.

항-PCSK9 항체가 서열번호 465의 아미노산 서열에 적어도 90% 동일한 아미노산 서열 및 서열번호 463의 아미노산 서열에 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하거나, 또는 서열번호 465의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 463의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하거나, 또는 항체 11F1인 본 발명의 특정 구체예에서, 항-PCSK9 항체는 약 45 mg의 분량으로 환자에게 주 1회 피하 투여되고, 여기서 환자의 혈청 LDL 콜레스테롤 수준은 약 7-10일 동안 적어도 약 30-50% 저하되고; 약 150 mg의 분량으로 환자에게 격주마다 1회 피하 투여되고, 여기서 환자의 혈청 LDL 콜레스테롤 수준은 약 10-14일 동안 적어도 약 30-50% 저하되고; 약 150 mg의 분량으로 환자에게 4주마다 1회 피하 투여되고, 여기서 환자의 혈청 LDL 콜레스테롤 수준은 약 24-28일 동안 적어도 약 30-50% 저하되고; 약 150 mg 초과 내지 약 200 mg의 분량으로 환자에게 4주마다 1회 피하 투여되고, 여기서 환자의 혈청 LDL 콜레스테롤 수준은 약 24-28일 동안 적어도 약 30-50% 저하되고; 약 170 mg 내지 약 180 mg의 분량으로 환자에게 4주마다 1회 피하 투여되고, 여기서 환자의 혈청 LDL 콜레스테롤 수준은 약 24-28일 동안 적어도 약 30-50% 저하되고; 약 150 mg 내지 약 170 mg의 분량으로 환자에게 4주마다 1회 피하 투여되고, 여기서 환자의 혈청 LDL 콜레스테롤 수준은 약 24-28일 동안 적어도 약 30-50% 저하되고; 약 450 mg의 분량으로 환자에게 4주마다 1회 피하 투여되고, 여기서 환자의 혈청 LDL 콜레스테롤 수준은 약 24-28일 동안 적어도 약 30-50% 저하되고; 약 150 mg의 분량으로 환자에게 6주마다 1회 피하 투여되고, 여기서 환자의 혈청 LDL 콜레스테롤 수준은 약 40-41일 동안 적어도 약 30-50% 저하되고; 약 150 mg 초과 내지 약 200 mg의 분량으로 환자에게 6주마다 1회 피하 투여되고, 여기서 환자의 혈청 LDL 콜레스테롤 수준은 약 40-41일 동안 적어도 약 30-50% 저하되고; 약 170 mg 내지 약 180 mg의 분량으로 환자에게 6주마다 1회 피하 투여되고, 여기서 환자의 혈청 LDL 콜레스테롤 수준은 약 40-41일 동안 적어도 약 30-50% 저하되고; 약 150 mg 내지 약 170 mg의 분량으로 환자에게 6주마다 1회 피하 투여되고, 여기서 환자의 혈청 LDL 콜레스테롤 수준은 약 40-41일 동안 적어도 약 30-50% 저하되고; 약 450 mg의 분량으로 환자에게 6주마다 1회 피하 투여되고, 여기서 환자의 혈청 LDL 콜레스테롤 수준은 약 40-41일 동안 적어도 약 30-50% 저하되고; 약 140 mg 내지 약 200 mg의 분량으로 환자에게 8주마다 피하 투여되고, 여기서 환자의 혈청 LDL 콜레스테롤 수준은 약 50-56일 동안 30-50% 저하되고; 약 170 mg 내지 약 180 mg의 분량으로 환자에게 8주마다 피하 투여되고, 여기서 환자의 혈청 LDL 콜레스테롤 수준은 약 50-56일 동안 30-50% 저하되고; 약 150 mg 내지 약 170 mg의 분량으로 환자에게 8주마다 피하 투여되고, 여기서 환자의 혈청 LDL 콜레스테롤 수준은 약 50-56일 동안 30-50% 저하되고; 약 450 mg의 분량으로 환자에게 8주마다 피하 투여되고, 여기서 환자의 혈청 LDL 콜레스테롤 수준은 약 50-56일 동안 30-50% 저하되고; 약 600 mg의 분량에서 8주마다 1회 피하 투여되고, 여기서 환자의 혈청 LDL 콜레스테롤 수준은 약 50-56일 동안 적어도 약 30-50% 저하되고; 약 700 mg의 분량에서 8주마다 1회 피하 투여되고, 여기서 환자의 혈청 LDL 콜레스테롤 수준은 약 50-56일 동안 적어도 약 30-50% 저하되고; 약 600 mg의 분량에서 12주마다 1회 피하 투여되고, 여기서 환자의 혈청 LDL 콜레스테롤 수준은 약 80-84일 동안 적어도 약 30-50% 저하되고; 약 700 mg의 분량에서 12주마다 1회 피하 투여되고, 여기서 환자의 혈청 LDL 콜레스테롤 수준은 약 80-84일 동안 적어도 약 30-50% 저하되고; 약 600 mg의 분량에서 16주마다 1회 피하 투여되고, 여기서 환자의 혈청 LDL 콜레스테롤 수준은 약 105-112일 동안 적어도 약 30-50% 저하되고; 약 700 mg의 분량에서 16주마다 1회 피하 투여되고, 여기서 환자의 혈청 LDL 콜레스테롤 수준은 약 105-112일 동안 적어도 약 30-50% 저하된다.

항-PCSK9 항체가 서열번호 465의 아미노산 서열에 적어도 90% 동일한 아미노산 서열 및 서열번호 463의 아미노산 서열에 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하거나, 또는 서열번호 465의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 463의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하거나, 또는 항체 11F1인 본 발명의 특정 구체예에서, 항-PCSK9 항체는 약 420 mg 내지 약 3000 mg의 분량으로 환자에게 매주 정맥내 투여되고, 여기서 환자의 혈청 LDL 콜레스테롤 수준은 약 7-10일 동안 30-50% 저하되고; 약 700 mg의 분량으로 환자에게 매주 정맥내 투여되고, 여기서 환자의 혈청 LDL 콜레스테롤 수준은 약 7-10일 동안 30-50% 저하되고; 약 1200 mg의 분량으로 환자에게 매주 정맥내 투여되고, 여기서 환자의 혈청 LDL 콜레스테롤 수준은 약 7-10일 동안 30-50% 저하되고; 약 1200 mg 이상 내지 약 3000 mg의 분량으로 환자에게 매주 정맥내 투여되고, 여기서 환자의 혈청 LDL 콜레스테롤 수준은 약 7-10일 동안 30-50% 저하되고; 약 420 mg 내지 약 3000 mg의 분량으로 환자에게 격주마다 정맥내 투여되고, 여기서 환자의 혈청 LDL 콜레스테롤 수준은 약 10-14일 동안 30-50% 저하되고; 약 700 mg의 분량으로 환자에게 격주마다 정맥내 투여되고, 여기서 환자의 혈청 LDL 콜레스테롤 수준은 약 10-14일 동안 30-50% 저하되고; 약 1200 mg의 분량으로 환자에게 격주마다 정맥내 투여되고, 여기서 환자의 혈청 LDL 콜레스테롤 수준은 약 10-14일 동안 30-50% 저하되고; 약 1200 mg 이상 내지 약 3000 mg의 분량으로 환자에게 격주마다 정맥내 투여되고, 여기서 환자의 혈청 LDL 콜레스테롤 수준은 약 10-14일 동안 30-50% 저하되고; 약 420 mg 내지 약 3000 mg의 분량으로 환자에게 4주마다 정맥내 투여되고, 여기서 환자의 혈청 LDL 콜레스테롤 수준은 약 24-28일 동안 30-50% 저하되고; 약 700 mg의 분량으로 환자에게 4주마다 정맥내 투여되고, 여기서 환자의 혈청 LDL 콜레스테롤 수준은 약 24-28일 동안 30-50% 저하되고; 약 1200 mg의 분량으로 환자에게 4주마다 정맥내 투여되고, 여기서 환자의 혈청 LDL 콜레스테롤 수준은 약 24-28일 동안 30-50% 저하되고; 약 1200 mg 이상 내지 약 3000 mg의 분량으로 환자에게 4주마다 정맥내 투여되고, 여기서 환자의 혈청 LDL 콜레스테롤 수준은 약 24-28일 동안 30-50% 저하되고; 약 1000 mg - 3000 mg의 분량에서 24주마다 1회 정맥내 투여되고, 여기서 환자의 혈청 LDL 콜레스테롤 수준은 약 150 내지 168일 동안 적어도 약 15-50% 저하되고; 약 1000 mg - 3000 mg의 분량에서 24주마다 1회 정맥내 투여되고, 여기서 환자의 혈청 LDL 콜레스테롤 수준은 약 160 내지 168일 동안 적어도 약 30-50% 저하되고; 약 1000 mg - 3000 mg의 분량에서 52주마다 1회 정맥내 투여되고, 여기서 환자의 혈청 LDL 콜레스테롤 수준은 약 350 내지 365일 동안 적어도 약 15-50% 저하되고; 약 1000 mg - 3000 mg의 분량에서 52주마다 1회 정맥내 투여되고, 여기서 환자의 혈청 LDL 콜레스테롤 수준은 약 360 내지 365일 동안 적어도 약 30-50% 저하된다.

본 발명의 다른 양상에서, 적어도 하나의 항-PCSK9 항체는 적어도 하나의 다른 콜레스테롤-저하제 이전에, 적어도 하나의 다른 콜레스테롤-저하제 이후에 또는 적어도 하나의 다른 콜레스테롤-저하제와 함께 환자에게 투여된다. 콜레스테롤 저하제에는 아토르바스타틴, 세리바스타틴, 플루바스타틴, 로바스타틴, 메바스타틴, 피타바스타틴, 프라바스타틴, 로수바스타틴, 심바스타틴을 비롯한 스타틴, 니코틴산 (니아신), 느린 방출 니아신 (SLO-NIACIN), 라로피프란트 (CORDAPTIVE), 피브린산 (LOPID (겜피브로질), TRICOR (페노피브레이트)), 담즙산 격리제, 예를 들면, 콜레스티라민 (QUESTRAN), 콜레세벨람 (WELCHOL), COLESTID (콜레스티폴)), 콜레스테롤 흡수 저해제 (ZETIA (에제티미브)), 지질 변형제, PPAR 감마 효능제, PPAR 알파/감마 효능제, 스쿠알렌 신타아제 저해제, CETP 저해제, 항-고혈압제, 술포닐 우레아, 인슐린, GLP-1 유사체, DDPIV 저해제, ApoB 조절제, MTP 저해제 및/또는 폐색성 동맥경화 치료제를 비롯한 항-당뇨병제, 온코스타틴 M, 에스트로겐, 베르빈, 그리고 면역-관련 질환에 대한 치료제가 포함된다.

일부 양상에서, 본 발명은 환자에서 혈청 LDL 콜레스테롤 수준을 저하시키는 방법을 포함한다. 상기 방법은 약 10 mg 내지 약 3000 mg 분량의 본원에서 설명된 적어도 하나의 항-PCSK9 항체를 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 분량은 주 1회 (QW) 투여된 약 10 mg 내지 약 70 mg의 적어도 하나의 항-PCSK9 항체이다. 일부 구체예에서, 분량은 주 1회 투여된 약 14 mg 내지 약 45 mg의 적어도 하나의 항-PCSK9 항체이다. 일부 구체예에서, 분량은 주 1회 투여된 약 14 mg 내지 약 35 mg의 적어도 하나의 항-PCSK9 항체이다. 일부 구체예에서, 분량은 2주마다 1회 (Q2W) 투여된 약 70 mg 내지 약 420 mg의 적어도 하나의 항-PCSK9 항체이다. 일부 구체예에서, 분량은 2주마다 1회 (Q2W) 투여된 약 70 mg 내지 약 350 mg의 적어도 하나의 항-PCSK9 항체이다. 일부 구체예에서, 분량은 2주마다 1회 (Q2W) 투여된 약 105 mg 내지 약 350 mg의 적어도 하나의 항-PCSK9 항체이다. 일부 구체예에서, 분량은 2주마다 1회 (Q2W) 투여된 약 140 mg 내지 약 280 mg의 적어도 하나의 항-PCSK9 항체이다. 일부 구체예에서, 분량은 4주마다 1회 (Q4W) 투여된 약 250 mg 내지 약 480 mg의 적어도 하나의 항-PCSK9 항체이다. 일부 구체예에서, 분량은 4주마다 1회 (Q4W) 투여된 약 280 mg 내지 약 420 mg의 적어도 하나의 항-PCSK9 항체이다. 일부 구체예에서, 분량은 4주마다 1회 (Q4W) 투여된 약 350 mg 내지 약 420 mg의 적어도 하나의 항-PCSK9 항체이다. 일부 구체예에서, 분량은 매주 1회 (QW) 투여된 약 420 mg 내지 약 3000 mg의 적어도 하나의 항-PCSK9 항체이다. 일부 구체예에서, 분량은 매주 1회 (QW) 투여된 약 1000 mg 내지 약 3000 mg의 적어도 하나의 항-PCSK9 항체이다. 일부 구체예에서, 분량은 매주 1회 (QW) 투여된 약 2000 mg 내지 약 3000 mg의 적어도 하나의 항-PCSK9 항체이다. 일부 구체예에서, 분량은 격주마다 1회 (Q2W) 투여된 약 420 mg 내지 약 3000 mg의 적어도 하나의 항-PCSK9 항체이다. 일부 구체예에서, 분량은 격주마다 1회 (Q2W) 투여된 약 1000 mg 내지 약 3000 mg의 적어도 하나의 항-PCSK9 항체이다. 일부 구체예에서, 분량은 격주마다 1회 (Q2W) 투여된 약 2000 mg 내지 약 3000 mg의 적어도 하나의 항-PCSK9 항체이다. 일부 구체예에서, 분량은 1개월마다 1회 (Q4W) 투여된 약 420 mg 내지 약 3000 mg의 적어도 하나의 항-PCSK9 항체이다. 일부 구체예에서, 분량은 1개월마다 1회 (Q4W) 투여된 약 1000 mg 내지 약 3000 mg의 적어도 하나의 항-PCSK9 항체이다. 일부 구체예에서, 분량은 1개월마다 1회 (Q4W) 투여된 약 2000 mg 내지 약 3000 mg의 적어도 하나의 항-PCSK9 항체이다. 일부 구체예에서, 혈청 LDL 콜레스테롤 수준은 투약전 혈청 LDL 콜레스테롤 수준과 비교하여 적어도 약 15% 감소된다. 일부 구체예에서, 혈청 LDL 콜레스테롤 수준은 적어도 약 20% 감소된다. 일부 구체예에서, 혈청 LDL 콜레스테롤 수준은 적어도 약 25% 감소된다. 일부 구체예에서, 혈청 LDL 콜레스테롤 수준은 적어도 약 30% 감소된다. 일부 구체예에서, 혈청 LDL 콜레스테롤 수준은 적어도 약 35% 감소된다. 일부 구체예에서, 혈청 LDL 콜레스테롤 수준은 적어도 약 40% 감소된다. 일부 구체예에서, 혈청 LDL 콜레스테롤 수준은 적어도 약 45% 감소된다. 일부 구체예에서, 혈청 LDL 콜레스테롤 수준은 적어도 약 50% 감소된다. 일부 구체예에서, 혈청 LDL 콜레스테롤 수준은 적어도 약 55% 감소된다. 일부 구체예에서, 혈청 LDL 콜레스테롤 수준은 적어도 약 60% 감소된다. 일부 구체예에서, 혈청 LDL 콜레스테롤 수준은 적어도 약 75% 감소된다. 일부 구체예에서, 혈청 LDL 콜레스테롤 수준은 적어도 약 70% 감소된다. 일부 구체예에서, 혈청 LDL 콜레스테롤 수준은 적어도 약 75% 감소된다. 일부 구체예에서, 혈청 LDL 콜레스테롤 수준은 적어도 약 80% 감소된다. 일부 구체예에서, 혈청 LDL 콜레스테롤 수준은 적어도 약 85% 감소된다. 일부 구체예에서, 혈청 LDL 콜레스테롤 수준은 적어도 약 90% 감소된다.

일부 양상에서, 본 발명은 환자에서 혈청 LDL 콜레스테롤 수준을 저하시키는 방법을 포함하고, 상기 방법은 적어도 하나의 항-PCSK9 항체의 분량을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하고, 그리고 여기서 항-PCSK9 항체의 분량은 (1) 적어도 약 14 mg 매주 (QW); (2) 적어도 약 35 mg 양 매주 (QW); (3) 적어도 약 45 mg 양 매주 (QW); (4) 적어도 약 70 mg 양 격주마다 (Q2W); (5) 적어도 약 105 mg 양 2주마다 또는 격주마다 (Q2W); (6) 적어도 약 140 mg 양 2주마다 또는 격주마다 (Q2W); (7) 적어도 약 150 mg 양 2주마다 또는 격주마다 (Q2W) (8) 적어도 약 280 mg 양 2주마다 또는 격주마다 (Q2W); 그리고 (9) 적어도 약 150 mg 양 4주마다 (Q4W); (10) 적어도 약 160 mg 양 4주마다 (Q4W); (11) 적어도 약 170 mg 양 4주마다 (Q4W); (12) 적어도 약 180 mg 양 4주마다 (Q4W); (13) 적어도 약 190 mg 양 4주마다 (Q4W); (14) 적어도 약 200 mg 양 4주마다 (Q4W); (15) 적어도 약 280 mg 양 4주마다 (Q4W); (16) 적어도 약 350 mg 양 4주마다 (Q4W); (17) 적어도 약 420 mg 양 4주마다 (Q4W); (18) 적어도 약 1000 mg 양 4주마다 (Q4W); (19) 적어도 약 2000 mg 양 4주마다 (Q4W); 그리고 (20) 적어도 약 3000 mg 양 4주마다 (Q4W)로 구성된 군에서 선택되는 일정으로 투여된다. 일부 구체예에서, 혈청 LDL 콜레스테롤 수준은 투약전 혈청 LDL 콜레스테롤 수준과 비교하여 적어도 약 15% 감소된다. 일부 구체예에서, 혈청 LDL 콜레스테롤 수준은 적어도 약 20% 감소된다. 일부 구체예에서, 혈청 LDL 콜레스테롤 수준은 적어도 약 25% 감소된다. 일부 구체예에서, 혈청 LDL 콜레스테롤 수준은 적어도 약 30% 감소된다. 일부 구체예에서, 혈청 LDL 콜레스테롤 수준은 적어도 약 35% 감소된다. 일부 구체예에서, 혈청 LDL 콜레스테롤 수준은 적어도 약 40% 감소된다. 일부 구체예에서, 혈청 LDL 콜레스테롤 수준은 적어도 약 45% 감소된다. 일부 구체예에서, 혈청 LDL 콜레스테롤 수준은 적어도 약 50% 감소된다. 일부 구체예에서, 혈청 LDL 콜레스테롤 수준은 적어도 약 55% 감소된다. 일부 구체예에서, 혈청 LDL 콜레스테롤 수준은 적어도 약 60% 감소된다. 일부 구체예에서, 혈청 LDL 콜레스테롤 수준은 적어도 약 65% 감소된다. 일부 구체예에서, 혈청 LDL 콜레스테롤 수준은 적어도 약 70% 감소된다. 일부 구체예에서, 혈청 LDL 콜레스테롤 수준은 적어도 약 75% 감소된다. 일부 구체예에서, 혈청 LDL 콜레스테롤 수준은 적어도 약 80% 감소된다. 일부 구체예에서, 혈청 LDL 콜레스테롤 수준은 적어도 약 85% 감소된다. 일부 구체예에서, 혈청 LDL 콜레스테롤 수준은 적어도 약 90% 감소된다.

일부 양상에서, 본 발명은 환자에서 PCSK9 값을 저하시키는 방법을 포함하고, 상기 방법은 적어도 하나의 항-PCSK9 항체의 분량을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하고, 그리고 여기서 항-PCSK9 항체의 분량은 (1) 적어도 약 14 mg 매주 (QW); (2) 적어도 약 35 mg 양 매주 (QW); (3) 적어도 약 45 mg 양 매주 (QW); (4) 적어도 약 70 mg 양 격주마다 (Q2W); (5) 적어도 약 105 mg 양 2주마다 (Q2W); (6) 적어도 약 140 mg 양 격주마다 (Q2W); (7) 적어도 약 150 mg 양 2주마다 또는 격주마다 (Q2W); (8) 적어도 약 280 mg 양 2주마다 또는 격주마다 (Q2W); (9) 적어도 약 150 mg 양 4주마다 (Q4W); (10) 적어도 약 160 mg 양 4주마다 (Q4W); (11) 적어도 약 170 mg 양 4주마다 (Q4W); (12) 적어도 약 180 mg 양 4주마다 (Q4W); (13) 적어도 약 190 mg 양 4주마다 (Q4W); (14) 적어도 약 200 mg 양 4주마다 (Q4W); (15) 적어도 약 280 mg 양 4주마다 (Q4W); (16) 적어도 약 350 mg 양 4주마다 (Q4W); (17) 적어도 약 420 mg 양 4주마다 (Q4W); (18) 적어도 약 1000 mg 양 4주마다 (Q4W); (19) 적어도 약 2000 mg 양 4주마다 (Q4W); 그리고 (20) 적어도 약 3000 mg 양 4주마다 (Q4W)로 구성된 군에서 선택되는 일정으로 투여된다. 일부 구체예에서, 혈청 PCSK9 값은 투약전 혈청 PCSK9 값과 비교하여 적어도 약 60% 감소된다. 일부 구체예에서, 혈청 PCSK9 값은 적어도 약 65% 감소된다. 일부 구체예에서, 혈청 PCSK9 값은 적어도 약 70% 감소된다. 일부 구체예에서, 혈청 PCSK9 값은 적어도 약 75% 감소된다. 일부 구체예에서, 혈청 PCSK9 값은 적어도 약 80% 감소된다. 일부 구체예에서, 혈청 PCSK9 값은 적어도 약 85% 감소된다. 일부 구체예에서, 혈청 PCSK9 값은 적어도 약 90% 감소된다.

일부 양상에서, 본 발명은 환자에서 총 콜레스테롤 수준을 저하시키는 방법을 포함하고, 상기 방법은 적어도 하나의 항-PCSK9 항체의 분량을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하고, 그리고 여기서 항-PCSK9 항체의 분량은 (1) 적어도 약 14 mg 매주 (QW); (2) 적어도 약 35 mg 양 매주 (QW); (3) 적어도 약 45 mg 양 매주 (QW); (4) 적어도 약 70 mg 양 격주마다 (Q2W); (5) 적어도 약 105 mg 양 2주마다 (Q2W); (6) 적어도 약 140 mg 양 격주마다 (Q2W); (7) 적어도 약 150 mg 양 2주마다 또는 격주마다 (Q2W); (8) 적어도 약 280 mg 양 2주마다 또는 격주마다 (Q2W); (9) 적어도 약 150 mg 양 4주마다 (Q4W); (10) 적어도 약 160 mg 양 4주마다 (Q4W); (11) 적어도 약 170 mg 양 4주마다 (Q4W); (12) 적어도 약 180 mg 양 4주마다 (Q4W); (13) 적어도 약 190 mg 양 4주마다 (Q4W); (14) 적어도 약 200 mg 양 4주마다 (Q4W); (15) 적어도 약 280 mg 양 4주마다 (Q4W); (16) 적어도 약 350 mg 양 4주마다 (Q4W); (17) 적어도 약 420 mg 양 4주마다 (Q4W); (18) 적어도 약 1000 mg 양 4주마다 (Q4W); (19) 적어도 약 2000 mg 양 4주마다 (Q4W); 그리고 (20) 적어도 약 3000 mg 양 4주마다 (Q4W)로 구성된 군에서 선택되는 일정으로 투여된다. 일부 구체예에서, 총 콜레스테롤 수준은 투약전 총 콜레스테롤 수준과 비교하여 적어도 약 20% 감소된다. 일부 구체예에서, 총 콜레스테롤 수준은 적어도 약 25% 감소된다. 일부 구체예에서, 총 콜레스테롤 수준은 적어도 약 30% 감소된다. 일부 구체예에서, 총 콜레스테롤 수준은 적어도 약 35% 감소된다. 일부 구체예에서, 총 콜레스테롤 수준은 적어도 약 40% 감소된다. 일부 구체예에서, 총 콜레스테롤 수준은 적어도 약 45% 감소된다. 일부 구체예에서, 총 콜레스테롤 수준은 적어도 약 50% 감소된다. 일부 구체예에서, 총 콜레스테롤 수준은 적어도 약 55% 감소된다. 일부 구체예에서, 총 콜레스테롤 수준은 적어도 약 60% 감소된다.

일부 양상에서, 본 발명은 환자에서 비-HDL 콜레스테롤 수준을 저하시키는 방법을 포함하고, 상기 방법은 적어도 하나의 항-PCSK9 항체의 분량을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하고, 그리고 여기서 항-PCSK9 항체의 분량은 (1) 적어도 약 14 mg 매주 (QW); (2) 적어도 약 35 mg 양 매주 (QW); (3) 적어도 약 45 mg 양 매주 (QW); (4) 적어도 약 70 mg 양 격주마다 (Q2W); (5) 적어도 약 105 mg 양 2주마다 (Q2W); (6) 적어도 약 140 mg 양 격주마다 (Q2W); (7) 적어도 약 150 mg 양 2주마다 또는 격주마다 (Q2W); (8) 적어도 약 280 mg 양 2주마다 또는 격주마다 (Q2W); (9) 적어도 약 150 mg 양 4주마다 (Q4W); (10) 적어도 약 160 mg 양 4주마다 (Q4W); (11) 적어도 약 170 mg 양 4주마다 (Q4W); (12) 적어도 약 180 mg 양 4주마다 (Q4W); (13) 적어도 약 190 mg 양 4주마다 (Q4W); (14) 적어도 약 200 mg 양 4주마다 (Q4W); (15) 적어도 약 280 mg 양 4주마다 (Q4W); (16) 적어도 약 350 mg 양 4주마다 (Q4W); (17) 적어도 약 420 mg 양 4주마다 (Q4W); (18) 적어도 약 1000 mg 양 4주마다 (Q4W); (19) 적어도 약 2000 mg 양 4주마다 (Q4W); 그리고 (20) 적어도 약 3000 mg 양 4주마다 (Q4W)로 구성된 군에서 선택되는 일정으로 투여된다. 일부 구체예에서, 비-HDL 콜레스테롤 수준은 투약전 비-HDL 콜레스테롤 수준과 비교하여 적어도 약 30% 감소된다. 일부 구체예에서, 비-HDL 콜레스테롤 수준은 적어도 약 35% 감소된다. 일부 구체예에서, 비-HDL 콜레스테롤 수준은 적어도 약 40% 감소된다. 일부 구체예에서, 비-HDL 콜레스테롤 수준은 적어도 약 45% 감소된다. 일부 구체예에서, 비-HDL 콜레스테롤 수준은 적어도 약 50% 감소된다. 일부 구체예에서, 비-HDL 콜레스테롤 수준은 적어도 약 55% 감소된다. 일부 구체예에서, 비-HDL 콜레스테롤 수준은 적어도 약 60% 감소된다. 일부 구체예에서, 비-HDL 콜레스테롤 수준은 적어도 약 65% 감소된다. 일부 구체예에서, 비-HDL 콜레스테롤 수준은 적어도 약 70% 감소된다. 일부 구체예에서, 비-HDL 콜레스테롤 수준은 적어도 약 75% 감소된다. 일부 구체예에서, 비-HDL 콜레스테롤 수준은 적어도 약 80% 감소된다. 일부 구체예에서, 비-HDL 콜레스테롤 수준은 적어도 약 85% 감소된다.

일부 양상에서, 본 발명은 환자에서 ApoB 수준을 저하시키는 방법을 포함하고, 상기 방법은 적어도 하나의 항-PCSK9 항체의 분량을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하고, 그리고 여기서 항-PCSK9 항체의 분량은 (1) 적어도 약 14 mg 매주 (QW); (2) 적어도 약 35 mg 양 매주 (QW); (3) 적어도 약 45 mg 양 매주 (QW); (4) 적어도 약 70 mg 양 격주마다 (Q2W); (5) 적어도 약 105 mg 양 2주마다 (Q2W); (6) 적어도 약 140 mg 양 격주마다 (Q2W); (7) 적어도 약 150 mg 양 2주마다 또는 격주마다 (Q2W); (8) 적어도 약 280 mg 양 2주마다 또는 격주마다 (Q2W); (9) 적어도 약 150 mg 양 4주마다 (Q4W); (10) 적어도 약 160 mg 양 4주마다 (Q4W); (11) 적어도 약 170 mg 양 4주마다 (Q4W); (12) 적어도 약 180 mg 양 4주마다 (Q4W); (13) 적어도 약 190 mg 양 4주마다 (Q4W); (14) 적어도 약 200 mg 양 4주마다 (Q4W); (15) 적어도 약 280 mg 양 4주마다 (Q4W); (16) 적어도 약 350 mg 양 4주마다 (Q4W); (17) 적어도 약 420 mg 양 4주마다 (Q4W)로 구성된 군에서 선택되는 일정으로 투여된다. 일부 구체예에서, ApoB 수준은 투약전 ApoB 수준과 비교하여 적어도 약 20% 감소된다. 일부 구체예에서, ApoB 수준은 적어도 약 25% 감소된다. 일부 구체예에서, ApoB 수준은 적어도 약 30% 감소된다. 일부 구체예에서, ApoB 수준은 적어도 약 35% 감소된다. 일부 구체예에서, ApoB 수준은 적어도 약 40% 감소된다. 일부 구체예에서, ApoB 수준은 적어도 약 45% 감소된다. 일부 구체예에서, ApoB 수준은 적어도 약 50% 감소된다. 일부 구체예에서, ApoB 수준은 적어도 약 55% 감소된다. 일부 구체예에서, ApoB 수준은 적어도 약 60% 감소된다. 일부 구체예에서, ApoB 수준은 적어도 약 65% 감소된다. 일부 구체예에서, ApoB 수준은 적어도 약 70% 감소된다. 일부 구체예에서, ApoB 수준은 적어도 약 75% 감소된다.

일부 양상에서, 본 발명은 환자에서 지방단백 A ("Lp(a)") 수준을 저하시키는 방법을 포함하고, 상기 방법은 적어도 하나의 항-PCSK9 항체의 분량을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하고, 그리고 여기서 항-PCSK9 항체의 분량은 (1) 적어도 약 14 mg 매주 (QW); (2) 적어도 약 35 mg 양 매주 (QW); (3) 적어도 약 45 mg 양 매주 (QW); (4) 적어도 약 70 mg 양 격주마다 (Q2W); (5) 적어도 약 105 mg 양 2주마다 (Q2W); (6) 적어도 약 140 mg 양 격주마다 (Q2W); (7) 적어도 약 150 mg 양 2주마다 또는 격주마다 (Q2W); (8) 적어도 약 280 mg 양 2주마다 또는 격주마다 (Q2W); (9) 적어도 약 150 mg 양 4주마다 (Q4W); (10) 적어도 약 160 mg 양 4주마다 (Q4W); (11) 적어도 약 170 mg 양 4주마다 (Q4W); (12) 적어도 약 180 mg 양 4주마다 (Q4W); (13) 적어도 약 190 mg 양 4주마다 (Q4W); (14) 적어도 약 200 mg 양 4주마다 (Q4W); (15) 적어도 약 280 mg 양 4주마다 (Q4W); (16) 적어도 약 350 mg 양 4주마다 (Q4W); (17) 적어도 약 420 mg 양 4주마다 (Q4W); (18) 적어도 약 1000 mg 양 4주마다 (Q4W); (19) 적어도 약 2000 mg 양 4주마다 (Q4W); 그리고 (20) 적어도 약 3000 mg 양 4주마다 (Q4W)로 구성된 군에서 선택되는 일정으로 투여된다. 일부 구체예에서, Lp(a) 수준은 투약전 Lp(a) 수준과 비교하여 적어도 약 10% 감소된다. 일부 구체예에서, Lp(a) 수준은 적어도 약 15% 감소된다. 일부 구체예에서, Lp(a) 수준은 적어도 약 20% 감소된다. 일부 구체예에서, Lp(a) 수준은 적어도 약 25% 감소된다. 일부 구체예에서, Lp(a) 수준은 적어도 약 30% 감소된다. 일부 구체예에서, Lp(a) 수준은 적어도 약 35% 감소된다. 일부 구체예에서, Lp(a) 수준은 적어도 약 40% 감소된다. 일부 구체예에서, Lp(a) 수준은 적어도 약 45% 감소된다. 일부 구체예에서, Lp(a) 수준은 적어도 약 50% 감소된다. 일부 구체예에서, Lp(a) 수준은 적어도 약 55% 감소된다. 일부 구체예에서, Lp(a) 수준은 적어도 약 60% 감소된다. 일부 구체예에서, Lp(a) 수준은 적어도 약 65% 감소된다.

일부 양상에서, 본 발명은 환자에서 콜레스테롤 관련 질환을 치료 또는 예방하기 위한 방법을 포함하고, 상기 방법은 약 10 mg 내지 약 3000 mg 분량의 본원에서 설명된 적어도 하나의 항-PCSK9 항체를 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 분량은 주 1회 (QW) 투여된 약 10 mg 내지 약 70 mg의 적어도 하나의 항-PCSK9 항체이다. 일부 구체예에서, 분량은 주 1회 투여된 약 14 mg 내지 약 45 mg의 적어도 하나의 항-PCSK9 항체이다. 일부 구체예에서, 분량은 주 1회 투여된 약 14 mg 내지 약 35 mg의 적어도 하나의 항-PCSK9 항체이다. 일부 구체예에서, 분량은 2주마다 1회 (Q2W) 투여된 약 70 mg 내지 약 420 mg의 적어도 하나의 항-PCSK9 항체이다. 일부 구체예에서, 분량은 2주마다 1회 (Q2W) 투여된 약 70 mg 내지 약 350 mg의 적어도 하나의 항-PCSK9 항체이다. 일부 구체예에서, 분량은 2주마다 1회 (Q2W) 투여된 약 105 mg 내지 약 350 mg의 적어도 하나의 항-PCSK9 항체이다. 일부 구체예에서, 분량은 2주마다 1회 (Q2W) 투여된 약 140 mg 내지 약 280 mg의 적어도 하나의 항-PCSK9 항체이다. 일부 구체예에서, 분량은 2주마다 1회 (Q2W) 투여된 약 150 mg 내지 약 280 mg의 적어도 하나의 항-PCSK9 항체이다. 일부 구체예에서, 분량은 2주마다 1회 (Q2W) 투여된 약 150 mg 내지 약 200 mg의 적어도 하나의 항-PCSK9 항체이다. 일부 구체예에서, 분량은 4주마다 1회 (Q4W) 투여된 약 150 mg 내지 약 480 mg의 적어도 하나의 항-PCSK9 항체이다. 일부 구체예에서, 분량은 4주마다 1회 (Q4W) 투여된 약 150 mg 내지 약 200 mg의 적어도 하나의 항-PCSK9 항체이다. 일부 구체예에서, 분량은 4주마다 1회 (Q4W) 투여된 약 200 mg 내지 약 480 mg의 적어도 하나의 항-PCSK9 항체이다. 일부 구체예에서, 분량은 4주마다 1회 (Q4W) 투여된 약 250 mg 내지 약 480 mg의 적어도 하나의 항-PCSK9 항체이다. 일부 구체예에서, 분량은 4주마다 1회 (Q4W) 투여된 약 280 mg 내지 약 420 mg의 적어도 하나의 항-PCSK9 항체이다. 일부 구체예에서, 분량은 4주마다 1회 투여된 약 350 mg 내지 약 420 mg의 적어도 하나의 항-PCSK9 항체이다. 일부 구체예에서, 분량은 4주마다 (Q4W) 약 1000 mg이다. 일부 구체예에서, 분량은 4주마다 (Q4W) 약 2000 mg이다. 일부 구체예에서, 분량은 4주마다 (Q4W) 약 3000 mg이다. 일부 구체예에서, 혈청 LDL 콜레스테롤 수준은 투약전 혈청 LDL 콜레스테롤 수준과 비교하여 적어도 약 15% 감소된다. 일부 구체예에서, 혈청 LDL 콜레스테롤 수준은 적어도 약 20% 감소된다. 일부 구체예에서, 혈청 LDL 콜레스테롤 수준은 적어도 약 25% 감소된다. 주 (Q4W). 일부 구체예에서, 혈청 LDL 콜레스테롤 수준은 적어도 약 30% 감소된다. 일부 구체예에서, 혈청 LDL 콜레스테롤 수준은 적어도 약 35% 감소된다. 일부 구체예에서, 혈청 LDL 콜레스테롤 수준은 적어도 약 40% 감소된다. 일부 구체예에서, 혈청 LDL 콜레스테롤 수준은 적어도 약 45% 감소된다. 일부 구체예에서, 혈청 LDL 콜레스테롤 수준은 적어도 약 50% 감소된다. 일부 구체예에서, 혈청 LDL 콜레스테롤 수준은 적어도 약 55% 감소된다. 일부 구체예에서, 혈청 LDL 콜레스테롤 수준은 적어도 약 60% 감소된다. 일부 구체예에서, 혈청 LDL 콜레스테롤 수준은 적어도 약 65% 감소된다. 일부 구체예에서, 혈청 LDL 콜레스테롤 수준은 적어도 약 70% 감소된다. 일부 구체예에서, 혈청 LDL 콜레스테롤 수준은 적어도 약 75% 감소된다. 일부 구체예에서, 혈청 LDL 콜레스테롤 수준은 적어도 약 80% 감소된다. 일부 구체예에서, 혈청 LDL 콜레스테롤 수준은 적어도 약 85% 감소된다. 일부 구체예에서, 혈청 LDL 콜레스테롤 수준은 적어도 약 90% 감소된다. 일부 구체예에서, 콜레스테롤 관련 질환은 이형 가족성 고콜레스테롤혈증, 동질접합성 가족성 고콜레스테롤혈증, 비-가족성 고콜레스테롤혈증, 고지질혈증 또는 이상지질혈증이다.

일부 양상에서, 본 발명은 환자에서 콜레스테롤 관련 질환을 치료 또는 예방하는 방법을 포함하고, 상기 방법은 적어도 하나의 항-PCSK9 항체의 분량을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하고, 그리고 여기서 항-PCSK9 항체의 분량은 (1) 적어도 약 14 mg 매주 (QW); (2) 적어도 약 35 mg 양 매주 (QW); (3) 적어도 약 45 mg 양 매주 (QW); (4) 적어도 약 70 mg 양 격주마다 (Q2W); (5) 적어도 약 105 mg 양 2주마다 (Q2W); (6) 적어도 약 140 mg 양 격주마다 (Q2W); (7) 적어도 약 150 mg 양 2주마다 또는 격주마다 (Q2W); (8) 적어도 약 280 mg 양 2주마다 또는 격주마다 (Q2W); (9) 적어도 약 150 mg 양 4주마다 (Q4W); (10) 적어도 약 160 mg 양 4주마다 (Q4W); (11) 적어도 약 170 mg 양 4주마다 (Q4W); (12) 적어도 약 180 mg 양 4주마다 (Q4W); (13) 적어도 약 190 mg 양 4주마다 (Q4W); (14) 적어도 약 200 mg 양 4주마다 (Q4W); (15) 적어도 약 280 mg 양 4주마다 (Q4W); (16) 적어도 약 350 mg 양 4주마다 (Q4W); (17) 적어도 약 420 mg 양 4주마다 (Q4W); (18) 적어도 약 1000 mg 양 4주마다 (Q4W); (19) 적어도 약 2000 mg 양 4주마다 (Q4W); 그리고 (20) 적어도 약 3000 mg 양 4주마다 (Q4W)로 구성된 군에서 선택되는 일정으로 투여된다. 일부 구체예에서, 혈청 LDL 콜레스테롤 수준은 투약전 혈청 LDL 콜레스테롤 수준과 비교하여 적어도 약 15% 감소된다. 일부 구체예에서, 혈청 LDL 콜레스테롤 수준은 적어도 약 20% 감소된다. 일부 구체예에서, 혈청 LDL 콜레스테롤 수준은 적어도 약 25% 감소된다. 일부 구체예에서, 혈청 LDL 콜레스테롤 수준은 적어도 약 30% 감소된다. 일부 구체예에서, 혈청 LDL 콜레스테롤 수준은 적어도 약 35% 감소된다. 일부 구체예에서, 혈청 LDL 콜레스테롤 수준은 적어도 약 40% 감소된다. 일부 구체예에서, 혈청 LDL 콜레스테롤 수준은 적어도 약 45% 감소된다. 일부 구체예에서, 혈청 LDL 콜레스테롤 수준은 적어도 약 50% 감소된다. 일부 구체예에서, 혈청 LDL 콜레스테롤 수준은 적어도 약 55% 감소된다. 일부 구체예에서, 혈청 LDL 콜레스테롤 수준은 적어도 약 60% 감소된다. 일부 구체예에서, 혈청 LDL 콜레스테롤 수준은 적어도 약 65% 감소된다. 일부 구체예에서, 혈청 LDL 콜레스테롤 수준은 적어도 약 70% 감소된다. 일부 구체예에서, 혈청 LDL 콜레스테롤 수준은 적어도 약 75% 감소된다. 일부 구체예에서, 혈청 LDL 콜레스테롤 수준은 적어도 약 80% 감소된다. 일부 구체예에서, 혈청 LDL 콜레스테롤 수준은 적어도 약 85% 감소된다. 일부 구체예에서, 혈청 LDL 콜레스테롤 수준은 적어도 약 90% 감소된다.

일부 구체예에서, 항-PCSK9 항체는 21B12, 26H5, 31H4, 8A3, 11F1 및/또는 8A1이다.

일부 구체예에서, 콜레스테롤 관련 질환은 이형 가족성 고콜레스테롤혈증, 동질접합성 가족성 고콜레스테롤혈증, 비-가족성 고콜레스테롤혈증, 고지질혈증 또는 이상지질혈증이다.

일부 양상에서, 본 발명은 21B12, 26H5, 31H4, 8A3, 11F1 및 8A1로 구성된 군에서 선택되는 적어도 하나의 항-PCSK9 항체를 포함하는 제약학적 제제를 포함한다.

본 발명의 다른 구체예는 본원에 함께 제공된 개시로부터 명백할 것이다.

도면의 간단한 설명
도 1A는 PCSK9의 성숙 형태의 아미노산 서열을 도시하는데, 프로-도메인이 밑줄로 표시된다.
도 1B₁-1B₄는 PCSK9의 아미노산과 핵산 서열을 도시하는데, 프로-도메인이 밑줄로 표시되고, 그리고 신호 서열이 굵은 글씨체로 표시된다.
도 2A-2D는 다양한 항원 결합 단백질의 다양한 경쇄의 서열 비교 표이다. 도 2C는 도 2A에서 시작된 서열을 계속한다. 도 2D는 도 2B에서 시작된 서열을 계속한다.
도 3A-3D는 다양한 항원 결합 단백질의 다양한 중쇄의 서열 비교 표이다. 도 3C는 도 3A에서 시작된 서열을 계속한다. 도 3D는 도 3B에서 시작된 서열을 계속한다.
도 3E-3JJ는 항원 결합 단백질의 일부 구체예의 가변 도메인에 대한 아미노산과 핵산 서열을 도시한다.
도 3KK는 다양한 불변 도메인에 대한 아미노산 서열을 도시한다.
도 3LL-3BBB는 항원 결합 단백질의 일부 구체예의 가변 도메인에 대한 아미노산과 핵산 서열을 도시한다.
도 3CCC-3JJJ는 항원 결합 단백질의 일부 구체예의 다양한 중쇄와 경쇄의 서열 비교 표이다.
도 4A는 인간 PCSK9에 대한 항원 결합 단백질의 결합 곡선이다.
도 4B는 인간 PCSK9에 대한 항원 결합 단백질의 결합 곡선이다.
도 4C는 시노몰구스 PCSK9에 대한 항원 결합 단백질의 결합 곡선이다.
도 4D는 시노몰구스 PCSK9에 대한 항원 결합 단백질의 결합 곡선이다.
도 4E는 생쥐 PCSK9에 대한 항원 결합 단백질의 결합 곡선이다.
도 4F는 생쥐 PCSK9에 대한 항원 결합 단백질의 결합 곡선이다.
도 5A는 PCSK9 및 다양한 항원 결합 단백질을 수반하는 SDS PAGE 실험의 결과를 도시하고, 이들 단백질의 상대적 순도와 농도를 보여준다.
도 5B와 5C는 21B12에 대한 Biacore 용액 평형 검정으로부터 그래프를 도시한다.
도 5D는 Biacore 포획 검정으로부터 동역학의 그래프를 도시한다.
도 5E는 3개의 ABP에 대한 비닝 결과를 묘사하는 막대그래프를 도시한다.
도 6A는 시험관내 PCSK9:LDLR 결합 검정에서 PCSK9에 대한 항원 결합 단백질 31H4 IgG2의 저해 곡선이다.
도 6B는 시험관내 PCSK9:LDLR 결합 검정에서 PCSK9에 대한 항원 결합 단백질 31H4 IgG4의 저해 곡선이다.
도 6C는 시험관내 PCSK9:LDLR 결합 검정에서 PCSK9에 대한 항원 결합 단백질 21B12 IgG2의 저해 곡선이다.
도 6D는 시험관내 PCSK9:LDLR 결합 검정에서 PCSK9에 대한 항원 결합 단백질 21B12 IgG4의 저해 곡선이다.
도 7A는 PCSK9의 LDL 흡수 차단 효과를 감소시키는 ABP의 효과를 증명하는 세포 LDL 흡수 검정에서 항원 결합 단백질 31H4 IgG2의 저해 곡선이다.
도 7B는 PCSK9의 LDL 흡수 차단 효과를 감소시키는 ABP의 효과를 증명하는 세포 LDL 흡수 검정에서 항원 결합 단백질 31H4 IgG4의 저해 곡선이다.
도 7C는 PCSK9의 LDL 흡수 차단 효과를 감소시키는 ABP의 효과를 증명하는 세포 LDL 흡수 검정에서 항원 결합 단백질 21B12 IgG2의 저해 곡선이다.
도 7D는 PCSK9의 LDL 흡수 차단 효과를 감소시키는 ABP의 효과를 증명하는 세포 LDL 흡수 검정에서 항원 결합 단백질 21B12 IgG4의 저해 곡선이다.
도 8A는 IgG 대조 치료된 생쥐에 비하여 변하는, ABP 31H4의 생쥐에서 혈청 콜레스테롤 저하 능력을 묘사하는 그래프이다 (^* p< 0.01).
도 8B는 시간 = 0시에 비하여 변하는, ABP 31H4의 생쥐에서 혈청 콜레스테롤 저하 능력을 묘사하는 그래프이다 (# p, 0.05).
도 8C는 C57B1/6 생쥐에서 HDL 콜레스테롤 수준에 대한 ABP 31H4의 효과를 묘사하는 그래프이다 (^* p< 0.01).
도 8D는 C57B1/6 생쥐에서 HDL 콜레스테롤 수준에 대한 ABP 31H4의 효과를 묘사하는 그래프이다 (# p< 0.05).
도 9는 다양한 시점 후 존재하는 간 LDLR 단백질의 양을 증강시키는 ABP 31H4의 능력의 웨스턴 블롯 분석을 묘사한다.
도 10A는 야생형 생쥐에서 총 혈청 콜레스테롤을 저하시키는 항원 결합 단백질 31H4의 능력을 묘사하는 그래프이다.
도 10B는 야생형 생쥐에서 HDL를 저하시키는 항원 결합 단백질 31H4의 능력을 묘사하는 그래프이다.
도 10C는 다양한 항원 결합 단백질 31H4과 16F12의 혈청 콜레스테롤 저하 능력을 묘사하는 그래프이다.
도 11A는 혈청 콜레스테롤을 저하시키는 항원 결합 단백질의 지속 기간과 능력을 검사하기 위한 주사 프로토콜을 묘사한다.
도 11B는 도 11A에서 프로토콜의 결과를 묘사하는 그래프이다.
도 12A는 HepG2 세포에서 스타틴과 ABP 21B12의 조합에 대응한 LDLR 수준을 도시한다.
도 12B는 HepG2 세포에서 스타틴과 ABP 31H4의 조합에 대응한 LDLR 수준을 도시한다.
도 12C는 HepG2 세포에서 스타틴과 ABP 25A7.1, 비-중화 항체, (대조적으로, "25A7" 중화 항체)의 조합에 대응한 LDLR 수준을 도시한다.
도 12D는 PCSK9를 과다 발현하는 HepG2 세포에서 스타틴과 ABP 21B12의 조합에 대응한 LDLR 수준을 도시한다.
도 12E는 PCSK9를 과다 발현하는 HepG2 세포에서 스타틴과 ABP 31H4의 조합에 대응한 LDLR 수준을 도시한다.
도 12F는 PCSK9를 과다 발현하는 HepG2 세포에서 스타틴과 ABP 25A7.1, 비-중화 항체, (대조적으로, "25A7" 중화 항체)의 조합에 대응한 LDLR 수준을 도시한다.
도 13A는 PCSK9에 대한 다양한 ABP의 다양한 경쇄 아미노산 서열을 도시한다. 점 (.)은 아미노산 없음을 지시한다.
도 13B는 PCSK9에 대한 다양한 ABP의 경쇄 분기도를 도시한다.
도 13C는 PCSK9에 대한 다양한 ABP의 다양한 중쇄 아미노산 서열을 도시한다. 점 (.)은 아미노산 없음을 지시한다.
도 13D는 PCSK9에 대한 다양한 ABP의 중쇄 계통수를 도시한다.
도 13E는 경쇄와 중쇄 CDR의 비교, 그리고 공통을 도출하기 위한 군의 지정을 도시한다.
도 13F는 군 1과 2에 대한 공통 서열을 도시한다.
도 13G는 군 3과 4에 대한 공통 서열을 도시한다.
도 13H는 군 1과 2에 대한 공통 서열을 도시한다. 점 (.)은 동일한 잔기를 지시한다.
도 13I는 군 2에 대한 공통 서열을 도시한다. 점 (.)은 동일한 잔기를 지시한다.
도 13J는 군 3과 4에 대한 공통 서열을 도시한다. 점 (.)은 동일한 잔기를 지시한다.
도 14는 항-PCSK9 항체 (21B12)의 복수-분량을 받는 환자에서 LDL-c 수준의 감소를 보여주는 그래프이다.
도 15는 항-PCSK9 항체 (21B12)의 복수-분량을 받는 적은 내지 중간 및 많은-분량 스타틴의 환자에서 LDL-c 수준의 감소를 보여주는 그래프이다
도 16은 항-PCSK9 항체 (21B12)의 복수-분량을 받는 환자에서 ApoB 수준의 감소를 보여주는 그래프이다.
도 17은 항-PCSK9 항체 (21B12)의 복수-분량을 받는 적은 내지 중간 및 많은-분량 스타틴의 환자에서 지방단백 a ("Lp(a)") 수준의 감소를 보여주는 막대그래프이다.
도 18은 항-PCSK9 항체 (21B12)의 복수-분량을 받는 이형 가족성 고콜레스테롤혈증 ("HeFH") 환자에서 LDL-c 수준의 감소를 보여주는 그래프이다.
도 19는 항-PCSK9 항체 (21B12)의 복수-분량을 받는 이형 가족성 고콜레스테롤혈증 ("HeFH") 환자에서 PCSK9 수준의 감소를 보여주는 그래프이다.
도 20은 항-PCSK9 항체 (21B12)의 복수-분량을 받는 이형 가족성 고콜레스테롤혈증 ("HeFH") 환자에서 총 콜레스테롤 수준의 감소를 보여주는 그래프이다.
도 21은 항-PCSK9 항체 (21B12)의 복수-분량을 받는 이형 가족성 고콜레스테롤혈증 ("HeFH") 환자에서 비-HDL 콜레스테롤 수준의 감소를 보여주는 그래프이다.
도 22는 항-PCSK9 항체 (21B12)의 복수-분량을 받는 이형 가족성 고콜레스테롤혈증 ("HeFH") 환자에서 ApoB 수준의 감소를 보여주는 그래프이다.
도 23은 항-PCSK9 항체 (21B12)의 복수-분량을 받는 이형 가족성 고콜레스테롤혈증 ("HeFH") 환자에서 지방단백 a ("Lp(a)")의 감소를 보여주는 막대그래프이다.
도 24A는 12주 기간에 걸쳐 격주마다 (Q2W) 항-PCSK9 항체 (21B12)의 다양한 분량을 받은, 실시예 22-25에서 설명된 4가지 연구로부터 환자에서 LDL-C 감소에 관한 집합체 데이터를 보여주는 그래프이다.
도 24B는 12주 기간에 걸쳐 4주마다 (Q4W) 항-PCSK9 항체 (21B12)의 다양한 분량을 받은, 실시예 22-25에서 설명된 4가지 연구로부터 환자에서 LDL-C 감소에 관한 집합체 데이터를 보여주는 그래프이다.
도 25A는 12주 기간에 걸쳐 격주마다 (Q2W) 또는 4주마다 (Q4W) 항-PCSK9 항체 (21B12)의 다양한 분량을 받은, 실시예 22-25에서 설명된 4가지 연구로부터 환자에서 Lp(a) 감소에 관한 집합체 데이터를 보여주는 막대그래프이다.
도 25B는 12주 기간에 걸쳐 격주마다 (Q2W) 또는 4주마다 (Q4W) 항-PCSK9 항체 (21B12)의 다양한 분량을 받은, 실시예 22-25에서 설명된 4가지 연구로부터 환자에서 HDL-C 감소에 관한 집합체 데이터를 보여주는 막대그래프이다.
도 25C는 12주 기간에 걸쳐 격주마다 (Q2W) 또는 4주마다 (Q4W) 항-PCSK9 항체 (21B12)의 다양한 분량을 받은, 실시예 22-25에서 설명된 4가지 연구로부터 환자에서 트리글리세리드 감소에 관한 집합체 데이터를 보여주는 막대그래프이다.
도 25D는 12주 기간에 걸쳐 격주마다 (Q2W) 또는 4주마다 (Q4W) 항-PCSK9 항체 (21B12)의 다양한 분량을 받은, 실시예 22-25에서 설명된 4가지 연구로부터 환자에서 VLDL-C 감소에 관한 집합체 데이터를 보여주는 막대그래프이다.
도 26은 다양한 안정화제/부형제를 내포하는 항-PCSK9 항체 (21B12) 제제의 점도를 보여주는 막대그래프이다.
도 27은 안정화제/부형제, 프롤린이 높은 단백질 농도를 갖는 항-PCSK9 항체 (21B12) 제제의 점도를 저하시키는 능력을 갖는다는 것을 보여주는 그래프이다.
도 28A는 25℃와 40℃에서 10 mM 아세트산나트륨, 그리고 9% 수크로오스 pH 5.2를 포함하는 제제에서 다양한 농도의 항-PCSK9 항체, 21B12의 점도를 보여주는 그래프이다.
도 28B는 25℃와 40℃에서 10 mM 아세트산나트륨, 125 mM 아르기닌, 그리고 3% 수크로오스 pH 5.0을 포함하는 제제와 비교하여, 25℃와 40℃에서 10 mM 아세트산나트륨, 그리고 9% 수크로오스 pH 5.2를 포함하는 제제에서 다양한 농도의 항-PCSK9 항체, 21B12의 점도를 보여주는 그래프이다.
도 28C는 25℃와 40℃에서 10 mM 아세트산나트륨, 100 mM 메티오닌, 그리고 4% 수크로오스 pH 5.0을 포함하는 제제와 비교하여, 25℃와 40℃에서 10 mM 아세트산나트륨, 그리고 9% 수크로오스 pH 5.2를 포함하는 제제에서 다양한 농도의 항-PCSK9 항체, 21B12의 점도를 보여주는 그래프이다.
도 28D는 25℃와 40℃에서 10 mM 아세트산나트륨과 250 mM 프롤린, pH 5.0을 포함하는 제제와 비교하여, 25℃와 40℃에서 10 mM 아세트산나트륨, 그리고 9% 수크로오스 pH 5.2를 포함하는 제제에서 다양한 농도의 항-PCSK9 항체, 21B12의 점도를 보여주는 그래프이다.
도 29A는 6개월의 기간에 걸쳐, 항-PCSK9 항체 (즉, 21B12) 제제의 다양한 제제에서 10 μm 입자의 숫자를 보여주는 막대그래프이다.
도 29B는 6개월의 기간에 걸쳐, 항-PCSK9 항체 (즉, 21B12) 제제의 다양한 제제에서 25 μm 입자의 숫자를 보여주는 막대그래프이다.
도 30A는 4개월의 기간에 걸쳐, 항-PCSK9 항체 (즉, 11F1) 제제의 다양한 제제에서 10 μm 입자의 숫자를 보여주는 막대그래프이다.
도 30B는 4개월의 기간에 걸쳐, 항-PCSK9 항체 (즉, 11F1) 제제의 다양한 제제에서 25 μm 입자의 숫자를 보여주는 막대그래프이다.
도 31은 경쟁 검정에서 11F1의 PCSKP, PCSK2, PCSK1 PCSK7 및 퓨린과의 결합 특이성을 보여주는 그래프이고, OD₄₅₀이 수직축 상에 플롯팅되고 PCSK9의 농도 (ug/ml)가 수평축 상에 플롯팅된다.
도 32는 경쟁 검정에서 11F1에 의한 LDLR:D374Y PCSK9 결합의 저해에 대한 분량 반응 곡선을 보여주는 그래프이고, OD₄₅₀이 수직축 상에 플롯팅되고 로그 [11F1] (pM)이 수평축 상에 플롯팅된다.
도 33은 경쟁 검정에서 11F1에 의한 LDLR: WT PCSK9 결합의 저해에 대한 분량 반응 곡선을 묘사하는 그래프이고, OD₄₅₀이 수직축 상에 플롯팅되고 로그 [11F1] (pM)이 수평축 상에 플롯팅된다.
도 34는 HepG2 세포에서 LDL 흡수의 인간 D374Y PCSK9-매개된 감소를 차단하는 11F1의 능력에 대한 분량 반응 곡선을 묘사하는 그래프이고, 상대적 형광 단위 (x10⁴)가 수직축 상에 플롯팅되고 로그 [11F1] (nM)이 수평축 상에 플롯팅된다.
도 35는 HepG2 세포에서 LDL 흡수의 인간 WT PCSK9-매개된 감소를 차단하는 11F1의 능력에 대한 분량 반응 곡선을 묘사하는 그래프이고, 상대적 형광 단위 (x10⁴)가 수직축 상에 플롯팅되고 로그 [11F1] (nM)이 수평축 상에 플롯팅된다.
도 36은 AAV에 의해 인간 PCSK9를 발현하는 생쥐에서 혈청 비-HDL 콜레스테롤에 대한 11F1과 8A3의 효과를 묘사하는 막대그래프이고, 비-HDL-C 혈청 농도 (mg/ml)가 수직축 상에 플롯팅되고 주사후 시간 (일자)이 수평축 상에 플롯팅된다.
도 37은 AAV에 의해 인간 PCSK9를 발현하는 생쥐에서 혈청 총 콜레스테롤에 대한 11F1과 8A3의 효과를 묘사하는 막대그래프이고, 혈청 총 콜레스테롤 (mg/ml)이 수직축 상에 플롯팅되고 주사후 시간 (일자)이 수평축 상에 플롯팅된다.
도 38은 AAV에 의해 인간 PCSK9를 발현하는 생쥐에서 혈청 HDL 콜레스테롤 (HDL-C)에 대한 11F1과 8A3의 효과를 묘사하는 막대그래프이고, HDL-C (mg/ml)가 수직축 상에 플롯팅되고 주사후 시간 (일자)이 수평축 상에 플롯팅된다.
도 39는 AAV에 의해 인간 PCSK9를 발현하는 생쥐에서 IgG2, 8A3과 11F1 항체 농도 프로필을 묘사하는 그래프이고, 혈청 항체 농도 (ng/mL)가 수직축 상에 플롯팅되고 주사후 시간 (일자)이 수평축 상에 플롯팅된다.
도 40은 AAV에 의해 인간 PCSK9를 발현하는 생쥐에서 IgG2, 11F1과 8A3에 대한 PK 매개변수를 요약하는 표이다.
도 41은 시노몰구스 원숭이에서 혈청 LDL 농도 (LDL-C)에 대한 항-KLH 항체 (대조), 21B12, 8A3 및 11F1의 단일 피하 투여의 효과를 묘사하는 그래프이고, LDL-C (mg/dl)가 수직축 상에 플롯팅되고 투여후 시간 (일자)이 수평축 상에 플롯팅된다.
도 42는 시노몰구스 원숭이에서 혈청 총 콜레스테롤에 대한 항-KLH 항체 (대조), 21B12, 8A3 및 11F1의 단일 피하 투여의 효과를 묘사하는 그래프이고, 총 콜레스테롤 농도 (mg/dl)가 수직축 상에 플롯팅되고 투여후 시간 (일자)이 수평축 상에 플롯팅된다.
도 43은 시노몰구스 원숭이에서 혈청 HDL 콜레스테롤에 대한 항-KLH 항체 (대조), 21B12, 8A3 및 11F1의 단일 피하 투여의 효과를 묘사하는 그래프이고, HDL-C (mg/dl)가 수직축 상에 플롯팅되고 투여후 시간 (일자)이 수평축 상에 플롯팅된다.
도 44는 시노몰구스 원숭이에서 혈청 트리글리세리드에 대한 항-KLH 항체 (대조), 21B12, 8A3 및 11F1의 단일 피하 투여의 효과를 묘사하는 그래프이고, 혈청 트리글리세리드 농도 (mg/dl)가 수직축 상에 플롯팅되고 투여후 시간 (일자)이 수평축 상에 플롯팅된다.
도 45는 시노몰구스 원숭이에서 아포지방단백 B (ApoB)에 대한 항-KLH 항체 (대조), 21B12, 8A3 및 11F1의 단일 피하 투여의 효과를 묘사하는 그래프이고, APOB 농도 (mg/dl)가 수직축 상에 플롯팅되고 투여후 시간 (일자)이 수평축 상에 플롯팅된다.
도 46은 시노몰구스 원숭이에서 항--KLH 항체 (대조), 21B12, 8A3 및 11F1에 대한 평균 약동학적 프로필을 묘사하는 그래프이고, 항체 농도 (ng/ml)가 수직축 상에 플롯팅되고 투여후 시간 (일자)이 수평축 상에 플롯팅된다.
도 47은 시노몰구스 원숭이에서 항--KLH 항체 (대조), 21B12, 8A3 및 11F1에 대한 PK 매개변수를 요약하는 표이다.
도 48A는 8A1, 8A3과 11F1의 경쇄 아미노산 서열의 비교뿐만 아니라 이러한 비교로부터 도출된 공통 서열을 도시한다. CDR 서열은 밑줄로 표시된다.
도 48B는 8A1, 8A3과 11F1의 중쇄 아미노산 서열의 비교뿐만 아니라 이러한 비교로부터 도출된 공통 서열을 도시한다. CDR 서열은 밑줄로 표시된다.

일정한 예시적인 구체예의 상세한 설명

PCSK9에 결합하는 항원 결합 단백질 (가령, 항체 및 이들의 기능성 결합 단편)이 본원에서 개시된다. 일부 구체예에서, 항원 결합 단백질은 PCSK9에 결합하고 PCSK9가 다양한 방식으로 기능하는 것을 예방한다. 일부 구체예에서, 항원 결합 단백질은 다른 물질과 상호작용하는 PCSK9의 능력을 차단하거나 감소시킨다. 가령, 일부 구체예에서, 항원 결합 단백질은 PCSK9가 LDLR에 결합하는 가능성을 예방하거나 감소시키는 방식으로 PCSK9에 결합한다. 다른 구체예에서, 항원 결합 단백질은 PCSK9에 결합하지만 LDLR과 상호작용하는 PCSK9의 능력을 차단하지 않는다. 일부 구체예에서, 항원 결합 단백질은 인간 단일클론 항체이다.

당업자가 인지하는 바와 같이, 본 발명의 개시에 비추어, PCSK9와 LDLR 사이에 상호작용을 변경하는 것은 LDL에 대한 결합에 이용가능한 LDLR의 양을 증가시킬 수 있고, 이것은 차례로, 개체 내에 혈청 LDL의 양을 감소시키고 개체의 혈청 콜레스테롤 수준에서 감소를 유발한다. 따라서 PCSK9에 대한 항원 결합 단백질은 상승된 혈청 콜레스테롤 수준을 갖는 개체, 상승된 혈청 콜레스테롤 수준의 위험에 처해 있는 개체, 또는 혈청 콜레스테롤 수준에서 감소로부터 이익을 얻을 수 있는 개체를 치료하기 위한 다양한 방법과 제제에 이용될 수 있다. 따라서 혈청 콜레스테롤을 저하하거나, 유지하거나, 또는 이의 증가를 예방하기 위한 다양한 방법과 기술 역시 본원에서 설명된다. 일부 구체예에서, 항원 결합 단백질은 PCSK9와 LDLR 사이에 결합을 허용하지만, 항원 결합 단백질은 LDLR에 대한 PCSK9의 유해한 활성을 예방하거나 감소시킨다. 일부 구체예에서, 항원 결합 단백질은 LDLR에 대한 PCSK9의 결합을 예방하거나 감소시킨다.

편의를 위하여, 하기 섹션은 본원에서 이용되는 용어의 다양한 의미를 개설한다. 이러한 논의 이후에, 항원 결합 단백질에 관한 일반적인 양상이 논의되고, 항원 결합 단백질의 다양한 구체예의 성질, 그리고 이들이 어떻게 이용될 수 있는 지를 예시하는 특정한 실례가 그 뒤를 잇는다.

정의와 구체예

상기의 일반적 설명 및 하기의 상세한 설명 둘 모두 단지 예시와 설명에 불과하고, 그리고 청구된 발명을 한정하지 않는 것으로 이해된다. 본 출원에서, 단수의 이용은 달리 명시되지 않으면, 복수를 포함한다. 본 출원에서, "또는"의 이용은 달리 규정되지 않으면, "및/또는"을 의미한다. 더 나아가, 용어 "포함하는"뿐만 아니라 다른 형태, 예를 들면, "포함한다" 및 "포함되는"의 이용은 한정하는 것이 아니다. 또한, "요소" 또는 "성분"과 같은 용어는 달리 명시되지 않으면, 하나의 단위를 포함하는 요소와 성분, 그리고 하나 이상의 아단위를 포함하는 요소와 성분 둘 모두를 포함한다. 또한, 용어 "부분"의 이용은 모이어티의 일부 또는 전체 모이어티를 포함할 수 있다.

본원에서 이용된 섹션 표제는 단지 편성을 목적으로 하고 설명된 요부 (subject matter)를 한정하는 것으로 해석되지 않는다. 특허, 특허 출원, 논문, 서적, 그리고 조약이 포함되지만 이들에 국한되지 않는 본 출원에서 인용된 모든 문서, 또는 문서의 일부는 본원에 순전히 전체로서 참고문헌으로 편입된다. 본 발명의 개시에 따라서 이용될 때, 하기 용어는 달리 지시되지 않으면, 하기 의미를 갖는 것으로 이해될 것이다:

용어 "프로단백질 전환효소 서브틸리신 케신 유형 9" 또는 "PCSK9"는 서열번호 1 및/또는 3에서 제시된 폴리펩티드 또는 이의 단편뿐만 아니라 대립형질 변이체, 스플라이스 변이체, 유도체 변이체, 치환 변이체, 결실 변이체, 및/또는 N-말단 메티오닌의 부가를 포함하는 삽입 변이체, 융합 폴리펩티드, 그리고 종간 동족체가 포함되지만 이들에 국한되지 않는 관련된 폴리펩티드를 지칭한다. 일정한 구체예에서, PCSK9 폴리펩티드는 말단 잔기, 예를 들면, 제한 없이, 리더 서열 잔기, 표적화 잔기, 아미노 말단 메티오닌 잔기, 리신 잔기, 태그 잔기 및/또는 융합 단백질 잔기를 포함한다. "PCSK9"는 또한, FH3, NARC1, HCHOLA3, 프로단백질 전환효소 서브틸리신/케신 유형 9, 그리고 중성 아폽토시스 제어된 전환효소 1로서 지칭된다. PCSK9 유전자는 분비 서브틸라아제 (subtilase) 패밀리의 프로테이나아제 K 하위패밀리에 속하는 프로단백질 전환효소 단백질을 인코딩한다. 용어 "PCSK9"는 프로단백질, 그리고 프로단백질의 자가촉매 이후에 산출된 산물 둘 모두를 의미한다. 자가촉매된 산물만 지칭될 때 (가령, 개열된 PCSK9에 선별적으로 결합하는 항원 결합 단백질의 경우에), 단백질은 "성숙", "개열된", "가공된" 또는 "활성" PCSK9로서 지칭될 수 있다. 비활성 형태만 지칭될 때, 단백질은 PCSK9의 "비활성", "프로-형태", 또는 "가공되지 않은" 형태로서 지칭될 수 있다. 본원에서 이용된 바와 같이 용어 PCSK9는 또한, 자연 발생 대립형질, 예를 들면, 돌연변이 D374Y, S127R과 F216L을 포함한다. 용어 PCSK9는 또한, PCSK9 아미노산 서열의 번역후 변형을 함입하는 PCSK9 분자, 예를 들면, 당화된 PCSK9 서열, PEG화된 PCSK9 서열, 신호 서열이 개열된 PCSK9 서열, 프로 도메인이 촉매 도메인으로부터 개열되지만 촉매 도메인으로부터 분리되지 않은 PCSK9 서열을 포함한다 (가령, 도 1A와 1B).

용어 "PCSK9 활성"은 PCSK9의 임의의 생물학적 효과를 포함한다. 일정한 구체예에서, PCSK9 활성은 기질 또는 수용체와 상호작용하거나 이에 결합하는 PCSK9의 능력을 포함한다. 일부 구체예에서, PCSK9 활성은 LDL 수용체 (LDLR)에 결합하는 PCSK9의 능력에 의해 대표된다. 일부 구체예에서, PCSK9는 LDLR에 결합하고 이를 수반하는 반응을 촉매한다. 일부 구체예에서, PCSK9 활성은 LDLR의 가용성을 변경하는 (가령, 감소시키는) PCSK9의 능력을 포함한다. 일부 구체예에서, PCSK9 활성은 개체 내에서 LDL의 양을 증가시키는 PCSK9의 능력을 포함한다. 일부 구체예에서, PCSK9 활성은 LDL에 결합하는데 가용한 LDLR의 양을 감소시키는 PCSK9의 능력을 포함한다. 일부 구체예에서, "PCSK9 활성"은 PCSK9 신호전달로부터 발생하는 임의의 생물학적 활성을 포함한다. 예시적인 활성에는 LDLR에 PCSK9 결합, LDLR 또는 기타 단백질을 개열하는 PCSK9 효소 활성, PCSK9 작용을 조장하는 LDLR 이외의 단백질에 PCSK9 결합, APOB 분비를 변경하는 PCSK9 (Sun X-M et al, "Evidence for effect of mutant PCSK9 on apoliprotein B secretion as the cause of unusually severe dominant hypercholesterolemia, Human Molecular Genetics 14: 1161-1169, 2005 및 Ouguerram K et al, "Apolipoprotein B100 metabolism in autosomal-dominant hypercholesterolemia related to mutations in PCSK9, Arterioscler thromb Vasc Biol. 24: 1448-1453, 2004), 간 재생과 뇌신경 세포 분화에서 PCSK9의 역할 (Seidah NG et al, "The secretory proprotein convertase neural apoptosis-regulated convertase 1 (NARC-1): Liver regeneration and neuronal differentiation" PNAS 100: 928-933, 2003), 그리고 간 글루코오스 대사에서 PCSK9의 역할 (Costet et al., "Hepatic PCSK9 expression is regulated by nutritional status via insulin and sterol regulatory element-binding protein 1c" J. Biol. Chem. 281(10):6211-18, 2006)이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.

본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "고콜레스테롤혈증"은 콜레스테롤 수준이 원하는 수준을 초과하여 상승되는 질환을 지칭한다. 일부 구체예에서, 이것은 혈청 콜레스테롤 수준이 상승된다는 것을 의미한다. 일부 구체예에서, 원하는 수준은 당업자에게 공지된 다양한 "위험 인자" (본원에서 설명되고 언급됨)를 고려한다.

용어 "폴리뉴클레오티드" 또는 "핵산"은 단일-가닥과 이중-가닥 뉴클레오티드 중합체 둘 모두를 포함한다. 폴리뉴클레오티드를 포함하는 뉴클레오티드는 리보뉴클레오티드 또는 데옥시리보뉴클레오티드 또는 어느 한쪽 유형의 뉴클레오티드의 변형된 형태일 수 있다. 상기 변형에는 염기 변형, 예를 들면, 브로모우리딘과 이노신 유도체, 리보오스 변형, 예를 들면, 2',3'-디데옥시리보오스, 그리고 뉴클레오티드간 연쇄 변형, 예를 들면, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포로셀레노에이트, 포스포로디셀레노에이트, 포스포로아닐로티오에이트, 포스포라닐라데이트와 포스포로아미데이트가 포함된다.

용어 "올리고뉴클레오티드"는 200개 또는 그 이하의 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 의미한다. 일부 구체예에서, 올리고뉴클레오티드는 10 내지 60개 염기 길이를 갖는다. 다른 구체예에서, 올리고뉴클레오티드는 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20 내지 40개 뉴클레오티드 길이를 갖는다. 올리고뉴클레오티드는 예로써, 돌연변이 유전자의 작제에서 이용을 위한 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 센스 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드일 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 검출 검정을 위한 방사성 라벨, 형광 라벨, 합텐 또는 항원성 라벨을 비롯한 라벨을 포함할 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 예로써, PCR 프라이머, 클로닝 프라이머 또는 혼성화 프로브로서 이용될 수도 있다.

"단리된 핵산 분자"는 게놈, mRNA, cDNA, 또는 합성 기원의 DNA 또는 RNA 또는 이들의 일부 조합을 의미하고, 이것은 단리된 폴리뉴클레오티드가 자연에서 관찰되는 폴리뉴클레오티드의 전체 또는 부분과 관련되지 않고, 또는 단리된 폴리뉴클레오티드가 자연에서 연결되지 않는 폴리뉴클레오티드에 연결된다. 본 발명의 개시의 목적으로, 특정 뉴클레오티드 서열을 "포함하는 핵산 분자"는 본래 염색체를 포함하지 않는 것으로 이해되어야 한다. 특정된 핵산 서열을 "포함하는" 단리된 핵산 분자는 특정된 서열 이외에, 10개까지 또는 심지어 20개까지의 다른 단백질 또는 이들의 부분에 대한 코딩 서열을 포함할 수 있고, 또는 언급된 핵산 서열의 코딩 영역의 발현을 제어하는 작동가능하게 연결된 조절 서열을 포함할 수 있고, 및/또는 벡터 서열을 포함할 수 있다.

달리 명시되지 않으면, 본원에서 논의된 단일-가닥 폴리뉴클레오티드 서열의 왼쪽 단부는 5' 단부이다; 이중-가닥 폴리뉴클레오티드 서열의 왼쪽 방향은 5' 방향으로 지칭된다. 미성숙 RNA 전사체의 5'에서 3' 부가의 방향은 전사 방향으로 지칭된다; RNA 전사체의 5' 단부에 5'이고 RNA 전사체와 동일한 서열을 갖는 DNA 가닥 상에 서열 영역은 "상류 서열"로 지칭된다; RNA 전사체의 3' 단부에 3'이고 RNA 전사체와 동일한 서열을 갖는 DNA 가닥 상에 서열 영역은 "하류 서열"로 지칭된다.

용어 "제어 서열"은 이것이 결찰되는 코딩 서열의 발현과 가공 처리에 영향을 줄 수 있는 폴리뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 이런 제어 서열의 성격은 숙주 생물체에 좌우될 수 있다. 특정 구체예에서, 원핵생물에 대한 제어 서열은 프로모터, 리보솜 결합 부위, 그리고 전사 종결 서열을 포함할 수 있다. 가령, 진핵생물에 대한 제어 서열은 전사 인자에 대한 하나 또는 복수의 인식 부위를 포함하는 프로모터, 전사 인핸서 서열, 그리고 전사 종결 서열을 포함할 수 있다. "제어 서열"은 리더 서열 및/또는 융합 파트너 서열을 포함할 수 있다.

용어 "벡터"는 단백질 코딩 정보를 숙주 세포 내로 전달하는데 이용되는 임의의 분자 또는 실체 (가령, 핵산, 플라스미드, 박테리오파지 또는 바이러스)를 의미한다.

용어 "발현 벡터" 또는 "발현 구조체"는 숙주 세포의 형질전환에 적합하고, 그리고 거기에 작동가능하게 연결된 하나 또는 그 이상의 이종기원성 코딩 영역의 발현을 주동하는 및/또는 제어하는 (숙주 세포와 함께) 핵산 서열을 내포하는 벡터를 지칭한다. 발현 구조체는 전사와 번역에 영향을 주거나 이들을 제어하고, 그리고 인트론이 존재하면, 거기에 작동가능하게 연결된 코딩 영역의 RNA 스플라이싱에 영향을 주는 서열을 포함할 수 있지만 이들에 한정되지 않는다.

본원에서 이용된 바와 같이, "작동가능하게 연결된"은 상기 용어가 적용되는 성분이 적절한 조건 하에, 그들의 선천적 기능을 수행할 수 있도록 하는 관계에 있다는 것을 의미한다. 가령, 단백질 코딩 서열에 "작동가능하게 연결된" 벡터 내에 제어 서열은 단백질 코딩 서열의 발현이 제어 서열의 전사 활성과 융화성인 조건 하에 달성되도록, 거기에 결찰된다.

용어 "숙주 세포"는 핵산으로 형질전환되었거나 형질전환될 수 있고, 따라서 목적되는 유전자를 발현하는 세포를 의미한다. 상기 용어는 목적되는 유전자가 존재하기만 하면, 자손이 형태학 또는 유전자 구성에서 최초 부모 세포와 동일한 지에 상관없이, 부모 세포의 자손을 포함한다.

용어 "형질감염"은 세포에 의한 외래 또는 외인성 DNA의 흡수를 의미하고, 그리고 세포는 외인성 DNA가 세포 막 내부에 도입될 때, "형질감염"된다. 다수의 형질감염 기술은 당분야에 널리 알려져 있고 본원에서 개시된다. 예로써, Graham et al., 1973, Virology 52:456; Sambrook et al., 2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, supra; Davis et al., 1986, Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier; Chu et al., 1981, Gene 13:197을 참조한다. 이런 기술은 하나 또는 그 이상의 외인성 DNA 모이어티를 적절한 숙주 세포 내로 도입하는데 이용될 수 있다.

용어 "형질전환"은 세포의 유전적 특징에서 변화를 지칭하고, 그리고 세포는 새로운 DNA 또는 RNA를 내포하도록 변형될 때, 형질전환된다. 가령, 세포는 새로운 유전자 물질을 형질감염, 형질도입, 또는 기타 기술에 의해 도입함으로써 고유 상태로부터 유전적으로 변형되는 경우에, 형질전환된다. 형질감염 또는 형질도입 이후에, 형질전환 DNA는 세포의 염색체 내로 물리적으로 함입함으로써 세포의 DNA와 재조합하거나, 또는 복제 없이 에피솜 요소로서 일시적으로 유지되거나, 또는 플라스미드로서 독립적으로 복제할 수 있다. 세포는 형질전환 DNA가 세포의 분열 시에 복제될 때, "안정되게 형질전환된" 것으로 간주된다.

용어 "폴리펩티드" 또는 "단백질"은 고유 단백질, 다시 말하면, 자연 발생 세포와 비-재조합 세포에 의해 생산된 단백질의 아미노산 서열을 갖는 거대분자를 의미한다; 또는 이것은 유전자-조작된 또는 재조합 세포에 의해 생산되고, 그리고 고유 단백질의 아미노산 서열을 갖는 분자, 또는 고유 서열로부터 결실, 고유 서열에 부가, 및/또는 고유 서열의 하나 또는 그 이상 아미노산의 치환을 갖는 분자를 포함한다. 상기 용어에는 또한, 하나 또는 그 이상의 아미노산이 상응하는 자연 발생 아미노산과 중합체의 화학적 유사체인 아미노산 중합체가 포함된다. 용어 "폴리펩티드"와 "단백질"은 PCSK9 항원 결합 단백질, 항체, 또는 항원-결합 단백질로부터 결실, 항원-결합 단백질에 부가, 및/또는 항원-결합 단백질의 하나 또는 그 이상 아미노산의 치환을 갖는 서열을 특이적으로 포함한다. 용어 "폴리펩티드 단편"은 전장 고유 단백질과 비교하여, 아미노-말단 결실, 카르복실-말단 결실, 및/또는 내부 결실을 갖는 폴리펩티드를 지칭한다. 이런 단편은 또한, 고유 단백질과 비교하여 변형된 아미노산을 내포한다. 일정한 구체예에서, 단편은 약 5개 내지 500개 아미노산 길이를 갖는다. 가령, 단편은 적어도 5, 6, 8, 10, 14, 20, 50, 70, 100, 110, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 또는 450개 아미노산 길이를 가질 수 있다. 유용한 폴리펩티드 단편에는 결합 도메인을 포함하는 항체의 면역학적으로 기능성 단편이 포함된다. PCSK9-결합 항체의 경우에, 유용한 단편에는 CDR 영역, 중쇄 및/또는 경쇄의 가변 도메인, 항체 사슬의 부분 또는 2개의 CDR을 포함하는 이의 가변 영역 등이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.

언급된 용어 "단리된 단백질"은 개체 단백질이 (1) 통상적으로 함께 관찰되는 적어도 일부 다른 단백질이 없고, (2) 동일한 공급원, 예를 들면, 동일한 종으로부터 다른 단백질이 본질적으로 없고, (3) 상이한 종으로부터 세포에 의해 발현되고, (4) 폴리뉴클레오티드, 지질, 탄수화물, 또는 자연에서 함께 결합되는 다른 물질 중에서 적어도 약 50 퍼센트로부터 분리되고, (5) 자연에서 함께 결합되지 않는 폴리펩티드와 작동가능하게 결합되고 (공유 또는 비공유 상호작용에 의해), 또는 (6) 자연에서 발생하지 않는다는 것을 의미한다. 전형적으로, "단리된 단백질"은 소정의 시료의 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 25%, 또는 적어도 약 50%를 구성한다. 게놈 또는 합성 기원의 DNA, cDNA, mRNA 또는 다른 RNA, 또는 이들의 임의의 조합이 이런 단리된 단백질을 인코딩할 수 있다. 바람직하게는, 단리된 단백질은 이의 치료적 용도, 진단적 용도, 예방적 용도, 연구 또는 기타 용도를 간섭하는, 자연 환경에서 관찰되는 단백질 또는 폴리펩티드 또는 기타 오염물질이 실질적으로 없다.

용어 "아미노산"은 당분야에서 통상적인 의미를 포함한다.

폴리펩티드 (가령, 항원 결합 단백질, 또는 항체)의 "변이체"는 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기가 다른 폴리펩티드 서열에 비하여, 아미노산 서열 내로 삽입되고, 아미노산 서열로부터 결실되고 및/또는 아미노산 서열 내로 치환되는 아미노산 서열을 포함한다. 변이체는 융합 단백질을 포함한다.

용어 "동일성"은 2개 또는 그 이상의 폴리펩티드 분자 또는 2개 또는 그 이상의 핵산 분자의 서열을 정렬하고 이들 서열을 비교함으로써 결정된, 이들 서열 간에 관계를 지칭한다. "동일성 퍼센트"는 비교된 분자에서 아미노산 또는 뉴클레오티드 간에 동일한 잔기의 퍼센트를 의미하고, 그리고 비교되는 분자의 가장 작은 크기에 기초하여 계산된다. 이들 계산을 위하여, 정렬 내에 갭 (만약 존재하면)은 바람직하게는, 특정 수학 모델 또는 컴퓨터 프로그램 (즉, "알고리즘")에 의해 다뤄진다. 정렬된 핵산 또는 폴리펩티드의 동일성을 계산하는데 이용될 수 있는 방법은 Computational Molecular Biology, (Lesk, A. M., ed.), 1988, New York: Oxford University Press; Biocomputing Informatics and Genome Projects, (Smith, D. W., ed.), 1993, New York: Academic Press; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, (Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds.), 1994, New Jersey: Humana Press; von Heinje, G., 1987, Sequence Analysis in Molecular Biology, New York: Academic Press; Sequence Analysis Primer, (Gribskov, M. and Devereux, J., eds.), 1991, New York: M. Stockton Press; 그리고 Carillo et al., 1988, SIAM J. Applied Math. 48:1073에서 설명된 것들이 포함된다.

동일성 퍼센트를 계산할 때, 비교되는 서열은 전형적으로, 서열 사이에 최대 정합을 제공하는 방식으로 정렬된다. 동일성 퍼센트를 결정하는데 이용될 수 있는 컴퓨터 프로그램의 한 가지 실례는 GCG 프로그램 패키지인데, 이것은 GAP (Devereux et al., 1984, Nucl. Acid Res. 12:387; Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, WI)를 포함한다. 컴퓨터 알고리즘 GAP는 서열 동일성 퍼센트가 결정되는 2개의 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 정렬하는데 이용된다. 이들 서열은 그들의 개별 아미노산 또는 뉴클레오티드의 최적 정합 (알고리즘에 의해 결정된 "정합된 폭")을 위해 정렬된다. 갭 오프닝 페널티 (gap opening penalty) (이것은 3x 평균 디아고날 (average diagonal)로서 계산되고, 여기서 "평균 디아고날"은 이용되는 비교 매트릭스의 디아고날의 평균이고; "디아고날 (diagonal)"은 특정 비교 매트릭스에 의한 각각의 완벽한 아미노산 정합에 할당된 스코어 또는 번호이다)와 갭 신장 페널티 (gap extension penalty) (이것은 통상적으로, 갭 오프닝 페널티의 1/10배이다)뿐만 아니라 비교 매트릭스, 예를 들면, PAM 250 또는 BLOSum 62가 상기 알고리즘과 함께 이용된다. 일정한 구체예에서, 표준 비교 매트릭스 (참조: Dayhoff et al., 1978, Atlas of Protein Sequence and Structure 5:345-352 for the PAM 250 comparison matrix; Henikoff et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:10915-10919 for the BLOSum 62 comparison matrix) 역시 상기 알고리즘에 의해 이용된다.

GAP 프로그램을 이용하여 폴리펩티드 또는 뉴클레오티드 서열에 대한 동일성 퍼센트을 결정하는데 이용될 수 있는 매개변수의 실례는 하기와 같다:

ㆍ 알고리즘: Needleman et al., 1970, J. Mol. Biol. 48:443-453

ㆍ 비교 매트릭스: Henikoff et al., 1992, supra로부터 BLOSum 62

ㆍ 갭 페널티: 12 (단부 갭에 대한 페널티 없음)

ㆍ 갭 길이 페널티: 4

ㆍ 유사성의 역치: 0

2개의 아미노산 서열을 정렬하기 위한 일정한 정렬 계획은 이들 두 서열의 단지 짧은 영역의 정합만을 산출하고, 그리고 이러한 작은 정렬된 영역은 심지어 이들 두 전장 서열 사이에 유의미한 관계가 없음에도 불구하고, 매우 높은 서열 동일성을 가질 지도 모른다. 따라서 선택된 정렬 방법 (GAP 프로그램)은 원하는 경우에, 표적 폴리펩티드의 적어도 50개 또는 다른 숫자의 연속 아미노산에 걸치는 정렬을 산출하기 위해 조정될 수 있다.

본원에서 이용된 바와 같이, 20개의 전통적인 (가령, 자연 발생) 아미노산 및 이들의 약어는 전통적인 용법을 따른다. Immunology--A Synthesis (2nd Edition, E. S. Golub and D. R. Gren, Eds., Sinauer Associates, Sunderland, Mass. (1991))을 참조하고, 이것은 본원에 순전히 참고문헌으로 편입된다. 이들 20개 전통적인 아미노산의 입체이성질체 (가령, D-아미노산), 비자연 아미노산, 예를 들면, α-,α-이중치환된 아미노산, N-알킬 아미노산, 젖산, 그리고 기타 비전통적인 아미노산 역시 본 발명의 폴리펩티드에 적합한 성분일 수 있다. 비전통적인 아미노산의 실례에는 하기가 포함된다: 4-히드록시프롤린, γ-카르복시글루타민산염, ε-N,N,N-트리메틸리신, ε-N-아세틸리신, O-포스포세린, N-아세틸세린, N-포르밀메티오닌, 3-메틸히스티딘, 5-히드록시리신, σ-N-메틸아르기닌, 그리고 기타 유사한 아미노산과 이미노산 (가령, 4-히드록시프롤린). 본원에서 이용된 폴리펩티드 기호법에서, 표준 용법과 관례에 따라서, 왼쪽 방향은 아미노 말단 방향이고, 그리고 오른쪽 방향은 카르복시-말단 방향이다.

유사하게, 달리 명시되지 않으면, 단일-가닥 폴리뉴클레오티드 서열의 왼쪽 단부는 5' 단부이다; 이중-가닥 폴리뉴클레오티드 서열의 왼쪽 방향은 5' 방향으로 지칭된다. 미성숙 RNA 전사체의 5'에서 3' 부가의 방향은 전사 방향으로 지칭된다; RNA 전사체의 5' 단부에 5'이고 RNA 전사체와 동일한 서열을 갖는 DNA 가닥 상에 서열 영역은 "상류 서열"로 지칭된다; RNA 전사체의 3' 단부에 3'이고 RNA 전사체와 동일한 서열을 갖는 DNA 가닥 상에 서열 영역은 "하류 서열"로 지칭된다.

보존성 아미노산 치환은 비-자연 발생 아미노산 잔기를 포함할 수 있는데, 이들은 전형적으로, 생물학적 시스템에서 합성보다는 화학적 펩티드 합성에 의해 함입된다. 이들에는 펩티드모방체 및 아미노산 모이어티의 다른 뒤집히거나 반전된 형태가 포함된다.

자연 발생 잔기는 공통의 측쇄 성질에 기초한 부류로 분류될 수 있다:

1) 소수성: 노르류신, Met, Ala, Val, Leu, Ile;

2) 중성 친수성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;

3) 산성: Asp, Glu;

4) 염기성: His, Lys, Arg;

5) 사슬 방향에 영향을 주는 잔기: Gly, Pro; 그리고

6) 방향족: Trp, Tyr, Phe.

가령, 비-보존성 치환은 이들 부류 중의 한 가지의 구성원을 다른 부류의 구성원으로 교체하는 것을 수반할 수 있다. 이런 치환된 잔기는 예로써, 비-인간 항체와 상동성인 인간 항체의 영역, 또는 상기 분자의 비-상동성 영역 내로 도입될 수 있다.

항원 결합 단백질 또는 PCSK9 단백질에 변화를 만듦에 있어서, 일정한 구체예에 따라, 아미노산의 친수도 지수 (hydropathic index)가 고려될 수도 있다. 각 아미노산은 소수성과 전하 특징의 기초에서 친수도 지수가 부여되었다. 이들은 하기와 같다: 이소류신 (+4.5); 발린 (+4.2); 류신 (+3.8); 페닐알라닌 (+2.8); 시스테인/시스틴 (+2.5); 메티오닌 (+1.9); 알라닌 (+1.8); 글리신 (-0.4); 트레오닌 (-0.7); 세린 (-0.8); 트립토판 (-0.9); 티로신 (-1.3); 프롤린 (-1.6); 히스티딘 (-3.2); 글루타민산염 (-3.5); 글루타민 (-3.5); 아스파르트산염 (-3.5); 아스파라긴 (-3.5); 리신 (-3.9); 그리고 아르기닌 (-4.5).

단백질에 상호작용성 생물학적 기능을 공여함에 있어서 아미노산의 친수도 지수의 중요성은 당분야에서 이미 알려져 있다. Kyte et al., J. Mol. Biol., 157:105-131 (1982). 일정한 아미노산은 유사한 친수도 지수 또는 스코어를 갖는 다른 아미노산에 대해 치환되고 유사한 생물학적 활성을 여전히 유지할 수 있는 것으로 알려져 있다. 친수도 지수에 기초하여 변화를 만듦에 있어서, 일정한 구체예에서, 친수도 지수가 ±2 내에 있는 아미노산의 치환이 포함된다. 일정한 구체예에서, ±1 내에 있는 것들이 포함되고, 그리고 일정한 구체예에서, ±0.5 내에 있는 것들이 포함된다.

또한, 유사 아미노산의 치환은 특히, 이렇게 산출된 생물학적으로 기능성 단백질 또는 펩티드가 현재의 경우에서처럼, 면역학적 구체예에서 이용이 의도되는 경우에, 친수성의 기초에서 효과적으로 만들어질 수 있는 것으로 당분야에 이미 알려져 있다. 일정한 구체예에서, 인접 아미노산의 친수성에 의해 지배되는, 단백질의 최대 국부 평균 친수성은 이의 면역원성과 항원성, 다시 말하면, 상기 단백질의 생물학적 성질과 상관한다.

하기의 친수성 값이 이들 아미노산 잔기에 부여되었다: 아르기닌 (+3.0); 리신 (+3.0); 아스파르트산염 (+3.0±1); 글루타민산염 (+3.0±1); 세린 (+0.3); 아스파라긴 (+0.2); 글루타민 (+0.2); 글리신 (0); 트레오닌 (-0.4); 프롤린 (-0.5±1); 알라닌 (-0.5); 히스티딘 (-0.5); 시스테인 (-1.0); 메티오닌 (-1.3); 발린 (-1.5); 류신 (-1.8); 이소류신 (-1.8); 티로신 (-2.3); 페닐알라닌 (-2.5) 및 트립토판 (-3.4). 유사한 친수성 값에 기초하여 변화를 만듦에 있어서, 일정한 구체예에서, 친수성 값이 ±2 내에 있는 아미노산의 치환이 포함되고, 일정한 구체예에서, ±1 내에 있는 것들이 포함되고, 그리고 일정한 구체예에서, ±0.5 내에 있는 것들이 포함된다. 또한, 친수성의 기초에서 일차 아미노산 서열로부터 에피토프를 확인할 수 있다. 이들 영역은 또한, "에피토프 코어 영역"으로 지칭된다.

예시적인 아미노산 치환은 표 1에 열거된다.

아미노산 치환

본래 잔기	예시적인 치환	바람직한 치환
Ala	Val, Leu, Ile	Val
Arg	Lys, Gln, Asn	Lys
Asn	Gln	Gln
Asp	Glu	Glu
Cys	Ser, Ala	Ser
Gln	Asn	Asn
Glu	Asp	Asp
Gly	Pro, Ala	Ala
His	Asn, Gln, Lys, Arg	Arg
Ile	Leu, Val, Met, Ala, Phe, 노르류신	Leu
Leu	노르류신, Ile, Val, Met, Ala, Phe	Ile
Lys	Arg, 1,4 디아미노-부티르산, Gln, Asn	Arg
Met	Leu, Phe, Ile	Leu
Phe	Leu, Val, Ile, Ala, Tyr	Leu
Pro	Ala	Gly
Ser	Thr, Ala, Cys	Thr
Thr	Ser	Ser
Trp	Tyr, Phe	Tyr
Tyr	Trp, Phe, Thr, Ser	Phe
Val	Ile, Met, Leu, Phe, Ala, 노르류신	Leu

용어 "유도체"는 아미노산 (또는 핵산)의 삽입, 결실, 또는 치환 이외의 화학적 변형을 포함하는 분자를 지칭한다. 일정한 구체예에서, 유도체는 중합체, 지질, 또는 기타 유기 또는 무기 모이어티와의 화학적 결합이 포함되지만 이들에 국한되지 않는 공유 변형을 포함한다. 일정한 구체예에서, 화학적으로 변형된 항원 결합 단백질은 화학적으로 변형되지 않은 항원 결합 단백질보다 큰 순환 반감기를 가질 수 있다. 일정한 구체예에서, 화학적으로 변형된 항원 결합 단백질은 원하는 세포, 조직, 및/또는 장기에 대한 향상된 표적화 능력을 가질 수 있다. 일부 구체예에서, 유도체 항원 결합 단백질은 폴리에틸렌 글리콜, 폴리옥시에틸렌 글리콜, 또는 폴리프로필렌 글리콜이 포함되지만 이들에 국한되지 않는 하나 또는 그 이상의 물 용해성 중합체 부착을 포함하도록 공유 변형된다. 예로써, U.S. 특허 번호 4,640,835, 4,496,689, 4,301,144, 4,670,417, 4,791,192와 4,179,337을 참조한다. 일정한 구체예에서, 유도체 항원 결합 단백질은 모노메톡시-폴리에틸렌 글리콜, 덱스트란, 셀룰로오스, 또는 기타 탄수화물 기초된 중합체, 폴리-(N-비닐 피롤리돈)-폴리에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜 동종중합체, 폴리프로필렌 산화물/에틸렌 산화물 공-중합체, 폴리옥시에틸화 폴리올 (가령, 글리세롤) 및 폴리비닐 알코올뿐만 아니라 이런 중합체의 혼합물이 포함되지만 이들에 국한되지 않는 하나 또는 그 이상 중합체를 포함한다. 일정한 구체예에서, 유도체는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 아단위로 공유 변형된다. 일정한 구체예에서, 하나 또는 그 이상의 물-용해성 중합체는 유도체의 하나 또는 그 이상의 특정한 위치, 예를 들면, 아미노 말단에서 결합된다. 일정한 구체예에서, 하나 또는 그 이상의 물-용해성 중합체는 유도체의 하나 또는 그 이상의 측쇄에 무작위로 부착된다. 일정한 구체예에서, PEG는 항원 결합 단백질에 대한 치료적 능력을 향상시키는데 이용된다. 일정한 구체예에서, PEG는 인간화 항체에 대한 치료적 능력을 향상시키는데 이용된다. 일정한 이와 같은 방법은 예로써, U.S. 특허 번호 6,133,426에서 논의되고, 이것은 본원에 순전히 참고문헌으로 편입된다. 주형 펩티드의 성질과 유사한 성질을 갖는 펩티드 유사체는 비-펩티드 약물로서 제약 업계에서 통상적으로 이용된다. 이들 유형의 비-펩티드 화합물은 "펩티드 모방체" 또는 "펩티드모방체"로 명명된다. Fauchere, J., Adv. Drug Res., 15:29 (1986); Veber & Freidinger, TINS, p.392 (1985); 그리고 Evans et al., J. Med. Chem., 30:1229 (1987), 이들은 본원에 순전히 참고문헌으로 편입된다. 이런 화합물은 종종, 전산화된 분자 모델링의 도움으로 개발된다. 치료적으로 유용한 펩티드에 구조적으로 유사한 펩티드 모방체는 유사한 치료적 또는 예방적 효과를 산출하는데 이용될 수 있다. 일반적으로, 펩티드모방체는 모범 폴리펩티드 (즉, 생화학적 성질 또는 약리학적 활성을 갖는 폴리펩티드), 예를 들면, 인간 항체에 구조적으로 유사하지만, 당분야에 널리 공지된 방법에 의해 --CH₂NH--, --CH₂S--, --CH₂-CH₂--, --CH=CH-(시스와 트랜스), --COCH₂--, --CH(OH)CH₂--, 그리고 --CH₂SO--에서 선택되는 연쇄에 의해 선택적으로 치환된 하나 또는 그 이상의 펩티드 연쇄를 갖는다. 동일한 유형의 D-아미노산으로 공통 서열의 하나 또는 그 이상의 아미노산의 체계적 치환 (가령, L-리신 대신에 D-리신)은 더욱 안정된 펩티드를 산출하기 위해 일정한 구체예에서 이용될 수 있다. 이에 더하여, 공통 서열 또는 실질적으로 동일한 공통 서열 변이를 포함하는 속박된 펩티드가 당분야에 공지된 방법에 의해 산출될 수 있다 (본원에 순전히 참고문헌으로 편입되는 Rizo and Gierasch, Ann. Rev. Biochem., 61:387 (1992)); 가령, 펩티드를 환화하는 분자내 이황화 가교를 형성할 수 있는 내부 시스테인 잔기를 부가함으로써.

생물학적 물질, 예를 들면, 폴리펩티드, 핵산, 숙주 세포 등과 관련하여 본 명세서 전반에서 이용된 용어 "자연 발생"은 자연에서 관찰되는 물질, 또는 자연에서 관찰되는 물질의 형태를 지칭한다.

본원에서 이용된 바와 같이, "항원 결합 단백질" ("ABP")은 특정된 표적 항원에 결합하는 임의의 단백질을 의미한다. 본 출원에서, 특정된 표적 항원은 PCSK9 단백질 또는 이의 단편이다. "항원 결합 단백질"에는 항체 및 이들의 결합 일부분, 예를 들면, 면역학적으로 기능성 단편이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 펩티바디는 항원 결합 단백질의 다른 실례이다. 본원에서 이용된 바와 같이, 항체 또는 면역글로불린 사슬 (중쇄 또는 경쇄) 항원 결합 단백질의 용어 "면역학적으로 기능성 단편" (또는 간단히 "단편")은 전장 사슬 내에 존재하는 아미노산 중에서 적어도 일부를 결여하지만 항원에 여전히 특이적으로 결합할 수 있는 항체의 부분 (상기 부분이 어떻게 획득되는지 또는 합성되는지에 상관없이)을 포함하는 항원 결합 단백질의 종류이다. 이런 단편은 그들이 표적 항원에 결합하고, 그리고 소정의 에피토프에 결합에 대해 본래 항체를 비롯한 다른 항원 결합 단백질과 경쟁할 수 있다는 점에서 생물학적으로 활성이다. 일부 구체예에서, 단편은 중화 단편이다. 일부 구체예에서, 단편은 LDLR과 PCSK9 사이에 상호작용의 가능성을 차단하거나 감소시킬 수 있다. 한 양상에서, 이런 단편은 전장 경쇄 또는 중쇄 내에 존재하는 적어도 하나의 CDR을 유지하고, 그리고 일부 구체예에서, 단일 중쇄 및/또는 경쇄 또는 이의 부분을 포함할 것이다. 이들 생물학적으로 활성 단편은 재조합 DNA 기술에 의해 생산될 수 있고, 또는 본래 항체를 비롯한 항원 결합 단백질의 효소적 또는 화학적 개열에 의해 생산될 수 있다. 면역학적으로 기능성 면역글로불린 단편에는 Fab, 디아바디 (너무 짧아 동일한 사슬 상에서 2개 도메인 사이에 대합을 허용하지 않는 짧은 펩티드 링커를 통해 연결된, 경쇄 가변 도메인과 동일한 폴리펩티드 상에서 중쇄 가변 도메인), Fab', F(ab')₂, Fv, 도메인 항체 및 단일-사슬 항체가 포함되지만 이들에 국한되지 않고, 그리고 이들은 인간, 생쥐, 쥐, 낙타 또는 토끼가 포함되지만 이들에 국한되지 않는 임의의 포유류 공급원으로부터 유래될 수 있다. 게다가, 본원에서 개시된 항원 결합 단백질의 기능성 부분, 예를 들면, 하나 또는 그 이상의 CDR은 이중기능성 치료적 성질을 갖거나, 또는 연장된 혈청 반감기를 갖는, 신체 내에 특정 표적에 지향된 치료제를 산출하기 위한 두 번째 단백질 또는 작은 분자에 공유 결합될 수 있는 것으로 예기된다. 당업자가 인지하는 바와 같이, 항원 결합 단백질은 비단백질 성분을 포함할 수 있다. 본 발명의 개시의 일부 섹션에서, ABP의 실례는 "번호/문자/번호" (가령, 25A7)에 관하여 본원에서 설명된다. 이들 경우에, 정확한 명칭은 특정한 항체를 나타낸다. 다시 말하면, 25A7로 명명된 ABP는 25A7.1로 명명된 항체와 반드시 동일한 것은 아니다 (이들이 명세서 내에서 동일한 것으로 명백하게 교시되지 않는다면, 예를 들면, 25A7와 25A7.3). 당업자가 인지하는 바와 같이, 일부 구체예에서, LDLR은 항원 결합 단백질이 아니다. 일부 구체예에서, LDLR의 하위 구분은 항원 결합 단백질, 예를 들면, EGFa가 아니다. 일부 구체예에서, PCSK9가 생체내에서 신호전달하는 다른 분자는 항원 결합 단백질이 아니다. 이런 구체예는 그와 같이 명백하게 확인될 것이다.

본원에서 설명된 일정한 항원 결합 단백질은 항체이거나 또는 항체로부터 유래된다. 일정한 구체예에서, 항원 결합 단백질의 폴리펩티드 구조는 각각, 단일클론 항체, 이중특이적 항체, 미니바디, 도메인 항체, 합성 항체 (때때로, 본원에서 "항체 모방체"로서 지칭됨), 키메라 항체, 인간화 항체, 인간 항체, 항체 융합체 (때때로, 본원에서 "항체 접합체"로서 지칭됨), 그리고 이의 단편이 포함되지만 이들에 국한되지 않는 항체에 기초된다. 일부 구체예에서, ABP는 아비머 (avimer) (단단하게 결합하는 펩티드)를 포함하거나 또는 이들로 구성된다. 이들 다양한 항원 결합 단백질은 본원에서 더욱 설명된다.

"Fc" 영역은 항체의 C_H1과 C_H2 도메인을 포함하는 2개의 중쇄 단편을 포함한다. 이들 2개의 중쇄 단편은 2개 또는 그 이상의 이황화 결합에 의해, 그리고 C_H3 도메인의 소수성 상호작용에 의해 서로 묶인다.

"Fab 단편"은 1개의 경쇄 및 1개의 중쇄의 C_H1과 가변 영역을 포함한다. Fab 분자의 중쇄는 다른 중쇄 분자와 이황화 결합을 형성할 수 없다.

"Fab' 단편"은 1개의 경쇄 및 VH 도메인과 C_H1 도메인을 내포하는 중쇄의 부분, 그리고 또한, C_H1과 C_H2 도메인 사이에 영역을 포함하고, 따라서 사슬간 이황화 결합이 2개의 Fab' 단편의 2개의 중쇄 사이에 형성되어 F(ab')₂ 분자가 형성될 수 있다.

"F(ab')₂ 단편"은 2개의 경쇄, 그리고 C_H1과 C_H2 도메인 사이에 불변 영역의 부분을 내포하는 2개의 중쇄를 내포하고, 따라서 사슬간 이황화 결합이 이들 두 중쇄 사이에 형성된다. F(ab')₂ 단편은 따라서, 2개의 중쇄 사이에 이황화 결합에 의해 서로 묶이는 2개의 Fab' 단편으로 구성된다.

"Fv 영역"은 중쇄와 경쇄 둘 모두로부터 가변 영역을 포함하지만, 불변 영역을 결여한다.

"단일-사슬 항체"는 중쇄와 경쇄 가변 영역이 유연성 링커에 의해 연결되어 단일 폴리펩티드 사슬을 형성하고, 이것이 항원 결합 영역을 형성하는 Fv 분자이다. 단일 사슬 항체는 International Patent Application Publication No. WO 88/01649 및 United States Patent No. 4,946,778과 No. 5,260,203에서 상세하게 논의되고, 이들의 개시는 참고문헌으로 편입된다.

"도메인 항체"는 단지 중쇄의 가변 영역 또는 경쇄의 가변 영역만을 내포하는 면역학적으로 기능성 면역글로불린 단편이다. 일부 경우에, 2개 또는 그 이상의 V_H 영역은 이가 도메인 항체를 산출하기 위해 펩티드 링커로 공유 연결된다. 이가 도메인 항체의 2개의 V_H 영역은 동일한 또는 상이한 항원을 표적으로 할 수 있다.

"이가 항원 결합 단백질" 또는 "이가 항체"는 2개의 항원 결합 부위를 포함한다. 일부 경우에, 이들 2개의 결합 부위는 동일한 항원 특이성을 갖는다. 이가 항원 결합 단백질 및 이가 항체는 이중특이적일 수 있다 (하기 참조). "다중특이적" 또는 "다중기능성" 항체 이외의 이가 항체는 일정한 구체예에서, 전형적으로 각각의 결합 부위가 동일한 것으로 이해된다.

"다중특이적 항원 결합 단백질" 또는 "다중특이적 항체"는 하나 이상의 항원 또는 에피토프를 표적으로 하는 것이다.

"이중특이적," "이중-특이적" 또는 "이중기능성" 항원 결합 단백질 또는 항체는 각각, 2개의 상이한 항원 결합 부위를 갖는 하이브리드 항원 결합 단백질 또는 항체이다. 이중특이적 항원 결합 단백질과 항체는 다중특이적 항원 결합 단백질 항체의 일종이고, 그리고 하이브리도마들의 융합 또는 Fab' 단편들의 연결이 포함되지만 이들에 국한되지 않는 다양한 방법에 의해 생산될 수 있다. 예로써, Songsivilai and Lachmann, 1990, Clin. Exp. Immunol. 79:315-321; Kostelnyet al., 1992, J. Immunol. 148:1547-1553을 참조한다. 이중특이적 항원 결합 단백질 또는 항체의 2개의 결합 부위는 2개의 상이한 에피토프에 결합하고, 이들은 동일한 또는 상이한 단백질 표적 상에 존재할 수 있다.

항원 결합 단백질은 해리 상수 (K_d)가 ≤10^-7 M일 때, 표적 항원에 "특이적으로 결합하는" 것으로 일컬어진다. ABP는 K_d가 ≤5 x 10^-9 M일 때 "높은 친화성"으로, 그리고 K_d가 ≤5x 10^-10 M일 때 "매우 높은 친화성"으로 항원에 특이적으로 결합한다. 한 구체예에서, ABP는 ≤10^-9 M의 K_d를 갖는다. 한 구체예에서, 오프-레이트는 <1 x 10^-5이다. 다른 구체예에서, ABP는 약 10^-9 M 내지 10^-13 M의 K_d로 인간 PCSK9에 결합하고, 그리고 또 다른 구체예에서, ABP는 K_d ≤5 x 10^-10으로 결합할 것이다. 당업자가 인지하는 바와 같이, 일부 구체예에서, 임의의 또는 모든 항원 결합 단편은 PCSK9에 특이적으로 결합할 수 있다.

항원 결합 단백질은 두 번째 표적에 결합하는 것보다 한 표적에 더욱 강하게 결합할 때, "선별적"이다.

"항원 결합 영역"은 명시된 항원 (가령, 파라토프)에 특이적으로 결합하는 단백질, 또는 단백질의 부분을 의미한다. 가령, 항원과 상호작용하고 상기 항원에 대한 특이성과 친화성을 항원 결합 단백질에 공여하는 아미노산 잔기를 내포하는 항원 결합 단백질의 부분이 "항원 결합 영역"으로 지칭된다. 항원 결합 영역은 전형적으로, 하나 또는 그 이상의 "상보성 결합 영역" ("CDRs")을 포함한다. 일정한 항원 결합 영역은 또한, 하나 또는 그 이상의 "뼈대" 영역을 포함한다. "CDR"은 항원 결합 특이성과 친화성에 기여하는 아미노산 서열이다. "뼈대" 영역은 항원 결합 영역과 항원 사이에 결합을 증진하기 위해, CDR의 적절한 입체형태를 유지하는데 보조할 수 있다. 구조적으로, 뼈대 영역은 항체에서 CDR 사이에 위치될 수 있다. 뼈대와 CDR 영역의 실례는 도 2A-3D, 3CCC-3JJJ에서 도시된다. 일부 구체예에서, 항체 3B6의 경쇄에 대한 CDR에 대한 서열은 하기와 같고: CDR1 TLSSGYSSYEVD (서열번호 279); CDR2 VDTGGIVGSKGE (서열번호 280); CDR3 GADHGSGTNFVVV (서열번호 281), 그리고 FR은 하기와 같다: FR1 QPVLTQPLFASASLGASVTLTC (서열번호 282); FR2 WYQQRPGKGPRFVMR (서열번호 283); FR3 GIPDRFSVLGSGLNRYLTIKNIQEEDESDYHC (서열번호 284); 그리고 FR4 FGGGTKLTVL (서열번호 285).

일정한 양상에서, PCSK9, 예를 들면, 인간 PCSK9에 결합하는 재조합 항원 결합 단백질이 제공된다. 이러한 문맥에서, "재조합 항원 결합 단백질"은 재조합 기술을 이용하여, 다시 말하면, 본원에서 설명된 바와 같은 재조합 핵산의 발현을 통해 만들어진 단백질이다. 재조합 단백질의 생산을 위한 방법과 기술은 당분야에 널리 공지되어 있다.

용어 "항체"는 임의의 아이소타입의 본래 면역글로불린, 또는 표적 항원에 특이적 결합에 대해 본래 항체와 경쟁할 수 있는 이의 단편을 지칭하고, 그리고 예로써, 키메라, 인간화, 완전 인간, 그리고 이중특이적 항체를 포함한다. "항체"는 일종의 항원 결합 단백질이다. 본래 항체는 일반적으로, 적어도 2개의 전장 중쇄와 2개의 전장 경쇄를 포함하지만, 일부 경우에 더욱 작은 사슬, 예를 들면, 중쇄만을 포함할 수 있는 낙타과에서 자연 발생하는 항체를 포함할 수 있다. 항체는 오로지 단일 공급원으로부터 유래되거나, 또는 "키메라"일 수 있다, 다시 말하면, 항체의 상이한 부분이 하기에 더욱 설명된 바와 같이 2개의 상이한 항체로부터 유래될 수 있다. 항원 결합 단백질, 항체, 또는 결합 단편은 하이브리도마에서, 재조합 DNA 기술에 의해, 또는 본래 항체의 효소적 또는 화학적 개열에 의해 생산될 수 있다. 달리 지시되지 않으면, 용어 "항체"는 2개의 전장 중쇄 및 2개의 전장 경쇄를 포함하는 항체 이외에, 유도체, 변이체, 단편, 그리고 이들의 뮤테인을 포함하고, 이들의 실례는 하기에 설명된다. 게다가, 명백하게 배제되지 않으면, 항체는 각각, 단일클론 항체, 이중특이적 항체, 미니바디, 도메인 항체, 합성 항체 (본원에서 때대로, "항체 모방체"로서 지칭됨), 키메라 항체, 인간화 항체, 인간 항체, 항체 융합체 (본원에서 때때로, "항체 접합체"로서 지칭됨), 그리고 이의 단편을 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 용어는 또한, 펩티바디를 포함한다.

자연 발생 항체 구조 단위는 전형적으로, 테트라머를 포함한다. 이와 같은 각 테트라머는 전형적으로, 폴리펩티드 사슬의 2개의 동일한 쌍으로 구성되고, 각 쌍은 1개의 전장 "경쇄" (일정한 구체예에서, 약 25 kDa) 및 1개의 전장 "중쇄" (일정한 구체예에서, 약 50-70 kDa)를 갖는다. 각 사슬의 아미노-말단 부분은 전형적으로, 항원 인식을 전형적으로 담당하는 약 100 내지 110개 또는 그 이상 아미노산의 가변 영역을 포함한다. 각 사슬의 카르복시-말단 부분은 전형적으로, 효과기 기능을 담당할 수 있는 불변 영역을 정의한다. 인간 경쇄는 전형적으로, 카파와 람다 경쇄로서 분류된다. 중쇄는 전형적으로, 뮤, 델타, 감마, 알파, 또는 엡실론으로서 분류되고, 그리고 항체의 아이소타입을 각각, IgM, IgD, IgG, IgA, 그리고 IgE로서 정의한다. IgG는 IgG1, IgG2, IgG3, 그리고 IgG4가 포함되지만 이들에 국한되지 않는 몇몇 하위부류를 갖는다. IgM은 IgM1과 IgM2가 포함되지만 이들에 국한되지 않는 하위부류를 갖는다. IgA는 IgA1과 IgA2가 포함되지만 이들에 국한되지 않는 하위부류로 유사하게 세분된다. 전장 경쇄와 중쇄 내에서, 전형적으로 가변과 불변 영역은 약 12개 또는 그 이상의 아미노산의 "J" 영역에 의해 연결되고, 중쇄는 또한, 약 10개 이상의 아미노산의 "D" 영역을 포함한다. 예로써, Fundamental Immunology, Ch. 7 (Paul, W., ed., 2nd ed. Raven Press, N.Y. (1989))을 참조한다 (순전히 전체로서 참고문헌으로 편입됨). 각 경쇄/중쇄 쌍의 가변 영역은 전형적으로, 항원 결합 부위를 형성한다.

가변 영역은 전형적으로, 상보성 결정 영역 또는 CDR로 불리는 3개의 초가변 영역에 의해 연결된 상대적으로 보존된 뼈대 영역 (FR)의 동일한 일반적 구조를 나타낸다. 각 쌍의 이들 두 사슬로부터 CDR은 전형적으로, 뼈대 영역에 의해 정렬되고, 이들은 특정한 에피토프에 결합을 가능하게 할 수 있다. N-말단에서 C-말단까지, 경쇄와 중쇄 가변 영역 둘 모두 전형적으로, 도메인 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 및 FR4를 포함한다. 각 도메인에 아미노산의 지정은 전형적으로, Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 and 1991)), 또는 Chothia & Lesk, J. Mol. Biol., 196:901-917 (1987); Chothia et al., Nature, 342:878-883 (1989)의 정의에 따른다.

일정한 구체예에서, 항체 중쇄는 항체 경쇄의 부재에서 항원에 결합한다. 일정한 구체예에서, 항체 경쇄는 항체 중쇄의 부재에서 항원에 결합한다. 일정한 구체예에서, 항체 결합 영역은 항체 경쇄의 부재에서 항원에 결합한다. 일정한 구체예에서, 항체 결합 영역은 항체 중쇄의 부재에서 항원에 결합한다. 일정한 구체예에서, 개별 가변 영역은 다른 가변 영역의 부재에서 항원에 특이적으로 결합한다.

일정한 구체예에서, CDR의 확정적 묘사 및 항체의 결합 부위를 포함하는 잔기의 확인은 항체의 구조를 해명함으로써 및/또는 항체-리간드 복합체의 구조를 해명함으로써 달성된다. 일정한 구체예에서, 이것은 당업자에게 공지된 임의의 다양한 기술, 예를 들면, X-선 결정학에 의해 달성될 수 있다. 일정한 구체예에서, 다양한 분석 방법이 CDR 영역을 확인하거나 접근하는데 이용될 수 있다. 이런 방법의 실례에는 Kabat 정의, Chothia 정의, AbM 정의 및 접촉 정의가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.

Kabat 정의는 항체에서 잔기를 넘버링하기 위한 표준이고 CDR 영역을 확인하는데 전형적으로 이용된다. 예로써, Johnson & Wu, Nucleic Acids Res., 28: 214-8 (2000)를 참조한다. Chothia 정의는 Kabat 정의와 유사하지만, Chothia 정의는 일정한 구조 루프 영역의 위치를 고려한다. 예로써, Chothia et al., J. Mol. Biol., 196: 901-17 (1986); Chothia et al., Nature, 342: 877-83 (1989)을 참조한다. AbM 정의는 항체 구조를 모데링하는 Oxford Molecular Group에 의해 생산된 컴퓨터 프로그램의 통합된 스위트를 이용한다. 예로써, Martin et al., Proc Natl Acad Sci (USA), 86:9268-9272 (1989); "AbM^TM, A Computer Program for Modeling Variable Regions of Antibodies," Oxford, UK; Oxford Molecular, Ltd를 참조한다. AbM 정의는 지식 데이터베이스 및 압 이니시오 방법, 예를 들면, Samudrala et al., "Ab Initio Protein Structure Prediction Using a Combined Hierarchical Approach," in PROTEINS, Structure, Function and Genetics Suppl., 3:194-198 (1999)에 의해 설명된 것들의 조합을 이용하여, 항체의 삼차 구조를 일차 서열로부터 모델링한다. 접촉 정의는 가용한 복합 결정 구조의 분석에 기초된다. 예로써, MacCallum et al., J. Mol. Biol., 5:732-45 (1996)을 참조한다.

협약에 의해, 중쇄 내에 CDR 영역은 전형적으로, H1, H2, 그리고 H3으로 지칭되고, 그리고 아미노 말단에서 카르복시 말단으로의 방향에서 순차적으로 넘버링된다. 경쇄 내에 CDR 영역은 전형적으로, L1, L2, 그리고 L3으로 지칭되고, 그리고 아미노 말단에서 카르복시 말단으로의 방향에서 순차적으로 넘버링된다.

용어 "경쇄"는 전장 경쇄 및 결합 특이성을 공여할 만큼 충분한 가변 영역 서열을 갖는 이의 단편을 포함한다. 전장 경쇄는 가변 영역 도메인, V_L, 그리고 불변 영역 도메인, C_L을 포함한다. 경쇄의 가변 영역 도메인은 폴리펩티드의 아미노-말단에 있다. 경쇄는 카파 사슬과 람다 사슬을 포함한다.

용어 "중쇄"는 전장 중쇄 및 결합 특이성을 공여할 만큼 충분한 가변 영역 서열을 갖는 이의 단편을 포함한다. 전장 중쇄는 가변 영역 도메인, V_H, 그리고 3개의 불변 영역 도메인, C_H1, C_H2, 그리고 C_H3을 포함한다. V_H 도메인은 폴리펩티드의 아미노-말단에 있고, 그리고 C_H 도메인은 카르복실-말단에 있고, C_H3이 폴리펩티드의 카르복시-말단에 가장 근접한다. 중쇄는 IgG (IgG1, IgG2, IgG3과 IgG4 아류형 포함), IgA (IgA1과 IgA2 아류형 포함), IgM과 IgE를 비롯한 임의의 아이소타입일 수 있다.

이중특이적 또는 이중기능성 항체는 전형적으로, 2개의 상이한 중쇄/경쇄 쌍 및 2개의 상이한 결합 부위를 갖는 인공 하이브리드 항체이다. 이중특이적 항체는 하이브리도마의 융합 또는 Fab' 단편의 연결이 포함되지만 이들에 국한되지 않는 다양한 방법에 의해 생산될 수 있다. 예로써, Songsivilai et al., Clin. Exp. Immunol., 79: 315-321 (1990); Kostelny et al., J. Immunol., 148:1547-1553 (1992)을 참조한다.

포유류의 일부 종은 또한, 단일 중쇄만을 갖는 항체를 생산한다.

각 개별 면역글로불린 사슬은 전형적으로, 여러 "면역글로불린 도메인"으로 구성되고, 이들 각각은 대략 90 내지 110개의 아미노산으로 구성되고 특징적인 접힘 패턴을 갖는다. 이들 도메인은 항체 폴리펩티드가 구성되는 기본 단위이다. 인간에서, IgA와 IgD 아이소타입은 4개의 중쇄 및 4개의 경쇄를 내포한다; IgG와 IgE 아이소타입은 2개의 중쇄와 2개의 경쇄를 내포한다; 그리고 IgM 아이소타입은 5개의 중쇄 및 5개의 경쇄를 내포한다. 중쇄 C 영역은 전형적으로, 효과기 기능을 담당할 수 있는 하나 또는 그 이상의 도메인을 포함한다. 중쇄 불변 영역 도메인의 숫자는 아이소타입에 좌우될 것이다. IgG 중쇄는 예로써, C_H1, C_H2와 C_H3으로 알려진 3개의 C 영역 도메인을 내포한다. 제공되는 항체는 이들 아이소타입과 아류형 중에서 임의의 한 가지를 가질 수 있다. 본 발명의 일정한 구체예에서, 항-PCSK9 항체는 IgG2 또는 IgG4 아류형이다.

용어 "가변 영역" 또는 "가변 도메인"은 항체의 경쇄 및/또는 중쇄의 부분을 지칭하고, 중쇄에서 대략 아미노-말단 120 내지 130개 아미노산 및 경쇄에서 약 100 내지 110개 아미노 말단 아미노산을 전형적으로 포함한다. 일정한 구체예에서, 상이한 항체의 가변 영역은 심지어 동일한 종의 항체 간에도 아미노산 서열에서 광범위하게 상이하다. 항체의 가변 영역은 전형적으로, 표적에 대한 특정 항체의 특이성을 결정한다.

용어 "중화 항원 결합 단백질" 또는 "중화 항체"는 리간드에 결합하고 리간드의 생물학적 효과를 예방하거나 감소시키는 항원 결합 단백질 또는 항체를 각각 지칭한다. 이것은 예로써, 리간드 상에서 결합 부위를 직접적으로 차단함으로써 또는 리간드에 결합하고, 그리고 간접적인 수단 (가령, 리간드에서 구조적 또는 활동적 변경)을 통해 리간드의 결합 능력을 변경함으로써 수행될 수 있다. 일부 구체예에서, 상기 용어는 또한, 자신에게 결합된 단백질이 생물학적 기능을 수행하지 못하도록 하는 항원 결합 단백질을 의미할 수 있다. 항원 결합 단백질, 예를 들면, 항체 또는 이의 면역학적으로 기능성 단편의 결합 및/또는 특이성을 평가함에 있어서, 항체 또는 단편은 과잉의 항체가 리간드에 결합된 결합 파트너의 양을 적어도 약 1-20, 20-30%, 30-40%, 40-50%, 50-60%, 60-70%, 70-80%, 80-85%, 85-90%, 90-95%, 95-97%, 97-98%, 98-99% 또는 그 이상 (시험관내 경쟁적 결합 검정에서 측정됨) 감소시킬 때, 결합 파트너에 대한 리간드의 결합을 실질적으로 저해할 수 있다. 일부 구체예에서, PCSK9 항원 결합 단백질의 경우에, 이런 중화 분자는 LDLR에 결합하는 PCSK9의 능력을 감소시킬 수 있다. 일부 구체예에서, 중화 능력은 경쟁 검정을 거쳐 특징화되고 및/또는 설명된다. 일부 구체예에서, 중화 능력은 IC₅₀ 또는 EC₅₀ 값의 측면에서 설명된다. 일부 구체예에서, ABP 27B2, 13H1, 13B5와 3C4는 비-중화 ABP이고, 3B6, 9C9와 31A4는 약한 중화제이고, 그리고 표 2에서 나머지 ABP는 강한 중화제이다. 일부 구체예에서, 항체 또는 항원 결합 단백질은 PCSK9에 결합하고, 그리고 PCSK9가 LDLR에 결합하는 것을 예방함으로써 (또는 LDLR에 결합하는 PCSK9의 능력을 감소시킴으로써) 중화한다. 일부 구체예에서, 항체 또는 ABP는 PCSK9에 결합하고, 그리고 PCSK9가 LDLR에 여전히 결합할 수 있도록 하면서, LDLR의 PCSK9 매개된 분해를 예방하거나 감소시킴으로써 중화한다. 따라서 일부 구체예에서, 중화 ABP 또는 항체는 PCSK9/LDLR 결합을 여전히 허용할 수 있지만, LDLR의 차후 PCSK9 관련된 분해를 예방할 것이다 (또는 감소시킬 것이다).

용어 "표적"은 항원 결합 단백질에 의해 결합될 수 있는 분자 또는 분자의 부분을 지칭한다. 일정한 구체예에서, 표적은 하나 또는 그 이상의 에피토프를 가질 수 있다. 일정한 구체예에서, 표적은 항원이다. 관용구 "항원 결합 단백질"에서 "항원"의 이용은 상기 항원을 포함하는 단백질 서열이 항체에 의해 결합될 수 있다는 것을 단순히 표시한다. 이러한 문맥에서, 이것은 단백질이 외래성이거나 또는 단백질이 면역 반응을 유도할 수 있도록 요구하지 않는다.

용어 "경쟁한다"는 동일한 에피토프에 대해 경쟁하는 항원 결합 단백질 (가령, 중화 항원 결합 단백질 또는 중화 항체)의 문맥에서 이용될 때, 검정에 의해 결정된 항원 결합 단백질 간의 경쟁을 의미하고, 여기서 조사되는 항원 결합 단백질 (가령, 항체 또는 이의 면역학적으로 기능성 단편)은 공통 항원 (가령, PCSK9 또는 이의 단편)에 대한 참고 항원 결합 단백질 (가령, 리간드, 또는 참고 항체)의 특이적 결합을 예방하거나 저해한다 (가령, 감소시킨다). 다양한 유형의 경쟁적 결합 검정, 예를 들면, 고형 상 직접 또는 간접 방사성면역검정 (RIA), 고형 상 직접 또는 간접 효소 면역검정 (EIA), 샌드위치 경쟁 검정 (예로써, Stahli et al., 1983, Methods in Enzymology 9:242-253); 고형 상 직접 비오틴-아비딘 EIA (예로써, Kirkland et al., 1986, J. Immunol. 137:3614-3619), 고형 상 직접 표지된 검정, 고형 상 직접 표지된 샌드위치 검정 (예로써, Harlow and Lane, 1988, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press); I-125 라벨을 이용한 고형 상 직접 표지 RIA (예로써, Morel et al., 1988, Molec. Immunol. 25:7-15); 고형 상 직접 비오틴-아비딘 EIA (예로써, Cheung, et al., 1990, Virology 176:546-552); 그리고 직접 표지된 RIA (Moldenhauer et al., 1990, Scand. J. Immunol. 32:77-82)가 한 항원 결합 단백질이 다른 항원 결합 단백질과 경쟁하는 지를 결정하는데 이용될 수 있다. 전형적으로, 이런 검정은 이들 중에서 어느 한쪽, 표지되지 않은 검사 항원 결합 단백질 및 표지된 참고 항원 결합 단백질을 보유하는 고형 표면 또는 세포에 결합된 정제된 항원의 이용을 수반한다. 경쟁적 저해는 검사 항원 결합 단백질의 존재에서 고형 표면 또는 세포에 결합된 표지의 양을 결정함으로써 측정된다. 통상적으로, 검사 항원 결합 단백질은 과잉으로 존재한다. 경쟁 검정에 의해 확인된 항원 결합 단백질 (경쟁 항원 결합 단백질)에는 참고 항원 결합 단백질과 동일한 에피토프에 결합하는 항원 결합 단백질, 그리고 입체 장애가 일어날 만큼, 참고 항원 결합 단백질에 의해 결합된 에피토프에 충분히 가까운 인접한 에피토프에 결합하는 항원 결합 단백질이 포함된다. 경쟁적 결합을 결정하기 위한 방법에 관한 부가적 상세는 본원의 실시예에서 제공된다. 통상적으로, 경쟁적 항원 결합 단백질이 과잉으로 존재할 때, 이것은 공통 항원에 대한 참고 항원 결합 단백질의 특이적 결합을 적어도 40-45%, 45-50%, 50-55%, 55-60%, 60-65%, 65-70%, 70-75% 또는 75% 또는 그 이상 저해할 것이다 (가령, 감소시킬 것이다). 일부 경우에, 결합은 적어도 80-85%, 85-90%, 90-95%, 95-97%, 또는 97% 또는 그 이상 저해된다.

용어 "항원"은 선별적 결합제, 예를 들면, 항원 결합 단백질 (예로써, 항체 또는 이의 면역학적 기능성 단편 포함)에 의해 결합될 수 있는 분자 또는 분자의 부분을 지칭한다. 일부 구체예에서, 항원은 항원에 결합할 수 있는 항체를 생산하기 위해 동물에서 이용될 수 있다. 항원은 상이한 항원 결합 단백질, 예를 들면, 항체와 상호작용할 수 있는 하나 또는 그 이상의 에피토프를 보유할 수 있다.

용어 "에피토프"는 항원 결합 단백질, 예를 들면, 항체에 의해 또는 T-세포 수용체에 결합될 수 있는 임의의 결정기를 포함한다. 에피토프는 항원을 표적으로 하는 항원 결합 단백질에 의해 결합되고, 그리고 항원이 단백질일 때, 항원 결합 단백질에 직접적으로 접촉하는 특정한 아미노산을 포함하는 항원의 한 영역이다. 흔히, 에피토프는 단백질 상에 존재하지만, 일부 경우에 다른 종류의 분자, 예를 들면, 핵산 상에 존재할 수 있다. 에피토프 결정기는 분자의 화학적으로 활성 표면 기, 예를 들면, 아미노산, 당 측쇄, 포스포릴 또는 술포닐 기를 포함할 수 있고, 그리고 특정한 3차원 구조 특징, 및/또는 특정한 전하 특징을 가질 수 있다. 일반적으로, 특정 표적 항원에 특이적인 항체는 단백질 및/또는 거대분자의 복합 혼합물 내에서 표적 항원 상에 에피토프를 우선적으로 인식할 것이다.

본원에서 이용된 바와 같이, "실질적으로 순수한"은 분자의 설명된 종류가 현존하는 우세한 종류라는 것을 의미한다, 다시 말하면, 몰 기초에서 이것이 동일한 혼합물 내에서 임의의 다른 개별 종류보다 풍부하다는 것을 의미한다. 일정한 구체예에서, 실질적으로 순수한 분자는 대상 종류가 현존하는 모든 거대분자 종류 중에서 적어도 50% (몰 기초에서)를 구성하는 조성물이다. 다른 구체예에서, 실질적으로 순수한 조성물은 조성물 내에 존재하는 모든 거대분자 종류 중에서 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99%를 구성할 것이다. 다른 구체예에서, 대상 종류는 본질적으로 균질하게 정제되고, 여기서 오염 종류가 조성물 내에서 전통적인 검출 방법에 의해 검출될 수 없고, 따라서 조성물은 단일 검출가능한 거대분자 종류로 구성된다.

용어 "작용제"는 본원에서, 화학적 화합물, 화학적 화합물의 혼합물, 생물학적 거대분자, 또는 생물학적 물질로부터 만들어진 추출물을 표시하는데 이용된다.

본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "라벨" 또는 "표지된"은 예로써, 방사성표지된 아미노산의 함입에 의한, 또는 표시된 아비딘 (가령, 광학적 또는 비색 방법에 의해 검출될 수 있는 형광 마커 또는 효소적 활성을 내포하는 스트렙타비딘)에 의해 검출될 수 있는 비오틴 모이어티의 폴리펩티드에 부착에 의한 검출가능한 마커의 함입을 지칭한다. 일정한 구체예에서, 라벨 또는 마커는 또한, 치료적일 수 있다. 폴리펩티드와 당단백질을 표지하는 다양한 방법은 당분야에 공지되어 있고 이용될 수 있다. 폴리펩티드에 대한 라벨의 실례에는 하기가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다: 방사성동위원소 또는 방사성핵종 (가령, ³H, ¹⁴C, ¹⁵N, ³⁵S, ⁹⁰Y, ⁹⁹Tc, ¹¹¹In, ¹²⁵I, ¹³¹I), 형광 라벨 (가령, FITC, 로다민, 란타니드 포스포르), 효소적 라벨 (가령, 양고추냉이 과산화효소, β-갈락토시다아제, 루시페라아제, 알칼리성 포스파타아제), 화학발광제, 비오티닐 기, 이차 리포터에 의해 인식되는 미리 결정된 폴리펩티드 에피토프 (가령, 류신 지퍼 쌍 서열, 이차 항체에 대한 결합 부위, 금속 결합 도메인, 에피토프 태그). 일정한 구체예에서, 라벨은 잠재적 입체 장애를 감소시키기 위해 다양한 길이의 스페이서 팔에 의해 부착된다.

본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "생물학적 시료"에는 살아있는 것 또는 이전에 살아있었던 것으로부터 물체의 임의의 양이 포함되지만 이에 국한되지 않는다. 이런 살아있는 것들에는 인간, 생쥐, 원숭이, 쥐, 토끼, 그리고 기타 동물이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 이런 물체에는 혈액, 혈청, 소변, 세포, 장기, 조직, 뼈, 골수, 림프절, 그리고 피부가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.

본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "제약학적 작용제 조성물" (또는 작용제 또는 약물)은 환자에 적절하게 투여될 때, 원하는 치료적 효과를 유도할 수 있는 화학적 화합물, 조성물, 작용제 또는 약물을 지칭한다. 이것은 한 가지 이상의 유형의 성분을 반드시 필요로 하지는 않는다.

용어 "치료 효과량"은 포유류에서 치료적 반응을 발생시키는 것으로 결정된 PCSK9 항원 결합 단백질의 양을 지칭한다. 이런 치료 효과량은 당업자에 의해 쉽게 확인된다.

본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "조절제"는 분자의 활성 또는 기능을 변화시키거나 변경하는 화합물이다. 가령, 조절제는 조절제의 부재에서 관찰된 활성 또는 기능의 크기와 비교하여 분자의 일정한 활성 또는 기능의 크기에서 증가 또는 감소를 유발할 수 있다. 일정한 구체예에서, 조절제는 분자의 적어도 하나의 활성 또는 기능의 크기를 감소시키는 저해제이다. 분자의 일정한 예시적인 활성과 기능에는 결합 친화성, 효소적 활성, 그리고 신호 전달이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 일정한 예시적인 저해제에는 단백질, 펩티드, 항체, 펩티바디, 탄수화물 또는 소형 유기 분자가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 펩티바디는 예로써, U.S. Patent No. 6,660,843 (PCT Application No. WO 01/83525에 상응함)에서 설명된다.

용어 "환자"와 "개체"는 교체 가능하게 이용되고, 여기에는 인간과 비-인간 동물 개체뿐만 아니라 공식적으로 진단된 질환을 앓는 개체, 공식적으로 인정된 질환이 없는 개체, 치료를 받는 개체, 질환이 발병하는 위험에 처해 있는 개체 등이 포함된다.

용어 "치료한다" 및 "치료"는 치료적 처치, 예방적 처치, 그리고 개체에서 질환 또는 기타 위험 인자가 발생할 위험을 감소시키는 적용이 포함한다. 치료는 질환의 완전한 치료를 요하지 않고, 그리고 증상 또는 근원적 위험 인자를 감소시키는 구체예를 포괄한다.

용어 "예방한다"는 사건의 가능성의 100% 제거를 요하지 않는다. 오히려, 이것은 사건의 발생의 가능성이 화합물 또는 방법의 존재에서 감소되었다는 것을 표시한다.

재조합 DNA, 올리고뉴클레오티드 합성, 그리고 조직 배양과 형질전환을 위해 표준 기술이 이용될 수 있다 (가령, 전기천공, 리포펙션). 효소적 반응과 정제 기술은 제조업체의 명세에 따라 또는 당분야에서 통상적으로 달성되는 바와 같이 또는 본원에서 설명된 바와 같이 수행될 수 있다. 전술한 기술과 절차는 일반적으로, 당분야에 널리 공지된 전통적인 방법에 따라, 그리고 본 명세서 전반에서 언급되고 논의되는 다양한 일반 참고문헌과 특수 참고문헌에서 설명되는 바와 같이 수행될 수 있다. 예로써, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(1989))을 참조하고, 이것은 본원에 순전히 참고문헌으로 편입된다. 특정한 정의가 제공되지 않으면, 본원에서 설명된 분석 화학, 합성 유기 화학, 그리고 의약 화학과 약화학과 연관하여 이용된 명명법, 그리고 이들의 실험 절차와 기술은 당분야에서 널리 공지되고 통상적으로 이용되는 것들이다. 화학적 합성, 화학적 분석, 제약학적 제조, 조제, 그리고 전달, 그리고 환자의 치료를 위해 표준 기술이 이용될 수 있다.

PCSK9에 대한 항원 결합 단백질

프로단백질 전환효소 서브틸리신 케신 유형 9 (PCSK9)는 저밀도 지방단백 수용체 (LDLR) 단백질의 수준을 조절하는데 관여하는 세린 프로테아제이다 (Horton et al., 2007; Seidah and Prat, 2007). PCSK9는 세린 프로테아제의 서브틸리신 (S8) 패밀리에서 프로호르몬-프로단백질 전환효소이다 (Seidah et al., 2003). 예시적인 인간 PCSK9 아미노산 서열은 서열번호 1과 3으로서 제공된다. 도 1A (단백질의 "프로" 도메인을 밑줄로 표시함) 및 도 1B (신호 서열을 굵은 글씨체로, 그리고 프로도메인을 밑줄로 표시함)에서. 예시적인 인간 PCSK9 코딩 서열은 서열번호 2로서 제공된다 (도 1B). 본원에서 설명된 바와 같이, PCSK9 단백질은 또한, 전장 PCSK9 단백질의 단편을 포함할 수 있다. PCSK9 단백질의 구조는 두 그룹에 의해 해명되었다 (Cunningham et al., Nature Structural & Molecular Biology, 2007, 그리고 Piper et al., Structure, 15:1-8, 2007, 이들 둘 모두 본원에 전체로서 참고문헌으로 편입된다). PCSK9는 신호 서열, N-말단 프로도메인, 서브틸리신-유사 촉매 도메인 및 C-말단 도메인을 포함한다.

인간 PCSK9를 비롯한 PCSK9에 결합하는 항원 결합 단백질 (ABPs)이 본원에서 제공된다. 일부 구체예에서, 제공된 항원 결합 단백질은 본원에서 설명된 바와 같이, 하나 또는 그 이상의 상보성 결정 영역 (CDRs)을 포함하는 폴리펩티드이다. 일부 항원 결합 단백질에서, CDR은 "뼈대" 영역 내로 끼어 넣어지고, 이것은 CDR(들)의 적절한 항원 결합 성질이 달성되도록, 이러한 CDR(들)을 배향시킨다. 일부 구체예에서, 본원에서 제공된 항원 결합 단백질은 PCSK9와 LDLR 사이에 상호작용을 간섭하거나, 차단하거나, 감소시키거나 또는 조절할 수 있다. 이런 항원 결합 단백질은 "중화"로서 표시된다. 일부 구체예에서, PCSK9와 LDLR 사이에 결합은 심지어 항원 결합 단백질이 중화이고 PCSK9에 결합됨에도 불구하고, 여전히 일어날 수 있다. 가령, 일부 구체예에서, ABP는 PCSK9 상에서 LDLR 결합 부위를 차단하지 않으면서, LDLR에 대한 PCSK9의 부정적인 영향을 예방하거나 감소시킨다. 따라서 일부 구체예에서, ABP는 PCSK9와 LDLR 사이에 결합 상호작용을 방해할 필요 없이, LDLR의 분해를 유발하는 PCSK9의 능력을 조절하거나 변경한다. 이런 ABP는 "비-경쟁적 중화" ABP로서 구체적으로 설명될 수 있다. 일부 구체예에서, 중화 ABP는 PCSK9가 LDLR에 결합하는 것을 예방하는 위치에서 및/또는 방식으로 PCSK9에 결합한다. 이런 ABP는 "경쟁적 중화" ABP로서 구체적으로 설명될 수 있다. 상기 중화제 둘 모두 더욱 많은 양의 유리 LDLR이 개체 내에 존재할 수 있도록 할 수 있고, 이것은 LDL에 더욱 많은 LDLR 결합을 유발한다 (따라서 개체 내에서 LDL의 양을 감소시킨다). 차례로, 이것은 개체 내에 존재하는 혈청 콜레스테롤의 양을 감소시킨다.

일부 구체예에서, 본원에서 제공된 항원 결합 단백질은 PCSK9-매개된 활성 (결합 포함)을 저해할 수 있다. 일부 구체예에서, 이들 에피토프에 결합하는 항원 결합 단백질은 특히, PCSK9와 LDLR 사이에 상호작용, 그리고 PCSK9에 의해 매개된 기타 생리학적 효과를 저해한다. 일부 구체예에서, 항원 결합 단백질은 PCSK9에 대한 인간, 예를 들면, 완전 인간 항체이다.

일부 구체예에서, ABP는 PCSK9의 촉매 도메인에 결합한다. 일부 구체예에서, ABP는 PCSK9의 성숙 형태에 결합한다. 일부 구체예에서, ABP는 PCSK9의 프로도메인에서 결합한다. 일부 구체예에서, ABP는 PCSK9의 성숙 형태에 선별적으로 결합한다. 일부 구체예에서, ABP는 PCSK9가 LDLR에 결합할 수 없거나 효율적으로 결합할 수 없도록 하는 방식으로 촉매 도메인에 결합한다. 일부 구체예에서, 항원 결합 단백질은 촉매 도메인의 c-말단에 결합하지 않는다. 일부 구체예에서, 항원 결합 단백질은 촉매 도메인의 n-말단에 결합하지 않는다. 일부 구체예에서, ABP는 PCSK9 단백질의 n- 또는 c-말단에 결합하지 않는다. 일부 구체예에서, ABP는 본원에서 논의된 항체에 의해 결합되는 에피토프 중에서 하나에 결합한다. 일부 구체예에서, 이것은 본원에서 개시된 항체와 다른 항체 사이에 경쟁 검정에 의해 결정될 수 있다. 일부 구체예에서, ABP는 표 2에서 설명된 항체 중에서 하나에 의해 결합되는 에피토프에 결합한다. 일부 구체예에서, 항원 결합 단백질은 PCSK9가 LDLR과 상호작용하는 것을 예방하기 위해, PCSK9의 특정한 입체형태 상태에 결합한다. 일부 구체예에서, ABP는 PCSK9의 V 도메인에 결합한다. 일부 구체예에서, ABP는 PCSK9의 V 도메인에 결합하고 PCSK9가 LDLR에 결합하는 것을 예방한다 (또는 감소시킨다). 일부 구체예에서, ABP는 PCSK9의 V 도메인에 결합하고, 그리고 ABP는 LDLR에 PCSK9의 결합을 예방하지 못하지만 (또는 감소시키지 못하지만), LDLR 상에서 PCSK9를 통해 매개된 유해한 활성을 예방하거나 감소시킨다.

본원에서 개시된 항원 결합 단백질은 다양한 유용성을 갖는다. 항원 결합 단백질 중에서 일부는 예로써, 특이적 결합 검정, PCSK9, 특히 인간 PCSK9 또는 이의 리간드의 친화성 정제, 그리고 PCSK9 활성의 다른 길항제를 확인하기 위한 스크리닝 검정에서 유용하다. 항원 결합 단백질 중에서 일부는 LDLR에 PCSK9의 결합을 저해하거나, 또는 PCSK9-매개된 활성을 저해하는데 유용하다.

항원 결합 단백질은 본원에서 설명된 바와 같이, 다양한 치료적 적용에서 이용될 수 있다. 가령, 일부 구체예에서, PCSK9 항원 결합 단백질은 본원에서 더욱 설명된 바와 같이, PCSK9와 연관된 질환, 예를 들면, 콜레스테롤 관련 질환 (또는 "혈청 콜레스테롤 관련 질환"), 예를 들면, 고콜레스테롤혈증을 치료하는데 유용하다. 항원 결합 단백질에 대한 다른 용도에는 예로써, PCSK9-연관된 질환 또는 장애의 진단, 그리고 PCSK9의 존재 또는 부재를 결정하기 위한 스크리닝 검정이 포함된다. 본원에서 설명된 항원 결합 단백질 중에서 일부는 PCSK9 활성과 연관된 결과, 증상, 및/또는 병리를 치료하는데 유용하다.

일부 구체예에서, 제공되는 항원 결합 단백질은 하나 또는 그 이상의 CDR (가령, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개 CDR)을 포함한다. 일부 구체예에서, 항원 결합 단백질은 (a) 폴리펩티드 구조, 그리고 (b) 폴리펩티드 구조 내로 삽입되고 및/또는 폴리펩티드 구조에 연결되는 하나 또는 그 이상의 CDR을 포함한다. 폴리펩티드 구조는 다양한 상이한 형태를 취할 수 있다. 가령, 이것은 자연 발생 항체, 또는 이의 단편 또는 변이체의 뼈대이거나, 또는 이러한 뼈대를 포함할 수 있고, 또는 자연에서 완전하게 합성될 수 있다. 다양한 폴리펩티드 구조의 실례는 하기에 더욱 설명된다.

일정한 구체예에서, 항원 결합 단백질의 폴리펩티드 구조는 항체이거나 또는 단일클론 항체, 이중특이적 항체, 미니바디, 도메인 항체, 합성 항체 (본원에서 때때로, "항체 모방체"로 지칭됨), 키메라 항체, 인간화 항체, 항체 융합체 (본원에서 때때로, "항체 접합체"로 지칭됨), 그리고 각각의 부분 또는 단편이 각기 포함되지만 이들에 국한되지 않는 항체로부터 유래된다. 일부 경우에, 항원 결합 단백질은 항체의 면역학적 단편 (가령, Fab, Fab', F(ab')₂, 또는 scFv)이다. 이들 다양한 구조는 본원에서 더욱 설명되고 정의된다.

본원에서 제공된 바와 같은 일정한 항원 결합 단백질은 인간 PCSK9에 특이적으로 및/또는 선별적으로 결합한다. 일부 구체예에서, 항원 결합 단백질은 서열번호 3의 잔기 153-692를 갖는 및/또는 이들로 구성되는 인간 PCSK9 단백질에 특이적으로 및/또는 선별적으로 결합한다. 일부 구체예에서, ABP는 서열번호 3의 잔기 31-152를 갖는 및/또는 이들로 구성되는 인간 PCSK9에 특이적으로 및/또는 선별적으로 결합한다. 일부 구체예에서, ABP는 도 1A에서 묘사된 바와 같은 인간 PCSK9 단백질 (서열번호 1)에 선별적으로 결합한다. 일부 구체예에서, 항원 결합 단백질은 PCSK9 단백질의 적어도 단편 및/또는 신호 서열이 있거나 없는 전장 PCSK9 단백질에 특이적으로 결합한다.

항원 결합 단백질이 치료적 적용에 이용되는 경우에, 항원 결합 단백질은 PCSK9의 하나 또는 그 이상의 생물학적 활성을 저해하거나, 간섭하거나 또는 조절할 수 있다. 한 구체예에서, 항원 결합 단백질은 인간 PCSK9에 특이적으로 결합하고 및/또는 LDLR에 인간 PCSK9의 결합을 적어도 약 20%-40%, 40-60%, 60-80%, 80-85%, 또는 그 이상 (가령, 시험관내 경쟁적 결합 검정에서 결합을 측정함으로써) 실질적으로 저해한다. 본원에서 제공되는 항원 결합 단백질 중에서 일부는 항체이다. 일부 구체예에서, ABP는 10^-7, 10^-8, 10^-9, 10^-10, 10^-11, 10^-12, 10^-13 M 이하의 K_d를 갖는다 (보다 강하게 결합한다). 일부 구체예에서, ABP는 PCSK9 (D374Y, 높은 친화성 변이체)에 LDLR의 결합 차단에 대한 1 마이크로M 이하, 1000 nM 내지 100 nM, 100nM 내지 10 nM, 10nM 내지 1 nM, 1000pM 내지 500pM, 500 pM 내지 200 pM, 200 pM 이하, 200 pM 내지 150 pM, 200 pM 내지 100 pM, 100 pM 내지 10 pM, 10 pM 내지 1 pM의 IC₅₀을 갖는다.

본 발명의 항-PCSK9 항체의 IgG2 중쇄 불변 도메인의 한 가지 실례는 서열번호 154, 도 3KK에서 도시된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는다.

본 발명의 항-PCSK9 항체의 IgG4 중쇄 불변 도메인의 한 가지 실례는 서열번호 155, 도 3KK에서 도시된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는다.

항-PCSK9 항체의 카파 경쇄 불변 도메인의 한 가지 실례는 서열번호 157, 도 3KK에서 도시된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는다.

항-PCSK9 항체의 람다 경쇄 불변 도메인의 한 가지 실례는 서열번호 156, 도 3KK에서 도시된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는다.

면역글로불린 사슬의 가변 영역은 일반적으로, 동일한 전체 구조를 나타내고, "상보성 결정 영역" 또는 CDR로 종종 불리는 3개의 초가변 영역에 의해 연결된 상대적으로 보존된 뼈대 영역 (FR)을 포함한다. 앞서 언급된 각 중쇄/경쇄 쌍의 2개 사슬로부터 CDR은 전형적으로, 뼈대 영역에 의해 정렬되어 표적 단백질 (가령, PCSK9) 상에서 특정한 에피토프와 특이적으로 결합하는 구조를 형성한다. N-말단에서 C-말단으로, 자연 발생 경쇄와 중쇄 가변 영역 둘 모두 이들 요소의 하기 순서와 전형적으로 합치한다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 및 FR4. 이들 도메인 각각에서 위치를 점유하는 아미노산에 번호를 지정하기 위한 넘버링 시스템이 고안되었다. 이러한 넘버링 시스템은 Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest (1987 and 1991, NIH, Bethesda, MD), 또는 Chothia & Lesk, 1987, J. Mol. Biol. 196:901-917; Chothia et al., 1989, Nature 342:878-883에서 정의된다.

다양한 중쇄와 경쇄 가변 영역이 본원에서 제공되고 도 2A-3JJ와 3LL-3BBB에서 묘사된다. 일부 구체예에서, 이들 가변 영역 각각은 상기 중쇄와 경쇄 불변 영역에 부착되어 각각 완전한 항체 중쇄와 경쇄를 형성할 수 있다. 게다가, 이렇게 산출된 중쇄와 경쇄 서열 각각은 합동되어 완전한 항체 구조를 형성할 수 있다.

제공되는 항체의 경쇄와 중쇄의 가변 영역 중에서 일부의 특정한 실례, 그리고 이들의 상응하는 아미노산 서열은 표 2에 요약된다.

예시적인 중쇄와 경쇄 가변 영역

항체	경쇄/중쇄 서열번호
30A4	5/74
3C4	7/85
23B5	9/71
25G4	10/72
31H4	12/67
27B2	13/87
25A7	15/58
27H5	16/52
26H5	17/51
31D1	18/53
20D10	19/48
27E7	20/54
30B9	21/55
19H9	22/56
26E10	23/49
21B12	23/49
17C2	24/57
23G1	26/50
13H1	28/91
9C9	30/64
9H6	31/62
31A4	32/89
1A12	33/65
16F12	35/79
22E2	36/80
27A6	37/76
28B12	38/77
28D6	39/78
31G11	40/83
13B5	42/69
31B12	44/81
3B6	46/60
5H5	421/419
24F7	425/423
22B11	429/427
30F1	433/431
24B9.1	437/435
24B9.2	441/439
20A5.1	445/443
20A5.2	449/447
20E5.1	453/451
20E5.2	457/455
8A3	461/459
11F1	465/463
12H11	469/467
11H4	473/471
11H8	477/475
11G1	481/479
8A1	485/483

다른 한편, 표 2에서 열거된 예시적인 가변 중쇄 각각은 표 2에서 도시된 임의의 예시적인 가변 경쇄와 합동되어 항체를 형성할 수 있다. 표 2는 본원에서 개시된 여러 항체에서 발견된 예시적인 경쇄와 중쇄 대합을 도시한다. 일부 경우에, 항체는 표 2에서 열거된 것들로부터 적어도 하나의 가변 중쇄 및 하나의 가변 경쇄를 포함한다. 다른 경우에, 항체는 2개의 동일한 경쇄 및 2개의 동일한 중쇄를 내포한다. 실례로서, 항체 또는 항원 결합 단백질은 1개의 중쇄와 1개의 경쇄, 2개의 중쇄, 또는 2개의 경쇄를 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 항원 결합 단백질은 표 2에서 열거된 서열 중에서 적어도 하나로부터 1, 2, 및/또는 3개의 중쇄 및/또는 경쇄 CDR을 포함한다 (및/또는 이들로 구성된다) (이들 서열에 대한 CDR은 도 2A-3D에서 개설되고, 그리고 다른 구체예는 도 3CCC-3JJJ와 15A-15D에서 개설된다). 일부 구체예에서, 6개 CDR 모두 (경쇄로부터 CDR1-3 (CDRL1, CDRL2, CDRL3), 그리고 중쇄로부터 CDR1-3 (CDRH1, CDRH2, 그리고 CDRH3)) ABP의 일부이다. 일부 구체예에서, 1, 2, 3, 4, 5개, 또는 그 이상의 CDR이 ABP 내에 포함된다. 일부 구체예에서, 표 2의 서열에서 CDR로부터 1개의 중쇄와 1개의 경쇄 CDR이 ABP 내에 포함된다 (표 2에서 이들 서열에 대한 CDR은 도 2A-3D에서 개설된다). 일부 구체예에서, 추가의 서열 (가령, 도 2A-2D, 3A-3D에서 묘사된 바와 같음, 그리고 다른 구체예는 3CCC-3JJJ와 15A-15D에서 묘사됨) 역시 ABP 내에 포함된다. 표 2에서 기재된 중쇄와 경쇄에 대한 CDR과 FR의 실례는 도 2A-3D에서 개설된다 (그리고, 다른 구체예는 도 3CCC-3JJJ와 15A-15D에서 개설된다). 선택적 경쇄 가변 서열 (CDR1, CDR2, CDR3, FR1, FR2, FR3, 그리고 FR4 포함)은 하기에서 선택될 수 있다: 5, 7, 9, 10, 12, 13, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 26, 28, 30, 31, 32, 33, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 42, 44, 46, 421, 425, 429, 433, 437, 441, 445, 449, 453, 457, 461,465, 469, 473, 477, 481, 그리고 485. 선택적 중쇄 가변 서열 (CDR1, CDR2, CDR3, FR1, FR2, FR3, 그리고 FR4 포함)은 하기에서 선택될 수 있다: 74, 85, 71, 72, 67, 87, 58, 52, 51, 53, 48, 54, 55, 56, 49, 57, 50, 91, 64, 62, 89, 65, 79, 80, 76, 77, 78, 83, 69, 81,60, 419, 423, 427, 431, 435, 439, 443, 447, 451, 455, 459, 463, 467, 471, 475, 479, 그리고 483. 도 2A-3D에서 일부 기입 사항에서, CDR과 FR의 서열 변이 또는 대안적 경계가 확인된다. 이들 대안은 ABP 명칭 다음에 "v1"로 확인된다. 이들 대안 중에서 대부분이 성격상 소수이기 때문에, 차이를 갖는 섹션만 표에서 전시된다. 경쇄 또는 중쇄의 나머지 섹션은 다른 패널에서 기본 ABP에 대해 도시된 바와 동일한 것으로 이해된다. 따라서 가령, 도 2C에서 19H9v1은 도 2A에서 19H9와 동일한 FR1, CDR1, 그리고 FR2를 갖고, 차이만 도 2C에서 표시된다. 3개의 핵산 서열 (ABP 26E10, 30B9, 그리고 31B12)의 경우에, 추가의 대안적 핵산 서열이 도면에서 제공된다. 당업자가 인지하는 바와 같이, 단지 하나의 이런 서열이 항체 또는 ABP의 산출에 실제로 이용될 필요가 있다. 정말로, 일부 구체예에서, 특정한 중쇄 또는 경쇄 핵산 중에서 단지 하나만 존재할 필요가 있거나 또는 존재할 필요가 없다. 일부 구체예에서, ABP는 표 2에서 임의의 단백질 서열을 인코딩할 수 있는 핵산 서열에 의해 인코딩된다. 일부 구체예에서, ABP는 LDLR에 결합하는 PCSK9의 형태 (가령, 상기 분자의 자가 촉매된 형태)에 선별적으로 결합한다. 일부 구체예에서, 항원 결합 단백질은 촉매 도메인의 c-말단 (가령, c-말단에서 최대 5. 5-10, 10-15, 15-20, 20-25, 25-30, 30-40개 아미노산)에 결합하지 않는다. 일부 구체예에서, 항원 결합 단백질은 촉매 도메인의 n-말단 (가령, n-말단에서 최대 5. 5-10, 10-15, 15-20, 20-25, 25-30, 30-40개 아미노산)에 결합하지 않는다. 일부 구체예에서, ABP는 PCSK9의 성숙 형태의 아미노산 1-100 내에 아미노산에 결합한다. 일부 구체예에서, ABP는 아미노산 31-100, 100-200, 31-152, 153-692, 200-300, 300-400, 452-683, 400-500, 500-600, 31-692, 31-449, 및/또는 600-692 내에 아미노산 (및/또는 이들로 구성되는 아미노산 서열)에 결합한다. 일부 구체예에서, ABP는 촉매 도메인에 결합한다. 일부 구체예에서, 중화 및/또는 비-중화 ABP는 프로도메인에 결합한다. 일부 구체예에서, ABP는 촉매 도메인과 프로 도메인 둘 모두에 결합한다. 일부 구체예에서, ABP는 프로도메인과 상호작용하는 촉매 도메인 상에서 구역을 차단하기 위해, 촉매 도메인에 결합한다. 일부 구체예에서, ABP는 Piper et al. (Structure 15:1-8 (2007), 이것은 그 안에 구조적 표현을 비롯하여, 전체로서 본원에 참고문헌으로 편입된다)에서 개설된 바와 같이, 프로-도메인이 상호작용하는 위치 또는 표면에서 촉매 도메인에 결합한다. 일부 구체예에서, ABP는 촉매 도메인에 결합하고 프로도메인의 이동성을 제한한다. 일부 구체예에서, ABP는 프로-도메인에 결합 없이, 촉매 도메인에 결합한다. 일부 구체예에서, ABP는 프로-도메인에 결합 없이, 촉매 도메인에 결합하지만, 프로-도메인이 재배향하여 PCSK9가 LDLR에 결합할 수 있도록 하는 것을 예방한다. 일부 구체예에서, ABP는 Piper et al.에서 프로-도메인의 잔기 149-152를 둘러싸는 것들과 동일한 에피토프에서 결합한다. 일부 구체예에서, ABP는 V 도메인 상에서 그루브에 결합한다 (Piper et al.에서 개설된 바와 같이). 일부 구체예에서, ABP는 V 도메인 상에서 그루브에 가까운 히스티딘-풍부한 패치에 결합한다. 일부 구체예에서, 이런 항체 (V 도메인에 결합한다)는 중화가 아니다. 일부 구체예에서, V 도메인에 결합하는 항체는 중화이다. 일부 구체예에서, 중화 ABP는 LDLR에 PCSK9의 결합을 예방한다. 일부 구체예에서, 중화 ABP는 LDLR의 PCSK9 분해를 예방하지만, LDLR에 PCSK9의 결합을 예방하지 않는다 (가령, ABP 31A4). 일부 구체예에서, ABP는 Piper et al. 논문의 도 4에서 묘사된 히스티딘 중에서 적어도 하나에 결합하거나 또는 이를 차단한다. 일부 구체예에서, ABP는 PCSK9에서 촉매 3체제 (catalytic triad)를 차단한다.

일부 구체예에서, 항체는 야생형 PCSK9에 비하여 변이체 PCSK9 단백질, 예를 들면, D374Y에 선별적으로 결합한다. 일부 구체예에서, 이들 항체는 야생형보다 적어도 2배 강하게 변이체에 결합하고, 그리고 바람직하게는, 야생형보다 2-5, 5-10, 10-100, 100-1000, 1000-10,000 배 또는 그 이상 강하게 돌연변이체에 결합한다 (K_d에 의해 측정됨). 일부 구체예에서, 항체는 LDLR과 상호작용하는 야생형 PCSK9의 능력보다 변이체 D374Y PCSK9가 LDLR과 상호작용하는 것을 선별적으로 저해한다. 일부 구체예에서, 이들 항체는 야생형의 능력보다 LDLR에 결합하는 변이체의 능력을 더욱 강하게 차단한다, 예를 들면, 야생형보다 적어도 2배, 그리고 바람직하게는, 야생형보다 2-5, 5-10, 10-100, 100-1000 배 또는 그 이상 강하게 돌연변이체의 능력을 차단한다 (IC₅₀에 의해 측정됨). 일부 구체예에서, 항체는 야생형 PCSK9 및 PCSK9의 변이체 형태, 예를 들면, D374Y 둘 모두에 유사한 수준에서 결합하고 이들을 중화시킨다. 일부 구체예에서, 항체는 PCSK9에 결합하여 LDLR의 변이체가 PCSK9에 결합하는 것을 예방한다. 일부 구체예에서, LDLR의 변이체는 인간 LDLR에 적어도 50% 동일하다. LDLR의 변이체는 당업자에게 알려져 있다 (가령, Brown MS et al, "Calcium cages, acid baths and recycling receptors" Nature 388: 629-630, 1997). 일부 구체예에서, ABP는 이형접합성 가족성 고콜레스테롤혈증 (여기서 LDLR의 기능 상실 변이체가 존재한다)에서 효과적인 LDLR의 수준을 상승시킬 수 있다.

일부 구체예에서, ABP는 도 1A 및/또는 도 1B에서 묘사된 PCSK9의 형태에 적어도 50%, 50-60, 60-70, 70-80, 80-90, 90-95, 95-99, 또는 그 이상의 동일성 퍼센트를 갖는 PCSK9의 변이체에 결합한다 (하지만 이들을 차단하지 않는다). 일부 구체예에서, ABP는 도 1A 및/또는 도 1B에서 묘사된 PCSK9의 성숙 형태에 적어도 50%, 50-60, 60-70, 70-80, 80-90, 90-95, 95-99, 또는 그 이상의 동일성 퍼센트를 갖는 PCSK9의 변이체에 결합한다 (하지만 이들을 차단하지 않는다). 일부 구체예에서, ABP는 도 1A 및/또는 도 1B에서 묘사된 PCSK9의 형태에 적어도 50%, 50-60, 60-70, 70-80, 80-90, 90-95, 95-99, 또는 그 이상의 동일성 퍼센트를 갖는 PCSK9의 변이체에 결합하고 이들이 LDLR과 상호작용하는 것을 예방한다. 일부 구체예에서, ABP는 도 1B에서 묘사된 PCSK9의 성숙 형태에 적어도 50, 50-60, 60-70, 70-80, 80-90, 90-95, 95-99, 또는 그 이상의 동일성 퍼센트를 갖는 PCSK9의 변이체에 결합하고 이들이 LDLR과 상호작용하는 것을 예방한다. 일부 구체예에서, PCSK9의 변이체는 인간 변이체, 예를 들면, 위치 474에서 변이체, E620G, 및/또는 E670G이다. 일부 구체예에서, 위치 474에서 아미노산은 발린 (다른 인간에서처럼) 또는 트레오닌 (비비와 생쥐에서처럼)이다. 본원에서 제공된 교차-반응성 데이터를 고려하면, 본 발명의 항체는 상기 변이체에 쉽게 결합할 것으로 생각된다.

일부 구체예에서, ABP는 표 2에서 설명된 항체 중에서 하나에 의해 결합되는 에피토프에 결합한다. 일부 구체예에서, 항원 결합 단백질은 PCSK9가 LDLR와 상호작용하는 것을 예방하기 위해 PCSK9의 특정한 입체형태 상태에 결합한다.

인간화 항원 결합 단백질 (가령, 항체)

본원에서 설명된 바와 같이, PCSK9에 대한 항원 결합 단백질은 인간화 항체 및/또는 이의 일부분을 포함할 수 있다. 이런 전략의 중요한 실용적인 적용은 생쥐 체액 면역계의 "인간화"이다.

일정한 구체예에서, 인간화 항체는 인간에서 실질적으로 비-면역원성이다. 일정한 구체예에서, 인간화 항체는 표적에 대해, 인간화 항체가 유래되는 다른 종으로부터 항체와 실질적으로 동일한 친화성을 갖는다. 예로써, U.S. Patent 5,530,101, U.S. Patent 5,693,761; U.S. Patent 5,693,762; U.S. Patent 5,585,089를 참조한다.

일정한 구체예에서, 면역원성을 감소시키지만 항원 결합 도메인의 고유 친화성을 점감시키지 않으면서 변형될 수 있는 항체 가변 도메인의 아미노산이 확인된다. 예로써, U.S. Patent Nos. 5,766,886과 5,869,619를 참조한다.

일정한 구체예에서, 당분야에 공지된 방법에 의한 항체의 변형은 전형적으로, 표적에 대한 증가된 결합 친화성을 달성하고 및/또는 수용자에서 항체의 면역원성을 감소시키도록 설계된다. 일정한 구체예에서, 인간화 항체는 동계 항원에 대한 항체의 친화성을 증가시키기 위해, 당화 부위가 제거되도록 변형된다. 예로써, Co et al., Mol. Immunol., 30:1361-1367 (1993)을 참조한다. 일정한 구체예에서, "재형성 (reshaping)", "과키메라화 (hyperchimerization)" 또는 "버니어링 (veneering)/재포장 (resurfacing)"과 같은 기술이 인간화 항체를 생산하는데 이용된다. 예로써, Vaswami et al., Annals of Allergy, Asthma, & Immunol. 81:105 (1998); Roguska et al., Prot. Engineer., 9:895-904 (1996); 그리고 U.S.PatentNo.6,072,035를 참조한다. 일정한 이런 구체예에서, 이런 기술은 전형적으로, 외래 잔기의 숫자를 감소시킴으로써 항체 면역원성을 감소시키지만, 항체의 반독된 투여 이후에 항-이디오타입과 항-알로타입 반응을 방해하지 않는다. 면역원성을 감소시키기 위한 일정한 다른 방법은 예로써, Gilliland et al., J. Immunol., 62(6): 3663-71 (1999)에서 설명된다.

일정한 경우에, 인간화 항체는 항원 결합 능력의 상실을 유발한다. 일정한 구체예에서, 인간화 항체는 "복귀 돌연변이"된다. 일정한 이런 구체예에서, 인간화 항체는 공여자 항체에서 발견되는 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기를 포함하도록 돌연변이된다. 예로써, Saldanha et al., Mol Immunol 36:709-19 (1999)를 참조한다.

일정한 구체예에서, PCSK9에 대한 항체의 경쇄와 중쇄 가변 영역의 상보성 결정 영역 (CDRs)은 동일한 종 또는 다른 종으로부터 뼈대 영역 (FRs)에 이식될 수 있다. 일정한 구체예에서, PCSK9에 대한 항체의 경쇄와 중쇄 가변 영역의 CDR은 공통 인간 FR에 이식될 수 있다. 공통 인간 FR을 산출하기 위해, 일정한 구체예에서, 여러 인간 중쇄 또는 경쇄 아미노산 서열로부터 FR이 공통 아미노산 서열을 확인하기 위해 정렬된다. 일정한 구체예에서, PCSK9에 대한 항체 중쇄 또는 경쇄의 FR은 상이한 중쇄 또는 경쇄로부터 FR로 대체된다. 일정한 구체예에서, PCSK9에 대한 항체의 중쇄와 경쇄의 FR에서 드문 아미노산은 대체되지 않는 반면, FR 아미노산의 나머지는 대체된다. 드문 아미노산은 그들이 FR 내에서 통상적으로 발견되지 않는 위치에 있는 특이적 아미노산이다. 일정한 구체예에서, PCSK9에 대한 항체로부터 유래된 이식된 가변 영역은 PCSK9에 대한 항체의 불변 영역과 상이한 불변 영역과 함께 이용될 수 있다. 일정한 구체예에서, 이식된 가변 영역은 단일 사슬 Fv 항체의 일부분이다. CDR 이식은 예로써, U.S. Patent Nos. 6,180,370, 6,054,297, 5,693,762, 5,859,205, 5,693,761, 5,565,332, 5,585,089, 그리고 5,530,101, 그리고 Jones et al., Nature, 321: 522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332: 323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988), Winter, FEBS Letts., 430:92-94 (1998)에서 설명되고, 이들은 본원에 순전히 참고문헌으로 편입된다.

인간 항원 결합 단백질 (가령, 항체)

본원에서 설명된 바와 같이, PCSK9에 결합하는 항원 결합 단백질은 인간 (즉, 완전 인간) 항체 및/또는 이의 일부분을 포함할 수 있다. 일정한 구체예에서, 중쇄와 경쇄 면역글로불린 분자를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열, 그리고 중쇄와 경쇄 면역글로불린 분자를 포함하는 아미노산 서열, 특히 가변 영역에 상응하는 서열이 제공된다. 일정한 구체예에서, 특히 CDR1 내지 CDR3으로부터 상보성 결정 영역 (CDR)에 상응하는 서열이 제공된다. 일정한 구체예에 따라서, 이런 면역글로불린 분자를 발현하는 하이브리도마 세포주가 제공된다. 일정한 구체예에 따라서, 이런 단일클론 항체를 발현하는 하이브리도마 세포주가 제공된다. 일정한 구체예에서, 하이브리도마 세포주는 표 2에서 설명된 세포주, 예를 들면, 21B12, 16F12와 31H4 중에서 적어도 하나로부터 선택된다. 일정한 구체예에서, 인간 PCSK9에 대한 정제된 인간 단일클론 항체가 제공된다.

생쥐 항체 생산에서 결함이 있는 생쥐 계통은 이런 생쥐가 생쥐 항체의 부재에서 인간 항체를 생산할 수 있을 것이라는 기대 속에, 인간 Ig 좌위의 큰 단편으로 조작될 수 있다. 큰 인간 Ig 단편은 큰 가변 유전자 다양성뿐만 아니라 항체 생산과 발현의 적절한 조절을 보존할 수 있다. 항체 다양화와 선별을 위한 생쥐 기구 (machinery) 및 인간 단백질에 대한 면역학적 관용의 결여를 활용함으로써, 이들 생쥐 계통에서 재현된 인간 항체 레퍼토리는 인간 항원을 비롯하여, 임의의 목적되는 항원에 대한 높은 친화성 완전 인간 항체를 산출할 수 있다. 하이브리도마 기술을 이용하여, 원하는 특이성을 갖는 항원-특이적 인간 MAb가 생산되고 선별될 수 있다. 일정한 예시적인 방법은 WO 98/24893, U.S. Patent No. 5,545,807, EP 546073, 그리고 EP 546073에서 설명된다.

일정한 구체예에서, 인간 가변 영역(들)과 함께, 인간 이외의 종으로부터 불변 영역을 이용할 수 있다.

효모 인공 염색체 (YACs)에서 메가염기 (megabase) 크기 인간 좌위를 클로닝하고 재구성하고, 그리고 이들을 생쥐 생식계열 내로 도입하는 능력은 매우 큰 또는 있는 그대로 맵핑된 좌위의 기능성 성분을 설명할 뿐만 아니라 인간 질환의 유용한 모델을 산출하는 접근법을 제공하다. 게다가, 생쥐 좌위의 그들의 인간 등가물로의 치환을 위한 이런 기술의 활용은 발달, 다른 시스템과의 소통, 그리고 질환 유도와 진행에서 관여 동안 인간 유전자 산물의 발현과 조절에 통찰력을 제공할 수 있다.

인간 항체는 뮤린 또는 쥐 가변 및/또는 불변 영역을 보유하는 항체와 연관된 문제점 중에서 일부를 회피한다. 이런 뮤린 또는 쥐 유래된 단백질의 존재는 항체의 급속한 청소를 유발할 수 있고, 또는 환자에 의한 항체에 대한 면역 반응의 발생을 유발할 수 있다. 뮤린 또는 쥐 유래된 항체의 활용을 피하기 위해, 설치류, 기타 포유류 또는 동물이 완전 인간 항체가 생산되도록 설치류, 기타 포유류 또는 동물 내로 기능성 인간 항체 좌위의 도입을 통해, 완전 인간 항체가 산출될 수 있다.

인간화 항체는 최초에, 인간이 아닌 항체 아미노산 서열을 내포하는 것으로 시작하지만, 이들 비인간 항체 아미노산 서열 중에서 적어도 일부가 인간 항체 서열로 대체되는 항체들이다. 이것은 항체가 인간에 의해 보유된 유전자에 의해 인코딩되는 (또는 인코딩될 수 있는) 인간 항체와 대조된다.

항원 결합 단백질 변이체

제공되는 다른 항체는 표 2에서 도시된 가변 중쇄와 가변 경쇄의 조합 또는 하위부분에 의해 형성된 앞서 열거된 ABP의 변이체이고, 그리고 표 2에서 서열의 아미노산 서열 (전체 서열 또는 상기 서열의 하위부분, 예를 들면, 하나 또는 그 이상의 CDR)에 각각 적어도 50%, 50-60, 60-70, 70-80%, 80-85%, 85-90%, 90-95%, 95-97%, 97-99%, 또는 99% 초과의 동일성을 갖는 가변 경쇄 및/또는 가변 중쇄를 포함한다. 일부 경우에, 이런 항체는 적어도 하나의 중쇄 및 하나의 경쇄를 포함하고, 반면 다른 경우에, 변이체 형태는 2개의 동일한 경쇄 및 2개의 동일한 중쇄 (또는 이들의 하위부분)를 내포한다. 일부 구체예에서, 도 2A-3D (그리고 13A-13J, 15A-15D 및 도 48A와 48B에서 다른 구체예)에서 서열 비교는 결합에 영향을 주는 변이 및 결합에 영향을 주지 않는 것으로 보이는 변이를 관찰함으로써, 변형될 수 있는 항체의 섹션을 확인하는데 이용될 수 있다. 가령, 유사한 서열을 비교함으로써, 변형될 수 있는 섹션 (가령, 특정 아미노산)을 확인하고, 그리고 이들이 ABP의 기능성을 여전히 유지하면서 (또는 개선하면서) 어떻게 변형될 수 있는 지를 확인할 수 있다. 일부 구체예에서, ABP의 변이체는 도 13A, 13C, 13F, 13G, 13H, 13I, 13J, 및/또는 48A와 48B에서 묘사된 공통 그룹과 서열을 포함하고, 그리고 변이는 이들 도면에서 가변으로 확인된 위치에서 허용된다. 도 13A, 13C, 13F, 13G, 48A와 48B에 도시된 CDR은 Chothia 방법 (구조 루프 영역의 장소에 기초됨, 예로써 "Standard conformations for the canonical structures of immunoglobulins," Bissan Al-Lazikani, Arthur M. Lesk and Cyrus Chothia, Journal of Molecular Biology, 273(4): 927-948, 7 November (1997)를 참조한다) 및 Kabat 방법 (서열 변이성에 기초됨, 예로써 Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition. NIH Publication No. 91-3242, Kabat et al., (1991)을 참조한다)의 하이브리드 조합에 기초하여 정의되었다. 어느 한쪽 방법에 의해 결정된 각 잔기는 CDR 잔기의 최종 목록 내에 포함되었다 (그리고, 도 13A, 13C, 13F, 13G, 그리고 48A와 48B에서 제공된다). 도 13H, 13I, 그리고 13J에서 CDR은 Kabat 방법 단독에 의해 획득되었다. 달리 명시되지 않으면, 도 13H-13J에서 정의된 공통 서열, CDR, 그리고 FR은 도 13에서 참고된 ABP에 대한 알려진 CDR과 FR을 규정하고 지배할 것이다.

일정한 구체예에서, 항원 결합 단백질은 서열번호 74, 85, 71, 72, 67, 87, 58, 52, 51, 53, 48, 54, 55, 56, 49, 57, 50, 91, 64, 62, 89, 65, 79, 80, 76, 77, 78, 83, 69, 81, 그리고 60의 서열 중에서 적어도 하나에서 선택되는 아미노산 서열에 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 가변 영역을 포함하는 중쇄를 포함한다. 일정한 구체예에서, 항원 결합 단백질은 서열번호 74, 85, 71, 72, 67, 87, 58, 52, 51, 53, 48, 54, 55, 56, 49, 57, 50, 91, 64, 62, 89, 65, 79, 80, 76, 77, 78, 83, 69, 81, 그리고 60의 서열 중에서 적어도 하나에서 선택되는 아미노산 서열에 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 가변 영역을 포함하는 중쇄를 포함한다. 일정한 구체예에서, 항원 결합 단백질은 서열번호 74, 85, 71, 72, 67, 87, 58, 52, 51, 53, 48, 54, 55, 56, 49, 57, 50, 91, 64, 62, 89, 65, 79, 80, 76, 77, 78, 83, 69, 81, 그리고 60의 서열 중에서 적어도 하나에서 선택되는 아미노산 서열에 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 가변 영역을 포함하는 중쇄를 포함한다.

일부 구체예에서, 항원 결합 단백질은 서열번호 74, 85, 71, 72, 67, 87, 58, 52, 51, 53, 48, 54, 55, 56, 49, 57, 50, 91, 64, 62, 89, 65, 79, 80, 76, 77, 78, 83, 69, 81, 그리고 60의 서열 중에서 적어도 하나에서 CDR로부터 하나 또는 그 이상의 CDR에 적어도 90%, 90-95%, 및/또는 95-99% 동일한 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개의 CDR (이들 각각은 상기 서열에 적어도 90%, 90-95%, 및/또는 95-99% 동일하다)이 존재한다.

일부 구체예에서, 항원 결합 단백질은 서열번호 74, 85, 71, 72, 67, 87, 58, 52, 51, 53, 48, 54, 55, 56, 49, 57, 50, 91, 64, 62, 89, 65, 79, 80, 76, 77, 78, 83, 69, 81, 그리고 60의 서열 중에서 적어도 하나에서 FR로부터 하나 또는 그 이상의 FR에 적어도 90%, 90-95%, 및/또는 95-99% 동일한 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 1, 2, 3, 또는 4개의 FR (이들 각각은 상기 서열에 적어도 90%, 90-95%, 및/또는 95-99% 동일하다)이 존재한다.

일정한 구체예에서, 항원 결합 단백질은 서열번호 5, 7, 9, 10, 12, 13, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 26, 28, 30, 31, 32, 33, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 42, 44, 그리고 46의 서열 중에서 적어도 하나에서 선택되는 아미노산 서열에 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 가변 영역을 포함하는 경쇄를 포함한다. 일정한 구체예에서, 항원 결합 단백질은 서열번호 5, 7, 9, 10, 12, 13, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 26, 28, 30, 31, 32, 33, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 42, 44, 그리고 46의 서열 중에서 적어도 하나에서 선택되는 아미노산 서열에 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 가변 영역을 포함하는 경쇄를 포함한다. 일정한 구체예에서, 항원 결합 단백질은 서열번호 5, 7, 9, 10, 12, 13, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 26, 28, 30, 31, 32, 33, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 42, 44, 그리고 46의 서열 중에서 적어도 하나에서 선택되는 아미노산 서열에 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 가변 영역을 포함하는 경쇄를 포함한다.

일부 구체예에서, 항원 결합 단백질은 서열번호 5, 7, 9, 10, 12, 13, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 26, 28, 30, 31, 32, 33, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 42, 44, 그리고 46의 서열 중에서 적어도 하나에서 CDR로부터 하나 또는 그 이상의 CDR에 적어도 90%, 90-95%, 및/또는 95-99% 동일한 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개의 CDR (이들 각각은 상기 서열에 적어도 90%, 90-95%, 및/또는 95-99% 동일하다)이 존재한다.

일부 구체예에서, 항원 결합 단백질은 서열번호 5, 7, 9, 10, 12, 13, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 26, 28, 30, 31, 32, 33, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 42, 44, 그리고 46의 서열 중에서 적어도 하나에서 FR로부터 하나 또는 그 이상의 FR에 적어도 90%, 90-95%, 및/또는 95-99% 동일한 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 1, 2, 3, 또는 4개의 FR (이들 각각은 상기 서열에 적어도 90%, 90-95%, 및/또는 95-99% 동일하다)이 존재한다.

본 발명의 개시에 비추어, 당업자는 널리 공지된 기술을 이용하여, 본원에서 제시된 바와 같은 ABP의 적절한 변이체를 결정할 수 있을 것이다. 일정한 구체예에서, 당업자는 활성에 중요한 것으로 생각되지 않는 영역을 표적으로 함으로써 활성을 파괴하지 않으면서, 변화될 수 있는 분자의 적절한 구역을 확인할 수 있다. 일정한 구체예에서, 유사한 폴리펩티드 사이에 보존되는 분자의 잔기와 부분을 확인할 수 있다. 일정한 구체예에서, 심지어, 생물학적 활성 또는 구조에 중요할 수 있는 구역도 생물학적 활성을 파괴하지 않으면서, 또는 폴리펩티드 구조에 부정적인 영향을 주지 않으면서 보존성 아미노산 치환에 종속될 수 있다.

부가적으로, 당업자는 활성 또는 구조에 중요한 유사한 폴리펩티드에서 잔기를 확인하는 구조-기능 연구를 재검토할 수 있다. 이런 비교를 고려하여, 유사한 단백질에서 활성 또는 구조에 중요한 아미노산 잔기에 상응하는 단백질에서 아미노산 잔기의 중요성을 예측할 수 있다. 당업자는 이런 예측된 중요한 아미노산 잔기에 대한 화학적으로 유사한 아미노산 치환을 선택할 수 있다.

당업자는 또한, 유사한 ABP에서 3차원 구조 및 상기 구조에 관련된 아미노산 서열을 분석할 수 있다. 이런 정보를 고려하여, 당업자는 3차원 구조에 관하여 항체의 아미노산 잔기의 정렬을 예측할 수 있다. 일정한 구체예에서, 당업자는 단백질의 표면 상에 있을 것으로 예측된 아미노산 잔기에 급격한 변화를 만들지 않는 것을 선택할 수 있는데, 그 이유는 이런 잔기가 다른 분자와의 중요한 상호작용에 관련될 수 있기 때문이다. 게다가, 당업자는 각각의 원하는 아미노산 잔기에서 단일 아미노산 치환을 내포하는 검사 변이체를 산출할 수 있다. 이들 변이체는 이후, 당업자에게 알려진 활성 검정을 이용하여 스크리닝될 수 있다. 이런 변이체는 적절한 변이체에 관한 정보를 모으는데 이용될 수 있다. 가령, 특정 아미노산 잔기에 대한 변화가 파괴되거나, 바람직하지 않게 감소되거나, 또는 부적절한 활성을 발생시키는 것으로 밝혀지면, 이런 변화를 갖는 변이체는 회피될 수 있다. 다시 말하면, 이런 일과적인 실험으로부터 모아진 정보에 기초하여, 당업자는 단독으로 또는 다른 돌연변이와 공동으로 추가의 치환이 회피되어야 하는 아미노산을 쉽게 결정할 수 있다.

다수의 과학적 간행물이 이차 구조의 예측에 헌신되었다. Moult J., Curr. Op. in Biotech., 7(4):422-427 (1996), Chou et al., Biochemistry, 13(2):222-245 (1974); Chou et al., Biochemistry, 113(2):211-222 (1974); Chou et al., Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol., 47:45-148 (1978); Chou et al., Ann. Rev. Biochem., 47:251-276 및 Chou et al., Biophys. J., 26:367-384 (1979)를 참조한다. 게다가, 이차 구조를 예측하는데 도움을 주는 컴퓨터 프로그램이 현재 가용하다. 이차 구조를 예측하는 한 가지 방법은 상동성 모델링 (homology modeling)에 기초된다. 가령, 30% 이상의 서열 동일성, 또는 40% 이상의 유사성을 갖는 2개의 폴리펩티드 또는 단백질은 종종, 유사한 구조적 위상을 갖는다. 단백질 구조 데이터베이스 (PDB)의 최근 성장은 폴리펩티드 또는 단백질의 구조 내에서 접힘의 잠재적 숫자를 비롯하여, 이차 구조의 증강된 예측력을 제공하였다. Holm et al., Nucl. Acid. Res., 27(1):244-247 (1999)을 참조한다. 소정의 폴리펩티드 또는 단백질 내에 제한된 숫자의 접힘이 있고, 그리고 일단 구조의 임계적 숫자가 해결되면, 구조 예측이 훨씬 정확해지는 것으로 제안되었다 (Brenner et al., Curr. Op. Struct. Biol., 7(3):369-376 (1997)).

이차 구조를 예측하는 추가의 방법에는 "스레딩 (threading)" (Jones, D., Curr. Opin. Struct. Biol., 7(3):377-87 (1997); Sippl et al., Structure, 4(1):15-19 (1996)), "프로필 분석" (Bowie et al., Science, 253:164-170 (1991); Gribskov et al., Meth. Enzym., 183:146-159 (1990); Gribskov et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 84(13):4355-4358 (1987)), 그리고 "진화적 연쇄" (Holm, supra (1999), 그리고 Brenner, supra (1997)을 참조한다)가 포함된다.

일정한 구체예에서, 항원 결합 단백질 변이체에는 당화 변이체가 포함되는데, 여기서 당화 부위의 숫자 및/또는 유형이 부모 폴리펩티드의 아미노산 서열과 비교하여 변경된다. 일정한 구체예에서, 단백질 변이체는 고유 단백질보다 더욱 많은 또는 더욱 적은 숫자의 N-연결된 당화 부위를 포함한다. N-연결된 당화 부위는 서열: Asn-X-Ser 또는 Asn-X-Thr로 특징되고, 여기서 X로서 지정된 아미노산 잔기는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산 잔기일 수 있다. 이러한 서열을 창출하기 위한 아미노산 잔기의 치환은 N-연결된 탄수화물 사슬의 부가를 위한 잠재적인 새로운 부위를 제공한다. 대안으로, 이러한 서열을 제거하는 치환은 현재의 N-연결된 탄수화물 사슬을 제거할 것이다. 또한, N-연결된 탄수화물 사슬의 재배열이 제공되는데, 여기서 하나 또는 그 이상의 N-연결된 당화 부위 (전형적으로, 자연 발생인 것들)가 제거되고, 그리고 하나 또는 그 이상의 새로운 N-연결된 부위가 창출된다. 추가의 바람직한 항체 변이체에는 시스테인 변이체가 포함되고, 여기서 하나 또는 그 이상의 시스테인 잔기가 부모 아미노산 서열과 비교하여 결실되거나 또는 다른 아미노산 (가령, 세린)으로 치환된다. 시스테인 변이체는 항체가 예로써, 불용성 봉입체의 단리 후 생물학적으로 활성 입체형태로 재접힘되어야 할 때, 유용할 수 있다. 시스테인 변이체는 일반적으로, 고유 단백질보다 적은 시스테인 잔기를 갖고, 그리고 전형적으로, 대합되지 않은 시스테인에 기인하는 상호작용을 최소화시키기 위해 균등한 숫자를 갖는다.

일정한 구체예에 따라서, 아미노산 치환은 (1) 단백분해에 대한 감수성을 감소시키고, (2) 산화에 대한 감수성을 감소시키고, (3) 단백질 복합체를 형성하기 위한 결합 친화성을 변경하고, (4) 결합 친화성을 변경하고, 및/또는 (4) 이런 폴리펩티드에 기타 생리화학적 성질 또는 기능성 성질을 공여하거나 변화시키는 것들이다. 일정한 구체예에 따라서, 단일 또는 복수 아미노산 치환 (일정한 구체예에서, 보존성 아미노산 치환)은 자연 발생 서열 (일정한 구체예에서, 분자간 접촉을 형성하는 도메인(들) 외부에 폴리펩티드의 부분에서)에서 만들어질 수 있다. 일정한 구체예에서, 보존성 아미노산 치환은 전형적으로, 부모 서열의 구조 특징을 실질적으로 변화시키지 않는다 (가령, 대체 아미노산은 부모 서열에서 발생하는 나선을 파괴하거나, 또는 부모 서열을 특징짓는 다른 유형의 이차 구조를 교란하는 경향이 없어야 한다). 당분야에서 인정된 폴리펩티드 이차와 삼차 구조의 실례는 Proteins, Structures and Molecular Principles (Creighton, Ed., W. H. Freeman and Company, New York (1984)); Introduction to Protein Structure (C. Branden & J. Tooze, eds., Garland Publishing, New York, N.Y. (1991)); 그리고 Thornton et al., Nature, 354:105 (1991)에서 설명되고, 이들은 각각 본원에 참고문헌으로 편입된다.

일부 구체예에서, 변이체는 본원에서 개시된 ABP의 핵산 서열의 변이체이다. 당업자는 상기 논의가 ABP 단백질 변이체 및 이들 단백질 변이체를 인코딩할 수 있는 핵산 서열을 확인하고, 평가하고 및/또는 창출하는데 이용될 수 있다는 것을 인지할 것이다. 따라서 이들 단백질 변이체를 인코딩하는 핵산 서열 (또한, 표 2에서 ABP를 인코딩하지만, 본원에서 명백하게 개시된 것들과 상이한 핵산 서열)이 예기된다. 가령, ABP 변이체는 서열번호 152, 153, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151에서 설명된 적어도 하나의 핵산 서열, 또는 서열번호 152, 153, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 그리고 151에서 핵산 서열에 의해 인코딩된 CDR(들) 중에서 적어도 1개 내지 6개 (및 이들의 다양한 조합)에 적어도 80, 80-85, 85-90, 90-95, 95-97, 97-99 또는 그 이상의 동일성을 가질 수 있다.

일부 구체예에서, 항체 (또는 이를 인코딩하는 핵산 서열)는 특정 ABP를 인코딩하는 핵산 서열 (또는 이의 핵산 서열 그 자체)이 표 2에서 단백질을 인코딩하는 임의의 핵산 서열 (예로써, 서열번호 152, 153, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 그리고 151이 포함되지만 이들에 국한되지 않음)에 엄격한 조건 하에 선별적으로 혼성화될 수 있으면, 변이체이다. 한 구체예에서, 적절한 중간 정도로 엄격한 조건은 5XSSC의 용액에서 사전 세척; 0.5% SDS, 1.0 mM EDTA (pH 8:0); 50℃, -65℃, 5xSSC에서 하룻밤 동안 혼성화, 또는 교차-종 상동성의 경우에, 45℃, 0.5xSSC에서 혼성화; 그 이후에, 65℃에서 20분 동안, 0.1% SDS를 내포하는 2x, 0.5x와 0.2xSSC 각각으로 2회 세척을 포함한다. 이런 혼성화 DNA 서열은 본 발명의 범위 내에 있고, 코돈 퇴화 (code degeneracy)로 인하여, 혼성화 DNA 서열에 의해 인코딩되는 항체 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열 및 이들 핵산 서열에 의해 인코딩되는 아미노산 서열 역시 본 발명의 범위 내에 있다. 일부 구체예에서, CDR의 변이체는 앞서 언급된 서열 내에서 하나 또는 그 이상의 CDR (개별 CDR은 도 2A-3D, 그리고 도 3CCC-3JJJ와 15A-15D에서 다른 구체예에 비추어 쉽게 결정될 수 있다)에 혼성화되는, 핵산 서열 및 이들 서열에 의해 인코딩된 아미노산 서열을 포함한다. 이러한 문맥에서 지칭되는 관용구 "선별적으로 혼성화된다"는 검출가능하게 및 선별적으로 결합한다는 것을 의미한다. 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드 및 이들의 단편은 비특이적 핵산에 대한 검출가능한 결합의 인지가능한 양을 최소화시키는 혼성화와 세척 조건 하에 핵산 가닥에 선별적으로 혼성화된다. 높은 엄격함 조건은 당분야에 공지되고 본원에서 논의된 바와 같은 선별적 혼성화 조건을 달성하는데 이용될 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 폴리뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드 및 단편, 그리고 목적되는 핵산 서열 사이에 핵산 서열 상동성은 적어도 80%이고, 그리고 더욱 전형적으로, 바람직하게는 적어도 85%, 90%, 95%, 99%, 그리고 100%의 상동성으로 증가한다. 2개의 아미노산 서열은 그들의 서열 사이에 부분적인 또는 완전한 동일성이 존재하면, 상동성이다. 가령, 85% 상동성은 두 서열이 최대 정합을 위해 정렬될 때, 85%의 아미노산이 동일하다는 것을 의미한다. 갭 (정합되는 두 서열중 어느 한쪽에서)은 정합을 극대화시키는데 허용된다; 5 또는 그 이하의 갭 길이가 바람직하고, 2 또는 그 이하가 더욱 바람직하다. 대안적으로 및 바람직하게는, 두 단백질 서열 (또는 이들로부터 유래된 적어도 30개 아미노산 길이의 폴리펩티드 서열)은 이러한 용어가 본원에서 이용된 바와 같이, 그들이 돌연변이 데이터 매트릭스 및 6 또는 그 이상의 갭 페널티를 갖는 프로그램 ALIGN을 이용하여 5 (표준 편차 단위에서) 이상의 정렬 스코어를 가지면, 상동성이다. Dayhoff, M. O., in Atlas of Protein Sequence and Structure, pp. 101-110 (Volume 5, National Biomedical Research Foundation (1972)) 및 Supplement 2 to this volume, pp. 1-10을 참조한다. 두 서열 또는 이들의 일부는 더욱 바람직하게는, ALIGN 프로그램을 이용하여 최적으로 정렬될 때, 그들의 아미노산이 50%보다 크거나 또는 이에 동등하게 동일하면, 상동성이다. 용어 "상응한다"는 본원에서, 폴리뉴클레오티드 서열이 참고 폴리뉴클레오티드 서열의 전부 또는 부분에 상동성 (즉, 동일하지만 엄격하게 진화적으로 관련되지 않음)이거나, 또는 폴리펩티드 서열이 참고 폴리펩티드 서열에 동일하다는 것을 의미하는데 이용된다. 대비하여, 용어 "상보성"은 본원에서, 상보성 서열이 참고 폴리뉴클레오티드 서열의 전부 또는 부분에 상동성이라는 것을 의미하는데 이용된다. 예로써, 뉴클레오티드 서열 "TATAC"는 참고 서열 "TATAC"에 상응하고 참고 서열 "GTATA"에 상보성이다.

항원 결합 단백질 (가령, 항체)의 제조

일정한 구체예에서, 항원 결합 단백질 (가령, 항체)은 항원 (가령, PCSK9)으로 면역화에 의해 생산된다. 일정한 구체예에서, 항체는 전장 PCSK9, PCSK9의 가용성 형태, 촉매 도메인 단독, 도 1A에서 도시된 PCSK9의 성숙 형태, PCSK9의 스플라이스 변이체 형태, 또는 이의 단편으로 면역화에 의해 생산될 수 있다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 항체는 다중클론 또는 단일클론일 수 있고, 및/또는 재조합 항체일 수 있다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 항체는 예로써, 인간 항체를 생산할 수 있는 유전자도입 동물의 면역화에 의해 제조된 인간 항체이다 (예로써, PCT Published Application No. W0 93/12227을 참조한다).

일정한 구체예에서, 항체의 내재된 성질, 예를 들면, 표적에 대한 항체의 친화성을 조작하기 위한 일정한 전략이 이용될 수 있다. 이런 전략에는 항체 변이체를 산출하기 위한 항체를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 분자의 특정-부위 또는 무작위 돌연변이유발의 이용이 포함되지만 이에 국한되지 않는다. 일정한 구체예에서, 이런 산출은 원하는 변화, 예를 들면, 증가된 또는 감소된 친화성을 나타내는 항체 변이체에 대한 스크리닝이 그 뒤를 잇는다.

일정한 구체예에서, 돌연변이유발 전략에서 표적화된 아미노산 잔기는 CDR 내에 있는 것들이다. 일정한 구체예에서, 가변 도메인의 뼈대 영역 내에 있는 아미노산이 표적화된다. 일정한 구체예에서, 이런 뼈대 영역은 일정한 항체의 표적 결합 성질에 기여하는 것으로 밝혀졌다. 예로써, Hudson, Curr. Opin. Biotech., 9:395-402 (1999) 및 그 안에 참고문헌을 참조한다.

일정한 구체예에서, 항체 변이체의 더욱 작고 더욱 효과적으로 스크리닝된 라이브러리는 무작위 또는 특정 부위 돌연변이유발을 CDR 내에 초돌연변이 부위에 제한함으로써 생산되고, 이들은 신체 친화성 성숙 과정 동안 돌연변이되기 쉬운 구역에 상응하는 부위이다. 예로써, Chowdhury & Pastan, Nature Biotech., 17: 568-572 (1999) 및 그 안에 참고문헌을 참조한다. 일정한 구체예에서, 일정한 직접과 역위 반복, 일정한 공통 서열, 일정한 이차 구조, 그리고 일정한 팰린드롬이 포함되지만 이들에 국한되지 않는 일정한 유형의 DNA 요소가 초돌연변이 부위를 확인하는데 이용될 수 있다. 가령, 초돌연변이 부위를 확인하는데 이용될 수 있는 이런 DNA 요소에는 퓨린 (A 또는 G), 그 이후에 구아닌 (G), 그 이후에 피리미딘 (C 또는 T), 그 이후에 아데노신 또는 티미딘 (A 또는 T)을 포함하는 테트라염기 서열 (즉, A/G-G-C/T-A/T)이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 초돌연변이 부위를 확인하는데 이용될 수 있는 DNA 요소의 다른 실례는 세린 코돈, A-G-C/T이다.

완전 인간 ABP (가령, 항체)의 제조

일정한 구체예에서, 파지 전시 기술이 단일클론 항체를 산출하는데 이용된다. 일정한 구체예에서, 이런 기술은 완전 인간 단일클론 항체를 생산한다. 일정한 구체예에서, 단일 Fab 또는 Fv 항체 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 파지 입자의 표면 상에 발현된다. 예로써, Hoogenboom et al., J. Mol. Biol., 227: 381 (1991); Marks et al., J Mol Biol 222: 581 (1991); U.S. Patent No. 5,885,793을 참조한다. 일정한 구체예에서, 파지는 표적에 대한 친화성을 갖는 항체 단편을 확인하기 위해 "스크리닝"된다. 따라서 일정한 이런 과정은 섬유상 박테리오파지의 표면 상에서 항체 단편 레퍼토리의 전시를 통한 면역 선별, 그리고 표적에 결합에 의한 파지의 차후 선별을 모방한다. 일정한 이런 절차에서, 높은 친화성 기능성 중화 항체 단편이 단리된다. 일정한 이런 구체예 (하기에 더욱 상세하게 논의됨)에서, 인간 항체 유전자의 완전한 레퍼토리는 말초 혈액 림프구로부터 자연적으로 재배열된 인간 V 유전자를 클로닝함으로써 산출된다. 예로써, Mullinax et al., Proc Natl Acad Sci (USA), 87: 8095-8099 (1990)를 참조한다.

일정한 구체예에 따라서, 본 발명의 항체는 인간 항체 생산 게놈의 실질적인 부분이 삽입되지만, 내인성 뮤린 항체의 생산이 결함되는 유전자도입 생쥐의 활용을 통해 제조된다. 이런 생쥐는 이후, 인간 면역글로불린 분자와 항체를 생산할 수 있고, 그리고 뮤린 면역글로불린 분자와 항체의 생산이 결함된다. 이러한 결과를 달성하기 위해 활용되는 기술은 본원의 명세서에서 개시된 특허, 출원 및 참고문헌에서 개시된다. 일정한 구체예에서, PCT Published Application No. WO 98/24893 또는 Mendez et al., Nature Genetics, 15:146-156 (1997)에서 개시된 것들과 같은 방법이 이용될 수 있고, 이들은 본원에 순전히 참고문헌으로 편입된다.

일반적으로, PCSK9에 특이적인 완전 인간 단일클론 ABP (가령, 항체)는 하기와 같이 생산될 수 있다. 인간 면역글로불린 유전자를 내포하는 유전자도입 생쥐는 목적되는 항원, 예를 들면, PCSK9로 면역화되고, 항체를 발현하는 생쥐로부터 림프 세포 (가령, B-세포)가 획득된다. 이런 회수된 세포는 영속 하이브리도마 세포주를 제조하기 위해 골수-유형 세포주와 융합되고, 그리고 이런 하이브리도마 세포주는 목적되는 항원에 특이적인 항체를 생산하는 하이브리도마 세포주를 확인하기 위해 스크리닝되고 선별된다. 일정한 구체예에서, PCSK9에 특이적인 항체를 생산하는 하이브리도마 세포주의 생산이 제공된다.

일정한 구체예에서, 완전 인간 항체는 인간 비장세포 (B 또는 T 세포)를 시험관내에서 항원에 노출시키고, 그리고 이후, 노출된 세포를 면역약화된 생쥐, 예를 들면, SCID 또는 nod/SCID에서 재구성함으로써 생산된다. 예로써, Brams et al., J.Immunol. 160: 2051-2058 (1998); Carballido et al., Nat. Med., 6: 103-106 (2000)를 참조한다. 일정한 이런 접근법에서, SCID 생쥐 (SCID-hu) 내로 인간 태아 조직의 이식은 장기 조혈과 인간 T-세포 발달을 유발한다. 예로써, McCune et al., Science, 241:1532-1639 (1988); Ifversen et al., Sem. Immunol., 8:243-248 (1996)을 참조한다. 일정한 경우에, 이런 키메라 생쥐에서 체액 면역 반응은 동물에서 인간 T-세포의 공동-발달에 의존한다. 예로써, Martensson et al., Immunol., 83:1271-179 (1994)를 참조한다. 일정한 접근법에서, 인간 말초 혈액 림프구는 SCID 생쥐 내로 이식된다. 예로써, Mosier et al., Nature, 335:256-259 (1988)를 참조한다. 일정한 이런 구체예에서, 이런 이식된 세포가 기폭 작용제 (priming agent), 예를 들면, 스타필로코커스 엔테로톡신 (Staphylococcal Enterotoxin, A (SEA))으로, 또는 항-인간 CD40 단일클론 항체로 처리될 때, 높은 수준의 B 세포 생산이 검출된다. 예로써, Martensson et al., Immunol., 84: 224-230 (1995); Murphy et al., Blood, 86:1946-1953 (1995)을 참조한다.

따라서 일정한 구체예에서, 완전 인간 항체는 숙주 세포에서 재조합 DNA의 발현에 의해 또는 하이브리도마 세포에서 발현에 의해 생산될 수 있다. 다른 구체예에서, 항체는 본원에서 설명된 파지 전시 기술을 이용하여 생산될 수 있다.

본원에서 설명된 항체는 본원에서 설명된 바와 같이, XenoMouse^® 기술의 활용을 통해 제조되었다. 이런 생쥐는 이후, 인간 면역글로불린 분자와 항체를 생산할 수 있고, 그리고 뮤린 면역글로불린 분자와 항체의 생산이 결함된다. 이를 달성하기 위해 이용되는 기술은 본원의 배경 섹션에서 개시된 특허, 출원, 그리고 참고문헌에서 개시된다. 특히, 하지만, 생쥐의 유전자도입 생산 및 이로부터 항체의 바람직한 구체예는 1996년 12월 3일자 제출된 U.S. Patent Application Serial No. 08/759,620, 그리고 1998년 6월 11일자 공개된 International Patent Application No. WO 98/24893과 2000년 12월 21일자 공개된 WO 00/76310에서 개시되고, 이들의 내용은 본원에 참고문헌으로 편입된다. 또한, Mendez et al., Nature Genetics, 15:146-156 (1997)을 참조하고, 이의 내용은 본원에 참고문헌으로 편입된다.

이런 기술의 이용을 통해, 다양한 항원에 대한 완전 인간 단일클론 항체가 생산되었다. 본질적으로, 생쥐의 XenoMouse^® 계통은 목적되는 항원 (가령, PCSK9)으로 면역화되고, 림프 세포 (가령, B-세포)가 초-면역화된 생쥐로부터 회수되고, 그리고 회수된 림프구는 영속 하이브리도마 세포주를 제조하기 위해 골수-유형 세포주와 융합된다. 이들 하이브리도마 세포주는 목적되는 항원에 특이적인 항체를 생산하는 하이브리도마 세포주를 확인하기 위해 스크리닝되고 선별된다. PCSK9에 특이적인 항체를 생산하는 복합 하이브리도마 세포주의 생산을 위한 방법이 본원에서 제공된다. 게다가, 이런 세포주에 의해 생산된 항체의 중쇄와 경쇄의 뉴클레오티드와 아미노산 서열 분석을 비롯하여, 이런 항체의 특성화가 본원에서 제공된다.

생쥐의 XenoMouse^® 계통의 생산은 U.S. Patent Application Serial Nos. 07/466,008 (1990년 1월 12일자 제출됨), 07/610,515 (1990년 11월 8일자 제출됨), 07/919,297 (1992년 7월 24일자 제출됨), 07/922,649 (1992년 7월 30일자 제출됨), 08/031,801 (1993년 3월 15일자 제출됨), 08/112,848 (1993년 8월 27일자 제출됨), 08/234,145 (1994년 4월 28일자 제출됨), 08/376,279 (1995년 1월 20일자 제출됨), 08/430,938 (1995년 4월 27일자 제출됨), 08/464,584 (1995년 6월 5일자 제출됨), 08/464,582 (1995년 6월 5일자 제출됨), 08/463,191 (1995년 6월 5일자 제출됨), 08/462,837 (1995년 6월 5일자 제출됨), 08/486,853 (1995년 6월 5일자 제출됨), 08/486,857 (1995년 6월 5일자 제출됨), 08/486,859 (1995년 6월 5일자 제출됨), 08/462,513 (1995년 6월 5일자 제출됨), 08/724,752 (1996년 10월 2일자 제출됨), 08/759,620 (1996년 12월 3일자 제출됨), 2001년 11월 30일자 제출된 U.S. Publication 2003/0093820, 그리고 U.S. Patent Nos. 6,162,963, 6,150,584, 6,114,598, 6,075,181과 5,939,598, 그리고 Japanese Patent Nos. 3 068 180 B2, 3 068 506 B2와 3 068 507 B2에서 더욱 논의되고 기술된다. 또한, 1996년 6월 12일자 특허 공고된 European Patent No., EP 0 463 151 B1, 1994년 2월 3일자 공개된 International Patent Application No., WO 94/02602, 1996년 10월 31일자 공개된 International Patent Application No., WO 96/34096, 1998년 6월 11일자 공개된 WO 98/24893, 2000년 12월 21일자 공개된 WO 00/76310을 참조한다. 앞서 언급된 각 특허, 출원, 그리고 참고문헌의 내용은 본원에 전체로서 참고문헌으로 편입된다.

대안적 접근법에서, GenPharm International, Inc.를 비롯한 다른 곳에서는 "미니좌위" 접근법을 이용하였다. 미니좌위 접근법에서, 외인성 Ig 좌위는 Ig 좌위로부터 조각 (개별 유전자)의 포함을 통해 모방된다. 따라서 하나 또는 그 이상의 V_H 유전자, 하나 또는 그 이상의 D_H 유전자, 하나 또는 그 이상의 J_H 유전자, mu 불변 영역, 그리고 통상적으로, 두 번째 불변 영역 (바람직하게는, 감마 불변 영역)이 동물 내로 삽입을 위한 구조체로 형성된다. 이러한 접근법은 U.S. Patent No. 5,545,807 (Surani et al.), U.S. Patent Nos. 5,545,806, 5,625,825, 5,625,126, 5,633,425, 5,661,016, 5,770,429, 5,789,650, 5,814,318, 5,877,397, 5,874,299와 6,255,458 (각각, Lonberg & Kay), U.S. Patent No. 5,591,669와 6,023.010 (Krimpenfort & Berns), U.S. Patent Nos. 5,612,205, 5,721,367과 5,789,215 (Berns et al.), 그리고 U.S. Patent No. 5,643,763 (Choi & Dunn), 그리고 GenPharm International U.S. Patent Application Serial Nos. 07/574,748 (1990년 8월 29일자 제출됨), 07/575,962 (1990년 8월 31일자 제출됨), 07/810,279 (1991년 12월 17일자 제출됨), 07/853,408 (1992년 3월 18일자 제출됨), 07/904,068 (1992년 6월 23일자 제출됨), 07/990,860 (1992년 12월 16일자 제출됨), 08/053,131 (1993년 4월 26일자 제출됨), 08/096,762 (1993년 7월 22일자 제출됨), 08/155,301 (1993년 11월 18일자 제출됨), 08/161,739 (1993년 12월 3일자 제출됨), 08/165,699 (1993년 12월 10일자 제출됨), 08/209,741 (1994년 3월 9일자 제출됨)에서 설명되고, 이들의 내용은 본원에 참고문헌으로 편입된다. 또한, European Patent No. 0 546 073 B1, International Patent Application Nos. WO 92/03918, WO 92/22645, WO 92/22647, WO 92/22670, WO 93/12227, WO 94/00569, WO 94/25585, WO 96/14436, WO 97/13852와 WO 98/24884, 그리고 U.S. Patent No. 5,981,175를 참조하고, 이들의 내용은 본원에 전체로서 참고문헌으로 편입된다. 게다가, Taylor et al., 1992, Chen et al., 1993, Tuaillon et al., 1993, Choi et al., 1993, Lonberg et al., (1994), Taylor et al., (1994), 그리고 Tuaillon et al., (1995), Fishwild et al., (1996)을 참조하고, 이들의 내용은 본원에 전체로서 참고문헌으로 편입된다.

Kirin은 또한, 마이크로세포 융합을 통해, 염색체의 큰 조각, 또는 전체 염색체가 도입된 생쥐로부터 인간 항체의 산출을 예증하였다. European Patent Application Nos. 773 288과 843 961을 참조하고, 이들의 내용은 본원에 참고문헌으로 편입된다. 부가적으로, Kirin의 Tc 생쥐와 Medarex의 미니좌위 (Humab) 생쥐의 이종 교배 (cross-breeding)의 결과인 KM^TM 생쥐가 산출되었다. 이들 생쥐는 Kirin 생쥐의 인간 IgH 이식염색체 (trasnchromosome) 및 Genpharm 생쥐의 카파 사슬 이식유전자 (transgene)를 보유한다 (Ishida et al., Cloning Stem Cells, (2002) 4:91-102).

인간 항체는 또한, 시험관내 방법에 의해 유래될 수 있다. 적절한 실례에는 파지 전시 (CAT, Morphosys, Dyax, Biosite/Medarex, Xoma, Symphogen, Alexion (이전에 Proliferon), Affimed) 리보솜 전시 (CAT), 효모 전시 등이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.

일부 구체예에서, 본원에서 설명된 항체는 인간 IgG4 중쇄뿐만 아니라 IgG2 중쇄를 보유한다. 항체는 또한, IgG1을 비롯한 다른 인간 아이소타입일 수 있다. 이들 항체는 다양한 기술에 의해 측정될 때, 높은 친화성을 갖고, 전형적으로 약 10^-6 내지 약 10^-13 M 또는 그 미만의 K_d를 갖는다.

인지되는 바와 같이, 항체는 하이브리도마 세포주 이외의 세포주에서 발현될 수 있다. 특정 항체를 인코딩하는 서열은 적절한 포유류 숙주 세포를 형질전환하는데 이용될 수 있다. 형질전환은 예로써, 폴리뉴클레오티드를 바이러스 내에 (또는 바이러스 벡터 내로) 포장하고 숙주 세포를 상기 바이러스 (또는 벡터)로 형질도입하는 것을 포함하는, 폴리뉴클레오티드를 숙주 세포 내로 도입하기 위한 임의의 공지된 방법에 의해, 또는 U.S. Patent Nos. 4,399,216, 4,912,040, 4,740,461과 4,959,455 (이들 특허는 본원에 참고문헌으로 편입된다)에 의해 예시되는 바와 같이, 당분야에 공지된 형질감염 절차에 의해 달성될 수 있다. 이용되는 형질전환 절차는 형질전환되는 숙주에 좌우된다. 이종기원성 폴리뉴클레오티드를 포유류 세포 내로 도입하기 위한 방법은 당분야에 널리 공지되어 있고, 여기에는 덱스트란-매개된 형질감염, 인산칼슘 침전, 폴리브렌 매개된 형질감염, 원형질체 융합, 전기천공, 리포좀 내에서 폴리뉴클레오티드(들)의 캡슐화, 그리고 핵 내로 DNA의 직접 미세주사가 포함된다.

발현을 위한 숙주로서 이용가능한 포유류 세포주는 당분야에 널리 공지되어 있고, 여기에는 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포, HeLa 세포, 새끼 햄스터 신장 (BHK) 세포, 원숭이 신장 세포 (COS), 인간 간세포 암종 세포 (가령, Hep G2), 인간 상피 신장 293 세포, 그리고 다수의 기타 세포주가 포함되지만 이들에 국한되지 않는, American Type Culture Collection (ATCC)으로부터 입수가능한 많은 영속화 세포주가 포함된다. 특히 선호되는 세포주는 어떤 세포주가 높은 발현 수준을 갖고, 그리고 구조성 PCSK9 결합 성질을 갖는 항체를 생산하는 지를 결정하는 것을 통해 선별된다.

일정한 구체예에서, 항체 및/또는 ABP는 하기 하이브리도마 중에서 적어도 하나에 의해 생산된다: 21B12, 31H4, 16F12, 표 2에서 열거되거나 실시예에서 개시된 임의의 다른 하이브리도마. 일정한 구체예에서, 항원 결합 단백질은 대략 1 nM 이하, 예를 들면, 1000pM 내지 100 pM, 100 pM 내지 10 pM, 10 pM 내지 1 pM, 및/또는 1 pM 내지 0.1 pM 또는 그 이하의 해리 상수 (K_D)로 PCSK9에 결합한다.

일정한 구체예에서, 항원 결합 단백질은 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgE, IgA, IgD, 그리고 IgM 아이소타입 중에서 적어도 하나의 면역글로불린 분자를 포함한다. 일정한 구체예에서, 항원 결합 단백질은 인간 카파 경쇄 및/또는 인간 중쇄를 포함한다. 일정한 구체예에서, 중쇄는 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgE, IgA, IgD, 또는 IgM 아이소타입이다. 일정한 구체예에서, 항원 결합 단백질은 포유류 세포에서 발현을 위해 클로닝된다. 일정한 구체예에서, 항원 결합 단백질은 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgE, IgA, IgD, 그리고 IgM 아이소타입의 임의의 불변 영역이 아닌 불변 영역을 포함한다.

일정한 구체예에서, 항원 결합 단백질은 인간 람다 경쇄 및 인간 IgG2 중쇄를 포함한다. 일정한 구체예에서, 항원 결합 단백질은 인간 람다 경쇄 및 인간 IgG4 중쇄를 포함한다. 일정한 구체예에서, 항원 결합 단백질은 인간 람다 경쇄 및 인간 IgG1, IgG3, IgE, IgA, IgD 또는 IgM 중쇄를 포함한다. 다른 구체예에서, 항원 결합 단백질은 인간 카파 경쇄 및 인간 IgG2 중쇄를 포함한다. 일정한 구체예에서, 항원 결합 단백질은 인간 카파 경쇄 및 인간 IgG4 중쇄를 포함한다. 일정한 구체예에서, 항원 결합 단백질은 인간 카파 경쇄 및 인간 IgG1, IgG3, IgE, IgA, IgD 또는 IgM 중쇄를 포함한다. 일정한 구체예에서, 항원 결합 단백질은 IgG2 아이소타입에 대한 불변 영역이 아니고, 또한 IgG4 아이소타입에 대한 불변 영역이 아닌 불변 영역에 결찰된 항체의 가변 영역을 포함한다. 일정한 구체예에서, 항원 결합 단백질은 포유류 세포에서 발현을 위해 클로닝된다.

일정한 구체예에서, 하이브리도마 세포주: 21B12, 31H4와 16F12 중에서 적어도 하나로부터 항체의 중쇄와 경쇄에 대한 보존성 변형 (및 인코딩 뉴클레오티드에 대한 상응하는 변형)은 하이브리도마 세포주: 21B12, 31H4와 16F12로부터 항체의 것들과 유사한 기능적 특징과 화학적 특징을 갖는 PCSK9에 대한 항체를 생산할 것이다. 대조적으로, 일정한 구체예에서, PCSK9에 대한 항체의 기능적 및/또는 화학적 특징에서 실질적인 변형은 (a) 예로써, 시트 또는 나선 입체형태로서, 치환의 구역에서 분자 중추의 구조, (b) 표적 부위에서 분자의 전하 또는 소수성, 또는 (c) 측쇄의 부피를 유지하는 것에 대한 효과에서 유의미하게 상이한 중쇄와 경쇄의 아미노산 서열에서 치환을 선별함으로써 달성될 수 있다.

가령, "보존성 아미노산 치환"은 해당 위치에서 아미노산 잔기의 극성 또는 전하에 대한 효과가 거의 또는 전혀 없도록, 비-고유 잔기로 고유 아미노산 잔기의 치환을 수반할 수 있다. 게다가, 폴리펩티드 내에서 임의의 고유 잔기는 또한, "알라닌 스캐닝 돌연변이유발"에 대해 앞서 설명된 바와 같이, 알라닌으로 치환될 수 있다.

바람직한 아미노산 치환 (보존성 또는 비-보존성인지에 상관없이)은 이런 치환이 요망되는 시점에서 당업자에 의해 결정될 수 있다. 일정한 구체예에서, 아미노산 치환은 PCSK9에 대한 항체의 중요한 잔기를 확인하거나, 또는 본원에서 설명된 바와 같이 PCSK9에 대한 항체의 친화성을 증가 또는 감소시키는데 이용될 수 있다.

일정한 구체예에서, 본 발명의 항체는 하이브리도마 세포주 이외의 세포주에서 발현될 수 있다. 일정한 구체예에서, 특정 항체를 인코딩하는 서열이 적절한 포유류 숙주 세포의 형질전환을 위해 이용될 수 있다. 일정한 구체예에 따라서, 형질전환은 예로써, 폴리뉴클레오티드를 바이러스 내에 (또는 바이러스 벡터 내로) 포장하고 숙주 세포를 상기 바이러스 (또는 벡터)로 형질도입하는 것을 포함하는, 폴리뉴클레오티드를 숙주 세포 내로 도입하기 위한 임의의 공지된 방법에 의해, 또는 U.S. Patent Nos. 4,399,216, 4,912,040, 4,740,461과 4,959,455 (이들 특허는 본원에 순전히 참고문헌으로 편입된다)에 의해 예시되는 바와 같이, 당분야에 공지된 형질감염 절차에 의해 달성될 수 있다. 일정한 구체예에서, 이용되는 형질전환 절차는 형질전환되는 숙주에 좌우될 수 있다. 이종기원성 폴리뉴클레오티드를 포유류 세포 내로 도입하기 위한 방법은 당분야에 널리 공지되어 있고, 여기에는 덱스트란-매개된 형질감염, 인산칼슘 침전, 폴리브렌 매개된 형질감염, 원형질체 융합, 전기천공, 리포좀 내에서 폴리뉴클레오티드(들)의 캡슐화, 그리고 핵 내로 DNA의 직접 미세주사가 포함된다.

발현을 위한 숙주로서 이용가능한 포유류 세포주는 당분야에 널리 공지되어 있고, 여기에는 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포, HeLa 세포, 새끼 햄스터 신장 (BHK) 세포, 원숭이 신장 세포 (COS), 인간 간세포 암종 세포 (가령, Hep G2), 그리고 다수의 기타 세포주가 포함되지만 이들에 국한되지 않는, American Type Culture Collection (ATCC)으로부터 입수가능한 많은 영속화 세포주가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 일정한 구체예에서, 세포주는 어떤 세포주가 높은 발현 수준을 갖고, 그리고 구조성 HGF 결합 성질을 갖는 항체를 생산하는 지를 결정하는 것을 통해 선별될 수 있다. 포유류 숙주 세포에 대한 적절한 발현 벡터는 널리 알려져 있다.

일정한 구체예에서, 항원 결합 단백질은 하나 또는 그 이상의 폴리펩티드를 포함한다. 일정한 구체예에서, 임의의 다양한 발현 벡터/숙주 시스템이 하나 또는 그 이상의 ABP 성분 또는 ABP 그 자체를 포함하는 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 분자를 발현하는데 활용될 수 있다. 이런 시스템에는 미생물, 예를 들면, 재조합 박테리오파지, 플라스미드, 또는 코스미드 DNA 발현 벡터로 형질전환된 박테리아; 효모 발현 벡터로 형질전환된 효모; 바이러스 발현 벡터 (가령, 배큘로바이러스)로 감염된 곤충 세포 시스템; 바이러스 발현 벡터 (가령, 꽃양배추 모자이크 바이러스, CaMV, 담배 모자이크 바이러스, TMV)로 형질감염된 또는 박테리아 발현 벡터 (가령, Ti 또는 pBR322 플라스미드)로 형질전환된 식물 세포 시스템; 또는 동물 세포 시스템이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.

일정한 구체예에서, 하나 또는 그 이상의 ABP 성분 또는 ABP 그 자체를 포함하는 폴리펩티드는 효모에서 재조합 방식으로 발현된다. 일정한 이런 구체예는 제조업체의 지시에 따라, 상업적으로 구입가능한 발현 시스템, 예를 들면, 피치아 (Pichia) 발현 시스템 (Invitrogen, San Diego, CA)을 이용한다. 일정한 구체예에서, 이런 시스템은 분비를 주동하기 위해 프리-프로-알파 서열에 의존한다. 일정한 구체예에서, 삽입물의 전사는 메탄올에 의한 유도 시에, 알코올 산화효소 (AOX1) 프로모터에 의해 주동된다.

일정한 구체예에서, 하나 또는 그 이상의 ABP 성분 또는 ABP 그 자체를 포함하는 분비된 폴리펩티드는 효모 성장 배지로부터 정제된다. 일정한 구체예에서, 폴리펩티드를 효모 성장 배지로부터 정제하는데 이용되는 방법은 폴리펩티드를 박테리아와 포유류 세포 상층액으로부터 정제하는데 이용되는 것들과 동일하다.

일정한 구체예에서, 하나 또는 그 이상의 ABP 성분 또는 ABP 그 자체를 포함하는 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산은 배큘로바이러스 발현 벡터, 예를 들면, pVL1393 (PharMingen, San Diego, CA) 내로 클로닝된다. 일정한 구체예에서, 이런 벡터는 스포도프테라 프루기페르다 (Spodoptera frugiperda) 세포를 sF9 단백질-없는 배지에서 감염시키고 재조합 폴리펩티드를 생산하기 위해 제조업체의 지시 (PharMingen)에 따라 이용될 수 있다. 일정한 구체예에서, 폴리펩티드는 정제되고, 그리고 헤파린-세파로오스 칼럼 (Pharmacia)을 이용하여 이런 배지로부터 농축된다.

일정한 구체예에서, 하나 또는 그 이상의 ABP 성분 또는 ABP 그 자체를 포함하는 폴리펩티드는 곤충 시스템에서 발현된다. 폴리펩티드 발현을 위한 일정한 곤충 시스템은 당업자에게 널리 알려져 있다. 한 가지 이와 같은 시스템에서, 아우토그라파 칼리포르니카 (Autographa californica) 핵 폴리헤드론형성 바이러스 (AcNPV)가 외래 유전자를 스포도프테라 프루기페르다 (Spodoptera frugiperda) 세포 또는 트리코플루시아 라바 (Trichoplusia larvae)에서 발현하기 위한 벡터로서 이용된다. 일정한 구체예에서, 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 분자는 바이러스의 비필수 유전자, 예를 들면, 폴리헤드린 유전자 내로 삽입되고, 그리고 상기 유전자에 대한 프로모터의 제어 하에 배치된다. 일정한 구체예에서, 핵산 분자의 성공적인 삽입은 비필수 유전자를 비활성으로 만들 것이다. 일정한 구체예에서, 이러한 비활성화는 검출가능한 특징을 유발한다. 가령, 폴리헤드린 유전자의 비활성화는 외피 단백질을 결여하는 바이러스의 생산을 유발한다.

일정한 구체예에서, 재조합 바이러스는 스포도프테라 프루기페르다 (S. frugiperda) 세포 또는 트리코플루시아 라바 (Trichoplusia larvae)를 감염시키는데 이용될 수 있다. 예로써, Smith et al., J. Virol., 46: 584 (1983); Engelhard et al., Proc. Nat. Acad. Sci. (USA), 91: 3224-7 (1994)을 참조한다.

일정한 구체예에서, 박테리아 세포에서 만들어진 하나 또는 그 이상의 ABP 성분 또는 ABP 그 자체를 포함하는 폴리펩티드는 박테리아 내에서 불용성 봉입체로서 생산된다. 일정한 구체예에서, 이런 봉입체를 포함하는 숙주 세포는 원심분리에 의해 수집되고; 0.15 M NaCl, 10 mM Tris, pH 8, 1 mM EDTA에서 세척되고; 그리고 0.1 mg/ml 리소자임 (Sigma, St. Louis, MO)으로 실온에서 15분 동안 처리된다. 일정한 구체예에서, 용해물은 초음파처리에 의해 투명해지고, 그리고 세포 잔해는 12,000 X g에서 10분 동안 원심분리에 의해 펠릿화된다. 일정한 구체예에서, 폴리펩티드-내포 펠릿은 50 mM Tris, pH 8, 그리고 10 mM EDTA에서 재현탁되고; 50% 글리세롤 위에 층을 이루고; 그리고 6000 X g에서 30분 동안 원심분리된다. 일정한 구체예에서, 이러한 펠릿은 Mg⁺⁺와 Ca⁺⁺가 없는 표준 인산염 완충 염수 용액 (PBS)에서 재현탁될 수 있다. 일정한 구체예에서, 폴리펩티드는 재현탁된 펠릿을 변성 SDS 폴리아크릴아미드 겔에서 분별함으로써 더욱 정제된다 (예로써, Sambrook et al., supra를 참조한다). 일정한 구체예에서, 이런 겔은 단백질을 가시화시키기 위해 0.4 M KCl에서 담길 수 있고, 이것은 절제되고 SDS를 결여하는 겔-이동 완충제에서 전기용리될 수 있다. 일정한 구체예에 따라서, 글루타티온-S-전이효소 (GST) 융합 단백질은 박테리아에서 가용성 단백질로서 생산된다. 일정한 구체예에서, 이런 GST 융합 단백질은 GST 정제 모듈 (Pharmacia)을 이용하여 정제되었다.

일정한 구체예에서, 일정한 폴리펩티드, 예를 들면, 하나 또는 그 이상의 ABP 성분 또는 ABP 그 자체를 포함하는 폴리펩티드를 "재접힘"하는 것이 바람직하다. 일정한 구체예에서, 이런 폴리펩티드는 본원에서 논의된 일정한 재조합 시스템을 이용하여 생산된다. 일정한 구체예에서, 폴리펩티드는 원하는 삼차 구조를 형성하고 및/또는 이황화 연쇄를 산출하기 위해 "재접힘"되고 및/또는 산화된다. 일정한 구체예에서, 이런 구조 및/또는 연쇄는 폴리펩티드의 일정한 생물학적 활성에 관련된다. 일정한 구체예에서, 재접힘은 당분야에 공지된 다양한 절차를 이용하여 달성된다. 예시적인 방법에는 가용화된 폴리펩티드 작용제를 무질서유발제 (chaotropic agent)의 존재에서 전형적으로 7 초과의 pH에 노출시키는 것이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 예시적인 무질서유발제는 구아니딘이다. 일정한 구체예에서, 재접힘/산화 용액은 또한, 환원제 및 환원제의 산화된 형태를 내포한다. 일정한 구체예에서, 환원제 및 이의 산화된 형태는 이황화 셔플링이 일어날 수 있도록 허용하는 특정 산화 환원 전위 (redox potential)를 산출하는 비율로 존재한다. 일정한 구체예에서, 이런 셔플링은 시스테인 가교의 형성을 가능하게 한다. 예시적인 산화 환원 커플에는 시스테인/시스타민, 글루타티온/디티오비스GSH, 염화 제2구리, 디티오트레이톨 DTT/디티안 DTT, 그리고 2-메르캅토에탄올 (bME)/디티오-bME가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 일정한 구체예에서, 재접힘의 효율을 증가시키기 위해 보조-용매가 이용된다. 예시적인 보조-용매에는 글리세롤, 다양한 분자량의 폴리에틸렌 글리콜, 그리고 아르기닌이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.

일정한 구체예에서, 하나 또는 그 이상의 ABP 성분 또는 ABP 그 자체를 포함하는 폴리펩티드는 실질적으로 정제된다. 일정한 단백질 정제 기술은 당업자에게 알려져 있다. 일정한 구체예에서, 단백질 정제는 비-폴리펩티드 분획물로부터 폴리펩티드 분획물의 가공 없는 분별을 수반한다. 일정한 구체예에서, 폴리펩티드는 크로마토그래피 및/또는 전기영동 기술을 이용하여 정제된다. 예시적인 정제 방법에는 황산암모늄으로 침전; PEG로 침전; 면역침전; 열 변성, 그 이후에 원심분리; 친화성 크로마토그래피 (가령, 단백질-A-세파로오스), 이온 교환 크로마토그래피, 배제 크로마토그래피, 그리고 역상 크로마토그래피가 포함되지만 이들에 국한되지 않는 크로마토그래피; 겔 여과; 히드록시아파티트 크로마토그래피; 등전위 초점; 폴리아크릴아미드 겔 전기영동; 그리고 이런 기술과 기타 기술의 조합이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 일정한 구체예에서, 폴리펩티드는 급속 단백질 액체 크로마토그래피에 의해 또는 고압 액체 크로마토그래피 (HPLC)에 의해 정제된다. 일정한 구체예에서, 정제 단계가 변화되거나 또는 일정한 단계가 생략될 수 있고, 그리고 실질적으로 정제된 폴리펩티드의 제조를 위한 적절한 방법이 여전히 산출된다.

일정한 구체예에서, 폴리펩티드 제조물의 정제의 정도가 정량된다. 정제의 정도를 정량하기 위한 일정한 방법은 당업자에게 알려져 있다. 일정한 예시적인 방법에는 제조물의 특이적 결합 활성을 결정하고, 그리고 제조물 내에서 폴리펩티드의 양을 SDS/PAGE 분석에 의해 평가하는 것이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 폴리펩티드 제조물의 정제의 양을 평가하기 위한 일정한 예시적인 방법은 제조물의 결합 활성을 계산하고, 그리고 이를 최초 추출물의 결합 활성에 비교하는 것을 포함한다. 일정한 구체예에서, 이런 계산의 결과는 "배수적 정제"로서 표시된다. 결합 활성의 양을 나타내는데 이용되는 단위는 수행된 특정 검정에 좌우된다.

일정한 구체예에서, 하나 또는 그 이상의 ABP 성분 또는 ABP 그 자체를 포함하는 폴리펩티드는 부분적으로 정제된다. 일정한 구체예에서, 부분 정제는 더욱 적은 정제 단계를 이용함으로써 또는 동일한 일반적 정제 계획의 상이한 형태를 이용함으로써 달성될 수 있다. 가령, 일정한 구체예에서, HPLC 기구를 활용하여 수행된 양이온 교환 칼럼 크로마토그래피는 일반적으로, 저압 크로마토그래피 시스템을 활용하는 동일한 기술보다 더욱 큰 "배수적 정제"를 유발할 것이다. 일정한 구체예에서, 더욱 낮은 정도의 정제를 유발하는 방법은 폴리펩티드의 전체 회수에서, 또는 폴리펩티드의 결합 활성 유지에서 이점을 가질 수 있다.

일정한 경우에, 폴리펩티드의 전기영동 이동은 SDS/PAGE의 상이한 조건에서, 때때로 유의미하게 변할 수 있다. 예로써, Capaldi et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 76: 425 (1977)를 참조한다. 상이한 전기영동 조건 하에, 정제된 또는 부분적으로 정제된 폴리펩티드의 겉보기 분자량은 상이할 수 있는 것으로 인지될 것이다.

예시적인 에피토프

항-PCSK9 항체가 결합하는 에피토프가 제공된다. 일부 구체예에서, 본원에서 개시된 항체에 의해 결합되는 에피토프가 특히 유용하다. 일부 구체예에서, 본원에서 설명된 항체에 의해 결합되는 임의의 에피토프에 결합하는 항원 결합 단백질이 유용하다. 일부 구체예에서, 표 2 및 도 2와 3에서 열거된 임의의 항체에 의해 결합된 에피토프가 특히 유용하다. 일부 구체예에서, 에피토프는 촉매 도메인 PCSK9 상에 있다.

일정한 구체예에서, PCSK9 에피토프는 PCSK9에 항-PCSK9 항체 또는 항원 결합 단백질의 결합을 예방하는데 (가령, 감소시키는데) 활용될 수 있다. 일정한 구체예에서, PCSK9 에피토프는 PCSK9에 항-PCSK9 항체 또는 항원 결합 단백질의 결합을 감소시키는데 활용될 수 있다. 일정한 구체예에서, PCSK9 에피토프는 PCSK9에 항-PCSK9 항체 또는 항원 결합 단백질의 결합을 실질적으로 저해하는데 활용될 수 있다.

일정한 구체예에서, PCSK9 에피토프는 PCSK9에 결합하는 항체 또는 항원 결합 단백질을 단리하는데 활용될 수 있다. 일정한 구체예에서, PCSK9 에피토프는 PCSK9에 결합하는 항체 또는 항원 결합 단백질을 산출하는데 활용될 수 있다. 일정한 구체예에서, PCSK9 에피토프 또는 PCSK9 에피토프를 포함하는 서열은 PCSK9에 결합하는 항체 또는 항원 결합 단백질을 산출하기 위한 면역원으로서 활용될 수 있다. 일정한 구체예에서, PCSK9 에피토프는 동물에 투여될 수 있고, 그리고 PCSK9에 결합하는 항체는 동물로부터 차후 획득될 수 있다. 일정한 구체예에서, PCSK9 에피토프 또는 PCSK9 에피토프를 포함하는 서열은 정상적인 PCSK9-매개된 활성, 예를 들면, PCSK9와 LDLR의 결합을 간섭하는데 활용될 수 있다.

일부 구체예에서, 본원에서 개시된 항원 결합 단백질은 N-말단 프로도메인, 서브틸리신-유사 촉매 도메인 및/또는 C-말단 도메인에 특이적으로 결합한다. 일부 구체예에서, 항원 결합 단백질은 PCSK-9의 기질-결합 그루부에 결합한다 (본원에서 전체로서 참고문헌으로 편입되는 Cunningham et al.에서 설명됨).

일부 구체예에서, 항체와 접촉하거나 또는 항체에 의해 묻히는 잔기를 내포하는 도메인(들)/영역(들)은 특정 잔기를 PCSK9 (가령, 야생형 항원)에서 돌연변이시키고, 그리고 항원 결합 단백질이 돌연변이된 또는 변이체 PCSK9 단백질에 결합할 수 있는 지를 결정함으로써 확인될 수 있다. 다수의 개별 돌연변이를 만듦으로써, 결합에서 직접적인 역할을 수행하거나, 또는 돌연변이가 항원 결합 단백질과 항원 사이의 결합에 영향을 줄 수 있을 만큼 항체에 충분히 가깝게 근접하는 잔기가 확인될 수 있다. 이들 아미노산의 지식으로부터, 항원 결합 단백질과 접촉하는 또는 항체에 의해 커버되는 잔기를 내포하는 항원의 도메인(들) 또는 영역(들)이 설명될 수 있다. 이런 도메인은 항원 결합 단백질의 결합 에피토프를 포함할 수 있다. 이러한 일반적 접근법의 한 가지 특정한 실례는 아르기닌/글루타민산 스캐닝 프로토콜을 활용한다 (예로써, Nanevicz, T., et al., 1995, J. Biol. Chem., 270:37, 21619-21625, 그리고 Zupnick, A., et al., 2006, J. Biol. Chem., 281:29, 20464-20473을 참조한다). 일반적으로, 아르기닌과 글루타민산은 야생형 폴리펩티드에서 아미노산에 대해 치환될 수 있는데 (전형적으로, 개별적으로), 그 이유는 이들 아미노산이 하전되고 부피가 크고, 따라서 돌연변이가 도입되는 항원의 영역 내에서 항원 결합 단백질과 항원 사이에 결합을 교란하는 잠재력을 갖기 때문이다. 야생형 항원 내에 존재하는 아르기닌은 글루타민산으로 대체된다. 다양한 이런 개별 돌연변이체가 획득되고, 그리고 수집된 결합 결과가 어떤 잔기가 결합에 영향을 주는 지를 결정하기 위해 분석된다.

항원 결합 단백질 및 본원에서 이용된 바와 같은 변이체 PCSK9 사이의 결합에서 변경 (가령, 감소 또는 증가)은 결합 친화성 (가령, 공지된 방법, 예를 들면, Biacore 검사 또는 하기 실시예에서 설명된 구슬 기초된 검정에 의해 측정됨), EC₅₀에서 변화, 및/또는 항원 결합 단백질의 총 결합 능력 (가령, 항원 결합 단백질 농도 대 항원 농도의 플롯에서 Bmax의 감소에 의해 증거됨)에서 변화 (가령, 감소)가 있음을 의미한다. 결합에서 유의미한 변경은 돌연변이된 잔기가 항원 결합 단백질에 대한 결합에 직접적으로 관여하거나 또는 결합 단백질이 항원에 결합될 때, 결합 단백질에 가깝게 근접한다는 것을 지시한다.

일부 구체예에서, 결합에서 유의미한 감소는 결합 친화성, EC₅₀, 및/또는 항원 결합 단백질과 돌연변이체 PCSK9 항원 사이에 수용력이 항원 결합 단백질 및 야생형 PCSK9 (가령, 서열번호 1 및/또는 서열번호 303에 도시됨) 사이의 결합에 비하여, 10% 이상, 20% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 55% 이상, 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상 또는 95% 이상 감소된다는 것을 의미한다. 일정한 구체예에서, 결합은 검출가능 한계 미만으로 감소된다. 일부 구체예에서, 결합에서 유의미한 감소는 변이체 PCSK9 단백질에 항원 결합 단백질의 결합이 항원 결합 단백질 및 야생형 PCSK9 단백질 (가령, 서열번호 1 및/또는 서열번호 303의 단백질) 사이에 관찰된 결합의 50% 이하 (가령, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15% 또는 10% 이하)일 때, 증거된다. 이런 결합 측정은 당분야에 공지된 다양한 결합 검정을 이용하여 달성될 수 있다.

일부 구체예에서, 야생형 PCSK9 단백질 (가령, 서열번호 1 또는 서열번호 303)에서 잔기가 아르기닌 또는 글루타민산으로 치환되는 변이체 PCSK9 단백질에 대한 훨씬 낮은 결합을 나타내는 항원 결합 단백질이 제공된다. 일부 구체예에서, 항원 결합 단백질의 결합은 야생형 PCSK9 단백질 (가령, 서열번호 1 또는 서열번호 303)과 비교하여, 하기 돌연변이: R207E, D208R, R185E, R439E, E513R, V538R, E539R, T132R, S351R, A390R, A413R, E582R, D162R, R164E, E167R, S123R, E129R, A311R, D313R, D337R, R519E, H521R, 그리고 Q554R 중에서 하나 또는 그 이상 (가령, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 또는 244)을 갖는 변이체 PCSK9 단백질에 대해 유의미하게 감소되거나 증가된다. 본원에서 이용된 속기 표기에서, 형식은 하기와 같다: 야생형 잔기: 폴리펩티드에서 위치: 돌연변이체 잔기, 여기서 잔기의 넘버링은 서열번호 1 또는 서열번호 303에서 지시된 바와 같다.

일부 구체예에서, 항원 결합 단백질의 결합은 야생형 PCSK9 단백질 (가령, 서열번호 1 또는 서열번호 303)과 비교하여, 서열번호 1 내에 하기 위치: 207, 208, 185, 181, 439, 513, 538, 539, 132, 351, 390, 413, 582, 162, 164, 167, 123, 129, 311, 313, 337, 519, 521, 그리고 554에서 하나 또는 그 이상 (가령, 1, 2, 3, 4, 5, 또는 그 이상)의 돌연변이를 갖는 돌연변이체 PCSK9 단백질에 대해 유의미하게 감소되거나 증가된다. 일부 구체예에서, 항원 결합 단백질의 결합은 야생형 PCSK9 단백질 (가령, 서열번호 1 또는 서열번호 303)과 비교하여, 서열번호 1 내에 하기 위치: 207, 208, 185, 181, 439, 513, 538, 539, 132, 351, 390, 413, 582, 162, 164, 167, 123, 129, 311, 313, 337, 519, 521, 그리고 554에서 하나 또는 그 이상 (가령, 1, 2, 3, 4, 5, 또는 그 이상)의 돌연변이를 갖는 돌연변이체 PCSK9 단백질에 대해 감소되거나 증가된다. 일부 구체예에서, 항원 결합 단백질의 결합은 야생형 PCSK9 단백질 (가령, 서열번호 1 또는 서열번호 303)과 비교하여, 서열번호 1 내에 하기 위치: 207, 208, 185, 181, 439, 513, 538, 539, 132, 351, 390, 413, 582, 162, 164, 167, 123, 129, 311, 313, 337, 519, 521, 그리고 554에서 하나 또는 그 이상 (가령, 1, 2, 3, 4, 5, 또는 그 이상)의 돌연변이를 갖는 돌연변이체 PCSK9 단백질에 대해 실질적으로 감소되거나 증가된다.

일부 구체예에서, ABP의 결합은 야생형 PCSK9 단백질 (가령, 서열번호 1 또는 서열번호 303)과 비교하여, 서열번호 1 또는 서열번호 303 내에 하기 돌연변이: R207E, D208R, R185E, R439E, E513R, V538R, E539R, T132R, S351R, A390R, A413R, E582R, D162R, R164E, E167R, S123R, E129R, A311R, D313R, D337R, R519E, H521R, 그리고 Q554R 중에서 하나 또는 그 이상 (가령, 1, 2, 3, 4, 5 등)을 갖는 돌연변이체 PCSK9 단백질에 대해 유의미하게 감소되거나 증가된다.

일부 구체예에서, ABP의 결합은 야생형 PCSK9 단백질 (가령, 서열번호 1 또는 서열번호 303)과 비교하여, 서열번호 1 또는 서열번호 303 내에 하기 돌연변이: R207E, D208R, R185E, R439E, E513R, V538R, E539R, T132R, S351R, A390R, A413R, 그리고 E582R 중에서 하나 또는 그 이상 (가령, 1, 2, 3, 4, 5 등)을 갖는 돌연변이체 PCSK9 단백질에 대해 유의미하게 감소되거나 증가된다. 일부 구체예에서, 결합은 감소된다. 일부 구체예에서, 결합에서 감소는 EC50에서 변화로서 관찰된다. 일부 구체예에서, EC50에서 변화는 EC50의 수치 값에서 증가이다 (따라서, 결합에서 감소이다).

일부 구체예에서, ABP의 결합은 야생형 PCSK9 단백질 (가령, 서열번호 1 또는 서열번호 303)과 비교하여, 서열번호 1 내에 하기 돌연변이: D162R, R164E, E167R, S123R, E129R, A311R, D313R, D337R, R519E, H521R, 그리고 Q554R 중에서 하나 또는 그 이상 (가령, 1, 2, 3, 4, 5 등)을 갖는 돌연변이체 PCSK9 단백질에 대해 유의미하게 감소되거나 증가된다. 일부 구체예에서, 결합은 감소된다. 일부 구체예에서, 결합에서 감소는 Bmax에서 변화로서 관찰된다. 일부 구체예에서, Bmax에서 변동은 ABP에 의해 산출된 최대 신호의 감소이다. 일부 구체예에서, 에피토프의 일부인 아미노산의 경우에, Bmax는 적어도 10% 감소된다, 예를 들면, 하기 양 중에서 적어도 한 가지: 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95, 98, 99, 또는 100 퍼센트의 감소는 일부 구체예에서, 잔기가 에피토프의 일부라는 것을 지시할 수 있다.

비록 단지 열거된 변이체 형태가 서열번호 1 또는 서열번호 303에서 도시된 야생형 서열에 관하여 참조되지만, PCSK9의 대립형질 변이체에서 지정된 위치에서 아미노산이 상이할 수 있는 것으로 인지될 것이다. PCSK9의 이런 대립형질 형태에 대한 훨씬 낮은 결합을 보이는 항원 결합 단백질 역시 예기된다. 따라서 일부 구체예에서, 임의의 전술한 구체예는 도 1A에 도시된 순수한 야생형 서열보다는 대립형질 서열에 비교될 수 있다.

일부 구체예에서, 항원 결합 단백질의 결합은 야생형 PCSK9 단백질 내에 선별된 위치에서 잔기가 임의의 다른 잔기로 돌연변이되는 변이체 PCSK9 단백질에 대해 유의미하게 감소된다. 일부 구체예에서, 본원에서 설명된 아르기닌/글루타민산 대체가 확인된 위치에 대해 이용된다. 일부 구체예에서, 알라닌이 확인된 위치에 대해 이용된다.

전술한 바와 같이, 결합에 직접적으로 관여하거나 또는 항원 결합 단백질에 의해 커버되는 잔기는 스캐닝 결과로부터 확인될 수 있다. 이들 잔기는 따라서, 항원 결합 단백질이 결합하는 결합 영역(들)을 내포하는 서열번호 1 (또는 서열번호 303 또는 서열번호 3)의 도메인 또는 영역의 표시를 제공할 수 있다. 실시예 39에 요약된 결과로부터 확인할 수 있는 바와 같이, 일부 구체예에서, 항원 결합 단백질은 서열번호 1 또는 서열번호 303의 아미노산: 207, 208, 185, 181, 439, 513, 538, 539, 132, 351, 390, 413, 582, 162, 164, 167, 123, 129, 311, 313, 337, 519, 521, 그리고 554 중에서 적어도 하나를 내포하는 도메인에 결합한다. 일부 구체예에서, 항원 결합 단백질은 서열번호 1 또는 서열번호 303의 아미노산 207, 208, 185, 181, 439, 513, 538, 539, 132, 351, 390, 413, 582, 162, 164, 167, 123, 129, 311, 313, 337, 519, 521, 그리고 554 중에서 적어도 하나를 내포하는 영역에 결합한다.

일부 구체예에서, 항원 결합 단백질은 서열번호 1 또는 서열번호 303의 아미노산 162, 164, 167, 207 및/또는 208 중에서 적어도 하나를 내포하는 영역에 결합한다. 일부 구체예에서, 확인된 잔기 중에서 하나 이상 (가령, 2, 3, 4, 또는 5)은 ABP에 의해 결합되는 영역의 일부이다. 일부 구체예에서, ABP는 ABP 21B12와 경쟁한다.

일부 구체예에서, 항원 결합 단백질은 서열번호 1 또는 서열번호 303의 아미노산 185의 적어도 하나를 내포하는 영역에 결합한다. 일부 구체예에서, ABP는 ABP 31H4와 경쟁한다.

일부 구체예에서, 항원 결합 단백질은 서열번호 1 또는 서열번호 303의 아미노산 439, 513, 538, 및/또는 539 중에서 적어도 하나를 내포하는 영역에 결합한다. 일부 구체예에서, 확인된 잔기 중에서 하나 이상 (가령, 2, 3, 또는 4)은 ABP에 의해 결합되는 영역의 일부이다. 일부 구체예에서, ABP는 ABP 31A4와 경쟁한다.

일부 구체예에서, 항원 결합 단백질은 서열번호 1 또는 서열번호 303의 아미노산 123, 129, 311, 313, 337, 132, 351, 390, 및/또는 413 중에서 적어도 하나를 내포하는 영역에 결합한다. 일부 구체예에서, 확인된 잔기 중에서 하나 이상 (가령, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 또는 9)은 ABP에 의해 결합되는 영역의 일부이다. 일부 구체예에서, ABP는 ABP 12H11과 경쟁한다.

일부 구체예에서, 항원 결합 단백질은 서열번호 1 또는 서열번호 303의 아미노산 582, 519, 521, 및/또는 554 중에서 적어도 하나를 내포하는 영역에 결합한다. 일부 구체예에서, 확인된 잔기 중에서 하나 이상 (가령, 2, 3, 또는 4)은 ABP에 의해 결합되는 영역의 일부이다. 일부 구체예에서, ABP는 ABP 3C4와 경쟁한다.

일부 구체예에서, 항원 결합 단백질은 서열번호 1 또는 서열번호 303의 단편 또는 전장 서열 내에 전술한 영역에 결합한다. 다른 구체예에서, 항원 결합 단백질은 이들 영역으로 구성되는 폴리펩티드에 결합한다. "서열번호 1 또는 서열번호 303"에 대한 언급은 이들 서열 중에서 한쪽 또는 양쪽이 이용되거나 적절할 수 있다는 것을 의미한다. 상기 관용구는 단지 하나만 이용될 수 있다는 것을 의미하지 않는다.

전술한 바와 같이, 상기 설명은 서열번호 1에 관하여 특정한 아미노산 위치를 언급한다. 하지만, 본 명세서 전반에서 일반적으로, 서열번호 3에서 제공되는, 위치 31에서 시작하는 Pro/Cat 도메인이 참조된다. 후술한 바와 같이, 서열번호 1과 서열번호 303은 PCSK9의 신호 서열을 결여한다. 따라서 이들 다양한 개시 사이에 임의의 비교는 넘버링에서 이러한 차이를 고려해야 한다. 특히, 서열번호 1에서 임의의 아미노산 위치는 서열번호 3에서 단백질 내로 추가의 30개 아미노산의 아미노산 위치에 상응할 것이다. 가령, 서열번호 1의 위치 207은 서열번호 3 (전장 서열, 그리고 본 명세서에서 전반적으로 이용된 넘버링 시스템)의 위치 237에 상응한다. 표 39.6은 서열번호 1 (및/또는 서열번호 303)을 참조하는 전술한 위치가 서열번호 3 (신호 서열을 포함한다)에 어떻게 상응하는 지를 개설한다. 따라서 서열번호 1 (및/또는 서열번호 303)에 관해 설명되는 임의의 전술한 구체예는 참고된 상응하는 위치에 의해, 서열번호 3에 관해 설명된다.

일부 구체예에서, ABP 21B12는 잔기 162-167 (가령, 서열번호 1의 잔기 D162-E167)을 내포하는 에피토프에 결합한다. 일부 구체예에서, ABP 12H11은 잔기 123-132 (가령, 서열번호 1의 S123-T132)를 내포하는 에피토프에 결합한다. 일부 구체예에서, ABP 12H11은 잔기 311-313 (가령, 서열번호 1의 A311-D313)을 내포하는 에피토프에 결합한다. 일부 구체예에서, ABP는 서열의 이들 가닥 중에서 임의의 한 가지를 내포하는 에피토프에 결합할 수 있다.

경쟁성 항원 결합 단백질

다른 양상에서, PCSK9에 특정한 결합에 대해, 본원에서 설명된 에피토프에 결합하는 구현된 항체 또는 기능성 단편 중에서 하나와 경쟁하는 항원 결합 단백질이 제공된다. 이런 항원 결합 단백질은 또한, 본원에서 구현된 항원 결합 단백질 중에서 하나와 동일한 에피토프 또는 중복 에피토프에 결합한다. 구현된 항원 결합 단백질과 경쟁하거나 또는 구현된 항원 결합 단백질과 동일한 에피토프에 결합하는 항원 결합 단백질과 단편은 유사한 기능성 성질을 나타낼 것으로 예상된다. 구현된 항원 결합 단백질과 단편에는 표 2 및/또는 도 2-3 내에 포함된 중쇄와 경쇄, 가변 영역 도메인과 CDR을 갖는 것들을 비롯하여, 앞서 설명된 것들이 포함된다. 따라서 특정한 실례로서, 제공되는 항원 결합 단백질에는 하기를 갖는 항체 또는 항원 결합 단백질과 경쟁하는 것들이 포함된다:

(a) 도 2-3에서 열거된 항체에 대해 열거된 6개의 CDR 모두;

(b) 표 2에서 열거된 항체에 대해 열거된 VH와 VL; 또는

(c) 표 2에서 열거된 항체에 대해 명시된 바와 같은 2개의 경쇄와 2개의 중쇄.

치료적 제약학적 제제와 투여

본 발명은 PCSK9에 대한 항원 결합 단백질을 내포하는 제약학적 제제를 제공한다. 본원에서 이용된 바와 같이, "제약학적 제제"는 병든 환자에 비경구 투여 (정맥내, 근육내, 피하, 에어로졸화, 폐내, 코내, 또는 척추강내가 포함되지만 이들에 국한되지 않음)에 적합하고, 그리고 제약학적으로 허용되는 부형제, 희석제, 그리고 Federal Drug Administration 또는 다른 외국 국가 기관에 의해 안전한 것으로 인증된 기타 첨가제만을 포함하는, 제약학적으로 활성 약물, 다시 말하면, PCSK9에 대한 적어도 하나의 항원 결합 단백질의 무균 조성물이다. 제약학적 제제는 직접적으로 투여될 수 있는 액체, 예를 들면, 수성 용액, 그리고 투여에 앞서 희석제를 첨가함으로써 용액으로 재구성될 수 있는 냉동 건조된 분말을 포함한다. 환자에 국소 투여를 위한 조성물, 경구 섭취용 조성물, 그리고 비경구 투입을 위한 조성물은 "제약학적 제제"의 용어의 범위로부터 특정적으로 제외된다.

일정한 구체예에서, 제약학적 제제는 안정된 제약학적 제제이다. 본원에서 이용된 바와 같이, 관용구, "안정된 제약학적 제제", "안정된 제제" 또는 "제약학적 제제는 안정하다"는 대조 제조 시료와 비교하여, 2-8℃에서 적어도 1개월, 또는 2개월, 또는 3개월, 또는 6개월, 또는 1년 또는 2년 동안 보관될 때, 5% 이하의 증가된 집합 및/또는 생물학적 활성의 감소된 상실을 나타내는 생물학적으로 활성 단백질의 제약학적 제제를 지칭한다. 제제 안정성은 크기 배제 HPLC ("SEC-HPLC"), 양이온 교환 HPLC (CEX-HPLC), 광 차폐에 의한 육안으로 보이지 않는 입자 검출 ("HIAC") 및/또는 육안 검사가 포함되지만 이들에 국한되지 않는, 다수의 표준 검정을 이용하여 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있다.

일정한 구체예에서, 제약학적 제제는 표 2 및 도 2 및/또는 3과 도 48A와 48B에서 묘사된 PCSK9에 대한 임의의 항원 결합 단백질을 포함한다. 일정한 다른 구체예에서, 제약학적 제제는 PCSK9에 대한 다른 항원 결합 단백질; 다시 말하면, 경쇄 가변 도메인, 서열번호 588 및 중쇄 가변 도메인, 서열번호 589로 구성되는 항체를 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 제약학적 제제는 21B12, 26H5, 31H4, 8A3, 11F1 또는 8A1 중에서 임의의 한 가지를 포함한다.

일부 구체예에서, 제약학적 제제는 PCSK9에 대한 하나 이상의 상이한 항원 결합 단백질을 포함한다. 일정한 구체예에서, 제약학적 제제는 PCSK9에 대한 하나 이상의 항원 결합 단백질을 포함하고, 여기서 PCSK9에 대한 항원 결합 단백질은 하나 이상의 에피토프에 결합한다. 일부 구체예에서, 다양한 항원 결합 단백질은 PCSK9에 결합에 대해 서로 경쟁하지 않을 것이다. 일부 구체예에서, 표 2 및 도 2 및/또는 3에서 묘사된 임의의 항원 결합 단백질은 제약학적 제제 내에서 함께 합동될 수 있다.

일정한 구체예에서, PCSK9에 대한 항원 결합 단백질 및/또는 치료적 분자는 당분야에 공지된 반감기 연장 운반체에 연결된다. 이런 운반체에는 폴리에틸렌 글리콜, 글리코겐 (가령, ABP의 당화), 그리고 덱스트란이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 이런 운반체는 예로써, 본원에 순전히 참고문헌으로 편입되는 U.S. Application Serial No. 09/428,082, US Patent No. 6,660,843 및 공개된 PCT Application No. WO 99/25044에서 설명된다.

일정한 구체예에서, 허용되는 제제 물질은 바람직하게는, 이용된 용량과 농도에서 수용자에게 비독성이다. 일부 구체예에서, 제제 물질(들)은 s.c. 및/또는 I.V. 투여용이다. 일정한 구체예에서, 제약학적 제제는 예로써, 조성물의 pH, 오스몰농도, 점도, 투명도, 색채, 등장성, 향기, 멸균율, 안정성, 용해 또는 방출의 속도, 흡착 또는 침투를 변경하거나, 유지하거나 또는 보존하기 위한 제제 물질을 포함한다.

일정한 구체예에서, 적절한 제제 물질에는 아미노산 (가령, 프롤린, 아르기닌, 리신, 메티오닌, 타우린, 글리신, 글루타민, 또는 아스파라긴); 항균제; 항산화제 (가령, 아스코르빈산, 아황산나트륨 또는 아황산수소나트륨); 완충제 (가령, 붕산염, 중탄산염, 인산나트륨 ("NaOAC"), Tris-HCl, Tris 완충제, 구연산염, 인산염 완충제, 인산염-완충 염수 (즉, PBS 완충제) 또는 기타 유기산); 증량제 (가령, 만니톨 또는 글리신); 킬레이트화제 (가령, 에틸렌디아민 테트라 아세트산 (EDTA)); 착화제 (가령, 카페인, 폴리비닐피롤리돈, 베타-시클로덱스트린 또는 히드록시프로필-베타-시클로덱스트린); 충전제; 단당류; 이당류; 그리고 기타 탄수화물 (가령, 글루코오스, 수크로오스, 프럭토오스, 락토오스, 만노오스, 트레할로스, 또는 덱스트린); 단백질 (가령, 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린); 착색제, 풍미제와 희석제; 유화제; 친수성 중합체 (가령, 폴리비닐피롤리돈); 저분자량 폴리펩티드; 염-형성 반대 이온 (가령, 나트륨); 보존제 (가령, 염화벤잘코늄, 벤조산, 살리실산, 치메로살, 페네틸 알코올, 메틸파라벤, 프로필파라벤, 클로르헥시딘, 소르빈산 또는 과산화수소); 용매 (가령, 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜); 당 알코올 (가령, 만니톨 또는 소르비톨); 현탁제; 계면활성제 또는 습윤제 (가령, 플루로닉스, PEG, 소르비탄 에스테르, 폴리소르베이트, 예를 들면, 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 80, 트리톤, 트로메타민, 레시틴, 콜레스테롤, 티록사폴); 안정성 증강제 (가령, 수크로오스 또는 소르비톨); 토니시티 증강제 (가령, 알칼리 금속 할로겐화물, 바람직하게는, 염화나트륨 또는 염화칼륨, 만니톨 소르비톨); 전달 운반체; 희석제; 부형제 및/또는 제약학적 어쥬번트가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. (Remington's Pharmaceutical Sciences, 18^th Edition, A.R. Gennaro, ed., Mack Publishing Company(1995).

일정한 구체예에서, 최적 제약학적 제제는 예로써, 의도된 투여 루트, 전달 형식 및 원하는 용량에 따라, 당업자에 의해 결정될 것이다. 예로써, Remington's Pharmaceutical Sciences, supra를 참조한다. 일정한 구체예에서, 이런 제제는 본 발명의 항체의 물리적 상태, 안정성, 생체내 방출 속도 및 생체내 청소 속도에 영향을 줄 수도 있다.

한 양상에서, 제약학적 제제는 높은 농도의 PCSK9에 대한 항원 결합 단백질을 포함한다. 일정한 구체예에서, ABP 농도는 약 70 mg/ml 내지 약 250 mg/ml, 예를 들면, 약 70 mg/ml, 약 80 mg/ml, 약 90 mg/ml, 약 100 mg/ml, 약 100 mg/ml, 약 120 mg/ml, 약 130 mg/ml, 약 140 mg/ml, 약 150 mg/ml, 약 160 mg/ml, 약 170 mg/ml, 약 180 mg/ml, 약 190 mg/ml, 약 200 mg/ml, 약 210 mg/ml, 약 220 mg/ml, 약 230 mg/ml, 약 240 mg/ml, 또는 약 250 mg/ml, 그리고 중간에 모든 값을 포함하는 범위에서 변한다. 일부 구체예에서, 21B12, 26H5, 또는 31H4의 농도는 약 100 mg/ml 내지 약 150 mg/ml, 예를 들면, 100 mg/ml, 약 100 mg/ml, 약 120 mg/ml, 약 130 mg/ml, 약 140 mg/ml, 또는 약 150 mg/ml 범위에서 변한다. 일부 구체예에서, 8A3, 11F1 또는 8A1의 농도는 약 140 mg/ml 내지 약 220 mg/ml, 예를 들면, 140 mg/ml, 약 150 mg/ml, 약 160 mg/ml, 약 170 mg/ml, 약 180 mg/ml, 약 190 mg/ml, 약 200 mg/ml, 약 210 mg/ml, 약 220 mg/ml, 또는 약 250 mg/ml 범위에서 변한다.

다른 양상에서, 제약학적 제제는 적어도 하나의 완충 작용제, 예를 들면, 가령 아세트산나트륨, 염화나트륨, 인산염, 인산염 완충 염수 ("PBS"), 및/또는 약 pH 7.0-8.5의 Tris 완충제를 포함한다. 완충제는 생리학적으로 적절한 pH를 유지시키는 역할을 한다. 이에 더하여, 완충제는 제약학적 제제의 등장성과 화학적 안정성을 증강하는 역할을 할 수 있다. 일정한 구체예에서, 완충 작용제는 중간에 모든 값을 포함하여, 약 0.05 mM 내지 약 40 mM, 예를 들면, 약 0.05 mM, 약 0.1 mM, 약 0.5 mM, 약 1.0 mM, 약 5.0 mM, 약 10 mM, 약 15 mM, 약 20 mM, 약 30 mM, 약 40 mM, 약 50 mM, 약 60 mM, 약 70 mM, 약 80 mM, 약 90 mM, 또는 약 100 nM 완충 작용제의 범위에서 변한다. 일정한 구체예에서, 완충제는 NaOAC이다. 제약학적 제제의 예시적인 pH는 약 4 내지 약 6, 또는 약 4.8 내지 약 5.8, 또는 약 5.0 내지 약 5.2, 또는 약 5, 또는 약 5.2를 포함한다.

일정한 구체예에서, 제약학적 제제는 약 250 내지 약 350 밀리오스몰 (miliosmol)/kg, 예를 들면, 약 250 mOsm/kg, 약 260 mOsm/kg, 약 270 mOsm/kg, 약 280 mOsm/kg, 약 290 mOsm/kg, 약 300 mOsm/kg, 약 310 mOsm/kg, 약 320 mOsm/kg, 약 330 mOsm/kg, 약 340 mOsm/kg, 또는 약 350 mOsm/kg, 그리고 중간에 모든 값을 포함하는 범위에서 변하는 삼투질 농도와 등장성이다. 본원에서 이용된 바와 같이, "삼투질 농도"는 용질 대 용적 유체의 비율의 적도이다. 다시 말하면, 이것은 용액의 킬로그램당 분자와 이온 (또는 분자)의 숫자이다. 삼투질 농도는 삼투압계로 불리는 분석 기구, 예를 들면, Advanced Instruments 2020 다중-시료 삼투압계, Norwood, MA에서 측정될 수 있다. Advanced Instrumetns 2020 다중-시료 삼투압계는 어는점 내림 (Freezing Point Depression) 방법을 이용함으로써 삼투질 농도를 측정한다. 용액 내에 삼투물질이 많을수록, 이것이 동결하는 온도가 하락한다. 삼투질 농도는 또한, 임의의 다른 방법을 이용하여, 그리고 당분야에 공지된 임의의 다른 단위, 예를 들면, 선형 외삽에서 측정될 수 있다.

또 다른 양상에서, 제약학적 제제는 폴리소르베이트-80, 폴리소르베이트-60, 폴리소르베이트-40, 그리고 폴리소르베이트-20이 포함되지만 이들에 국한되지 않는 적어도 하나의 계면활성제를 포함한다. 일정한 구체예에서, 제약학적 제제는 제제의 용적당 약 0.004% 내지 약 10% 중량 ("w/v"), 예를 들면, 제제의 약 0.004%, 약 0.005%, 약 0.006%, 약 0.007%, 약 0.008%, 약 0.009%, 약 0.01%, 약 0.05%, 약 0.1%, 약 0.5%, 약 1%, 약 5%, 또는 약 10% 계면활성제 w/v 범위에서 변하는 농도에서 계면활성제를 포함한다. 일정한 구체예에서, 제약학적 제제는 제제의 약 0.004% 내지 약 0.1% w/v 범위에서 변하는 농도에서 폴리소르베이트 80을 포함한다. 일정한 구체예에서, 제약학적 제제는 제제의 약 0.004% 내지 약 0.1% w/v 범위에서 변하는 농도에서 폴리소르베이트 20을 포함한다.

일정한 구체예에서, 제약학적 제제는 적어도 하나의 안정화제, 예를 들면, 폴리히드록시 탄화수소 (소르비톨, 만니톨, 글리세롤 및 덜시톨이 포함되지만 이들에 국한되지 않음) 및/또는 이당류 (수크로오스, 락토오스, 말토오스 및 트레할로스가 포함되지만 이들에 국한되지 않음) 및/또는 아미노산 (프롤린, 아르기닌, 리신, 메티오닌, 그리고 타우린이 포함되지만 이들에 국한되지 않음) 및/또는 벤질 알코올을 포함한다; 상기 폴리히드록시 탄화수소 및/또는 이당류 및/또는 아미노산 및/또는 벤질 알코올의 총합은 제제의 약 0.5% 내지 약 10% w/v이다. 일정한 구체예에서, 제약학적 제제는 약 1%, 약 2%, 약 3%, 약 4%, 약 5%, 약 6%, 약 7%, 약 8%, 약 9% 또는 약 10% 수크로오스의 농도에서 안정화제를 포함한다. 일정한 구체예에서, 제약학적 제제는 약 5% 수크로오스의 농도에서 안정화제를 포함한다. 일정한 구체예에서, 제약학적 제제는 약 1%, 약 2%, 약 3%, 약 4%, 약 5%, 약 6%, 약 7%, 약 8%, 약 9% 또는 약 10% 소르비탈의 농도에서 안정화제를 포함한다. 일정한 구체예에서, 제약학적 제제는 약 9% 소르비탈의 농도에서 안정화제를 포함한다. 일정한 구체예에서, 제약학적 제제는 약 1%, 약 2%, 약 3%, 약 4%, 약 5% 프롤린, 아르기닌, 리신, 메티오닌, 및/또는 타우린의 농도에서 안정화제를 포함한다. 일정한 구체예에서, 제약학적 제제는 약 2-3% 프롤린의 농도에서 안정화제를 포함한다. 일정한 구체예에서, 제약학적 제제는 약 1%, 약 2%, 약 3%, 약 4%, 약 5% 벤질 알코올의 농도에서 안정화제를 포함한다. 일정한 구체예에서, 제약학적 제제는 약 1-2% 벤질 알코올의 농도에서 안정화제를 포함한다.

한 양상에서, 제약학적 제제는 실온 (즉, 25℃)에서 측정될 때, 약 30 센티푸아즈 (cP) 이하의 점도 수준을 갖는다. 본원에서 이용된 바와 같이, "점도"는 흐름에 대한 유체의 저항이고, 그리고 센티푸아즈 (cP) 또는 밀리파스칼-초 (mPa-s)의 단위에서 측정될 수 있는데, 여기서 소정의 전단 속도에서 1 cP=1 mPa-s. 점도는 점도계, 예를 들면, Brookfield Engineering Dial Reading Viscometer, 모델 LVT를 이용함으로써 측정될 수 있다. 점도는 또한, 임의의 다른 방법을 이용하여, 그리고 당분야에 공지된 임의의 다른 단위 (가령, 절대, 운동학적 또는 동적 점도 또는 절대 점도)에서 측정될 수 있다. 일정한 구체예에서, 제약학적 제제는 약 25 cP, 약 20 cP, 약 18 cP, 약 15 cP, 약 12 cP, 약 10 cP; 약 8 cP, 약 6 cP, 약 4 cP; 약 2 cP; 또는 약 1 cP 이하의 점도 수준을 갖는다.

한 양상에서, 제약학적 제제는 당업자에게 공지된 적어도 하나의 안정성 검정, 예를 들면, 시간의 흐름에서 생물학적으로 활성 단백질의 생물물리학적 또는 생화학적 특징을 조사하는 검정에 의해 측정될 때 안정하다. 전술한 바와 같이, 본 발명의 안정된 제약학적 제제는 대조 제조 시료와 비교하여, 2-8℃에서 적어도 1개월, 또는 2개월, 또는 3개월, 또는 6개월, 또는 1년 또는 2년 동안 보관될 때, 5% 이하의 증가된 집합 및/또는 생물학적 활성의 감소된 상실을 나타내는 생물학적으로 활성 단백질의 제약학적 제제이다. 일정한 구체예에서, 제약학적 제제 안정성은 크기 배제 HPLC ("SEC-HPLC")를 이용하여 측정된다. SEC-HPLC는 수력학적 용적에서 차이에 기초하여 단백질을 분리한다. 더욱 큰 수력학적 단백질 용적을 갖는 분자는 더욱 작은 용적을 갖는 분자보다 일찍 용리한다. SEC-HPLC의 경우에, 안정된 제약학적 제제는 대조 시료와 비교하여, 고분자량 종류에서 단지 약 5%의 증가를 나타내야 한다. 일정한 다른 구체예에서, 제약학적 제제는 대조 시료와 비교하여, 고분자량 종류에서 단지 약 4%, 단지 약 3%, 단지 약 2%, 단지 약 1%, 단지 약 0.5% 증가를 보여야 한다.

일정한 구체예에서, 제약학적 제제 안정성은 양이온 교환 HPLC (CEX-HPLC)를 이용하여 측정된다. CEX-HPLC는 표면 전하에서 차이에 기초하여 단백질을 분리한다. 설정된 pH에서, 항-PCSK9 ABP의 하전된 동종형은 양이온 교환 칼럼 상에서 분리되고 염 구배 (salt gradient)를 이용하여 용리된다. 용리액은 UV 흡광도에 의해 모니터링된다. 하전된 동종형 분포는 각 동종형의 피크 면적을 총 피크 면적의 퍼센트로서 결정함으로써 평가된다. CEX-HPLC의 경우에, 안정된 제약학적 제제는 대조 시료와 비교하여, 주요 동종형 피크에서 단지 약 5% 감소를 보여야 한다. 일정한 다른 구체예에서, 안정된 제약학적 제제는 대조 시료와 비교하여, 주요 동종형 피크에서 단지 약 3% 내지 약 5% 감소를 보여야 한다. 일정한 구체예에서, 제약학적 제제는 대조 시료와 비교하여, 주요 동종형 피크에서 단지 약 4% 감소, 단지 약 3% 감소, 단지 약 2% 감소, 단지 약 1% 감소, 단지 약 0.5% 감소를 보여야 한다.

일정한 구체예에서, 제약학적 제제 안정성은 광 차폐에 의한 육안으로 보이지 않는 입자 검출 ("HIAC")을 이용하여 측정된다. 액체 시료채집기가 구비된 광-방해 센서 (HIAC/Royco HRLD-150 또는 등가물)를 내포하는 전자, 액체-매개된 입자-계수 시스템 (HIAC/Royco 9703 또는 등가물)은 소정의 검사 시료에서 입자의 숫자 및 그들의 크기 범위를 정량한다. 액체 내에 입자가 광원과 검출기 사이를 통과할 때, 이들은 검출기에 들어가는 광의 빔을 점감시키거나 또는 "방해한다." 입자의 농도가 센서의 정상적인 범위 내에 있을 때, 이들 입자는 하나씩 검출된다. 검출 존을 통한 각 입자의 통과는 광-검출기 상에서 입사 광 (incident light)을 감소시키고, 그리고 광-검출기의 전압 출력이 순간적으로 감소한다. 전압에서 변화는 전기 펄스로서 등록되고, 이들은 상기 기구에 의해 존재하는 입자의 숫자로 전환된다. 이러한 방법은 비-특이적이고, 그리고 기원에 상관없이 입자를 측정한다. 모니터링된 입자 크기는 일반적으로, 10 um, 그리고 25 um이다. HIAC의 경우에, 안정된 제약학적 제제는 대조 시료와 비교하여, 용기 (또는 단위)당 단지 6000개의 10μm 입자를 보여야 한다. 일정한 구체예에서, 안정된 제약학적 제제는 대조 시료와 비교하여, 용기 (또는 단위)당 단지 5000, 단지 4000, 단지 3000, 단지 2000, 단지 1000개의 10μm 입자를 보여야 한다. 또 다른 구체예에서, 안정된 제약학적 제제는 대조 시료와 비교하여, 용기 (또는 단위)당 단지 600개의 25μm 입자를 보여야 한다. 일정한 구체예에서, 안정된 제약학적 제제는 대조 시료와 비교하여, 용기 (또는 단위)당 단지 500, 단지 400, 단지 300, 단지 200, 단지 100, 단지 50개의 25μm 입자를 보여야 한다.

일정한 구체예에서, 제약학적 제제 안정성은 육안 평가를 이용하여 측정된다. 육안 평가는 시료의 가시적인 물리적 특징을 설명하는데 이용되는 정성적 방법이다. 시료는 평가되는 특징 (가령, 색채, 투명도, 입자 또는 이물의 존재)에 따라, 검사 부스의 검은 및/또는 흰 배경을 배경으로 하여 조사된다. 시료는 또한, 유백광 참고 표준 및 색채 참고 표준을 배경으로 하여 조사된다. 육안 평가의 경우에, 안정된 제약학적 제제는 대조 시료와 비교하여, 색채, 투명도, 입자 또는 이물의 존재에서 유의미한 변화를 보이지 않아야 한다.

본 발명의 한 가지 양상은 하기를 포함하는 제약학적 제제이다: (i) 약 70 mg/ml 내지 약 250 mg/ml의 PCSK9에 대한 항원 결합 단백질; (ii) 약 0.05 mM 내지 약 40 mM의 완충제, 예를 들면, 아세트산나트륨 ("NaOAC")은 완충 작용제로서 역할한다; (iii) 약 1% 내지 약 5% 프롤린, 아르기닌, 리신, 메티오닌, 또는 타우린 (또한, 2-아미노에탄술폰산으로 알려져 있음) 및/또는 0.5% 내지 약 5% 벤질 알코올, 이것은 안정화제로서 역할한다; 그리고 (iv) 약 0.004% 내지 약 10% w/v의 비-이온성 계면활성제 제제 (폴리소르베이트-80, 폴리소르베이트-60, 폴리소르베이트-40, 그리고 폴리소르베이트-20이 포함되지만 이들에 국한되지 않음); 여기서 상기 제제는 약 4.0 내지 6.0의 범위에서 pH를 갖는다. 일정한 다른 구체예에서, 본 발명의 제약학적 제제는 (i) 적어도 약 70 mg/ml, 약 100 mg/ml, 약 120 mg/ml, 약 140 mg/ml, 약 150 mg/ml, 약 160 mg/ml, 약 170 mg/ml, 약 180 mg/ml, 약 190 mg/ml, 약 200 mg/ml의 항-PCSK9 항체; (ii) 약 10 mM NAOAC; (iii) 약 0.01% 폴리소르베이트 80; 그리고 (iv) 약 2% 내지 3% 프롤린 (또는 약 250 mM 내지 약 270 mM 프롤린)을 포함하고, 여기서 상기 제제는 약 5의 pH를 갖는다. 일정한 다른 구체예에서, 본 발명의 제약학적 제제는 (i) 적어도 약 70 mg/ml, 약 100 mg/ml, 약 120 mg/ml, 약 140 mg/ml의 항-PCSK9 항체, 21B12, 26H5 및/또는 31H4; (ii) 약 10 mM NAOAC; (iii) 약 0.01% 폴리소르베이트 80; 그리고 (iv) 약 2% 내지 3% 프롤린 (또는 약 250 mM 내지 약 270 mM 프롤린)를 포함하고, 여기서 상기 제제는 약 5의 pH를 갖는다. 일정한 다른 구체예에서, 본 발명의 제약학적 제제는 (i) 적어도 약 150 mg/ml, 약 160 mg/ml, 약 170 mg/ml, 약 180 mg/ml, 약 190 mg/ml, 약 200 mg/ml의 항-PCSK9 항체, 8A3, 11F1 및/또는 8A1; (ii) 약 10 mM NAOAC; (iii) 약 0.01% 폴리소르베이트 80; 그리고 (iv) 약 2% 내지 3% 프롤린 (또는 약 250 mM 내지 약 270 mM 프롤린)을 포함하고, 여기서 상기 제제는 약 5의 pH를 갖는다.

본 발명의 한 양상은 하기를 포함하는 제약학적 제제이다: (i) 적어도 약 70 mg/ml 내지 약 250 mg/ml의 항-PCSK9 항체; (ii) 약 5 mM 내지 약 20 mM의 완충제, 예를 들면, NAOAC; (iii) 상기 제제의 약 1% 내지 약 10% w/v는 폴리히드록시 탄화수소, 예를 들면, 소르비톨, 또는 이당류, 예를 들면, 수크로오스를 포함한다; 그리고 (iv) 상기 제제의 약 0.004% 내지 약 10% w/v의 계면활성제, 예를 들면, 폴리소르베이트 20 또는 폴리소르베이트 80; 여기서 상기 제제는 약 4.8 내지 5.8의 범위에서 pH를 갖고; 그리고 여기서 제약학적 제제는 점도를 감소시키는 역할을 하는 약 80 mM 내지 약 300 mM 프롤린, 아르기닌, 리신, 메티오닌, 또는 타우린 및/또는 0.5% 내지 약 5% 벤질 알코올을 선택적으로 포함한다. 일정한 다른 구체예에서, 본 발명의 제약학적 제제는 (i) 적어도 약 70 mg/ml 내지 약 250 mg/ml의 항-PCSK9 항체; (ii) 약 10 mM NAOAC; (iii) 약 9% 수크로오스; 그리고 (iv) 약 0.004% 폴리소르베이트 20을 포함하고, 여기서 상기 제제는 약 5.2의 pH를 갖는다. 일정한 다른 구체예에서, 본 발명의 제약학적 제제는 (i) 적어도 약 70 mg/ml, 약 100 mg/ml, 약 120 mg/ml, 약 140 mg/ml, 약 160 mg/ml, 약 180 mg/ml, 약 200 mg/ml의 항-PCSK9 항체; (ii) 약 15 mM NAOAC; (iii) 약 9% 수크로오스; 그리고 (iv) 약 0.01% 폴리소르베이트 20을 포함하고, 여기서 상기 제제는 약 5.2의 pH를 갖는다. 일정한 다른 구체예에서, 본 발명의 제약학적 제제는 (i) 적어도 약 70 mg/ml, 약 100 mg/ml, 약 120 mg/ml, 약 140 mg/ml, 약 160 mg/ml, 약 180 mg/ml, 약 200 mg/ml의 항-PCSK9 항체; (ii) 약 20 mM NAOAC; (iii) 약 9% 수크로오스; 그리고 (iv) 약 0.01% 폴리소르베이트 20을 포함하고, 여기서 상기 제제는 약 5.2의 pH를 갖는다. 일정한 다른 구체예에서, 본 발명의 제약학적 제제는 (i) 적어도 약 70 mg/ml, 약 100 mg/ml, 약 120 mg/ml, 약 140 mg/ml, 약 160 mg/ml, 약 180 mg/ml, 약 200 mg/ml의 항-PCSK9 항체; (ii) 약 10 mM NAOAC; (iii) 약 9% 수크로오스; (iv) 약 0.01% 폴리소르베이트 80; 그리고 (v) 약 250 mM 프롤린을 포함하고, 여기서 상기 제제는 약 5의 pH를 갖는다.

본 발명의 제약학적 제제는 복합 요법에서 투여될 수 있다, 다시 말하면, 다른 작용제와 합동될 수 있다. 일정한 구체예에서, 복합 요법은 적어도 하나의 항-콜레스테롤 작용제와 공동으로, PCSK9에 결합할 수 있는 항원 결합 단백질을 포함한다. 작용제에는 시험관내에서 합성 제조된 화학적 제제, 항체, 항원 결합 영역, 그리고 이들의 조합과 접합체가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 일정한 구체예에서, 작용제는 효능제, 길항제, 알로스테릭 조절제, 또는 독소로서 기능할 수 있다. 일정한 구체예에서, 작용제는 표적을 저해하거나 자극하고 (가령, 수용체 또는 효소 활성화 또는 저해), 따라서 LDLR의 증가된 발현을 증진하거나 또는 혈청 콜레스테롤 수준을 감소시키는 기능을 할 수 있다.

일정한 구체예에서, PCSK9에 대한 항원 결합 단백질은 콜레스테롤-저하 (혈청 및/또는 총 콜레스테롤) 작용제로 치료 이전에, 치료와 동시에, 그리고 치료 이후에 투여될 수 있다. 일정한 구체예에서, PCSK9에 대한 항원 결합 단백질은 고콜레스테롤혈증, 심장 질환, 당뇨병, 및/또는 임의의 콜레스테롤 관련 질환의 발생을 예방하거나 경감하기 위해 예방적으로 투여될 수 있다. 일정한 구체예에서, PCSK9에 대한 항원 결합 단백질은 현재의 고콜레스테롤혈증 질환의 치료를 위해 투여될 수 있다. 일부 구체예에서, ABP는 질환 및/또는 상기 질환과 연관된 증상의 발생을 지연시킨다. 일부 구체예에서, ABP는 콜레스테롤 관련 질환 중에서 임의의 한 가지의 증상 또는 이들의 부분집합을 결여하는 개체에 제공된다.

일정한 구체예에서, PCSK9에 대한 항원 결합 단백질은 다양한 콜레스테롤 관련 질환, 예를 들면, 고콜레스테롤혈증을 치료하기 위한 특정 치료제와 함께 이용된다. 일정한 구체예에서, 질환 및 치료의 원하는 수준을 고려하여, 2가지, 3가지, 또는 그 이상의 작용제가 투여될 수 있다. 일정한 구체예에서, 이런 작용제는 동일한 제제 내에 포함에 의해 함께 제공될 수 있다. 일정한 구체예에서, 이런 작용제(들) 및 PCSK9에 대한 항원 결합 단백질은 동일한 제제 내에 포함에 의해 함께 제공될 수 있다. 일정한 구체예에서, 이런 작용제는 별개로 조제되고, 그리고 치료 키트 내에 포함에 의해 함께 제공될 수 있다. 일정한 구체예에서, 이런 작용제 및 PCSK9에 대한 항원 결합 단백질은 별개로 조제되고, 그리고 치료 키트 내에 포함에 의해 함께 제공될 수 있다. 일정한 구체예에서, 이런 작용제는 별개로 제공될 수 있다.

일정한 구체예에서, 적어도 하나의 추가의 치료제와 함께 또는 이러한 치료제 없이, PCSK9에 대한 항원 결합 단백질을 포함하는 제제는 원하는 정도의 순도를 갖는 선별된 제제를 선택적 제제 작용제와 혼합함으로써, 냉동 건조된 덩어리 또는 수성 용액의 형태에서 보관용으로 제조될 수 있다 (Remington's Pharmaceutical Sciences, supra). 게다가, 일정한 구체예에서, 적어도 하나의 추가의 치료제와 함께 또는 이러한 치료제 없이, PCSK9에 대한 항원 결합 단백질을 포함하는 제제는 적절한 부형제를 이용하여 리오필리제이트 (lyophilizate)로서 조제될 수 있다.

일정한 구체예에서, 비경구 투여가 예기될 때, 치료적 제제는 제약학적으로 허용되는 운반체에서, 추가의 치료제와 함께 또는 추가의 치료제 없이, PCSK9에 대한 원하는 항원 결합 단백질을 포함하는 발열원-없는, 비경구 허용되는 수성 용액의 형태일 수 있다. 일정한 구체예에서, 비경구 주사를 위한 운반체는 PCSK9에 대한 항원 결합 단백질이 적어도 하나의 추가의 치료제와 함께 또는 이러한 치료제 없이, 적절하게 보존된 무균, 등장성 용액으로서 조제되는 무균 증류수이다. 일정한 구체예에서, 제조는 주사가능 마이크로스피어, 생물침식성 입자, 중합성 화합물 (가령, 폴리젖산 또는 폴리글리콜산), 구슬 또는 리포좀과 같은 작용제를 이용하여 원하는 분자의 조제를 수반할 수 있고, 이것은 산물의 제어된 또는 지속 방출을 제공할 수 있고, 상기 산물은 이후, 데포 주사를 통해 전달될 수 있다. 일정한 구체예에서, 히알루론산 역시 이용될 수 있고, 그리고 순환에서 지속된 기간을 증진하는 효과를 가질 수 있다. 일정한 구체예에서, 이식가능 약물 전달 장치가 원하는 분자를 도입하는데 이용될 수 있다.

일정한 구체예에서, 제약학적 제제는 흡입용으로 조제될 수 있다. 일정한 구체예에서, PCSK9에 대한 항원 결합 단백질은 적어도 하나의 추가의 치료제와 함께 또는 이러한 치료제 없이, 흡입을 위한 건성 분말로서 조제될 수 있다. 일정한 구체예에서, 적어도 하나의 추가의 치료제와 함께 또는 이러한 치료제 없이, PCSK9에 대한 항원 결합 단백질을 포함하는 흡입 용액은 에어로졸 전달을 위한 추진제를 이용하여 조제될 수 있다. 일정한 구체예에서, 용액은 분무될 수 있다. 폐 투여는 화학적으로 변형된 단백질의 폐 전달을 설명하는 PCT application no. PCT/US94/001875에서 더욱 설명된다.

일정한 구체예에서, 제약학적 제제는 정제의 제조에 적합한 비-독성 부형제와의 혼합물에서, 적어도 하나의 추가의 치료제와 함께 또는 이러한 치료제 없이, 효과량의 PCSK9에 대한 항원 결합 단백질을 포함할 수 있다. 일정한 구체예에서, 정제를 무균수, 또는 다른 적절한 운반체에 용해시킴으로써, 용액은 단위-분량 형태로 제조될 수 있다. 일정한 구체예에서, 적절한 부형제에는 비활성 희석제, 예를 들면, 탄산칼슘, 탄산나트륨 또는 중탄산염, 락토오스, 또는 인산칼슘; 또는 결합제, 예를 들면, 전분, 젤라틴, 또는 아카시아; 또는 윤활제, 예를 들면, 스테아르산마그네슘, 스테아르산, 또는 활석이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.

지속된- 또는 제어된-전달 제제에서, 적어도 하나의 추가의 치료제(들)와 함께 또는 이러한 치료제 없이, PCSK9에 대한 항원 결합 단백질을 포함하는 제제를 비롯한 추가의 제약학적 제제는 당업자에게 명백할 것이다. 일정한 구체예에서, 다양한 다른 지속된- 또는 제어된-전달 수단, 예를 들면, 리포좀 캐리어, 생물침식성 마이크로입자 또는 다공성 구슬 및 데포 주사를 조제하기 위한 기술 역시 당업자에게 알려져 있다. 예로써, 제약학적 제제의 전달을 위한 다공성 중합성 마이크로입자의 제어된 방출을 설명하는 PCT Application No. PCT/US93/00829를 참조한다. 일정한 구체예에서, 지속 방출 제조물은 성형된 물품, 예를 들면, 필름, 또는 마이크로캡슐의 형상에서 반 침투성 중합체 매트릭스를 포함할 수 있다. 지속 방출 매트릭스에는 폴리에스테르, 히드로겔, 폴리락티드 (U.S. 3,773,919 및 EP 058,481), L-글루타민산과 감마 에틸-L-글루타민산염의 공중합체 (Sidman et al., Biopolymers, 22:547-556 (1983)), 폴리 (2-히드록시에틸-메타크릴레이트) (Langer et al., J. Biomed. Mater. Res., 15:167-277 (1981) 및 Langer, Chem. Tech., 12:98-105 (1982)), 에틸렌 비닐 아세트산염 (Langer et al., supra) 또는 폴리-D(-)-3-히드록시부티르산 (EP 133,988)이 포함될 수 있다. 일정한 구체예에서, 지속 방출 제제는 또한, 리포좀을 포함할 수 있는데, 이들은 당분야에 공지된 여러 방법 중에서 한 가지에 의해 제조될 수 있다. 예로써, Eppstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:3688-3692 (1985); EP 036,676; EP 088,046 및 EP 143,949를 참조한다.

생체내 투여에 이용되는 제약학적 제제는 전형적으로, 무균이다. 일정한 구체예에서, 이것은 무균 여과 막을 통한 여과에 의해 달성될 수 있다. 일정한 구체예에서, 제제가 냉동 건조되는 경우에, 이러한 방법을 이용한 멸균은 냉동 건조와 재구성 이전에 또는 이후에 수행될 수 있다. 일정한 구체예에서, 비경구 투여를 위한 제제는 냉동 건조된 형태로 또는 용액으로 보관될 수 있다. 일정한 구체예에서, 비경구 제제는 일반적으로, 무균 접근 포트를 갖는 용기, 예를 들면, 피하 주사 바늘에 의해 관통되는 마개가 달린 정맥내 용액 백 또는 바이알 내로 배치된다.

일정한 구체예에서, 일단 제약학적 제제가 조제되면, 이것은 무균 바이알 내에 용액, 현탁액, 겔, 에멀젼, 고체, 또는 탈수되거나 냉동 건조된 분말로서 보관될 수 있다. 일정한 구체예에서, 이런 제제는 이용하기 용이한 형태로 또는 투여에 앞서 재구성되는 형태 (가령, 냉동 건조된)로 보관될 수 있다.

일정한 구체예에서, 일단 제약학적 제제가 조제되면, 이것은 미리-충전된 주사기 내에 이용하기 용이한 형태의 용액 또는 현탁액으로서 보관될 수 있다.

일정한 구체예에서, 단일분량 투여 단위를 생산하기 위한 키트가 제공된다. 일정한 구체예에서, 키트는 건조된 단백질을 갖는 첫 번째 용기 및 수성 제제를 갖는 두 번째 용기 둘 모두를 내포할 수 있다. 일정한 구체예에서, 단일과 복수-챔버 미리-충전된 주사기 (가령, 액체 주사기 및 리오시린지)를 내포하는 키트가 포함된다.

일정한 구체예에서, 적어도 하나의 추가의 치료제와 함께 또는 이러한 치료제 없이, 치료적으로 이용되는 PCSK9에 대한 항원 결합 단백질을 포함하는 제약학적 제제의 효과량은 예로써, 치료적 배경과 목적에 좌우될 것이다. 당업자는 치료에 적합한 용량 수준이 일정한 구체예에 따르면, 전달되는 분자, 적어도 하나의 추가의 치료제와 함께 또는 이러한 치료제 없이, PCSK9에 대한 항원 결합 단백질이 이용되는 징후, 투여 루트, 그리고 환자의 크기 (체중, 체표면 또는 장기 크기) 및/또는 상태 (연령 및 전반적인 건강)에 부분적으로 좌우되어 변한다는 것을 인지할 것이다. 일정한 구체예에서, 임상의는 최적 치료 효과를 얻기 위해 용량을 적정하고 투여 루트를 변경할 수 있다.

일정한 구체예에서, 제제는 원하는 분자가 흡수되거나 캡슐화되는 막, 스펀지 또는 기타 적절한 물질의 이식을 통해 국소 투여될 수 있다. 일정한 구체예에서, 이식 장치가 이용되는 경우에, 상기 장치는 임의의 적절한 조직 또는 장기 내로 이식될 수 있고, 그리고 원하는 분자의 전달은 확산, 시한-방출 볼러스, 또는 연속 투여를 통해 달성될 수 있다.

용량 및 투약 섭생

표 2와 도 2 및/또는 3 및/또는 도48A와 48B에서 묘사된 임의의 PCSK9에 대한 항원 결합 단백질은 본 발명의 방법에 따라 환자에게 투여될 수 있다. 일부 구체예에서, PCSK9에 대한 항원 결합 단백질에는 21B12, 26H5, 31H4, 8A3, 11F1 또는 8A1이 포함된다.

본 발명의 방법에 따라 환자에게 투여되는 PCSK9에 대한 항원 결합 단백질 (가령, 항-PCSK9 항체)의 양은 일반적으로, 치료 효과량이다. ABP의 양은 밀리그램의 항체 (즉, mg) 또는 환자 체중 킬로그램당 밀리그램의 항체 (즉, mg/kg)로 표시될 수 있다. 일정한 구체예에서, PCSK9 항원 결합 단백질의 전형적인 용량은 약 0.1 μg/kg 내지 약 100 mg/kg 또는 그 이상의 PCSK9에 대한 항원 결합 단백질의 범위에서 변할 수 있다. 일정한 구체예에서, 용량은 0.1 μg/kg 내지 약 100 mg/kg; 또는 1 μg/kg 내지 약 100 mg/kg; 또는 5 μg/kg 내지 약 100 mg/kg의 PCSK9에 대한 항원 결합 단백질; 또는 1 mg/kg 내지 약 50 mg/kg의 PCSK9에 대한 항원 결합 단백질; 또는 2 mg/kg 내지 약 20 mg/kg의 PCSK9에 대한 항원 결합 단백질; 또는 2 mg/kg 내지 약 10 mg/kg의 PCSK9에 대한 항원 결합 단백질의 범위에서 변할 수 있다.

일정한 구체예에서, PCSK9에 대한 항원 결합 단백질의 양 (또는 분량)은 적어도 약 10 mg 내지 약 1400mg; 또는 약 14 mg 내지 약 1200 mg; 또는 약 14 mg 내지 약 1000 mg; 또는 약 14 mg 내지 약 800 mg; 또는 약 14 mg 내지 약 700 mg; 또는 약 14 mg 내지 약 480 mg; 또는 약 20 mg 내지 약 480 mg; 또는 약 70 mg 내지 약 480 mg; 또는 약 80 mg 내지 약 480 mg; 또는 약 90 mg 내지 약 480 mg; 또는 약 100 mg 내지 약 480 mg, 또는 약 105 mg 내지 약 480 mg; 또는 약 110 mg 내지 약 480 mg; 또는 약 115 mg 내지 약 480 mg; 또는 약 120 mg 내지 약 480 mg; 또는 약 125 mg 내지 약 480 mg; 또는 약 130 mg 내지 약 480 mg; 또는 약 135 mg 내지 약 480 mg; 또는 약 140 mg 내지 약 480 mg; 또는 약 145 mg 내지 약 480 mg; 또는 약 150 mg 내지 약 480 mg; 또는 약 160 mg 내지 약 480 mg; 또는 약 170 mg 내지 약 480 mg; 또는 약 180 mg 내지 약 480 mg 또는 약 190 mg 내지 약 480 mg 또는 약 200 mg 내지 약 480 mg; 또는 약 210 mg 내지 약 480 mg; 또는 약 220 mg 내지 약 480 mg; 또는 약 230 mg 내지 약 480 mg; 또는 약 240 mg 내지 약 480 mg; 또는 약 250 mg 내지 약 480 mg; 또는 약 260 mg 내지 약 480 mg; 또는 약 270 mg 내지 약 480 mg; 또는 약 280 mg 내지 약 480 mg; 또는 약 290 mg 내지 약 480 mg; 또는 약 300 mg 내지 약 480 mg; 또는 약 310 mg 내지 약 480 mg; 또는 약 320 mg 내지 약 480 mg; 또는 약 330 mg 내지 약 480 mg; 또는 약 340 mg 내지 약 480 mg; 또는 약 350 mg 내지 약 480 mg; 또는 약 360 mg 내지 약 480 mg; 또는 약 370 mg 내지 약 480 mg; 또는 약 380 mg 내지 약 480 mg; 또는 약 390 mg 내지 약 480 mg; 또는 약 400 mg 내지 약 480 mg; 또는 약 410 mg 내지 약 480 mg; 또는 약 420 mg 내지 약 480 mg; 또는 약 430 mg 내지 약 480 mg; 또는 약 440 mg 내지 약 480 mg; 또는 약 450 mg 내지 약 480 mg; 또는 약 460 mg 내지 약 480 mg; 또는 약 470 mg 내지 약 480 mg의 PCSK9에 대한 항원 결합 단백질의 범위에서 변할 수 있다.

일정한 구체예에서, 투약 빈도는 이용되는 제제에서 PCSK9에 대한 항원 결합 단백질 및/또는 임의의 추가의 치료제의 약동학적 매개변수를 고려할 것이다. 일정한 구체예에서, 임상의는 원하는 효과를 달성하는 용량이 도달될 때까지 제제를 투여할 것이다. 일정한 구체예에서, 제제는 이런 이유로, 시간의 흐름에서 단일 분량, 또는 2회, 3회, 4회 또는 그 이상의 분량 (이들은 원하는 분자의 동일한 양을 내포하거나 내포하지 않을 수 있다)으로서, 또는 이식 장치 또는 카테터를 통한 연속 주입으로서 투여될 수 있다. 제제는 또한, 표준 바늘과 주사기로, 피하 또는 정맥내 전달될 수 있다. 이에 더하여, 피하 전달의 경우에, 펜 전달 장치뿐만 아니라 자기주사기 전달 장치가 본 발명의 제약학적 제제를 전달하는데 적용을 갖는다. 적절한 용량의 추가의 정밀화는 당업자에 의해 일과적으로 이루어지고 이들에 의해 일과적으로 수행되는 작업의 범위 내에 있다. 일정한 구체예에서, 적절한 용량은 적절한 용량-반응 데이터의 이용을 통해 확인될 수 있다. 일부 구체예에서, 투여의 양과 빈도는 획득되는 원하는 콜레스테롤 수준 (혈청 및/또는 전체), 그리고 개체의 현재 콜레스테롤 수준, LDL 수준, 및/또는 LDLR 수준을 고려할 수 있고, 이들 모두 당업자에게 널리 알려진 방법에 의해 획득될 수 있다.

일정한 구체예에서, 적어도 약 10 mg; 또는 약 14 mg까지; 또는 약 20 mg까지; 또는 약 35 mg까지; 또는 약 40 mg까지, 또는 약 45 mg까지, 또는 약 50 mg까지; 또는 약 70 mg까지의 PCSK9에 대한 항원 결합 단백질의 분량이 이를 필요로 하는 환자에 주 1회 (QW) 투여된다.

일부 다른 구체예에서, 적어도 약 70 mg, 또는 약 100 mg까지; 또는 약 105 mg까지, 또는 약 110 mg까지; 또는 약 115 mg까지, 또는 약 120 mg까지; 또는 약 140 mg까지; 또는 약 160 mg까지; 또는 약 200 mg까지; 또는 약 250 mg까지; 또는 280 mg까지; 또는 300 mg까지; 또는 350 mg까지; 또는 400 mg까지; 또는 420 mg까지의 PCSK9에 대한 항원 결합 단백질의 분량이 이를 필요로 하는 환자에 격주마다 1회, (또는 2주마다)(Q2W) 투여된다.

일정한 다른 구체예에서, 적어도 약 250 mg; 또는 약 280 mg까지; 또는 약 300 mg까지; 또는 약 350 mg까지; 또는 약 400 mg까지; 또는 약 420 mg까지; 또는 약 450 mg까지; 또는 480 mg까지의 PCSK9에 대한 항원 결합 단백질의 분량이 이를 필요로 하는 환자에 4주마다 1회, (또는 월 1회) 투여된다.

일부 구체예에서, 혈청 LDL 콜레스테롤 수준은 투약전 혈청 LDL 콜레스테롤 수준과 비교하여, 적어도 약 15% 감소된다. 일부 구체예에서, 혈청 LDL 콜레스테롤 수준은 적어도 약 20% 감소된다. 일부 구체예에서, 혈청 LDL 콜레스테롤 수준은 적어도 약 25% 감소된다. 일부 구체예에서, 혈청 LDL 콜레스테롤 수준은 적어도 약 30% 감소된다. 일부 구체예에서, 혈청 LDL 콜레스테롤 수준은 적어도 약 40% 감소된다. 일부 구체예에서, 혈청 LDL 콜레스테롤 수준은 적어도 약 50% 감소된다. 일부 구체예에서, 혈청 LDL 콜레스테롤 수준은 적어도 약 55% 감소된다. 일부 구체예에서, 혈청 LDL 콜레스테롤 수준은 적어도 약 60% 감소된다. 일부 구체예에서, 혈청 LDL 콜레스테롤 수준은 적어도 약 65% 감소된다. 일부 구체예에서, 혈청 LDL 콜레스테롤 수준은 적어도 약 70% 감소된다. 일부 구체예에서, 혈청 LDL 콜레스테롤 수준은 적어도 약 75% 감소된다. 일부 구체예에서, 혈청 LDL 콜레스테롤 수준은 적어도 약 80% 감소된다. 일부 구체예에서, 혈청 LDL 콜레스테롤 수준은 적어도 약 85% 감소된다. 일부 구체예에서, 혈청 LDL 콜레스테롤 수준은 적어도 약 90% 감소된다.

일부 구체예에서, 혈청 LDL 콜레스테롤 수준은 투약전 혈청 LDL 콜레스테롤 수준과 비교하여, 적어도 약 15% 감소되고, 그리고 이러한 감소는 투약전 수준에 비하여 적어도 약 3일, 적어도 약 5일, 적어도 약 7일, 적어도 약 10일, 적어도 약 14일, 적어도 약 21일, 적어도 약 25일, 적어도 약 28일, 또는 적어도 약 31일의 기간 동안 지속된다.

일부 구체예에서, 혈청 LDL 콜레스테롤 수준은 투약전 혈청 LDL 콜레스테롤 수준과 비교하여, 적어도 약 20% 감소되고, 그리고 이러한 감소는 투약전 수준에 비하여 적어도 약 3일, 적어도 약 5일, 적어도 약 7일, 적어도 약 10일, 적어도 약 14일, 적어도 약 21일, 적어도 약 25일, 적어도 약 28일, 또는 적어도 약 31일의 기간 동안 지속된다.

일부 구체예에서, 혈청 LDL 콜레스테롤 수준은 투약전 혈청 LDL 콜레스테롤 수준과 비교하여, 적어도 약 25% 감소되고, 그리고 이러한 감소는 투약전 수준에 비하여 적어도 약 3일, 적어도 약 5일, 적어도 약 7일, 적어도 약 10일, 적어도 약 14일, 적어도 약 21일, 적어도 약 25일, 적어도 약 28일, 또는 적어도 약 31일의 기간 동안 지속된다.

일부 구체예에서, 혈청 LDL 콜레스테롤 수준은 투약전 혈청 LDL 콜레스테롤 수준과 비교하여, 적어도 약 30% 감소되고, 그리고 이러한 감소는 투약전 수준에 비하여 적어도 약 3일, 적어도 약 5일, 적어도 약 7일, 적어도 약 10일, 적어도 약 14일, 적어도 약 21일, 적어도 약 25일, 적어도 약 28일, 또는 적어도 약 31일의 기간 동안 지속된다.

일부 구체예에서, 혈청 LDL 콜레스테롤 수준은 투약전 혈청 LDL 콜레스테롤 수준과 비교하여, 적어도 약 35% 감소되고, 그리고 이러한 감소는 투약전 수준에 비하여 적어도 약 3일, 적어도 약 5일, 적어도 약 7일, 적어도 약 10일, 적어도 약 14일, 적어도 약 21일, 적어도 약 25일, 적어도 약 28일, 또는 적어도 약 31일의 기간 동안 지속된다.

일부 구체예에서, 혈청 LDL 콜레스테롤 수준은 투약전 혈청 LDL 콜레스테롤 수준과 비교하여, 적어도 약 40% 감소되고, 그리고 이러한 감소는 투약전 수준에 비하여 적어도 약 3일, 적어도 약 5일, 적어도 약 7일, 적어도 약 10일, 적어도 약 14일, 적어도 약 21일, 적어도 약 25일, 적어도 약 28일, 또는 적어도 약 31일의 기간 동안 지속된다.

일부 구체예에서, 혈청 LDL 콜레스테롤 수준은 투약전 혈청 LDL 콜레스테롤 수준과 비교하여, 적어도 약 45% 감소되고, 그리고 이러한 감소는 투약전 수준에 비하여 적어도 약 3일, 적어도 약 5일, 적어도 약 7일, 적어도 약 10일, 적어도 약 14일, 적어도 약 21일, 적어도 약 25일, 적어도 약 28일, 또는 적어도 약 31일의 기간 동안 지속된다.

일부 구체예에서, 혈청 LDL 콜레스테롤 수준은 투약전 혈청 LDL 콜레스테롤 수준과 비교하여, 적어도 약 50% 감소되고, 그리고 이러한 감소는 투약전 수준에 비하여 적어도 약 3일, 적어도 약 5일, 적어도 약 7일, 적어도 약 10일, 적어도 약 14일, 적어도 약 21일, 적어도 약 25일, 적어도 약 28일, 또는 적어도 약 31일의 기간 동안 지속된다.

일부 구체예에서, 혈청 LDL 콜레스테롤 수준은 투약전 혈청 LDL 콜레스테롤 수준과 비교하여, 적어도 약 55% 감소되고, 그리고 이러한 감소는 투약전 수준에 비하여 적어도 약 3일, 적어도 약 5일, 적어도 약 7일, 적어도 약 10일, 적어도 약 14일, 적어도 약 21일, 적어도 약 25일, 적어도 약 28일, 또는 적어도 약 31일의 기간 동안 지속된다.

일부 구체예에서, 혈청 LDL 콜레스테롤 수준은 투약전 혈청 LDL 콜레스테롤 수준과 비교하여, 적어도 약 60% 감소되고, 그리고 이러한 감소는 투약전 수준에 비하여 적어도 약 3일, 적어도 약 5일, 적어도 약 7일, 적어도 약 10일, 적어도 약 14일, 적어도 약 21일, 적어도 약 25일, 적어도 약 28일, 또는 적어도 약 31일의 기간 동안 지속된다.

일부 구체예에서, 혈청 LDL 콜레스테롤 수준은 투약전 혈청 LDL 콜레스테롤 수준과 비교하여, 적어도 약 65% 감소되고, 그리고 이러한 감소는 투약전 수준에 비하여 적어도 약 3일, 적어도 약 5일, 적어도 약 7일, 적어도 약 10일, 적어도 약 14일, 적어도 약 21일, 적어도 약 25일, 적어도 약 28일, 또는 적어도 약 31일의 기간 동안 지속된다.

일부 구체예에서, 혈청 LDL 콜레스테롤 수준은 투약전 혈청 LDL 콜레스테롤 수준과 비교하여, 적어도 약 70% 감소되고, 그리고 이러한 감소는 투약전 수준에 비하여 적어도 약 3일, 적어도 약 5일, 적어도 약 7일, 적어도 약 10일, 적어도 약 14일, 적어도 약 21일, 적어도 약 25일, 적어도 약 28일, 또는 적어도 약 31일의 기간 동안 지속된다.

일부 구체예에서, 혈청 LDL 콜레스테롤 수준은 투약전 혈청 LDL 콜레스테롤 수준과 비교하여, 적어도 약 75% 감소되고, 그리고 이러한 감소는 투약전 수준에 비하여 적어도 약 3일, 적어도 약 5일, 적어도 약 7일, 적어도 약 10일, 적어도 약 14일, 적어도 약 21일, 적어도 약 25일, 적어도 약 28일, 또는 적어도 약 31일의 기간 동안 지속된다.

일부 구체예에서, 혈청 LDL 콜레스테롤 수준은 투약전 혈청 LDL 콜레스테롤 수준과 비교하여, 적어도 약 80% 감소되고, 그리고 이러한 감소는 투약전 수준에 비하여 적어도 약 3일, 적어도 약 5일, 적어도 약 7일, 적어도 약 10일, 적어도 약 14일, 적어도 약 21일, 적어도 약 25일, 적어도 약 28일, 또는 적어도 약 31일의 기간 동안 지속된다.

일부 구체예에서, 혈청 LDL 콜레스테롤 수준은 투약전 혈청 LDL 콜레스테롤 수준과 비교하여, 적어도 약 85% 감소되고, 그리고 이러한 감소는 투약전 수준에 비하여 적어도 약 3일, 적어도 약 5일, 적어도 약 7일, 적어도 약 10일, 적어도 약 14일, 적어도 약 21일, 적어도 약 25일, 적어도 약 28일, 또는 적어도 약 31일의 기간 동안 지속된다.

일부 구체예에서, 혈청 LDL 콜레스테롤 수준은 투약전 혈청 LDL 콜레스테롤 수준과 비교하여, 적어도 약 90% 감소되고, 그리고 이러한 감소는 투약전 수준에 비하여 적어도 약 3일, 적어도 약 5일, 적어도 약 7일, 적어도 약 10일, 적어도 약 14일, 적어도 약 21일, 적어도 약 25일, 적어도 약 28일, 또는 적어도 약 31일의 기간 동안 지속된다.

일정한 치료적 적용

당업자가 인지하는 바와 같이, 변화된 콜레스테롤, LDL, LDLR, PCSK9, VLDL-C, 아포단백질 B ("ApoB"), 지방단백 A ("Lp(a)"), 트리글리세리드, HDL-C, 비-HDL-C, 그리고 총 콜레스테롤 수준에 관련되거나, 이들 수준을 수반하거나, 또는 이들 수준에 의해 영향을 받을 수 있는 질환은 본 발명에서 설명된 PCSK9에 대한 항원 결합 단백질에 의해 해결될 수 있다. 한 양상에서, PCSK9에 대한 항원 결합 단백질은 상승된 혈청 콜레스테롤 수준에 관련되거나 또는 상승된 혈청 콜레스테롤 수준이 관련되는 질환을 치료하고 및/또는 예방하고 및/또는 이들의 위험을 감소시키는 방법에서 이용될 수 있다. 한 양상에서, PCSK9에 대한 항원 결합 단백질은 상승된 PCSK9 값에 관련되거나 또는 상승된 PCSK9 값이 관련되는 질환을 치료하고 및/또는 예방하고 및/또는 이들의 위험을 감소시키는 방법에서 이용될 수 있다. 한 양상에서, PCSK9에 대한 항원 결합 단백질은 상승된 총 콜레스테롤 수준에 관련되거나 또는 상승된 총 콜레스테롤 수준이 관련되는 질환을 치료하고 및/또는 예방하고 및/또는 이들의 위험을 감소시키는 방법에서 이용될 수 있다. 한 양상에서, PCSK9에 대한 항원 결합 단백질은 상승된 비-HDL 콜레스테롤 수준에 관련되거나 또는 상승된 비-HDL 콜레스테롤 수준이 관련되는 질환을 치료하고 및/또는 예방하고 및/또는 이들의 위험을 감소시키는 방법에서 이용될 수 있다. 한 양상에서, PCSK9에 대한 항원 결합 단백질은 상승된 ApoB 수준에 관련되거나 또는 상승된 ApoB 수준이 관련되는 질환을 치료하고 및/또는 예방하고 및/또는 이들의 위험을 감소시키는 방법에서 이용될 수 있다. 한 양상에서, PCSK9에 대한 항원 결합 단백질은 상승된 Lp(a) 수준에 관련되거나 또는 상승된 Lp(a) 수준이 관련되는 질환을 치료하고 및/또는 예방하고 및/또는 이들의 위험을 감소시키는 방법에서 이용될 수 있다. 한 양상에서, PCSK9에 대한 항원 결합 단백질은 상승된 트리글리세리드 수준에 관련되거나 또는 상승된 트리글리세리드 수준이 관련되는 질환을 치료하고 및/또는 예방하고 및/또는 이들의 위험을 감소시키는 방법에서 이용될 수 있다. 한 양상에서, PCSK9에 대한 항원 결합 단백질은 상승된 VLDL-C 수준에 관련되거나 또는 상승된 VLDL-C 수준이 관련되는 질환을 치료하고 및/또는 예방하고 및/또는 이들의 위험을 감소시키는 방법에서 이용될 수 있다.

한 양상에서, PCSK9에 대한 항원 결합 단백질은 환자에서 혈청 LDL 콜레스테롤 수준을 조정하는데 이용된다. 일부 구체예에서, PCSK9에 대한 항원 결합 단백질은 혈청 LDL 콜레스테롤의 양을 비정상적으로 높은 수준 또는 심지어 정상적인 수준으로부터 감소시키는데 이용된다. 일정한 구체예에서, 혈청 LDL 콜레스테롤 수준은 적어도 약 30% 감소된다. 일정한 구체예에서, 혈청 LDL 콜레스테롤 수준은 적어도 약 35% 감소된다. 일정한 구체예에서, 혈청 LDL 콜레스테롤 수준은 적어도 약 40% 감소된다. 일정한 구체예에서, 혈청 LDL 콜레스테롤 수준은 적어도 약 45% 감소된다. 일정한 구체예에서, 혈청 LDL 콜레스테롤 수준은 적어도 약 50% 감소된다. 일정한 구체예에서, 혈청 LDL 콜레스테롤 수준은 적어도 약 55% 감소된다. 일부 구체예에서, 혈청 LDL 콜레스테롤 수준은 적어도 약 60% 감소된다. 일부 구체예에서, 혈청 LDL 콜레스테롤 수준은 적어도 약 65% 감소된다. 일부 구체예에서, 혈청 LDL 콜레스테롤 수준은 적어도 약 70% 감소된다. 일부 구체예에서, 혈청 LDL 콜레스테롤 수준은 적어도 약 75% 감소된다. 일부 구체예에서, 혈청 LDL 콜레스테롤 수준은 적어도 약 80% 감소된다. 일부 구체예에서, 혈청 LDL 콜레스테롤 수준은 적어도 약 85% 감소된다. 일부 구체예에서, 혈청 LDL 콜레스테롤 수준은 적어도 약 90% 감소된다.

한 양상에서, PCSK9에 대한 항원 결합 단백질은 환자에서 혈청 PCSK9 값을 조정하는데 이용된다. 일정한 구체예에서, PCSK9에 대한 항원 결합 단백질은 중화이다. 일부 구체예에서, PCSK9에 대한 항원 결합 단백질은 PCSK9 값을 비정상적으로 높은 수준 또는 심지어 정상적인 수준으로부터 감소시키는데 이용된다. 일부 구체예에서, 혈청 PCSK9 값은 적어도 약 60% 감소된다. 일부 구체예에서, 혈청 PCSK9 값은 적어도 약 65% 감소된다. 일부 구체예에서, 혈청 PCSK9 값은 적어도 약 70% 감소된다. 일부 구체예에서, 혈청 PCSK9 값은 적어도 약 75% 감소된다. 일부 구체예에서, 혈청 PCSK9 값은 적어도 약 80% 감소된다. 일부 구체예에서, 혈청 PCSK9 값은 적어도 약 85% 감소된다. 일부 구체예에서, 혈청 PCSK9 값은 적어도 약 90% 감소된다.

한 양상에서, PCSK9에 대한 항원 결합 단백질은 환자에서 총 콜레스테롤 수준을 조정하는데 이용된다. 일정한 구체예에서, PCSK9에 대한 항원 결합 단백질은 중화이다. 일부 구체예에서, PCSK9에 대한 항원 결합 단백질은 총 콜레스테롤의 양을 비정상적으로 높은 수준 또는 심지어 정상적인 수준으로부터 감소시키는데 이용된다. 일부 구체예에서, 총 콜레스테롤 수준은 적어도 약 20% 감소된다. 일부 구체예에서, 총 콜레스테롤 수준은 적어도 약 25% 감소된다. 일부 구체예에서, 총 콜레스테롤 수준은 적어도 약 30% 감소된다. 일부 구체예에서, 총 콜레스테롤 수준은 적어도 약 35% 감소된다. 일부 구체예에서, 총 콜레스테롤 수준은 적어도 약 40% 감소된다. 일부 구체예에서, 총 콜레스테롤 수준은 적어도 약 45% 감소된다. 일부 구체예에서, 총 콜레스테롤 수준은 적어도 약 50% 감소된다. 일부 구체예에서, 총 콜레스테롤 수준은 적어도 약 55% 감소된다. 일부 구체예에서, 총 콜레스테롤 수준은 적어도 약 60% 감소된다.

한 양상에서, PCSK9에 대한 항원 결합 단백질은 환자에서 비-HDL 콜레스테롤 수준을 조정하는데 이용된다. 일정한 구체예에서, PCSK9에 대한 항원 결합 단백질은 중화이다. 일부 구체예에서, PCSK9에 대한 항원 결합 단백질은 비-HDL 콜레스테롤을 비정상적으로 높은 수준 또는 심지어 정상적인 수준으로부터 감소시키는데 이용된다. 일부 구체예에서, 비-HDL 콜레스테롤 수준은 적어도 약 30% 감소된다. 일부 구체예에서, 비-HDL 콜레스테롤 수준은 적어도 약 35% 감소된다. 일부 구체예에서, 비-HDL 콜레스테롤 수준은 적어도 약 40% 감소된다. 일부 구체예에서, 비-HDL 콜레스테롤 수준은 적어도 약 50% 감소된다. 일부 구체예에서, 비-HDL 콜레스테롤 수준은 적어도 약 55% 감소된다. 일부 구체예에서, 비-HDL 콜레스테롤 수준은 적어도 약 60% 감소된다. 일부 구체예에서, 비-HDL 콜레스테롤 수준은 적어도 약 65% 감소된다. 일부 구체예에서, 비-HDL 콜레스테롤 수준은 적어도 약 70% 감소된다. 일부 구체예에서, 비-HDL 콜레스테롤 수준은 적어도 약 75% 감소된다. 일부 구체예에서, 비-HDL 콜레스테롤 수준은 적어도 약 80% 감소된다. 일부 구체예에서, 비-HDL 콜레스테롤 수준은 적어도 약 85% 감소된다.

한 양상에서, PCSK9에 대한 항원 결합 단백질은 환자에서 ApoB 수준을 조정하는데 이용된다. 일정한 구체예에서, PCSK9에 대한 항원 결합 단백질은 중화이다. 일부 구체예에서, PCSK9에 대한 항원 결합 단백질은 ApoB의 양을 비정상적으로 높은 수준 또는 심지어 정상적인 수준으로부터 감소시키는데 이용된다. 일부 구체예에서, ApoB 수준은 적어도 약 25% 감소된다. 일부 구체예에서, ApoB 수준은 적어도 약 30% 감소된다. 일부 구체예에서, ApoB 수준은 적어도 약 35% 감소된다. 일부 구체예에서, ApoB 수준은 적어도 약 40% 감소된다. 일부 구체예에서, ApoB 수준은 적어도 약 45% 감소된다. 일부 구체예에서, ApoB 수준은 적어도 약 50% 감소된다. 일부 구체예에서, ApoB 수준은 적어도 약 55% 감소된다. 일부 구체예에서, ApoB 수준은 적어도 약 60% 감소된다. 일부 구체예에서, ApoB 수준은 적어도 약 65% 감소된다. 일부 구체예에서, ApoB 수준은 적어도 약 70% 감소된다. 일부 구체예에서, ApoB 수준은 적어도 약 75% 감소된다.

한 양상에서, PCSK9에 대한 항원 결합 단백질은 환자에서 Lp(a) 수준을 조정하는데 이용된다. 일정한 구체예에서, PCSK9에 대한 항원 결합 단백질은 중화이다. 일부 구체예에서, PCSK9에 대한 항원 결합 단백질은 Lp(a)의 양을 비정상적으로 높은 수준 또는 심지어 정상적인 수준으로부터 감소시키는데 이용된다. 일부 구체예에서, Lp(a) 수준은 적어도 약 5% 감소된다. 일부 구체예에서, Lp(a) 수준은 적어도 약 10% 감소된다. 일부 구체예에서, Lp(a) 수준은 적어도 약 15% 감소된다. 일부 구체예에서, Lp(a) 수준은 적어도 약 20% 감소된다. 일부 구체예에서, Lp(a) 수준은 적어도 약 25% 감소된다. 일부 구체예에서, Lp(a) 수준은 적어도 약 30% 감소된다. 일부 구체예에서, Lp(a) 수준은 적어도 약 35% 감소된다. 일부 구체예에서, Lp(a) 수준은 적어도 약 40% 감소된다. 일부 구체예에서, Lp(a) 수준은 적어도 약 45% 감소된다. 일부 구체예에서, Lp(a) 수준은 적어도 약 50% 감소된다. 일부 구체예에서, Lp(a) 수준은 적어도 약 55% 감소된다. 일부 구체예에서, Lp(a) 수준은 적어도 약 60% 감소된다. 일부 구체예에서, Lp(a) 수준은 적어도 약 65% 감소된다.

당업자가 인지하는 바와 같이, 본 발명의 PCSK9에 대한 항원 결합 단백질은 콜레스테롤 관련 질환을 치료하고 및/또는 예방하는데 치료적으로 유용할 수 있다. 일부 구체예에서, "콜레스테롤 관련 질환" (이것은 "혈청 콜레스테롤 관련 질환"을 포함한다)에는 하기 중에서 한 가지 또는 그 이상이 포함된다: 가족성 고콜레스테롤혈증, 비-가족성 고콜레스테롤혈증, 고지질혈증, 심장 질환, 신진대사장애, 당뇨병, 관상동맥성 심장 질환, 뇌졸중, 심혈관 질환, 알츠하이머병 및 일반적으로 이상지질혈증, 이것은 예로써, 상승된 총 혈청 콜레스테롤, 상승된 LDL, 상승된 트리글리세리드, 상승된 VLDL, 및/또는 낮은 HDL에 의해 표현될 수 있다. ABP를 단독으로, 또는 하나 또는 그 이상의 다른 작용제와 공동으로 이용하여 치료될 수 있는 일차와 이차 이상지질혈증의 일부 무제한적 실례에는 신진대사장애, 진성 당뇨병, 가족성 결합성 고지질혈증, 가족성 고트리글리세리드혈증, 이형 고콜레스테롤혈증, 동질접합성 고콜레스테롤혈증, 가족성 결함성 아포지방단백 B-100을 비롯한 가족성 고콜레스테롤혈증; 다유전자성 고콜레스테롤혈증; 잔존물 제거 질환 (remnant removal disease), 간 리파아제 결핍; 하기 중에서 한 가지에 부수적인 이상지질혈증: 식상, 갑상선 기능 저하, 에스트로겐과 프로게스틴 요법, 베타-차단제, 그리고 티아지드 이뇨제를 비롯한 약물; 신장 증후군, 만성 신부전, 쿠싱 증후군, 원발성 담즙성 간경변, 글리코겐 보관 질환, 간암, 담즙 분비 중지, 선단 비대증, 인슐린종, 단리된 성장 호르몬 결핍, 그리고 알코올-유도된 고트리글리세리드혈증이 포함된다. ABP는 또한, 죽상경화 질환, 예를 들면, 가령, 심혈관 죽음, 비-심혈관 또는 전 원인 죽음, 관상동맥성 심장 질환, 관상 동맥 질환, 말초 동맥 질환, 뇌졸중 (허혈성과 출혈성), 협심증, 또는 뇌혈관 질환과 관동맥 증후군, 심근 경색과 불안정형 협심증을 예방하거나 또는 치료하는데 유용할 수 있다. 일부 구체예에서, ABP는 하기의 위험을 감소시키는데 유용하다: 치명적 심장 마비와 비-치명적 심장 마비, 치명적 뇌졸중과 비-치명적 뇌졸중, 일정한 유형의 심장 수술, 심부전으로 인한 입원, 심장 질환을 앓는 환자에서 흉통, 및/또는 확립된 심장 질환, 예를 들면, 이전 심장 마비, 이전 심장 수술로 인한 심혈관 사건, 및/또는 동맥 경화의 흔적이 있는 흉통 및/또는 이식-관련 혈관 질환. 일부 구체예에서, ABP는 상승된 CRP 또는 hsCRP에 기인한 심혈관 위험을 예방하거나 또는 감소시키는데 유용하다. 일부 구체예에서, 이들 ABP와 방법은 재발성 심혈관 사건의 위험을 감소시키는데 이용될 수 있다.

당업자가 인지하는 바와 같이, 스타틴의 이용을 통해 일반적으로 해결가능한 (치료가능한 또는 예방가능한) 질환 또는 장애 역시 본 발명의 항원 결합 단백질의 적용으로부터 이익을 얻을 수 있다. 이에 더하여, 일부 구체예에서, 콜레스테롤 합성의 예방 또는 증가된 LDLR 발현으로부터 이익을 얻을 수 있는 질환 또는 장애 역시 항원 결합 단백질의 다양한 구체예에 의해 치료될 수 있다. 이에 더하여, 당업자가 인지하는 바와 같이, 항-PCSK9 항체의 이용은 당뇨병의 치료에서 특히 유용할 수 있다. 당뇨병은 관상동맥성 심장 질환에 대한 위험 인자일 뿐만 아니라, 인슐린이 PCSK9의 발현을 증가시킨다. 다시 말하면, 당뇨병을 앓는 사람은 상승된 혈장 지질 수준 (이것은 높은 PCSK9 수준에 관련될 수 있고)을 갖고 이들 수준의 저하로부터 이익을 얻을 수 있다. 이것은 일반적으로, Costet et al. ("Hepatic PCSK9 Expression is Regulated by Nutritional Status via Insulin and Sterol Regulatory Element-binding Protein 1C", J. Biol. Chem., 281: 6211-6218, 2006)에서 더욱 상세하게 논의되고, 이것은 본원에 전체로서 참고문헌으로 편입된다.

일부 구체예에서, 항원 결합 단백질은 혈청 콜레스테롤 수준을 더욱 안전한 범위로 감소시키기 위해, 진성 당뇨병, 복부 대동맥류, 죽상동맥경화증 및/또는 말초 혈관 질환을 앓는 환자들에게 투여된다. 일부 구체예에서, 항원 결합 단백질은 본원에서 설명된 질환 중에서 한 가지가 발병하는 위험에 처해 있는 환자에게 투여된다. 일부 구체예에서, ABP는 흡연하고 있거나 이전에 흡연했었던 개체 (즉, 이전 흡연자), 고혈압을 앓는 개체 또는 조기 심장 마비의 가족력이 있는 개체에 투여된다.

일부 구체예에서, 개체는 그들이 2004 NCEP 치료 목표에서 중간 또는 높은 위험에 처해 있으면, ABP가 투여된다. 일부 구체예에서, ABP는 개체의 LDL 콜레스테롤 수준이 160 mg/dl 이상이면, 개체에 투여된다. 일부 구체예에서, ABP는 개체의 LDL 콜레스테롤 수준이 130 이상이면 (그리고, 이들이 2004 NCEP 치료 목표에 따라 중간 또는 적당하게 높은 위험을 가지면), 투여된다. 일부 구체예에서, ABP는 개체의 LDL 콜레스테롤 수준이 100 이상이면 (그리고, 이들이 2004 NCEP 치료 목표에 따라 높은 또는 매우 높은 위험을 가지면), 투여된다. 일부 구체예에서, ABP는 개체의 LDL 콜레스테롤 수준이 80 mg/dL 이상이면, 투여된다. 일부 구체예에서, ABP는 개체의 LDL 콜레스테롤 수준이 70 mg/dL 이상이면, 투여된다.

의사는 특정 환자의 개별 프로필에 따라, 적절한 치료 조치와 표적 지질 수준을 선별할 수 있을 것이다. 고지질혈증의 치료를 보도하기 위한 한 가지 널리-인정되는 표준은 Third Report of the National Cholesterol Education Program (NCEP) Expert Panel on Detection, Evaluation, 그리고 Treatment of the High Blood Cholesterol in Adults (Adult Treatment Panel III) Final Report, National Institutes of Health, NIH Publication No. 02-5215 (2002)이고, 이의 인쇄된 간행물은 본원에 전체로서 참고문헌으로 편입된다.

일부 구체예에서, PCSK9에 대한 항원 결합 단백질은 고콜레스테롤혈증, 고지질혈증 또는 이상지질혈증의 치료 또는 예방 및/또는 그 결과로서 약제의 제조 및/또는 기타 콜레스테롤 관련 질환 (가령, 본원에서 언급된 것들)에 이용된다. 일정한 구체예에서, PCSK9에 대한 항원 결합 단백질은 PCSK9 활성이 정상적인 질환, 예를 들면, 고콜레스테롤혈증을 치료하거나 예방하는데 이용된다. 이런 질환에서, 예로써 PCSK9 활성의 정상 미만으로의 감소는 치료적 효과를 제공할 수 있다.

복합 요법

일정한 구체예에서, 콜레스테롤 관련 질환, 예를 들면, 고콜레스테롤혈증, 고지질혈증 또는 이상지질혈증을 치료하는 방법이 제공되고, 상기 방법은 치료 효과량의 하나 또는 그 이상의 PCSK9에 대한 항원 결합 단백질 및 다른 치료제를 투여하는 것을 포함한다. 일정한 구체예에서, PCSK9에 대한 항원 결합 단백질은 적어도 하나의 다른 치료제의 투여에 앞서 투여된다. 일정한 구체예에서, PCSK9에 대한 항원 결합 단백질은 적어도 하나의 다른 치료제의 투여와 동시에 투여된다. 일정한 구체예에서, PCSK9에 대한 항원 결합 단백질은 적어도 하나의 다른 치료제의 투여 이후에 투여된다.

치료제 (항원 결합 단백질과 별개로)에는 적어도 하나의 다른 콜레스테롤-저하 (혈청 및/또는 전신 콜레스테롤) 작용제가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 일부 구체예에서, 작용제는 LDLR의 발현을 증가시키고, 혈청 HDL 수준을 증가시키거나, LDL 수준을 저하시키거나 또는 트리글리세리드 수준을 저하시키는 것으로 관찰되었다. 예시적인 작용제에는 스타틴 (아토르바스타틴, 세리바스타틴, 플루바스타틴, 로바스타틴, 메바스타틴, 피타바스타틴, 프라바스타틴, 로수바스타틴, 심바스타틴), 니코틴산 (니아신) (NIACOR, NIASPN (느린 방출 니아신), SLO-NIACIN (느린 방출 니아신), CORDAPTIVE (라로피프란트)), 피브린산 (LOPID (겜피브로질), TRICOR (페노피브레이트), 담즙산 격리제 (QUESTRAN (콜레스티라민), 콜레세벨람 (WELCHOL), COLESTID (콜레스티폴)), 콜레스테롤 흡수 저해제 (ZETIA (에제티미브)), 니코틴산과 스타틴의 합동 (ADVICOR (LOVASTATIN 및 NIASPN), 스타틴과 흡수 저해제의 합동 (VYTORIN (ZOCOR 및 ZETIA) 및/또는 지질 변형제가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 일부 구체예에서, ABP는 PPAR 감마 효능제, PPAR 알파/감마 효능제, 스쿠알렌 신타아제 저해제, CETP 저해제, 항-고혈압제, 항-당뇨병제 (가령, 술포닐 우레아, 인슐린, GLP-1 유사체, DDPIV 저해제, 예를 들면, 메타포르민), ApoB 조절제, 예를 들면, 미포메르산, MTP 저해제 및/또는 폐색성 동맥경화 치료제와 합동된다. 일부 구체예에서, ABP는 개체 내에서 LDLR 단백질의 수준을 증가시키는 작용제, 예를 들면, 스타틴, 일정한 사이토킨, 예를 들면, 온코스타틴 M, 에스트로겐, 및/또는 일정한 허브 성분, 예를 들면, 베르베린과 합동된다. 일부 구체예에서, ABP는 개체 내에서 혈청 콜레스테롤 수준을 증가시키는 작용제 (가령, 일정한 항정신병약, 일정한 HIV 프로테아제 저해제, 식이 요인 (dietary factor), 예를 들면, 높은 프럭토오스, 수크로오스, 콜레스테롤 또는 일정한 지방산, 그리고 RXR, RAR, LXR, FXR에 대한 일정한 핵 수용체 효능제와 길항제)와 합동된다. 일부 구체예에서, ABP는 개체 내에서 PCSK9의 수준을 증가시키는 작용제, 예를 들면, 스타틴 및/또는 인슐린과 합동된다. 이들 둘의 복합은 다른 작용제의 원치 않는 부작용이 ABP에 의해 경감될 수 있도록 한다.

일정한 구체예에서, PCSK9에 대한 항원 결합 단백질은 염증에 대한 적어도 하나의 치료제와 병용될 수 있다. 일정한 구체예에서, PCSK9에 대한 항원 결합 단백질은 면역 질환에 대한 적어도 하나의 치료제와 병용될 수 있다. 염증과 면역 질환에 대한 예시적인 치료제에는 시클로옥시게나아제 타입 1 (COX-1)과 시클로옥시게나아제 타입 2 (COX-2) 저해제; 38 kDa 미토겐-활성화된 단백질 키나아제 (p38-MAPK)의 작은 분자 조절제; 염증 경로에 관여하는 세포내 분자의 작은 분자 조절제가 포함되지만 이들에 국한되지 않고, 여기서 이런 세포내 분자에는 jnk, IKK, NF-κB, ZAP70, 그리고 lck가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 염증에 대한 일정한 예시적인 치료제는 예로써, C.A. Dinarello & L.L. Moldawer Proinflammatory and Anti-Inflammatory Cytokines in Rheumatoid Arthritis: A Primer for Clinicians Third Edition (2001) Amgen Inc. Thousand Oaks, CA에서 설명된다.

진단적 적용

일부 구체예에서, ABP는 진단적 도구로서 이용된다. ABP는 시료 및/또는 개체 내에 존재하는 PCSK9의 양을 검정하는데 이용될 수 있다. 당업자가 인지하는 바와 같이, 이런 ABP는 중화 ABP일 필요가 없다. 일부 구체예에서, 진단적 ABP는 중화 ABP가 아니다. 일부 구체예에서, 진단적 ABP는 중화 ABP가 결합하는 에피토프와 상이한 에피토프에 결합한다. 일부 구체예에서, 2개의 ABP는 서로 경쟁하지 않는다.

일부 구체예에서, 본원에서 개시된 ABP는 PCSK9의 수준에서 변화와 연관된 질환 또는 장애에 대해 스크리닝/진단하기 위해, 포유류 조직 또는 세포 내에서 PCSK9의 검출을 위한 검정 키트 및/또는 방법에서 이용되거나 제공된다. 키트는 PCSK9에 결합하는 ABP, 그리고 ABP와 PCSK9 (존재하면)의 결합 및 선택적으로 PCSK9 단백질 수준을 지시하기 위한 수단을 포함한다. ABP의 존재를 지시하기 위한 다양한 수단이 이용될 수 있다. 가령, 형광단, 기타 분자 프로브, 또는 효소가 ABP에 연결될 수 있고, 그리고 ABP의 존재가 다양한 방식으로 관찰될 수 있다. 이런 질환에 대해 스크리닝하기 위한 방법은 키트의 이용 또는 단순히, 개시된 ABP 중에서 하나의 이용, 그리고 ABP가 시료 내에서 PCSK9에 결합하는 지의 결정을 수반할 수 있다. 당업자가 인지하는 바와 같이, 높은 또는 상승된 수준의 PCSK9는 시료 내에서 PCSK9에 대한 더욱 많은 양의 ABP 결합을 유발할 것이다. 따라서 ABP 결합의 정도는 얼마나 많은 PCSK9가 시료 내에 있는 지를 결정하는데 이용될 수 있다. 미리 결정된 양 (가령, PCSK9 관련 질환이 없는 개체가 갖는 양 또는 범위)보다 많은 PCSK9의 양을 갖는 개체 또는 시료는 PCSK9 매개된 질환을 앓는 것으로 특징될 수 있다. 일부 구체예에서, ABP는 스타틴이 개체 내에서 PCSK9의 양을 증가시키는 지를 결정하기 위해, 스타틴을 복용하는 개체에 투여된다.

일부 구체예에서, ABP는 비-중화 ABP이고, 그리고 ABP 및/또는 스타틴 치료를 받는 개체 내에서 PCSK9의 양을 결정하는데 이용된다.

실시예

수행된 실험 및 얻은 결과를 포함한, 다음 실시예는 예시적인 목적으로만 제공되고 본 발명에 제한하는 것으로 이해되지 않는다.

실시예 1

면역화 및 역가측정

항-PCSK9 항체 및 하이브리도마의 발생

PCSK9의 성숙한 형태에 대한 항체 (도 1A의 서열로서 나타남, 여기서 프로-도메인은 밑줄 쳐져 있음)를 XenoMouse^® 생쥐 (Abgenix, Fremont, CA)에서 길렀고, 여기서 상기 생쥐는 인간 면역글로불린 유전자를 함유한 생쥐이다. PCSK9에 대한 항체를 생산하는 데에 두 군의 XenoMouse^® 생쥐, 군 1과 2를 이용하였다. 군 1은 완전 인간 IgG2_κ및 IgG2λ항체를 생산하는 XenoMouse^® 계통 XMG2-KL의 생쥐를 포함하였다. 인간 PCSK9로 군 1 생쥐를 면역화하였다. 참조물 (NM_174936)로서 GenBank 서열을 이용한 표준 재조합 기술을 이용하여 PCSK9를 제조하였다. 군 2는 완전 인간 IgG4_κ 및 IgG4λ 항체를 생산하는 XenoMouse^® 계통 XMG4-KL의 생쥐를 포함하였다. 또한 인간 PCSK9로 군 2 생쥐를 면역화하였다.

표 3의 스케줄에 따라서, 두 군 모두의 생쥐에 항원을 11회 주사하였다. 초기 면역화에서, 생쥐 각각에 복부로 복강내 전달되는 전체 10 μg의 항원을 주사하였다. 차후 추가접종은 5ug 분량이고 주사 방법은 복부로 복강내 주사와 꼬리 바닥에서 피하 주사 사이에 시차를 두었다. 복강내 주사를 위하여, TiterMax^® Glod (Sigma, Cat # T2684)로 에멀젼으로서 항원을 제조하고 피하 주사를 위하여 항원을 알룸 (알루미늄 포스페이트) 및 CpG 올리고와 혼합한다. 주사 2 내지 8 및 10에서, 생쥐 각각에 어쥬번트 알룸 겔내 전체 5 μg의 항원을 주사하였다. 생쥐 당 5 μg 항원의 최종 주사는 인산염 완충 염수에서 전달되고 두 부위, 복부 내로 50% IP 및 꼬리 바닥에 50% SQ, 내로 전달된다. 면역화 프로그램은 하기 제시된, 표 2에서 요약된다.

<표 3>

XenoMouse 동물을 적정하는 데에 이용되는 프로토콜은 다음과 같았다: Costar 3368 배지 결합 평판을 뉴트라바딘 @ 8ug/ml (50ul/웰)으로 코팅하였고 하룻밤 동안 1XPBS/0.05%아지드에서 4℃로 인큐베이션하였다. 상기 평판을 TiterTek 3-주기 세척을 이용하여 RO 물로 세척하였다. 평판을 250ul의 1XPBS/1%유(milk)를 이용하여 차단하였고 RT에서 적어도 30분 동안 인큐베이션하였다. 차단한 것을 TiterTek 3-주기 세척을 이용하여 RO 물로 씻어내었다. 이후 당업자는 1XPBS/1%유/10mM Ca2+ (검정 희석제)에서 b-인간 PCSK9 @ 2ug/ml를 포획하였고 RT에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 이후 당업자는 TiterTek 3-주기 세척을 이용하여 RO 물로 세척하였다. 일차 항체에 대하여, 혈청을 1:100으로 이중복하여 1:3으로 적정하였다. 이것은 검정 희석제 50ul/웰에서 수행하였고 RT에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 이후 당업자는 TiterTek 3-주기 세척을 이용하여 RO 물로 세척하였다. 이차 항체는 50ul/웰의 검정 희석제내 염소 항 인간 IgG Fc HRP @ 400 ng/ml였다. 이것을 RT에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 이후 이것을 TiterTek 3-주기 세척을 이용하여 RO 물로 세척하였고 종이 타월로 두드려 건조시켰다. 기질에 대하여, 1-단계 TMB 용액 (Neogen, Lexington, Kentucky)을 이용하였고 (50ul/웰) RT에서 30분 동안 발달하도록 하였다.

ELISA 검정에서 따른 프로토콜은 다음과 같았다: V5His 태그는 없고 b-PCSK9를 포함한 시료에 대하여 다음 프로토콜을 이용하였다: Costar 3368 배지 결합 평판 (Corning Life Sciences)을 이용하였다. 평판을 1XPBS/0.05%아지드, (50 μl/웰)에서 8 μg /ml의 뉴트라바딘으로 코팅하였다. 평판을 하룻밤 동안 4℃에서 인큐베이션하였다. 이후 Titertek M384 평판 세척기 (Titertek, Huntsville, AL)를 이용하여 평판을 세척하였다. 3-주기 세척을 수행하였다. 평판을 250 μl의 1XPBS/1%유로 차단하였고 실온에서 대략 30분 인큐베이션하였다. 이후 M384평판 세척기를 이용하여 평판을 세척하였다. 3-주기 세척을 수행하였다. 포획은 V5 태그가 없는 b-hu PCSK9였고, 상기 포획을 1XPBS/1%유/10mM Ca²⁺ (40 μl/웰)내 2 μg/ml로 첨가하였다. 이후 평판을 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 3-주기 세척을 수행하였다. 혈청을 1:100으로 이중복하여 1:3으로 적정하였고, 그리고 H열은 혈청에 대한 블랭크(blank)였다. 50 μl/웰의 용적에서, 검정 희석제로 적정을 수행하였다. 평판을 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 그 다음, 3-주기 세척을 수행하였다. 1XPBS/1%유/10mM Ca²⁺ (50 μl/웰)내 100 ng/ml (1:4000)의 염소 항 인간 IgG Fc HRP를 평판에 첨가하였고 실온에서 1시간 인큐베이션하였다. 3-주기 세척을 이용하여 다시 한번, 평판을 세척하였다. 이후 평판을 종이 타월로 두드리며 건조시켰다. 최종적으로, 1 단계 TMB (Neogen, Lexington, Kentucky) (50 μl/웰)를 평판에 첨가하였고 실온에서 30분 후에 1N 염산 (50 μl/웰)로 퀀칭하였다. Titertek 평판 판독기를 이용하여 450 nm에서 즉시 OD를 판독하였다.

평판 결합 PCSK9를 검출하기 위한 양성 대조군은 검정 희석제내 3 μg/ml으로 이중복하여 1:3으로 적정된 가용성 LDL 수용체 (R&D Systems, Cat #2148LD/CF) 및 다클론 토끼 항-PCSK9 항체 (Caymen Chemical #10007185)였다. 400 ng/ml의 농도의 염소 항 LDLR (R&D Systems, Cat #AF2148) 및 토끼 항 염소 IgGFc HRP로 LDLR를 검출하였고; 검정 희석제내 400 ng/ml의 농도의 염소 항-토끼 IgG Fc로 토끼 다클론을 검출하였다. 음성 대조군은 검정 희석제내 1:100으로 이중복하여 1:3으로 적정된 무경험(naive) XMG2-KL 및 XMG4-KL 혈청이었다.

V5His 태그가 있는 b-PCSK9를 포함한 시료에 대하여 다음 프로코톨을 이용하였다: Costar 3368 배지 결합 평판 (Corning Life Sciences)을 이용하였다. 평판을 1XPBS/0.05%아지드, (50 μl/웰)에서 8 μg /ml의 뉴트라바딘으로 코팅하였다. 평판을 하룻밤 동안 4℃에서 인큐베이션하였다. 이후 Titertek M384 평판 세척기 (Titertek, Huntsville, AL)를 이용하여 평판을 세척하였다. 3-주기 세척을 수행하였다. 평판을 250 μl의 1XPBS/1%유로 차단하였고 실온에서 대략 30분 인큐베이션하였다. 이후 M384 평판 세척기를 이용하여 평판을 세척하였다. 3-주기 세척을 수행하였다. 포획은 V5 태그가 있는, b-hu PCSK9였고, 상기 포획을 1XPBS/1%유/10mM Ca²⁺ (40 μl/웰)내 2 μg/ml로 첨가하였다. 이후 평판을 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 3-주기 세척을 수행하였다. 혈청을 1:100으로 이중복하여 1:3으로 적정하였고, 그리고 H열은 혈청에 대한 블랭크였다. 50 μl/웰의 용적에서, 검정 희석제로 적정을 수행하였다. 평판을 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 그 다음, 3-주기 세척을 이용하여 작동되는 M384 평판 세척기를 이용하여 평판을 세척하였다. 1XPBS/1%유/10mM Ca²⁺내 400 ng/ml의 염소 항 인간 IgG Fc HRP를 50 μl/웰로 평판에 첨가하였고 상기 평판을 실온에서 1시간 인큐베이션하였다. 3-주기 세척을 이용하여 다시 한번, 평판을 세척하였다. 이후 평판을 종이 타월로 두드리며 건조시켰다. 최종적으로, 1 단계 TMB (Neogen, Lexington, Kentucky) (50 μl/웰)를 평판에 첨가하였고 상기 평판을 실온에서 30분 후에 1N 염산 (50 μl/웰)로 퀀칭하였다. Titertek 평판 판독기를 이용하여 450 nm에서 즉시 OD를 판독하였다.

양성 대조군은 검정 희석제내 3 μg/ml로 이중복하여 1:3으로 적정된, 토끼 항-PCSK9, LDLR이었다. LDLR은 400 ng/ml의 농도의 염소 항-LDLR (R&D Systems, Cat #AF2148) 및 토끼 항-염소 IgG Fc HRP로 검출하고; 토끼 폴리는 검정 희석제내 400 ng/ml의 농도의 염소 항-토끼 IgG Fc로 검출하였다. 검정 희석제내 1 μg/ml로 이중복하여 1:3으로 인간 항-His 1.2,3 및 항-V5 1.7.1을 적정하였고; 둘 모두를 검정 희석제내 400 ng/ml의 농도의 염소 항-인간 IgG Fc HRP로 검출하였다. 음성 대조군은 검정 희석제내 1:100으로 이중복하여 1:3으로 적정된 무경험 XMG2-KL 및 XMG4-KL 혈청이었다.

설명된 바와 같은 가용성 항원으로 면역화된 생쥐에 대한 ELISA 검정으로 인간 PCSK9에 대항한 항체의 역가를 검사하였다. 표 4는 ELISA 데이터를 요약하고 PCSK9에 대해 특이적인 것으로 나타난 몇몇 생쥐가 있었다는 점을 나타낸다. 가령, 표 4를 참조한다. 따라서, 면역화 프로그램의 말에, 수확하기 위해 10마리의 생쥐 (표 4에서 굵은 활자체)를 선택하였고, 본원에서 설명된 바와 같이, 비장 및 림프절, 각각에서 비장세포 및 림프구를 단리시켰다.

<표 4>

실시예 2

림프구, B-세포 단리의 회수, 융합체 및 하이브리도마의 발생

이 실시예는 어떻게 면역 세포를 회수하고 하이브리도마를 발생시키는지에 대해 약술한다. 선택된 면역화된 생쥐를 경추탈골로 희생시켰고 그리고 배액 림프절을 코호트 각각으로부터 수확하고 풀링하였다. 조직으로부터 세포를 방출시키기 위해 DMEM에서 분쇄시킴으로써 림프 조직으로부터 B 세포를 분리시켰고, 상기 세포를 DMEM에서 현탁시켰다. 세포 수를 세었고, 일 억 개의 림프구 당 0.9 ml DMEM의 세포 펠렛(pellet)에 첨가하여 세포를 부드럽게 하지만 완전히 재현탁시켰다.

림프구를 1:4의 비율로 ATCC, cat.# CRL 1580 (Kearney et al., (1979) J. Immunol. 123, 1548-1550)으로부터 구매한 비분비 골수종 P3X63Ag8.653 세포와 혼합하였다. 4분 간 400 x g에서 원심분리함으로써 세포 혼합물을 부드럽게 펠렛화하였다. 상층액을 따라낸 후, 1 ml 피펫을 이용하여 세포를 부드럽게 혼합하였다. Sigma (cat# P7306) 로부터의 예열된 PEG/DMSO 용액 (100 만개의 B-세포당 1 ml)을 1분에 걸쳐 부드럽게 교반하면서 천천히 첨가하였고 그 다음 1분 간 혼합하였다. 예열된 IDMEM (100만 개의 B-세포 당 2 ml) (글루타민, L-글루타민, 페니실린/스트렙토마이신(pen/strep), MEM 비-필수 아미노산 (모두 Invitrogen으로부터)이 없는 DMEM을 부드럽게 교반하면서 2분에 걸쳐 첨가하였다. 최종적으로, 예열된 IDMEM (10⁶ 개의 B-세포당 8 ml)을 3분에 걸쳐 첨가하였다.

융합된 세포를 6분 간 400 x g으로 회전시켜 가라앉혔고 백 만개의 B-세포 당 20 ml 선택 배지 (DMEM (Invitrogen), L-글루타민, 페니실린/스트렙토마이신, MEM 비-필수 아미노산, 나트륨 피루베이트, 2-머캅토에탄올 (모두 Invitrogen으로부터), HA-아자세린 하이포잔틴 및 OPI (옥살로아세테이트, 피루베이트, 소 인슐린) (둘 다 Sigma로부터)로 보충된, 15 % FBS (Hyclone), 그리고 IL-6 (Boehringer Mannheim))에서 재현탁시켰다. 세포를 37C에서 20-30분 동안 인큐베이션하였고 이후 200 ml 선택 배지에서 재현탁시켰고 그리고 96 웰에 도말하기에 앞서 T175 플라스크에서 3-4일 동안 배양하였다. 따라서, PCSK9에 대한 항원 결합 단백질이 생산되는 하이브리도마가 생산되었다.

실시예 3

PCSK9 항체의 선택

본 실시예는 어떻게 다양한 PCSK9 항원 결합 단백질을 특성화하고 선택하는지에 대해 약술한다. PCSK9와 분비된 항체 (실시예 1과 2에서 생산된 하이브리도마로부터 생산됨)의 결합을 평가하였다. 항체의 선택은 결합 데이터 및 LDLR과의 PCSK9 결합의 저해 및 친화성에 기반하였다. 하기 설명된 바와 같이, ELISA로 가용성 PCSK9와의 결합을 분석하였다. 결합 친화성을 정량화하는 데에 BIAcore^® (표면 플라스몬 공명)를 이용하였다.

일차 스크린(Screen)

야생형 PCSK9에 결합하는 항체에 대한 일차 스크린을 수행하였다. 두 가지 수확물에서 일차 스크린을 수행하였다. 일차 스크린은 ELISA 검정을 포함하였고 그리고 다음 프로토콜을 이용하여 수행하였다:

Costar 3702 배지 결합 384 웰 평판 (Corning Life Sciences)을 이용하였다. 평판을 40 μl/웰의 용적의 1XPBS/0.05%아지드내 4 μg/ml의 농도의 뉴트라바딘으로 코팅하였다. 평판을 하룻밤 동안 4℃에서 인큐베이션하였다. 이후 Titertek 평판 세척기 (Titertek, Huntsville, AL)를 이용하여 평판을 세척하였다. 평판을 90 μl의 1XPBS/1%유로 차단하였고 실온에서 대략 30분 인큐베이션하였다. 이후 평판을 세척하였다. 다시, 3-주기 세척을 수행하였다. 포획 시료는 V5 태그가 없는, 비오틴화-PCSK9이었고, 상기 시료를 40 μl/웰의 용적의 1XPBS/1%유/10mM Ca²⁺내 0.9 μg/ml로 첨가하였다. 이후 평판을 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 그 다음, 3-주기 세척을 이용하여 작동되는 Titertek 평판 세척기를 이용하여 평판을 세척하였다. 10 μl의 상층액을 40 μl의 1XPBS/1%유/10mM Ca²⁺ 내로 이동시켰고 실온에서 1.5시간 인큐베이션하였다. 다시, 3-주기 세척을 이용하여 작동되는 Titertek 평판 세척기를 이용하여 평판을 세척하였다. 1XPBS/1%유/10mM Ca²⁺내 100 ng/ml (1:4000)의 농도로 40 μl/웰의 염소 항-인간 IgG Fc POD를 평판에 첨가하였고 실온에서 1시간 인큐베이션하였다. 3-주기 세척을 이용하여, 평판을 다시 한 번 세척하였다. 최종적으로, 40 μl/웰의 1-단계 TMB (Neogen, Lexington, Kentucky)를 평판에 첨가하였고 40 μl/웰의 1N 염산으로 퀀칭을 실온에서 30분 후에 수행하였다. Titertek 평판 판독기를 이용하여 450 nm에서 즉시 OD를 판독하였다.

일차 스크린은 두 가지 수확물로부터 식별되는 전체 3104개 항원 특이적 하이브리도마를 야기하였다. 가장 높은 ELISA OD에 기반하여, 수확물 당 1500개 하이브리도마는 전체 3000개의 양성을 위해 진전되었다.

확인 스크린

이후 안정된 하이브리도마가 확립되었는지 확인하기 위해 야생형 PCSK9과 결합하는 것에 대해 3000개의 양성을 재스크리닝하였다. 스크린을 다음과 같이 수행하였다: Costar 3702 배지 결합 384 웰 평판 (Corning Life Sciences)을 이용하였다. 평판을 40 μl/웰의 용적의 1XPBS/0.05%아지드내 3 μg/ml의 뉴트라바딘으로 코팅하였다. 평판을 하룻밤 동안 4℃에서 인큐베이션하였다. 이후 Titertek 평판 세척기 (Titertek, Huntsville, AL)를 이용하여 평판을 세척하였다. 3-주기 세척을 수행하였다. 평판을 90 μl의 1XPBS/1%유로 차단하였고 실온에서 대략 30분 인큐베이션하였다. 이후 M384 평판 세척기를 이용하여 평판을 세척하였다. 3-주기 세척을 수행하였다. 포획 시료는 V5 태그가 없는, b-PCSK9였고, 상기 시료를 40 μl/웰의 용적의 1XPBS/1%유/10mM Ca²⁺내 0.9 μg/ml로 첨가하였다. 이후 평판을 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 그 다음, 3-주기 세척을 이용하여 평판을 세척하였다. 10 μl의 상층액을 40μl의 1XPBS/1%유/10mM Ca²⁺ 내로 이동시켰고 실온에서 1.5시간 인큐베이션하였다. 다시 3-주기 세척을 이용하여 작동되는 Titertek 평판 세척기를 이용하여 평판을 세척하였다. 1XPBS/1%유/10mM Ca²⁺내 100 ng/ml (1:4000)의 농도로 40 μl/웰의 염소 항-인간 IgG Fc POD를 평판에 첨가하였고, 그리고 평판을 실온에서 1시간 인큐베이션하였다. 3-주기 세척을 이용하여 다시 한번, 평판을 세척하였다. 최종적으로, 40 μl/웰의 한-단계 TMB (Neogen, Lexington, Kentucky)를 평판에 첨가하였고 실온에서 30분 후에 40 μl/웰의 1N 염산으로 퀀칭하였다. Titertek 평판 판독기를 이용하여 450 nm에서 즉시 OD를 판독하였다. 전체 2441개의 양성을 이차 스크린에서 반복하였다. 이후 이들 항체를 차후 스크리닝에서 이용하였다.

생쥐 교차-반응성 스크린

이후 항체가 인간 및 생쥐 PCSK9 둘 모두에 결합할 수 있는지 확인하기 위해 생쥐 PCSK9에 대한 교차-반응성에 대해 하이브리도마의 패널을 스크리닝하였다. 교차-반응성 스크린에서 다음 프로토콜을 이용하였다: Costar 3702 배지 결합 384 웰 평판 (Corning Life Sciences)을 이용하였다. 평판을 40 μl/웰의 용적의 1XPBS/0.05%아지드내 3 μg/ml의 뉴트라바딘으로 코팅하였다. 평판을 하룻밤 동안 4℃에서 인큐베이션하였다. 이후 Titertek 평판 세척기 (Titertek, Huntsville, AL)를 이용하여 평판을 세척하였다. 3-주기 세척을 수행하였다. 평판을 90 μl의 1XPBS/1%유로 차단하였고 실온에서 대략 30분 인큐베이션하였다. 이후 Titertek 평판 세척기를 이용하여 평판을 세척하였다. 3-주기 세척을 수행하였다. 포획 시료는 비오틴화된-생쥐 PCSK9였고, 상기 시료를 40 μl/웰의 용적의 1XPBS/1%유/10mM Ca²⁺ 내 1 μg/ml로 첨가하였다. 이후 평판을 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 그 다음, 3-주기 세척을 이용하여 작동되는 Titertek 평판을 이용하여 평판을 세척하였다. 50 μl의 상층액을 평판으로 이동시켰고 실온에서 1시간 인큐베이션하였다. 다시, 3-주기 세척을 이용하여 평판을 세척하였다. 1XPBS/1%유/10mM Ca²⁺내 100 ng/ml (1:4000)의 농도로 40 μl/웰의 염소 항-인간 IgG Fc POD를 평판에 첨가하였고 그리고 상기 평판을 실온에서 1시간 인큐베이션하였다. 3-주기 세척을 이용하여 다시 한번, 평판을 세척하였다. 최종적으로, 40 μl/웰 1-단계 TMB (Neogen, Lexington, Kentucky)를 평판에 첨가하였고 실온에서 30분 후에 40 μl/웰의 1N 염산으로 퀀칭하였다. Titertek 평판 판독기를 이용하여 450 nm에서 즉시 OD를 판독하였다. 579개의 항체를 관찰하여 생쥐 PCSK9와 교차-반응시켰다. 이후 이들 항체를 차후 스크리닝에서 이용하였다.

D374Y 돌연변이체 결합 스크린

PCSK9내 D374Y돌연변이는 인간 모집단에서 기록되어왔다 (가령, Timms KM et al, "A mutation in PCSK9 causing autosomal-dominant hypercholesterolemia in a Utah pedigree", Hum. Genet. 114: 349-353, 2004). 항체가 야생형에 대해 특이적인지 또는 PCSK9의 D374Y 형태에 또한 결합되는지 확인하기 위하여, 이후 시료를 돌연변이 D374Y를 포함하는 돌연변이체 PCSK9 서열에 결합하는 것에 대해 스크리닝하였다. 스크린에 대한 프로토콜은 다음과 같았다: 스크린에서 Costar 3702 배지 결합 384 웰 평판 (Corning Life Sciences)을 이용하였다. 평판을 40 μl/웰의 용적의 1XPBS/0.05%아지드내 4 μg/ml의 뉴트라바딘으로 코팅하였다. 평판을 하룻밤 동안 4℃에서 인큐베이션하였다. 이후 Titertek 평판 세척기 (Titertek, Huntsville, AL)를 이용하여 평판을 세척하였다. 3-주기 세척을 수행하였다. 평판을 90 μl의 1XPBS/1%유로 차단하였고 실온에서 대략 30분 인큐베이션하였다. 이후 Titertek 평판 세척기를 이용하여 평판을 세척하였다. 3-주기 세척을 수행하였다. 평판을 1XPBS/1%유/10mMCa²⁺내 1 μg/ml의 농도의 비오틴화된 인간 PCSK9 D374Y로 코팅하였고 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 이후 Titertek 평판 세척기를 이용하여 평판을 세척하였다. 3-주기 세척을 수행하였다. 최근의 소모(exhaust) 하이브리도마 배양 상층액을 PBS/유/Ca²⁺ (10 ml 플러스 40 ml)에서 1:5로 희석하였고 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 그 다음, 1XPBS/1%유/10mMCa²⁺내 1ug/ml에서 40μl/웰의 토끼 항-인간 PCSK9 (Cayman Chemical) 및 인간 항-His 1.2.3 1:2를 평판 상에 적정하였고, 이후 상기 평판을 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 이후 Titertek 평판 세척기를 이용하여 평판을 세척하였다. 3-주기 세척을 수행하였다. 1XPBS/1%유/10mM Ca²⁺내 100 ng/ml (1:4000)의 농도로 40 μl/웰의 염소 항-인간 IgG Fc HRP를 평판에 첨가하였고 그리고 상기 평판을 실온에서 1시간 인큐베이션하였다. 1XPBS/1%유/10mM Ca²⁺내 100 ng/ml (1:4000) 농도로 40 μl/웰의 염소 항-토끼 IgG Fc HRP를 평판에 첨가하였고 그리고 상기 평판을 실온에서 1시간 인큐베이션하였다. 이후 Titertek 평판 세척기를 이용하여 평판을 세척하였다. 3-주기 세척을 수행하였다. 최종적으로, 40 μl/웰의 1-단계 TMP (Neogen, Lexington, Kentucky)를 평판에 첨가하였고 실온에서 30분 후 40 μl/웰의 1N 염산으로 퀀칭하였다. Titertek 평판 판독기를 이용하여 450 nm에서 즉시 OD를 판독하였다. 야생형 PCSK9에서 96% 이상의 양성 적중(positive hit)은 또한 돌연변이체 PCSK9를 결합시켰다.

대규모 수용체 리간드 차단 스크린

LDLR과의 PCSK9 결합을 차단하는 항체에 대해 스크리닝하기 위해, D374Y PCSK9 돌연변이체를 이용하여 검정을 발달시켰다. 이 검정을 위해 돌연변이체를 이용하였는데, 이는 상기 돌연변이체가 더욱 민감한 수용체 리간드 차단 검정이 발달되도록 하는 LDLR과의 더 높은 결합 친화성을 가지기 때문이다. 수용체 리간드 차단 스크린에서 다음 프로토콜을 이용하였다: 스크린에서 Costar 3702 배지 결합 384 웰 평판 (Corning Life Sciences)을 이용하였다. 평판을 40 μl/웰의 용적의 1XPBS/0.05%아지드내 2 μg/ml의 염소 항-LDLR (R&D Cat #AF2148)로 코팅하였다. 평판을 하룻밤 동안 4℃에서 인큐베이션하였다. 이후 Titertek 평판 세척기 (Titertek, Huntsville, AL)를 이용하여 평판을 세척하였다. 3-주기 세척을 수행하였다. 평판을 90 μl의 1XPBS/1%유로 차단하였고 실온에서 대략 30분 인큐베이션하였다. 이후 Titertek 평판 세척기를 이용하여 평판을 세척하였다. 3-주기 세척을 수행하였다. 포획 시료는 LDLR (R&D, Cat #2148LD/CF)이었고, 그리고 상기 시료를 40 μl/웰의 용적의 1XPBS/1%유/10mM Ca²⁺내 0.4 μg/ml로 첨가하였다. 이후 평판을 실온에서 1시간 10분 동안 인큐베이션하였다. 동시에, 20 ng/ml의 비오틴화된 인간 D374Y PCSK9를 Nunc 폴리프로필렌 평판내 15 마이크로 리터의 하이브리도마 소모 상층액과 인큐베이션하였고 그리고 소모 상층액 농도는 1:5로 희석하였다. 이후 평판을 실온에서 약 1시간 30분 동안 전-인큐베이션하였다. 그 다음, 3-주기 세척을 이용하여 작동되는 Titertek 평판 세척기를 이용하여 세척하였다. 50 μl/웰의 전-인큐베이션된 혼합물을 LDLR 코팅 ELISA 평판 상에 이동시켰고 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. LDLR-결합 b-PCSK9을 검출하기 위하여, 검정 희석제내 500 ng/ml 에서 40 μl/웰의 스트렙타비딘 HRP를 평판에 첨가하였다. 평판을 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. Titertek 평판 세척기를 이용하여 평판을 다시 세척하였다. 3-주기 세척을 수행하였다. 최종적으로, 40μl/웰의 1-단계 TMB (Neogen, Lexington, Kentucky)를 평판에 첨가하였고 실온에서 30분 후 40μl/웰의1N 염산으로 퀀칭하였다. Titertek 평판 판독기를 이용하여 450 nm에서 즉시 OD를 판독하였다. 스크린은 PCSK9 및 LDLR 웰 사이의 상호작용을 차단한 384개의 항체, 상호작용을 강하게 차단한 100개의 항체를 식별하였다 (OD < 0.3). 이들 항체는 PCSK9 및 LDLR의 결합 상호작용을 90% 보다 더 크게 저해하였다 (90%보다 더 크게 저해).

차단제 서브세트(subset) 상에서 수용체 리간드 결합 검정

이후 첫 번째 대규모 수용체 리간드 저해 검정에서 식별된 중화제의 384개 구성원 서브세트 상에서 돌연변이체 효소를 이용하여 수용체 리간드 검정을 반복하였다. 대규모 수용체 리간드 차단 스크린에서 수행되었던 것과 동일한 프로토콜을 384개 구성원 차단제 서브세트 검정의 스크린에서 이용하였다. 이 반복 스크린은 초기 스크리닝 데이터를 확인하였다.

384개 구성원 서브세트의 이 스크린은 PCSK9 돌연변이체 효소 및 LDLR 사이의 상호작용이 90%보다 더 크게 차단된 85개의 항체를 식별하였다.

야생형 PCSK9를 결합시키지만 D374Y 돌연변이체는 결합시키지 않는 차단제의 수용체 리간드 결합 검정

3000 상층액의 초기 패널에서, 야생형 PCSK9에 특이적으로 결합하고 huPCSK9(D374Y) 돌연변이체에서는 그렇지 않은 것을 보여주는 86개의 항체가 있었다. LDLR 수용체에 야생형 PCSK9의 결합을 차단하는 능력에 대하여 이들 86 상층액을 검사하였다. 다음 프로토콜을 이용하였다: 스크린에서 Costar 3702 배지 결합 384 웰 평판 (Corning Life Sciences)을 이용하였다. 평판을 40 μl/웰의 용적의 1XPBS/0.05%아지드내 10 μg/ml의 항-His 1.2.3으로 코팅하였다. 평판을 하룻밤 동안 4℃에서 인큐베이션하였다. 이후 Titertek 평판 세척기 (Titertek, Huntsville, AL)를 이용하여 세척하였다. 3-주기 세척을 수행하였다. 평판을 90 μl의 1XPBS/1%유로 차단하였고 실온에서 대략 30분 인큐베이션하였다. 이후 Titertek 평판 세척기를 이용하여 평판을 세척하였다. 3-주기 세척을 수행하였다. LDLR (R&D Systems, #2148LD/CF 또는 R&D Systems, #2148LD)을 40 μl/웰의 용적의 1XPBS/1%유/10mM Ca²⁺내 5 μg/ml로 첨가하였다. 이후 평판을 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 그 다음, 3-주기 세척을 이용하여 작동되는 Titertek 평판 세척기를 이용하여 평판을 세척하였다. 동시에, 비오틴화된 인간 야생형 PCSK9를 Nunc 폴리프로필렌 평판내 하이브리도마 소모 상층액으로 전-인큐베이션하였다. 22 μl의 하이브리도마 상층액을 1XPBS/1%유/10mMCa2+내 583 ng/ml의 농도로 33ul의 b-PCSK9 내로 이동시켰으며, 이는 최종 b-PCSK9 농도 = 350 ng/ml 및 1:2.5의 최종 희석에서 소모 상층액을 제공하였다. 평판을 실온에서 대략 1시간 30분 동안 전-인큐베이션하였다. 50 μl/웰의 사전 인큐베이션된 혼합물을 LDLR 포획 ELISA 평판 상에 이동시켰고 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 이후 Titertek 평판 세척기를 이용하여 평판을 세척하였다. 3-주기 세척을 수행하였다. 검정 희석제내 500 ng/ml 에서 40 μl/웰의 스트렙타비딘 HRP를 평판에 첨가하였다. 평판을 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 이후 Titertek 평판 세척기를 이용하여 평판을 다시 세척하였다. 3-주기 세척을 수행하였다. 최종적으로, 40μl/웰의 1-단계 TMB (Neogen, Lexington, Kentucky)를 평판에 첨가하였고 실온에서 30분 후 40μl/웰의 1N 염산으로 퀀칭하였다. Titertek 평판 판독기를 이용하여 450 nm에서 즉시 OD를 판독하였다.

스크리닝 결과

설명된 검정 결과에 기반하여, 여러 가지 하이브리도마 계열을 PCSK9와 바람직한 상호작용을 하는 항체를 생산하는 것으로서 식별하였다. 각각의 계열로부터 처리가능한 수의 클론을 단리시키는 데에 한계 희석을 이용하였다. 클론은 하이브리도마 계열 번호 (가령 21B12) 및 클론 번호 (가령 21B12.1)에 의해 선정되었다. 일반적으로, 본원에서 설명된 기능성 검정에 의해 특정 계열의 상이한 클론 중에서 차이는 검출되지 않았다. 약간의 경우에, 기능성 검정에서 상이하게 작용하는 특정 계열로부터 클론을 식별하였다, 예를 들어, 25A7.1은 PCSK9/LDLR을 차단하지 않는 것으로 밝혀졌지만 25A7.3 (본원에서 25A7로 언급됨)은 중화되었다. 단리된 클론을 50-100 ml의 하이브리도마 배지에서 각각 확장시켰고 소모까지 성장하도록 하였다, (즉, 약 10% 미만의 세포 생존력). 이들 배양물의 상층액내 PCSK9에 대한 항체의 농도 몇 효력을 본원에서 설명된 바와 같이, ELISA로 그리고 시험관내 기능성 검사로 측정하였다. 본원에서 설명된 스크리닝의 결과로서, PCSK9에 대한 항체 중 가장 높은 역가를 가진 하이브리도마를 식별하였다. 선택된 하이브리도마는 도 2A-3D 및 표 2에서 보여준다.

실시예 4.1

하이브리도마로부터 인간 31H4 IgG4 항체의 생산

이 실시예는 어떻게 항원 결합 단백질 중 하나를 하이브리도마로부터 생산하는지에 대해 일반적으로 설명한다. 생산 작업은 50ml 소모 상층액 발생 그 다음 단백질 A 정제를 이용하였다. Integra 생산은 일정 비율 증가(scale up)를 위함이었고 추후에 수행하였다. 20 ml의 배지내 T75 플라스크에서 하이브리도마 계열 31H4를 성장시켰다 (Integra Media, 표 5). 하이브리도마가 T75 플라스크에서 거의 합쳐졌을 때, 상기 하이브리도마를 Integra 플라스크 (Integra Biosciences, Integra CL1000, cat# 90 005)로 이동시켰다.

Integra 플라스크는 막에 의해 두 개의 챔버(chamber), 소형 챔버와 대형 챔버로 나누어지는 세포 배양 플라스크이다. 31H4 하이브리도마 계열로부터 ml 당 1x10⁶ 개 세포의 최소 세포 밀도로 20-30 ml 용적의 하이브리도마 세포를 Integra 배지내 Integra 플라스크의 소형 챔버 내에 두었다 (Integra 배지의 성분에 대하여 표 5를 참고). Integra 배지 (1L)를 단독으로 Integra 플라스크의 대형 챔버에 두었다. 두 개의 챔버로 분리하는 막은 작은 분자량의 영양소에 대해 투과성이지만, 하이브리도마 세포 그리고 이들 세포에 의해 생산된 항체에 대해서는 비투과성이다. 따라서, 하이브리도마 세포 및 이들 하이브리도마 세포에 의해 생산된 항체는 소형 챔버에서 보유하였다.

1주일 후, 배지를 Integra 플라스크의 챔버 둘 모두로부터 제거하였고 신선한 Integra 배지로 교체하였다. 소형 챔버로부터의 수집된 배지를 분리하여 보유하였다. 성장 2주 후, 소형 챔버로부터의 배지를 다시 수집하였다. 하이브리도마 계열로부터 제1주에서의 수집된 배지를 하이브리도마 계열로부터 제2주에서의 수집된 배지와 합쳤다. 하이브리도마 계열로부터의 결과적 수집된 배지 시료를 회전시켜 세포 및 잔해물을 제거하였고 (3000rpm에서 15분) 그리고 결과적 상층액을 여과시켰다 (0.22μm). 정화된 조건화 배지를 단백질 A-세파로오스 칼럼 상에 로딩하였다. 선택적으로, 배지는 우선 농축될 수 있고 이후에 단백질 A 세파로오스 칼럼 상에 로딩될 수 있다. 확장 PBS 세척으로 비-특이적 결합을 제거하였다. 단백질 A 칼럼 상의 결합된 항체 단백질을 단백질 A 칼럼으로부터 표준 산성 항체 용리로 회수하였다 (가령, 50 mM 시트레이트, pH 3.0). 음이온 교환 수지, 가령 Q 세파로오스 수지 상에서 크기 배제 크로마토그래피 또는 결합 이온 교환 크로마토그래피로 단백질 A 세파로오스 풀내 집합된 항체 단백질을 제거하였다. 31H4 단백질에 대한 특정 IEX 조건은 pH 7.8-8.0에서의 Q-세파로오스 HP이다. 25 칼럼 용적내 10 mM-500 mM의 NaCl 구배로 항체를 용리시켰다.

<표 5>

실시예 4.2

형질감염된 세포로부터 재조합 31H4 인간 IgG2 항체의 생산

본 실시예는 어떻게 31H4 IgG2 항체를 형질감염된 세포로부터 생산하는지에 대해 약술한다. 일과성 발현에 대한 293 세포 및 안정된 발현에 대한 CHO 세포를 31H4 중쇄와 경쇄를 인코딩하는 플라스미드로 형질감염시켰다. 세포 및 세포 잔해물을 제거함으로써 형질감염된 세포로부터 조건화 배지를 회수하였다. 정화된 조건화 배지를 단백질 A-세파로오스 칼럼 상에 로딩하였다. 선택적으로, 배지는 우선 농축될 수 있고 이후에 단백질 A 세파로오스 칼럼 상에 로딩될 수 있다. 확장 PBS 세척으로 비-특이적 결합을 제거하였다. 단백질 A 칼럼 상의 결합된 항체 단백질을 단백질 A 칼럼으로부터 표준 산성 항체 용리로 회수하였다 (가령, 50 mM 시트레이트, pH 3.0). 음이온 교환 수지, 가령 Q 세파로오스 수지 상에서 크기 배제 크로마토그래피 또는 결합 이온 교환 크로마토그래피로 단백질 A 세파로오스 풀내 집합된 항체 단백질을 제거하였다. 31H4 단백질에 대한 특정 IEX 조건은 pH 7.8-8.0에서의 Q-세파로오스 HP이다. 25 칼럼 용적내 10 mM-500 mM의 NaCl 구배로 항체를 용리시켰다.

실시예 5

하이브리도마로부터 인간 21B12 IgG4 항체의 생산

본 실시예는 어떻게 항체 21B12 IgG4를 하이브리도마로부터 생산하는지에 대해 약술한다. 하이브리도마 계열 21B12를 배지 (Integra 배지, 표 5)내 T75 플라스크에서 성장시켰다. 하이브리도마가 T75 플라스크에서 거의 합쳐졌을 때, 상기 하이브리도마를 Integra 플라스크 (Integra Biosciences, Integra CL1000, cat# 90 005)로 이동시켰다.

Integra 플라스크는 막에 의해 두 개의 챔버, 소형 챔버와 대형 챔버로 나누어지는 세포 배양 플라스크이다. 31H4 하이브리도마 계열로부터 ml 당 1x10⁶ 개 세포의 최소 세포 밀도로 20-30 ml 용적의 하이브리도마 세포를 Integra 배지내 Integra 플라스크의 소형 챔버 내에 두었다 (Integra 배지의 성분에 대하여 표 5를 참고). Integra 배지 (1L)를 단독으로 Integra 플라스크의 대형 챔버에 두었다. 두 개의 챔버로 분리하는 막은 작은 분자량의 영양소에 대해 투과성이지만, 하이브리도마 세포 그리고 이들 세포에 의해 생산된 항체에 대해서는 비투과성이다. 따라서, 하이브리도마 세포 및 이들 하이브리도마 세포에 의해 생산된 항체는 소형 챔버에서 보유하였다.

1주일 후, 배지를 Integra 플라스크의 챔버 둘 모두로부터 제거하였고 신선한 Integra 배지로 교체하였다. 소형 챔버로부터의 수집된 배지를 분리하여 보유하였다. 성장 2주 후, 소형 챔버로부터의 배지를 다시 수집하였다. 하이브리도마 계열로부터 제1주에서의 수집된 배지를 하이브리도마 계열로부터 제2주에서의 수집된 배지와 합쳤다. 하이브리도마 계열로부터의 결과적 수집된 배지 시료를 회전시켜 세포 및 잔해물을 제거하였고 (3000rpm에서 15분) 그리고 결과적 상층액을 여과시켰다 (0.22μm). 정화된 조건화 배지를 단백질 A-세파로오스 칼럼 상에 로딩하였다. 선택적으로, 배지는 우선 농축될 수 있고 이후에 단백질 A 세파로오스 칼럼 상에 로딩될 수 있다. 확장 PBS 세척으로 비-특이적 결합을 제거하였다. 단백질 A 칼럼 상의 결합된 항체 단백질을 단백질 A 칼럼으로부터 표준 산성 항체 용리로 회수하였다 (가령, 50 mM 시트레이트, pH 3.0). 음이온 교환 수지, 가령 Q 세파로오스 수지 상에서 크기 배제 크로마토그래피 또는 결합 이온 교환 크로마토그래피로 단백질 A 세파로오스 풀내 집합된 항체 단백질을 제거하였다. 21B12 단백질에 대한 특정 IEX 조건은 pH 7.8-8.0에서의 Q-세파로오스 HP이다. 25 칼럼 용적내 10 mM-500 mM의 NaCl 구배로 항체를 용리시켰다.

실시예 6

형질감염된 세포로부터 인간 21B12 IgG2 항체의 생산

본 실시예는 어떻게 21B12 IgG2 항체를 형질감염된 세포로부터 생산하는지에 대해 약술한다. 세포 (일과성 발현에 대한 293 세포 및 안정된 발현에 대한 CHO 세포)를 21B12 중쇄와 경쇄를 인코딩하는 플라스미드로 형질감염시켰다. 세포 및 세포 잔해물을 제거함으로써 하이브리도마 세포로부터의 조건화 배지를 회수하였다. 정화된 조건화 배지를 단백질 A-세파로오스 칼럼 상에 로딩하였다. 선택적으로, 배지는 우선 농축될 수 있고 이후에 단백질 A 세파로오스 칼럼 상에 로딩될 수 있다. 확장 PBS 세척으로 비-특이적 결합을 제거하였다. 단백질 A 칼럼 상의 결합된 항체 단백질을 단백질 A 칼럼으로부터 표준 산성 항체 용리로 회수하였다 (가령, 50 mM 시트레이트, pH 3.0). 양이온 교환 수지, 가령 SP-세파로오스 수지 상에서 크기 배제 크로마토그래피 또는 결합 이온 교환 크로마토그래피로 단백질 A 세파로오스 풀내 집합된 항체 단백질을 제거하였다. 21B12 단백질에 대한 특정 IEX 조건은 pH 5.2에서의 SP-세파로오스 HP였다. 20 mM 아세트산나트륨 완충제내 10 mM-500 mM의 NaCl 구배를 함유하는 25 칼럼 용적의 완충제로 항체를 용리시켰다.

실시예 7

항체 중쇄와 경쇄의 서열 분석

이후 Sanger (디데옥시) 뉴클레오티드 서열화로 상기 항체의 경쇄와 중쇄에 대한 핵산 및 아미노산 서열을 결정하였다. 이후 아미노산 서열을 핵산 서열에 대해 추론하였다. 가변 도메인에 대한 핵산 서열은 도 3E-3JJ에서 나타난다.

31H4, 21B12, 그리고 16F12의 람다 경쇄 가변 영역에 대한 cDNA 서열을 결정하였고 그리고 상기 서열은 각각, 서열번호 153, 95, 그리고 105로 개시된다.

31H4, 21B12, 그리고 16F12의 중쇄 가변 영역에 대한 cDNA 서열을 결정하였고 그리고 상기 서열은 각각, 서열번호 152, 94, 그리고 104로 개시된다.

람다 경쇄 불변 영역 (서열번호 156), 그리고 IgG2 및 IgG4 중쇄 불변 영역 (서열번호 154 및 155)은 도 3KK에서 보여준다.

각각의 이들 cDNA 서열로부터 예측된 폴리펩티드 서열을 결정하였다. 31H4, 21B12, 그리고 16F12의 람다 경쇄 가변 영역에 대한 예측된 폴리펩티드 서열을 예측하였고 그리고 상기 서열은 각각, 서열번호 12, 23, 그리고 35로 개시되었다, 람다 경쇄 불변 영역 (서열번호 156), 31H4, 21B12, 그리고 16F12의 중쇄 가변 영역을 예측하였고 그리고 상기 영역은 (각각 서열번호 67, 49, 그리고 79로 개시되었다. IgG2 및 IgG4 중쇄 불변 영역 (서열번호 154 및 155).

FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4 분할은 FIG 2A-3D에서 보여준다.

서열 데이터에 기반하여, 중쇄 또는 경쇄 가변 영역 각각이 파생되는 생식계열 유전자를 결정하였다. 생식계열 유전자의 동일성은 도 2A-3D의 상응하는 하이브리도마 계열 옆에 명시되고 각각은 독특한 서열번호에 의해 대표된다. 2A-3D은 또한 특성화되었던 추가적인 항체에 대한 결정된 아미노산 서열을 나타낸다.

실시예 8

PCSK9와의 항체 결합의 특성

PCSK9에 결합하는 다수의 항체를 식별하는 데에, 여러 가지 기법을 이용하여 결합의 성질을 정량화하고 추가로 특성화하였다. 본 연구의 하나의 측면에서, Biacore 친화성 분석을 수행하였다. 본 연구의 또 다른 측면에서 KinExA^® 친화성 분석을 수행하였다. 이들 연구에서 이용된 시료와 완충제는 하기 도 6에서 제시된다.

<표 6>

BIAcore ^® 친화성 측정

이 실시예에서 설명된 PCSK9에 대한 21B12 항체의 BIAcore^® (표면 플라스몬 공명 장치, Biacore, Inc., Piscataway, NJ) 친화성 분석을 제조자의 지시에 따라 수행하였다.

간략하게, Biacore 2000 시각적 바이오센서 (Biacore, GE Healthcare, Piscataway, NJ)를 이용하여 표면 플라스몬 공명 실험을 수행하였다. 200 이하의 공명 단위 (RU)의 최대 분석물 결합 반응 (Rmax)을 주는 수준에서 아민-커플링함으로써 개별적인 항-PCSK9 항체 각각을 연구-등급(research-grade) CM5 바이오센서 칩에 고정화하였다. PCSK9 단백질의 농도를 2배 간격으로 변화시켰고 (분석물) 그리고 고정화된 항체 표면 위에 주사하였다 (1.5분 동안 100 μl/분의 유속으로). 0.01% BSA로 보충된 신선한 HBS-P 완충제 (pH 7.4, 0.01 M Hepes, 0.15 M NaCl, 0.005% 계면활성제 P-20, Biacore)를 결합 완충제로서 이용하였다. 항-PCSK9 항체 각각의 결합 친화성을 pH 7.4에서 각각의 인간, 생쥐, 그리고 시노몰구스 원숭이 PCSK9 단백질에 대해 분리 실험으로 측정하였다 (사용된 농도는 100, 50, 25, 12.5, 6.25, 3.125, 그리고 0 nM였다).

추가로, 0.01% BSA로 보충된 pH 6.0 HBS-P 완충제 (pH 6.0, 0.01 M Hepes, 0.15 M NaCl, 0.005% 계면활성제 P-20, Biacore)를 이용하여 pH 6.0에서 인간 PCSK9에 대한 항체의 결합 친화성을 또한 측정하였다. 얻은 결합 신호는 용액내 자유 PCSK9에 비례하였다. 이중-곡선 1-부위 동질 결합 모델 (KinExA^® 소프트웨어, Sapidyne Instruments Inc., Boise, ID) (6.0 pH 런(run)에 대해 n=1)을 이용하여 경쟁 곡선의 비선형 회귀 분석으로부터 해리 평형 상수 (K_D)를 얻었다. 흥미롭게도, 항체 더 낮은 pH에서 더 단단한 결합 친화성을 보여주는 것으로 나타났다 (여기서 Kd는 각각 31H4, 21B12, 그리고 16F12에 대하여 12.5, 7.3, 그리고 29 pM이 었음).

BIA 평가 3.1 컴퓨터 프로그램 (BIAcore, Inc. Piscataway, NJ)을 이용하여 k_a (결합 속도 상수), k_d (해리 속도 상수), 그리고 K_D (해리 평형 상수)를 포함한 항체 결합 동력학적 매개변수를 측정하였다. 더 낮은 해리 평형 상수는 PCSK9에 대하여 항체의 더 큰 친화성을 나타낸다. BIAcore^® 친화성 분석에 의해 측정된 K_D 값은 하기 제시된, 표 7.1에 제시된다.

<표 7.1>

표 7.2는 k_온 및 k_오프 속도를 나타낸다.

<표 7.2>

KinExA ^® 친화성 측정

제조자의 지시에 따라서 16F12 및 31H4의 16F12 및 31H4 KinExA^® (Sapidyne Instruments, Inc., Boise, ID Sapidyne Instruments, Inc., Boise, ID) 친화성 분석을 수행하였다. 간략하게, Reacti-Gel™ (6x) (Pierce)을 인간, V5-태그된 시아노 또는 His-태그된 생쥐 PCSK9 단백질 중 하나로 전-코팅하였고 BSA로 차단하였다. 이후 10 또는 100 pM의 항체 및 하나의 PCSK9 단백질을 PCSK9-코팅된 비드(bead)를 통과하기 전에 8시간 동안 실온에서 다양한 농도 (0.1 pM - 25 nM)의 PCSK9 단백질과 인큐베이션하였다. 비드-결합 31H4의 양을 형광으로 (Cy5) 표지된 염소 항-인간 IgG (H+L) 항체로 정량화하였다 (Jackson Immuno Research). 결합 신호는 결합 평형에서 자유 31H4의 농도에 비례한다. 1-부위 동질 결합 모델을 이용하여 두 세트의 경쟁 곡선의 비선형 회귀로부터 평형 해리 상수 (K_D)를 얻었다. 분석에서 KinExA^® Pro 소프트웨어를 이용하였다. 이 분석에서 발생된 결합 곡선은 도 4A-4F로서 제시된다.

16F12 및 31H4 항체 둘 모두는 인간 및 시아노 PCSK9에 대해 유사한 친화성을 보였지만, 생쥐 PCSK9에 대해서는 대략 10-250배 더 낮은 친화성을 보였다. KinExA^® 시스템을 이용하여 검사된 두 개의 항체 중에서, 항체 31H4는 인간 및 시아노 PCSK9 둘 모두에 대해서 각각 3 및 2 pM K_D로 더 높은 친화성을 보였다. 16F12는 인간 PCSK9에 대해 15pM K_D 및 시아노 PCSK9에 대해 16 pM K_D으로 약간 더 약한 친화성을 보였다.

KinExA^® 친화성 분석의 결과는 하기 제시된, 표 8.1에서 요약된다.

<표 8.1>

추가로, SDS PAGE를 수행하여 시료의 양과 질을 확인하고 이는 도 5A에서 나타난다. cPCSK9는 겔 상에서 그리고 또한 KinExA^® 검정으로부터 계산된 활성 결합 농도로부터 약 50% 미만을 나타냈다. 따라서, cPCSK9에 대한 mAb의 K_D를 본 발명에서 50%의 활성 cPCSK9로서 조정하였다.

ABP 21B12에 대한 Kd를 측정하는 데에 BIAcore 용액 평형 결합 검정을 이용하였다. KinExA 검정을 이용하여 21B12.1은 적은 신호를 나타내었고, 따라서, 비아코어(biacore) 용액 평형 검정을 적용시켰다. 고정화된 PCSK9 표면과의 항체의 결합 상에서 유의미한 결합을 관찰하지 못했으므로, 약 7000 RU 밀도를 갖는 아민 커플링을 이용하여 CM5 칩의 유동 세포 4 상에 21B12 항체를 고정화하였다. 유동 세포 3을 백그라운드 대조군(background control)으로서 이용하였다. 0.3, 1, 그리고 3 nM의 인간 PCSK9 또는 시아노 PCSK9를 PBS 플러스 0.1mg/ml BSA, 0.005% P20에서 연속 희석(serial dilution)의 21B12.1 항체 시료 (0.001 ~ 25 nM의 범위)와 혼합하였다. 혼합된 용액내 자유 PCSK9의 결합을 21B12.1 항체 표면 위에 주사함으로써 측정하였다. 21B12.1 표면 상의 100% PCSK9 결합 신호를 용액내 mAb 부재에서 측정하였다. 증가하는 농도의 mAb와의 감소된 PCSK9 결합 반응은 고정화된 펩티바디(peptibody) 표면과의 결합으로부터 PCSK9가 차단되는, 용액내 mAb와의 PCSK9 결합을 명시하였다. mAb 농도와 대비하여 PCSK9 결합 신호를 플로팅(Plotting)하여, KinExA Pro™ 소프트웨어내 1-부위 동질 결합 모델을 이용하여 세 세트의 곡선 (0.3, 1 및 3nM 고정된 PCSK9 농도)으로부터 K_D를 계산하였다. cPCSK9가 KinExA 검정 및 SDS-겔로부터 관찰된 더 낮은 단백질 농도를 가짐에도 불구하고, 이의 농도는 cPCSK9의 농도가 K_D의 계산을 위해 이용된 것이 아니기 때문에 여기서 조정되지 않았다. 결과는 하기 표 8.2에서 그리고 도 5B-5D에서 나타난다. 도 5B는 hPCSK9에 대해 세 가지 상이한 hPCSK9 농도에서 용액 평형 검정으로부터의 결과를 나타낸다. 도 5C는 mPCSK9에 대한 유사한 세트의 결과를 나타낸다. 도 5D는 상기 비아코어 포획 검정으로부터의 결과를 나타낸다.

<표 8.2>

실시예 9

차단 D374Y PCSK9/LDLR 결합에 대한 31H4 및 21B12의 효능

이 실시예는 LDLR에 결합하는 차단 PCSK9 D374Y의 능력에서 두 개의 항체에 대한 IC50 값을 제공한다. 깨끗한 384 웰 평판 (Costar)을 완충제 A (100 mM 나트륨 카코딜레이트 pH 7.4)에서 희석된 2 마이크로그램/ml의 염소 항-LDL 수용체 항체 (R&D Systems)로 코팅하였다. 평판을 완충제 A로 완전하게 세척하였고 이후 완충제 B (완충제 A내 1% 유)로 2시간 동안 차단하였다. 세척 후, 평판을 완충제 C (10 mM CaCl2로 보충된 완충제 B)에서 희석된 0.4 마이크로그램/ml의 LDL 수용체 (R&D Systems)와 1.5시간 동안 인큐베이션하였다. 이 인큐베이션과 동시에, 20 ng/ml의 비오틴화된 D374Y PCSK9를 완충제 A에서 희석된 다양한 농도의 31H4 IgG2, 31H4 IgG4, 21B12 IgG2 또는 21B12 IgG4 항체 또는 완충제 A 단독 (대조군)과 인큐베이션하였다. LDL 수용체 함유 평판을 세척하였고 그리고 비오틴화된 D374Y PCSK9/항체 혼합물을 상기 평판으로 이동시키고 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 완충제 C내 500 ng/ml의 스트렙타비딘-HRP (Biosource)와 그 다음 TMB 기질 (KPL)과의 인큐베이션으로 LDL 수용체와의 비오틴화된 D374Y의 결합을 검출하였다. 1N HCl로 신호를 퀀칭하였고 450 nm에서 흡광도를 판독하였다.

이 결합 연구의 결과는 도 6A-6D에서 보여준다. 요약하자면, IC₅₀ 값을 항체 각각에 대해 측정하였고 상기 값은 31H4 IgG2에 대해 199 pM (도 6A), 31H4 IgG4에 대해 156 pM (도 6B), 21B12 IgG2에 대해 170 pM (도 6C), 그리고 21B12 IgG4에 대해 169 pM (도 6D)인 것으로 밝혀졌다.

항체는 이 검정에서 LDLR과의 야생형 PCSK9의 결합을 또한 차단하였다.

실시예 10

세포 LDL 흡수 검정

이 실시예는 세포에 의한 LDL 흡수를 감소시키는 다양한 항원 결합 단백질의 능력을 증명한다. 10% FBS로 보충된 DMEM 배지 (Mediatech, Inc)에서 웰 당 5x10⁵개 세포의 농도로 검고, 깨끗한 바닥 96-웰 평판 (Costar)에 인간 HepG2 세포를 접종하였고 하룻밤 동안 37℃ (5% CO2)에서 인큐베이션하였다. PCSK9 및 항체 복합체를 형성하기 위하여, 2 μg/ml의 D374Y 인간 PCSK9를 흡수 완충제 (1% FBS를 가진 DMEM)에서 희석된 다양한 농도의 항체 또는 흡수 완충제 단독 (대조군)과 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. PBS로 세포를 세척한 후, D374Y PCSK9/항체 혼합물을 세포로 이동시켰고, 그 다음 LDL-BODIPY (Invitrogen)를 6 μg/ml의 최종 농도로 흡수 완충제에서 희석하였다. 37℃ (5% CO2)에서 3시간 동안 인큐베이션 후, 세포를 PBS로 완전하게 세척하였고 그리고 세포 형광 신호를 480-520nm (여기(excitation)) 및 520-600nm (방출(emission))의 Safire™ (TECAN)로 검출하였다.

세포 흡수 검정의 결과는 도 7A-7D에서 보여준다. 요약하자면, IC₅₀ 값을 항체 각각에 대하여 측정하였고 상기 값은 31H4 IgG2 에 대하여 16.7 nM (도 7A), 31H4 IgG4에 대하여 13.3 nM (도 7B), 21B12 IgG2에 대하여13.3 nM (도 7C), 그리고 21B12 IgG4에 대하여 18 nM (도 7D)인 것으로 밝혀졌다. 이들 결과는 적용된 항원 결합 단백질이 세포에 의해 LDL 흡수를 차단하는 PCSK9 (D374Y)의 효과를 감소시킬 수 있다는 점을 증명한다. 또한 항체는 이 검정에서 야생형 PCSK9의 효과를 차단하였다.

실시예 11

6일 연구에서 31H4 항체의 혈청 콜레스테롤 저하 효과

PCSK9 단백질에 대항하는 항체 요법을 통한 야생형 (WT) 생쥐내 총 혈청 콜레스테롤 (TC) 저하를 평가하기 위하여, 다음 절차를 수행하였다.

Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME)로부터 얻은 수컷 WT 생쥐 (C57BL/6 계통, 9-10주령, 17-27 g)에게 실험 기간 내내 정상적인 사료 (Harland-Teklad, Diet 2918)를 공급하였다. T=0에 생쥐의 꼬리 정맥을 통해 10mg/kg의 수준으로 항-PCSK9 항체 31H4 (PBS내 2 mg/ml) 또는 대조군 IgG (PBS내 2 mg/ml) 중 하나를 생쥐에게 투여하였다. 또한 무경험 생쥐는 무경험 대조군으로서 따로 두었다. 투약 군 및 희생 시간은 표 9에서 보여준다.

<표 9>

표 9에서 나타난 미리-결정된 시점에 CO2 질식으로 생쥐를 희생시켰다. 대정맥으로 통하여 에펜도르프 튜브내로 혈액을 수집하였고 30분 동안 실온에서 응고되도록 하였다. 이후 시료를 10분 동안 12,000xg의 테이블 탑 원심분리(table top centrifuge)에서 회전시켜 가라앉혀 혈청을 분리시켰다. Hitachi 912 임상 분석기 및 Roche/Hitachi TC 및 HDL-C 키트를 이용하여 혈청 총 콜레스테롤 및 HDL-C를 측정하였다.

실험 결과는 도 8A-8D에서 보여준다. 요약하자면, 항체 31H4가 투여되었던 생쥐는 실험 과정에 걸쳐 감소된 혈청 콜레스테롤 수준을 나타내었다 (도 8A 및 도 8B). 추가로, 생쥐는 또한 감소된 HDL 수준을 나타내었다는 점에 주목한다 (도 8C 및 도 8D). 도 8A 및 도 8C에 대하여, 퍼센트 변화는 같은 시점에서 대조군 IgG와 비교된다 (^*P<0.01, # P<0.05). 도 8B 및 도 8D에 대하여, 퍼센트 변화는 t=0시간에 무경험 동물에서 측정된 혈청 콜레스테롤 및 HDL 수준과 비교된다 (^*P<0.01, # P<0.05).

더 낮은 HDL 수준에 관하여, 생쥐의 HDL에서의 감소는 HDL 감소가 인간에서 일어날 것이고 유기체에서 혈청 콜레스테롤 수준도 감소되었다는 점을 단순히 추가로 반영한다는 것을 나타내지 않는다는 점을 당업자가 이해할 것이라는 점에 주목한다. 생쥐가 LDL 입자 상에서 대부분의 혈청 콜레스테롤를 지니고 있는 인간과는 상이한 고밀도 지방단백 (HDL) 입자에서 다수의 혈청 콜레스테롤을 이동시킨다는 점에 주목한다. 생쥐에서 총 혈청 콜레스테롤의 측정은 혈청 HDL-C의 수준과 가장 많이 유사하다. 생쥐 HDL은 LDL 수용체 (LDLR)에 대한 리간드이고 LDLR에 의해 상기 고밀도 지방단백이 제거되도록 하는 아포지방단백 E (apoE)를 함유한다. 따라서, 생쥐에서 (HDL에서의 감소가 인간에 대해서는 예측되지 않는다는 점을 이해하면서), HDL을 검사하는 것은 본 실시예에 대해 적합한 지표이다. 예를 들어, 대조적으로 인간 HDL은 apoE를 함유하지 않고 LDLR에 대한 리간드도 아니다. PCSK9 항체는 생쥐에서 LDLR 발현을 증가시키기 때문에, 간은 더 많은 HDL을 제거할 수 있고 따라서 혈청 HDL-C 수준을 저하시킬 수 있다.

실시예 12

6일 연구에서 LDLR 수준에서의 항체 31H4의 효과

본 실시예는 항원 결합 단백질이 시간이 지남에 따라, 예측된 바와 같이, 개체내 LDLR 수준을 변경한다는 점을 증명하였다. LDLR 수준에서의 항체 31H4의 효과를 알아내기 위하여 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다. 실시예 13에서 설명된 희생된 생쥐로부터 얻은 50-100 mg의 간 조직을 완전 프로테아제 저해제 (Roche)를 함유한 0.3 ml의 RIPA 완충제 (Santa Cruz Biotechnology Inc.)에서 균질화하였다. 균질물을 30분 동안 얼음 상에서 인큐베이션하였고 세포 잔해물을 펠렛화하기 위해 원심분리하였다. BioRad 단백질 검정 시약 (BioRad laboratories)을 이용하여 상층액내 단백질 농도를 측정하였다. 100 μg의 단백질을 10분 동안 70℃에서 변성시켰고 4-12% 비스-트리스(Bis-Tris) SDS 구배 겔 (Invitrogen) 상에 분리하였다. 단백질을 0.45 μm PVDF 막 (Invitrogen)으로 이동시켰고 실온에서 1시간 동안 5% 비-지방 유를 함유한 세척 완충제 (50mM 트리스 PH7.5, 150mM NaCL, 2mM CaCl₂ 및 0.05% 트윈(Tween) 20)로 차단하였다. 이후 블롯을 실온에서 1 시간 동안 염소 항-생쥐 LDLR 항체 (R&D 시스템) 1:2000으로 또는 항-β 액틴 (시그마(sigma)) 1:2000으로 프로빙하였다. 블롯을 간단히 세척하였고 소 항-염소 IgG-HRP (Santa Cruz Biotechnology Inc.) 1:2000 또는 염소 항-생쥐 IgG-HRP (Upstate) 1:2000으로 인큐베이션하였다. 실온에서 1시간 인큐베이션 후, 블롯을 전체적으로 세척하였고 ECL 플러스 키트 (Amersham biosciences)를 이용하여 면역반응 밴드를 검출하였다. 웨스턴 블롯은 도 9에서 나타난 바와 같이, 항체 31H4의 존재에서 LDLR 단백질 수준의 증가를 보여주었다.

실시예 13

13일 연구에서 항체 31H4의 혈청 콜레스테롤 저하 효과

13일 연구에서 PCSK9 단백질에 대항하는 항체 요법을 통하여 야생형 (WT) 생쥐내 총 혈청 콜레스테롤 (TC) 저하를 평가하기 위하여, 다음 절차를 수행하였다.

Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME)로부터 얻은 수컷 WT 생쥐 (C57BL/6 계통, 9-10주령, 17-27 g)에게 실험 기간 내내 정상적인 사료 (Harland-Teklad, Diet 2918)를 공급하였다. T=0에 생쥐의 꼬리 정맥을 통해 10mg/kg의 수준으로 항-PCSK9 항체 31H4 (PBS내 2 mg/ml) 또는 대조군 IgG (PBS내 2 mg/ml) 중 하나를 생쥐에게 투여하였다. 또한 무경험 생쥐는 무경험 대조군으로서 따로 두었다.

투약 군 및 희생 시간은 표 10에서 보여준다. 동물을 희생시켰고 실시예 13에서와 같이 간을 추출하여 준비하였다.

<표 10>

6일 실험이 13일 연구로 연장되었을 때, 6일 연구에서 관찰된 동일한 혈청 콜레스테롤 저하 효과가 13일 연구에서도 또한 관찰되었다. 더욱 특이적으로, 10 mg/kg으로 투약된 동물은 3일차에 혈청 콜레스테롤에서 31% 감소를 나타내었으며, 이는 13일까지 투약-전 수준으로 점진적으로 복귀되었다. 도 10A는 이 실험의 결과를 나타낸다. 도 10C는 10mg/kg 분량의 31H4로, 그리고 또한, 10mg/kg의 또 다른 항체, 16F12로 상기 절차를 반복한 결과를 나타낸다. 투약 군 및 희생 시간은 표 11에서 보여준다.

<표 11>

도 10C에서 나타난 바와 같이, 16F12 및 31H4 둘 모두는 단일 분량 직후에 총 혈청 콜레스테롤에서의 유의미하고 실질적인 감소를 야기시켰고 한 주 이상 (10일 또는 그 이상) 동안 혜택을 제공하였다. 반복된 13일 연구의 결과는 관찰된 3일차에 26%의 혈청 콜레스테롤 수준으로의 감소로, 첫 번째 13일 연구의 결과와 일치하였다. 도 10A 및 도 10B에 대하여, 퍼센트 변화는 같은 시점에서 대조군 IgG와 비교된다 (^*P<0.01). 도 10C에 대하여, 퍼센트 변화는 같은 시점에서 대조군 IgG와 비교된다 (^*P<0.05).

실시예 14

13일 연구에서 HDL 수준에서의 항체 31H4의 효과

실시예 15에서 동물에 대한 HDL 수준을 또한 검사하였다. HDL 수준은 생쥐에서 감소하였다. 더욱 특이적으로, 10 mg/kg으로 투약된 동물은 3일차에 HDL 수준에서 33% 감소를 나타내었으며, 이는 13일까지 투약-전 수준으로 점진적으로 복귀되었다. 도 10B는 이 실험의 결과를 나타낸다. 3일 차에 34%의 HDL 수준의 감소가 있었다. 도 10B는 반복된 13일 실험의 결과를 나타낸다.

당업자에 의해 이해될 바와 같이, 항체는 생쥐 HDL를 저하시킬 것이지만, 반면에 인간 및 다른 유기체 (가령, 생쥐)에서 HDL 수준의 차이 때문에, 이것이 인간에서는 일어날 것으로 예상되지 않는다. 따라서, 생쥐 HDL에서의 감소는 인간 HDL에서의 감소를 나타내지 않는다.

실시예 15

항원 결합 펩티드의 항체 생산 지속 혜택의 반복된 투여

상기 실시예에서 얻은 결과가 추가적인 분량으로의 추가 혜택을 위해 지속될 수 있다는 점을 입증하기 위하여, 실시예 15 및 16에서 실험을 도 11A에서 나타난 투약 스케줄로 반복하였다. 결과는 도 11B에 나타난다. 도 11B의 그래프에서 볼 수 있는 것과 같이, 모든 생쥐가 31H4 항원 결합 단백질의 초기 주사를 맞았기 때문에 둘 모두의 생쥐 세트가 총 혈청 콜레스테롤에서 유의미한 감소를 나타내었는데, 31H4 ABP의 추가 주사를 맞은 생쥐는 총 혈청 콜레스테롤에서 지속된 감소를 나타내었고, 반면에 대조군 주사만 맞은 이들 생쥐는 결국에는 그들의 총 혈청 콜레스테롤에서 증가를 나타내었다. 도 11에 대하여, 퍼센트 변화는 t=0시간에 무경험 동물과 비교된다 (^*P<0.01, ^**P<0.001).

이 실시예로부터의 결과는 반복된 적용이 개체내 생물학적 조절 때문에 효능에서의 감소를 야기하는 다른 콜레스테롤 치료 방법과는 다르게, 본 접근법이 검사되는 기간에 걸쳐 이러한 문제를 겪지 않는 것으로 보인다는 점을 증명한다. 더욱이, 이것은 이전 실시예에서 관찰된, 기준선으로의 총 혈청 콜레스테롤 또는 HDL 콜레스테롤 수준의 복귀가 개체에 의해 발달되는 치료에 대한 몇몇 저항에 때문이 아니라, 개체내 항체 유용성의 감소때문이라는 점을 제시한다.

실시예 16

콜레스테롤 관련 질환의 치료를 위한 PCSK9 항체의 용도

콜레스테롤 관련 질환 (콜레스테롤에서의 감소 (가령, 혈청 콜레스테롤)가 이로울 수 있음)을 나타내는 인간 환자에게 치료 효과량의 PCSK9 항체, 31H4 (또는, 예를 들어, 21B12)를 투여한다. 치료 동안 주기적인 시간에, 환자를 모니터링하여 질환의 증상이 진정되는 지에 대해 확인한다. 치료 후, PCSK9 항체로 치료를 받은 환자는 치료되지 않은 환자와 비교하여, 혈청 콜레스테롤 수준이 감소되었다는 점이 발견된다.

실시예 17

고콜레스테롤혈증의 치료를 위한 PCSK9 항체의 용도

고콜레스테롤혈증의 증상이 나타나는 인간 환자에게 치료 효과량의 PCSK9 항체, 가령 31H4 (또는, 예를 들어, 21B12)를 투여한다. 치료 동안 주기적인 시간에, 인간 환자를 모니터링하여 혈청 콜레스테롤 수준이 감소되었는지에 대해 확인한다. 치료 후, PCSK9 항체로 치료를 받은 환자는 치료받지 않은 관절염 환자와 비교하여, 혈청 콜레스테롤 수준이 감소되었다는 점이 발견된다.

실시예 18

관상동맥성 심장 질환 및/또는 재발하는 심혈관 사건의 예방을 위한 PCSK9 항체의 용도

관상동맥성 심장 질환이 발병할 위험이 있는 인간 환자를 식별한다. 환자에게 치료 효과량의 PCSK9 항체, 가령 31H4 (또는, 예를 들어, 21B12)를 단독으로, 스타틴, 가령, 심바스타틴과 동시에 또는 연속하여 투여한다. 치료 동안 주기적인 시간에, 인간 환자를 모니터링하여 환자의 총 혈청 콜레스테롤 수준이 변화하는지에 대해 확인한다. 예방 치료 내내, PCSK9 항체로 치료를 받은 환자는 치료를 받지 않은 환자와 비교하여 혈청 콜레스테롤이 감소되었고 따라서 관상동맥성 심장 질환 또는 재발하는 심혈관 사건에 대한 그들의 위험이 감소되었다는 점이 발견된다.

실시예 19

고콜레스테롤혈증의 예방을 위한 PCSK9 항원 결합 단백질의 용도

고콜레스테롤혈증이 발병할 위험을 나타내는 인간 환자를 가족력 분석 및/또는 생활방식, 및/또는 현재 콜레스테롤 수준을 통하여 식별한다. 개체에게 치료 효과량의 PCSK9 항체, 31H4 (또는 예를 들어, 21B12)를 정기적으로 투여한다 (가령, 매주 1회). 치료 동안 주기적인 시간에, 환자를 모니터링하여 혈청 콜레스테롤 수준이 감소되었지에 대해 확인한다. 치료 후, PCSK9 항체로 예방 치료를 받은 개체는 치료되지 않은 개체와 비교하여 혈청 콜레스테롤 수준이 저하되었다는 점이 발견된다.

실시예 20

건강한 개체에서 인간 항-PCSK9 항체의 안정성, 내약성, 약동학 및 약력학을 평가하기 위한 단계 1, 랜덤화, 이중-맹검, 위약-조절, 상승적 단일 분량 연구

이 연구는 건강한 개체에서 인간 항-PCSK9 항체 (단일클론 항체 21B12)의 안정성, 내약성, PK, 약력학 (PD) (LDL-C), 그리고 면역원성을 평가하기 위한 랜덤화, 이중-맹검, 위약-조절, 상승적-단일-분량 연구였다. 7, 21, 70, 210, 또는 420　mg SC의 분량으로 21B12, 또는 상응하는 위약; 또는 21 또는 420　mg IV의 분량으로 21B12, 또는 상응하는 위약을 받도록 개체를 3:1 비율 (21B12:위약; 7개 코호트내 전체 56명　개체에 대한 분량 코호트 당 8명 개체)로 랜덤화하였다.

56명의 개체는 랜덤화되고 시험 산물 (42　21B12, 14　위약)을 받았다; 40명의 개체 (30　21B12, 10　위약)는 SC 루트의 투여로 시험 산물을 받았고, 16명 개체 (12　21B12, 4 위약)는 IV 루트로 시험 산물을 받았다. 연구 산물을 받았던 56명 개체 중 53명 (95%)은 연구를 완료하였다. 21B12를 받았던 3명의 개체는 완전한 동의를 취소하여 연구를 완료하지 않았다.

연구 모집단은 주로 남성 (54명 [96%])으로 구성되었고 31.2 (범위: 20 내지 45)세의 평균 연령을 가졌다. 86%의 개체는 백인이었고, 그 다음 9%의 히스패닉/라틴계, 4%의 흑인 그리고 1% 다른 인종이었다. 평균 기준선 LDL-C 값은 치료 군 사이에서 유사하였고 113 내지 143 mg/dL의 범위에 있었다.

이 연구에서, 21B12는 분량 의존적인 효과 지속기간의 단일 분량 ≥　70 mg SC에서 평균 55% 내지 60%까지 LDL-C를 감소시켰다. 투약 2주 내에 LDL-C 최하점을 관찰하였다. 단일 분량 ≥ 70 mg SC에서 PCSK9의 완전한 억제를 관찰하였고, 이는 순환 LDL-C 에서 나타나는 효과와 매우 연관된다.

PK 분석은 21B12가 비선형 (농도-의존) 제거를 나타내었다는 점을 증명하였다. 평균 t_최대는 4 내지 6일의 범위였다. 예상한 바와 같이, 농도 (C_최대) 및 시간 0부터 무한까지의 농도-시간 곡선 아래 영역 (AUC_0-무한)이 관찰되는 가장 높은 최대 중간값은 420 mg IV 군에서 발생하였고 각각, 139 μg/mL 및 1550 일·μg/mL였다.

임의의 분량으로 21B12를 받았던 42명 개체 중 29명 (69%), 그리고 위약을 받았던 14명 개체 중 10명 (71%)에서 치료-신생 부작용이 보고되었다. 부작용의 개체 발생률과 21B12의 분량 사이에, 또는 부작용의 개체 발생률과 21B12의 투여 루트 (SC 대 IV) 사이에 어떠한 관계도 나타나지 않았다.

부작용이 심각하게 보고되지는 않았고, 어떠한 개체도 부작용 때문에 연구를 중단하지 않았다. 연구시 어떠한 사망도 없었다.

21B12를 받았던 42명 개체 중 18명 (43%), 위약을 받았던 14명 개체 중 10명 (71%)에서 치료-관련 부작용이 보고되었다. 치료 관련 부작용의 개체 발생률과 21B12의 분량 사이에, 또는 치료-관련 부작용의 개체 발생률과 21B12의 투여 루트 (SC 대 IV) 사이에 어떠한 관계도 나타나지 않았다.

선택된 실험실 변수, 심전도 (ECG), 또는 활력 징후에서 21B12의 임상학적으로 중요한 효과를 나타내는 경향은 없었다.

이 연구에서, 21B12는 최대 420　mg까지 단일 SC 및 IV 분량에서 잘 견뎌내는 것으로 나타났다.

이 연구에서 등록된 개체로부터의 혈청 시료를 항-21B12 항체의 존재 (기준선) 또는 발달 (치료-후)에 대해 검사하였다. 21B12를 받았던 모든 42명의 개체로부터의 시료는 항-21B12 항체에 대해 음성이었다.

실시예 21

안정된 분량의 스타틴이 투여된 고지질혈증을 가진 개체에서 인간 항-PCSK9 항체의 안정성, 내약성, 약동학 및 약력학을 평가하기 위한 단계 1, 랜덤화, 이중-맹검, 위약 조절, 상승적인 다수 분량 연구

이 연구는 현재 안정된 분량의 스타틴이 투여된 고지혈성 (가령, 고콜레스테롤성) 개체에서 인간 항-PCSK9 항체 (단일클론 항체 21B12)를 이용한 단계 1b, 랜덤화, 이중-맹검, 위약 조절, 상승적인 다수-분량 연구이다. 상기 연구는 7개의 코호트를 가졌다. 모든 코호트에 대한 목적은 21B12의 안정성, 내약성, 및 면역원성의 특성, 그리고 PK 및 PD (LDL-C 및 PCSK9)의 특성을 포함하였다. 연구의 코호트 1 내지 5는 안정된 낮은 내지 중간(low to moderate) 분량의 스타틴이 투여된 고콜레스테롤 개체에서, 21B12 분량-단계적 증대 부분을 나타내었다. 각각, 21B12의 5회 SC 용량 중 1회 (14 또는 35 mg QW 6 번; 또는 140 mg 또는 280 mg Q2W 3 번; 또는 420　mg Q4W 2　번) 또는 상응하는 위약을 받도록 ≥1개월 동안 매일 안정된 로수바스타틴 <40 mg, 아토르바스타틴 <80 mg 또는 심바스타틴 20-80 mg으로 LDL-C (70-200 mg/dL)를 가진 코호트 1 내지 5 (코호트 당 n = 8)내 개체를 3: 1 비율로 랜덤화하였다. 고분량의 스타틴 (아토르바스타틴 80 mg 또는 로수바스타틴 40 mg)으로 고콜레스텔롤 개체에서 코호트 6을 수행하였다. 이 코호트 (n=12)내 개체를 로수바스타틴 40 mg 또는 아토르바스타틴 80 mg으로 처리하였고 그리고 각각, 21B12 (140 mg SC Q2W 3번) 또는 상응하는 위약을 받도록 3:1 비율로 랜덤화하였다. 이형 가족성 고콜레스테롤혈증 가진 개체 (WHO 규준을 이용하여 식별됨)에서 코호트 7을 수행하였다; 이 코호트 (n=6)내 개체를 각각, 21B12 (140 mg SC Q2W 3 번) 또는 상응하는 위약을 받도록 2:1 비율로 랜덤화하였다. 명확성을 위하여, 코호트 1은 주 1회, 6번, 14 mg 21B12의 SC 투여를 받았다. 코호트 2는 주 1회, 6번, 35 mg 21B12의 SC 투여를 받았다. 코호트 3은 격주마다 1회, 3번 140 mg 21B12의 SC 투여를 받았다. 코호트 4는 격주마다 1회, 3번 280 mg 21B12의 SC 투여를 받았다. 코호트 5는 4주마다, 2번 420 mg 21B12의 SC 투여를 받았다.

등록되고 21B12 또는 위약에 대해 랜덤화된 40명 개체로부터 예비 결과를 얻었다. 이들 40명 개체 중, 28명 개체는 ≥ 1 분량의 연구 산물 (21B12 또는 위약)을 받았고 따라서 예비 안정성 분석 세트 (치료에 대한 맹검)를 나타내었다. 예비 맹검 안정성 데이터는 이들 28명 개체에 대해 이용가능하였으며, 이들 모두 코호트 1 내지 4로부터 온 것이었다. 어떠한 사망, 심각한 부작용, 또는 부작용으로 인한 조기 중단이 보고되지 않았다. 전반적으로, 적어도 1개의 부작용이 ≥ 1 분량의 연구 산물을 받은 28명 개체 중 15명 (54%)에서 보고되었다. 피로, 관절통, 변비, 및 상기도 감염을 제외하고, 대부분의 부작용 (치료에 대한 맹검)이 단일 개체에서 보고되었으며, 이는 각각 28명 개체 중 2명 (7%)에서 보고되었다.

예비 약력학적 결과 (치료에 대한 맹검)는 코호트 1, 2, 및 3에 대해 이용가능하였다. 순환 LDL-C내 21B12-용량-의존성 감소를 안정된 중간 분량의 스타틴이 투여된 개체에서 관찰하였다. LDL-C 최하점은 초기 투약의 2주 내에 관찰되었고 코호트 3에서 60% 내지 80%의 범위 내에 있었다 (140　mg Q2W SC 3 번). 코호트 3에서 PCSK9의 거의-완전한 억제를 관찰하였고, 이는 순환 LDL-C 에서 나타나는 효과와 매우 연관된다.

최종 결과에서, 21B12 (N=39) 또는 위약 (N=12)을 받도록 코호트 1-6내 개체 (N=51)를 랜덤화하였다; 26명 개체 (51%)가 남성이었고; 평균 (SD) 연령은 58 (7)세였다. 어떠한 사망 또는 심각한 부작용 (AE)도 보고되지 않았고 어떠한 개체가 AE 때문에 연구를 중단하지 않았다. 21B12에 대한 어떠한 중화 항체도 검출되지 않았다.

낮은 내지 중간 분량의 스타틴이 투여된 코호트 1-5내 개체는 격주로 3회 21B12의 SC 투여 후 최대 감소에서 위약에 비해 최대 81%까지 및 투약 간격 말 (즉, 6주에)에 위약에 비해 75%, 그리고 4주마다 2회 SC 투여 후 투약 간격 말 (즉, 8주에)에 66%의 평균 LDL-C 감소를 가졌다. 낮은 내지 중간 분량의 스타틴이 투여된 코호트 1-5내 개체는 최대 감소에서 위약에 비해 최대 81%까지 및 투약 간격 말에 위약에 비해 75%의 최대 LDL-C 감소를 가졌다 (도 14). 효과의 정도 및 지속시간은 용량-의존적이었다. 혈장 PCSK9는 더 높은 분량에서 검출될 수 없었다. 유사하게도, 격주로 3회 투여 후 투약 간격의 말에, 고-분량 스타틴이 투여된 개체 (코호트 6)은 위약에 비해 63%의 LDL-C에서의 평균 감소, 및 위약에 비해 73%의 LDL-C에서의 최대 감소를 가졌다 (도 15).

이들 데이터는 6주에 걸친 21B12의 반복된 SC 투여가 심각한 AE없이, 낮은-내지-중간 또는 고-분량 스타틴이 투여된 개체내, 투약 섭생에 의존하여, 위약에 비해 최대 81%까지 순환 LDL-C를 감소시켰다는 점을 보여준다. 21B12의 LDL-C-저하 효과는 고분량 스타틴 및 낮은-내지-중간 스타틴 분량 군 사이에서 비교가능하였다.

낮은 내지 중간 분량의 스타틴이 투여된 코호트 1-5내 개체는 투약 간격 말에 위약에 비해 최대 94%까지 PCSK9 수준의 평균 감소를 가졌고, 데이터는 보여지지 않았다. 낮은-내지-중간 분량의 스타틴이 투여된 코호트 1-5내 개체는 투약 간격 말에 위약에 비해 최대 54%까지 평균 ApoB 감소, 및 연구 동안에 48% (35 mg QW) 내지 59% (140 mg 및 280 mg Q2W 및 420 mg Q4W) 범위의 최대 감소를 가졌다 (p　<　0.001)(도 16). 추가로, 낮은-내지-중간 및 고-분량의 스타틴이 투여된 코호트 1-6내 개체는 투약 간격 말에 위약에 비해 최대 43%까지 평균 Lp(a) 감소를 가졌다 (도 17).

heFH를 가진 코호트 7내 개체는 투약 간격 말에 (즉, 주6, 격주로 3회 21B12의 SC 투여 2주 후) 위약에 비해 65%의 LDL-C에서의 평균 감소, 및 위약에 비해 70%의 최대 LDL-C 감소를 가졌다 (도 18). 투약 간격 동안에 LDL-C 감소는 heFH가 없는 개체에서 관찰되는 것들과 비교가능하였다. 21B12 치료 후, 순환 PCSK9는 heFH 개체에서 검출될 수 없었다.

heFH를 가진 코호트 7내 개체는 투약 간격 말에 (즉, 주6, 격주로 3회 21B12의 SC 투여 2주 후) 위약에 비해 78%의 혈청 PCSK9 값에서의 평균 감소를 가졌다 (도 19). heFH를 가진 코호트 7내 개체는 투약 간격 말에 (즉, 주6, 격주로 3회 21B12의 SC 투여 2주 후) 위약에 비해 최대 42%까지의 총 콜레스테롤에서의 평균 감소, 및 위약에 비해 47%의 최대 총 콜레스테롤 감소를 가졌다 (도 20). heFH를 가진 코호트 7내 개체는 투약 간격 말에 (즉, 주6, 격주로 3회 21B12의 SC 투여 2주 후) 위약에 비해 61%의 비-HDL 콜레스테롤에서의 평균 감소, 및 위약에 비해 67%의 비-HDL 콜레스테롤의 최대 감소를 가졌다 (도 21). heFH를 가진 코호트 7내 개체는 투약 간격 말에 (즉, 주6, 격주로 3회 21B12의 SC 투여 2주 후) 위약에 비해 최대 47%까지의 ApoB 수준에서의 평균 감소, 및 위약에 비해 57%의 ApoB의 최대 감소를 가졌다 (도 22). heFH를 가진 코호트 7내 개체는 투약 간격 말에 (즉, 주6, 격주로 3회 21B12의 SC 투여 2주 후) 위약에 비해 50%의 지방단백 a (Lp(a))에서의 평균 감소를 가졌다 (도 23).

코호트 7에서, 21B12는 치료 기준(standard-of-care) 요법을 받고 있는 heFH 및 고지질혈증을 가진 개체에서 비결합 PCSK9 수준을 감소시켰고 순환 LDL-C 수준을 실질적으로 저하시켰다. 검사된 격주 투여는 heFH 개체에서의 LDL-C 감소를 제공하였고, 상기 개체는 비-heFH 개체에서의 상기 감소와 비교가능하였다. 어떠한 심각한 AE도 보고되지 않았다.

실시예 22

이형 가족성 고콜레스테롤혈증을 가진 환자내 인간 항-PCSK9 항체의 내약성 및 효능을 평가하기 위한 이중-맹검, 랜덤화, 위약-조절 연구

이 연구의 목적은 이형 가족성 고콜레스테롤혈증 (HeFH)을 가진 개체내 저밀도 지방단백 콜레스테롤 (LDL-C)에서 기준선으로부터 변화 퍼센트에서의, 위약과 비교하여, 피하 (SC) 인간, 항-PCSK9 항체 (단일클론 항체 21B12)의 12주 효과를 평가하기 위함이다.

이 연구는 HeFH의 진단을 받은 개체내 단일클론 항체 21B12의 안정성, 내약성, 및 효능을 평가하는 이중-맹검, 랜덤화, 층화(stratified), 위약-조절 임상 실험이다. 150명 개체의 전체 등록을 계획한다. 모든 포함/배제 규준을 충족하는 개체를 2개의 치료군으로 동일한 분배로 랜덤화할 것이다: 350 mg 또는 420 mg Q4W SC (4주마다 1회, 피하)의 단일클론 항체, 21B12 또는 위약 Q4W SC. 랜덤화는 기준선에서 LDL-C 수준 (< 130 mg/dL [3.4 mmol/L] 대 ≥ 130 mg/dL) 및 에제티미브 용도를 스크리닝함으로써 층화될 것이다 (예 대 아니오). 랜덤화는 적격성을 결정하기 위해 이용된 스크리닝 LDL-C 평가의 5-10일 내에 발생해야 한다. 단일클론 항체, 21B12, 그리고 위약을 맹검할 것이다. 연구 방문은 제2, 4, 8, 그리고 12주에 있다. 단일클론 항체, 21B12, 또는 위약의 최종 투여는 제8주에 있다. 연구의 종료(EOS) 방문 및 지질의 마지막 평가는 제12주에 있다.

남성 및 여성, ≥ 18 내지 ≤ 75세의 연령, 및 Simon Broome Register Group (SBRG)의 진단적 규준에 의한 이형 가족성 고콜레스테롤혈증의 진단은 이 연구에 적격이다. 등록을 위하여, 개체는 LDL-C 스크리닝 전에 적어도 4주 동안 모든 허용된 (가령, 에제티미브, 담즙-산 봉쇄 수지, 스타놀, 또는 조절-승인된 및 시판된 니아신 (가령, Niaspan 또는 Niacor)) 지질-조절 약물에 대해 안정한 분량(들)으로, 승인된 스타틴이 투여되어야 하고, 그리고 연구원의 의견에서,　증량은 필요하지 않다. 스크리닝에서 중앙 연구실에 의해 공복 LDL-C는 ≥ 100 mg/dL (2.6 mmol/L)이어야 하고 공복 트리글리세리드는 ≤ 400 mg/dL (4.5 mmol/L)이어야 한다.

예비 데이터 (데이터는 나타나지 않음)는 350 mg 21B12로 처리된 개체가 투약 간격 말에 38.46%의 LDL-C에서 기준선으로부터 최소 제곱 (LS) 평균 퍼센트 감소를 가졌고, 그리고 420 mg 21B12로 처리된 개체는 45.68%의 LDL-C에서 기준선으로부터 LS 평균 퍼센트 감소를 가졌다는 점을 증명하였다. 350 mg 21B12로 처리된 개체는 투약 간격 말에 21.69%의 Lp(a)에서 기준선으로부터 LS 평균 퍼센트 감소를 가졌고, 그리고 420 mg 21B12로 처리된 개체는 28.23%의 Lp(a)에서 기준선으로부터 LS 평균 퍼센트 감소를 가졌다. 350 mg 21B12로 처리된 개체는 투약 간격 말에 15.39%의 HDL-C에서 기준선으로부터 LS 평균 퍼센트 증가를 가졌고, 그리고 420 mg 21B12로 처리된 개체는 6.77%의 HDL-C에서 기준선으로부터 LS 평균 퍼센트 증가를 가졌다. 350 mg 21B12로 처리된 개체는 투약 간격 말에 17.16%의 VLDL-C에서 기준선으로부터 LS 평균 퍼센트 감소를 가졌고, 그리고 420 mg 21B12로 처리된 개체는 18.49%의 VLDL-C에서 기준선으로부터 LS 평균 퍼센트 감소를 가졌다. 350 mg 21B12로 처리된 개체는 투약 간격 말에 17.24%의 트리글리세리드에서 기준선으로부터 LS 평균 퍼센트 감소를 가졌고, 그리고 420 mg 21B12로 처리된 개체는 트리글리세리드 4.56%에서 기준선으로부터 LS 평균 퍼센트 감소를 가졌다. 350 mg 21B12로 처리된 개체는 투약 간격 말에 36.16%의 비-HDL 콜레스테롤에서 기준선으로부터 LS 평균 퍼센트 감소를 가졌고, 그리고 420 mg 21B12로 처리된 개체는 41.81%의 비-HDL 콜레스테롤에서 기준선으로부터 LS 평균 퍼센트 감소를 가졌다. 최종적으로, 350 mg 21B12로 처리된 개체는 투약 간격 말에 24.82%의 총 콜레스테롤에서 기준선으로부터 LS 평균 퍼센트 감소를 가졌고, 그리고 420 mg 21B12로 처리된 개체는 29.45%의 총 콜레스테롤에서 기준선으로부터 LS 평균 퍼센트 감소를 가졌다. (데이터는 나타나지 않음).

도 24는 다음 분량의 21B12에 대한 LDL-C 감소 데이터를 나타내는 그래프이다: 70 mg, 105 mg 및 140 mg (Q2W 또는 2주마다 1회 투약) 및 280 mg, 350 mg 및 420 (Q4W 또는 월 1회 투약). 이 데이터는 실시예 22-25에서 설명된 연구로부터의 집합 데이터이다). 요약하자면, 집합 데이터는 420 mg Q4W가 제12주에서 LDL-C에서 기준선으로부터 대략 60% 감소 및 LDL-C 감소의 평활 유지를 야기한다. 추가로, 이 데이터는 420 mg Q4W가 제12주에 LDL-C에서 기준선으로부터 대략 56% 감소 및 투약 간격 말에 더 적은 LDL-C 반동을 야기한다.

도 25A-25D는 실시예 22-25에서 설명된 연구로부터의 집합 데이터가 파생된, Lp(a), HDL-C, 트리글리세리드 및 VLDL-C, 각각에서 21B12 투여의 이로운 효과를 나타내는 막대그래프이다. 추가로, 기준선으로부터 분량 의존 감소를 총 콜레스테롤 (25-37%, p 값 <0.001), 비-HDL-C (36-53%, p 값 <0.001), 그리고 ApoB (36-53%, p 값 < 0.001)에 대해 관찰하였다 (데이터는 나타나지 않음).

실시예 23

효과적인 분량의 HMG-Co-A 환원효소 저해제를 견뎌낼 수 없는 고콜레스테롤 환자내 에제티미브와 비교하여 LDL-C 에서 인간 항-PCSK9 항체의 내약성 및 효능을 평가하기 위한 랜덤화 연구

이 연구의 목적은 효과적인 분량의 HMG-Co-A 환원효소 저해제를 견뎌낼 수 없는 고콜레스테롤 개체내 저밀도 지방단백 콜레스테롤 (LDL-C)에서 기준선으로부터 변화 퍼센트에서의, 에제티미브와 비교하여, 피하 (SC) 인간, 항-PCSK9 항체 (단일클론 항체 21B12)의 12주 효과를 평가하기 위함이다.

본 연구는 인간 항-PCSK9 항체, 단일클론 항체, 21B12에 대한 랜덤화, 층화, 평행 군 임상 시험이다. 150명 개체를 등록하는 것이 계획된다. 모든 포함/배제 규준을 충족하는 개체를 5개의 치료군으로 동일한 분배로 랜덤화할 것이다: 280 mg, 350 mg 또는 420 mg Q4W SC (4주마다 1회, 피하)의 단일클론 항체, 21B12; 420 mg Q4W SC의 단일클론 항체, 21B12와 10 mg 매일 (QD) 경구 (PO)의 에제티미브; 또는 위약 Q4W SC와 10 mg QD PO의 에제티미브. 랜덤화는 기준선에서 LDL-C 수준 (< 130 mg/dL [3.4 mmol/L] 대 ≥ 130 mg/dL) 및 스타틴 용도를 스크리닝함으로써 층화될 것이다 (네 대 아니오). 랜덤화는 적격성을 결정하기 위해 이용된 스크리닝 LDL-C 평가의 5-10일 내에 발생해야 한다. 단일클론 항체, 21B12, 그리고 위약을 맹검할 것이다. 에제티미브는 맹검하지 않는다. 연구 방문은 제2, 4, 8, 그리고 12주에 있다. 단일클론 항체, 21B12, 또는 위약의 최종 투여는 제8주에 있다. 연구의 종료(EOS) 방문 및 지질의 마지막 평가는 제12주에 있다.

남성 및 여성, ≥ 18 내지 ≤ 75세의 연령이 이 연구에 적격이다. 개체는 적어도 1 스타틴으로 시도되었고 그리고 근육통 또는 근육병 때문에 임의의 분량 또는 다음의 매주 전체 최대 분량으로 상기 스타틴 분량에서의 증가를 견뎌낼 수 없었을 것이다: 아토르바스타틴 ≤ 70 mg, 심바스타틴 ≤ 140 mg, 프라바스타틴 ≤ 140 mg, 로수바스타틴 ≤ 35 mg, 로바스타틴 ≤ 140 mg, 플루바스타틴 ≤ 280 mg. 비목록 스타틴에 대하여, 최대 전체 매주 분량은 가장 작은 이용가능한 정제 크기로 7회를 초과해서는 안된다. 스타틴이 중단되거나 또는 분량이 감소되었을 때 증상이 완화되었을 것이다. 스타틴 (상기 정의된 최대 분량을 초과하지 않는), 담즙 산 봉쇄 수지, 및/또는 스타놀 요법을 받는다면, 분량(들)은 LDL-C 스크리닝에 앞서 적어도 4주 동안은 안정되어야 한다. 스크리닝의 시작에 개체에게 에제티미브가 투여된다면, 에제티미브는 LDL-C 스크리닝에 앞서 ≥ 4주 동안 중단되어야 한다. 그들의 위험 카테고리에 따라서 (NCEP ATP III 치료 목적에 기반하여) 개체는 스크리닝에서 다음 공복 LDL-C (중앙 연구실에 의해) 규준을 충족시켜야 한다: 관상동맥성 심장 질환 (CHD) 또는 CHD 위험 등가를 진단받은 개체에 대해 ≥ 100 mg/dL (2.6 mmol/L); CHD 또는 위험 등가를 진단 받지 않은 및 2 개 이상의 위험 인자가 없는 개체에 대해 ≥ 130 mg/dL (3.4 mmol/L); CHD 또는 위험 등가를 진단받지 않은 및 1개의 위험인자가 있거나 위험인자가 없는 개체에 대해 ≥ 160 mg/dL (4.1 mmol/L). 공복 트리글리세리드는 스크리닝에서 중앙 연구실에 의해 결정된 바와 같이 ≤ 400 mg/dL (4.5 mmol/L)가 되어야 한다.

예비 데이터 (데이터는 나타나지 않음)는 280 mg 21B12로 처리된 개체가 투약 간격 말에 38.79%의 LDL-C에서 기준선으로부터 LS 평균 퍼센트 감소를 가졌고; 350 mg 21B12로 처리된 개체가 투약 간격 말에 40.01%의 LDL-C에서 기준선으로부터 LS 평균 퍼센트 감소를 가졌고; 그리고 420 mg 21B12로 처리된 개체가 50.63%의 LDL-C에서 기준선으로부터 LS 평균 퍼센트 감소를 가졌다는 점을 증명하였다. 예비 데이터는 280 mg 21B12로 처리된 개체가 투약 간격 말에 27.38%의 Lp(a)에서 기준선으로부터 LS 평균 퍼센트 감소를 가졌고; 350 mg 21B12로 처리된 개체가 투약 간격 말에 16.04%의 Lp(a)에서 기준선으로부터 LS 평균 퍼센트 감소를 가졌고; 그리고 420 mg 21B12로 처리된 개체가 23.84%의 Lp(a)에서 기준선으로부터 LS 평균 퍼센트 감소를 가졌다는 점을 증명하였다. 예비 데이터는 280 mg 21B12로 처리된 개체가 투약 간격 말에 8.62%의 HDL-C에서 기준선으로부터 LS 평균 퍼센트 증가를 가졌고; 350 mg 21B12로 처리된 개체가 투약 간격 말에 4.62%의 HDL-C에서 기준선으로부터 LS 평균 퍼센트 증가를 가졌고; 420 mg 21B12로 처리된 개체가 7.55%의 HDL-C에서 기준선으로부터 LS 평균 퍼센트 증가를 가졌다는 점을 증명하였다. 예비 데이터는 280 mg 21B12로 처리된 개체가 투약 간격 말에 31.02%의 VLDL-C에서 기준선으로부터 LS 평균 퍼센트 감소를 가졌고; 350 mg 21B12로 처리된 개체가 투약 간격 말에 38.14%의 VLDL-C에서 기준선으로부터 LS 평균 퍼센트 감소를 가졌고; 그리고 420 mg 21B12로 처리된 개체가 37.27%의 VLDL-C에서 기준선으로부터 LS 평균 퍼센트 감소를 가졌다는 점을 증명하였다. 예비 데이터는 280 mg 21B12로 처리된 개체가 투약 간격 말에 15.35%의 트리글리세리드에서 기준선으로부터 LS 평균 퍼센트 감소를 가졌고; 350 mg 21B12로 처리된 개체가 투약 간격 말에 19.22%의 트리글리세리드에서 기준선으로부터 LS 평균 퍼센트 감소를 가졌고; 그리고 420 mg 21B12로 처리된 개체가 19.55%의 트리글리세리드에서 기준선으로부터 LS 평균 퍼센트 감소를 가졌다는 점을 증명하였다. 예비 데이터는 280 mg 21B12로 처리된 개체가 투약 간격 말에 31.03%의 총 콜레스테롤에서 기준선으로부터 LS 평균 퍼센트 감소를 가졌고; 350 mg 21B12로 처리된 개체가 투약 간격 말에 34.46%의 총 콜레스테롤에서 기준선으로부터 LS 평균 퍼센트 감소를 가졌고; 그리고 420 mg 21B12로 처리된 개체가 42.23%의 총 콜레스테롤에서 기준선으로부터 LS 평균 퍼센트 감소를 가졌다는 점을 증명하였다. 예비 데이터는 280 mg 21B12로 처리된 개체가 투약 간격 말에 39.92%의 비-HDL-C에서 기준선으로부터 LS 평균 퍼센트 감소를 가졌고; 350 mg 21B12로 처리된 개체가 투약 간격 말에 42.86%의 비-HDL-C에서 기준선으로부터 LS 평균 퍼센트 감소를 가졌고; 그리고 420 mg 21B12로 처리된 개체가 53.49%의 비-HDL-C에서 기준선으로부터 LS 평균 퍼센트 감소를 가졌다는 점을 증명하였다.

실시예 24

10% 이하의 10년 프라밍햄(Framingham) 위험 점수를 가진 고콜레스테롤 환자내 LDL-C에서 인간 항-PCSK9 항체의 내약성 및 효능을 평가하기 위한 랜덤화, 위약 및 에제티미브-조절, 분량-범위 연구

이 연구의 목적은 10% 이하의 10년 프라밍햄 위험 점수를 가진 고콜레스테롤 환자에서 단일요법으로서 이용될 때 저밀도 지방단백 콜레스테롤 (LDL-C)에서 기준선으로부터 변화 퍼센트에서의, 위약과 비교하여, 2주마다 (Q2W) 또는 4주마다 (Q4W) 피하 (SC) 인간, 항-PCSK9 항체 (단일클론 항체 21B12)의 12주 효과를 평가하기 위함이다.

본 연구는 411명 개체를 등록하는, 인간 항-PCSK9 항체, 단일클론 항체, 21B12에 대한 랜덤화, 층화, 위약 및 에제티미브 조절, 평행 군 분량 범위 임상 시험이다. 모든 포함/배제 규준을 충족하는 개체를 9개의 치료군으로 동일한 분배로 랜덤화하였다: 단일클론 항체, 21B12의 6회 분량 섭생 중 1회 (70 mg, 105 mg, 또는 140 mg Q2W SC, 또는 280 mg, 350 mg 또는 420 mg Q4W SC (4주마다 1회, 피하), Q2W 또는 Q4W SC 투여로 위약, 또는 매일 (QD) 경구 (PO) 투여로 에제티미브. LDL-C 수준 (<130 mg/dL [3.4 mmol/L] 대 > 130 mg/dL)을 스크리닝함으로써 랜덤화는 층화되었다. 랜덤화는 적격성을 결정하기 위해 이용된 스크리닝 LDL-C 평가의 5-10일 내에 발생하였다. 연구 방문은 개체가 Q2W SC 또는 Q4W 치료 또는 에제티미브를 받는지 상관없이, 2주마다 있었다. 단일클론 항체, 21B12의 3 Q2W 분량 군, 그리고 1 Q2W 위약 군을 서로에 대해 맹검하였고, 3 Q4W 분량 군 및 1 Q4W 위약 군을 서로에 대해 맹검하였다. 에제티미브는 맹검하지 않았다. 연구의 종료 방문 및 지질의 마지막 평가는 Q4W IP 스케줄의 개체에 대해 제12주 및 Q2W IP 스케줄의 개체에 대해 제14주에 있었다.

남성 및 여성, ≥ 18 내지 ≤ 75세의 연령이 이 연구에 적격이다. 스크리닝에서 중앙 연구소에 의해 공복 LDL-C는 ≥ 100 mg/dL (2.6 mmol/L) 및 < 190 mg/dL (4.9 mmol/L)였고 공복 트리글리세리드는 ≤ 400 mg/dL (4.5 mmol/L)였다. 개체는 10% 이하의 National Cholesterol Education Panel Adult Treatment Panel III (NCEP ATP III) 프라밍햄 위험 점수를 가졌다.

일차 종점은 제12주의 LDL-C에서 기준선으로부터 변화 퍼센트였다. 이차 종점은 아포지방단백 B (ApoB), 지방단백 (a) (Lp(a))에서 및 총 콜레스테롤 대 고-밀도 지방단백 (HDL)-C의 비율에서의 변화 퍼센트를 포함하였다. 내약성 및 안정성을 또한 평가하였다.

예비 데이터는 70 mg 21B12 (Q2W)로 처리된 개체가 투약 간격 말에 41.21%의 LDL-C에서 기준선으로부터 평균 퍼센트 감소를 가졌고; 105 mg 21B12 (Q2W)로 처리된 개체가 투약 간격 말에 45.44%의 LDL-C에서 기준선으로부터 평균 퍼센트 감소를 가졌고; 그리고 140 mg 21B12 (Q2W)로 처리된 개체가 51.56%의 LDL-C에서 기준선으로부터 평균 퍼센트 감소를 가졌다는 점을 증명하였다 (데이터는 나타나지 않음).

예비 데이터는 280 mg 21B12 (Q4W)로 처리된 개체가 투약 간격 말에 37.53%의 LDL-C에서 기준선으로부터 평균 퍼센트 감소를 가졌고; 350 mg 21B12로 처리된 개체가 투약 간격 말에 42.16%의 LDL-C에서 기준선으로부터 평균 퍼센트 감소를 가졌고; 그리고 420 mg 21B12로 처리된 개체가 47.52%의 LDL-C에서 기준선으로부터 평균 퍼센트 감소를 가졌다는 점을 증명하였다 (데이터는 나타나지 않음).

최종 데이터는 제12주에서, 21B12를 받은 개체가 최대 51%까지의 LDL-C에서 기준선으로부터 최소-제곱 (LS) 평균 퍼센트 감소를 가졌고 (표 12); 에제티미브에 대해 기준선으로부터 변화 퍼센트는 14%였다. 기준선 내지 제12주의 변화는 위약보다 21B12가 최대 72 mg/dL까지 더 컸다. 21B12를 받은 개체는 위약보다 37%- 53% 더 큰 그리고 에제티미브보다 37% 더 큰 기준선으로부터 LDL-C 감소를 가졌다. ApoB (최대 44%까지), Lp(a) (최대 29%까지) 및 총 콜레스테롤/HDL 비 (최대 38%까지)에 대한 기준선으로부터 평균 감소는 위약보다 21B12가 더 컸다.

<표 12>

실시예 25

고콜레스테롤 환자에서 HMG-Co-A 환원효소 저해제와 조합하여 LDL-C에서의 인간 항-PCSK9 항체의 내약성 및 효능을 평가하기 위한 이중-맹검, 랜덤화, 위약-조절, 분량-범위 연구

이 연구의 목적은 고콜레스테롤혈증을 가진 개체에서 HMG-Co-A 환원효소 저해제 (가령, 스타틴)를 첨가하여 이용될 때 저밀도 지방단백 콜레스테롤 (LDL-C)에서 기준선으로부터 변화 퍼센트에서의, 위약과 비교하여, 2주마다 (Q2W) 또는 4주마다 (Q4W) 피하 (SC) 인간, 항-PCSK9 항체 (단일클론 항체 21B12)의 제12주의 효과를 평가하기 위함이다.

본 연구는 631명 개체를 등록하는, 인간 항-PCSK9 항체, 단일클론 항체, 21B12에 대한 이중-맹검, 랜덤화, 층화, 위약 조절, 평행 군 분량 범위 임상 시험이다. 에제티미브와 또는 에제티미브 없이 적어도 4주의 스타틴 요법 동안 안정 분량이 투여된 그리고 모든 포함/배제 규준을 충족하는 개체를 8개의 치료군으로 동일한 분배로 랜덤화할 것이다: 단일클론 항체, 21B12 피하 (SC) (70 mg Q2W, 105 mg Q2W, 140 mg Q2W, 280 mg Q4W, 350 mg Q4W, 그리고 420 mg Q4W, 위약 Q2W SC, 또는 위약 Q4W SC). 기준선에서 LDL-C 수준 (<130 mg/dL [3.4 mmol/L] 대 > 130 mg/dL) 및 에제티미브 용도를 스크리닝함으로써 랜덤화는 층화될 것이다 (예 대 아니오). 랜덤화는 적격성을 결정하기 위해 이용된 스크리닝 LDL-C 평가의 5-10일 내에 발생해야 한다. 연구 방문은 개체가 Q2W SC 또는 Q4W 치료를 받는지 상관없이, 2주마다 있었다. 단일클론 항체, 21B12의 3 Q2W 분량 군, 그리고 1 Q2W 위약 군을 서로에 대해 맹검하였고, 3 Q4W 분량 군 및 1 Q4W 위약 군을 서로에 대해 맹검하였다. 연구의 종료 방문 및 지질의 마지막 평가는 Q4W IP 스케줄의 개체에 대해 제12주 및 Q2W IP 스케줄의 개체에 대해 제14주에 있다.

남성 및 여성, ≥ 18 내지 ≤ 80세의 연령이 이 연구에 적격이다. 등록을 위하여, 개체는 LDL-C 스크리닝 전에 적어도 4주 동안 안정된 분량(들)으로, 에제티미브와 함께, 또는 에제티미브 없이, 스타틴이 투여되어야 하고, 그리고 증량은 필요하지 않다. 스크리닝에서 공복 LDL-C는 ≥ 85 mg/dL (2.2 mmol/L) 이어야 한다. ≥ 85 mg/dL (2.2 mmol/L) 내지 < 100 mg/dL (2.6 mmol/L)의 공복 LDL-C를 스크리닝함에 따른 개체의 등록은 전체 계획된 등록 중 대략 20% 이하로 제한될 것이다. 공복 트리글리세리드는 스크리닝에서 중앙 연구소에 의해 결정된 바와 같은 ≤ 400 mg/dL (4.5 mmol/L)이어야 한다.

예비 데이터는 70 mg 21B12 (Q2W)로 처리된 개체가 투약 간격 말에 39.22%의 LDL-C에서 기준선으로부터 LS 평균 퍼센트 감소를 가졌고; 105 mg 21B12 (Q2W)로 처리된 개체가 투약 간격 말에 56.38%의 LDL-C에서 기준선으로부터 LS 평균 퍼센트 감소를 가졌고; 그리고 140 mg 21B12 (Q2W)로 처리된 개체가 68.76%의 LDL-C에서 기준선으로부터 LS 평균 퍼센트 감소를 가졌다는 점을 증명하였다 (데이터는 나타나지 않음). 예비 데이터는 70 mg 21B12 (Q2W)로 처리된 개체가 투약 간격 말에 21.17%의 Lp(a)에서 기준선으로부터 LS 평균 퍼센트 감소를 가졌고; 105 mg 21B12 (Q2W)로 처리된 개체가 투약 간격 말에 33.41%의 Lp(a)에서 기준선으로부터 LS 평균 퍼센트 감소를 가졌고; 그리고 140 mg 21B12 (Q2W)로 처리된 개체가 33.87%의 Lp(a)에서 기준선으로부터 LS 평균 퍼센트 감소를 가졌다는 점을 증명하였다 (데이터는 나타나지 않음). 예비 데이터는 70 mg 21B12 (Q2W)로 처리된 개체가 투약 간격 말에 21.17%의 HDL-C에서 기준선으로부터 LS 평균 퍼센트 증가를 가졌고; 105 mg 21B12 (Q2W)로 처리된 개체가 투약 간격 말에 6.80%의 HDL-C에서 기준선으로부터 LS 평균 퍼센트 증가를 가졌고; 그리고 140 mg 21B12 (Q2W)로 처리된 개체가 8.43%의 HDL-C에서 기준선으로부터 LS 평균 퍼센트 증가를 가졌다는 점을 증명하였다 (데이터는 나타나지 않음). 예비 데이터는 70 mg 21B12 (Q2W)로 처리된 개체가 투약 간격 말에 14.84%의 VLDL-C에서 기준선으로부터 LS 평균 퍼센트 감소를 가졌고; 105 mg 21B12 (Q2W)로 처리된 개체가 투약 간격 말에 12.75%의 VLDL-C에서 기준선으로부터 LS 평균 퍼센트 감소를 가졌고; 그리고 140 mg 21B12 (Q2W)로 처리된 개체가 45.14%의 VLDL-C에서 기준선으로부터 LS 평균 퍼센트 감소를 가졌다는 점을 증명하였다 (데이터는 나타나지 않음). 예비 데이터는 70 mg 21B12 (Q2W)로 처리된 개체가 투약 간격 말에 7.20%의 트리글리세리드에서 기준선으로부터 LS 평균 퍼센트 감소를 가졌고; 105 mg 21B12 (Q2W)로 처리된 개체가 투약 간격 말에 5.65%의 트리글리세리드에서 기준선으로부터 LS 평균 퍼센트 감소를 가졌고; 그리고 140 mg 21B12 (Q2W)로 처리된 개체가 17.60%의 트리글리세리드에서 기준선으로부터 LS 평균 퍼센트 감소를 가졌다는 점을 증명하였다 (데이터는 나타나지 않음). 예비 데이터는 70 mg 21B12 (Q2W)로 처리된 개체가 투약 간격 말에 36.20%의 비-HDL-C에서 기준선으로부터 LS 평균 퍼센트 감소를 가졌고; 105 mg 21B12 (Q2W)로 처리된 개체가 투약 간격 말에 51.20%의 비-HDL-C에서 기준선으로부터 LS 평균 퍼센트 감소를 가졌고; 그리고 140 mg 21B12 (Q2W)로 처리된 개체가 64.61%의 비-HDL-C에서 기준선으로부터 LS 평균 퍼센트 감소를 가졌다는 점을 증명하였다 (데이터는 나타나지 않음). 예비 데이터는 70 mg 21B12 (Q2W)로 처리된 개체가 투약 간격 말에 26.33%의 총 콜레스테롤에서 기준선으로부터 LS 평균 퍼센트 감소를 가졌고; 105 mg 21B12 (Q2W)로 처리된 개체가 투약 간격 말에 36.91%의 총 콜레스테롤에서 기준선으로부터 LS 평균 퍼센트 감소를 가졌고; 그리고 140 mg 21B12 (Q2W)로 처리된 개체가 46.17%의 총 콜레스테롤에서 기준선으로부터 LS 평균 퍼센트 감소를 가졌다는 점을 증명하였다 (데이터는 나타나지 않음).

예비 데이터는 280 mg 21B12 (Q4W)로 처리된 개체가 투약 간격 말에 42.62%의 LDL-C에서 기준선으로부터 LS 평균 퍼센트 감소를 가졌고; 350 mg 21B12로 처리된 개체가 투약 간격 말에 56.84%의 LDL-C에서 기준선으로부터 LS 평균 퍼센트 감소를 가졌고; 그리고 420 mg 21B12로 처리된 개체가 52.19%의 LDL-C에서 기준선으로부터 LS 평균 퍼센트 감소를 가졌다는 점을 증명하였다 (데이터는 나타나지 않음). 예비 데이터는 280 mg 21B12 (Q2W)로 처리된 개체가 투약 간격 말에 22.54%의 Lp(a)에서 기준선으로부터 LS 평균 퍼센트 감소를 가졌고; 350 mg 21B12 (Q2W)로 처리된 개체가 투약 간격 말에 29.43%의 Lp(a)에서 기준선으로부터 LS 평균 퍼센트 감소를 가졌고; 그리고 420 mg 21B12 (Q2W)로 처리된 개체가 23.29%의 Lp(a)에서 기준선으로부터 LS 평균 퍼센트 감소를 가졌다는 점을 증명하였다 (데이터는 나타나지 않음). 예비 데이터는 280 mg 21B12 (Q2W)로 처리된 개체가 투약 간격 말에 2.17%의 HDL-C에서 기준선으로부터 LS 평균 퍼센트 증가를 가졌고; 350 mg 21B12 (Q2W)로 처리된 개체가 투약 간격 말에 6.92%의 HDL-C에서 기준선으로부터 LS 평균 퍼센트 증가를 가졌고; 그리고 420 mg 21B12 (Q2W)로 처리된 개체가 7.42%의 HDL-C에서 기준선으로부터 LS 평균 퍼센트 증가를 가졌다는 점을 증명하였다 (데이터는 나타나지 않음). 예비 데이터는 280 mg 21B12 (Q2W)로 처리된 개체가 투약 간격 말에 18.12%의 VLDL-C에서 기준선으로부터 LS 평균 퍼센트 감소를 가졌고; 350 mg 21B12 (Q2W)로 처리된 개체가 투약 간격 말에 20.89%의 VLDL-C에서 기준선으로부터 LS 평균 퍼센트 감소를 가졌고; 그리고 420 mg 21B12 (Q2W)로 처리된 개체가 28.66%의 VLDL-C에서 기준선으로부터 LS 평균 퍼센트 감소를 가졌다는 점을 증명하였다 (데이터는 나타나지 않음). 예비 데이터는 280 mg 21B12 (Q2W)로 처리된 개체가 투약 간격 말에 6.75%의 트리글리세리드에서 기준선으로부터 LS 평균 퍼센트 감소를 가졌고; 350 mg 21B12 (Q2W)로 처리된 개체가 투약 간격 말에 9.17%의 트리글리세리드에서 기준선으로부터 LS 평균 퍼센트 감소를 가졌고; 그리고 420 mg 21B12 (Q2W)로 처리된 개체가 11.13%의 트리글리세리드에서 기준선으로부터 LS 평균 퍼센트 감소를 가졌다는 점을 증명하였다 (데이터는 나타나지 않음). 예비 데이터는 280 mg 21B12 (Q2W)로 처리된 개체가 투약 간격 말에 38.89%의 비-HDL-C에서 기준선으로부터 LS 평균 퍼센트 감소를 가졌고; 350 mg 21B12 (Q2W)로 처리된 개체가 투약 간격 말에 50.83%의 비-HDL-C에서 기준선으로부터 LS 평균 퍼센트 감소를 가졌고; 그리고 420 mg 21B12 (Q2W)로 처리된 개체가 48.54%의 비-HDL-C에서 기준선으로부터 LS 평균 퍼센트 감소를 가졌다는 점을 증명하였다 (데이터는 나타나지 않음). 예비 데이터는 280 mg 21B12 (Q2W)로 처리된 개체가 투약 간격 말에 28.08%의 총 콜레스테롤에서 기준선으로부터 LS 평균 퍼센트 감소를 가졌고; 350 mg 21B12 (Q2W)로 처리된 개체가 투약 간격 말에 36.04%의 총 콜레스테롤에서 기준선으로부터 LS 평균 퍼센트 감소를 가졌고; 그리고 420 mg 21B12 (Q2W)로 처리된 개체가 42.76%의 총 콜레스테롤에서 기준선으로부터 LS 평균 퍼센트 감소를 가졌다는 점을 증명하였다 (데이터는 나타나지 않음).

실시예 26

스타틴의 존재에서 LDLR이 추가로 상향조절된 PCSK9 ABP

이 실시예는 PCSK9에 대한 ABP가 스타틴의 존재에서 이용될 때 LDLR 유용성에서의 추가적 증가를 초래하였다는 점을 증명하며, 이는 추가적인 혜택이 두 개의 조합 이용에 의해 성취될 수 있다는 점을 증명한다.

HepG2 세포를 10% 소 태아 혈청 (FBS)을 가진 DMEM에 접종하였고 그리고 ~90% 합류까지 성장시켰다. 48시간 동안 3% FBS를 가진 DMEM에서 명시된 양의 메비놀린 (스타틴, Sigma) 및 PCSK9 ABP (도 12A-12C)로 세포를 처리하였다. 총 세포 용해물을 제조하였다. 50 mg의 전체 단백질을 겔 전기영동으로 분리시켰고 PVDF 막으로 이동시켰다. 토끼 항-인간 LDL 수용체 항체 (Fitzgerald) 또는 토끼 항-인간 b-액틴 항체를 이용하여 면역블롯을 수행하였다. 증진된 화학발광 결과는 도 12A-12C의 상부 패널에서 보여진다. 밴드의 강도를 ImageJ 소프트웨어로 정량화하였고 b-액틴으로 정상화하였다. LDLR의 상대 수준은 도 12A-12C의 하부 패널에서 보여진다. ABP 21B12 및 31H4는 PCSK9 중화 항체인 반면에, 25A7.1은 비-중화 항체이다.

또한 HepG2-PCSK9 세포를 만들었다. 이들은 인간 PCSK9로 형질감염된 안정된 HepG2 세포주였다. 세포를 10% 소 태아 혈청 (FBS)을 가진 DMEM에 접종하였고 그리고 ~90% 합류까지 성장시켰다. 48시간 동안 3% FBS를 가진 DMEM에서 명시된 양의 메비놀린 (Sigma) 및 PCSK9 ABP (도 12D-12F)로 세포를 처리하였다. 총 세포 용해물을 제조하였다. 50 mg의 전체 단백질을 겔 전기영동으로 분리시켰고 PVDF 막으로 이동시켰다. 토끼 항-인간 LDL 수용체 항체 (Fitzgerald) 또는 토끼 항-인간 b-액틴 항체를 이용하여 면역블롯을 수행하였다. 증진된 화학발광 결과는 상부 패널에서 보여진다. 밴드의 강도를 ImageJ 소프트웨어로 정량화하였고 b-액틴으로 정상화하였다.

도 12A-12F에서 나타난 결과에서 보여질 수 있는 바와 같이, 증가하는 양의 중화 항체 및 증가하는 양의 스타틴은 일반적으로 LDLR의 수준의 증가를 야기시켰다. ABP의 증가하는 수준에 대한 효과에서 이러한 증가는 특히 도 12D-12F에서 명백하며, 여기서 세포는 PCSK9로 또한 형질감염되었으며, 이는 ABP가 더 큰 정도까지 그들의 효과를 증명하도록 한다.

흥미롭게도, 12A-12C에 대한 도 12D-12F의 비교에서의 결과로 증명된 바와 같이, LDLR 수준에서 ABP 농도의 영향은 PCSK9가 세포에 의해 생산될 때 급격히 증가하였다. 추가로, 중화 ABP (21B12 및 31H4)는 심지어 스타틴의 존재시, LDLR 수준에서 25A7.1 ABP (비-중화제)보다 더 큰 증가를 야기시켰으며, 이는 추가적인 혜택이 PCSK9에 대한 스타틴 및 ABP 둘 모두의 이용에 의해 성취될 수 있다는 점을 증명한다.

실시예 27

공통 서열

항-PCSK9 ABP의 V_H와 V_L에 상응하는 CDR의 표준 계통발생학적 분석을 이용하여 공통 서열을 결정하였다. V_H와 V_L에 상응하는 동일한 서열 내에 근접한 CDR을 유지시킴으로써 공통 서열을 결정하였다. 간략하게, 비교 배열을 가공처리하고 계통발생론을 추론하는 편의성을 위해 V_H 또는 V_L 중 하나의 전체 가변 도메인에 상응하는 아미노산 서열을 FASTA 포맷팅(formatting)으로 전환시켰다. 그 다음, V_H 또는 V_L에 상응하는 동일한 서열 내에 근접한 CDR을 여전히 유지하면서 CDR 단독의 검사가 동시 사건 (가령, 공통 생식계열 뼈대 유산을 우연하게 공유하는 비관련 항체와 같은) 때문에 임의의 아미노산 위치 가중 편향을 도입하는 것 없이 수행될 수 있게 하기 위하여 이들 서열의 뼈대 영역을 인공적인 연결자 서열 ("bbbbbbbbbb" 플레이스홀더(placeholder), 비-특이적 핵산 구조체)로 교체하였다. 이후 표준 ClutalW-유사 알고리즘을 이용하는 프로그램을 이용하여 이러한 구성방식의 V_H 또는 V_L 서열은 유사성 배열 인터로게이션(interrogation)을 서열화하였다 (Thompson et al., 1994, Nucleic Acids Res. 22:4673-4680을 참조). 8.0의 갭(gap) 형성 페널티(penalty)는 2.0의 갭 연장 페널티와 함께 이용되었다. 이 프로그램은 UPGMA (산술 평균을 이용한 비가중 쌍 그룹 방법) 또는 Neighbor-Joining 방법 (Saitou and Nei, 1987, Molecular Biology and Evolution 4:406-425를 참조) 중 하나를 이용한 서열 유사성 배열에 기반하여 유사하게 계통도를 발생시켜 분기 길이 비교 및 군별(grouping)을 통하여 서열 그룹의 유사성과 차이를 구성하고 설명하였다. 두 방법은 모두 유사한 결과를 초래하였지만 UPGMA-유래 트리(tree)가 궁극적으로 이용되었는데 이는 상기 방법이 더 간편하고 더 보존적인 추측 세트를 이용할 수 있기 때문이다. UPGMA-유래 트리가 발생되었으며 여기서 서열의 유사한 그룹은 그룹 내에서 개별적인 서열 중 100개의 잔기 당 15개보다 적은 치환을 갖는 것으로서 정의되었고 (규모에 대해 트리 도해에서의 범례를 참고) 그리고 공통 서열 수집을 정의하는 데에 이용되었다. 비교의 결과는 도 13A-13J 및 도 48-49에서 나타난다. 도 13E에서, 그룹은 계통 분기하는 경쇄에서 서열은 또한 중쇄에서 계통 분기이고 15개보다 적은 치환을 가지도록 선택되었다.

실시예 28

PCSK9 ABP 제제의 제조

UF/DF - 한외여과/정용여과 방법론

약물 물질, 가령, 항체 21B12 및 항체 11F1은 Millipore Pellicon XL Filter, 50 cm² 크기 (재생 셀룰로오스, 30,000 분자량 컷-오프(Cut-Off)) 막을 이용하여 벤치 스케일(bench scale) Millipore TFF UF/DF 시스템으로, 안정화제를 포함한, 제제 완충제로 교환된 완충제였다. 적어도 10 용적의 정용여과 완충제가 교환될 때까지 정용여과 단계를 수행하였다. 정용여과 단계가 완료되고 나면, UF/DF 시스템을 한외여과 모드로 전환시켰고 제제 각각을 표적 농도 수준으로 농축시켰다.

UF/DF 단계가 완료된 후, 적절한 양의 폴리소르베이트 20 또는 80을 1.0% (w/w) 신선하게 제조된 폴리소르베이트 ("PS") 스톡 용액으로터의 제제 각각에 첨가하여 바람직한 폴리소르베이트 농도에 도달시켰다.

일차 용기를 충전(filling)하기에 앞서, 제제 각각을 층류 후드(hood) 하에 0.2 마이크론 여과기를 이용하여 무균 상태로 여과시켰다. 충전 또한 무균 상태로 수행하였고 적절한 충전 기기를 이용하여 수동으로 또는 자동으로 수행하였다.

실시예 29

저하된 점도를 가진 고농도 PCSK9 ABP 제제

고단백질 농도의 점도에서 상이한 부형제의 효과를 평가하기 위해, 고농도 단백질 제제에 대한 부형제 점도 조절제를 탐색하는 데에 점도, 안정성 및 용해성 스크리닝 검정을 이용하였다. 특이적으로, 모든 시료 제조물, 가령 항체 21B12 시료는 층류 후드 하에 무균 상태로 만들어졌다. 검사되어야할 시료의 냉동 건조는 고단백질 농도를 얻기 위해 간단한 방법을 허용하였다. 냉동 건조를 위해 1.5 mL의 70mg/mL 단백질 (가령, 21B12)을 3cc 유리 바이알 내로 피펫팅하였다. VirTis Lab Scale Lyophilizer에서 일반적인 냉동 건조 주기를 이용하여 냉동 건조를 수행하였다. 냉동 건조 완충제는 pH 4.8의 1.0% 수크로오스를 가진 10mM L-글루타민산염이었다. 냉동 건조된 시료 (가령, 냉동 건조된 21B12 시료)를 하기 표 13에서 나타난, 대략 0.65 mL의 부형제 완충제로 150-200 mg/mL의 최종 단백질 농도까지 개별적으로 재구성하였다. 재구성된 시료를 완전 용해되도록 하룻밤 동안 두었다. 이후 하기 설명된 바와 같이 점도를 측정하였다.

<표 13>

점도, 안정성, 용해성 스크린으로부터의 결과는 다양한 부형제의 첨가 후 21B12 점도에서의 변화를 보여주었다 (도 26). 목적을 스크리닝하기 위해 이용된 모든 부형제가 용액 점도의 저하를 야기하지는 않았다; L-알라닌, 글리세롤, 황산나트륨, 수크로오스, 그리고 염화아연 첨가는 대조 시료와 비교하여 훨씬 더 높은 점도를 야기하였다. 스크린에서 이용된 여러 가지 부형제는 후보자, 예를 들어 L-아르기닌, 카르니틴, 크레아티닌, L-메티오닌, 그리고 타우린을 조절하는 훌륭한 점도인 것으로 나타났다.

특이적 PCSK9 ABP의 점도에서 상이한 제제의 효과를 평가하기 위하여, 21B12의 조성물을 하기 표 29.2에서 나타난 6개의 상이한 제제로 조제하였다. 모든 제제에서 21B12의 농도는 134 mg/ml였다. 조성물을 바이알에 1.0 ml의 최종 용적까지 충전하였다. 조성물을 실온에서 인큐베이션하였다 (즉, 25℃).

21B12의 투석 및 농도

Pierce Slide-A-Lyzer (Rockford, IL) 투석 카세트에 대략 10 mL 21B12를 첨가함으로써 그리고 완전한 완충제 교환을 위해 3 주기 (2시간 x 2 및 16시간 x 1) 동안 4℃에서 2 L 완충제에 대해 투석시킴으로써 투석을 통해 10 mM 아세트산나트륨, 9.0% (w/v) 수크로오스에서 최초로 21B12로부터의 수크로오스 제거를 성취하였다. 투석을 위한 완충제는 pH 5.0의 10 mM 아세트산나트륨 (아세트산으로 만들었음)을 함유하였다. 그 다음, 시료 용적이 바람직한 농도를 위해 요구되는 용적보다 약간 아래가 될 때까지 3000 rpm으로 회전된 Beckman Coulter Allegra 6R 원심분리기 (Fullerton, California)내 Millipore Amicon UltraPrep 장치 (Billerica, MA)를 이용하여 모든 시료를 농축시켰다.

이후 Agilent 8453 분광 광도계 (Santa Clara, California)를 이용하여 A280에서 흡광도를 측정함으로써 농도 측정을 수행하였다. 적절한 흡광 계수를 이용하여 단백질 농도를 계산하였다. 이후 적절한 양의 완충제를 시료에 첨가하여 상기 완충제를 바람직한 농도 아래로 희석시켰고 또 다른 A280을 수행하여 실험에 대한 최종 농도를 얻었다.

점도를 더 낮추기 위해 또한 작용할 수 있는 안정화제의 첨가:

점도를 더 낮추려는 시도에서 부형제, 가령 프롤린, 벤질 알코올, 크레아티닌, 메티오닌, 타우린 등을 검사하였다. 이들 부형제를 고농도 스톡 용액으로부터의 21B12 제제 시료에 개별적으로 첨가하였다.

점도 측정

일정한 25C에서 순환 수조에 의해 조절되는 시료 컵 온도를 맞추면서 CPE-40 축을 가진 Brookfield LV-DVII 원뿔 및 평판 점도계 (Middleboro, Massachusetts)를 이용하여 점도를 측정하였다. 양변위 피펫터(positive displacement pipettor)로 500 ul의 시료를 시료 컵에 첨가하였다. 시료 컵을 고정시킨 후, 약 80% 토크(torque)가 성취될 때까지 축의 회전 속도를 점진적으로 증가시켰다. 이 시점에서 회전 속도를 중지시켰고 Rheocalc 소프트웨어에 의해 점도 측정값이 발생되었다.

<표 14>

결과는 L-프롤린, 벤질 알코올, 크레아티닌, 메티오닌 및 타우린 모두, 고농도의 PCSK9 ABP, 21B12에서 유의미한 점도 저하 효과를 가졌다는 점을 보여준다 (표 14를 참조).

특이적 PCSK9 ABP에서 상이한 제제의 효과를 추가로 평가하기 위하여, 21B12의 조성물을 하기 표 15에서 나타난 상이한 제제로 조제하였다. 제제는 3개의 군으로 나뉜다: (1) 10 mM 아세트산나트륨 완충제, pH 5.2내 21B12의 다양한 농도 세트, (2) 시료 각각을 넣은 3% (대략 261 mM) L-프롤린이 있는 10 mM 아세트산나트륨 완충제, pH 5.2내 21B12의 다양한 농도 세트, 및 (3) 상이한 pH 수준 (4.0 내지 5.5)에서 10 mM 아세트산나트륨 완충제내 약 117-134 mg/mL에서 농축된 21B12 시료 플러스 첨가된 NaCl 또는 L-메티오닌/벤질 알코올 조합 중 하나가 있는 10 mM 아세트산나트륨 완충제, pH 5.2내 두 가지 시료의 세트.

<표 15>

결과는 L-프롤린이 고농도의 PCSK9 ABP, 21B12에서 유의미한 점도 저하 효과를 가졌다는 것을 보여주었다 (도 27을 참조).

특이적 PCSK9 ABP에서 상이한 제제의 효과를 추가로 평가하기 위하여, 21B12의 조성물을 하기 표 16에서 나타난 상이한 제제로 조제하였다.

<표 16>

결과는 1.5% 또는 2.0% 프롤린 (대략 131 nM - 174 mM 프롤린) 및 1% 벤질 알코올로 조제된 21B12 제제가 고농도의 PCSK9 ABP, 21B12에서 유의미한 점도 저하 효과를 가졌다는 점을 보여준다.

특이적 PCSK9 ABP에서 상이한 제제의 효과를 추가로 평가하기 위하여, 21B12의 조성물을 하기 표 17에서 나타난 상이한 제제로 조제하였다.

<표 17>

결과는 특이적 안정화제/부형제를 갖는 제제와 감소된 점도를 갖는 고농도의 21B12 단백질을 획득하는 능력을 보여준다 (도 28A-28D를 참조). 특이적으로, 도 28A는 25℃ 및 40℃에서 10 mM 아세트산나트륨, 그리고 9% 수크로오스 pH 5.2를 포함한 제제내 다양한 농도의 항-PCSK9 항체, 21B12의 점도를 보여주는 그래프이다.

도 28B는 25℃ 및 40℃에서 10 mM 아세트산나트륨, 125 mM 아르기닌, 그리고 3% 수크로오스 pH 5.0을 포함한 제제와 비교하여, 25℃ 및 40℃에서 10 mM 아세트산나트륨, 그리고 9% 수크로오스 pH 5.2를 포함한 제제내 다양한 농도의 항-PCSK9 항체, 21B12의 점도를 보여주는 그래프이다.

도 28C는 25℃ 및 40℃에서 10 mM 아세트산나트륨, 100 mM 메티오닌, 그리고 4% 수크로오스 pH 5.0을 포함한 제제와 비교하여, 25℃ 및 40℃에서 10 mM 아세트산나트륨, 그리고 9% 수크로오스 pH 5.2를 포함한 제제내 다양한 농도의 항-PCSK9 항체, 21B12의 점도를 보여주는 그래프이다.

도 28D는 25℃ 및 40℃에서 10 mM 아세트산나트륨 그리고 250 mM 프롤린을 포함한 제제와 비교하여, 25℃ 및 40℃에서 10 mM 아세트산나트륨, 그리고 9% 수크로오스 pH 5.2를 포함한 제제내 다양한 농도의 항-PCSK9 항체, 21B12의 점도를 보여주는 그래프이다.

실시예 30

고농도 11F1 점도 연구

표 30은 다양한 항체농도에서 그리고 다양한 제제에서 섭씨 25도의 11F1 항체 점도를 보여준다.

상기 실시예 29에서 21B12에 대해 설명된 바와 같이 유사하게 11F1의 고농도 스톡 용액을 제조하였다. 이후 Agilent 8453 분광 광도계 (Santa Clara, California)를 이용하여 A280에서 흡광도를 측정함으로써 농도 측정을 수행하였다. 적절한 흡광 계수를 이용하여 단백질 농도를 계산하였다. 이후 적절한 양의 완충제를 시료에 첨가하여 상기 시료를 바람직한 농도까지 낮춰 희석하였고 그리고 또 다른 A280에서 수행하여 실험에 대한 최종 농도를 얻었다. 고농도 스톡 용액으로부터 파생된 11F1 제제 시료에 개별적으로 부형제를 첨가하였다.

일정한 25℃에서 순환 수조에 의해 조절되는 시료 컵 온도를 맞춰 CPE-40을 가진 Brookfield LV-DVII 원뿔 및 평판 점도계 (Middleboro, Massachusetts)를 이용하여 점도를 측정하였다. 양변위 피펫터로 500 μL의 시료를 시료 컵에 첨가하였다. 시료 컵을 고정시킨 후, 약 80% 토크가 성취될 때까지 축의 회전 속도를 점진적으로 증가시켰다. 이 시점에서 회전 속도를 중지시켰고 Rheocalc 소프트웨어에 의해 점도 측정값이 발생되었다.

상이한 유형의 점도계, CP50-1 축을 가진 Anton Paar Physica Model MCR300을 이용하여 고농도 단백질 제제를 가끔씩 측정하였다. 600 uL 시료를 이 기기에서 이용하였고 용액 점도를 계산하는 데에 Rheoplus 소프트웨어 버전 3.4를 이용하였다. 어느 점도계를 이용하든지 측정에서 큰 차이는 없었다.

<표 30>

표 30에서 보여진 결과는 특이적 안정화제/부형제를 갖는 제제에서 상대적으로 낮은 점도를 가진 고농도의 11F1 항체를 획득하는 능력을 증명한다. 안정화제 메티오닌, 프롤린, 아르기닌, 글리신, 세린 및 알라닌을 포함한 제제는 특히 더 낮은 점도를 나타내었다.

실시예 31

고농도 PCSK9 ABP 제제의 안정성 연구

고단백질 PCSK9 ABP 제제에서 안정성의 효과를 평가하기 위하여, 21B12의 조성물을 하기 표 31.1에서 나타난 상이한 제제로 조제하였다. 0주, 1개월, 2개월, 3개월, 그리고 6개월, 그리고 1년 동안 -30℃ 또는 4℃의 명시된 용기에서 제제를 인큐베이션하였다. 각각의 시점에서 제제 각각에 대하여, 고유 크기 배제 HPLC (SEC-HPLC)에 의한 항체 단위체를 모니터링하기 위해 그리고 광 차폐 (HIAC)에 의한 육안으로 보이지 않는 입자 검출을 위해 패키지 각각으로부터 시료를 제거하였다.

<표 31.1>

SEC-HPLC:

SEC-HPLC는 단백질의 유체역학 용적에서의 차이에 기반하여 단백질을 분리한다. 더 큰 유체역학 단백질 용적을 가진 분자는 더 작은 용적을 가진 분자보다 더 일찍 용리한다. 가변 파장 검출기가 있는 Agilent HPLC 상에서, 5 μm 입자 크기를 가진, TSK-GEL G3000SWXL 7.8 mm x 300 mm 칼럼 (Tosoh Bioscience)을 이용하여 고유 SEC-HPLC를 수행하였다. 이동상은 100 mM 나트륨 인산염, 250 mM 염화나트륨, pH 6.8 ± 0.1이었다. 유속은 0.5 mL/분이었다. 280 nm에서 칼럼 용리액을 모니터링하였다. 크로마토그램내 통합된 피크 면적을 단위체와 고분자량 종류의 양을 정량화하는 데에 이용하였다.

<표 31.2>

표 31.2는 0주, 1개월, 2개월, 3개월, 그리고 6개월 동안 X℃에서 인큐베이션된 표 31.1에 나열된 21B12 제제의 고유 SEC-HPLC 분석 결과를 보여준다. "HMW %"는 시료내 고분자량 21B12 단위체의 양을 반영한다. 이들 결과는 6개월 후 어떠한 제제에 대한 사안도 관찰되지 않았다는 점을 명시한다; 하지만 몇몇 분자량 종류가 메티오닌 제제 (즉, 제제 2, 5 및 8)에서 증가하였다.

광 차폐 (HIAC)에 의한 육안으로 보이지 않는 입자 검출:

액체 시료채집기와 광-차폐 센서 (HIAC/RoycoHRLD-150 또는 등가물)를 함유한 전자, 액체-함유 입자-카운팅(counting) 시스템 (HIAC/Royco 9703 또는 등가물)은 주어진 검사 시료의 입자수 및 그들의 크기 범위를 정량화한다. 액체내 입자들이 광원과 검출기 사이를 통과할 때 그들은 검출기 상에 떨어지는 빛의 빛줄기를 약화시키거나 또는 "차폐"한다. 입자의 농도가 센서의 정상적인 범위 내에 있을 때, 이들 입자는 차례로 검출된다. 검출 구역을 통과한 입자 각각의 통과는 광-검출기 상의 입사광을 감소시키고 광-검출기의 전압 출력은 일시적으로 감소된다. 전압에서의 변화는 기기에 의해 존재하는 입자수로 전환되는 전기 파동으로서 나타난다. 방법은 비-특이적이며 입자의 기원과 상관없이 입자를 측정한다. 모니터링된 입자 크기는 10 μm, 및 25 μm였다.

이 예시에서, 4℃에서 보관된 시료를 이용하여 HIAC 분석을 수행하였다. 특이적으로, 입자-카운팅 시스템에서 입자로서 검출될 수 있는 기포를 제거하기 위하여 표 31.1에서 21B12 제제의 시료를 진공처리 하였다 ("가스제거"라고도 불림). 21B12 시료에 대하여, 방법은 1 내지 2시간 동안 75 토르에서 시료를 진공처리 하기 위함이었다. 입자-카운팅은 가스제거 공정을 완료 2시간 이내에 수행되었다.

도 29A 및 29B는 0주, 1개월, 2개월, 3개월, 그리고 6개월 동안 용기에서 인큐베이션된 상기-식별된 제제에 대한 HIAC 검정의 결과를 보여준다. 10 μm, 및 25 μm 입자의 수를 세었다. 도 29A 및 29B는 모든 21B12의 제제가 HIAC로 측정된 바와 같이 안정되었음을 증명한다. 유리 주사기내 제제, 즉, 제제 4-6이 단백질 농도와 제제에 걸쳐 더 높은 입자 수준을 보였음에도 불구하고, 이들 입자의 총 수는 입자 크기 (10 μm 및 25 μm) 각각에 대해 USP 한계 아래이다. 10 μm 입자에 대한 USP 한계는 용기당 6000이고 25 μm 입자에 대해서는, 용기 당 600이다.

실시예 32

11F1 안정성 연구

11F1의 고농도 제제 (150 mg/mL)를 연구하기 위해, 하기 표 32에서 명시된 바와 같이 후보 부형제를 이용하여 여러 가지 제제를 만들었다. 적어도 6개월 동안 -30℃ 또는 4℃에서 명시된 용기에 제제를 보관하였다.

<표 32A>

하기 표 32B에서 명시된 시점에 -30℃ 및 4℃에서 보관 후 크기 배제 HPLC로 HMW% 종류를 평가하였다. 간단하게, 크기 배제 HPLC는 단백질의 유체역학 용적에서의 차이에 기반하여 단백질을 분리한다. 더 큰 유체역학 단백질 용적을 가진 분자는 더 작은 용적을 가진 분자보다 더 일찍 용리한다. 가변 파장 검출기가 있는 Agilent HPLC 상에서, 5 μm 입자 크기를 가진, TSK-GEL G3000SWXL 7.8 mm x 300 mm 칼럼 (Tosoh Bioscience)을 이용하여 고유 SEC-HPLC를 수행하였다. 이동상은 100 mM 나트륨 인산염, 250 mM 염화나트륨, pH 6.8 +/- 0.1이었다. 유속은 0.5 mL/분이었다. 280 nm에서 칼럼 용리액을 모니터링하였다. 크로마토그램내 통합된 피크 면적을 단위체와 고분자량 종류의 양을 정량화하는 데에 이용하였다.

<표 32B>

표 32B는 0주, 2개월, 4개월, 또는 6개월 동안 4℃에서 또는 -30℃에서 인큐베이션된 표 32A에 나열된11F1 제제의 고유 SEC-HPLC 분석의 결과를 보여준다. "HMW %"는 시료내 고분자량 11F1의 양을 반영한다. 이들 결과는 최대 6개월 후 어떠한 제제에 대한 사안도 관찰되지 않았다는 점을 명시하지만, 몇몇 고분자량 종류가 -30℃에서 보관된 메티오닌 제제 (즉, 제제 3, 및 6)에서 증가하였다.

하기 표 32C에서 명시된 바와 같이 일차 용기에서 제제를 제조함으로써 추가적인 고농도 11F1 제제의 안정성을 평가하였다:

<표 32C>

1년 동안 섭씨 4°에서 제제를 인큐베이션하였다. 하기 표 32D에서 명시된 시점에, 용기 각각으로부터 시료를 제거하였고 상기 표 32B에 대해 설명된 바와 같이 SEC-HPLC로 분석하였다..

<표 32D>

하기 표 32E에서 명시된 시점에, 양이온 교환 HPLC (CEX-HPLC)로 분석된 용기 각각으로부터 시료를 제거하였다. 양이온 교환 HPLC는 단백질의 표면 전하에서의 차이에 기반하여 단백질을 분리한다. 세트 pH에서, 11F1의 전하된 동종형을 양이온 교환 칼럼 상에서 분리시켰고 그리고 염 구배를 이용하여 용리시켰다. UV 흡광도로 용리액을 모니터링하였다. 총 피크 면적의 퍼센트로서 동종형 각각의 피크 면적을 결정함으로써 전하된 동종형 분포를 평가하였다.

가변 파장 검출기가 있는 Agilent HPLC 상에서, 10 μm 입자 크기를 가진, Dionex G3000SWXL 4.0 mm ID x 250 mm 칼럼 (Tosoh Bioscience)을 이용하여 고유 CEX-HPLC를 수행하였다. 이동상은 20 mM MES, pH 6.0 +/-0.1 및 500 mM 염화나트륨을 가진 동일한 완충제의 선형 기울기였다. 유속은 0.6 mL/분이었다. 280 nm에서 칼럼 용리액을 모니터링하였다. 크로마토그램내 통합된 피크 면적을 상이하게 전하된 동종형의 양을 정량화하는 데에 이용하였다.

<표 32E>

표 32D 및 32E 둘 모두는 설명된 11F1 제제가 4℃에서 최대 1년까지 보관시 HMW% (SEC-HPLC)에서 5% 미만의 증가 또는 주요 동종형 피크 (CATION HPLC)에서 3-5% 미만의 변수를 나타내었다는 점을 증명한다. 사실상 두 매개변수 모두에서의 변화는 매우 낮았으며 이는 매우 안정된 제제임을 명시한다.

광 차폐 (HIAC)에 의한 육안으로 보이지 않는 입자 검출:

액체 시료채집기와 광-차폐 센서 (HIAC/RoycoHRLD-150 또는 등가물)를 함유한 전자, 액체-함유 입자-카운팅 시스템 (HIAC/Royco 9703 또는 등가물)은 주어진 검사 시료의 입자수 및 그들의 크기 범위를 정량화한다. 액체내 입자들이 광원과 검출기 사이를 통과할 때 그들은 검출기 상에 떨어지는 빛의 빛줄기를 약화시키거나 또는 "차폐"한다. 입자의 농도가 센서의 정상적인 범위 내에 있을 때, 이들 입자는 차례로 검출된다. 검출 구역을 통과한 입자 각각의 통과는 광-검출기 상의 입사광을 감소시키고 광-검출기의 전압 출력은 일시적으로 감소된다. 전압에서의 변화는 기기에 의해 존재하는 입자수로 전환되는 전기 파동으로서 나타난다. 방법은 비-특이적이며 입자의 기원과 상관없이 입자를 측정한다. 모니터링된 입자 크기는 10 μm, 및 25 μm였다.

이 예시에서, 4℃에서 보관된 시료를 이용하여 HIAC 분석을 수행하였다. 특이적으로, 입자-카운팅 시스템에서 입자로서 검출될 수 있는 기포를 제거하기 위하여 표 32a에서 11F1 제제의 시료를 진공처리 하였다 ("가스제거"라고도 불림). 11F1 시료에 대하여, 방법은 1 내지 2시간 동안 75 토르에서 시료를 진공처리 하기 위함이었다. 입자-카운팅은 가스제거 공정을 완료 2시간 이내에 수행되었다.

도 30A 및 30B는 0주, 그리고 4 개월 동안 용기에서 인큐베이션된 상기-식별된 제제에 대한 HIAC 검정의 결과를 보여준다. 10 μm, 및 25 μm 입자의 수를 세었다. 도 30A 및 30B는 모든 11F1의 제제가 HIAC로 측정된 바와 같이 안정되었음을 증명한다. 모든 제제에 대한 입자의 총 수는 입자 크기 (10 μm 및 25 μm) 각각에 대해 USP 한계 아래이다. 10 μm 입자에 대한 USP 한계는 용기당 6000이고 25 μm 입자에 대해서는, 용기 당 600이다.

실시예 33

11F1 결합 특이성

이 검정으로부터의 결과는 11F1이 PCSK1, PCSK2, PCSK7, 또는 퓨린이 아닌 PCSK9에 결합한다는 점을 증명하고, 이는 PCSK9에 대한 11F1의 특이성을 증명한다.

완충제 A (25 mM 트리스, 150 mM NaCl, 0.1% BSA, 0.05% 트윈, pH 7.5)에서 희석된, 비오틴화된 PCSK9는 실온에서 1시간 인큐베이션 동안 0.2 μg/mL의 농도로 뉴트라비딘 코팅된 96 웰 평판에 결합되었다. 별도로, 0.4 μg/mL의 11F1을 PCSK1, PCSK2, PCSK7, PCSK9 또는 퓨린 중 하나의 다양한 농도 (0 내지 20 μg/mL의 범위)로 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다 (R&D Systems, Minneapolis, MN) (트윈 없이(w/o) 완충제 A에서 희석시킴). 4.5 μg/mL에서의 퓨린 저해제는 모든 퓨린 함유 반응을 포함시켰다. PCSK9 코팅된 스트렙타비딘 평판을 완충제 A로 세척하였고 그리고 항체/프로단백질 전환효소 혼합물을 평판에 첨가하고 1시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 세척 후, 염소-α-인간 Fc-HRP (160 ng/mL, 완충제 A에서 희석시킴) (Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME)와 그 다음 TMB 기질과의 인큐베이션으로 결합된 항체를 검출하였다. 1 N HCl로 반응을 중지시켰고 Spectramax Plus 384 분광 광도계 (Molecular Devices Inc., Sunnyvale, CA) 상에서 450 nm의 파장에서 흡광도를 판독하였다.

이 검정은 평판-포획된 PCSK9와의 11F1의 결합을 위해 경쟁하는 용액내 프로단백질 전환효소의 능력에 의존한다. 용액 분량에서 11F1 및 PCSK9의 전-인큐베이션은 감소된 OD450으로서 검출된 평판-포획된 PCSK9에 결합하는 11F1의 양을 의존적으로 그리고 강력하게 감소시켰다 (도 31). 모든 결과는 프로단백질 전환효소의 농도와 대비하여 평균 OD450 값 ± 표준 편차로서 표현되었다. 용액에서, PCSK1, PCSK2, PCSK7, 또는 퓨린과의 11F1의 전-인큐베이션은 평판-포획된 PCSK9와의 11F1의 결합에 유의미하게 영향을 주지는 않았다. 따라서, 연구된 단백질 농도에서, 11F1은 PCSK9에만 결합하고 검사된 다른 프로단백질 전환효소 패밀리에는 결합하지 않는다.

실시예 33

LDLR:PCSK9 결합의 11F1 저해의 효능

본 실시예는 나노몰 농도의 11F1이 이 검정 조건 하에 LDLR과의 D374Y 및 야생형 PCSK9 둘 모두의 결합을 저해할 수 있다는 점을 증명한다.

간략하게, 4℃에서 하룻밤 인큐베이션함으로써, 깨끗한 384 웰 평판을 PBS에서 희석된, 2 μg/mL의 염소 항-LDL 수용체 항체 (R&D Systems, Minneapolis, MN)로 코팅하였다. 평판을 완충제 A (100 mM s나트륨 카코딜레이트 pH 7.5)로 완전하게 세척하였고 이후 실온에서 2시간 동안 완충제 B (완충제 A내 1% 비-지방 분유 [Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA])로 차단하였다. 세척 후, 평판을 완충제 C (10 mM CaCl2로 보충된 완충제 B)로 희석된 0.4 μg/mL의 LDL 수용체 (R&D Systems, Minneapolis, MN)와 실온에서 1.5시간 동안 인큐베이션하였다. 이 인큐베이션과 동시에, 20 ng/mL의 비오틴화된 D374Y PCSK9 또는 100 ng/mL의 비오틴화된 WT PCSK9를 완충제 A에서 희석된 다양한 농도의 항-PCSK9 항체 11F1과 인큐베이션하였다 (D374Y PCSK9 검정에 대하여 6.0 ng/mL 내지 200 ug/mL 또는 WT PCSK9 검정에 대하여 3.1 ng/mL 내지 25 ug/mL 범위의 최종 농도). LDLR-코팅된 평판을 세척하였고 비오틴화된 PCSK9/항체 혼합물을 첨가하였다. LDLR 평판을 1시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 스트렙타비딘-HRP (완충제 C내 500 ng/mL)와 그 다음 TMB 기질과의 인큐베이션으로 LDLR과의 비오틴화된 PCSK9의 결합을 검출하였다. 1N HCl로 반응을 중지시켰고 SpectraMax Plus 384 분광 광도계 (Molecular Devices Inc., Sunnyvale, CA) 상에서 450 nm의 파장에서 흡광도를 판독하였다. OD450과 대비하여 항체 농도의 로그를 플롯하는 데에 GraphPad Prism (v 4.01) 소프트웨어를 이용하여 비선형 회귀에 의한 IC50 값을 측정하였다.

11F1은 LDLR:PCSK9 결합을 저해하였다. D374Y PCSK9 검정내 11F1에 대한 IC50 값은 9.1 nM ± 1.5 nM (n=3)의 평균 (± SD)으로 7.3 nM 내지 10.1 nM의 범위에 있었다. 야생형 PCSK9 검정내 11F1에 대한 IC50 값은 5.9 nM ± 1.9 nM (n=3)의 평균으로 4.4 nM 내지 8.1 nM의 범위에 있었다. 이들 IC50 값은 결합 검정에서 이용된 재조합 D374Y PCSK9 또는 WT PCSK9의 양에 의존한다는 점에 주목해야 한다. D374Y 및 야생형 검정 둘 모두에 대한 대표적인 분량 반응 곡선은 각각, 도 32 및 도 33에서 제시된다.

실시예 34

세포 LDL 흡수 차단에서 11F1의 효능

11F1은 시험관내 PCSK9와 LDLR의 상호작용을 차단하고 HepG2 세포내 LDL 흡수의 PCSK9-매개된 감소를 방지할 수 있다.

간략하게, 10% FBS 및 1%의 항생-항진균성 용액 (Mediatech Inc., Herndon, VA)으로 보충된 DMEM (Mediatech Inc., Herndon, VA)내 웰 당 5x104개 세포의 밀도로 검고, 깨끗한 바닥 96-웰 평판에 인간의 HepG2 세포를 접종하였다. 세포를 하룻밤 동안 37℃ (5% CO2)에서 인큐베이션하였다. D374Y PCSK9와 항체 사이 또는 WT PCSK9와 항체 사이의 복합체를 형성하기 위해, 666.7 nM 내지 0.7 nM (D374Y PCSK9를 차단하기 위한) 또는 3.3 μm 내지 3.3 nM (WT PCSK9를 차단하기 위한)으로 11F1의 일련의 희석 (1:2)을 제제 완충제 (25 mM HEPES, pH 7.5, 0.15 M NaCL)에서 준비하였다. D374Y PCSK9 (2 μg/mL) 또는 WT PCSK9 (25 μg/mL) 중 하나를 흡수 완충제 (1% FBS를 함유한 DMEM)에서 희석하였고 다양한 농도의 11F1과 함께 또는 흡수 완충제 단독 (음성 대조)으로만 실온에서 1시간 동안 진탕하면서 인큐베이션하였다. BODIPY-LDL (Invitrogen, Carlsbad, CA)을 12 μg/mL의 농도까지 흡수 완충제에서 희석하였다. 하룻밤 인큐베이션 후, HepG2 세포를 DPBS (Mediatech Inc., Herndon, VA)로 2번 헹구어냈다. 11F1과의 25 마이크로리터의 D374Y PCSK9 또는 WT PCSK9 복합체 및 25 μL의 희석된 BODIPY-LDL (Invitrogen, Carlsbad, CA)을 세포에 첨가하였고 3시간 동안 37℃ (5% CO2)에서 인큐베이션하였다. 세포를 DPBS로 5번 세척하였고 100 μL DPBS에서 재현탁시켰다. 형광 신호를 480~520 nm (여기) 및 520~600 nm (방출)에서 Safire 평판 판독기 (Tecan Systems Inc., San Jose, CA)를 이용하여 검출하였고 상기 신호는 상대 형광 단위 (RFU)로서 표현되었다.

RFU와 대비하여 항체 농도의 로그를 플롯하고 S자형 용량-반응 (가변 경사) 곡선 맞춤 프로그램을 이용하여 비선형 회귀에 의한 EC50 값을 측정하는 데에 GraphPad Prism (Version 4.02, GraphPad Software Inc., San Diego, CA) 소프트웨어를 이용하였다.

이 실시예는 11F1이 용량-의존 방식으로 HepG2 세포내 LDL 흡수의 D374Y PCSK9 또는 WT PCSK9 -매개된 감소를 차단하였다는 점을 보여준다. HepG2 세포에 재조합 정제된 D374Y PCSK9 (2 μg/mL) 또는 WT PCSK9 (25 μg/mL)를 첨가한 것은 BODIPY-LDL의 흡수를 각각, 비처리된 세포에서 측정된 수준의 ~50 내지 60% 및 ~40%까지 감소시켰다. 항체는 비처리된 세포에서 관찰된 수준까지 LDL 흡수를 용량-의존적으로 복귀시켰다. LDL 흡수의 D374Y PCSK9-매개된 감소를 차단하는 11F1의 능력에 대한 평균 (± SD) EC50 값은 35.3 ± 9.1 nM (n = 6, 도 34)이었다. LDL 흡수의 WT PCSK9-매개된 감소를 차단하는 11F1의 능력에 대한 EC50 값은 124.2 ± 28.5 nM (n = 3, 도 35)이었다. 이들 EC50 값은 세포 검정에서 이용된 재조합 D374Y PCSK9 또는 WT PCSK9의 양(amount)의 함수라는 점에 주목해야 한다. 더 적은 D374Y PCSK9가 검정에서 이용되었기 때문에 EC50 값은 WT PCSK9보다 D374Y PCSK9에 대하여 더 낮으며 더 적게 이용된 이유는 LDLR과의 이의 결합 친화성이 WT PCSK9보다 5- 내지 30-배 더 크기 때문이다 (Cunningham et al, 2007; Fisher et al, 2007; Kwon et al, 2008).

본원에서 보고된 EC50 값은 11F1에 대한 3 내지 6회 분리 측정으로부터 유래된 대표적인 평균 값이다.

실시예 35

생쥐 모델에서 아데노-연관 바이러스를 통해 발현된 인간 PCSK9의 차단에서 11F1 및 8A3의 효능

항-PCSK9 항체 11F1 또는 8A3의 단일 정맥내 볼러스 투여는 AAV에 의해 인간 PCSK9를 발현하는 생쥐내 혈청 비-HDL-C 및 TC에서의 유의미한 감소를 야기한다. 이 실시예는 생체내 인간 PCSK9의 기능을 차단하는 두 항-PCSK9 항체 모두의 효과를 증명한다.

간략하게, 인간 PCSK9를 발현하는 120 C57BL/6 생쥐는 인간 PCSK9에 대해 코딩하는 조작된 아데노 연관 바이러스 (AAV)로의 감염에 의해 발생되었으며, 상기 쥐는 상승된 수준의 순환 저밀도 지방단백 콜레스테롤 (LDL-C)을 야기한다. Cobas Integra 400 플러스 화학 분석기 (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN)를 이용하여 혈청 콜레스테롤 분석을 수행하였다. 유사한 수준의 비-HDL-C (LDL-C 및 VLDL-C), HDL-C 및 TC를 갖는 치료 군으로 동물을 랜덤화하였다. 치료일 0 (T=0)에, 생쥐 서브세트를 안락사시켰고 혈청을 수집하여 일일 기준선 수준을 확립하였다. 이후 남아있는 생쥐에게 꼬리 정맥 주사를 통하여 30 mg/kg의 11F1, 8A3 또는 항-키홀-림펫 헤모사이아닌(KLH) IgG2 대조 항체를 투여하였다. 1 내지 5일에 주사 후, 생쥐 서브세트를 안락사시키고 대정맥으로부터 전체 혈액을 수집하고 그리고 실온에서 30분 동안 응고되도록 하였다. 10분 동안 벤치 탑(bench top) 원심분리기로 12,000 rpm에서 원심분리 후, 혈청을 수집하였다. Cobas Integra 400 플러스 화학 분석기를 이용하여 혈청 콜레스테롤 분석을 수행하였다.

샌드위치 ELISA 검정을 이용하여 PCSK9의 혈청 농도를 측정하였다. 1X PBS에서 희석된 2 μg/ml의 단일클론 항-PCSK9 항체 (31H4)로 깨끗한 96 웰 평판을 하룻밤 동안 코팅하였다. 평판을 1X PBS/.05% 트윈으로 완전하게 세척하였고 이후 3% BSA/1XPB로 2시간 동안 차단하였다. 세척 후, 평판을 일반적인 검정 희석제에서 희석된 혈청과 2시간 동안 인큐베이션하였다 (Immunochemistry Technologies, Bloomington, MN). 재조합 인간 PCSK9 (1 ng/ml 내지 500 ng/ml)를 동시에 검정하였고 각각의 ELISA 평판 상에서 표준 곡선을 발생시키는 데에 이용하였다. 토끼 다중클론 비오틴화된 항-PCSK9 항체 (D8773, Amgen Inc, CA)를 1 ug/ml (1% BSA/PBS내)로 첨가하였고, 그 다음 뉴트라비딘-HRP를 200 ng/ml (1% BSA/PBS내)로 첨가하였다. TMB 기질과의 인큐베이션으로 결합 PCSK9를 검출하였다. 1N HCl의 첨가로 반응을 중지시켰고 Spectra Max Plus 384 분광 광도계 (Molecular Devices Inc, Sunnyvale, CA) 상의 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 재조합 인간 PCSK9로 발생된 표준 곡선 (4-매개변수 로지스틱 정합(logistic fit))을 혈청 시료에서 상응하는 농도의 PCSK9를 측정하는 데에 이용하였다.

샌드위치 ELISA 검정을 이용하여 항체의 혈청 농도를 측정하였다. 다중클론 염소 항-인간 Fc IgG 및 HRP-표지된 염소 항-인간 IgG Fcγ 다중클론 시약 (둘 모두 Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc, West Grove, PA로부터)을 각각, 포획 및 검출 항체로서 이용하였다. 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘 (TMB) 기질 용액은 과산화물과 반응하였고, 그리고 겨자무과산화효소 (HRP)의 존재에서, 포획 시약에 의해 결합된 각각의 항-PCSK9 항체의 양에 비례하는 비색 신호를 형성하였다. 미세평판 판독기 (Spectra Max Plus 384)를 이용하여 450 nm 마이너스 650 nm에서 색의 강도 (광학 밀도, OD)를 측정하였다. 개별적으로 만들어진 표준 곡선의 Logistic (자동-추산) 회귀가 있는 Watson 버전 7.0.0.01 (Thermo Scientific, Waltham, MA) 데이터 감소 패키지를 이용하여 데이터를 분석하였다. 검정을 위한 정량화의 하한 (LLOQ)는 34.4 ng/mL이었다.

AAV 생쥐내 약동학적 매개변수의 계산

WinNonlin Enterprise, 버전 5.1.1 (Pharsight, St. Louis, MO)을 이용하여 개체 각각에 대해 미리 결정된 명목상 시점을 이용하여 혈청 농도 상에서 비-구획 분석 (NCA)을 수행하였다. 말단 제거율 상수 및 반감기를 추정하기 위한 데이터 점을 농도-시간 프로필의 육안 검사로 선택하였다. 보고된 NCA 매개변수는 다음을 포함하였다: 겉보기 반감기 (t1/2), 시간 0에서부터 마지막 측정 농도까지의 혈청 농도-시간 곡선 하 면적 (AUC0-t), 그리고 겉보기 혈청 청소 (CL0-t). 선형 로그-선형 사다리꼴 방법을 이용하여 AUC0-t를 측정하였고, 그리고 Dose/AUC0-t로 CL0-t를 계산하였다. 11F1, 8A3, 그리고 31H4 항체에 대하여. 연구-후 실제 분량이 나타난 분량 용액 분석은 30 mg/kg 표적의 20% 내에 있었다. 하지만, IgG2 대조군에 대하여, 실제 분량이 나타난 분석은 의도한 표적의 오직 40%였다. 따라서, IgG2 대조군에 대한 CL0-t 계산을 위해 12 mg/kg의 보정된 분량을 이용하였다. 2개의 유효 숫자로 기록된 반감기를 제외한, 매개변수는 3개의 유효 숫자로 기록되었다.

통계학적 분석

모든 콜레스테롤 결과는 평균의 평균 ± 표준 오차로서 표현되었다. 모든 약동학적 데이터는 평균 ± 표준 편차로서 표현되었다. 1-방식 ANOVA에 의해 측정된 0.05의 p값은 항-KLH IgG2 대조 항체 주사 동물 및 동일한 시점에 항-PCSK9 항체가 투여된 동물 사이의 통계학적 유의성을 측정하는 데에 역치로서 이용되었다.

혈청 비-HDL-C, HDL-C, 그리고 TC에서 항-PCSK9 항체의 효과

기준선을 설립하기 위하여, 인간 PCSK9를 발현하는 생쥐 서브세트를 항체의 주사에 앞서 안락사시켰고 혈액을 수집하였다. 이들 동물내 비-HDL-C, HDL-C 그리고 TC 수준은 각각, 33 ± 4, 117 ± 4 및 183 ± 9 mg/dL, (평균 ± SEM)이었다. 무경험 동물내 PCSK9의 수준은 4921 ng/mL ± 2044 ng/mL인 것으로 측정되었다.

항-KLH IgG2 대조 항체 (대조 동물)가 주사된 생쥐와 비교하여, 11F1의 주사는 주사-후 제1, 2, 그리고 4일에 비-HDL-C의 유의미한 저하를 초래 (최대 59%로)한 반면에, TC는 제4일에만 훨씬 저하되었다 (22%까지) (도 36, 도 37). HDL-C의 어떠한 유의미한 저하도 임의의 시점에 관찰되지 않았다 (도 38).

대조 동물과 비교하여, 8A3의 주사는 주사-후 제1, 2, 그리고 4일에 비-HDL-C의 유의미한 저하를 초래 (최대 65%로)한 반면에, TC는 주사-후 제2일에 훨씬 저하되었다 (최대 24%로) (도 36, 도 37). HDL-C의 어떠한 유의미한 저하도 임의의 시점에 관찰되지 않았다 (도 38).

약동학

30 mg/kg의 정맥내 분량에서, 11F1 및 8A3은 매우 유사한 약동학적 작용을 가졌다 (도 39). 이들 두개의 분자에 대하여, AUC0-t 노출, 추정된 CL0-t, 그리고 겉보기 반감기는 동등하였다 (도 40의 표). 항-KLH IgG2 대조 항체는 11F1 및 8A3보다 예상치않게 더 낮은 AUC0-t 노출을 가졌지만, 이것은 항체가 의도된 것보다 더 낮은 분량으로 투여되기 때문일 가능성이 있다 (30 mg/kg과는 대조적으로 12 mg/kg; 분량 용액 분석은 40%의 표적이 되는 항체 농도를 보여주었다. 보정된 분량을 이용하여 계산될 때, 항-KLH IgG2 대조 항체 CL0-t는 11F1 및 8A3의 것과 유사하였고, 그리고 >120시간에 항-KLH IgG2 대조 항체의 겉보기 반감기를 추정하였다. 이들 데이터는 11F1 및 8A3 CL0-t 값이 항-KLH IgG2 대조 항체와 더 유사하기 때문에, AAV 모델에 투여된 다른 항체와 비교할 때 항체 성향에 PCSK9 리간드의 영향은11F1 와 8A3에 대해 덜 두드러진다는 점을 제시하였다.

요약

생쥐내 AAV에 의한 인간 PCSK9의 발현 (대략 5 ug/mL)은 대략 33 mg/dL의 혈청 비-HDL-C 수준을 야기하였다. 11F1의 30 mg/kg 주사 후, 주사-후 제1, 2 및 4일에 유의미한 혈청 비-HDL-C 저하가 관찰되었다 (대조 동물과 비교하여 최대 59%). TC의 유의미한 저하는 제4일에만 확인되었다. 8A3의 주사는 대조 동물과 비교하여 최대 65%로 유사한 패턴의 비-HDL-C 저하를 야기하였다. 하지만 8A3 투여는 최대 24%로, 주사-후 제2일에만 유의미한 TC 저하를 야기하였다. 11F1 또는 8A3 중 하나가 투여된 동물에서 어떠한 HDL-C의 유의미한 저하가 관찰되지 않았다. 11F1 및 8A3의 혈청 항체 수준 분석은 항-KLH IgG2 대조 항체와 유사한 프로필을 증명하였다.

실시예 36

시노몰구스 원숭이내 혈청 지질에서 11F1, 21B12 및 8A3의 단일 피하 투여의 효과

시노몰구스 원숭이에게 11F1, 8A3 또는 21B12의 단일 SC 투여는 혈청 LDL-C, 그리고 TC의 유의미한 저하를 야기한다. 이 연구는 비-인간 영장류내 혈청 콜레스테롤을 저하시키는 항-PCSK9 항체의 능력을 증명하였다.

간략하게, 실험에 앞서 적어도 2주 동안 무경험 수컷 시노몰구스 원숭이를 그들의 환경에 적응시켰다. 동물을 그들의 혈청 TC, HDL-C, LDL-C, 그리고 트리글리세리드 수준, 그리고 그들의 체중의 전-스크린에 기반하여 치료 군으로 랜덤화하였다. 1주 후, 시점 설계된 T = 0에서 기준선 혈청 지질 수준을 측정하기 위해, 동물을 하룻밤 동안 단식시켰고, 그리고 말초 혈관구조 (요측피정맥 또는 복재정맥)으로부터 피를 뽑았다. 이후 동물에게 0.5 mg/kg (모두 0.4 mL/kg 체중에서)의 항-KLH IgG2 대조 항체, 11F1, 21B12, 또는 8A3으로 SC 주사하였다. 이후 45일 기간에 걸쳐 설계된 시점에서 동물로부터 공복 혈액 시료를 수집하였다.

특정 시점에서, 하룻밤 동안 공복 조건 하에 동물의 말초 혈관구조 (요측피정맥 또는 복재정맥)로부터 혈액을 수집하였다. 실온에서 30분 동안 전체 혈액이 응고되도록 하였다. 20분 동안 3,000 rpm에서 원심분리 후, 혈청을 수집하였다. Cobas Integra 400 분석기 (Roche Diagnostics Inc, Indianapolis, IN)를 이용하여 직접적인 혈청 콜레스테롤 분석을 수행하였다. 다음 방법론과 함께, Anilytics, MD로 특정 시점 (제0, 3, 6, 15, 24 및 33일)에 아포지방단백 B 혈청 수준을 측정하였다. 6개 점 표준 곡선을 이용하여 Hitachi 717 분석기로의 분석을 위해 17μL 분취량의 시료 (제조 없음)를 이용하였다. 시료의 초기 값이 표준 곡선 선형성보다 더 높다면, 시료를 희석하고 적절한 희석 인자를 곱한 결과로 반복하였다. DiaSorin (Stillwater, MN)으로부터 검정을 위한 시약 (APO-B 시약 키트 # 86071, 항체 세트 # 86060, 대조군 세트 # 86103)을 얻었다.

34.4 내지 3000 ng/mL (정량화의 하한 [LLOQ]이 되는 34.4 ng/mL)의 검정 범위로 효소-결합 면역흡착 검정 (ELISA)을 이용하여 혈청내 항체 농도를 측정하였다.

Watson^® LIMS, 버전 7.0.0.01 (Thermo Scientific, Waltham, MA)을 이용하여 개체 각각에 대해 미리 결정된 명목상 시점을 이용하여 혈청 농도 상에서 비-분획 분석 (NCA)을 수행하였다. 말단 제거율 상수 및 반감기를 추정하기 위한 데이터 점을 농도-시간 프로필 및 최적 선형 정합의 육안 검사로 선택하였다 (전형적으로 360 시간으로부터 항체 농도가 정량화의 하한 아래로 떨어질 때까지). 보고된 NCA 매개변수는 다음을 포함하였다: 말단 반감기 (t1/2,z), 최대 혈청 농도 (C_최대), 시간 0에서부터 무한대까지의 혈청 농도-시간 곡선 하 면적 (AUC0-무한), 그리고 겉보기 혈청 청소 (CL/F). 선형 로그-선형 사다리꼴 방법을 이용하여 AUC0-무한을 측정하였다. 2개의 유효 숫자로 기록된 반감기를 제외한, 모든 매개변수는 3개의 유효 숫자로 기록되었다.

통계학적 분석

공변량으로서 기준선을 그리고 고정된 효과로서 치료 군을 고려한 통계학적 모델을 LDL-C, HDL-C, TC, 그리고 트리글리세리드에 대해 각각의 시점에서 로그 형질전환된 반응에 정합시켰다. Tukey 다중 비교 보정을 적용시켜 각각의 시점에서 쌍별 비교(pairwise comparison)를 조정하였다. 조정된 p-값을 이용하여 알파=0.05에서 통계학적 유의성을 평가하였다.

혈청 LDL 콜레스테롤에서 11F1, 21B12, 그리고 8A3의 효과

11F1에 대한 최대 LDL-C 저하를 항-KLH IgG2 대조 항체-처리된 원숭이 (대조 동물)와 비교하여 LDL-C의 57% 저하로, 주사 9일 후 관찰하였다. 제27일까지 LDL-C는 대조 동물에서 관찰된 것과 유사한 수준으로 복귀하였다. 21B12에 대한 최대 LDL-C 저하를 대조 동물과 비교하여 LDL-C의 64% 저하로, 주사 3일 후 관찰하였다. 제6일까지 LDL-C는 대조 동물과 유사한 수준으로 복귀하였다. 8A3에 대한 최대 LDL-C 저하를 대조 동물과 비교하여 LDL-C의 54% 저하로, 주사 4일 후 관찰하였다. 제27일까지 LDL-C는 대조 동물에서 관찰된 것과 유사한 수준으로 복귀하였다 (도 41).

혈청 총 콜레스테롤에서 11F1, 21B12, 그리고 8A3의 효과

11F1에 대한 최대 TC 저하를 항-KLH IgG2 대조 항체-처리된 원숭이 (대조 동물)와 비교하여 TC의 27% 저하로, 주사 9일 후 관찰하였다. 제27일까지 TC는 대조 동물에서 관찰된 것과 유사한 수준으로 복귀하였다. 21B12에 대한 최대 TC 저하를 대조 동물과 비교하여 TC의 20% 저하로, 주사 3일 후 관찰하였다. 제4일까지 TC는 일시적으로 운반체-치료된 원숭이에서 관찰된 것과 유사한 수준으로 복귀하였지만, 해당 일을 포함하여, 제14 내지 18일에는 훨씬 저하되었다. 8A3에 대한 최대 TC 저하를 대조 동물과 비교하여 TC의 22% 저하로, 주사 9일 후 관찰하였다. 제30일까지 TC는 대조 동물에서 관찰된 것과 유사한 수준으로 복귀하였다 (도 42).

혈청 HDL 콜레스테롤 및 트리글리세리드에서 11F1, 21B12, 그리고 8A3의 효과

평균 및 각각의 시점에, 11F1 또는 8A3으로 처리된 동물에 대한 HDL-C 또는 트리글리세리드 수준은 항-KLH IgG2 대조 항체-처리된 원숭이에서 관찰된 것과 유의미하게 상이하지 않았다 (알파 = 0.05 유의성 수준에 기반하여). 하지만, 21B12는 단일 시점 (주사 후 제 18일)에 HDL-C에서의 통계학적으로 유의미한 변화를 유도하였다 (도 43 및 도 45).

아포지방단백 B (ApoB)에서 11F1, 21B12, 그리고 8A3의 효과

주사-후, 제 3, 6, 15, 24 및 33일에 혈청 ApoB 수준을 측정하였다. 11F1 및 8A3은 항-KLH IgG2 대조 항체-처리된 원숭이와 비교하여, 제 3 내지 24일에 ApoB 저하와 연관되었다 (도 46). 21B12는 제3일에만 ApoB 수준의 통계학적으로 유의미한 저하와 연관되었다.

11F1, 21B12, 그리고 8A3의 약동학적 프로필

치료에 의한 평균 농도-시간 프로필의 요약 플롯은 748에서 나타난다. 11F1, 21B12, 8A3, 그리고 항-KLH IgG2 대조 항체를 받은 동물에 대한 추정된 평균 약동학적 매개변수는 도 47의 표에 나타난다.

모든 군내 항체 흡수는 일관되고 피하 항체 투여의 특성이었다. CL/F, C_최대, 그리고 AUC0-무한에 대한 21B12 약동학적 작용은 이전 연구에서 관찰된 작용과 일치하였으며 여기서 21B12는 동일한 분량으로 투여되었다. 11F1 및 8A3의 약동학은 21B12와는 상당히 달랐으며, 여기서 더 낮은 CL/F가 관찰되었고 (대략 15%의 21B12 CL/F) 그리고 더 긴 반감기가 추정되었다 (21B12에 대해 40 시간과 비교하여 대략 200 시간). 특히, 11F1 및 8A3의 약동학은 서로 그리고 항-KLH IgG2 대조 항체와는 구별되지 않았다. 이들 데이터는 11F1 및 8A3이 PCSK9에 대한 친화성이 없는 항-KLH IgG2 대조 항체와 동일한 노출 프로필을 갖는 것을 고려하여, 11F1 및 8A3의 성향이 21B12보다 PCSK9 표적과 연관하여 훨씬 더 적은 정도로 영향을 받는다는 점을 제시한다.

결과의 요약

45일 연구 과정에 걸쳐서, TC 및 LDL-C의 통계학적으로 유의미한 저하를 항-KLH IgG2 대조 항체와 비교하여 11F1, 21B12, 또는 8A3이 투여된 동물에서 관찰하였다. 11F1은 해당 일을 포함하여 제2일 내지 제24일의 통계학적으로 유의미한 LDL-C 저하 (항-KLH IgG2 대조 항체와 대비하여)와 연관되었다. 21B12는 해당 일을 포함하여 제1일 내지 제4일의 통계학적으로 유의미한 LDL-C 저하 (항-KLH IgG2 대조 항체와 대비하여)를 증명하였다. 8A3은 해당 일을 포함하여 제1 내지 제24일의 통계학적으로 유의미한 LDL-C 저하 (항-KLH IgG2 대조 항체와 대비하여)를 증명하였다. TC 및 ApoB에서의 변화는 모든 군에 대한 LDL-C에서 관찰된 변화를 반영하였다. 11F1은 주사 9일 후 LDL-C의 최대 저하 (동일한 시점에 항-KLH IgG2 대조 항체와 대비하여)를 달성하였다 (-57%). 21B12는 주사 3일 후 LDL-C의 최대 저하 (동일한 시점에 항-KLH IgG2 대조 항체와 대비하여)를 달성하였다 (-64%). 8A3은 주사 4일 후 LDL-C의 최대 저하 (동일한 시점에 항-KLH IgG2 대조 항체와 대비하여)를 달성하였다 (-54%). 21B12는 주사 18일 후, 단일 시점에 HDL-C를 저하시켰다. 11F1 또는 8A3 투여 후 HDL-C 수준에서 어떠한 통계학적으로 유의미한 변화도 관찰되지 않았다. 11F1, 21B12, 또는 8A3 투여 후 트리글리세리드 수준에서 어떠한 통계학적으로 유의미한 변화도 관찰되지 않았다.

실시예 37

동질접합성 가족성 고콜레스테롤혈증을 가진 개체내 LDL-C에서 인간 항-PCSK9 항체의 안정성, 내약성 및 효능을 평가하기 위한 2 파트 연구(Two Part Study)

연구 설계: 이것은 2 파트 연구이다. 파트 A는 개방 표지, 단일 암(single arm), 다중심 예비 연구이다. 등록은 확장되지만 그 외에는 파트 A와 동일한 설계인, 파트 B는 인간 항체, 21B12의 이중-맹검, 랜덤화, 위약-조절, 다중심 연구이다. 포함/배제 규준 및 평가 스케줄 둘 모두는 파트 A와 B가 동일할 것이다.

포함 규준은 다음을 포함한다:

● ≥ 12 내지 ≤ 65세의 연령의 남성 및 여성

● 동질접합성 가족성 고콜레스테롤혈증의 진단

● 적어도 4주 동안 안정된 지질-저하 요법

● LDL 콜레스테롤 >130 mg/dl (3.4 mmol/L)

● 트리글리세리드 < 400 mg/dL(4.5 mmol/L)

● 스크리닝에서 > 40 kg 또는 이보다 더 큰 체중

배제 규준은 다음을 포함한다:

● 랜덤화에 앞서 8주 내에 LDL 또는 혈장 성분채집술

● New York Heart Failure Association (NYHA) 클래스 III 또는 IV 또는 마지막으로 공지된 좌심실 박출율(ejection fraction) < 30%

● 랜덤화의 3개월 이내에 심근 경색증, 불안정 협심증, 경피적 관상동맥 중재술 (PCI), 관상동맥 우회술 (CABG) 또는 뇌졸중

● 계획된 심장 수술 또는 혈관재형성

● 비조절 심부정맥

● 비조절 고혈압

평가 스케줄은 부작용 (AE) 및 유의미한 부작용 (SAE) 데이터의 수집, 활력 징후, 동시 투약, 실험실 검사 등을 포함하지만, 이제 제한되지 않는다.

포함/배제 규준을 충족하는 개체는 NCEP Adult Treatment Panel TLC (또는 비교할만한) 식이요법을 따르도록 지시될 것이고 연구 기간 동안에 그들의 현재 지질 저하 요법을 유지하도록 요구될 것이다.

무균의, 깨끗한, 무색의 냉동 액체로 21B12 제제를 제시할 것이다. 10 mM 아세트산나트륨, 9% (w/v) 수크로오스, 0.004% (w/v) 폴리소르베이트 20, pH 5.2로 조제된 70 mg/mL 21B12의 1-mL 전달가능한 용적으로 무균 바이알 각각을 충전할 것이다. 바이알 각각은 일회용 전용이다. 위약은 깨끗한, 무색의, 무균의, 무-단백질 냉동 액체로서 동일한 용기에 제시될 것이고 10 mM 아세트산나트륨, 9% (w/v) 수크로오스, 0.004% (w/v) 폴리소르베이트 20, pH 5.2로 조제된다.

파트 A에서, 4-16명 개체는 등록되고 개방 표지 21B12 제제 (420 mg Q4W)를 받을 것이다. 연구 방문은 4주마다 있을 것이다. 이들 방문은 부작용 (AE) 및 유의미한 부작용 (SAE) 데이터의 수집, 활력 징후, 동시 투약, 실험실 검사 등을 수반할 것이다. 공복 지질 패널을 제6주에 수집하여 21B12 제제를 이용한 치료에 대한 반응에서의 최하점 LDL-C 수준을 평가할 것이다. 제1일, 제4주, 그리고 제8주에 21B12 제제를 투여할 것이다. 연구의 종료(EOS) 방문 및 지질의 마지막 평가는 제12주에 있을 것이다.

대략 51명의 새로운 개체가 파트 B에 등록될 것이다. 등록된 개체를 2개의 치료 군으로 2:1 분배로 랜덤화할 것이다: 420 mg 21B12 Q4W SC 또는 위약 Q4W SC. 랜덤화는 기준선 LDL-C 수준에 의해 층화될 것이다. 연구 방문은 제2주 및 제 10주에 일어나는 2개의 선택적인 방문으로, 4주마다 있을 것이다. 방문은 AE 및 SAE 데이터의 수집, 활력 징후, 동시 투약, 실험실 검사 등을 수반할 것이다. 공복 지질 패널을 제6주에 수집하여 21B12 치료에 대한 반응에서의 최하점 LDL-C 수준을 평가할 것이다. 제1일, 제4주, 그리고 제8주에 21B12 제제를 투여할 것이다. 연구의 종료(EOS) 방문 및 지질의 마지막 평가는 모든 개체에 대해 제12주에 있을 것이다.

참조로서 편입

특허, 특허 출원, 논문, 교과서, 등, 그리고 그 안에 인용된 참고문헌을 포함하여, 본원에서 인용된 모든 참고문헌은, 이들이 이미 본 명세서에 없는 한, 이들 전체로 참조로서 본원에 편입된다. 참조로서 편입된 참고문헌에서 제공된 임의의 정의 또는 용어가 본원에서 제공된 용어 및 논의와 상이할 정도까지, 본 명세서의 용어 및 정의가 우선한다.

등가물

전술한 명세서는 당업자가 본 발명을 실시하는 것을 가능하게 하는 데에 충분한 것으로 간주된다. 전술한 설명 및 실시예는 본 발명의 특정한 바람직한 구체예를 상세히 설명하고 발명자에 의해 고려되는 최고의 방식을 설명한다. 하지만, 전술한 것이 아무리 상세하게 본문에서 나타나더라도, 본 발명은 많은 방식으로 실시될 수 있고 그리고 본 발명은 첨부된 청구범위 및 이의 임의의 등가물에 따라서 해석되어야하는 것으로 이해될 수 있다.

SEQUENCE LISTING <110> Chan, Joyce Gibbs, John Dias, Clapton Scott, Robert Wasserman, Scott Clogston, Chris Osslund, Timothy <120> METHODS OF TREATING OR PREVENTING CHOLESTEROL RELATED DISORDERS <130> A-1635-WO-PCT <150> 61/642,363 <151> 2012-05-03 <150> 61/614,417 <151> 2012-03-22 <150> 61/595,526 <151> 2012-02-06 <150> 61/562,303 <151> 2011-11-21 <150> 61/484,610 <151> 2011-05-10 <160> 589 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 662 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Gln Glu Asp Glu Asp Gly Asp Tyr Glu Glu Leu Val Leu Ala Leu Arg 1 5 10 15 Ser Glu Glu Asp Gly Leu Ala Glu Ala Pro Glu His Gly Thr Thr Ala 20 25 30 Thr Phe His Arg Cys Ala Lys Asp Pro Trp Arg Leu Pro Gly Thr Tyr 35 40 45 Val Val Val Leu Lys Glu Glu Thr His Leu Ser Gln Ser Glu Arg Thr 50 55 60 Ala Arg Arg Leu Gln Ala Gln Ala Ala Arg Arg Gly Tyr Leu Thr Lys 65 70 75 80 Ile Leu His Val Phe His Gly Leu Leu Pro Gly Phe Leu Val Lys Met 85 90 95 Ser Gly Asp Leu Leu Glu Leu Ala Leu Lys Leu Pro His Val Asp Tyr 100 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catcattggt gcctccagcg actgcagcac ctgctttgtg 1140 tcacagagtg ggacatcaca ggctgctgcc cacgtggctg gcattgcagc catgatgctg 1200 tctgccgagc cggagctcac cctggccgag ttgaggcaga gactgatcca cttctctgcc 1260 aaagatgtca tcaatgaggc ctggttccct gaggaccagc gggtactgac ccccaacctg 1320 gtggccgccc tgccccccag cacccatggg gcaggttggc agctgttttg caggactgtg 1380 tggtcagcac actcggggcc tacacggatg gccacagcca tcgcccgctg cgccccagat 1440 gaggagctgc tgagctgctc cagtttctcc aggagtggga agcggcgggg cgagcgcatg 1500 gaggcccaag ggggcaagct ggtctgccgg gcccacaacg cttttggggg tgagggtgtc 1560 tacgccattg ccaggtgctg cctgctaccc caggccaact gcagcgtcca cacagctcca 1620 ccagctgagg ccagcatggg gacccgtgtc cactgccacc aacagggcca cgtcctcaca 1680 ggctgcagct cccactggga ggtggaggac cttggcaccc acaagccgcc tgtgctgagg 1740 ccacgaggtc agcccaacca gtgcgtgggc cacagggagg ccagcatcca cgcttcctgc 1800 tgccatgccc caggtctgga atgcaaagtc aaggagcatg gaatcccggc ccctcagggg 1860 caggtgaccg tggcctgcga ggagggctgg accctgactg gctgcagcgc cctccctggg 1920 acctcccacg tcctgggggc ctacgccgta gacaacacgt gtgtagtcag gagccgggac 1980 gtcagcacta caggcagcac cagcgaagag gccgtgacag ccgttgccat ctgctgccgg 2040 agccggcacc tggcgcaggc ctcccaggag ctccag 2076 <210> 3 <211> 692 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Met Gly Thr Val Ser Ser Arg Arg Ser Trp Trp Pro Leu Pro Leu Leu 1 5 10 15 Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Gly Pro Ala Gly Ala Arg Ala Gln Glu 20 25 30 Asp Glu Asp Gly Asp Tyr Glu Glu Leu Val Leu Ala Leu Arg Ser Glu 35 40 45 Glu Asp Gly Leu Ala Glu Ala Pro Glu His Gly Thr Thr Ala Thr Phe 50 55 60 His Arg Cys Ala Lys Asp Pro Trp Arg Leu Pro Gly Thr Tyr Val Val 65 70 75 80 Val Leu Lys Glu Glu Thr His Leu Ser Gln Ser Glu Arg Thr Ala Arg 85 90 95 Arg Leu Gln Ala Gln Ala Ala Arg Arg Gly Tyr Leu Thr Lys Ile Leu 100 105 110 His Val Phe His Gly Leu Leu Pro Gly Phe Leu Val Lys Met Ser Gly 115 120 125 Asp Leu Leu Glu Leu Ala Leu Lys Leu Pro His Val Asp Tyr Ile Glu 130 135 140 Glu Asp Ser Ser Val Phe Ala Gln Ser Ile Pro Trp Asn Leu Glu Arg 145 150 155 160 Ile Thr Pro Pro Arg Tyr Arg 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120 ccaggaacag cccccaaact cctcatttat gactataata agcgaccctc agggattcct 180 gaccgattct ctggctccaa gtctggcacg tcagccaccc tgggcatcac cggactccag 240 actggggacg aggccgatta ttactgcgga acatgggata gcagtctgag tggttatgtc 300 ttcggaactg ggaccagggt caccgtccta 330 <210> 108 <211> 366 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 108 caggtgcacc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cgtctggatt caccttcaac agctttggca tgcactgggt ccgccaggct 120 ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcactt atatggtctg atggaagtga taaatactat 180 gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gagagccata 300 gcagccctct actactacta cggtatggac gtctggggcc aagggaccac ggtcaccgtc 360 tcctca 366 <210> 109 <211> 330 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 109 cagtctgtgt tgacgcagcc gccctcagtg tctgcggccc caggacagaa ggtcaccatc 60 tcctgctctg gaagcagttc caacattggg aataattttg tatcctggta ccagcagttc 120 ccaggaacag cccccaaact cctcatttat gactataata agcgaccctc 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tgggcatcac cggactccag 240 actggggacg aggccgatta ttactgcgga acatgggata gcagcctgag tggttatgtc 300 ttcggaactg ggaccagggt caccgtccta 330 <210> 112 <211> 366 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 112 caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cgtctggatt caccttcagc agctttggca tgcactgggt ccgccaggct 120 ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcactt atatggaatg atggaagtaa taaatactat 180 gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gagagccata 300 gcagccctct actactacta cggtatggac gtctggggcc aagggaccac ggtcaccgtc 360 tcctca 366 <210> 113 <211> 330 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 113 cagtctgtgt tgacgcagcc gcccacagtg tctgcggccc caggacagaa ggtcaccatc 60 tcctgctctg gaagcagctc caacattggg aataattttg tatcctggta ccagcagctc 120 ccaggaacag cccccaaact cctcatttat gactataata agcgaccctc agggattcct 180 gaccgattct ctggctccaa gtctggcacg tcagccaccc tgggcatcac cggactccag 240 actggggacg aggccgatta ctactgcgga 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caccgtccta 330 <210> 116 <211> 363 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 116 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc agctatgcca tgaactgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtctcaact attagtggta gtggtgataa cacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaaaagttt 300 gtactaatgg tgtatgctat gcttgactac tggggccagg gaaccctggt caccgtctcc 360 tca 363 <210> 117 <211> 321 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 117 gacatcctga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgttggaga cagagtcacc 60 atcacttgcc gggcaagtca gagcattagc agttatttaa attggtatca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaaggtcct gatctatgct gcctccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180 aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcaacag tctgcaacct 240 gaagattttg caacttacta ctgtcaacag agttacagtt cccccatcac cttcggccaa 300 gggacacgac tggagattaa a 321 <210> 118 <211> 363 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 118 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc cgggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc agctatgcca tgaactgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtctcaact attagtggta gtggtggtaa cacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaaaagttt 300 gtactaatgg tgtatgctat gcttgactac tggggccagg gaaccctggt caccgtctcc 360 tca 363 <210> 119 <211> 321 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 119 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctatctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 atcacttgcc gggcaagtca gagcattagc atctatttaa attggtatca gcagaagcca 120 gggaaagccc cttacctcct gatctatgct gcagccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180 aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240 gaagattttg caacttacta ctgtcaacag agttacagtg cccccatcac cttcggccaa 300 gggacacgac tggagattaa a 321 <210> 120 <211> 345 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 120 caggttcagc tggtgcagtc tggagctgag gtgaagaagc ctggggcctc actgaaggtc 60 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gatgggatgg atcagcgttt acaatggtaa cacaaactat 180 gcacagaagg tccagggcag agtcaccatg accacagaca catccacgag cacagtctac 240 atggagctga ggagcctgag ctctgacgac acggccgtgt attactgtgc gagaggctac 300 ggtatggacg tctggggcca agggaccacg gtcaccgtct cctca 345 <210> 123 <211> 327 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 123 cagtctgccc tgactcagcc tgcctccgtg tctgggtctc ctggacagtc gatcaccatc 60 tcctgcactg gaaccagcag tgacgttggt ggttataact ctgtctcctg gtaccaacag 120 cacccaggca aaccccccaa actcatgatt tatgaggtca gtaatcggcc ctcaggggtt 180 tctattcgct tctctggctc caagtctggc aacacggcct ccctgaccat ctctgggctc 240 caggctgagg acgaggctga ttatttctgc agctcatata caagcaccag catggtcttc 300 ggcggaggga ccaagctgac cgtccta 327 <210> 124 <211> 345 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 124 caggttcagc tggtgcagtc tggagctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60 tcctgcaagg cttctggtta ccccttgacc agctatggta tcagctgggt gcgacaggcc 120 cctggacaag ggcttgagtg gatgggatgg atcagcgctt acaatggtaa cacaaactat 180 gcacagaagg tccagggcag agtcaccatg accacagaca 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120 ccaggaacgg cccccaaact cctcatctat aggaataatc agcggccctt aggggtccct 180 gaccgattct ctggctccaa gtctggcacc tcagcctccc tggccatcag tgggctccag 240 tctgaggatg aggctgatta ttattgtgca gcatgggatg acagcctgaa ttgggtgttc 300 ggcggaggga ccaagctgac cgtccta 327 <210> 134 <211> 357 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 134 gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtccagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cacctttagt cgctattgga tgagctgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtggccaac ataaagcatg atggaagtga gaaatactat 180 gtggactctg tgaagggccg attcaccatt tccagagaca acgccaagaa ctcactgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gagagagtca 300 aactggggat ttgcttttga tgtctggggc cacgggacaa tggtcaccgt ctcttca 357 <210> 135 <211> 327 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 135 cagtctgtgc tgactcagcc accctcagcg tctgggcccc ccggacagag ggtcaccatc 60 tcttgttctg gaagcagctc caacatcgga agtaatactg taaactggta ccagcagctc 120 ccaggaacgg cccccaaact cctcatctat agtaataatc ggcggccctc aggggtccct 180 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tgatgctttt gatgtctggg gccaagggac aatggtcacc 360 gtctcttca 369 <210> 153 <211> 333 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 153 cagtctgtgc tgacgcagcc gccctcagtg tctggggccc cagggcagag ggtcaccatc 60 tcctgcactg ggagcagctc caacatcggg gcaggttatg atgtacactg gtaccagcag 120 cttccaggaa cagcccccaa actcctcatc tctggtaaca gcaatcggcc ctcaggggtc 180 cctgaccgat tctctggctc caagtctggc acctcagcct ccctggccat cactgggctc 240 caggctgagg atgaggctga ttattactgc cagtcctatg acagcagcct gagtggttcg 300 gtattcggcg gagggaccaa gctgaccgtc cta 333 <210> 154 <211> 326 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 154 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 1 5 10 15 Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp 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Thr Ile Ser Gly Ser Gly Asp Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 366 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 366 Gly Tyr Ser Leu Thr Ser Tyr Gly Ile Ser 1 5 10 <210> 367 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 367 Gly Tyr Ala Leu Thr Ser Tyr Gly Ile Ser 1 5 10 <210> 368 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 368 Gly Tyr Thr Leu Thr Ser Tyr Gly Ile Ser 1 5 10 <210> 369 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 369 Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr Gly Ile Ser 1 5 10 <210> 370 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 370 Gly Tyr Thr Phe Pro Ser Tyr Gly Ile Ser 1 5 10 <210> 371 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 371 Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Trp Met Ser 1 5 10 <210> 372 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 372 Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr Trp Met Ser 1 5 10 <210> 373 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 373 Gly Leu Thr Phe Ser Asn Phe Trp Met Ser 1 5 10 <210> 374 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 374 Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met Asn 1 5 10 <210> 375 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 375 Gly Phe Thr Phe Asn Ser Phe Gly Met His 1 5 10 <210> 376 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 376 Gly Phe Thr Phe Arg Ser Tyr Gly Met His 1 5 10 <210> 377 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 377 Asn Ile Lys Gln Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Val Asp Ser Val Lys Gly 1 5 10 15 <210> 378 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 378 Asn Ile Lys His Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Val Asp Ser Val Lys Gly 1 5 10 15 <210> 379 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 379 Thr Ile Ser Gly Ser Gly Asp Asn Thr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly 1 5 10 15 <210> 380 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 380 Thr Ile Ser Gly Ser Gly Gly Asn Thr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly 1 5 10 15 <210> 381 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 381 Leu Ile Trp Asn Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly 1 5 10 15 <210> 382 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 382 Leu Ile Trp Ser Asp Gly Ser Asp Glu Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly 1 5 10 15 <210> 383 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 383 Leu Ile Trp Ser Asp Gly Ser Asp Lys Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly 1 5 10 15 <210> 384 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 384 Leu Ile Trp His Asp Gly Ser Asn Thr Tyr Val Asp Ser Val Lys Gly 1 5 10 15 <210> 385 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 385 Glu Ser Asn Trp Gly Phe Ala Phe Asp Ile 1 5 10 <210> 386 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 386 Glu Ser Asn Trp Gly Phe Ala Phe Asp Val 1 5 10 <210> 387 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 387 Gly Tyr Val Met Asp Val 1 5 <210> 388 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 388 Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ile Tyr Leu Asn 1 5 10 <210> 389 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 389 Thr Gly Thr Asn Ser Asp Val Gly Gly Tyr Asn Ser Val Ser 1 5 10 <210> 390 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 390 Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Ala Tyr Asn Ser Val Ser 1 5 10 <210> 391 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 391 Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Arg Tyr Asn Ser Val Ser 1 5 10 <210> 392 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 392 Arg Asn Asn Gln Arg Pro Leu 1 5 <210> 393 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 393 Ala Ala Ala Ser Leu Gln Ser 1 5 <210> 394 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 394 Gln Gln Ser Tyr Ser Ala Pro Ile Thr 1 5 <210> 395 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 395 Asn Ser Tyr Thr Ser Thr Ser Met Val 1 5 <210> 396 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 396 Ser Ser Tyr Thr Ser Ser Ser Val Val 1 5 <210> 397 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 397 Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu Asn Trp Val 1 5 10 <210> 398 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 398 Gly Thr Trp Asp Ser Ser Leu Ser Ser Tyr Val 1 5 10 <210> 399 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 399 Gly Thr Trp Asp Ser Ser Leu Ser Ala Tyr Val 1 5 10 <210> 400 <211> 116 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 400 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Tyr 20 25 30 Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu 65 70 75 80 Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Tyr Ser Ser Gly Trp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 401 <211> 118 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 401 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Val Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Asn Ile Lys Gln Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Ser Asn Trp Gly Phe Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Met Val Thr Val Ser 115 <210> 402 <211> 115 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 402 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Asn Ile Lys Gln Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asn Trp Gly Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val 100 105 110 Thr Val Ser 115 <210> 403 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 403 Glu Asn Leu Tyr Phe Gln 1 5 <210> 404 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> VARIANT <222> 1 <223> Xaa= D, A, R or no amino acid <220> <221> VARIANT <222> 2 <223> Xaa=Y, I, G or no amino acid <220> <221> VARIANT <222> 3 <223> Xaa=D, A, G or no amino acid <220> <221> VARIANT <222> 4 <223> Xaa=F, A, L or no amino acid <220> <221> VARIANT <222> 5 <223> Xaa=W, L, A or no amino acid <220> <221> VARIANT <222> 6 <223> Xaa=S, Y, A or no amino acid <220> <221> VARIANT <222> (7)...(7) <223> Xaa=A, Y, R or no amino acid <220> <221> VARIANT <222> (8)...(8) <223> Xaa=Y, P or no amino acid <220> <221> VARIANT <222> (9)...(9) <223> Xaa=Y, G or no amino acid <220> <221> VARIANT <222> (10)...(10) <223> Xaa=D, G or no amino acid <220> <221> VARIANT <222> (11)...(11) <223> Xaa=A, M or no amino acid <220> <221> VARIANT <222> (12)...(12) <223> Xaa=F,D or no amino acid <220> <221> VARIANT <222> (13)...(13) <223> Xaa=D, V or no amino acid <220> <221> VARIANT <222> (14)...(14) <223> Xaa=V or no amino acid <400> 404 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 <210> 405 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> VARIANT <222> 1 <223> Xaa=Q or G <220> <221> VARIANT <222> 2 <223> Xaa=S, T, A or no amino acid <220> <221> VARIANT <222> 3 <223> Xaa=Y, W or no amino acid <220> <221> VARIANT <222> 4 <223> Xaa=D or no amino acid <220> <221> VARIANT <222> 5 <223> Xaa=S or no amino acid <220> <221> VARIANT <222> 6 <223> Xaa=S or no amino acid <220> <221> VARIANT <222> (7)...(7) <223> Xaa=L, T or no amino acid <220> <221> VARIANT <222> (8)...(8) <223> Xaa=A, S or no amino acid <220> <221> VARIANT <222> (9)...(9) <223> Xaa=G, A, V or no amino acid <220> <221> VARIANT <222> (10)...(10) <223> Xaa=S, Y, V or no amino acid <220> <221> VARIANT <222> (11)...(11) <223> Xaa=V or no amino acid <400> 405 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 <210> 406 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> VARIANT <222> 1 <223> Xaa=G <220> <221> VARIANT <222> 2 <223> Xaa=Y, F or G <220> <221> VARIANT <222> 3 <223> Xaa=T or S <220> <221> VARIANT <222> 4 <223> Xaa=L or F <220> <221> VARIANT <222> 5 <223> Xaa=T, S or N <220> <221> VARIANT <222> 6 <223> Xaa=S or A <220> <221> VARIANT <222> (7)...(7) <223> Xaa=Y or F <220> <221> VARIANT <222> (8)...(8) <223> Xaa=G, S or Y <220> <221> VARIANT <222> (9)...(9) <223> Xaa=I, M or W <220> <221> VARIANT <222> (10)...(10) <223> Xaa=S, N or H <400> 406 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 <210> 407 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> VARIANT <222> 1 <223> Xaa=T or no amino acid <220> <221> VARIANT <222> 2 <223> Xaa=G or S <220> <221> VARIANT <222> 3 <223> Xaa=S, T or G <220> <221> VARIANT <222> 4 <223> Xaa=S <220> <221> VARIANT <222> 5 <223> Xaa=S <220> <221> VARIANT <222> 6 <223> Xaa=N, D or S <220> <221> VARIANT <222> (7)...(7) <223> Xaa=I, V or N <220> <221> VARIANT <222> (8)...(8) <223> Xaa=G or I <220> <221> VARIANT <222> (9)...(9) <223> Xaa=A or G <220> <221> VARIANT <222> (10)...(10) <223> Xaa=G, Y, S or N <220> <221> VARIANT <222> (11)...(11) <223> Xaa=Y or N <220> <221> VARIANT <222> (12)...(12) <223> Xaa=D, S, T or F <220> <221> VARIANT <222> (13)...(13) <223> Xaa=V <220> <221> VARIANT <222> (14)...(14) <223> Xaa=S, N or H <400> 407 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 <210> 408 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> VARIANT <222> 1 <223> Xaa=W, S, L or no amino acid <220> <221> VARIANT <222> 2 <223> Xaa=V, I or E <220> <221> VARIANT <222> 3 <223> Xaa=S, W or I <220> <221> VARIANT <222> 4 <223> Xaa=F, S or N <220> <221> VARIANT <222> 5 <223> Xaa=Y, S, D or H <220> <221> VARIANT <222> 6 <223> Xaa=N, S or G <220> <221> VARIANT <222> (7)...(7) <223> Xaa=S or G <220> <221> VARIANT <222> (8)...(8) <223> Xaa=N, Y, D or R <220> <221> VARIANT <222> (9)...(9) <223> Xaa=T, I or E <220> <221> VARIANT <222> (10)...(10) <223> Xaa=N, S, Y or D <220> <221> VARIANT <222> (11)...(11) <223> Xaa=Y <220> <221> VARIANT <222> (12)...(12) <223> Xaa=A and N <220> <221> VARIANT <222> (13)...(13) <223> Xaa=Q, D or P <220> <221> VARIANT <222> (14)...(14) <223> Xaa=K or S <220> <221> VARIANT <222> (15)...(15) <223> Xaa=L or V <220> <221> VARIANT <222> (16)...(16) <223> Xaa=Q or K <220> <221> VARIANT <222> (17)...(17) <223> Xaa=G or S <400> 408 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa <210> 409 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> VARIANT <222> 1 <223> Xaa=G, E, S or D <220> <221> VARIANT <222> 2 <223> Xaa=N, V or Y <220> <221> VARIANT <222> 3 <223> Xaa=S or N <220> <221> VARIANT <222> 4 <223> Xaa=N, Q or K <220> <221> VARIANT <222> 5 <223> Xaa=R <220> <221> VARIANT <222> 6 <223> Xaa=P <220> <221> VARIANT <222> (7)...(7) <223> Xaa=S <400> 409 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 410 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> VARIANT <222> 1 <223> Xaa=D or no amino acid <220> <221> VARIANT <222> 2 <223> Xaa=Y, A or no amino acid <220> <221> VARIANT <222> 3 <223> Xaa=D, I or no amino acid <220> <221> VARIANT <222> 4 <223> Xaa=F, A or no amino acid <220> <221> VARIANT <222> 5 <223> Xaa=W, A or no amino acid <220> <221> VARIANT <222> 6 <223> Xaa=S, L or no amino acid <220> <221> VARIANT <222> (7)...(7) <223> Xaa=A, Y, G or no amino acid <220> <221> VARIANT <222> (8)...(8) <223> Xaa=Y, Q or no amino acid <220> <221> VARIANT <222> (9)...(9) <223> Xaa=G, Y or L <220> <221> VARIANT <222> (10)...(10) <223> Xaa=Y, D or V <220> <221> VARIANT <222> (11)...(11) <223> Xaa=G, A or P <220> <221> VARIANT <222> (12)...(12) <223> Xaa=M or F <220> <221> VARIANT <222> (13)...(13) <223> Xaa=D <220> <221> VARIANT <222> (14)...(14) <223> Xaa=V or Y <400> 410 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 <210> 411 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> VARIANT <222> 1 <223> Xaa=Q, A, G or no amino acid <220> <221> VARIANT <222> 2 <223> Xaa=S, V, T or no amino acid <220> <221> VARIANT <222> 3 <223> Xaa=Y, N or W <220> <221> VARIANT <222> 4 <223> Xaa=S or D <220> <221> VARIANT <222> 5 <223> Xaa=S, Y or D <220> <221> VARIANT <222> 6 <223> Xaa=S or T <220> <221> VARIANT <222> (7)...(7) <223> Xaa=L or S <220> <221> VARIANT <222> (8)...(8) <223> Xaa=S, T or N <220> <221> VARIANT <222> (9)...(9) <223> Xaa=G, S or A <220> <221> VARIANT <222> (10)...(10) <223> Xaa=S, M, W or Y <220> <221> VARIANT <222> (11)...(11) <223> Xaa=V <400> 411 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 <210> 412 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> VARIANT <222> 1 <223> Xaa=G, P or A <220> <221> VARIANT <222> 2 <223> Xaa=Y, W, F, T or S <220> <221> VARIANT <222> 3 <223> Xaa=T, P, S, A, C, V, L or I <220> <221> VARIANT <222> 4 <223> Xaa=L, F, I, V, M, A or Y <220> <221> VARIANT <222> 5 <223> Xaa=T, P, S or A <220> <221> VARIANT <222> 6 <223> Xaa=S, T, A or C <220> <221> VARIANT <222> (7)...(7) <223> Xaa=Y, W, F, T or S <220> <221> VARIANT <222> (8)...(8) <223> Xaa=G, P or A <220> <221> VARIANT <222> (9)...(9) <223> Xaa=I, L, V, M, A or F <220> <221> VARIANT <222> (10)...(10) <223> Xaa=S, T, A or C <400> 412 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 <210> 413 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> VARIANT <222> 1 <223> Xaa=T or S <220> <221> VARIANT <222> 2 <223> Xaa=G, P or A <220> <221> VARIANT <222> 3 <223> Xaa=T or S <220> <221> VARIANT <222> 4 <223> Xaa=S, N, T, A, C or Q <220> <221> VARIANT <222> 5 <223> Xaa=S, T, A or C <220> <221> VARIANT <222> 6 <223> Xaa=D or E <220> <221> VARIANT <222> (7)...(7) <223> Xaa=V, I, M, L, F or A <220> <221> VARIANT <222> (8)...(8) <223> Xaa=G, P or A <220> <221> VARIANT <222> (9)...(9) <223> Xaa=G, A, R, P, V, L, I, K, Q or N <220> <221> VARIANT <222> (10)...(10) <223> Xaa=Y, W, F, T or S <220> <221> VARIANT <222> (11)...(11) <223> Xaa=N or Q <220> <221> VARIANT <222> (12)...(12) <223> Xaa=Y, S, W, F, T, S, T, A or C <220> <221> VARIANT <222> (13)...(13) <223> Xaa=V, I, M, L, F, or A <220> <221> VARIANT <222> (14)...(14) <223> Xaa=S, T, A or C <400> 413 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 <210> 414 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> VARIANT <222> 1 <223> Xaa=W, Y or F <220> <221> VARIANT <222> 2 <223> Xaa=V, I, M, L, F or A <220> <221> VARIANT <222> 3 <223> Xaa=S, T, A or C <220> <221> VARIANT <222> 4 <223> Xaa=A, F, V, L, I, Y or M <220> <221> VARIANT <222> 5 <223> Xaa=Y, W, F, T or S <220> <221> VARIANT <222> 6 <223> Xaa=N or Q <220> <221> VARIANT <222> (7)...(7) <223> Xaa=G, P or A <220> <221> VARIANT <222> (8)...(8) <223> Xaa=N or Q <220> <221> VARIANT <222> (9)...(9) <223> Xaa=T or S <220> <221> VARIANT <222> (10)...(10) <223> Xaa=N or Q <220> <221> VARIANT <222> (11)...(11) <223> Xaa=Y, W, F, T or S <220> <221> VARIANT <222> (12)...(12) <223> Xaa=A, V, L or I <220> <221> VARIANT <222> (13)...(13) <223> Xaa=Q, E, N or D <220> <221> VARIANT <222> (14)...(14) <223> Xaa=K, R, Q or N <220> <221> VARIANT <222> (15)...(15) <223> Xaa=L, F, V, I, M, A or Y <220> <221> VARIANT <222> (16)...(16) <223> Xaa=Q or N <220> <221> VARIANT <222> (17)...(17) <223> Xaa=G, P or A <400> 414 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa <210> 415 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> VARIANT <222> 1 <223> Xaa=E or D <220> <221> VARIANT <222> 2 <223> Xaa=V, I, M, L, F or A <220> <221> VARIANT <222> 3 <223> Xaa=S, T, A or C <220> <221> VARIANT <222> 4 <223> Xaa=N or Q <220> <221> VARIANT <222> 5 <223> Xaa=R, K, Q or N <220> <221> VARIANT <222> 6 <223> Xaa=P or A <220> <221> VARIANT <222> (7)...(7) <223> Xaa=S, T, A or C <400> 415 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 416 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> VARIANT <222> 1 <223> Xaa=G, P, A or no amino acid <220> <221> VARIANT <222> 2 <223> Xaa=Y, W, F, T or S <220> <221> VARIANT <222> 3 <223> Xaa=G, V, P, A, I, M, L or F <220> <221> VARIANT <222> 4 <223> Xaa=M, L, F or I <220> <221> VARIANT <222> 5 <223> Xaa=D or E <220> <221> VARIANT <222> 6 <223> Xaa=V, I, M, L, F or A <400> 416 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 417 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> VARIANT <222> 1 <223> Xaa=S, N, T, A, C or Q <220> <221> VARIANT <222> 2 <223> Xaa=S, T, A or C <220> <221> VARIANT <222> 3 <223> Xaa=Y, W, F, T or S <220> <221> VARIANT <222> 4 <223> Xaa=T or S <220> <221> VARIANT <222> 5 <223> Xaa=S, T, A or C <220> <221> VARIANT <222> 6 <223> Xaa=S, T, A or C <220> <221> VARIANT <222> (7)...(7) <223> Xaa=N, S, Q, T, A or C <220> <221> VARIANT <222> (8)...(8) <223> Xaa=M, V, L, F, I or A <220> <221> VARIANT <222> (9)...(9) <223> Xaa=V, I, M, L, F or A <400> 417 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 418 <211> 363 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 418 caggtgcagg tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60 tcctgcaagg cttctggata caccttcacc ggctactata tacactgggt gcgacaggcc 120 cctggacaag ggcttgagtg gatgggatgg atcaaccctc acagtggtgg cgcaaactat 180 gcacagaagt ttcagggcag ggtcaccatg accagggaca cgtccatcag cacagcctac 240 atggagctga gcaggctgag atctgacgac acggccgtgt attactgtgc gagaggcaac 300 tggaactacg actactacgg tatggacgtc tggggccaag ggaccacggt caccgtctcc 360 tca 363 <210> 419 <211> 121 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 419 Gln Val Gln Val Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr 20 25 30 Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Pro His Ser Gly Gly Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Asn Trp Asn Tyr Asp Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 420 <211> 321 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 420 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 atcacttgcc gggcgagtca ggacattagc aattatttag cctggtatca gcagaaacca 120 gggaaagttc ctaagctcct gatctatgct gcatccactt tgcaatcagg ggtcccatct 180 cggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag cctacagcct 240 gaagatgttg caacttattt ctgtcaaagg tatcagattg ccccattcac tttcggccct 300 gggaccaagg tggatatcaa a 321 <210> 421 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 421 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Val Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Arg Tyr Gln Ile Ala Pro Phe 85 90 95 Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys 100 105 <210> 422 <211> 366 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 422 caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cgtctggatt caccttcagt agctatggca tgcactgggt ccgccaggct 120 ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcagtt atctggtatg atggaagtac taaatactat 180 gcagactccg tgaagggccg atccaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gaggtcagtg 300 gctggttacc actactacta cggtatggac gtctggggcc aagggaccac ggtcaccgtc 360 tcctca 366 <210> 423 <211> 122 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 423 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Thr Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Ser Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Val Ala Gly Tyr His Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 424 <211> 324 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 424 tcttctgagc tgactcagga ccctgctgtg tctgtggcct tgggacagac agtcaggatc 60 acatgccaag gagacagcct cagaggctat tatgcaacct ggtaccagca gaagccaaga 120 caggcccctg tacttgtcat ctatggtaaa aactaccggc cctcagggat cccagaccga 180 ttctctggct ccacctcagg aaacacagct tccttgacca tcactggggc tcaggcggaa 240 gatgaggctg actattactg taactcccgg gacagcattg gtaaccatct ggtgttcggc 300 ggagggacca agctgaccgt ccta 324 <210> 425 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 425 Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln 1 5 10 15 Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Gly Tyr Tyr Ala 20 25 30 Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Arg Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr 35 40 45 Gly Lys Asn Tyr Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Thr Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu 65 70 75 80 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Arg Asp Ser Ile Gly Asn His 85 90 95 Leu Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 <210> 426 <211> 366 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 426 caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cgtctggatt caccttcagt agctatggct tgcactgggt ccgccaggct 120 ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcagtt atatggttag atggaagtaa taaatactat 180 gcagactccg tgaagggccg atccaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gaggtcagtg 300 gctggttacc actactacta cggtatggac gtctggggcc aagggaccac ggtcaccgtc 360 tcctca 366 <210> 427 <211> 122 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 427 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Gly Leu His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Val Ile Trp Leu Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Ser Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Val Ala Gly Tyr His Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 428 <211> 324 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 428 tcttctgagc tgactcagga ccctgctgtg tctgtggcct tgggacagac agtcaggatc 60 acatgccaag gagacagcct cagaagttat tatggaagct ggtaccagca gaagccaaga 120 caggcccctg tacttgtcat ctttggtaaa aacaaccggc cctcagggat cccagaccga 180 ttctctggct ccacctcagg aaacacagct tccttgacca tcactggggc tcaggcggaa 240 gatgaggctg actattactg taactcacgg gacatcattg gtgaccatct gctgttcggc 300 ggagggacca agctgaccgt ccta 324 <210> 429 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 429 Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln 1 5 10 15 Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Gly 20 25 30 Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Arg Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Phe 35 40 45 Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Thr Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu 65 70 75 80 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Arg Asp Ile Ile Gly Asp His 85 90 95 Leu Leu Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 <210> 430 <211> 366 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 430 caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagt ctgggaggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cgtctggatt caccttcagg aactatggca tgcactgggt ccgccaggct 120 ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcagtt atatggtttg atggaagtaa taaatactat 180 gcagactccg tgaagggccg atccaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgctaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gaggtcagtg 300 gctggttacc actactacta cggtatggac gtctggggcc aagggaccac ggtcaccgtc 360 tcctca 366 <210> 431 <211> 122 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 431 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Ser Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Asn Tyr 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Val Ile Trp Phe Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Ser Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Leu Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Val Ala Gly Tyr His Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 432 <211> 324 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 432 tcttctgagc tgactcagga ccctgctgtg tctgtggcct tgggacagac agtcaggatc 60 acatgccagg gagacagcct cagaagctat tatgcaagct ggtaccagca gaagccaaga 120 caggcccctg tacttgtcat ctatggtaaa aacaaccggc cctcagggat cccagaccga 180 atctctggct ccacctcagg aaacacagct tccttgacca tcactggggc tcaggcggaa 240 gatgaggctg actattactg taaatcccgg gacatcattg gtgaccatct ggtgttcggc 300 ggagggacca aactgaccgt ccta 324 <210> 433 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 433 Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln 1 5 10 15 Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala 20 25 30 Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Arg Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr 35 40 45 Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Ile Ser Gly Ser 50 55 60 Thr Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu 65 70 75 80 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Lys Ser Arg Asp Ile Ile Gly Asp His 85 90 95 Leu Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 <210> 434 <211> 342 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 434 caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cgtctggatt caccttcagt agctatggca tgcactgggt ccgccaggct 120 ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcagtt atatggtatg 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atatactatg atggaattaa taaacactat 180 gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gagagatcgg 300 ggactggact ggggccaggg aaccctggtc accgtctcct ca 342 <210> 467 <211> 114 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 467 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Ala Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Val Ile Tyr Tyr Asp Gly Ile Asn Lys His Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Arg Gly Leu Asp Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val 100 105 110 Ser Ser <210> 468 <211> 339 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 468 gacatcgtga tgacccagtc tccagactcc ctggctgtgt ctctgggcga gagggccacc 60 atcaactgca agtccagcca gagtgtttta tacagctcca acagtaagaa ctacttagtt 120 tggtaccagc agaaaccagg acagcctcct aagctgctca tttactgggc ctctacccgg 180 gaatccgggg tccctgaccg attcagtggc agcgggtctg ggacagattt cactctcacc 240 atcagcagcc tgcaggctga agatgtggca gtttattact gtcaacaata ttatagtact 300 ccgtggacgt tcggccaagg gaccaaggtg gaaatcaaa 339 <210> 469 <211> 113 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 469 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser 20 25 30 Ser Asn Ser Lys Asn Tyr Leu Val Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln 85 90 95 Tyr Tyr Ser Thr Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile 100 105 110 Lys <210> 470 <211> 357 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 470 gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtccagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag 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VARIANT <222> (108)...(108) <223> Xaa = D or H <220> <221> VARIANT <222> (119)...(119) <223> Xaa = Q or H <400> 583 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Xaa Tyr 20 25 30 Trp Met Xaa Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Ser Ile Lys Gln Asp Gly Ser Glu Xaa Tyr Tyr Val Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Xaa Ile Ser Arg Asp Xaa Ala Xaa Asn Ser Leu Xaa 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Xaa Leu Val Leu Met Val Tyr Xaa Xaa Xaa Tyr Tyr Tyr Tyr 100 105 110 Gly Met Asp Val Trp Gly Xaa Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 584 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> VARIANT <222> 3 <223> Xaa = T or A <400> 584 Met Gln Xaa Leu Gln Thr Pro Leu Thr 1 5 <210> 585 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> VARIANT <222> 6 <223> Xaa = S or N <220> <221> VARIANT <222> 10 <223> Xaa = S or T <400> 585 Gly Phe Thr Phe Ser Xaa Tyr Trp Met Xaa 1 5 10 <210> 586 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> VARIANT <222> 9 <223> Xaa = K or R <400> 586 Ser Ile Lys Gln Asp Gly Ser Glu Xaa Tyr Tyr Val Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 587 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> VARIANT <222> 1 <223> Xaa = D or P <220> <221> VARIANT <222> 8 <223> Xaa = D or A <220> <221> VARIANT <222> 9 <223> Xaa = I or L <220> <221> VARIANT <222> 10 <223> Xaa = D or H <400> 587 Xaa Leu Val Leu Met Val Tyr Xaa Xaa Xaa Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met 1 5 10 15 Asp Val <210> 588 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 588 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Arg 20 25 30 Ser Asn Asn Arg Asn Phe Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Pro Pro Asn Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln 85 90 95 Tyr Tyr Thr Thr Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile 100 105 110 Lys <210> 589 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 589 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Asn Tyr 20 25 30 Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Asp Trp Val 35 40 45 Ser Thr Ile Ser Gly Ser Gly Gly Thr Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Ile Ile Ser Arg Asp Ser Ser Lys His Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Asp Ser Asn Trp Gly Asn Phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115

Claims (1)

1. PCSK9에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체를 포함하는 제약 조성물의 용도.

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