KR20210076945A - Trem2 안정화 항체 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 골수 세포 상에서 발현되는 인간 유발 수용체 2(TREM2) 단백질에 결합하고 안정화하는 항체 및 이들 항체를 사용하는 방법을 제공한다.

Description

TREM2 안정화 항체
서열 목록
본 출원은 ASCII 형식으로 전자 제출되고, 그 전체 내용이 본원에 인용되어 포함되는 서열 목록을 포함한다. 2019년 9월 16일자로 생성된 상기 ASCII 사본은 파일명이 PAT058251_ST25.txt이며, 크기가 147,551 바이트이다.
기술분야
본 발명은 골수 세포 상에서 발현되는 인간 유발 수용체 2(TREM2) 단백질에 결합하고 안정화하는 항체 및 이들 항체를 사용하는 방법을 제공한다.
골수 세포 상에서 발현되는 트리거 수용체 또는 "TREM"은 상이한 유형의 골수 세포, 예컨대 대식세포, 수지상 세포, 파골세포, 미세아교세포, 비만 세포, 단핵구, 폐 상피 세포, 피부의 랑게르한스 세포, 쿠퍼 세포, 및 호중구 상에 발현되는 막통과 당단백질 그룹이다(문헌[Takaki, R. et al., Immunol. Rev., 2006, 214: 118-29]). TREM은 이의 세포 외 도메인에 면역글로불린(Ig)-유형 폴드를 가지며 이에 따라 면역글로불린 수퍼패밀리(IgSF)에 속한다. TREM 수용체는 짧은 세포 내 도메인을 함유하지만, 신호전달 매개체를 위한 도킹 모티프가 없고 세포 활성화를 위해 어답터 단백질, 예컨대 DAP12(12 kDa의 DNAX-활성화 단백질)를 필요로 한다. TREM의 2개 구성원이 보고되었다: TREM1 및 TREM2는 둘 다 면역 및 염증 반응에서 중요한 역할을 담당한다. 인간 TREM을 인코딩하는 유전자는 TREM1, TREM2, TREM3, TREM4 및 TREM5, 뿐만 아니라 TREM-유사 유전자를 인코딩하는 유전자 클러스터를 포함하는 염색체 6p21.1에 매핑된다.
TREM2는 약 40 kDa의 당단백질이며, 이는 N-탈당화후 26 kDa로 감소된다. 전체 TREM2 단백질은 선도 신호 펩타이드(아미노산 1~18), 단일 V-형 IgSF 세포 외 영역, (아미노산 19~132), 스톡(stalk) 영역(아미노산 133~172), 양전하를 띠는 막통과 도메인(아미노산 173~197), 및 세포질 꼬리(아미노산 198~230)로 구성된다(문헌[Kober et al., Elife 5 (2016); Kober et al., J. Mol. Biol. 429 (2017) 1607-1629.]). 엑손 2에 의해 인코딩된 세포 외 영역은 3개의 잠재적 N-글리코실화 부위를 함유하는 단일 유형 V IgSF 도메인으로 구성된다. 추정되는 막통과 영역은 하전된 라이신 잔기를 함유한다. TREM2의 세포질 꼬리에는 신호전달 모티프가 없으며, 신호전달 어답터 분자 DAP12/TRYROBP를 통해 신호를 전달하는 것으로 생각된다.
TREM2는 DAP12와 물리적으로 연합되며, 이는 TREM2 및 여러 다른 세포 표면 수용체에 대한 신호전달 어답터 단백질로 작용한다. DAP12의 세포질 도메인은 면역수용체 티로신 활성화 모티프(ITAM)를 함유한다(문헌[Wunderlich, J. Biol. Chem. 288, 33027-33036, 2013]). 상호작용 수용체의 활성화 후, DAP12는 Src 키나제에 의해 보존된 ITAM 티로신 잔기에서 인산화를 거친다. Syk 단백질 키나제의 후속 모집 및 활성화는 미토겐-활성화 단백질 키나제(MAPK), PI3K, NFκB 및 포스포리파제 Cγ(PLCγ)의 활성화를 포함하는 하류 신호전달 경로를 유발한다.
TREM2는 지질다당류(LPS), 열 충격 단백질 60, 신경돌기 파편, 박테리아, 아포지단백질 E 및 광범위한 음이온성 및 쯔비터이온성 지질, 예를 들어 포스파티드산(PA), 포스파티딜글리세롤(PG), 포스파티딜세린(PS), 포스파티딜이노시톨(PI), 포스파티딜콜린(PC), 카디오리핀 및 스핑고미엘린에 의해 활성화될 수 있다. TREM2 활성화는 미세아교세포 및 대식구의 포식세포능을 증가시키고, 전염증성 사이토카인의 방출을 감소시키고, TLR 신호전달을 제한한다. TREM2는 CSF-1 수용체 신호전달과의 상승작용에 의해 미세아교세포 생존을 지속한다. 또한, TREM2는 Plexin-A1과 상호작용하여 세포 접착 및 이동성을 조절한다. TREM2는 또한 Aβ 플라크 또는 뉴런 파편과 접촉하는 미세아교세포 세포 표면 영역에서 농축된다(문헌[Yuan et al., Neuron 90 (2016) 724-739]). 이 환경에서 TREM2에 의해 감지되는 리간드 중 일부, 예를 들어 인지질 및 미엘린 지질(문헌[Poliani et al., J. Clin. Invest. 125 (2015): 2161-2170]) 뿐만 아니라 ApoE(문헌[Atagi et al., J. Biol. Chem. 290 (2015): 26043-26050]; [Bailey et al., J. Biol. Chem. 290 (2015): 26033-26042])는 최근 확인되었다. TREM2는 미세아교세포 내로의 Aβ 흡수에 기여하므로, 다른 리간드는 Aβ 및 플라크 연관 뉴런 파편일 수 있다(문헌[Xiang et al., EMBO Mol. Med. 8 (2016): 992-1004]). TREM2는 또한 세포사멸 세포(문헌[Takahashi et al., J. Exp. Med. 201 (2005), 647-657]), 미엘린 잔해(문헌[Poliani et al., J. Clin. Invest. 125 (2015): 2161-2170]) 및 박테리아 비드(문헌[Cen et al., Am. J. Respir. 188 (2013) 201-212])의 제거에 역할을 하는 것으로 나타났다. TREM2 신호전달은 섭취된 먹이의 분해를 촉진하며 지질 대사, 미엘린 흡수 및 세포 내 분해에 중추적이다.
TREM2는 엑토도메인 부분절단(shedding) 및 막-내 단백분해에 의한 순차적 단백분해 가공을 거친다(문헌[Wunderlich, J. Biol. Chem. 288, 33027-33036, 2013]). 엑토도메인 부분절단 동안, TREM2의 엑토도메인은 프로테아제, 예컨대 ADAM(디스인테그린(disintegrin) 및 메탈로프로티나제 도메인 함유 단백질) 또는 BACE(베타-부위 APP 절단 효소) 패밀리의 구성원에 의해 방출된다(문헌[Kleinberger, Sci. Transl. Med . 2014; 6(243):243ra86]).
엑토도메인의 제거 후, 잔여 막-보유 단편은 γ-분비효소(secretase) 매개 막내 단백분해에 의해 추가 가공된다. 엑토도메인 부분절단에 의해 제조되는 TREM2의 가용성 단편(sTREM2)이 수지상 세포 배양 상청액에서뿐만 아니라 비염증성 신경 질병 및 다발성 경화증 환자로부터의 혈장 및 CSF(뇌척수액) 샘플에서 관찰되었다(문헌[Kleinberger, 2014]). 인간 CSF에서 TREM2의 부분절단된 엑토도메인, 즉 sTREM2는 잠재적인 알츠하이머병(AD) 바이오마커로 평가되었고 일반적으로 노화 동안 증가되는 것으로 나타났다(문헌[Suarez-Calvet, EMBO Mol. Med. 8, 466-476, 2016]). AD 경과 동안의 상세한 분석은 sTREM2가 임상 증상이 나타나기 전에 AD에서 초기에 증가하며, MCI-AD에서 피크를 이루고, 상승된, 그러나 AD 치매에서 MCI-AD 단계에 비해 더 낮은 수준으로 유지됨을 드러내었다(문헌[Suarez-Calvet, 2016]).
질환의 피크에서 TREM2 발현 증가는 해결을 유도한다(예를 들어, 복막염, 상처 치유)(문헌[Turnbull, 2006; Gawish, 2015]). 신경염증과 같은 만성 염증 상태에서 TREM2는 지속적으로 부분절단되며, 미세아교세포와 대식세포에서 신호전달 기능을 발휘할 수 없다. 따라서, 세포 표면에서 TREM2의 부분절단을 안정화 및/또는 방지하면 미세아교세포 및 대식세포에서 기능적이고 신호전달-가능한 TREM2 발현이 복원될 것이다.
인간 유전 연구는 sTREM2의 부족보다는 표면 TREM2의 손실이 질환 위험을 유발한다는 것을 나타낸다. 예를 들어, TREM2 단백질 내, 예를 들어 서열 번호 1 내 R에서 H로의 위치 47에서의 아미노산 돌연변이는 세포 표면 발현을 약간 감소시키고(Kleinberger 2014), TREM2의 리간드 결합 능력을 감소시킨다(Wang 2015, Atagi 2015, Bailey 2015). TREM2 내 아미노산 돌연변이 T66M은 세포 표면에서 TREM2의 발현이 결여를 유발하여(Kleinberger 2014), 가용성 TREM2가 생성되지 않는다. TREM2의 절단 부위에서의 돌연변이: H157Y는 sTREM2의 발현을 향상시키고, 전장 막 결합된 TREM2를 감소시키며, 증가된 AD 위험과 관련되어 있다(Thornton 2017, Schlepckow 2017). 따라서 이러한 유전적 연구는 세포 표면에서 TREM2를 안정화하는 것이 sTREM2를 감소시키고 원형질막-결합된 TREM2를 증가시키는 데 바람직함을 시사한다.
Haass et al. (WO18015573)은 TREM2의 스톡(stalk) 영역에 위치한 아미노산 152~161에 걸친 10-아미노산 펩타이드(AHVEHSISRS 서열 번호 132)에 결합하는, 및 TREM2 절단을 억제하는 항체를 생성하였다. 이러한 항체는 직접 결합하여 절단 부위를 차단함으로써 TREM2의 절단을 방지한다. Schwabe et al. (WO17062672)은 TREM2에 대한 항체 결합을 개시한다. 그러나, 임의의 개시된 항체에 대해서는 안정화 효과가 나타나지 않는다. 대조적으로, WO17062672에 기재된 일부 항체에 대해서는 불안정화 효과가 보고된다(실시예 15).
따라서, TREM2를 안정화하고 TREM2 관련 기능을 활성화하고/하거나 촉진시키고, 우수한 개발가능성 특성을 가지며, TREM2 안정화가 유익한 신경변성 질환을 앓고 있는 환자의 치료에 적합한 hTREM2 항체를 확인하고 개발할 필요가 있다.
공개된 문헌은 ADAM17에 대한 절단 부위가 스톡(stalk) 영역 내에 존재하기 때문에 TREM2를 안정화시키는 항체를 생성하기 위해 TREM2의 스톡 영역을 표적으로 했다. 실제로, 항체(또는 이의 결합 단편)와 같은 큰 분자는 스톡의 상대적으로 작은 영역(아미노산 133~172)에 대한 부분절단효소(sheddase)의 접근을 입체적으로 방해할 것으로 예상된다. 따라서, TREM2에 대한 안정화 항체를 생성하려는 이전의 시도가 TREM2의 스톡 영역을 표적으로 삼은 것은 놀라운 일이 아니다. TREM2의 IgSF 영역(서열 번호 1, 2 또는 3 중 어느 하나의 아미노산 19~132)은 절단 부위(H157)에서 멀리 떨어져 위치하며, 엑토도메인의 일부이다. TREM2의 IgSF 영역에 대한 항체가 부분절단효소가 TREM2 절단 부위에 접근하는 것을 입체적으로 방해하지 않을 것으로 예상되기 때문에 지금까지 IgSF 영역이 TREM2를 안정화할 항체에 대한 잠재적 표적으로 간주되지 않았다.
놀랍게도, 본 발명자들은 본원에 개시된 항체가 IgSF 영역에 결합하고 세포 표면에서 TREM2를 효과적으로 안정화할 수 있음을 발견했다. 본 발명자들은 또한 그러한 항체가 인간 M2A 대식세포에서 TREM2-의존성 식균 작용을 촉진하는 것과 같은 기능적 다운스트림 효과를 나타낼 수 있음을 보여주었다. 더욱이, 이러한 항체는 또한 예를 들어, 뇌에서 미세아교세포 또는 대식세포의 식세포 능력을 증가시킴으로써 생체 내 TREM2-의존성 기능을 향상시킬 수 있다.
따라서, 인간 TREM2(hTREM2)의 IgSF 도메인에 특이적으로 결합하고, hTREM2 단백질을 안정화시키는 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 예를 들어, 단클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 본원에 제공된다. 이러한 항체는 본원에서 "hTREM2 항체 또는 이의 항원-결합 단편"으로 지칭된다. 이들 hTREM2 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 (i) TREM2 엑토도메인의 부분절단을 감소시키거나 억제할 수 있고; (ii) 세포 표면 상의 TREM2 단백질을 안정화시키고/시키거나; (iii) TREM2 기능들, 예컨대 그의 동족 리간드에 대한 결합, 세포 내 신호전달, 식세포작용 증가, 식세포작용 물질의 분해 촉진, 및 TREM2-의존성 다운스트림 조절 기능 촉진을 유지하거나 증가시킬 수 있다. 기능장애 TREM2 또는 부재 표면 TREM2는 인간 신경염증성 및 신경변성 병리와 연관되기 때문에, 본원에 기재된 hTREM2 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 신경염증성 또는 신경변성 질환, 예컨대 알츠하이머병, 전두측두엽 치매, 파킨슨병, 근위축 측삭 경화증, 나수-하코라병, 다발성 경화증, 근위축 측삭 경화증(ALS), 항-NMDA 수용체 뇌염, 자폐증, 뇌 루푸스(NP-SLE), 화학-유도 말초 신경병증(CIPN), 포진 후 신경통, 만성 염증성 탈미엘린화 다발신경병증(CIDP), 간질, 길랑-바레 증후군(GBS), 봉입체 근육염, 리소좀 저장 질병, 예컨대 스핑고미엘린지질증(니만-픽 C) 및 점액다당질 축적증 II/IIIB, 이염색백색질 장애, 다초점성 운동 신경병증, 중증 근무력증, 신경-베체트병, 시신경척수염(NMO), 시신경염, 다발근육염, 피부근육염, 라스무센 뇌염, 레트 증후군, 뇌졸중, 횡단 척수염, 외상성 뇌 손상, 척수 손상, 바이러스성 뇌염, 또는 세균성 수막염을 치료, 예방 또는 진단하는데 사용될 수 있다. 본원에 기재된 hTREM2 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 또한 TREM2 또는 TREM2 수용체의 비정상적 또는 돌연변이된 변이체를 발현하는 세포의 광범위한 단백질분해 절단에 의해 매개되거나 이와 관련된 자가면역, 염증 또는 악성 장애를 치료, 예방 또는 진단하는데 적합하다. 일부 바람직한 실시형태에서, 본원에 기재된 hTREM2 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 알츠하이머병, 전두측두엽 치매, 파킨슨병, 근위축 측삭 경화증, 또는 나수-하코라병으로부터 선택된 질환을 치료, 예방 또는 진단하는데 사용될 수 있다. 또한, 본원에 개시된 TREM2-결합 항체 또는 항원-결합 단편을 사용하여 TREM2-관련 질환을 진단하고/하거나 치료하는 방법이 본원에 제공된다.
일 양태에서, TREM2 단백질의 IgSF 도메인에 특이적으로 결합하고, TREM2 단백질을 안정화시키는 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 본원에 제공된다. 일부 바람직한 실시형태에서, 이들 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 TREM2-발현 세포, 예컨대 대식세포, 수지상 세포, 파골세포, 미세아교세포, 비만 세포, 단핵구, 폐 상피 세포, 피부 랑게르한스 세포, 쿠퍼 세포, 호중구 또는 간암 세포의 세포 표면 상에서 TREM2 단백질을 안정화시킨다. 일부 실시형태에서, 이들 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 TREM2 단백질의 엑토도메인의 단백질분해 부분절단을 감소시킨다.
일부 실시형태에서, 인간 TREM2의 IgSF 도메인에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 본원에 제공된다. 예를 들어, 이러한 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 서열 번호 1의 아미노산 잔기 19 내지 132, 서열 번호 2의 아미노산 잔기 19 내지 132, 또는 서열 번호 3의 아미노산 잔기 19 내지 132를 포함하는 인간 TREM2의 IgSF 도메인에 결합한다. 일부 실시형태에서, TREM2 항체는 인간 또는 인간화 항체이다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 단편은 Fab, F(ab')2, Fv 단편, scFv, 미니바디, 또는 디아바디이다.
일부 실시형태에서, TREM2 항체는 이중특이적 항체이다. 일부 실시형태에서, 이중특이적 항체는 인간 TREM2 및 DAP12에 특이적으로 결합한다.
일부 실시형태에서, TREM2 항체는 Fc 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, Fc 영역은 하나 이상의 돌연변이를 갖고 모 항체와 비교할 때 감소된 항체-의존성 세포매개성 세포독성(ADCC) 또는 보체-의존성 세포독성(CDC) 활성을 갖는 변형된 IgG1 Fc 영역이다. 일부 실시형태에서, Fc 영역은 IgG2 Fc 영역, IgG4 Fc 영역, 또는 IgG2/IgG4 하이브리드 Fc 영역으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, hTREM2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 단클론이다. 이러한 단클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산, 및 이러한 단클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터 및 숙주 세포가 본원에 제공된다.
또 다른 양태에서, 하나 이상의 본원에 기재된 TREM2 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 또는 이러한 항체 또는 항원-결합 단편을 코딩하는 핵산, 또는 이러한 핵산을 포함하는 세포 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물이 본원에 제공된다.
또 다른 양태에서, 본원에 기재된 임의의 TREM2 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 치료적 유효량을 대상체에게 투여함으로써, 이를 필요로 하는 대상체에서 TREM2 기능 상실과 관련된 질환을 치료하는 방법이 본원에 제공된다. 이러한 방법은 하기 단계들 중 하나 이상을 포함할 수 있다: (1) 대상체로부터 얻은 샘플 내 세포 표면 TREM2 수준을 분석하는 단계; (2) 세포 표면 TREM2 수준이 기준 수준보다 낮은 대상체를 선별하는 단계로서, 기준 수준이 건강한 대상체로부터 얻은 샘플 내 세포 표면 TREM2 수준인, 단계; 및 (3) TREM2 단백질의 IgSF 도메인에 특이적으로 결합하고 TREM2 단백질을 안정화시키는 치료적 유효량의 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 대상체에 투여하는 단계. 일부 실시형태에서, 이러한 방법들은 대상체에게 제2의 작용제를 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 샘플 내 세포 표면 TREM2 수준은 유세포측정, 면역조직화학, 웨스턴 블롯팅, 면역형광 검정, 방사선면역검정(RIA), 효소-연관 면역흡착 검정(ELISA), 동종성 시간 분해 형광(HTRF), 또는 양전자 방출 단층촬영(PET)으로부터 선택되는 검정에 의해 결정될 수 있다. 일부 실시형태에서, 샘플은 뇌척수액 및 그의 세포 성분을 포함한다. 일부 실시형태에서, TREM2 기능 상실과 관련된 질환은 신경염증성 또는 신경변성 질병, 예컨대 알츠하이머병, 전두측두엽 치매, 파킨슨병, 근위축 측삭 경화증, 나수-하코라병, 다발성 경화증, 근위축 측삭 경화증(ALS), 항-NMDA 수용체 뇌염, 자폐증, 뇌 루푸스(NP-SLE), 화학-유도 말초 신경병증(CIPN), 포진 후 신경통, 만성 염증성 탈미엘린화 다발신경병증(CIDP), 간질, 길랑-바레 증후군(GBS), 봉입체 근육염, 리소좀 저장 질병, 예컨대 스핑고미엘린지질증(니만-픽 C) 및 점액다당질 축적증 II/IIIB, 이염색백색질 장애, 다초점성 운동 신경병증, 중증 근무력증, 신경-베체트병, 시신경척수염(NMO), 시신경염, 다발근육염, 피부근육염, 라스무센 뇌염, 레트 증후군, 뇌졸중, 횡단 척수염, 외상성 뇌 손상, 척수 손상, 바이러스성 뇌염, 또는 세균성 수막염이다. 일부 바람직한 실시형태에서, TREM2 기능 상실과 관련된 질환은 알츠하이머병, 전두측두엽 치매, 파킨슨병, 근위축 측삭 경화증, 또는 나수-하코라병으로부터 선택된 신경변성 질환이다. 추가의 바람직한 실시형태에서, 질환은 알츠하이머병이다. 일부 실시형태에서, TREM2 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 대식세포, 수지상 세포, 파골세포, 미세아교세포, 비만 세포, 단핵구, 폐 상피 세포, 피부 랑게르한스 세포, 쿠퍼 세포, 호중구 또는 간암 세포로부터 선택된 TREM2-발현 세포의 세포 표면 상에서 TREM2 단백질을 안정화시킨다. 일부 실시형태에서, TREM2 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 경구, 정맥 내, 두개 내, 척수강 내, 피하, 또는 비강 내 경로를 통해 대상체에게 투여된다.
또 다른 양태에서, TREM2 기능 상실과 관련된 질환의 치료에 사용하기 위한 TREM2 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 본원에 제공된다. 일부 바람직한 실시형태에서, 이들 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 TREM2 단백질의 IgSF 도메인(즉, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 19 내지 132, 서열 번호 2의 아미노산 잔기 19 내지 132, 또는 서열 번호 3의 아미노산 잔기 19 내지 132)에 특이적으로 결합하고, TREM2 단백질을 안정화시킨다. 일부 바람직한 실시형태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 대식세포, 수지상 세포, 파골세포, 미세아교세포, 비만 세포, 단핵구, 폐 상피 세포, 피부 랑게르한스 세포, 쿠퍼 세포, 호중구 또는 간암 세포로부터 선택된 TREM2 발현 세포의 세포 표면 상에서 TREM2 단백질을 안정화시킨다. 일부 실시형태에서, TREM2 기능 상실과 관련된 질환은 신경염증성 또는 신경변성 질병, 예컨대 알츠하이머병, 전두측두엽 치매, 파킨슨병, 근위축 측삭 경화증, 나수-하코라병, 다발성 경화증, 근위축 측삭 경화증(ALS), 항-NMDA 수용체 뇌염, 자폐증, 뇌 루푸스(NP-SLE), 화학-유도 말초 신경병증(CIPN), 포진 후 신경통, 만성 염증성 탈미엘린화 다발신경병증(CIDP), 간질, 길랑-바레 증후군(GBS), 봉입체 근육염, 리소좀 저장 질병, 예컨대 스핑고미엘린지질증(니만-픽 C) 및 점액다당질 축적증 II/IIIB, 이염색백색질 장애, 다초점성 운동 신경병증, 중증 근무력증, 신경-베체트병, 시신경척수염(NMO), 시신경염, 다발근육염, 피부근육염, 라스무센 뇌염, 레트 증후군, 뇌졸중, 횡단 척수염, 외상성 뇌 손상, 척수 손상, 바이러스성 뇌염, 또는 세균성 수막염이다. 일부 바람직한 실시형태에서, TREM2 기능 상실과 관련된 질환은 알츠하이머병, 전두측두엽 치매, 파킨슨병, 근위축 측삭 경화증, 또는 나수-하코라병으로부터 선택된 신경변성 질환이다. 추가의 바람직한 실시형태에서, 질환은 알츠하이머병이다. 일부 실시형태에서, TREM2 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 대식세포, 수지상 세포, 파골세포, 미세아교세포, 비만 세포, 단핵구, 폐 상피 세포, 피부 랑게르한스 세포, 쿠퍼 세포, 호중구 또는 간암 세포로부터 선택된 TREM2-발현 세포의 세포 표면 상에서 TREM2 단백질을 안정화시킨다.
도 1a는 인간 TREM2 이소형 1(서열 번호　1), 이소형 2(서열 번호 2), 및 이소형 3(서열 번호　3)의 아미노산 서열의 예시적 정렬을 나타낸다.
도 1b는 TREM2의 구조 및 신호전달 어답터 단백질 DAP12와의 그 상호작용을 예시한다. 성숙 TREM2는 단일 면역글로불린(IgSF) 도메인, 스톡 영역, 막통과(TM) 도메인, 및 세포질 도메인을 포함한다.
도 2는 항체 처리에 의한 CHO-hDAP12-hTREM2 세포에서 TREM2의 안정화를 보여준다.
도 3은 PMA로 처리하기 전 후에 인간 M2A 대식세포에 대한 TREM2 항체의 결합을 보여준다.
도 4는 WT-TREM2(4a)에 대한 항체의 결합 및 CHO-hDAP12 세포(4b, c)에서 재조합적으로 발현된 TREM2-TREM1 키메라 단백질을 보여준다.
도 5는 TREM2 항체에 의한, hM2A의 세포 표면에서의 TREM2의 안정화를 보여준다.
도 6(a, b)는 세포 표면에서 TREM2를 안정화시키는 항체가 또한 인간 M2A의 식세포 능력을 증가시킴을 보여준다. 이소형 대조군과 비교하여 스튜던트 T-검정(Student's T-test), *Pval<0.05, **Pval<0.01, ***Pval<0.001을 사용하여 통계를 계산하였다.
도 7(a, b)는 hM2A에서 식세포작용 분석에서 가장 낮은 유효 용량의 결정을 보여준다. 이소형 대조군과 비교하여 스튜던트 T-검정(Student's T-test), *Pval<0.05, **Pval<0.01, ***Pval<0.001을 사용하여 통계를 계산하였다.
도 8은 플레이트-결합된 TREM2 항체가 TREM2-의존성 NFAT 프로모터 의존성 유전자 전사를 유도함을 보여준다.
도 9(a, b)는 TREM2 항체가 인간 M2A 대식세포에서 Syk 인산화를 증가시킴을 보여준다. (b)는 (a)에 도시된 웨스턴 블롯의 총 Syk와 관련하여 서로 다른 조건하에서의 pSyk의 정량화를 나타낸다.
도 10은 인간 M2A 대식세포에 의한 에스. 아우레우스(S.aureus) 바이오입자 0~3시간의 식세포작용을 보여준다.
도 11은 인간 M2A 대식세포에 의한 SH-SY5Y 세포 3~12시간의 식세포작용을 보여준다.
도 12는 TREM2 항체가 인간 M2A 대식세포의 화학주성을 촉진함을 보여준다.
도 13은 TREM2 항체가 세포사멸 pHrodo-표지된 SH-SY5Y 세포를 사용하여 인간 iPS 유래 미세아교세포에서 식세포작용 및 판독으로서 누적 식세포작용을 촉진함을 보여준다.
도 14는 TREM2 항체가 인간 iPS 유래 미세아교세포의 화학주성을 촉진함을 보여준다.
도 15(a~e)는 큐프리존 모델에서 TREM2 항체를 사용한 예방적/수반되는, 및 치료적 치료의 결과를 보여준다.
도 16은 인간화 TREM2 마우스에서 MPTP 모델의 이미지 분석(A) 결과 및 각 그룹에 대한 대표적인 현미경 사진(B)을 보여준다.
도 17(a~c)는 CHO-hDAP12-hTREM2 세포에서 완전한 IgG MOR041877, MOR41895, MOR042596, MOR044698 및 MOR03207을 사용한 Fab MOR041877, MOR041895 및 MOR042596의 교차-차단 실험 결과를 보여준다.
도 18은 MOR042596으로 처리한 후 hM2A의 식세포작용 능력 증가를 보여준다.
도 19는 X-선 결정학에 의해 결정된 바와 같이 MOR042596에 결합하는 TREM2의 에피토프를 보여준다. TREM2의 단백질 백본은 카툰 표현으로 도시되며, Fab에서 5Å 거리 내에 있는 TREM2 잔기의 측쇄는 스틱으로 도시된다. Fab 중쇄는 어두운 회색 표면으로 표시되고, 경쇄는 밝은 회색 표면으로 표시된다.
도 20은 MOR042596(결정 구조) 및 MOR044698(상동 모델)을 비교한 TREM2-Fab 인터페이스(도 19 참조)의 확대도를 보여준다. Fab의 5Å 내에 있는 TREM2 잔기는 스틱으로 표시되고, LCDR3에 근접한 잔기(D39-K42)가 표시된다. 중쇄(암회색, 우측 상단) 및 경쇄(연회색, 좌측 상단)의 LCDR1 및 LCDR2는 두 Fab에 대해 동일하다. LCDR3은 두 Fab에 대해 LCDR3의 백본 루프 형태를 동일하게 유지하는 여러 공유 핵심 잔기(위치 90, 93, 95)를 가지고 있다. 89, 91, 92, 94, 96번 위치가 변경되며, MOR044698에 1개의 추가의 삽입(S95a)이 있다. MOR042596과 MOR044698 사이에 전체 에피토프가 보존된다.
도 21은 X-선 결정학에 의해 결정된 바와 같이 MOR041877에 결합하는 TREM2의 에피토프를 보여준다. TREM2의 단백질 백본은 카툰 표현으로 도시되며, Fab에서 5Å 거리 내에 있는 TREM2 잔기의 측쇄는 스틱으로 도시된다. Fab 중쇄는 어두운 회색 표면으로 표시되고, 경쇄는 밝은 회색 표면으로 표시된다.
도 22(a, b)는 TREM2 및 Iba1(A)에 대해 염색된, 큐프리존 및 MOR044698-mu 또는 이소형 대조군 항체로 처리된 hTREM2-KI 마우스의 뇌 피질을, 대조군으로서 나이브 마우스와 함께 보여준다. hTREM2에 대해 양성인 정규화된 영역의 정량 분석이 제공된다(B).
인간 TREM2의 세포 외 도메인에 특이적으로 결합하고, TREM2 단백질을 안정화시키는 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 본원에 제공된다. 이들 TREM2-항체 또는 이의 항원-결합 단편은 TREM2 엑토도메인의 부분절단을 감소시키거나 억제할 수 있고; 세포 표면 상의 TREM2 단백질을 안정화시키고; 선택적으로 TREM2 기능들, 예컨대 그의 동족 리간드에 대한 결합, 세포 내 신호전달, 식세포작용 증가, 및 식세포작용 물질의 분해 촉진을 유지하거나 증가시킬 수 있다. 기능장애 TREM2 또는 부재 표면 TREM2는 인간 신경염증성 및 신경변성 병리와 연관되기 때문에, 본원에 기재된 TREM2-안정화 항체 및 이의 항원-결합 단편은 신경염증성 또는 신경변성 질환, 예컨대 알츠하이머병, 전두측두엽 치매, 파킨슨병, 근위축 측삭 경화증, 나수-하코라병, 다발성 경화증, 근위축 측삭 경화증(ALS), 항-NMDA 수용체 뇌염, 자폐증, 뇌 루푸스(NP-SLE), 화학-유도 말초 신경병증(CIPN), 포진 후 신경통, 만성 염증성 탈미엘린화 다발신경병증(CIDP), 간질, 길랑-바레 증후군(GBS), 봉입체 근육염, 리소좀 저장 질병, 예컨대 스핑고미엘린지질증(니만-픽 C) 및 점액다당질 축적증 II/IIIB, 이염색백색질 장애, 다초점성 운동 신경병증, 중증 근무력증, 신경-베체트병, 시신경척수염(NMO), 시신경염, 다발근육염, 피부근육염, 라스무센 뇌염, 레트 증후군, 뇌졸중, 횡단 척수염, 외상성 뇌 손상, 척수 손상, 바이러스성 뇌염, 또는 세균성 수막염을 치료, 예방 또는 진단하는데 사용될 수 있다. 본원에 기재된 TREM2-결합 항체 및 이의 항원-결합 단편은 또한 TREM2 또는 TREM2 수용체의 비정상적 또는 돌연변이된 변이체를 발현하는 세포의 광범위한 단백질분해 절단에 의해 매개되거나 이와 관련된 자가면역, 염증 또는 악성 장애를 치료, 예방 또는 진단하는데 적합하다. 일부 바람직한 실시형태에서, 본원에 기재된 hTREM2 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 알츠하이머병, 전두측두엽 치매, 파킨슨병, 근위축 측삭 경화증, 또는 나수-하코라병으로부터 선택된 질환을 치료, 예방 또는 진단하는데 사용될 수 있다. 또한, 본원에 개시된 TREM2-결합 항체 및 이의 항원-결합 단편을 사용하여 TREM2 관련 질환을 진단하고/하거나 치료하는 방법이 본원에 제공된다.
TREM2는 박테리아 및 죽어가는 세포의 비-염증 식세포작용을 매개하고 염증 반응을 줄인다. TREM2의 동종접합성 기능 손실은 나수-하코라병(경화 백색질장애를 포함하는 다낭성 지질막 뼈형성장애, "PLOSL"), 또는 전두측두엽 치매(FTD)-유사 증후군, 뼈 낭종을 특징으로 하는 질병, 신경염증, 진행성 신경변성 및 초로성 치매를 유도한다. TREM2의 이종접합성 기능 손실 돌연변이 R47H도 후기-개시 알츠하이머병(AD)에 대한 중요한 위험 인자이며, 아포지단백질 E ε4 대립유전자와 유사한 효과 크기를 갖는다. TREM2는 백색질, 해마 및 신피질에서 확인되는 미세아교세포에서 발현되며, 이는 부분적으로 AD 뇌에서 보고되는 병리적 특징과 일치하여, AD 발병기전에서 TREM2의 관여 가능성을 뒷받침한다. 유전적 스크리닝으로 TREM2에서 이종접합성 미스센스 돌연변이를 이제 AD에 부가하여, 파킨슨병(PD), 근위축 측삭 경화증(ALS), 및 전두측두엽 치매(FTD)에 대한 위험 인자로 확인하였다(Kleinberger, Sci Transl Med. 2014 Jul 2;6(243):243ra86). 따라서, 기능적 TREM2는 중증 인지 장애 및 치매를 유도하는 노화-관련 신경염증성 및 신경변성 질병에 대해 보호하기 위해 요구된다.
대안적 스플라이싱으로 인해, 3개의 TREM2 이소형이 인간에 존재하며, 이소형 1이 가장 긴 이소형이다. 인간 TREM2 이소형 1(서열 번호 1), 인간 TREM2 이소형 2(서열 번호 2), 및 인간 TREM2 이소형 3(서열 번호 3)의 아미노산 서열의 정렬이 도 1a에 제시되어 있다. 도 1b는 TREM2의 구조 및 신호전달 어답터 단백질 DAP12와의 그 상호작용을 예시한다.
정의
명세서 및 청구범위에서 사용되는 바와 같이, 단수 형태는 문맥상 명확히 달리 나타내지 않는 한 복수의 언급 대상을 포함한다. 예를 들어, 용어 "세포"는 이의 혼합물을 비롯하여 복수의 세포를 포함한다.
범위를 포함하는 모든 수치 표기, 예를 들어, pH, 온도, 시간, 농도, 및 분자량은 0.1의 증분씩 (+) 또는 (-)로 변화되는 근사치이다. 항상 명시적으로 언급되는 것은 아니지만, 모든 수치 표기 앞에 용어 "약"이 선행됨이 이해되어야 한다. 수치 값 X에 관한 용어 "약"은, 예를 들어, 이 범위 내의 모든 값을 포함하여 X±15%를 의미한다. 또한 항상 명시적으로 언급되는 것은 아니지만, 본원에 기술된 시약은 단순히 예이며 이의 등가물이 당업계에 알려져 있음이 이해되어야 한다.
문맥이 달리 요구하지 않는 한, 본 명세서 및 다음의 청구범위 전체에 걸쳐, 용어 "포함하다" 및 "포함하고 있다" 및 "포함하는"과 같은 변형은 달리 언급되지 않는 한 개방형의 비제한적 의미로 본원에서 사용된다.
본원에서 사용될 때 "~으로 구성된"은 양태, 실시형태 및/또는 청구항 요소에 명시되지 않은 임의의 요소, 단계 또는 성분을 배제한다. 본원에서 사용될 때 "~으로 필수적으로 구성된"은, 양태, 실시형태 및/또는 청구항의 기본적인 그리고 신규한 특성에 실질적으로 영향을 미치지 않는 재료 또는 단계는 배제하지 않는다.
본원에서 사용된 바와 같은, "TREM2"("골수 세포 상에서 발현되는 유발 수용체 2(triggering receptor expressed on myeloid cells 2)", TREM2, TREM2a, TREM2b, 또는 TREM2c로도 알려져 있음)는 면역글로불린 수퍼패밀리(IgSF)에 속하는 막통과 당단백질을 지칭한다. 전체 TREM2 단백질(서열 번호 1)은 선도 신호 펩타이드(아미노산 1~18), 단일 V-형 IgSF 세포 외 영역(아미노산 19~132), 스톡(stalk) 영역(아미노산 133~172), 양전하를 띠는 막통과 도메인(아미노산 173~197), 및 세포질 꼬리(아미노산 198~230)로 구성된다(문헌[Feuerbach et al., Neurosci. Lett. 660 (2017): 109-114]). 인간 TREM2 유전자는 염색체 위치 6p21.1에 매핑되며, TREM2 유전자의 게놈 서열은 GenBank(Gene ID: 54209)에서 확인할 수 있다. 대체 스플라이싱으로 인해, 3개의 TREM2 이소형이 인간에게 존재한다(ID ENSP00000362205, ENSP00000342651, 및 ENSP00000362214로 ENSEMBL에서 사용가능한 단백질 서열). 용어 "TREM2"는 TREM2의 모든 이소형을 총칭하는데 사용된다. 가장 긴 인간 TREM2 이소형에 대한 단백질 및 mRNA 서열은 다음과 같다:
골수 세포 상에서 발현되는 유발 수용체 2 전구체 이소형 1 전구체[호모 사피엔스](NP_061838.1)
Figure pct00001
(서열 번호 1)
호모 사피엔스 골수 세포 상에서 발현되는 유발 수용체 2(TREM2), 전사체 변이체 1, mRNA(NCBI 참조 서열: NM_018965.3)
Figure pct00002
(서열 번호 133)
인간 TREM2 이소형 2(서열 번호 2) 및 이소형 3(서열 번호 3)의 아미노산 서열을 도 1a에 나타낸다. 본원에 사용된 바와 같이, 인간 TREM2 단백질은 또한 임의의 서열 번호 1, 2, 또는 3과 그 전체 길이에 걸쳐 적어도 약 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 단백질을 포괄하며, 여기서 이러한 단백질은 여전히 리간드 결합, 세포 내 신호전달, 식세포 작용 및 식세포 물질의 분해 촉진, 및 TREM2의 다른 조절 기능을 갖는다. 뮤린, 게잡이원숭이(cyno), 및 다른 동물 TREM2 단백질의 서열은 당분야에 알려져 있다(예를 들어, 뮤린 TREM2 단백질에 대해 NP_112544.1 및 NP_001259007.1).
용어 "세포 외 도메인"은 세포의 지질 이중층의 세포 외측 상에 노출되는 막통과 단백질 부분을 나타낸다. 단백질의 엑토도메인을 결정하는 방법은 당분야에 알려져 있다(Singer (1990); High et al. (1993), and McVector software, Oxford Molecular). 예를 들어, 인간 TREM2 단백질의 세포 외 도메인은 서열 번호 1의 아미노산 잔기 19 내지 172를 포함할 수 있다.
용어 TREM2의 "엑토도메인"은 부분절단효소 절단 후 방출되는 TREM2의 세포 외 도메인 부분을 나타낸다. 절단 부위는 아미노산 H157과 S158 사이에 있는 것으로 보고되어 있다(문헌[Feuerbach et al., Neurosci. Lett. 660 (2017): 109-114]). 따라서, hTREM2의 엑토도메인은 서열 번호 1, 2, 또는 3 중 어느 하나의 아미노산 19~157로 구성될 것이다.
용어 "IgSF 도메인"은 면역글로불린(Ig)-형 폴드를 함유하여 면역글로불린 수퍼패밀리에 속하는 TREM2의 세포 외 도메인의 일부를 지칭한다. 인간에서, 예를 들어, IgSF 도메인은 서열 번호 1, 2 및 3 중 어느 하나의 아미노산 잔기 19 내지 132로 구성된다.
용어 TREM2의 "스톡 영역"은 V-유형 면역글로불린(IgSF) 도메인 및 막통과 도메인을 연결하는 TREM2의 세포 외 도메인 부분을 나타낸다. 예를 들어, 인간 TREM2 이소형 1 단백질의 스톡 영역은 서열 번호 1의 아미노산 133~172를 포함할 수 있다.
용어 "막통과 도메인"은 세포의 지질 이중층에 걸쳐있는 막통과 단백질 부분을 나타낸다. 단백질의 막통과 도메인을 결정하는 방법은 당 분야에 알려져 있다(Elofsson et al., Annu. Rev. Biochem. 76 (2007):125-140; Bernsel et al., Protein Science 14 (2005):1723-1728).
용어 "세포질 도메인" 및 "세포질 꼬리"는 상호 교환적으로 사용되며 세포의 지질 이중층의 세포질측 상에 있는 막통과 단백질 부분을 나타낸다. 단백질의 세포질 꼬리를 결정하는 방법은 당분야에 알려져 있다(Elofsson et al. (2007) and Bernsel et al. (2005)).
본원에 사용된 용어 "안정화"는 TREM2-발현 세포에서 TREM2 세포 표면 수준, 예를 들어 염증 질환 또는 신경변성 질환 없는 건강한 대상체에서 상응하는 TREM2-발현 세포에서 TREM2 수준의 유지, 회복 또는 증가를 지칭한다. 이는 예를 들어 TREM2 엑토도메인의 부분절단을 감소 또는 억제하거나 TREM2의 세포 표면 발현을 증가시킴으로써 달성될 수 있다. TREM2 세포 표면 수준은 유세포 분석/FACS에 의해, 또는 TREM2 세포 표면 면역침강에 의해, 또는 시간에 따른 가용성 TREM2의 감소에 의해 평가될 수 있다. TREM2 세포 표면 발현은 또한, 효소-결합 면역흡착 분석(ELISA), 방사면역분석(RIA), 생물검정(예를 들어, 식세포작용 증가), 웨스턴 블롯 분석, 유세포 분석, 면역조직화학, 면역형광 분석, 동종 시간분해 형광(HTRF), 또는 양전자 방출 단층 촬영(PET)에 의해 검출될 수 있다.
본원에서 용어 "활성화"는 세포 표면에서, 예를 들어, 적절한 TREM2 의존적 활성이 손상된 염증성 또는 신경변성 질환이 있는 개체 또는 건강한 대상체의 TREM2-발현 세포에서 발현되는 TREM2의 다운스트림 신호전달의 개시 또는 보존을 지칭한다. 이것은 달성될 수 있지만, 상이한 세포 내 신호전달 캐스케이드를 통해 Syk 인산화의 개선, 식세포작용, 증가된 표적-지향 세포 운동성(화학주성), 증가된 세포 생존, 사이토카인 조절 또는 TREM2를 발현하는 세포의 케모카인 방출, 세포 내 식세포작용 물질의 분해 증가, 또는 유전자 발현의 변화를 유도하는, TREM2 관련 DAP12 또는 DAP10의 인산화에 국한되지 않는다. 증가된 TREM2 의존성 DAP12 또는 Syk 인산화는 웨스턴 블롯, ELISA 또는 유세포 분석/FACS로 평가될 수 있다. 세포들의 지향 운동성, 예를 들어, 화학주성은 생물검정에 의해 평가될 수 있다. 사이토카인 방출의 조절은 효소-결합 면역흡착 분석(ELISA), 방사성면역분석(RIA) 또는 유세포 분석/FACS에 의해 평가될 수 있다. 유전자 발현의 변화는 mRNA 수준에서 정량적 RT-PCR에 의해, 또는 단백질 수준에서 웨스턴 블롯 또는 유세포 분석에 의해 평가될 수 있다.
본원에서 용어 "촉진하다"는 질환 손상된 TREM2 의존적 활성의 향상 또는 회복을 지칭한다. 이러한 활성에는 식세포작용, 증가된 표적-지향 세포 운동성(화학주성), 증가된 세포 생존, 사이토카인 조절 또는 TREM2를 발현하는 세포의 케모카인 방출, 세포 내 식세포작용 물질의 분해 증가, 인접 세포들(성상 세포/뉴런)의 세포 반응 조절 또는 유전자 발현 변화가 포함될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "항체"는 항원에 특이적으로 결합하는 면역글로불린 분자로부터 유래된 단백질 또는 폴리펩타이드 서열을 지칭한다. 항체는 다중클론성 또는 단클론성, 다중 또는 단일 사슬, 또는 온전한 면역글로불린일 수 있고, 천연 공급원으로부터 또는 재조합 공급원으로부터 유래될 수 있다. 천연 발생 "항체"는 이황화 결합에 의해 상호 연결된 적어도 2개의 중(H)쇄 및 2개의 경(L)쇄를 포함하는 당단백질이다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역(본원에서 VH로 약칭됨) 및 중쇄 불변 영역으로 구성된다. 중쇄 불변 영역은 세 개의 도메인 CH1, CH2 및 CH3으로 구성된다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역(본 설명에서 VL로 약칭됨) 및 경쇄 불변 영역으로 구성된다. 경쇄 불변 영역은 하나의 도메인 CL로 구성된다. VH 및 VL 영역은 상보성 결정 영역(CDR: complementarity determining region)으로 불리는 초가변성의 영역들로 더 세분될 수 있으며, 이들 사이에는 프레임워크 영역(FR: framework region)으로 불리는 더 보존된 영역들이 산재되어 있다. 각각의 VH 및 VL은 다음 순서로 아미노-말단으로부터 카르복실-말단으로 배열된 3개의 CDR 및 4개의 FR로 구성된다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 항원과 상호작용하는 결합 도메인을 함유한다. 항체의 불변 영역은 면역계의 다양한 세포(예를 들어, 이펙터 세포) 및 고전 보체계의 첫 번째 구성요소(C1q)를 포함한, 숙주 조직 또는 인자에 대한 면역글로불린의 결합을 매개할 수 있다. 항체는 단클론 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 낙타 항체, 또는 키메라 항체일 수 있다. 항체는 임의의 이소형(예컨대, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA, 및 IgY), 클래스(예컨대, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, 및 IgA2), 또는 서브클래스의 항체일 수 있다. 본 명세서 전체에서, 용어 "항체" 또는 "항체 분자"는 또한 문맥상 달리 지시되지 않는 한, 이의 임의의 단편 및 이의 임의의 유도체를 포함한다.
용어 "항체 단편" 또는 "항원 결합 단편"은 항원의 에피토프와(예를 들어, 결합, 입체 장애, 안정화/불안정화, 공간 분포에 의해) 특이적으로 상호작용하는 능력을 보유하는 항체의 적어도 일부분을 지칭한다. 항체 단편의 예는 Fab, Fab', F(ab')2, Fv 단편, scFv 항체 단편, 디술피드-연결 Fv(sdFv), VH 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fd 단편, 선형 항체, 단일 도메인 항체, 예컨대 sdAb(VL 또는 VH), 낙타과 VHH 도메인, 힌지 영역에서 디술피드 가교에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편과 같은 항체 단편으로 형성된 다중특이성 항체, 및 항체의 단리된 CDR 또는 다른 에피토프 결합 단편을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 항원 결합 단편은 또한 단일 도메인 항체, 맥시바디, 미니바디, 나노바디, 인트라바디, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디, v-NAR 및 비스-scFv 내에 혼입될 수 있다(예를 들어 문헌[Hollinger and Hudson, Nature Biotechnology 23:1126-1136, 2005] 참조). 항원 결합 단편은 또한, 피브로넥틴 III형(Fn3)과 같은 폴리펩타이드를 기반으로 한 스캐폴드에 이식될 수 있다(피브로넥틴 폴리펩타이드 미니바디를 기술한 미국 특허 제6,703,199호 참조). 용어 "scFv"는 경쇄의 가변 영역을 포함하는 적어도 하나의 항체 단편 및 중쇄의 가변 영역을 포함하는 적어도 하나의 항체 단편을 포함하는 융합 단백질을 지칭하며, 여기서 경쇄 및 중쇄 가변 영역은 예를 들어 합성 링커, 예를 들어 짧은 유연성 폴리펩타이드 링커를 통해 연접하여 연결되고, 단쇄 폴리펩타이드로서 발현될 수 있고, 여기서 scFv는 그것이 유래된 온전한 항체의 특이성을 보유한다. 명시되지 않는 한, 본원에서 사용되는 바와 같이, scFv는 예를 들어 폴리펩타이드의 N-말단 및 C-말단과 관련하여, VL 및 VH 가변 영역을 어느 하나의 순서로 가질 수 있고, scFv는 VL-링커-VH를 포함할 수 있거나 또는 VH-링커-VL을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이 용어 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"은 항원 특이성 및 결합 친화성을 부여하는 항체 가변 영역 내의 아미노산의 서열을 지칭한다. 예를 들어, 일반적으로 각각의 중쇄 가변 영역 내에 3개의 CDR(예를 들어 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3)이 존재하고 각각의 경쇄 가변 영역 내에 3개의 CDR(LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3)이 존재한다. 주어진 CDR의 정확한 아미노산 서열 경계는 문헌[Kabat et al. (1991), "Sequences of Proteins of Immunological Interest", 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD]("Kabat" 넘버링 체계), 문헌[Al-Lazikani et al., (1997) JMB 273,927-948]("Chothia" 넘버링 체계), 또는 이들의 조합, 및 ImMunoGenTics(IMGT) 넘버링(문헌[Lefranc, M.-P., The Immunologist, 7, 132-136 (1999)]; 문헌[Lefranc, M.-P. et al., Dev. Comp. Immunol., 27, 55-77 (2003)]; 문헌[Lefranc et al., (2015) Nucleic Acids Res. 43, D413-422])("IMGT" 넘버링 체계)에 기재된 것들을 포함하는, 잘 알려진 여러 체계들을 사용하여 결정될 수 있다. 주어진 CDR 영역(예를 들어, HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 또는 LCDR3)에 대한 조합된 Kabat 및 Chothia 넘버링 체계에 있어서, 일부 실시형태에서, CDR은 Chothia CDR의 일부로서 정의된 아미노산 잔기와 함께, Kabat CDR의 일부로서 정의된 아미노산 잔기에 상응한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "Chothia" 번호 체계에 따라 정의된 CDR은 또한 때때로 "초가변 루프"로 지칭된다. IMGT 하에서, 항체의 CDR 영역은 IMGT/DomainGap Align 프로그램을 사용하여 결정될 수 있다. 일반적으로, 특별히 지시되지 않는 한, 항체 분자는 하나 이상의 Kabat CDR 및/또는 Chothia CDR의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
용어 "에피토프"는 면역글로불린에 특이적으로 결합할 수 있거나 달리 분자와 상호작용할 수 있는 임의의 단백질 결정부위를 포함한다. 에피토프 결정부위는 일반적으로, 분자의 화학적 활성 표면 그룹, 예컨대 아미노산 또는 탄수화물 또는 당 측쇄로 이루어지고, 특이적인 3차원의 구조적 특성뿐만 아니라 특이적인 전하 특성도 가질 수 있다. 에피토프는 "선형" 또는 "입체형태적"일 수 있다. 입체형태적 에피토프와 선형 에피토프는 예를 들어 전자에 대한 결합이 변성 용매의 존재하에서 상실되지만 후자는 그렇지 않다는 점에서 구별된다.
"~와 동일한 에피토프를 결합한다"는 항체를 비교하기 위해 동일한 에피토프 맵핑 기술을 사용할 때 항체, 항체 단편 또는 다른 항원-결합 모이어티가 특정 항원에 결합하고 예시된 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 능력을 의미한다. 예시된 항체 및 다른 항체의 에피토프는 에피토프 매핑 기술을 사용하여 결정될 수 있다. 에피토프 매핑 기술은 당업계에 잘 공지되어 있다. 예를 들어, 입체형태적 에피토프는 아미노산의 공간적 입체형태를 예컨대 예를 들어, 수소/중수소 교환, x-선 결정학 및 2차원 핵 자기 공명에 의해 결정함으로써 쉽게 식별된다.
또 다른 실시형태에서, 본 개시내용은 표 1에 기재된 항체와 교차-경쟁하는 항체 또는 항체 단편을 지칭한다.
일 실시형태에서 본 개시내용은 항체 또는 항체 단편을 지칭하고, 여기서 상기 항체 또는 항체 단편은 표 1의 항체 중 하나 이상의 Kabat, Chothia, IMGT, 또는 조합된 Kabat/Chothia 방법 중 어느 하나에 의해 정의된 6개의 CDR을 포함하는 항체 또는 항체 단편과 교차-경쟁한다.
또 다른 실시형태에서, 본 개시내용은 표 1의 항체 중 하나와 동일한 에피토프에 (예를 들어, 결합 및/또는 안정화에 의해) 결합하는 항체 또는 항체 단편을 지칭한다.
추가 실시형태에서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 표 1의 항체 중 어느 하나의 Kabat, Chothia, IMGT, 또는 조합된 Kabat/Chothia 방법 중 어느 하나에 의해 정의된 6개의 CDR을 포함하는 항체 또는 항체 단편의 에피토프와 중첩하는 에피토프에 (예를 들어, 결합 및/또는 안정화에 의해) 결합한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "1가 항체"는 표적 분자 상의 단일 에피토프에 결합하는 항체를 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "2가 항체"는 적어도 2개의 동일 표적 분자 상의 2개의 에피토프에 결합하는 항체를 지칭한다. 2가 항체는 또한 표적 분자들을 서로 가교결합시킬 수 있다. "2가 항체"는 또한 적어도 2개의 동일 표적 분자 상의 2개의 상이한 에피토프에 결합하는 항체를 지칭한다.
용어 "다가 항체"는 1보다 큰 원자가를 갖는 단일 결합 분자를 지칭하며, 여기서, "원자가"는 항체 구축물 분자 1개당 존재하는 항원 결합 모이어티의 수로 기재된다. 이와 같이, 단일 결합 분자가 표적 분자 상의 하나 초과의 결합 부위에 결합할 수 있다. 다가 항체의 예는 2가 항체, 3가 항체, 4가 항체, 5가 항체 등과, 이중특이성 항체 및 이중파라토프 항체를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 예를 들어, TREM2에 있어서, 다가 항체(예를 들어, TREM2 이중파라토프 항체)는 각각 TREM2의 두 도메인에 대한 결합 모이어티를 갖는다.
용어 "다가 항체"는 또한 2개의 개별 표적 분자에 대해 1개 초과의 항원 결합 모이어티를 갖는 단일 결합 분자를 지칭한다. 예를 들어, TREM2에 결합하는 항체 및 TREM2에 결합하지 않는 제2 표적 분자. 일 실시형태에서, 다가 항체는 4개의 에피토프 결합 도메인을 갖는 4가 항체이다. 4가 분자는 그 표적 분자의 각각의 결합 부위에 대해 이중특이성이고 2가일 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "이중특이성 항체"는 2개 이상의 상이한 에피토프들에 결합하는 항체를 지칭한다. 일부 실시형태에서, 이중특이성 항체는 2개의 상이한 표적에 결합한다. 일부 실시형태에서, 이중특이성 항체는 단일 표적 분자 상의 2개의 상이한 에피토프에 결합한다. 단일 표적 분자 상의 2개의 상이한 에피토프에 결합하는 항체는 "이중파라토프 항체"로도 공지되어 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 어구 "단클론 항체" 또는 "단클론 항체 조성물"은 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖거나 동일한 유전자원으로부터 유래된 항체, 이중특이성 항체 등을 포함하는 폴리펩타이드를 지칭한다. 이 용어는 또한, 단일 분자 조성물의 항체 분자의 제제를 포함한다. 단클론 항체 조성물은 특정 에피토프에 대한 단일 결합 특이성 및 친화성을 나타낸다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 어구 "인간 항체"는 프레임워크 영역과 CDR 영역 둘 다가 인간 기원의 서열로부터 유래된 가변 영역을 갖는 항체를 포함한다. 불변 영역도 인간 서열, 예를 들어, 인간 생식세포 계열 서열, 또는 인간 생식세포 계열 서열의 돌연변이 버전, 또는 인간 프레임워크 서열 분석으로부터 유래된 컨센서스 프레임워크 서열을 함유하는 항체로부터 유래되며, 이는 예를 들어, 문헌[Knappik, et al. (2000. J Mol Biol 296, 57-86)]에 기재된 바와 같다. 면역글로불린 가변 도메인, 예를 들어 CDR의 구조 및 위치는 잘 알려진 넘버링 체계, 예를 들어 Kabat 넘버링 체계, Chothia 넘버링 체계, 또는 Kabat와 Chothia의 조합, 및 ImMunoGenTics(IMGT) 넘버링을 이용하여 정의될 수 있다(예를 들어, [Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Department of Health and Human Services (1991), eds. Kabat et al.]; 문헌[Al Lazikani et al., (1997) J. Mol. Bio. 273:927 948)]; 문헌[Kabat et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th edit., NIH Publication no. 91-3242 U.S. Department of Health and Human Services]; 문헌[Chothia et al., (1987) J. Mol. Biol. 196:901-917]; 문헌[Chothia et al., (1989) Nature 342:877-883]; 및 문헌[Al-Lazikani et al., (1997) J. Mal. Biol. 273:927-948]; 문헌[Lefranc, M.-P., The Immunologist, 7, 132-136 (1999)]; 문헌[Lefranc, M.-P. et al., Dev. Comp. Immunol., 27, 55-77 (2003)]; 문헌[Lefranc et al., (2015) Nucleic Acids Res. 43, D413-422] 참고).
본 발명의 인간 항체는 인간 서열에 의해 코딩되지 않는 아미노산 잔기(예를 들어, 시험관 내 무작위 또는 부위-특이적 돌연변이 유도에 의해 또는 생체 내 체세포 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이, 또는 안정성 또는 제조의 촉진을 위한 보존적 치환)를 포함할 수 있다. 그러나, 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "인간 항체"는 마우스와 같은 다른 포유류 종의 생식세포 계열로부터 유래되는 CDR 서열이 인간 프레임워크 서열에 이식된 항체는 포함하지 않고자 한다.
본원에 사용된 어구 "재조합 인간 항체"는 재조합적 수단에 의해 제조, 발현, 생성, 또는 단리된 모든 인간 항체, 예컨대 인간 면역글로불린 유전자에 대해 트랜스제닉(transgenic) 또는 트랜스크로모조말(transchromosomal) 동물(예를 들어, 마우스) 또는 이로부터 제조된 하이브리도마로부터 단리된 항체, 인간 항체를 발현하도록 형질전환된 숙주 세포, 예를 들어 트랜스펙토마(transfectoma)로부터 단리된 항체, 재조합적 조합 인간 항체 라이브러리로부터 단리된 항체, 및 전부의 또는 일부분의 인간 면역글로불린 유전자의 서열을 다른 DNA 서열로 스플라이싱하는 것을 수반하는 임의의 다른 수단에 의해 제조, 발현, 생성, 또는 단리된 항체를 포함한다. 이러한 재조합 인간 항체는, 프레임워크 영역 및 CDR 영역이 인간 생식세포 계열 면역글로불린 서열로부터 유래된 가변 영역을 가진다. 그러나 특정 실시형태에서 이러한 재조합 인간 항체는 시험관 내 돌연변이 유발(또는, 인간 Ig 서열을 위한 트랜스제닉 동물이 사용될 때, 생체 내 체세포 돌연변이 유발) 처리될 수 있고, 따라서 재조합 항체의 VH 및 VL 영역의 아미노산 서열은, 인간 생식계열 VH 및 VL 서열로부터 유래되고 이와 관련되지만, 생체 내 인간 항체 생식계열 레퍼토리 내에 자연적으로 존재하지 않을 수 있는 서열이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "Fc 영역"은 CH3, CH2, 및 항체의 불변 도메인의 힌지 영역의 적어도 일부분을 포함하는 폴리펩타이드를 지칭한다. 선택적으로, Fc 영역은 일부 항체 클래스에 존재하는 CH4 도메인을 포함할 수 있다. Fc 영역은 항체의 불변 도메인의 전체 힌지 영역을 포함할 수 있다. 일 실시형태에서, 본 발명은 항체의 Fc 영역 및 CH1 영역을 포함한다. 일 실시형태에서, 본 발명은 항체의 Fc 영역 및 CH3 영역을 포함한다. 다른 실시형태에서, 본 발명은 항체의 불변 도메인으로부터의 Fc 영역, CH1 영역, 및 C카파/람다 영역을 포함한다. 일 실시형태에서, 본 발명의 결합 분자는 불변 영역, 예를 들어 중쇄 불변 영역을 포함한다. 일 실시형태에서, 이러한 불변 영역은 야생형 불변 영역과 비교하여 변형된다. 즉, 본원에 개시된 본 발명의 폴리펩타이드는 3개의 중쇄 불변 도메인(CH1, CH2, 또는 CH3) 중 하나 이상 및/또는 경쇄 불변 영역 도메인(CL)에 대한 변경 또는 변형을 포함할 수 있다. 변형의 예는 하나 이상의 도메인에서의 1개 이상의 아미노산의 부가, 결실, 또는 치환을 포함한다. 이러한 변화는 이펙터 기능, 반감기 등을 최적화하기 위해 포함될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "친화도"는 단일 항원 부위에서의 항체와 항원 사이의 상호작용의 강도를 의미한다. 각각의 항원 부위 내에서, 항체의 가변 영역은 많은 부위에서 약한 비공유적 힘을 통해 항원과 상호작용하며; 상호작용이 많을수록 친화도는 더 강하다. 본원에서 사용되는 바와 같이, IgG 항체 또는 이의 단편(예를 들어, Fab 단편)에 대한 "고친화도"라는 용어는 표적 항원에 대해 10-8 M 이하, 10-9 M 이하, 또는 10-10 M, 또는 10-11 M 이하, 또는 10-12 M 이하, 또는 10-13 M 이하의 친화도를 갖는 항체를 지칭한다. 그러나, 고친화도 결합은 다른 항체 이소타입들에 있어서 다를 수 있다. 예를 들어, IgM 이소타입에 있어서 고친화도 결합은 10-7 M 이하 또는 10-8 M 이하의 친화도를 갖는 항체를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "Kassoc", "Ka" 또는 "Kon"은 특정 항체-항원 상호작용의 결합 속도를 지칭하고자 하며, 반면 용어 "Kdis," "Kd," 또는 "Koff"는 특정 항체-항원 상호작용의 해리 속도를 지칭하고자 한다. 일 실시형태에서, 본원에 사용된 바와 같이 용어 "KD" (또는 "KD)"는 해리 상수를 지칭하고자 하며, 이러한 해리 상수는 Ka에 대한 Kd의 비율(즉, Kd/Ka)로부터 수득되고 몰 농도(M)로서 표현된다. 항체에 대한 KD 값은 당업계의 잘 확립된 방법을 사용하여 결정될 수 있다. 항체의 KD를 결정하는 방법은 표면 플라즈몬 공명을 사용하거나 바이오센서 시스템, 예컨대 Biacore® 시스템을 사용하는 것이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "친화력(avidity)"은 항체-항원 복합체의 전체 안정성 또는 강도의 정보적인 척도(measure)를 지칭한다. 이것은 다음의 3가지 주요 요인에 의해 제어된다: 항체 에피토프 친화도; 항원 및 항체 둘 다의 원자가; 및 상호작용 파트의 구조적 배열. 궁극적으로, 이들 요인은 항체의 특이성, 즉, 특정 항체가 정확한 항원 에피토프에 결합하는 가능성을 한정한다(define).
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "결합 특이성" 또는 "특이적으로 결합하는"은 하나의 항원 결정부위와 반응하고 다른 항원 결정부위와는 반응하지 않는 개별 항체 결합 부위의 능력을 지칭한다. 항체의 결합 부위는 이 분자의 Fab 부분에 위치하고, 중쇄 및 경쇄의 초가변 영역으로부터 구축된다. 항체의 결합 친화도는 단일 항원 결정부위와 항체 상의 단일 결합 부위 사이의 반응의 강도이다. 이는 항원 결정부위와 항체의 결합 부위 사이에 작용하는 인력과 척력의 합이다.
용어 "치료하다" 및 "치료"는 치료적 처치를 지칭하며, 여기서 그 목적은 원하지 않는 생리적 변화 또는 장애를 둔화시키는 것이다. 본 발명의 목적을 위해, 유익하거나 요망되는 임상 결과는 검출 가능하건 검출 가능하지 않건, 증상의 경감, 질환 정도의 감소, 질환의 안정화된(즉, 악화되지 않는) 상태, 질환 진행의 지연 또는 둔화, 질환 상태의 개선 또는 완화, 및 관해(부분적이거나 전체적이거나 무관하게)를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. "치료"는 또한 치료를 받지 않은 경우의 예상 생존 대비 생존 연장을 의미할 수 있다.
임의의 특정 질환 또는 장애의 "예방", "예방하다" 및 "예방하는"이라는 용어는 해당 질환 또는 장애의 증상이 나타나기 전에 본 발명의 화합물을 대상체에게 투여하는 것과 같은 예방적 또는 방지적 조치를 지칭한다.
용어 "대상체"는 본 발명의 방법에 따른 치료가 제공되는 동물, 인간 또는 비-인간을 지칭한다. 수의학적 및 비-수의학적 응용이 고려된다. 이 용어는 포유류, 예컨대, 인간, 다른 영장류, 돼지, 설치류, 예컨대 마우스 및 래트, 토끼, 기니피그, 햄스터, 소, 말, 고양이, 개, 양 및 염소를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 전형적인 대상체는 인간, 농장 동물, 및 가내 애완동물, 예컨대 고양이 및 개를 포함한다. 일부 바람직한 실시형태에서, 대상체는 인간이다.
"유효량"은 유익하거나 요망되는 결과를 초래하기에 충분한 양을 지칭한다. 예를 들어, 치료량은 요망되는 치료 효과를 달성하는 양이다. 상기 양은 질환 또는 질환 증상의 발병을 방지하는 데 필요한 양인 예방적 유효량과 동일하거나 상이할 수 있다. 유효량은 하나 이상의 투여, 적용 또는 투여량으로 투여될 수 있다. 치료 화합물의 "치료적 유효량"(즉, 유효 투여량)은 선택되는 치료 화합물에 의존한다. 조성물은 2일 1회를 포함하여, 1일 1회 이상 내지 1주 1회 이상 투여될 수 있다. 당업자는, 대상체의 질환 또는 장애의 중증도, 이전 치료, 일반 건강 및/또는 연령, 및 존재하는 다른 질병을 포함하지만 이에 한정되지 않는 특정 요인이 대상체를 효과적으로 치료하기 위해 요구되는 투여량 및 타이밍에 영향을 미칠 수 있음을 이해할 것이다. 또한, 본원에서 기재되는 치료 화합물의 치료적 유효량을 이용한 대상체의 치료는 단회 치료 또는 일련의 치료를 포함할 수 있다.
용어 "핵산" 또는 "폴리뉴클레오타이드"는 단일- 또는 이중-가닥 형태의 데옥시리보핵산(DNA) 또는 리보핵산(RNA) 및 이들의 중합체를 지칭한다. 구체적으로 제한되지 않는 한, 이 용어는 기준 핵산과 유사한 결합 특성을 갖고 자연 발생 뉴클레오타이드와 유사한 방식으로 대사되는 천연 뉴클레오타이드의 알려져 있는 유사체를 함유하는 핵산을 포괄한다. 달리 나타내지 않는 한, 특정한 핵산 서열은 또한 명시적으로 나타낸 서열뿐만 아니라 그의 보존적으로 변형된 변이체(예를 들어 축퇴성 코돈 치환), 대립유전자, 오르토로그, SNP, 및 상보성 서열을 함축적으로 포괄한다. 구체적으로, 축퇴성 코돈 치환은 하나 이상의 선택된(또는 모든) 코돈의 제3 위치가 혼합-염기 및/또는 데옥시이노신 잔기로 치환된 서열을 생성함으로써 달성될 수 있다(문헌[Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991)]; 문헌[Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985)]; 및 문헌[Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994)]).
용어 "펩타이드", "폴리펩타이드", 및 "단백질"은 상호교환가능하게 사용되고, 펩타이드 결합에 의해 공유 결합된 아미노산 잔기로 구성된 화합물을 지칭한다. 단백질 또는 펩타이드는 적어도 2개의 아미노산을 함유하여야 하고, 단백질 또는 펩타이드 서열을 포함할 수 있는 아미노산의 최대 수에 대한 제한은 존재하지 않는다. 폴리펩타이드는 펩타이드 결합에 의해 서로 연결된 2개 이상의 아미노산을 포함하는 임의의 펩타이드 또는 단백질을 포함한다. 본원에 사용된 상기 용어는 본 기술 분야에서 예를 들어 펩타이드, 올리고펩타이드 및 올리고머로도 통상적으로 지칭되는 짧은 쇄, 및 많은 유형이 존재하는, 일반적으로 본 기술 분야에서 단백질로 지칭되는 더 긴 쇄 둘 다를 지칭한다. "폴리펩타이드"는 다른 것 중에서도, 예를 들어 생물학적 활성 단편, 실질적으로 상동성 폴리펩타이드, 올리고펩타이드, 동종이량체, 이종이량체, 폴리펩타이드의 변이체, 변형된 폴리펩타이드, 유도체, 유사체, 융합 단백질을 포함한다. 폴리펩타이드는 천연 펩타이드, 재조합 펩타이드 또는 이들의 조합을 포함한다.
용어 "보존적 서열 변형"은 아미노산 서열을 함유하는 항체 또는 항체 단편의 결합 특징에 유의하게 영향을 미치지 않거나 이를 변경하지 않는 아미노산 변형을 지칭한다. 이러한 보존적 변형은 아미노산 치환, 부가 및 결실을 포함한다. 변형은 당업계에 공지된 표준 기술, 예컨대 부위-지정 돌연변이유발 및 PCR-매개 돌연변이유발에 의해 본 발명의 항체 또는 항체 단편 내에 도입될 수 있다. 보존적 아미노산 치환은 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 대체된 것이다. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 패밀리가 당업계에서 정의되어 있다. 이들 패밀리는 염기성 측쇄(예를 들어, 라이신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄(예를 들어, 아스파르트산, 글루탐산), 하전되지 않은 극성 측쇄(예를 들어, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인, 트립토판), 비극성 측쇄(예를 들어, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌), 베타-분지형 측쇄(예를 들어, 트레오닌, 발린, 이소류신), 및 방향족 측쇄(예를 들어, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)를 갖는 아미노산을 포함한다. 따라서, 본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 단편 내의 하나 이상의 아미노산 잔기는 동일한 측쇄 패밀리로부터의 다른 아미노산 잔기로 대체될 수 있고, 변경된 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 본원에 기술된 기능적 분석법을 사용하여 테스트될 수 있다.
용어 "상동성" 또는 "동일성"은 2개의 중합체 분자 사이, 예를 들어 2개의 DNA 분자 또는 2개의 RNA 분자와 같은 2개의 핵산 분자 사이, 또는 2개의 폴리펩타이드 분자 사이의 서브유닛 서열 동일성을 나타낸다. 두 분자 모두에서 서브유닛 위치가 동일한 단량체 서브유닛에 의해 점유될 때, 예를 들어 2개의 DNA 분자 각각에서 하나의 위치가 아데닌에 의해 점유되는 경우, 이들은 그 위치에서 상동성이거나 동일하다. 두 서열 사이의 상동성은 매칭되거나 상동성인 위치의 수의 직접적인 함수이다; 예를 들어, 두 서열에서의 위치의 절반(예를 들어, 길이가 10개의 서브유닛인 중합체에서 5개의 위치)이 상동성일 경우, 두 서열은 50% 상동성이고; 위치의 90%(예를 들어 10개 중 9개)가 매칭되거나 상동성일 경우, 두 서열은 90% 상동성이다. "서열 동일성"의 백분율은 비교창에 걸쳐 최적으로 정렬된 두 서열을 비교함으로써 결정될 수 있으며, 비교창에서의 아미노산 서열의 단편은 두 서열의 최적 정렬을 위해 기준 서열(부가 또는 결실을 포함하지 않음)과 비교하여 부가 또는 결실(예를 들어, 갭 또는 오버행)을 포함할 수 있다. 백분율은 두 서열에서 동일한 아미노산 잔기가 나타나는 위치의 수를 결정하여 매칭된 위치의 수를 산출하고, 매칭된 위치의 수를 비교창의 위치의 총 수로 나누고, 그 결과에 100을 곱하여 서열 동일성 백분율을 산출함으로써 계산될 수 있다. 결과는 쿼리 서열에 대한 대상 서열의 동일성 퍼센트이다.
용어 "단리된"은 천연 상태로부터 변경되거나 제거된 것을 의미한다. 예를 들어 살아있는 동물에 천연적으로 존재하는 핵산 또는 펩타이드는 "단리된" 것이 아니지만, 그의 천연 상태의 공존 물질로부터 부분적으로 또는 완전히 분리된 상기 핵산 또는 펩타이드는 "단리된" 것이다. 단리된 핵산 또는 단백질은 실질적으로 정제된 형태로 존재할 수 있거나, 예를 들어 숙주 세포와 같은 비-천연 환경에 존재할 수 있다. 단리된 항체에는 상이한 항원 특이성을 가진 다른 항체가 실질적으로 없다(예컨대 TREM2에 특이적으로 결합하는 단리된 항체에는 TREM2가 아닌 항원에 특이적으로 결합하는 항체가 실질적으로 없음). 그러나 표적 분자에 특이적으로 결합하는 단리된 항체는 다른 종으로부터의 동일한 항원에 대해 교차-반응성을 가질 수 있으며, 예컨대 TREM2에 특이적으로 결합하는 단리된 항체는 다른 종으로부터의 TREM2 분자에 결합할 수 있다. 단리된 항체는 단클론 항체일 수 있다. 단리된 항체는 재조합 단클론 항체일 수 있다. 또한, 단리된 항체에는 다른 세포 물질 및/또는 화학물질이 실질적으로 없을 수 있다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 분야의 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기술되는 것과 유사하거나 동등한 방법 및 재료가 본 발명의 실시에 사용될 수 있지만, 적합한 방법 및 재료가 이하에 기술된다. 본원에 언급된 모든 간행물, 특허 출원, 특허 및 기타 참고문헌은 그 전체가 참고로 포함된다. 상충하는 경우, 정의를 포함한 본 명세서가 우선한다. 또한, 재료, 방법, 및 실시예는 단지 예시적인 것이며, 제한하고자 하는 것이 아니다.
본 발명의 하나 이상의 실시형태의 세부 사항은 하기의 첨부된 도면 및 설명에 기재되어 있다. 본 발명의 기타 특징, 목적 및 장점은 이러한 설명 및 도면으로부터, 그리고 청구범위로부터 명백할 것이다.
기능성 TREM2를 안정화시키는 항체
세포 표면에서 TREM2를 안정화시키는 항체 및 이의 항원-결합 단편이 본원에 제공된다. 이러한 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 TREM2의 단백질분해 절단을 방해하고/하거나 TREM2 단백질의 엑토도메인의 부분절단을 감소시킴으로써 TREM2의 안정화를 달성할 수 있다. 일부 바람직한 실시형태에서, 이러한 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 인간 TREM2의 IgSF 도메인, 예를 들어, 서열 번호 1, 2 또는 3 중 어느 하나의 아미노산 잔기 19 내지 132에 특이적으로 결합한다.
세포 표면 TREM2의 감소 또는 부재는 인간 신경염증성 및 신경변성 병리와 연관되기 때문에, 본원에 기재된 TREM2-안정화 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 신경염증성 및 신경변성 질환, 예컨대 알츠하이머병, 전두측두엽 치매, 파킨슨병, 근위축 측삭 경화증, 나수-하코라병, 다발성 경화증, 근위축 측삭 경화증(ALS), 항-NMDA 수용체 뇌염, 자폐증, 뇌 루푸스(NP-SLE), 화학-유도 말초 신경병증(CIPN), 포진 후 신경통, 만성 염증성 탈미엘린화 다발신경병증(CIDP), 간질, 길랑-바레 증후군(GBS), 봉입체 근육염, 리소좀 저장 질병, 예컨대 스핑고미엘린지질증(니만-픽 C) 및 점액다당질 축적증 II/IIIB, 이염색백색질 장애, 다초점성 운동 신경병증, 중증 근무력증, 신경-베체트병, 시신경척수염(NMO), 시신경염, 다발근육염, 피부근육염, 라스무센 뇌염, 레트 증후군, 뇌졸중, 횡단 척수염, 외상성 뇌 손상, 척수 손상, 바이러스성 뇌염, 또는 세균성 수막염을 치료, 예방 또는 진단하는데 사용될 수 있다. 일부 바람직한 실시형태에서, 본원에 기재된 hTREM2 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 알츠하이머병, 전두측두엽 치매, 파킨슨병, 근위축 측삭 경화증, 또는 나수-하코라병으로부터 선택된 질환을 치료, 예방 또는 진단하는데 사용될 수 있다.
이들의 약리학적 프로파일로 인해, 본원에 기재된 hTREM2 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 CNS 관련 질환, PNS 관련 질환, 전신 염증 및 기타 염증과 관련된 질환, 화학 물질 남용으로 인한 통증 및 금단 증상과 같은 다양한 질환 또는 병태의 치료에 유용할 것이다. CNS에 관련된 질환 또는 장애에는 일반 불안 장애, 인지 장애, 학습 및 기억력 결핍 및 기능부전, 알츠하이머병(경도, 중등도 및 중증), 주의력 결핍 및 과잉행동 장애, 파킨슨병, 파킨슨병에서의 치매, 헌팅턴병, ALS, 프리온 신경변성 장애, 예컨대 크로츠펠트-야콥병 및 구루병, 질 드라 투렛 증후군, 정신병, 우울증 및 우울 장애, 조증, 조울증, 정신분열병, 정신분열병에서의 인지 결핍, 강박성 충동 장애, 공황 장애, 섭식 장애, 기면증, 통각, AIDS-치매, 노인성 치매, 노화에 관련된 경도 인지 장애(MCI), 노화 연관 기억력 장애, 자폐증, 읽기장애, 지연성 이상운동, 간질, 및 경련 장애, 외상 후 스트레스 장애, 일시적 무산소증, 가성치매, 생리-전 증후군, 후기 황체기 증후군, 만성 피로 증후군 및 시차가 포함된다.
본원에 기재된 hTREM2 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 특히 TREM2 또는 TREM2 수용체의 비정상적 또는 돌연변이된 변이체를 발현하는 세포의 광범위한 단백질분해 절단에 의해 매개되거나 이와 관련된 자가면역, 염증 또는 악성 장애를 치료, 예방 또는 진단하는데 적합하다. 자가면역 질병의 예에는 비제한적으로 관절염(예를 들어 류마티스 관절염, 만성 진행성 관절염 및 변형 관절염) 그리고 염증성 질환 및 뼈 손실이 관여되는 류마티스 질병을 포함하는 류마티스 질병, 염증통, 강직성 척추염을 포함하는 척추 관절병증, 라이터 증후군, 반응성 관절염, 건선 관절염, 및 장병원성 관절염, 과민증(기도 과민증 및 피부 과민증을 모두 포함함) 및 알러지가 포함된다. 자가면역 질환에는 자가면역 혈액 장애(예컨대 용혈성 빈혈, 재생불량성 빈혈, 진정 적혈구계 빈혈 및 특발성 혈소판감소증), 전신 홍반성 루푸스, 염증성 근육 장애, 다발연골염, 경화부종, 베게너 육아종증, 피부근육염, 만성 활성 간염, 중증 근무력증, 건선, 스티븐-존슨 증후군, 특발성 스프루, 내분비 눈병증, 그레이브스병, 사르코이드증, 다발성 경화증, 원발성 담관 간경화, 소아 당뇨병(I형 진성 당뇨병), 포도막염(전방 및 후방), 건성 각막결막염 및 봄철 각막결막염, 간질 폐 섬유증, 건선 관절염 및 사구체신염(예컨대 통풍, 랑게르한스 세포 조직구증, 특발성 신증후군 또는 최소 변화 신장병증을 포함하는 신증후군을 포함하거나 포함하지 않음), 종양, 피부 및 각막의 염증성 질병, 근육염, 뼈 임플란트의 이완, 대사 장애, 예컨대 죽상경화, 당뇨병, 및 이상지질혈증이 포함된다.
본원에 기재된 hTREM2 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 천식, 기관지염, 진폐증, 폐기종, 특발성 폐 섬유증 또는 COPD를 포함하는 기도의 다른 폐색성 또는 염증성 질환의 치료, 예방 또는 개선에 유용하다.
본원에 기재된 hTREM2 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 조혈 또는 간형성 악성 장애, 예컨대 급성 골수 백혈병, 만성 골수 백혈병, 골수증식성 장애, 골수형성이상 증후군, 다발 골수종, 발작성 야간 헤모글로빈뇨, 판코니 빈혈, 중증 지중해빈혈, 비스코트-올드리치 증후군, 적혈구포식성 림프조직구증식증을 치료하는데 사용될 수 있다.
본원에 기재된 hTREM2 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 비정상적인 TREM2 활성 및/또는 발현과 직접 또는 간접적으로 관련된 임의의 질환 또는 장애를 치료하는 데 사용될 수 있다. TREM2-관련 장애에는: 면역학적 장애, 특히 염증 장애가 관여되는 것(예컨대, 박테리아 감염, 진균 감염, 바이러스 감염, 원충 또는 다른 기생충 감염, 건선, 패혈증, 뇌 말라리아, 염증성 대장 질병, 관절염, 예컨대 류마티스성 관절염, 모낭염, 농가진, 육아종, 지질성 폐렴, 혈관염, 및 골관절염), 자가면역 장애(예컨대, 류마티스 관절염, 갑상샘염, 예컨대 하시모토 갑상샘염 및 그레이브스병, 인슐린-내성 당뇨병, 악성 빈혈, 애디슨병, 물집증, 백반증, 궤양성 장염, 전신 홍반성 루푸스(SLE), 쇼그렌 증후군, 다발성 경화증, 피부근육염, 혼합 연결 조직 질병, 피부경화증, 다발근육염, 이식 거부, 예컨대 동종이식 거부), T 세포 장애(예컨대, AIDS), 알러지성 염증 장애(예컨대, 피부 및/또는 점막 알러지, 예컨대 알러지성 비염, 천식, 건선), 신경학적 장애, 눈 장애, 태아 장애, 또는 비정상적인 TREM2 활성 및/또는 발현과 직접적으로 또는 간접적으로 연관되는 임의의 다른 장애(예컨대, 종양, 암, 백혈병, 골수 질병, 및 외상)가 포함된다.
일부 실시형태에서, TREM2-관련 장애는 천식, 뇌염, 염증성 대장 질병, 만성 폐색성 폐 질병(COPD), 알러지 장애, 패혈성 쇼크, 폐 섬유증, 미분화 척추관절병증, 미분화 관절병증, 관절염, 염증성 골용해, 또는 만성 바이러스성 또는 박테리아성 감염으로 일어나는 만성 염증으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, TREM2-관련 장애는 치매, 전두측두엽 치매, 알츠하이머병, 혈관성 치매, 혼합 치매, 크로츠펠트-야콥병, 정상압 수두증, 근위축 측삭 경화증, 헌팅턴병, 타우병증 질병, 나수-하코라병, 뇌졸중, 급성 외상, 만성 외상, 루푸스, 급성 및 만성 장염, 상처 치유, 크론병, 염증성 대장 질병, 궤양성 장염, 비만, 말라리아, 본태성 떨림, 중추 신경계 루푸스, 베체트병, 파킨슨병, 레위 소체를 갖는 치매, 다중 시스템 아트로피, 샤이-드래거 증후군, 진행성 핵상 마비, 피질 기저 신경절 변성, 급성 파종 뇌척수염, 육아종성 장애, 사르코이드증, 노화 질병, 발작, 척수 손상, 외상성 뇌 손상, 노화 관련 황반 변성, 녹내장, 색소 망막염, 망막 변성, 호흡기 감염, 패혈증, 눈 감염, 전신 감염, 루푸스, 관절염, 다발성 경화증, 낮은 뼈 밀도, 골다공증, 뼈형성, 골화성 질병, 뼈의 파제트병, 및 암으로부터 선택된다. 일부 바람직한 실시형태에서, TREM2-관련 장애는 알츠하이머병, 전두측두엽 치매, 파킨슨병, 근위축 측삭 경화증, 또는 나수-하코라병으로 구성된 목록으로부터 선택된다.
일부 바람직한 실시형태에서, TREM2-관련 장애는 치매, 전두측두엽 치매, 알츠하이머병, 나수-하코라병, 및 다발성 경화증으로부터 선택된다. 일부 바람직한 실시형태에서, TREM2-관련 장애는 치매, 예컨대 전두측두엽 치매, 알츠하이머병, 혈관성 치매, 의미적 치매, 또는 레비 소체를 갖는 치매이다. 더욱 바람직한 실시형태에서, TREM2-관련 장애는 알츠하이머병이다. 또 다른 바람직한 실시형태에서, 상기 장애는 파킨슨병이다.
인간 TREM2에 특이적으로 결합하는 항체 및 이의 항원-결합 단편
일 양태에서, 인간 TREM2 단백질의 IgSF 도메인("hTREM2 항체 또는 이의 항원-결합 단편")에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 예를 들어 단클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 본원에 제공된다. 이러한 항체 또는 항원-결합 단편은 세포 표면 상의 TREM2 단백질을 안정화시키고/시키거나 TREM2 단백질의 엑토도메인의 부분절단을 감소시킬 수 있다.
일부 실시형태에서, 본원에 제공된 hTREM2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 중쇄 CDR1(HCDR1), 중쇄 CDR2(HCDR2), 중쇄 CDR3(HCDR3), 및 경쇄 CDR1(LCDR1), 경쇄 CDR2(LCDR2), 및 경쇄 CDR3(LCDR3)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본원에 제공된 hTREM2 항체 또는 항원-결합 단편은 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 및 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본원에 제공된 hTREM2 항체 또는 항원-결합 단편은 전장 중쇄 서열(HC) 및 전장 경쇄 서열(LC)을 포함한다.
표 1에는 인간 TREM2 단백질에 특이적으로 결합하는 예시적인 TREM2 항체 또는 항원 결합 단편의 서열이 열거되어 있다. 본 출원의 본문의 전체에 걸쳐, 명세서의 본문(예를 들어 표 1)과 서열 목록 사이에 차이가 존재할 경우, 본 명세서의 본문이 우선한다.
[표 1]
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일부 실시형태에서, hTREM2 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 표 1에 기재된 임의의 VH 도메인의 아미노산 서열을 갖는 VH 도메인을 포함한다. 다른 적합한 hTREM2 항체 또는 이의 항원-결합 단편은, 돌연변이되었으나, 표 1에 기재된 서열에 표시된 VH 영역과 적어도 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 또는 99%의 VH 도메인 동일성을 갖는 아미노산을 포함할 수 있다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 인간 TREM2에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 또한 제공하며, 항체 또는 항체 단편(예를 들어, 항원-결합 단편)은 표 1에 열거된 HCDR 중 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는 VH CDR을 포함한다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 표 1에 열거된 HCDR 중 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 이상의 VH CDR을 포함하는(또는 대안적으로, 이들로 구성된), 인간 TREM2에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편(예를 들어, 항원-결합 단편)을 제공한다.
일부 실시형태에서, hTREM2 항체 또는 항체 단편(예를 들어, 항원 결합 단편)은 표 1에 기재된 임의의 VL 도메인의 아미노산 서열을 갖는 VL 도메인을 포함한다. 다른 적합한 항-인간 TREM2 항체 또는 항체 단편(예를 들어, 항원 결합 단편)은, 돌연변이되었으나, 표 1에 기재된 서열에 표시된 VL 영역과 적어도 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 또는 99%의 VL 도메인 동일성을 갖는 아미노산을 포함할 수 있다. 본 발명은 인간 TREM2에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편(예를 들어, 항원 결합 단편)을 또한 제공하며, 항체 또는 항체 단편(예를 들어, 항원 결합 단편)은 표 1에 열거된 LCDR 중 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는 VL CDR을 포함한다. 특히, 본 발명은 표 1에 열거된 LCDR 중 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는 1개, 2개, 3개 이상의 VL CDR을 포함하는(또는 대안적으로, 이들로 구성된), 인간 TREM2에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편(예를 들어, 항원 결합 단편)을 제공한다.
본원에 개시된 다른 항-인간 TREM2 항체 또는 항체 단편(예를 들어, 항원 결합 단편)은, 돌연변이되었으나, 표 1에 기재된 서열에 표시된 CDR 영역과 적어도 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 또는 99%의 CDR 영역 동일성을 갖는 아미노산을 포함한다. 일부 실시형태에서, 이는 표 1에 기재된 서열에서 표시된 CDR 영역과 비교할 때, CDR 영역에 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개 이하의 아미노산이 돌연변이된, 돌연변이 아미노산 서열들을 포함한다.
인간 TREM2에 특이적으로 결합하는 항체 및 이의 항원 결합 단편의 VH, VL, 전장 중쇄, 및 전장 경쇄를 코딩하는 핵산 서열, 예를 들어 표 1의 핵산 서열이 본원에서 또한 제공된다. 이러한 핵산 서열은 의도된 숙주 세포, 예를 들어 포유류 세포에서의 발현용으로 최적화될 수 있다.
본원에 개시된 다른 항-인간 TREM2 항체는, 아미노산 또는 아미노산을 코딩하는 핵산이 돌연변이되었으나, 표 1에 기재된 서열과 적어도 80, 85, 90 95, 96, 97, 98, 또는 99%의 동일성을 갖는 것들을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은, 표 1에 기재된 서열에 표시된 가변 영역과 비교할 때 1개, 2개, 3개, 4개, 또는 5개 이하의 아미노산이 가변 영역에서 돌연변이되었지만 실질적으로 동일한 치료 활성을 보유하는 돌연변이 아미노산 서열을 포함한다.
제공된 각각의 항체는 인간 TREM2에 결합하므로, VH, VL, 전장 경쇄, 및 전장 중쇄 서열(아미노산 서열 및 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열)은 "혼합 및 매칭"되어, 본원에 개시된 다른 TREM2-결합 항체를 생성할 수 있다. 이러한 "혼합 및 매칭된" TREM2-결합 항체는 당업계에 알려진 결합 분석법(예를 들어, ELISA, 실시예에 기재된 분석법)을 이용하여 테스트될 수 있다. 쇄들이 혼합 및 매칭되는 경우, 특정 VH/VL 쌍으로부터의 VH 서열은 구조적으로 유사한 VH 서열로 대체되어야 한다. 특정 전장 중쇄/전장 경쇄 쌍으로부터의 전장 중쇄 서열은 구조적으로 유사한 전장 중쇄 서열로 대체되어야 한다. 특정 VH/VL 쌍으로부터의 VL 서열은 구조적으로 유사한 VL 서열로 대체되어야 한다. 특정 전장 중쇄/전장 경쇄 쌍으로부터의 전장 경쇄 서열은 구조적으로 유사한 전장 경쇄 서열로 대체되어야 한다.
따라서, 일 실시형태에서, 본 발명은 서열 번호 13 및 50 중 어느 하나로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH); 및 서열 번호 24 및 61 중 어느 하나로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 갖는 단리된 단클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하며; 여기서 상기 항체는 인간 TREM2에 특이적으로 결합한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 (i) 서열 번호 15, 29, 33, 35, 37, 39, 52, 66, 70, 72, 74, 76 중 어느 하나로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 전장 중쇄(HC); 및 서열 번호 26 및 63 중 어느 하나로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 전장 경쇄(LC)를 갖는 단리된 단클론 항체; 또는 (ii) 이의 항원 결합 부분을 포함하는 기능성 단백질을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 표 1에 기재된 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3, 및 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3, 또는 이들의 조합을 포함하는 인간 TREM2-결합 항체 또는 이의 항체 단편을 제공한다. 항체의 HCDR1의 아미노산 서열은 서열 번호 4, 7, 8, 10, 41, 44, 45, 47에 나타나 있다. 항체의 HCDR2의 아미노산 서열은 서열 번호 5, 9, 11, 42, 46, 48에 나타나 있다. 항체의 HCDR3의 아미노산 서열은 서열 번호 6, 12, 43, 49에 나타나 있다. 항체의 LCDR1의 아미노산 서열은 서열 번호 17, 20, 23, 54, 57, 60에 나타나 있다. 항체의 LCDR2의 아미노산 서열은 서열 번호 18, 21, 55, 58에 나타나 있다. 항체의 LCDR3의 아미노산 서열은 서열 번호 19, 22, 56, 59, 56에 나타나 있다.
각각의 항체가 인간 TREM2에 결합하고 항원-결합 특이성이 주로 CDR1, CDR2, 및 CDR3 영역에 의해 제공됨을 고려하면, 각각의 항체는 본원에 개시된 다른 인간 TREM2-결합 분자를 생성하기 위해 VH CDR1, CDR2 및 CDR3과 VL CDR1, CDR2 및 CDR3을 함유해야 하지만, VH CDR1, CDR2 및 CDR3 서열과 VL CDR1, CDR2 및 CDR3 서열은 "혼합 및 매칭"될 수 있다(즉, 상이한 항체들로부터의 CDR들은 혼합 및 매칭될 수 있다). 이러한 "혼합 및 매칭된" TREM2-결합 항체는 당업계에 공지된 결합 검정법 및 실시예에 기재된 검정법(예컨대 ELISA)을 사용하여 시험될 수 있다. VH CDR 서열이 혼합 및 매칭되는 경우, 특정 VH 서열로부터의 CDR1, CDR2, 및/또는 CDR3 서열은 구조적으로 유사한 CDR 서열(들)로 대체되어야 한다. 마찬가지로, VL CDR 서열이 혼합 및 매칭되는 경우, 특정 VL 서열로부터의 CDR1, CDR2, 및/또는 CDR3 서열은 구조적으로 유사한 CDR 서열(들)로 대체되어야 한다. 본 발명의 단클론 항체에 대해 하나 이상의 VH 및/또는 VL CDR 영역 서열을 본원에 예시된 CDR 서열로부터의 구조적으로 유사한 서열로 치환함으로써 새로운 VH 및 VL 서열이 생성될 수 있음은 당업자에게 명백할 것이다.
따라서, 본 발명은 서열 번호 4, 7, 8, 10, 41, 44, 45, 47로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1; 서열 번호 5, 9, 11, 42, 46, 48로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2; 서열 번호 6, 12, 43, 49로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3; 서열 번호 17, 20, 23, 54, 57, 60으로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1; 서열 번호 18, 21, 55, 58로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2; 및 서열 번호 19, 22, 56, 59, 56으로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3을 포함하는 단리된 단클론 항체 또는 이의 항원 결합 영역을 제공하며, 항체는 인간 TREM2에 특이적으로 결합한다.
특정 실시형태에서, 인간 TREM2에 특이적으로 결합하는 항체는 표 1에 기재된 항체 또는 항체 단편(예를 들어, 항원 결합 단편)이다. 일부 실시형태에서, 인간 TREM2에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 영역은 서열 번호 4, 7, 8 또는 10의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역 1(HCDR1); 서열 번호 5, 9 또는 11의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역 2(HCDR2); 서열 번호 6 또는 12의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역 3(HCDR3); 서열 번호 17, 20, 또는 23의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역 1(LCDR1); 서열 번호 18 또는 21의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역 2(LCDR2); 및 서열 번호 19 또는 22의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역 3(LCDR3)을 포함한다.
일부 실시형태에서, 인간 TREM2에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 영역은 서열 번호 41, 44, 45 또는 47의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1; 서열 번호 42, 46, 또는 48의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2; 서열 번호 43 또는 49의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3; 서열 번호 54, 57, 또는 60의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1; 서열 번호 55 또는 58의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2; 및 서열 번호 56 또는 59의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함한다.
일부 실시형태에서, 인간 TREM2에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 영역은 서열 번호 13의 아미노산 서열(또는 이와 적어도 약 90%, 95%, 99% 이상 동일하고/하거나, 1개, 2개, 3개 이상의 치환, 삽입, 결실, 또는 변형을 갖는 서열)을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 서열 번호 24의 아미노산 서열(또는 이와 적어도 약 90%, 95%, 99% 이상 동일하고/하거나, 1개, 2개, 3개 이상의 치환, 삽입, 결실, 또는 변형을 갖는 서열)을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함한다.
일부 실시형태에서, 인간 TREM2에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 영역은 서열 번호 50의 아미노산 서열(또는 이와 적어도 약 90%, 95%, 99% 이상 동일하고/하거나, 1개, 2개, 3개 이상의 치환, 삽입, 결실, 또는 변형을 갖는 서열)을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 서열 번호 61의 아미노산 서열(또는 이와 적어도 약 90%, 95%, 99% 이상 동일하고/하거나, 1개, 2개, 3개 이상의 치환, 삽입, 결실, 또는 변형을 갖는 서열)을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함한다.
일부 실시형태에서, 인간 TREM2에 특이적으로 결합하는 항체는 서열 번호 15의 아미노산 서열(또는 이와 적어도 약 90%, 95%, 99% 이상 동일하고/하거나, 1개, 2개, 3개 이상의 치환, 삽입, 결실, 또는 변형을 갖는 서열)을 포함하는 중쇄, 및 서열 번호 26의 아미노산 서열(또는 이와 적어도 약 90%, 95%, 99% 이상 동일하고/하거나, 1개, 2개, 3개 이상의 치환, 삽입, 결실, 또는 변형을 갖는 서열)을 포함하는 경쇄를 포함한다.
일부 실시형태에서, 인간 TREM2에 특이적으로 결합하는 항체는 서열 번호 29의 아미노산 서열(또는 이와 적어도 약 90%, 95%, 99% 이상 동일하고/하거나, 1개, 2개, 3개 이상의 치환, 삽입, 결실, 또는 변형을 갖는 서열)을 포함하는 중쇄, 및 서열 번호 26의 아미노산 서열(또는 이와 적어도 약 90%, 95%, 99% 이상 동일하고/하거나, 1개, 2개, 3개 이상의 치환, 삽입, 결실, 또는 변형을 갖는 서열)을 포함하는 경쇄를 포함한다.
일부 실시형태에서, 인간 TREM2에 특이적으로 결합하는 항체는 서열 번호 33의 아미노산 서열(또는 이와 적어도 약 90%, 95%, 99% 이상 동일하고/하거나, 1개, 2개, 3개 이상의 치환, 삽입, 결실, 또는 변형을 갖는 서열)을 포함하는 중쇄, 및 서열 번호 26의 아미노산 서열(또는 이와 적어도 약 90%, 95%, 99% 이상 동일하고/하거나, 1개, 2개, 3개 이상의 치환, 삽입, 결실, 또는 변형을 갖는 서열)을 포함하는 경쇄를 포함한다.
일부 실시형태에서, 인간 TREM2에 특이적으로 결합하는 항체는 서열 번호 35의 아미노산 서열(또는 이와 적어도 약 90%, 95%, 99% 이상 동일하고/하거나, 1개, 2개, 3개 이상의 치환, 삽입, 결실, 또는 변형을 갖는 서열)을 포함하는 중쇄, 및 서열 번호 26의 아미노산 서열(또는 이와 적어도 약 90%, 95%, 99% 이상 동일하고/하거나, 1개, 2개, 3개 이상의 치환, 삽입, 결실, 또는 변형을 갖는 서열)을 포함하는 경쇄를 포함한다.
일부 실시형태에서, 인간 TREM2에 특이적으로 결합하는 항체는 서열 번호 37의 아미노산 서열(또는 이와 적어도 약 90%, 95%, 99% 이상 동일하고/하거나, 1개, 2개, 3개 이상의 치환, 삽입, 결실, 또는 변형을 갖는 서열)을 포함하는 중쇄, 및 서열 번호 26의 아미노산 서열(또는 이와 적어도 약 90%, 95%, 99% 이상 동일하고/하거나, 1개, 2개, 3개 이상의 치환, 삽입, 결실, 또는 변형을 갖는 서열)을 포함하는 경쇄를 포함한다.
일부 실시형태에서, 인간 TREM2에 특이적으로 결합하는 항체는 서열 번호 39의 아미노산 서열(또는 이와 적어도 약 90%, 95%, 99% 이상 동일하고/하거나, 1개, 2개, 3개 이상의 치환, 삽입, 결실, 또는 변형을 갖는 서열)을 포함하는 중쇄, 및 서열 번호 26의 아미노산 서열(또는 이와 적어도 약 90%, 95%, 99% 이상 동일하고/하거나, 1개, 2개, 3개 이상의 치환, 삽입, 결실, 또는 변형을 갖는 서열)을 포함하는 경쇄를 포함한다.
일부 실시형태에서, 인간 TREM2에 특이적으로 결합하는 항체는 서열 번호 52의 아미노산 서열(또는 이와 적어도 약 90%, 95%, 99% 이상 동일하고/하거나, 1개, 2개, 3개 이상의 치환, 삽입, 결실, 또는 변형을 갖는 서열)을 포함하는 중쇄, 및 서열 번호 63의 아미노산 서열(또는 이와 적어도 약 90%, 95%, 99% 이상 동일하고/하거나, 1개, 2개, 3개 이상의 치환, 삽입, 결실, 또는 변형을 갖는 서열)을 포함하는 경쇄를 포함한다.
일부 실시형태에서, 인간 TREM2에 특이적으로 결합하는 항체는 서열 번호 66의 아미노산 서열(또는 이와 적어도 약 90%, 95%, 99% 이상 동일하고/하거나, 1개, 2개, 3개 이상의 치환, 삽입, 결실, 또는 변형을 갖는 서열)을 포함하는 중쇄, 및 서열 번호 63의 아미노산 서열(또는 이와 적어도 약 90%, 95%, 99% 이상 동일하고/하거나, 1개, 2개, 3개 이상의 치환, 삽입, 결실, 또는 변형을 갖는 서열)을 포함하는 경쇄를 포함한다.
일부 실시형태에서, 인간 TREM2에 특이적으로 결합하는 항체는 서열 번호 70의 아미노산 서열(또는 이와 적어도 약 90%, 95%, 99% 이상 동일하고/하거나, 1개, 2개, 3개 이상의 치환, 삽입, 결실, 또는 변형을 갖는 서열)을 포함하는 중쇄, 및 서열 번호 63의 아미노산 서열(또는 이와 적어도 약 90%, 95%, 99% 이상 동일하고/하거나, 1개, 2개, 3개 이상의 치환, 삽입, 결실, 또는 변형을 갖는 서열)을 포함하는 경쇄를 포함한다.
일부 실시형태에서, 인간 TREM2에 특이적으로 결합하는 항체는 서열 번호 72의 아미노산 서열(또는 이와 적어도 약 90%, 95%, 99% 이상 동일하고/하거나, 1개, 2개, 3개 이상의 치환, 삽입, 결실, 또는 변형을 갖는 서열)을 포함하는 중쇄, 및 서열 번호 63의 아미노산 서열(또는 이와 적어도 약 90%, 95%, 99% 이상 동일하고/하거나, 1개, 2개, 3개 이상의 치환, 삽입, 결실, 또는 변형을 갖는 서열)을 포함하는 경쇄를 포함한다.
일부 실시형태에서, 인간 TREM2에 특이적으로 결합하는 항체는 서열 번호 74의 아미노산 서열(또는 이와 적어도 약 90%, 95%, 99% 이상 동일하고/하거나, 1개, 2개, 3개 이상의 치환, 삽입, 결실, 또는 변형을 갖는 서열)을 포함하는 중쇄, 및 서열 번호 63의 아미노산 서열(또는 이와 적어도 약 90%, 95%, 99% 이상 동일하고/하거나, 1개, 2개, 3개 이상의 치환, 삽입, 결실, 또는 변형을 갖는 서열)을 포함하는 경쇄를 포함한다.
일부 실시형태에서, 인간 TREM2에 특이적으로 결합하는 항체는 서열 번호 76의 아미노산 서열(또는 이와 적어도 약 90%, 95%, 99% 이상 동일하고/하거나, 1개, 2개, 3개 이상의 치환, 삽입, 결실, 또는 변형을 갖는 서열)을 포함하는 중쇄, 및 서열 번호 63의 아미노산 서열(또는 이와 적어도 약 90%, 95%, 99% 이상 동일하고/하거나, 1개, 2개, 3개 이상의 치환, 삽입, 결실, 또는 변형을 갖는 서열)을 포함하는 경쇄를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 발명은, 예를 들어 표면 플라즈몬 공명(SPR)으로 측정하는 경우 200 pM 미만의 해리 상수(KD), 예를 들어, 150 pM 미만, 120 pM 미만, 100 pM 미만, 90 pM 미만, 70 pM 미만, 50 pM 미만, 40 pM 미만, 30 pM 미만, 20 pM 미만, 또는 10 pM 미만의 KD로 TREM2 단백질의 IgSF 도메인에 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다. 일부 바람직한 실시형태에서, 본원에 제공된 항체 또는 항원-결합 단편은 50 pM 미만의 해리 상수(KD)로 TREM2 단백질의 IgSF 도메인에 결합한다. 일부 바람직한 실시형태에서, 본원에 제공된 항체 또는 항원-결합 단편은 5 pM 미만의 해리 상수(KD)로 TREM2 단백질의 IgSF 도메인에 결합한다.
항원 상의 목적하는 에피토프가 일단 결정되면, 예를 들어 본 발명에 기재된 기술을 이용하여 그 에피토프에 대한 항체를 생성할 수 있다. 대안적으로, 발견 과정 중에, 항체의 생성 및 특성화는 바람직한 에피토프에 대한 정보를 밝힐 수 있다. 이후 이 정보로부터, 동일한 에피토프에 결합하는 항체를 경쟁적으로 스크리닝할 수 있다. 이를 달성하기 위한 접근법은, 교차-경쟁 연구를 수행하여 서로 경쟁적으로 결합하는 항체, 예를 들어 항원에 결합하기 위해 경쟁하는 항체를 찾는 것이다. 항체들의 교차 경쟁을 기초로 하여 항체를 "비닝(binning)"하는 고처리량 방법은 국제 특허 출원 번호 WO 2003/48731에 기술되어 있다. 에피토프는 항체가 결합하는 잔기를 포함할 수 있다.
일반적으로, 특정 표적 항원에 특이적인 항체는, 단백질 및/또는 거대분자의 복합 혼합물 내의 표적 항원 상의 에피토프를 우선적으로 인식할 것이다.
에피토프를 포함하는 주어진 폴리펩타이드의 영역은 당업계에 잘 공지된 임의의 수의 에피토프 매핑 기술을 사용하여 식별될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66 (Glenn E. Morris, Ed., 1996, Humana Press, Totowa, N.J)]을 참조한다. 예를 들어, 선형 에피토프는 예를 들어, 고체 지지체 상에서 다수의 펩타이드들을 동시에 합성하고, 펩타이드를 여전히 지지체에 부착시킨 채 이러한 펩타이드를 항체와 반응시킴으로써 결정될 수 있으며, 상기 펩타이드는 단백질 분자의 일부에 상응한다. 이러한 기술은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어, 미국 특허 제4,708,871호; 문헌[Geysen et al., (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 8:3998-4002]; 문헌[Geysen et al., (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:78-182]; 문헌[Geysen et al., (1986) Mol. Immunol. 23:709-715]에 기재되어 있다. 이와 유사하게, 입체형태적 에피토프는 아미노산의 공간적 입체형태를 예를 들어, x-선 결정학 및 2차원 핵 자기 공명과 같은 것에 의해 결정함으로써 쉽게 식별된다. 예를 들어, 상기 문헌[Epitope Mapping Protocols]을 참조한다. 단백질의 항원 영역은 또한, 표준 항원성 및 친수도 도표(hydropathy plot), 예컨대 Oxford Molecular Group으로부터 입수가능한 Omiga 버전 1.0 소프트웨어 프로그램을 사용하여 계산된 것을 사용하여 식별될 수 있다. 이 컴퓨터 프로그램은 항원성 프로파일을 결정하기 위해 홉/우즈(Hopp/Woods) 방법을 이용하고(문헌[Hopp et al., (1981) Proc. Natl. Acad. Sci USA 78:3824-3828]); 친수도 도표를 위해서는 카이트/둘리틀(Kyte-Doolittle) 기술을 이용한다(문헌[Kyte et al., (1982) J. MoI. Biol. 157:105-132]). 일부 실시형태에서, 항-TREM2 항체는 인간 TREM2의 IgSF 도메인 내 에피토프에 특이적으로 결합한다. 예를 들어, 항-TREM2 항체는 서열 번호 1, 2, 또는 3 중 어느 하나의 아미노산 잔기 19 내지 132 내 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있다.
항체 분자는 다클론 또는 단클론 항체일 수 있다. 단클론 항체는 하이브리도마 기술에 의해, 또는 파지 디스플레이 또는 조합 방법과 같은 다른 방법들에 의해 제조될 수 있다.
항체를 생성하기 위한 파지 디스플레이 및 조합적 방법은 당업계에 공지되어 있다(예를 들어, Ladner 등의 미국 특허 제5,223,409호; Kang 등의 국제 공개 WO 92/18619; Dower 등의 국제 공개 WO 91/17271; Winter 등의 국제 공개 WO 92/20791; Markland 등의 국제 공개 WO 92/15679; Breitling 등의 국제 공개 WO 93/01288; McCafferty 등의 국제 공개 WO92/01047; Garrard 등의 국제 공개 WO 92/09690; Ladner 등의 국제 공개 WO90/02809; 문헌[Fuchs et al. (1991) Bio/Technology 9:1370-1372]; 문헌[Hay et al. (1992) Hum Antibod Hybridomas 3:81-85]; 문헌[Huse et al. (1989) Science 246:1275-1281]; 문헌[Griffths et al. (1993) EMBO J 12:725-734]; 문헌[Hawkins et al. (1992) J Mol Biol 226:889-896]; 문헌[Clackson et al. (1991) Nature 352:624-628]; 문헌[Gram et al. (1992) PNAS 89:3576-3580]; 문헌[Garrad et al. (1991) Bio/Technology 9:1373-1377]; 문헌[Hoogenboom et al. (1991) Nuc Acid Res 19:4133-4137]; 및 문헌[Barbas et al. (1991) PNAS 88:7978-7982]에 기재된 바와 같음).
일 실시형태에서, 항체는 인간 항체(예를 들어, 인간 면역글로불린 서열로부터 항체를 제조하기 위해 유전적으로 조작된 트랜스제닉(transgenic) 마우스에서 제조된 항체), 또는 비-인간 항체, 예를 들어 설치류(마우스 또는 래트), 염소, 영장류(예를 들어 원숭이), 또는 낙타 항체이다.
키메라 및/또는 인간화 항체는 비-인간 대상체에서 생성되거나 비-인간 항체 유전자의 발현으로부터 유래된 항체에 대한 인간 환자에 의한 면역 반응을 최소화하도록 조작될 수 있다. 키메라 항체는 비-인간 동물 항체 가변 영역 및 인간 항체 불변 영역을 포함한다. 이러한 항체는 원래의 단클론 항체의 에피토프 결합 특이성을 유지하지만, 인간에게 투여되는 경우 면역원성이 더 적을 수 있으므로 환자가 견딜 가능성이 더 크다. 예를 들어, 마우스 항체(예를 들어, 마우스 단클론 항체)의 경쇄(들)의 가변 영역 중 1개 또는 전부(예를 들어, 1개, 2개 또는 3개) 및/또는 중쇄(들)의 가변 영역 중 1개 또는 전부(예를 들어, 1개, 2개 또는 3개)는 각각이 인간 불변 영역, 예컨대, 제한 없이, IgG1 인간 불변 영역에 연결될 수 있다. 키메라 단클론 항체는 당업계에 공지된 재조합 DNA 기술로 생성될 수 있다. 예를 들어, 비-인간 항체 분자의 불변 영역을 코딩하는 유전자는 인간 불변 영역을 코딩하는 유전자로 치환될 수 있다(Robinson 등의 PCT 특허 출원 제PCT/US86/02269호; Akira 등의 유럽 특허 출원 제184,187호; 또는 Taniguchi, M.의 유럽 특허 출원 제171,496호 참조). 또한, 키메라 항체를 생성하는 데 사용될 수 있는 다른 적합한 기술이 예를 들어 미국 특허 제4,816,567호; 미국 특허 제4,978,775호; 미국 특허 제4,975,369호; 및 미국 특허 제4,816,397호에 기재되어 있다.
키메라 항체는 추가로, 항원 결합에 관여하지 않는 가변 영역의 부분을 인간 가변 영역으로부터의 등가의 부분으로 대체함으로써 "인간화"될 수 있다. 인간화 항체는 가변 영역 내에 하나 이상의 인간 프레임워크 영역을, 중쇄 및/또는 경쇄의 비-인간(예를 들어, 마우스, 래트, 또는 햄스터) 상보성 결정 영역(CDR)과 함께 포함한다. 일부 실시형태에서, 인간화 항체는 CDR 영역을 제외하고 완전히 인간인 서열을 포함한다. 인간화 항체는 전형적으로, 비-인간화 항체에 비해 인간에 대한 면역원성이 더 적고, 따라서 특정 상황에서 치료적 유익성을 제공한다. 인간화 TREM2 항체는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 생성될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Hwang et al., Methods 36:35, 2005]; 문헌[Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86:10029-10033, 1989]; 문헌[Jones et al., Nature 321:522-25, 1986]; 문헌[Riechmann et al., Nature 332:323-27, 1988]; 문헌[Verhoeyen et al., Science 239:1534-36, 1988]; 문헌[Orlandi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86:3833-3837, 1989]; 미국 특허 제5,225,539호; 미국 특허 제5,530,101호; 미국 특허 제5,585,089호; 미국 특허 제5,693,761호; 미국 특허 제5,693,762호; 및 미국 특허 제6,180,370호; 및 WO 90/07861을 참조한다.
인간 TREM2 항체는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 생성될 수 있다. 예를 들어, 휴머니어링(humaneering) 기술은 비-인간 항체를 조작된 인간 항체로 전환시키는 데 사용된다. 미국 특허 공개 제20050008625호에는 비-인간 항체의 결합 특징과 동일한 결합 특징을 유지하거나 비-인간 항체의 결합 특징에 비해 더 양호한 결합 특징을 제공하면서 항체에서 비-인간 항체 가변 영역을 인간 가변 영역으로 대체하기 위한 생체 내 방법이 기재되어 있다. 이러한 방법은 비-인간 기준 항체의 가변 영역을 완전 인간 항체로 에피토프-가이드 대체하는 것에 의존한다. 생성된 인간 항체는 일반적으로, 기준 비-인간 항체와 구조적으로 관련이 없지만, 기준 항체와 동일한 항원 상의 동일한 에피토프에 결합한다. 간략하게는, 일련의 에피토프-가이드 상보성 대체 접근법은, 항원에 대한 테스트 항체의 결합에 반응하는 리포터 시스템의 존재 하에, 제한된 양의 항원에 대한 결합에 대해 세포 내에서 "경쟁자"와 기준 항체("테스트 항체")의 다양한 하이브리드들의 라이브러리 사이에서 경쟁을 셋업(set up)함으로써 가능해진다. 경쟁자는 기준 항체 또는 이의 유도체, 예컨대 단쇄 Fv 단편일 수 있다. 경쟁자는 또한, 기준 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항원의 천연 또는 인공 리간드일 수 있다. 경쟁자의 유일한 요건은, 이러한 경쟁자가 기준 항체와 동일한 에피토프에 결합하고, 이러한 경쟁자가 항원 결합에 대하여 기준 항체와 경쟁하는 것이다. 테스트 항체는 비-인간 기준 항체로부터의 공통적인 하나의 항원-결합 V-영역, 및 다양한 공급원, 예컨대 인간 항체의 레퍼토리 라이브러리로부터 무작위로 선택된 다른 V-영역을 갖는다. 기준 항체로부터의 공통적인 V-영역은 가이드로서의 역할을 하며, 테스트 항체를 항원 상의 동일한 에피토프 상에 동일한 배향에서 위치시켜, 선택이 기준 항체에 대한 최고 항원-결합 충실도(fidelity) 쪽으로 편향된다.
많은 유형의 리포터 시스템들이 테스트 항체와 항원 사이의 요망되는 상호작용을 검출하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 상보적 리포터 단편들은 항원 및 테스트 항체에 각각 연결될 수 있으며, 따라서 단편 상보성에 의한 리포터 활성화는 테스트 항체가 항원에 결합할 때만 발생한다. 테스트 항체- 및 항원-리포터 단편 융합이 경쟁자와 공동-발현되는 경우, 리포터 활성화는 경쟁자와 경쟁하는 테스트 항체의 능력에 의존적이게 되고, 이러한 능력은 항원에 대한 테스트 항체의 친화도에 비례한다. 사용될 수 있는 다른 리포터 시스템은 미국 특허 출원 번호 10/208,730(공개 20030198971)에 개시된 바와 같은 자동-억제성 리포터 재활성화 시스템(RAIR) 또는 미국 특허 출원 번호 10/076,845(공개 20030157579)에 개시된 경쟁적 활성화 시스템을 포함한다.
일련의 에피토프-가이드 상보성 대체 시스템을 이용하여, 경쟁자, 항원 및 리포터 구성요소와 함께 단일 테스트 항체를 발현하는 세포를 식별하기 위해 선발이 이루어진다. 이들 세포에서, 각각의 테스트 항체는 제한된 양의 항원에 결합하기 위해 경쟁자와 일대일로 경쟁한다. 리포터의 활성은 테스트 항체에 결합된 항원의 양에 비례하며, 이는 다시 항원에 대한 테스트 항체의 친화도 및 테스트 항체의 안정성에 비례한다. 테스트 항체는 처음에, 테스트 항체로서 발현되는 경우, 기준 항체의 활성에 대한 이들 테스트 항체의 활성을 기준으로 하여 선택된다. 제1 라운드의 선택의 결과는 "하이브리드" 항체들의 세트이며, 이들 항체 각각은 기준 항체로부터의 동일한 비-인간 V-영역 및 라이브러리로부터의 인간 V-영역으로 구성되고, 이들 항체 각각은 항원 상의, 기준 항체와 동일한 에피토프에 결합한다. 제1 라운드에서 선택된 하이브리드 항체 중 하나 이상은 기준 항체에 비견되거나 더 높은, 항원에 대한 친화도를 가질 것이다.
제2 V-영역 대체 단계에서, 제1 단계에서 선택된 인간 V-영역은 동족 인간 V-영역의 다양한 라이브러리를 이용한 잔여 비-인간 기준 항체 V-영역의 인간 대체물의 선택을 위한 가이드로서 사용된다. 제1 라운드에서 선택된 하이브리드 항체는 또한, 제2 라운드의 선택을 위한 경쟁자로서 사용될 수 있다. 제2 라운드의 선택 결과는, 기준 항체와 구조적으로 상이하지만 동일한 항원에의 결합에 대해 기준 항체와 경쟁하는 완전 인간 항체들의 세트이다. 선택된 인간 항체들 중 일부는 기준 항체와 동일한 항원 상의 동일한 에피토프에 결합한다. 이들 선택된 인간 항체들 중에서, 하나 이상은 동일한 에피토프에, 기준 항체의 친화도에 비견되거나 이보다 더 높은 친화도로 결합한다.
일부 실시형태에서, 본 발명은 인간 TREM2 단백질에 결합하고 TREM2-의존성 생리적 활성을 촉진하는, 예를 들어 (예를 들어 hM2A 대식세포 내, 또는 인간 iPS-유래 미세아교세포-유사 세포 내, 또는 뇌의 미세아교세포/대식세포 내) 식세포작용을 향상시키고, 인간 iPS-유래 미세아교세포-유사 세포의 화학주성을 강화시키고, 인간 단핵구 세포주 내 NFAT-기반 리포터 유전자 활성을 증가시키거나, hM2A 대식세포 내 Syk 인산화를 증가시키는 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다. 이러한 촉진 및/또는 향상은 예를 들어 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 또는 적어도 90%일 수 있다.
조작된 및 변형된 항체
본 발명의 항체는 변형 항체를 조작하기 위한 시작 물질로서 표 1에 기재된 하나 이상의 VH 및/또는 VL 서열을 갖는 항체를 사용하여 제조될 수 있으며, 이러한 변형된 항체는 시작 항체로부터 변경된 특성을 가질 수 있다. 항체는 1개 또는 2개의 가변 영역(즉, VH 및/또는 VL), 예를 들어 하나 이상의 CDR 영역 내 및/또는 하나 이상의 프레임워크 영역 내의 하나 이상의 잔기를 변형시킴으로써 조작될 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 항체는 예를 들어 항체의 이펙터 기능(들)을 변경하기 위해, 불변 영역(들) 내의 잔기를 변형함으로써 조작될 수 있다.
수행될 수 있는 가변 영역 조작의 하나의 유형은 CDR 이식이다. 항체는 주로 6개의 중쇄 및 경쇄 상보성 결정 영역(CDR)에 위치한 아미노산 잔기를 통해 표적 항원과 상호작용한다. 이러한 이유에서, CDR 내의 아미노산 서열은 CDR 외부의 서열에서보다 개별 항체들 간에 더 다양하다. CDR 서열이 대부분의 항체-항원 상호작용을 책임지기 때문에, 상이한 특성을 갖는 상이한 항체로부터의 프레임워크 서열에 이식된 특이적 천연 발생 항체로부터의 CDR 서열을 포함하는 발현 벡터를 구축함으로써 특이적 천연 발생 항체의 특성을 모방하는 재조합 항체를 발현시키는 것이 가능하다(예컨대 문헌[Riechmann, L. et al., 1998 Nature 332:323-327]; 문헌[Jones, P. et al., 1986 Nature 321:522-525]; 문헌[Queen, C. et al., 1989 Proc. Natl. Acad., U.S.A. 86:10029-10033]; 미국 특허 제5,225,539호(Winter), 및 미국 특허 제5,530,101호; 미국 특허 제5,585,089호; 미국 특허 제5,693,762호 및 미국 특허 제6,180,370호(Queen 등) 참조).
이러한 프레임워크 서열은 생식세포 계열 항체 유전자 서열 또는 재배열된 항체 서열을 포함하는 공개 DNA 데이터베이스 또는 공개된 참고문헌으로부터 획득될 수 있다. 예를 들어, 인간 중쇄 및 경쇄 가변 영역 유전자에 대한 생식세포 계열 DNA 서열은 "VBase" 인간 생식세포 계열 서열 데이터베이스(인터넷 www.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase 상에서 입수가능함)와, 문헌[Kabat, E. A., et al., 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242]; 문헌[Tomlinson, I. M., et al., 1992 J. fol. Biol. 227:776-798]; 및 문헌[Cox, J. P. L. et al., 1994 Eur. J Immunol. 24:827-836]에서 찾아볼 수 있으며; 이들 각각의 내용은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다. 예를 들어, 인간 중쇄 및 경쇄 가변 영역 유전자에 대한 생식세포 계열 DNA 서열 및 재배열된 항체의 서열은 "IMGT" 데이터베이스에서 찾을 수 있다(인터넷 www.imgt.org에서 입수가능함; 문헌[Lefranc, M.P. et al., 1999 Nucleic Acids Res. 27:209-212] 참조; 이들 각각의 내용은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다.)
본 발명의 항체 및 이의 항원-결합 단편에 사용하기 위한 프레임워크 서열의 일례는, 본 발명의 선별된 항체 및 이의 항원-결합 단편에 의해 사용된 프레임워크 서열, 예를 들어, 컨센서스(consensus) 서열 및/또는 본 발명의 모노클로날 항체에 의해 사용되는 프레임워크 서열과 구조적으로 유사한 것들이다. VH CDR1, 2 및 3 서열 및 VL CDR1, 2 및 3 서열은, 프레임워크 서열이 유래되는 생식세포 계열 면역글로불린 유전자에서 발견되는 것과 동일한 서열을 갖는 프레임워크 영역에 이식될 수 있거나, CDR 서열은 생식세포 계열 서열과 비교하여 하나 이상의 돌연변이를 함유하는 프레임워크 영역에 이식될 수 있다. 예를 들어, 특정한 경우, 항체의 항원 결합 능력을 유지시키거나 증강시키기 위해 프레임워크 영역 내의 잔기를 돌연변이화하는 것이 유익한 것으로 밝혀졌다(예를 들어 미국 특허 제5,530,101호; 미국 특허 제5,585,089호; 미국 특허 제5,693,762호 및 미국 특허 제6,180,370호(Queen 등) 참조).
또 다른 유형의 가변 영역 변형은 VH 및/또는 VL CDR1, CDR2 및/또는 CDR3 영역 내의 아미노산 잔기를 돌연변이화하여, 이로써 관심 항체의 하나 이상의 결합 특성(예컨대 친화도)을 향상시키는 것이며, 이는 "친화도 성숙"으로 공지되어 있다. 부위-특이적 돌연변이생성 또는 PCR-매개 돌연변이생성은 돌연변이(들)를 도입하기 위해 수행될 수 있고, 항체 결합 또는 다른 관심 기능적 특성에 미치는 효과는 본원에 기재되고 실시예에 제공된 바와 같이 시험관 내 또는 생체 내 검정법에서 평가될 수 있다. 보존적 변형(상기 논의된 바와 같음)이 도입될 수 있다. 돌연변이는 아미노산 치환, 부가 또는 결실일 수 있다. 더욱이, 전형적으로 CDR 영역 내의 1, 2, 3, 4 또는 5개 이하의 잔기가 변경된다.
광범위하게 다양한 항체/면역글로불린 프레임워크 또는 스캐폴드는, 생성된 폴리펩타이드가 TREM2에 특이적으로 결합하는 적어도 하나의 결합 영역을 포함하는 한, 이용될 수 있다. 이러한 프레임워크 또는 스캐폴드는 5개의 주요 이디오타입(idiotype)의 인간 면역글로불린, 이의 항원 결합 단편을 포함하고, 바람직하게는 인간화된 특징들을 갖는, 다른 동물 종의 면역글로불린을 포함한다. 낙타과에서 확인된 것들과 같은 단일 중쇄 항체가 이러한 측면에서 특히 관심의 대상이다. 신규 프레임워크, 스캐폴드 및 단편은 당업자에 의해 계속해서 발견 및 개발되고 있다.
일 양태에서, 본 발명은, 본 발명의 CDR이 이식될 수 있는 비-면역글로불린 스캐폴드를 사용하여 비-면역글로불린-기반 항체를 생성하는 방법에 관한 것이다. 공지된 또는 미래의 비-면역글로불린 프레임워크 및 스캐폴드는, 이들이 표적 TREM2 단백질에 특이적인 결합 영역을 포함하는 한, 이용될 수 있다. 공지된 비-면역글로불린 프레임워크 또는 스캐폴드는 피브로넥틴(Compound Therapeutics, Inc., 미국 매사추세츠주 월섬 소재), 안키린(Molecular Partners AG, 스위스 취리히 소재), 도메인 항체(Domantis, Ltd.(미국 매사추세츠주 캠브리지 소재) 및 Ablynx nv, 벨기에 쯔위나드 소재)), 리포칼린(Pieris Proteolab AG, 독일 프라이징 소재), 소형 모듈 면역-의약품(Trubion Pharmaceuticals Inc., 미국 워싱턴주 시애틀 소재), 맥시바디(maxybody)(Avidia, Inc., 미국 캘리포니아주 마운틴 뷰 소재), 단백질 A(Affibody AG, 스웨덴 소재) 및 아필린(affilin)(감마-크리스탈린 또는 유비퀴틴)(SciI Proteins GmbH, 독일 할레 소재)을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
피브로넥틴 스캐폴드는 피브로넥틴 III형 도메인(예컨대 제10 모듈의 피브로넥틴 III형(10 Fn3 도메인))을 기반으로 한다. 피브로넥틴 III형 도메인은 2개의 베타 시트 사이에 분포되고 그 자체가 서로에 대해 패킹되어 단백질 코어를 형성하는 7 또는 8개의 베타 가닥을 가지고, 추가로, 베타 가닥을 서로 연결하고 용매 노출되는 루프(CDR과 유사함)를 함유한다. 베타 시트 샌드위치의 각각의 모서리에는 이러한 루프가 적어도 3개 존재하며, 여기서, 모서리는 베타 가닥의 방향에 수직인 단백질의 경계이다(미국 특허 제6,818,418호 참조). 이들 피브로넥틴-기반 스캐폴드는, 전체 폴드(overall fold)가 낙타 및 라마 IgG에서 전체 항원 인식 단위를 포함하는 최소 기능성 항체 단편인 중쇄의 가변 영역과 밀접하게 관련되어 있지만, 면역글로불린이 아니다. 이러한 구조때문에, 비-면역글로불린 항체는 성질 및 친화도 면에서 항체와 유사한 항원 결합 특성을 모방한다. 이들 스캐폴드는, 생체 내에서 항체의 친화도 성숙 과정과 유사한 루프 무작위화 및 시험관 내 셔플링 전략에 사용될 수 있다. 이들 피브로넥틴-기반 분자는, 분자의 루프 영역이 표준 클로닝 기술을 사용하여 본 발명의 CDR로 대체될 수 있는 스캐폴드로서 사용될 수 있다.
낙타과 항체
신세계 구성원, 예컨대 라마 종(라마 팍코스(Lama paccos), 라마 글라마(Lama glama) 및 라마 비쿠그나(Lama vicugna))을 포함하여 낙타 및 단봉 낙타(카멜루스 박트리아누스(Camelus bactrianus) 및 카멜루스 드로마데리우스(Calelus dromaderius)) 과(family)의 구성원들로부터 수득된 항체 단백질은 크기, 구조적 복합성 및 인간 대상체에 대한 항원성에 관하여 특성화되어 왔다. 자연에서 발견되는 바와 같은 이러한 포유류 과로부터의 소정의 IgG 항체에는 경쇄가 결여되어 있고, 따라서 이러한 항체는, 다른 동물로부터의 항체의 경우 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 갖는 전형적인 4개 사슬 4차 구조와는 구조적으로 다르다. PCT/EP93/02214(1994년 3월 3일에 공개된 WO 94/04678)를 참조한다.
VHH로서 식별된 작은 단일 가변 도메인인 낙타과 항체의 영역은, 표적에 대해 고 친화도를 갖는 작은 단백질을 수득하기 위해 유전자 조작에 의해 수득될 수 있으며, 이는 "낙타과 나노바디"로 공지된 저분자량 중량 항체-유래 단백질을 초래한다. 미국 특허 제5,759,808호(1998년 6월 2일자로 허여됨)를 참조하며; 또한 문헌[Stijlemans, B. et al., 2004 J Biol Chem 279: 1256-1261]; 문헌[Dumoulin, M. et al., 2003 Nature 424: 783-788]; 문헌[Pleschberger, M. et al. 2003 Bioconjugate Chem 14: 440-448]; 문헌[Cortez-Retamozo, V. et al. 2002 Int J Cancer 89: 456-62]; 및 문헌[Lauwereys, M. et al. 1998 EMBO J 17: 3512-3520]을 참조한다. 낙타과 항체 및 항체 단편의 조작된 라이브러리는 예를 들어 벨기에 헨트 소재의 Ablynx로부터 구매가능하다. 비-인간 기원의 다른 항체 및 이의 항원 결합 단편과 같이, 낙타과 항체의 아미노산 서열은 재조합적으로 변경되어 인간 서열을 더 밀접하게 닮은 서열이 수득될 수 있으며, 즉, 나노바디가 "인간화"될 수 있다. 따라서, 인간에 대한 낙타과 항체의 자연적으로 낮은 항원성이 더 감소될 수 있다.
낙타과 나노바디는 인간 IgG 분자의 분자량의 대략 1/10의 분자량을 가지며, 단백질은 단지 수 나노미터의 물리적 직경을 가진다. 작은 크기로 인한 하나의 결과는, 더 큰 항체 단백질에게는 기능적으로 보이지 않는 항원 부위에 결합하는 낙타과 나노바디의 능력으로서, 즉, 낙타과 나노바디는, 그렇지 않으면 은폐적인 항원을 고전적인 면역학적 기술을 사용하여 검출하는 시약으로서, 및 가능한 치료제로서 유용하다. 따라서, 작은 크기로 인한 또 다른 결과는, 낙타과 나노바디가 표적 단백질의 홈 또는 좁은 틈에서 특이적 부위에 결합한 결과 억제할 수 있고, 따라서, 고전적인 항체의 기능보다는 고전적인 저분자량 약물의 기능과 더 밀접하게 닮은 능력에서 역할을 할 수 있다는 것이다.
저분자량 및 소형 크기는 추가로, 극도로 내열성이며, 극도의 pH 및 단백질용해적 분해에 대해 안정하고, 항원성이 낮은 낙타과 나노바디를 초래한다. 또 다른 결과는, 낙타과 나노바디가 용이하게 순환계로부터 조직 내로 이동하며, 심지어 혈액-뇌 장벽을 가로지르고, 신경 조직에 영향을 주는 장애를 치료할 수 있다는 것이다. 나아가, 나노바디는 혈액-뇌 장벽을 가로질러 약물 수송을 용이하게 할 수 있다. 2004년 8월 19일에 공개된 미국 특허 출원 제20040161738호를 참조한다. 인간에 대한 낮은 항원성과 조합된 이들 특징은 큰 치료적 잠재성을 나타낸다. 나아가, 이들 분자는 원핵 세포, 예컨대 이. 콜라이에서 완전히 발현될 수 있고, 박테리오파지와 융합 단백질로서 발현되고, 기능적이다.
따라서, 본 발명의 특징은 TREM2에 대해 고 친화도를 갖는 낙타과 항체 또는 나노바디이다. 본원의 일 실시형태에서, 낙타과 항체 또는 나노바디는 낙타과 동물에서 천연적으로 생성되며, 즉, 다른 항체에 대해 본원에 기재된 기술을 사용하여 TREM2 또는 이의 펩타이드 단편으로 면역화한 후 낙타과에 의해 생성된다. 대안적으로, TREM2-결합 낙타과 나노바디는 조작되며, 즉, 예를 들어 본원의 실시예에 기재된 바와 같이 표적으로서 TREM2를 이용하여 패닝 절차(panning procedure)를 사용하여 적절하게 돌연변이유발된 낙타과 나노바디 단백질을 디스플레이하는 파지 라이브러리로부터의 선발에 의해 생성된다. 조작된 나노바디는 추가로, 수령자(recipient) 대상체에서 45분 내지 2주의 반감기를 갖도록 유전자 조작에 의해 맞춤화될 수 있다. 구체적인 실시형태에서, 낙타과 항체 또는 나노바디는 예를 들어 PCT/EP93/02214에 기재된 바와 같이 본 발명의 인간 항체의 중쇄 또는 경쇄의 CDR 서열을 나노바디 또는 단일 도메인 항체 프레임워크 서열 내로 이식함으로써 수득된다.
이중특이성 분자 및 다가 항체
또 다른 양태에서, 본 발명은 본 발명의 TREM2-결합 항체 또는 이의 단편을 포함하는 이중특이적 또는 다중특이적 분자를 특징으로 한다. 본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 영역은 또 다른 기능성 분자, 예를 들어 또 다른 펩타이드 또는 단백질(예컨대 수용체에 대한 또 다른 항체 또는 리간드)로 유도체화되거나 이에 연결되어, 적어도 2개의 상이한 결합 부위 또는 표적 분자에 결합하는 이중특이성 분자를 생성할 수 있다. 본 발명의 항체는 사실상, 1개 초과의 다른 기능성 분자로 유도체화되거나 이에 연결되어, 2개 초과의 상이한 결합 부위 및/또는 표적 분자에 결합하는 다중특이성 분자를 생성할 수 있으며; 이러한 다중특이성 분자 또한, 본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "이중특이성 분자"에 포함시키고자 한다. 본 발명의 이중특이성 분자를 생성하기 위해, 본 발명의 항체는 하나 이상의 다른 결합 분자, 예컨대 또 다른 항체, 항체 단편, 펩타이드 또는 결합 모방체에 기능적으로(예컨대 화학적 커플링, 유전자 융합, 비공유 결합 또는 다른 방법에 의해) 연결되어서, 이중특이성 분자가 생성되게 할 수 있다.
따라서, 본 발명은 TREM2에 대한 적어도 하나의 제1 결합 특이성 및 제2 표적 에피토프에 대한 제2 결합 특이성을 포함하는 이중특이성 분자를 포함한다. 예를 들어, 제2 표적 에피토프는 제1 표적 에피토프와 상이한, TREM2의 또 다른 에피토프이다.
추가로, 이중특이성 분자가 다중특이성인 본 발명에 있어서, 이러한 분자는 제1 및 제2 표적 에피토프 외에도 제3 결합 특이성을 추가로 포함할 수 있다.
일 실시형태에서, 본 발명의 이중특이성 분자는 적어도 하나의 항체 또는 이의 항체 단편(예를 들어 Fab, Fab', F(ab')2, Fv 또는 단쇄 Fv를 포함함)을 결합 특이성으로서 포함한다. 항체는 또한, 경쇄 또는 중쇄 이량체 또는 이의 임의의 최소 단편, 예컨대 Fv 또는 단쇄 구축물(Ladner 등의 미국 특허 제4,946,778호에 기재된 바와 같음)일 수 있다.
디아바디는 2가, 이중특이성 분자이며, 이 분자에서 VH 및 VL 도메인은 단일 폴리펩타이드 사슬 상에서 발현되고, 동일한 사슬 상의 상기 2개의 도메인들 사이에서 쌍을 형성하기에는 너무 짧은 링커에 의해 연결된다. VH 및 VL 도메인은 또 다른 사슬의 상보적 도메인과 쌍을 이루며, 이로써, 2개의 항원 결합 부위를 생성한다(예컨대 문헌[Holliger et al., 1993 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448]; 문헌[Poijak et al., 1994 Structure 2:1121-1123] 참조). 디아바디는 동일한 세포 내에서 구조 VHA-VLB 및 VHB-VLA(VH-VL 배열) 또는 VLA-VHB 및 VLB-VHA(VL-VH 배열)를 갖는 2개의 폴리펩타이드 사슬을 발현시킴으로써 제조될 수 있다. 이들 대부분의 디아바디는 박테리아에서 가용성 형태로 발현될 수 있다. 단쇄 디아바디(scDb)는 2개의 디아바디-형성 폴리펩타이드 사슬들을 대략 15개 아미노산 잔기의 링커를 이용하여 연결함으로써 제조된다(문헌[Holliger and Winter, 1997 Cancer Immunol. Immunother., 45 (3-4):128-30]; 문헌[Wu et al., 1996 Immunotechnology, 2 (1):21-36] 참조). scDb는 박테리아 내에서 가용성, 활성 단량체 형태로 발현될 수 있다(문헌[Holliger and Winter, 1997 Cancer Immunol. Immunother., 45 (34): 128-30]; 문헌[Wu et al., 1996 Immunotechnology, 2 (1):21-36]; 문헌[Pluckthun and Pack, 1997 Immunotechnology, 3 (2): 83-105]; 문헌[Ridgway et al., 1996 Protein Eng., 9 (7):617-21] 참조). 디아바디는 Fc에 융합되어, "디-디아바디"를 생성할 수 있다(문헌[Lu et al., 2004 J. Biol. Chem., 279 (4):2856-65] 참조).
본 발명의 이중특이성 분자에 이용될 수 있는 다른 항체로는 뮤린, 키메라 및 인간화 단클론 항체가 있다.
본 발명의 이중특이성 분자는 구성 결합 특이성들을 본원에 공지된 방법을 사용하여 콘쥬게이션함으로써 제조될 수 있다. 예를 들어, 이중특이성 분자의 각각의 결합 특이성은 개별적으로 생성된 다음, 서로 콘쥬게이션될 수 있다. 결합 특이성이 단백질 또는 펩타이드인 경우, 여러 가지 커플링제 또는 가교제가 공유 콘쥬게이션에 사용될 수 있다. 가교제의 예는 단백질 A, 카르보디이미드, N-숙신이미딜-5-아세틸-티오아세테이트(SATA), 5,5'-디티오비스(2-니트로벤조산)(DTNB), o-페닐렌디말레이미드(oPDM), N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트(SPDP) 및 술포숙신이미딜 4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카르복실레이트(술포-SMCC)를 포함한다(예를 들어, 문헌[Karpovsky et al., 1984 J. Exp. Med. 160:1686]; 문헌[Liu, M A et al., 1985 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:8648] 참조). 다른 방법은 문헌[Paulus, 1985 Behring Ins. Mitt. No. 78, 118-132]; 문헌[Brennan et al., 1985 Science 229:81-83], 및 문헌[Glennie et al., 1987 J. Immunol. 139: 2367-2375]에 기재된 것을 포함한다. 콘쥬게이팅제는 SATA 및 술포-SMCC이며, 이들은 둘 다 Pierce Chemical Co.(미국 일리노이주 록포드 소재)로부터 입수가능하다.
결합 특이성이 항체인 경우, 이들은 2개의 중쇄의 C-말단 힌지의 술프히드릴 결합에 의해 콘쥬게이션될 수 있다. 특정 실시형태에서, 힌지 영역은 콘쥬게이션 이전에 홀수, 예를 들어 1개의 술프히드릴 잔기를 함유하도록 변형된다.
대안적으로, 2개의 결합 특이성들은 동일한 벡터 내에서 코딩되고, 동일한 숙주 세포 내에서 발현 및 어셈블리될 수 있다. 이러한 방법은 특히, 이중특이성 분자가 mAb X mAb, mAb X Fab, Fab X F (ab')2 또는 리간드 X Fab 융합 단백질인 경우, 유용하다. 본 발명의 이중특이성 분자는 1개의 단쇄 항체 및 결합 결정부위를 포함하는 단쇄 분자 또는 2개의 결합 결정부위들을 포함하는 단쇄 이중특이성 분자일 수 있다. 이중특이성 분자는 적어도 2개의 단쇄 분자를 포함할 수 있다. 이중특이성 분자의 제조 방법은 예를 들어 미국 특허 제5,260,203호; 미국 특허 제5,455,030호; 미국 특허 제4,881,175호; 미국 특허 제5,132,405호; 미국 특허 제5,091,513호; 미국 특허 제5,476,786호; 미국 특허 제5,013,653호; 미국 특허 제5,258,498호; 및 미국 특허 제5,482,858호에 기재되어 있다.
이중특이성 분자가 그의 특이적 표적에 결합하는 것은 예를 들어 효소-결합 면역흡착 분석(ELISA), 방사면역분석(REA), FACS 분석, 생물검정(bioassay)(예를 들어, 성장 억제) 또는 웨스턴 블롯(Western Blot) 분석에 의해 확인될 수 있다. 이들 분석법 각각은 일반적으로 관심 복합체에 특이적인 표지된 시약(예를 들어, 항체)을 사용하여 특정 관심 단백질-항체 복합체의 존재를 검출한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 TREM2에 결합하는 본 발명의 항체 및 이의 항원 결합 단편의 적어도 2개의 동일한 또는 상이한 항원-결합 부분을 포함하는 다가 화합물을 제공한다. 항원 결합 부분들은 단백질 융합 또는 공유 또는 비공유 연결부를 통해 함께 연결될 수 있다. 대안적으로, 연결 방법은 이중특이성 분자에 대해 기재되어 왔다. 4가 화합물은 예를 들어, 본 발명의 항체 및 이의 항원 결합 단편을, 본 발명의 항체 및 이의 항원 결합 단편의 불변 영역, 예를 들어 Fc 또는 힌지 영역에 결합하는 항체 및 이의 항원 결합 단편과 가교함으로써 수득될 수 있다.
삼량체화 도메인은 예를 들어 유럽 특허 제1 012 280B1호에 기재되어 있다. 오량체화 모듈은 예를 들어 PCT/EP97/05897에 기재되어 있다.
일부 실시형태에서, TREM2-결합 분자는 TREM2 및 DAP12 둘 다에 결합하는 이중특이적 항체이다. 일부 실시형태에서, TREM2-결합 분자는 제1 항원 및 제2 항원을 인식하는 이중특이적 항체이다. 일부 실시형태에서, 제1 항원은 인간 TREM2 또는 이의 천연 발생 변이체이다. 일부 실시형태에서, 제2 항원은 인간 DAP12 또는 이의 천연 발생 변이체이다. 일부 실시형태에서, 제2 항원은 인간 DAP10 또는 Siglec(시알산-결합 면역글로불린-형 렉틴)이다. 일부 실시형태에서, 제2 항원은 아밀로이드 베타 또는 이의 단편, Tau, IAPP, 알파-시누클레인, TDP-43, FUS 단백질, 프리온 단백질, PrPSc, 헌팅틴, 칼시토닌, 수퍼옥사이드 디스뮤타제, 아탁신, Lewy 바디, 심방 나트륨이뇨 인자, 섬 아밀로이드 폴리펩타이드, 인슐린, 아포지단백질 AI, 혈청 아밀로이드 A, 메딘, 프로락틴, 트랜스티레틴, 리소자임, 베타 2 마이크로글로불린, 겔솔린, 케라토에피텔린, 시스타틴, 면역글로불린 경쇄 AL, S-IBM 단백질, 반복-관련 비-ATG(RAN) 번역 산물, 디펩타이드 반복(DPR) 펩타이드, 글리신-알라닌(GA) 반복 펩타이드, 글리신-프롤린(GP) 반복 펩타이드, 글리신-아르기닌(GR) 반복 펩타이드, 프롤린-알라닌(PA) 반복 펩타이드, 및 프롤린-아르기닌(PR) 반복 펩타이드로부터 선택되는 질환-야기 단백질이다. 일부 실시형태에서, 제2 항원은 트랜스페린 수용체, 인슐린 수용체, 인슐린 유사 성장 인자 수용체, LRP-1, 및 LRP1로부터 선택되는 혈액 뇌 장벽 표적화 단백질; 또는 면역 세포상에서 발현되는 리간드 및/또는 단백질이고, 여기서 리간드 및/또는 단백질은: CD40, OX40, ICOS, CD28, CD137/4-1BB, CD27, GITR, PD-L1, CTLA4, PD-L2, PD-1, B7-H3, B7-H4, HVEM, BTLA, KIR, GAL9, TIM3, A2AR, LAG, 및 포스파티딜세린으로 구성된 군으로부터 선택된다. 대안적으로, 제2 항원은 하나 이상의 종양 세포 상에서 발현되는 단백질일 수 있다.
반감기가 연장된 항체
본 발명은 TREM2에 특이적으로 결합하며, 생체 내에서 연장된 반감기를 갖는 항체를 제공한다.
많은 요인들이 생체 내 단백질의 반감기에 영향을 미칠 수 있다. 예를 들어, 신장 여과, 간에서의 대사, 단백질용해 효소(프로테아제)에 의한 분해 및 면역원성 반응(예컨대 항체에 의한 단백질 중화 및 대식세포 및 수지상 세포에 의한 섭취). 본 발명의 항체 및 이의 항원 결합 단편의 반감기를 연장하기 위해 여러 가지 전략들이 사용될 수 있다. 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜(PEG), reCODE PEG, 항체 스캐폴드, 폴리시알산(PSA), 히드록시에틸 전분(HES), 알부민-결합 리간드 및 탄수화물 차폐물에 대한 화학적 연결에 의해; 혈청 단백질, 예컨대 알부민, IgG, FcRn 및 트랜스페링(transferring)에 결합하는 단백질에 대한 유전자 융합에 의해; 혈청 단백질에 결합하는 다른 결합 모이어티, 예컨대 나노바디, Fab, DARPin, 아비머, 아피바디 및 안티칼린에 대한 커플링(유전적으로 또는 화학적으로)에 의해; rPEG, 알부민, 알부민의 도메인, 알부민-결합 단백질 및 Fc에 대한 유전자 융합에 의해; 또는 나노담체, 서방성 제형 또는 의료 장치 내로의 혼입에 의해.
생체 내에서 항체의 혈청 순환을 연장하기 위해, 불활성 중합체 분자, 예컨대 고분자량 PEG가, 항체의 N- 또는 C-말단에 대한 PEG의 부위-특이적 콘쥬게이션을 통해, 또는 라이신 잔기 상에 존재하는 엡실론-아미노기를 통해, 다기능성 링커와 함께 또는 없이 항체 또는 이의 단편에 부착될 수 있다. 항체를 페길화하기 위해, 항체, 이의 항원 결합 단편을 전형적으로, 하나 이상의 폴리에틸렌 글리콜(PEG)이 항체 또는 항체 단편에 부착되게 되는 조건 하에, PEG, 예컨대 PEG의 반응성 에스테르 또는 알데히드 유도체와 반응시킨다. 페길화는 반응성 PEG 분자(또는 유사한 반응성 수용성 중합체)를 이용하여 아실화 반응 또는 알킬화 반응에 의해 수행될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이 용어 "폴리에틸렌 글리콜"은, 다른 단백질을 유도체화하는 데 사용되어 온 임의의 형태의 PEG, 예컨대 모노(C1-C10)알콕시- 또는 아릴옥시-폴리에틸렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜-말레이미드를 포함하고자 한다. 일 실시형태에서, 페길화되는 항체는 비글리코실화된 항체이다. 생물학적 활성의 최소 손실을 초래하는 선형 또는 분지형 중합체 유도체화가 사용될 것이다. 콘쥬게이션 정도는, 항체에 대한 PEG 분자의 적당한 콘쥬게이션을 보장하기 위해 SDS-PAGE 및 질량 분광법에 의해 면밀히 모니터링될 수 있다. 미반응된 PEG는 크기-배제 또는 이온-교환 크로마토그래피에 의해 항체-PEG 콘쥬게이트로부터 분리될 수 있다. PEG 유도체화된 항체는 당업자에게 잘 공지된 방법을 사용하여, 예를 들어 본원에 기재된 면역검정에 의해, 결합 활성뿐만 아니라 생체 내 효능에 대해 시험될 수 있다. 단백질의 페길화 방법은 당업계에 공지되어 있고, 본 발명의 항체 및 이의 항원 결합 단편에 적용될 수 있다. 예를 들어, Nishimura 등의 EP 0 154 316 및 Ishikawa 등의 EP 0 401 384 참조.
다른 변형된 페길화 기술은, 화학적으로 특정된 측쇄를 tRNA 신테타아제(synthetase) 및 tRNA를 포함하는 재구성된 시스템을 통해 생합성 단백질 내로 혼입하는 화학적 직교성 지향성 조작 기술의 재구성(reconstituting chemically orthogonal directed engineering technology)(ReCODE PEG)을 포함한다. 이러한 기술은 이. 콜라이, 효모 및 포유류 세포 내의 생합성 단백질 내로 30개 초과의 새로운 아미노산이 혼입되게 한다. tRNA는 앰버 코돈이 위치하는 임의의 장소에 규범적인(normative) 아미노산을 혼입하여, 앰버를 정지 코돈으로부터, 화학적으로 특정된 아미노산의 혼입을 신호화하는 것으로 전환시킨다.
재조합 페길화 기술(rPEG)이 또한, 혈청 반감기 연장에 사용될 수 있다. 이러한 기술은 300 내지 600개 아미노산의 비구조화된 단백질 테일을 기존의 제약적 단백질에 유전적으로 융합시키는 것을 수반한다. 이러한 비구조화된 단백질 사슬의 겉보기 분자량이 이의 실제 분자량보다 약 15배 더 크기 때문에, 단백질의 혈청 반감기가 크게 증가된다. 화학적 콘쥬게이션 및 재정제(repurification)를 필요로 하는 전통적인 페길화와는 대조적으로, 본 제조 공정은 크게 간소화되고, 생성물은 균질하다.
폴리시알화는 치료적 펩타이드 및 단백질의 활성 수명을 연장하고 안정성을 향상시키기 위해 천연 중합체 폴리시알산(PSA)을 사용하는 또 다른 기술이다. PSA는 시알산 중합체(당)이다. 폴리시알산은 단백질 및 치료적 펩타이드 약물 전달에 사용되는 경우, 콘쥬게이션시에 보호적 미세환경을 제공한다. PSA는 순환계에서 치료 단백질의 활성 수명을 증가시키고, 이러한 단백질이 면역계에 의해 인식되는 것을 방지한다. PSA 중합체는 인체 내에서 천연적으로 발견된다. 이러한 PSA는 이들의 벽을 PSA로 코팅하기 위해 수백만년에 걸쳐 진화한 소정의 박테리아에 의해 채택되었다. 그 후에, 이들 천연적으로 폴리시알화된 박테리아는 분자 모방 덕분에, 신체의 방어 시스템을 포장(foil)할 수 있었다. 자연의 궁극적인 잠행(stealth) 기술인 PSA는 이러한 박테리아로부터 대량으로 및 예정된 물리적 특징을 갖고, 쉽게 제조될 수 있다. 박테리아 PSA는 단백질에 커플링된 경우에조차, 이러한 박테리아 PSA가 인체 내의 PSA와 화학적으로 동일하기 때문에 완전히 비면역원성이다.
또 다른 기술은 항체에 연결된 히드록시에틸 전분("HES") 유도체의 사용을 포함한다. HES는 찰옥수수 전분으로부터 유래된 변형된 천연 중합체이고, 신체의 효소에 의해 대사될 수 있다. HES 용액은 통상, 부족 혈액 용적을 치환하고 혈액의 유동학적 특성을 개선시키기 위해 투여된다. 항체의 헤실화(hesylation)는 분자의 안정성의 증가와, 신장 청소율(renal clearance)의 감소에 의해 순환 반감기를 연장시킬 수 있고, 이는 증가된 생물학적 활성을 초래한다. 상이한 매개변수들, 예컨대 HES의 분자량을 다르게 함으로써, 광범위한 HES 항체 콘쥬게이트들이 맞춤화될 수 있다.
생체 내에서 증가된 반감기를 갖는 항체는 또한, 하나 이상의 아미노산 변형(즉, 치환, 삽입 또는 결실)을 IgG 불변 도메인 또는 이의 FcRn 결합 단편(바람직하게는 Fc 또는 힌지 Fc 도메인 단편) 내로 도입하여 발생될 수 있다. 예를 들어, 국제 공개 WO 98/23289; 국제 공개 WO 97/34631; 및 미국 특허 제6,277,375호를 참조한다.
나아가, 항체는, 항체 또는 항체 단편을 생체 내에서 더 안정하게 만들거나 생체 내에서 더 긴 반감기를 갖기 위해 알부민에 콘쥬게이션될 수 있다. 상기 기술은 당업계에 잘 공지되어 있으며, 예를 들어, 국제 공개 WO 93/15199, WO 93/15200 및 WO 01/77137; 및 유럽 특허 EP 413,622를 참조한다.
반감기를 증가시키기 위한 전략은 특히, 나노바디, 피브로넥틴-기반 바인더(binder), 및 증가된 생체 내 반감기가 요망되는 다른 항체 또는 단백질에 유용하다.
항체 콘쥬게이트
본 발명은 융합 단백질을 생성하기 위해, 이종성 단백질 또는 폴리펩타이드(또는 이의 항원-결합 단편, 바람직하게는 적어도 10, 적어도 20, 적어도 30, 적어도 40, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90 또는 적어도 100개 아미노산의 폴리펩타이드)에 재조합적으로 융합되거나 화학적으로 콘쥬게이션된(공유 및 비-공유 콘쥬게이션 둘 다를 포함) 인간 TREM2의 IgSF 도메인에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다. 특히, 본 발명은 본원에 기재된 항체의 항원-결합 단편(예를 들어, Fab 단편, Fd 단편, Fv 단편, F(ab)2 단편, VH 도메인, VH CDR, VL 도메인 또는 VL CDR) 및 이종성 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드를 포함하는 융합 단백질을 제공한다. 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드를 항체 또는 항체 단편에 융합시키거나 콘쥬게이션시키는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 미국 특허 제5,336,603호, 미국 특허 제5,622,929호, 미국 특허 제5,359,046호, 미국 특허 제5,349,053호, 미국 특허 제5,447,851호 및 미국 특허 제5,112,946호; 유럽 특허 EP 307,434 및 EP 367,166; 국제 공개 WO 96/04388 및 WO 91/06570; 문헌[Ashkenazi et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 10535-10539]; 문헌[Zheng et al., 1995, J. Immunol. 154:5590-5600]; 및 문헌[Vil et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:11337-11341]을 참조한다.
추가의 융합 단백질은 유전자-셔플링, 모티프-셔플링, 엑손-셔플링 및/또는 코돈-셔플링("DNA 셔플링"으로 총칭됨) 기술을 통해 생성될 수 있다. DNA 셔플링은 본 발명의 항체 및 이의 항원 결합 단편의 활성을 변경시키기 위해 이용될 수 있다(예컨대 더 높은 친화도 및 더 낮은 해리 속도를 갖는 항체 및 이의 항원 결합 단편). 일반적으로, 미국 특허 제5,605,793호, 미국 특허 제5,811,238호, 미국 특허 제5,830,721호, 미국 특허 제5,834,252호, 및 미국 특허 제5,837,458호; 문헌[Patten et al., 1997, Curr. Opinion Biotechnol. 8:724-33]; 문헌[Harayama, 1998, Trends Biotechnol. 16 (2):76-82]; 문헌[Hansson, et al., 1999, J. Mol. Biol. 287:265-76; 및 문헌[Lorenzo and Blasco, 1998, Biotechniques 24 (2):308-313]을 참조한다(이들 특허 및 공개는 각각 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함됨). 항체 및 이의 항원 결합 단편 또는 코딩된 항체 및 이의 항원 결합 단편은 재조합 이전에, 오류-유발 PCR, 무작위 뉴클레오타이드 삽입 또는 다른 방법에 의해 무작위 돌연변이유발 처리됨으로써 변경될 수 있다. TREM2의 IgSF 영역에 특이적으로 결합하는 항체, 이의 항원-결합 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 하나 이상의 이종성 분자의 하나 이상의 구성성분, 모티프, 섹션, 파트, 도메인, 단편 등과 재조합될 수 있다.
더욱이, 항체 및 이의 항원 결합 단편은 정제를 용이하게 하기 위한 펩타이드와 같은 마커 서열에의 융합이 가능할 수 있다. 일 실시형태에서, 마커 아미노산 서열은 헥사-히스티딘 펩타이드, 예컨대 pQE 벡터에 제공된 태그(QIAGEN, Inc., 미국 91311 캘리포니아주 채츠워스 이튼 애비뉴 9259)이며, 이들 중 많은 것이 구매가능하다. 예를 들어, 문헌[Gentz et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:821-824]에 기재된 바와 같이, 헥사-히스티딘은 융합 단백질의 편리한 정제를 제공한다. 정제에 유용한 다른 펩타이드 태그는, 인플루엔자 헤마글루티닌 단백질로부터 유래된 에피토프에 상응하는 헤마글루티닌("HA") 태그(문헌[Wilson et al., 1984, Cell 37:767]) 및 "FLAG" 태그(문헌[Hopp et al., Bio/Technology 6 (1988): 1204-1210])를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
일 실시형태에서, 본 발명의 항체 및 이의 항원-결합 단편은 진단제 또는 검출가능 제제에 콘쥬게이션된다. 이러한 항체는 임상 테스트 절차의 일부로서 질환 또는 장애의 발병, 발달, 진행 및/또는 중증도를 모니터링하거나 전망(prognose)하는 데, 예컨대 특정 요법의 효능을 결정하는 데 유용할 수 있다. 이러한 진단 및 검출은 항체를, 비제한적으로 다양한 효소들, 예컨대 비제한적으로, 서양고추냉이 퍼옥시다아제, 알칼리 포스파타아제, 베타-갈락토시다아제 또는 아세틸콜린에스테라아제; 보결 분자단(prosthetic group), 예컨대 비제한적으로, 스트렙타비딘/비오틴 및 아비딘/비오틴; 형광 물질, 예컨대 비제한적으로, 움벨리페론(umbelliferone), 플루오레세인, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민, 디클로로트리아지닐아민 플루오레세인, 단실 클로라이드 또는 피코에리트린; 발광 물질, 예컨대 비제한적으로, 루미놀; 생체발광 물질, 예컨대 비제한적으로, 루시퍼라아제, 루시페린 및 에쿼린(aequorin); 방사성 물질, 예컨대 비제한적으로, 요오드(131I, 125I, 123I 및 121I), 탄소(14C), 황(35S), 트리튬(3H), 인듐(115In, 113In, 112In 및 111In), 테크네튬(99Tc), 탈륨(201Ti), 갈륨(68Ga, 67Ga), 팔라듐(103Pd), 몰리브덴(99Mo), 제논(133Xe), 불소(18F), 153Sm, 177Lu, 159Gd, 149 Pm, 140La, 175Yb, 166Ho, 90Y, 47Sc, 186Re, 188Re, 142Pr, 105Rh, 97Ru, 68Ge, 57Co, 65Zn, 85Sr, 32P, 153Gd, 169Yb, 51Cr, 54Mn, 75Se, 113Sn 및 117Tin; 및 다양한 양전자 방사 단층 촬영을 사용하는 양전자 방출 금속 및 비방사성 상자성 금속 이온을 포함하는 검출가능한 성분에 커플링함으로써 달성될 수 있다.
또한, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 치료적 모이어티 또는 약물 모이어티에 콘쥬게이션될 수 있다. 치료적 모이어티 또는 약물 모이어티는 고전적인 화학적 치료제로 한정되는 것으로 해석되어서는 안 된다. 예를 들어, 약물 모이어티는 요망되는 생물학적 활성을 갖는 단백질, 펩타이드 또는 폴리펩타이드일 수 있다. 이러한 단백질은 예를 들어, 독소, 예컨대 아브린(abrin), 리신(ricin) A, 슈도모나스 외독소, 콜레라 독소 또는 디프테리아 독소; 단백질, 예컨대 종양 괴사 인자, 알파-인터페론, 베타-인터페론, 신경 성장 인자, 혈소판-유래 성장 인자, 조직 플라스미노겐 활성화제, 아폽토시스 제제, 항-혈관형성 제제; 또는 생물학적 반응 조절제, 예컨대 림포카인을 포함할 수 있다.
더욱이, 항체는 치료적 모이어티, 예컨대 방사성 금속 이온, 예컨대 알파-이미터, 예컨대 213Bi, 또는 비제한적으로, 131In, 131LU, 131Y, 131Ho, 131Sm을 포함하는 방사성금속 이온을 폴리펩타이드에 콘쥬게이션시키는 데 유용한 거대환식(macrocyclic) 킬레이터에 콘쥬게이션될 수 있다. 일 실시형태에서, 거대환식 킬레이터는 링커 분자를 통해 항체에 부착될 수 있는 1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-N,N',N'',N'''-테트라아세트산(DOTA)이다. 이러한 링커 분자는 당업계에 일반적으로 공지되어 있고, 각각 그 전체가 참고로 포함된 문헌[Denardo et al., 1998, Clin Cancer Res. 4 (10):2483-90]; 문헌[Peterson et al., 1999, Bioconjug. Chem. 10 (4):553-7]; 및 문헌[Zimmerman et al., 1999, Nucl. Med. Biol. 26 (8):943-50]에 기재되어 있다.
치료적 모이어티를 항체에 접합시키는 기술은 당업계에 잘 공지되어 있으며, 예를 들어, 문헌[Amon et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985)]; 문헌[Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery", in Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et al. (eds.), pp. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987)]; 문헌[Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", in Monoclonal Antibodies 84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), pp. 475-506 (1985)]; 문헌["Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), pp. 303-16 (Academic Press 1985)], 및 문헌[Thorpe et al., 1982, Immunol. Rev. 62:119-58]을 참조한다.
항체는 또한, 표적 항원의 면역분석 또는 정제에 특히 유용한 고체 지지체에 부착될 수 있다. 이러한 고체 지지체는 유리, 셀룰로오스, 폴리아크릴아미드, 나일론, 폴리스티렌, 폴리비닐 클로라이드 또는 폴리프로필렌을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
항체를 인코딩하는 핵산
본원에 개시된 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 코딩하는 핵산이 또한 본원에 제공된다. 이러한 핵산은 본원에 개시된 hTREM2 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 절편 또는 도메인을 포함하는 폴리펩타이드를 코딩할 수 있다. 이러한 핵산 또는 폴리뉴클레오타이드는 본원에 개시된 hTREM2 항체의 중쇄 또는 경쇄로부터의, 적어도 하나의 CDR 영역, 일반적으로 모든 3개의 CDR 영역을 코딩할 수 있다. 이러한 핵산 또는 폴리뉴클레오타이드는 본원에 개시된 hTREM2 항체의 중쇄 및/또는 경쇄의 가변 영역 서열의 전부 또는 실질적으로 전부를 또한 코딩할 수 있다. 이러한 핵산 또는 폴리뉴클레오타이드는 또한 항체의 가변 영역 및 불변 영역 둘 다를 코딩할 수 있다. 유전적 코드의 축퇴성 때문에, 여러 가지 핵산 서열들은 각각의 면역글로불린 아미노산 서열을 코딩할 것이다. 예를 들어, 본 발명은 본원에 개시된 하나 이상의 항체들로부터 선택되는 hTREM2 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 각각 인코딩하는 제1 및 제2 핵산을 특징으로 한다. 핵산은 표 1에 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 실질적으로 동일한 서열(예컨대 이와 적어도 약 85%, 90%, 95%, 또는 99% 서열 동일성을 갖거나, 표 1에 나타낸 서열과 3, 6, 15, 30, 또는 45개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 서열)을 포함할 수 있다. 핵산은 표 1에 나타낸 바와 같은 하나 초과의 뉴클레오타이드 서열(예를 들어 경쇄 가변 도메인 서열 및 중쇄 가변 도메인 서열, 또는 예를 들어, 경쇄 서열 또는 중쇄 서열), 또는 이와 실질적으로 동일한 서열(예컨대 이와 적어도 약 85%, 90%, 95%, 또는 99% 서열 동일성을 갖거나, 표 1에 나타낸 서열과 3, 6, 15, 30, 또는 45개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 서열)을 포함할 수 있다.
소정 실시형태에서, 핵산은 표 1에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역으로부터의 적어도 1개, 2개, 또는 3개의 CDR 또는 초가변 루프를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 실질적으로 상동성인 서열(예컨대 이와 적어도 약 85%, 90%, 95%, 또는 99% 서열 동일성을 갖고/갖거나 하나 이상의 치환, 예컨대 보존 치환을 갖는 서열)을 포함할 수 있다. 다른 실시형태에서, 핵산은 표 1에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역으로부터의 적어도 1개, 2개, 또는 3개의 CDR, 또는 초가변 루프를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 실질적으로 상동성인 서열(예컨대 이와 적어도 약 85%, 90%, 95%, 또는 99% 서열 동일성을 갖고/갖거나 하나 이상의 치환, 예컨대 보존 치환을 갖는 서열)을 포함할 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 핵산은 표 1에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 중쇄 및 경쇄 가변 영역으로부터의 적어도 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 또는 6개의 CDR, 또는 초가변 루프를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 실질적으로 상동성인 서열(예컨대 이와 적어도 약 85%, 90%, 95%, 또는 99% 서열 동일성을 갖고/갖거나 하나 이상의 치환, 예컨대 보존 치환을 갖는 서열)을 포함할 수 있다.
소정 실시형태에서, 핵산은 표 1에 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열을 갖는 중쇄 가변 영역으로부터의 적어도 1개, 2개, 또는 3개의 CDR 또는 초가변 루프를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열, 이와 실질적으로 상동성인 서열(예컨대 이와 적어도 약 85%, 90%, 95%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 서열)을 포함할 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 핵산은 표 1에 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열을 갖는 경쇄 가변 영역으로부터의 적어도 1개, 2개, 또는 3개의 CDR 또는 초가변 루프를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 실질적으로 상동성인 서열(예컨대 이와 적어도 약 85%, 90%, 95%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 서열)을 포함할 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 핵산은 표 1에 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열을 갖는 중쇄 및 경쇄 가변 영역으로부터의 적어도 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 또는 6개의 CDR 또는 초가변 루프를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 실질적으로 상동성인 서열(예컨대 이와 적어도 약 85%, 90%, 95%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 서열)을 포함할 수 있다.
이 폴리뉴클레오타이드 서열들은 드 노보(de novo) 합성(예를 들어, 고상 DNA 합성)에 의해, 또는 hTREM2 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 코딩하는 기존의 서열의 PCR 돌연변이유발에 의해 생성될 수 있다. 핵산의 직접적인 화학적 합성은 당업계에 공지된 방법, 예컨대 문헌[Narang et al., 1979, Meth. Enzymol. 68:90]의 포스포트리에스테르 방법; 문헌[Brown et al., Meth. Enzymol. 68:109, 1979]의 포스포디에스테르 방법; 문헌[Beaucage et al., Tetra. Lett., 22:1859, 1981]의 디에틸포스포르아미다이트 방법; 및 미국 특허 제4,458,066호의 고체 지지체 방법에 의해 달성될 수 있다. PCR에 의해 폴리뉴클레오타이드 서열에 돌연변이를 도입하는 것은, 예를 들어, 문헌[PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification, H. A. Erlich (Ed.), Freeman Press, NY, N.Y., 1992]; 문헌[PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Innis et al. (Ed.), Academic Press, San Diego, Calif., 1990]; 문헌[Mattila et al., Nucleic Acids Res. 19:967, 1991]; 및 문헌[Eckert et al., PCR Methods and Applications 1:17, 1991]에 기재된 바와 같이 수행될 수 있다.
본원에 개시된 hTREM2 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 절편 또는 도메인을 포함하는 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터(예를 들어, 발현 벡터)가 또한 본원에 제공된다. 이러한 벡터는 예를 들어, 생체 외 세포에서 또는 생체 내 세포에서, 예를 들어 유기체내 관심 조직 또는 조직들에서 hTREM2 항체 또는 항원-결합 단편(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같음)을 발현 및/또는 생산하거나, 이의 발현에 영향을 미치도록 사용될 수 있다. hTREM2 항체들 또는 이의 결합 단편들을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 발현시키기 위해 다양한 발현 벡터가 사용될 수 있다. 바이러스 기반 발현 벡터와 비바이러스 발현 벡터 둘 다가 세포, 예를 들어 포유동물 세포에서 항체들 또는 이의 단편들을 생산하기 위해 사용될 수 있다. 비-바이러스 벡터 및 시스템은, 전형적으로 단백질 또는 RNA를 발현시키기 위한 발현 카세트와 함께 플라스미드, 에피솜 벡터, 및 인간 인공 염색체(예를 들어, 문헌[Harrington et al., Nat Genet. 15:345, 1997] 참조)를 포함한다.). 이러한 비-바이러스 벡터는 예를 들어 지질(예를 들어, 리포펙타민), 전기천공, 기계적 세포막 왜곡 등을 사용하여 당 업계에 공지된 형질감염 또는 형질도입 방법을 사용하여 관심 세포로 전달될 수 있다. 용어 "발현 벡터"는 요망되는 코딩 서열이 삽입될 수 있는 캐리어 핵산 분자로서, 상기 코딩 서열이 발현될 수 있는 세포 내로의 도입을 위한, 캐리어 핵산 분자를 지칭한다. 벡터는 DNA 벡터, RNA 벡터, 플라스미드, 코스미드, 또는 바이러스 벡터, 또는 인공 염색체일 수 있다(예컨대, 문헌[Harrington et al., Nat Genet 15:345, 1997] 참조). 예를 들어, 포유류(예컨대 인간) 세포에서 hTREM2 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 발현에 유용한 비-바이러스 벡터는 pThioHis A, B 및 C, pcDNA3.1/His, pEBVHis A, B 및 C(Invitrogen, 미국 캘리포니아주 샌디에고 소재), MPSV 벡터, 및 단백질 발현용의 당업계에 공지된 수많은 다른 벡터들을 포함한다. 예를 들어, 한 클래스의 벡터는 동물 바이러스, 예컨대 소 유두종 바이러스, 폴리오마 바이러스, 아데노바이러스, 백시니아 바이러스, 바큘로바이러스, 레트로바이러스(라우스 육종 바이러스, MMTV 또는 MOMLV) 또는 SV40 바이러스로부터 유래되는 DNA 요소를 이용한다. 또 다른 클래스의 벡터는 RNA 바이러스, 예컨대 셈리키 포레스트(Semliki Forest) 바이러스, 동부 말 뇌염(Eastern Equine Encephalitis) 바이러스 및 플라비바이러스로부터 유래되는 RNA 요소를 이용한다. 유용한 바이러스 벡터는 하기 바이러스 중 어느 하나를 기반으로 하는 벡터를 포함한다: 레트로바이러스(예를 들어, 렌티바이러스), 렌티바이러스 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스, 헤르페스 바이러스(예를 들어, 단순 포진 바이러스(HSV)), SV40을 기반으로 하는 벡터, 유두종 바이러스, HBP 엡스타인 바(Epstein Barr) 바이러스, 백시니아 바이러스, 신비스(Sinbis) 바이러스, 인플루엔자 바이러스, 레오바이러스, 뉴캐슬병 바이러스(NDV), 홍역 바이러스, 수포성 구내염 바이러스(VSV), 파보바이러스, 폴리오바이러스, 폭스바이러스, 세네카 밸리(Seneca Valley) 바이러스, 콕사키바이러스, 엔테로바이러스, 점액종 바이러스, 마라바 바이러스, 또는 셈리키 포레스트 바이러스(SFV). 상기 문헌[Brent et al.]; 문헌[Smith, Annu. Rev. Microbiol. 49:807, 1995]; 및 문헌[Rosenfeld et al., Cell 68:143, 1992]을 참조한다.
일부 실시형태에서, 벡터는 레트로바이러스 벡터이다. 일부 실시형태에서, 벡터는 렌티바이러스 벡터이다. 레트로바이러스, 예컨대 렌티바이러스로부터 유래된 벡터는 딸세포에서의 이식유전자의 장기간의 안정적인 통합 및 이의 증식을 허용하기 때문에 장기적인 유전자 전달을 달성하기에 적합한 도구이다. 렌티바이러스 벡터는 비-증식 세포, 예컨대 간세포의 형질도입을 가능하게 할 수 있다는 점에서 종양-레트로바이러스, 예컨대 뮤린 백혈병 바이러스로부터 유래된 벡터에 비해 추가의 장점을 갖는다. 렌티바이러스 벡터는 또한 낮은 면역원성의 추가의 장점을 갖는다. 레트로바이러스 벡터는 또한 예를 들어 감마레트로바이러스 벡터일 수 있다. 감마레트로바이러스 벡터에는, 예를 들어 프로모터, 패키징 신호(Ψ), 프라이머 결합 부위(PBS), 하나 이상(예를 들어 2개)의 장형 말단 반복체(LTR), 및 관심 이식유전자, 예를 들어 CAR을 코딩하는 유전자가 포함될 수 있다. 감마레트로바이러스 벡터에는 바이러스 구조 유전자, 예컨대 gag, pol, 및 env가 결여되어 있을 수 있다. 예시적인 감마레트로바이러스 벡터에는 뮤린 백혈병 바이러스(MLV), 비장-병소 형성 바이러스(SFFV), 및 골수증식성 육종 바이러스(MPSV), 및 이로부터 유래된 벡터가 포함된다. 다른 감마레트로바이러스 벡터가, 예를 들어 문헌[Tobias Maetzig et al., "Gammaretroviral Vectors: Biology, Technology and Application" Viruses. 2011 Jun; 3(6): 677-713]에 기재되어 있다.
일부 실시형태에서, 벡터는 아데노-관련 바이러스(AAV) 벡터, 예컨대, 재조합 AAV(rAAV) 벡터이다. "AAV"는 아데노-관련 바이러스에 대한 약어이며, 바이러스 자체 또는 이의 유도체를 지칭하기 위해 사용될 수 있다. 이 용어는 달리 요구되지 않는 한, 모든 서브타입과, 천연 발생 형태 및 재조합 형태 둘 다를 포괄한다. 약어 "rAAV"는 재조합 AAV 벡터(또는 "rAAV 벡터")로도 지칭되는 재조합 아데노-관련 바이러스를 지칭한다. 용어 "AAV"는, 예를 들어, AAV 유형 1(AAV1), AAV 유형 2(AAV2), AAV 유형 3(AAV3), AAV 유형 4(AAV4), AAV 유형 5(AAV5), AAV 유형 6(AAV6), AAV 유형 7(AAV7), AAV 유형 8(AAV8), AAV 유형 9(AAV9), AAV 유형 10(AAVrh10을 포함하는 AAV10), AAV 유형 12(AAV12), 조류 AAV, 소 AAV, 개 AAV, 말 AAV, 영장류 AAV, 비-영장류 AAV, 및 양 AAV를 포함한다. "영장류 AAV"는 영장류를 감염시키는 AAV를 지칭하며, "비-영장류 AAV"는 비-영장류를 감염시키는 AAV를 지칭하고, "소 AAV"는 소 포유류를 감염시키는 AAV를 지칭하며, 기타 등등이다.
다양한 혈청형의 AAV의 게놈 서열뿐만 아니라 천연 역방위 말단 반복체(ITR), Rep 단백질, 및 캡시드 서브유닛의 서열도 당업계에 알려져 있다. 이러한 서열은 문헌 또는 공개 데이터베이스, 예컨대 GenBank에서 확인될 수 있다. 예를 들어, GenBank 등록 번호 NC-002077 (AAV1), AF063497 (AAV1), NC-001401 (AAV2), AF043303 (AAV2), NC-001729 (AAV3), NC-001829 (AAV4), U89790 (AAV4), NC-006152 (AAV5), AF513851 (AAV7), AF513852 (AAV8), 및 NC-006261 (AAV8); 또는 그 개시 내용이 본원에 참고로 포함되는 간행물, 예컨대 WO2005033321(AAV1~9)을 참조한다. 또한 예를 들어 문헌[Srivistava et al. (1983) J. Virology 45:555]; 문헌[Chiorini et al. (1998) J. Virology 71 :6823]; 문헌[Chiorini et al. (1999) J. Virology 73: 1309]; 문헌[Bantel-Schaal et al. (1999) J. Virology 73:939]; 문헌[Xiao et al. (1999) J. Virology 73:3994]; 문헌[Muramatsu et al. (1996) Virology 221 :208]; 문헌[Shade et al.,(1986) J. Virol. 58:921]; 문헌[Gao et al. (2002) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 99: 11854]; 문헌[Moris et al. (2004) Virology 33:375-383]; 국제 공개 WO 00/28061, WO 99/61601, WO 98/11244; 및 미국 특허 제6,156,303호를 참조한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "rAAV 벡터"는 AAV 기원이 아닌 폴리뉴클레오타이드 서열(즉, AAV에 대하여 이종성인 폴리뉴클레오타이드), 전형적으로 세포의 유전적 형질전환을 위한 관심 서열을 포함하는 AAV 벡터를 지칭한다. 일부 실시형태에서, 이종성 폴리뉴클레오타이드에는 적어도 하나의, 때때로 2개의 AAV 역방위 말단 반복체(ITR) 서열이 측면에 위치할 수 있다. 용어 rAAV 벡터는 rAAV 벡터 입자 및 rAAV 벡터 플라스미드 둘 다를 포괄한다. rAAV 벡터는 단일-가닥(ssAAV) 또는 자가-상보성(scAAV)일 수 있다. "AAV 바이러스" 또는 "AAV 바이러스 입자" 또는 "rAAV 벡터 입자"는 적어도 하나의 AAV 캡시드 단백질(전형적으로 하나 이상의 야생형 AAV의, 또는 이로부터 유래된 모든 캡시드 단백질) 및 캡슐화된 폴리뉴클레오타이드 rAAV 벡터로 구성된 바이러스 입자를 지칭한다. 상기 입자가 이종성 폴리뉴클레오타이드(즉, 야생형 AAV 게놈 이외의 폴리뉴클레오타이드, 예컨대 포유류 세포로 전달될 이식유전자)를 포함하는 경우, 이것은 전형적으로 "rAAV 벡터 입자" 또는 단순히 "rAAV 벡터"로 지칭된다. rAAV 벡터가 rAAV 입자 내에 포함되므로, rAAV 입자의 제조에는 반드시 rAAV 벡터의 제조가 포함된다.
일부 실시형태에서, 벡터는 예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 hTREM2 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 코딩하는 핵산을 포함하는 재조합 DNA 분자일 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "재조합"은 벡터, 폴리뉴클레오타이드, 폴리펩타이드 또는 세포가 클로닝, 제한효소 처리 또는 라이게이션 단계(예컨대 내부에 포함된 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드와 관련됨) 및/또는 자연에서 발견되는 생성물과는 다른 구축물을 생성하는 다른 절차들의 다양한 조합의 생성물임을 의미한다. 재조합 바이러스 또는 벡터는 재조합 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 바이러스 입자이다. 이 용어에는 각각 원래의 폴리뉴클레오타이드 구축물의 복제물 및 원래의 바이러스 구축물의 자손이 포함된다.
재조합 벡터에는 전형적으로, 발현될 핵산 서열에 작동가능하게 연결된 하나 이상의 조절 서열이 포함된다. 용어 "조절 서열"에는 프로모터, 인핸서, 및 다른 발현 제어 요소(예컨대, 폴리아데닐화 신호)가 포함된다. 조절 서열에는 뉴클레오타이드 서열의 구성적 발현을 지시하는 조절 서열과, 조직-특이적 조절 서열 및/또는 유도성 서열이 포함된다. 발현 벡터에는 또한 숙주 세포에서 메신저 RNA 안정성 및 번역가능성을 최적화하기 위해 설계된 요소 및/또는 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은, hTREM2 항체 또는 이의 항원-결합을 발현하는 영구적인, 안정한 세포 클론을 확립하기 위한 약물 선발 마커가 포함될 수 있다. 발현 벡터의 설계는 형질전환될 숙주 세포의 선택, 요망되는 단백질의 발현 수준 등과 같은 요인에 의존할 수 있다. 이러한 재조합 발현 벡터의 일반적인 생성 방법은 당업계에 알려진 다른 것들 중에서 문헌[Sambrook and Russell eds. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd edition]; 시리즈, 문헌[Ausubel et al. eds. (2007(2010년까지 업데이트됨)) Current Protocols in Molecular Biology]에서 찾을 수 있다.
특정 개시 신호가 또한 코딩 서열의 효율적 번역을 위해 요구될 수 있다. 이들 신호에는 ATG 개시 코돈 또는 인접 서열이 포함된다. ATG 개시 코돈을 포함하는 외인성 번역 제어 신호가 제공될 필요가 있을 수 있다. 당업자는 쉽게 이를 결정하고 필요한 신호를 제공할 수 있을 것이다. 전체 삽입물의 번역을 보장하기 위해 개시 코돈이 요망되는 코딩 서열의 리딩 프레임(reading frame)과 "인-프레임" 상태로 있어야 함은 잘 알려져 있다. 외인성 번역 제어 신호 및 개시 코돈은 천연 또는 합성일 수 있다. 발현의 효율은 적절한 전사 인핸서 요소의 포함에 의해 향상될 수 있다.
발현은 당업계에 알려진 임의의 적절한 숙주 세포, 예를 들어, 포유류 숙주 세포, 박테리아 숙주 세포, 효모 숙주 세포, 곤충 숙주 세포 등을 이용할 수 있다. 원핵 및 진핵 발현 시스템 둘 다가 널리 이용가능하다. 일부 실시형태에서, 발현 시스템은 포유류 세포 발현, 예컨대 CHO 세포 발현 시스템이다. 일부 실시형태에서, 핵산은 요망되는 숙주 세포에서의 발현을 촉진하기 위해 코돈-최적화될 수 있다. 발현을 위해 선택된 세포 유형, 소기관, 및 유기체에서 DNA 절편의 발현을 효과적으로 지시하는 프로모터 및/또는 인핸서를 이용하는 것이 중요할 것이다. 분자 생물학 분야의 당업자는 일반적으로 단백질 발현을 위한 프로모터, 인핸서, 및 세포 유형의 조합의 용도를 알고 있으며, 예를 들어, 문헌[Sambrook et al. (2001)]을 참조한다.
대부분의 전사된 진핵 RNA 분자는 일차 전사체로부터 인트론을 제거하기 위해 RNA 스플라이싱을 거칠 것이다. 게놈 진핵 서열을 함유하는 벡터는 단백질 발현을 위한 전사체의 적절한 프로세싱을 보장하기 위해 도너 및/또는 억셉터 스플라이스 부위를 필요로 할 수 있다(문헌[Chandler et al., 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94(8):3596-601] 참조).
본 발명의 벡터 또는 구축물은 일반적으로 적어도 하나의 종결 신호를 포함할 것이다. "종결 신호" 또는 "종결자"는 RNA 폴리머라아제에 의한 RNA 전사체의 특이적 종결에 관여되는 DNA 서열로 이루어진다. 따라서 소정 실시형태에서, RNA 전사체의 생성을 종료시키는 종결 신호가 고려된다. 생체 내에서 바람직한 메시지 수준을 달성하기 위해 종결자가 필요할 수 있다. 진핵 시스템에서, 종결자 영역은 폴리아데닐화 부위를 노출시키기 위해 새로운 전사체의 부위-특이적 절단을 허용하는 특정 DNA 서열을 또한 포함할 수 있다. 이는 전사체의 3' 말단에 약 200개 A 잔기(폴리 A) 스트레치를 부가하도록 특화 내인성 폴리머라아제에 신호를 준다. 상기 폴리A 테일로 변형된 RNA 분자는 더 안정한 것으로 나타나며 더 효율적으로 번역된다. 따라서, 진핵생물이 관여되는 다른 실시형태에서, 종결자가 RNA 절단을 위한 신호를 포함하는 것이 바람직하며, 종결자 신호가 메시지의 폴리아데닐화를 촉진하는 것이 더 바람직하다. 종결자 및/또는 폴리아데닐화 부위 요소는 메시지 수준을 향상시키고/시키거나 카세트로부터의 다른 서열로의 통독(read through)을 최소화하는 역할을 할 수 있다. 본 발명에서 사용하기 위해 고려되는 종결자에는 예를 들어, 유전자의 종결 서열, 예컨대 소 성장 호르몬 종결자 또는 바이러스 종결 서열, 예컨대 SV40 종결자를 포함하지만 이에 한정되지 않는, 본원에서 기재되거나 당업자에게 알려진 임의의 알려진 전사 종결자가 포함된다. 소정 실시형태에서, 종결 신호에는, 서열 절두로 인한 것과 같이, 전사가능하거나 번역가능한 서열이 없을 수 있다.
발현, 특히 진핵 발현에서, 전형적으로 전사체의 적절한 폴리아데닐화를 초래하기 위해 폴리아데닐화 신호가 포함될 것이다. 폴리아데닐화 신호의 성질은 본 발명의 성공적인 실시에 중추적인 것으로 여겨지지 않고/않거나 임의의 이러한 서열이 이용될 수 있다. 바람직한 실시형태에는 다양한 표적 세포에서 편리하고/하거나 잘 기능하는 것으로 알려진 SV40 폴리아데닐화 신호 및/또는 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 신호가 포함된다. 폴리아데닐화는 전사체의 안정성을 증가시킬 수 있거나 세포질 수송을 촉진할 수 있다.
숙주 세포에서 벡터를 증식시키기 위해, 벡터는 복제가 개시되는 특정 핵산 서열인 하나 이상의 복제 기점 부위(종종 "ori"로 명명됨)를 함유할 수 있다. 대안적으로 숙주 세포가 효모인 경우 자율 복제 서열(ARS)이 이용될 수 있다.
본 발명의 소정 실시형태에서, 본 발명의 핵산 구축물을 함유하는 세포는 발현 벡터에 마커를 포함시킴으로써 시험관 내 또는 생체 내에서 확인될 수 있다. 이러한 마커는 세포에 확인가능한 변화를 부여하여 발현 벡터를 함유하는 세포의 용이한 확인을 허용할 것이다. 일반적으로, 선발가능 마커는 선발을 허용하는 특성을 부여하는 것이다. 양성 선발가능 마커는 마커의 존재가 그 선발을 허용하는 것인 반면, 음성 선발가능 마커는 그 존재가 그 선발을 방지하는 것이다. 양성 선발가능 마커의 예로는 약물 내성 마커가 있다.
보통 약물 선발 마커의 포함은 형질전환체의 클로닝 및 확인을 보조하며, 예를 들어, 네오마이신, 퓨로마이신, 하이그로마이신, DHFR, GPT, 제오신 및 히스티디놀에 대한 내성을 부여하는 유전자가 유용한 선발가능 마커이다. 조건의 구현에 기반하여 형질전환체의 구별을 허용하는 표현형을 부여하는 마커에 더하여, 스크리닝가능한 마커, 예컨대 그 기반이 비색 분석인 GFP를 포함하는 다른 유형의 마커가 또한 고려된다. 대안적으로, 스크리닝가능한 효소, 예컨대 단순 포진 바이러스 티미딘 키나아제(HSV-tk) 또는 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라아제(CAT)가 이용될 수 있다. 당업자는 또한, 가능하게는 FACS 분석과 함께, 면역학적 마커를 이용하는 방법을 알 것이다. 사용되는 마커는 이것이 유전자 산물을 코딩하는 핵산과 동시적으로 발현될 수 있는 한, 중요한 것으로 여겨지지 않는다. 선발가능한 및 스크리닝가능한 마커의 추가 예는 당업자에게 잘 알려져 있다.
발현 벡터의 선택은 벡터의 하나 이상의 성분이 발현되는 의도된 세포에 따라 다르다. 전형적으로, 벡터는 하나 이상의 조절 서열, 예컨대 hTREM2 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드에 작동적으로 연결된 프로모터 및 다른 조절 서열(예를 들어, 인핸서)을 함유한다.
"프로모터"는 전사의 개시 및 속도가 제어되는 핵산 서열 영역인 제어 서열이다. 이는 조절 단백질 및 분자가 결합할 수 있는 유전 요소, 예컨대 RNA 폴리머라아제 및 다른 전사 인자를 함유할 수 있다. 어구 "작동가능하게 배치된", "작동가능하게 연결된", "제어 하의" 및 "전사 제어 하의"는 프로모터가 핵산 서열의 전사 개시 및/또는 발현을 제어하기 위해 그 서열에 관해 정확한 기능적 위치 및/또는 배향으로 있음을 의미한다. 프로모터는 핵산 서열의 전사 활성화에 관여되는 시스-작용 조절 서열을 지칭하는 "인핸서"와 함께 사용될 수도 있고 사용되지 않을 수도 있다.
프로모터는 코딩 절편 및/또는 엑손의 상류에 배치된 5' 비-코딩 서열을 단리함으로써 수득될 수 있는 바와 같이, 유전자 또는 서열과 자연적으로 연관된 것일 수 있다. 이러한 프로모터는 "내인성"으로 지칭될 수 있다. 이와 유사하게, 인핸서는 핵산 서열의 하류 또는 상류에 배치된, 그 서열과 자연적으로 연관된 서열일 수 있다. 대안적으로, 그 천연 환경에서 핵산 서열과 보통 연관되지 않는 프로모터를 지칭하는 재조합 또는 이종성 프로모터의 제어 하에 코딩 핵산 절편을 배치함으로써 소정 장점이 획득될 것이다. 재조합 또는 이종성 인핸서는 또한 그 천연 환경에서 핵산 서열과 보통 연관되지 않는 인핸서를 지칭한다. 이러한 프로모터 또는 인핸서에는 다른 유전자의 프로모터 또는 인핸서, 및 임의의 다른 원핵, 바이러스, 또는 진핵 세포로부터 단리된 프로모터 또는 인핸서, 및 "천연 발생"이 아닌 프로모터 또는 인핸서, 즉 발현을 변경시키는 돌연변이 및/또는 상이한 전사 조절 영역의 상이한 요소를 함유하는 프로모터 또는 인핸서가 포함될 수 있다. 합성에 의해 프로모터 및 인핸서의 핵산 서열을 생성하는 것에 더하여, 서열은 재조합 클로닝 및/또는 핵산 증폭 기술, 예를 들어 PCR을 사용하여 생성될 수 있다(본원에 개시된 조성물과 관련하여)(US 4683202, US 5928906 참조). 또한, 비-핵 소기관, 예컨대 미토콘드리아, 엽록체 등 내에 서열의 전사 및/또는 발현을 지시하는 제어 서열도 채택될 수 있음이 고려된다.
이용되는 프로모터는 구성적, 유도성, 합성, 조직- 또는 세포-특이적, 및/또는 도입된 DNA 절편의 고수준 발현을 지시하기에 적절한 조건 하에 유용한 프로모터, 예컨대 재조합 단백질 및/또는 펩타이드의 대규모 제조에서 유리한 것일 수 있다. 게다가, 인간 TREM2 단백질(즉, hTREM2), 예를 들어 인핸서, 리보솜 결합 부위, 전사 종결 서열 등에 결합하는 항체를 코딩하는 핵산의 발현을 개선하기 위해 다른 조절 요소가 또한 포함될 수 있다.
일부 실시형태에서, hTREM2 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 계속적 발현을 제공하기 위해 구성적 프로모터가 채택된다. 구성적 프로모터의 예는 극초기 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터, 시미안 바이러스 40(SV40) 초기 프로모터, 마우스 유방 종양 바이러스(MMTV) 프로모터, 인간 면역결핍 바이러스(HIV) 장형 말단 반복(LTR) 프로모터, MoMuLV 프로모터, 조류 백혈병 바이러스 프로모터, 엡스타인-바 바이러스 극초기 프로모터, 라우스 육종 바이러스 프로모터와, 인간 유전자 프로모터, 예컨대 비제한적으로 액틴 프로모터, 미오신 프로모터, 연장 인자-1α 프로모터, 헤모글로빈 프로모터, 및 크레아틴 키나아제 프로모터를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
일 실시형태에서, 유도적 프로모터는 유도적 조건 하에서를 제외하고는 삽입된 서열의 발현을 방지하기 위해 이용된다. 유도성 프로모터의 사용은 발현이 요망되는 경우에 작동가능하게 연결되는 폴리뉴클레오타이드 서열의 발현을 개시시킬 수 있거나, 또는 발현이 요망되지 않는 경우에 발현을 종료시킬 수 있는 분자 스위치를 제공한다. 유도성 프로모터의 예는 메탈로티오닌 프로모터, a를 포함하지만, 이들로 한정되지 않는다.
유도성 프로모터는 예를 들어, 아라비노스 프로모터, lacZ 프로모터, 테트라사이클린 프로모터, 메탈로티오네인 프로모터, 글루코코르티코이드 프로모터, 프로게스테론 프로모터, 또는 열 충격 프로모터를 포함하지만, 이들로 한정되지 않는다.
프로모터 외에도, hTREM2 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 효율적인 발현을 위해서는 다른 조절 요소가 또한, 필요하거나 요망될 수 있다. 이러한 요소는 ATG 개시 코돈 및 인접한 리보솜 결합 부위 또는 기타 서열을 포함한다. 또한, 발현 효율은 사용되는 세포 시스템에 적절한 인핸서를 포함시킴으로써 증강될 수 있다(예를 들어, 문헌[Scharf et al., Results Probl. Cell Differ. 20:125, 1994; 및 Bittner et al., Meth. Enzymol., 153:516, 1987] 참조). 예를 들어, SV40 인핸서 또는 CMV 인핸서가 포유동물 숙주 세포에서의 발현을 증가시키기 위하여 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 조직- 또는 세포-특이적 프로모터가 특정 조직 또는 세포에서만 hTREM2 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 발현을 제공하기 위해 채택된다. 조직- 또는 세포-특이적 프로모터 또는 요소의 아이덴티티와, 이의 활성을 특성화하기 위한 분석법은 당업자에게 잘 알려져 있다. 예는 인간 LIMK2 유전자(문헌[Nomoto et al. 1999, Gene, 236(2):259-271]), 소마토스타틴 수용체 2 유전자(문헌[Kraus et al., 1998, FEES Lett., 428(3): 165-170]), 뮤린 부고환 레틴산-결합 유전자(문헌[Lareyre et al., 1999, J. Biol. Chem., 274(12):8282-8290]), 인간 CD4(문헌[Zhao-Emonet et al., 1998, Biochirn. Biophys. Acta, 1442(2-3): 109-119]), 마우스 알파2 (XI) 콜라겐(문헌[Tsumaki, et al., 1998, J. Biol. Chem., 273(36):22861-22864]), D1A 도파민 수용체 유전자(문헌[Lee, et al., 1997, J. Auton. Nerv. Syst., 74(2-3):86-90]), 인슐린-유사 성장 인자 II(문헌[Wu et al., 1997, Biochem. Biophys. Res. Commun., 233(1):221-226]), 인간 혈소판 내피 세포 부착 분자-1(문헌[Almendro et al., 1996, J. Immunol., 157(12):5411-5421]), 근육 크레아틴 키나아제(MCK) 프로모터(문헌[Wang et al., Gene Ther. 2008 Nov;15(22):1489-99])를 포함한다.
일부 실시형태에서, hTREM2 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 발현을 제공하기 위해 합성 프로모터가 채택된다. 합성 프로모터는 천연 프로모터의 전사 효능을 크게 능가할 수 있다. 예를 들어, 내인성 세포 기구 또는 인자에 의해 활성이 제거되지 않거나 감소되지 않는 합성 프로모터가 선택될 수 있다. 트랜스-작용 인자 결합 부위 및 인핸서를 포함하는 다른 요소가 전사 효율을 개선하기 위해 합성 프로모터 내로 삽입될 수 있다. 합성 프로모터는 합성 및 생물학적 프로모터 둘 다의 최상의 특징들을 조합하도록 합리적으로 설계되고 화학적으로 합성될 수 있다. 전장의 화학적으로 합성된 프로모터를 생성하기 위해 몇몇 공정을 통해 합성 올리고들이 어닐링되고 라이게이션된다. 합성 프로모터는 유도성 또는 세포-유형 특이적 프로모터일 수 있다.
바람직한 실시형태에서, 벡터는 아데노연관 벡터(AAV)이다. 실시형태에서, AAV 벡터는 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 hTREM2 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 전형적인 실시형태에서, AAV 벡터는 역 말단 반복(ITR) 서열에 의해 한쪽 또는 양쪽 측면에 있는 hTREM2 항체 또는 이의 결합 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 폴리뉴클레오타이드는 하나 이상의 추가 요소들, 예컨대, 예를 들어, 프로모터, 인핸서, 하나 이상의 인트론 서열, 폴리(A) 서열 및 이들의 조합을 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 벡터는 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같이, AAV 캡시드로 캡슐화된 hTREM2 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 폴리뉴클레오타이드 AAV 벡터 플라스미드를 포함한다.
일부 실시형태에서, 벡터는 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같이, 적어도 하나의 표적 세포-적합한 조절 서열, 예를 들어, 프로모터에 작동가능하게 연결된, hTREM2 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다.
일부 실시형태에서, AAV 벡터 내 ITR은 동일한 AAV 혈청형으로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, AAV 벡터 내 ITR은 상이한 AAV 혈청형으로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, AAV 입자 내 ITR은 동일하다. 일부 실시형태에서, AAV 입자 내 ITR은 상이하다.
일부 실시형태에서, AAV 벡터 내 ITR은 AAV 캡시드와 동일한 AAV 혈청형으로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, AAV 벡터 내 ITR은 AAV 캡시드의 것과 상이한 혈청형으로부터 유래된다. 일 실시형태에서, ITR은 AAV2로부터 유래되고, AAV 캡시드는 AAV2 이외의 혈청형, 예를 들어, AAV9로부터 유래된다.
발현 벡터는 또한, 삽입된 hTREM2 항체 또는 이의 항원-결합 단편 서열에 의해 코딩된 폴리펩티드와 함께 융합 단백질을 형성하기 위해 분비 신호 서열 위치를 제공할 수 있다. 보다 종종, hTREM2 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 삽입된 서열은 벡터에 포함되기 이전에 신호 서열에 연결된다. hTREM2 항체 경쇄 및 중쇄 가변 도메인을 코딩하는 서열을 수령하는 데 사용되는 벡터는 이따금 또한, 불변 영역 또는 이의 일부를 코딩한다. 이러한 벡터는 가변 영역을 불변 영역과의 융합 단백질로서 발현시킬 수 있으며, 이로써, 온전한 항체 및 이의 항원 결합 단편의 생성을 초래한다. 일반적으로, 이러한 불변 영역은 인간 불변 영역이다.
발현 벡터의 생성은 어느 하나가 벡터를 소화시키기 위한 표준 재조합 기술과 함께 이용될 수 있는 다중 제한 효소 부위들을 포함하는 핵산 영역인 다중 클로닝 부위(MCS)를 포함하는 벡터를 이용할 수 있다. 문헌[Carbonelli et al., 1999, Levenson et al., 1998, and Cocea, 1997]을 참조한다. "제한 효소 소화"는 핵산 분자에서 특정 위치에서만 기능하는 효소를 이용한 핵산 분자의 촉매적 절단을 지칭한다. 이러한 제한 효소 중 많은 것이 구매가능하다. 이러한 효소의 사용은 당업자에게 널리 이해되어 있다. 빈번하게, 벡터는 외인성 서열이 벡터와 라이게이션될 수 있도록 MCS 내를 절단하는 제한 효소를 사용하여 선형화되거나 단편화된다. "라이게이션"은 서로 연접할 수도 있고 연접하지 않을 수도 있는 2개의 핵산 단편 간에 포스포디에스테르 결합을 형성하는 과정을 지칭한다. 제한 효소 및 라이게이션 반응이 관여되는 기술은 재조합 기술 분야의 당업자에게 잘 알려져 있다.
관심 폴리뉴클레오타이드 서열을 함유하는 발현 벡터를 도입하는 방법은 세포 숙주의 유형에 따라 다르다. 예를 들어, 원핵 세포의 경우 염화칼슘 형질감염이 통상적으로 사용되는 반면, 다른 세포 숙주의 경우 인산칼슘 처리 또는 전기천공이 사용될 수 있다(일반적으로, 상기 문헌[Sambrook et al.] 참조). 다른 방법은, 예를 들어 전기천공, 인산칼슘 처리, 리포좀-매개 형질전환, 주입 및 미세주입, 발리스틱(ballistic) 방법/유전자 총, 비로좀, 면역리포좀, 다가양이온:핵산 콘쥬게이트, 네이키드(naked) DNA, 인공 비리온, 헤르페스 바이러스 구조 단백질 VP22에 대한 융합, 제제-증강된 DNA 흡수, 생체 외 형질도입, 원형질체 융합, 레트로바이러스 형질도입, 바이러스 형질감염, 지질 기반 형질감염 또는 기타 통상적인 기술을 포함한다. 원형질체 융합의 경우, 세포가 배지에서 성장되고 적절한 활성에 대해 스크리닝된다. 재조합 단백질을 장기간 고수율로 생성하기 위해서는, 안정적인 발현이 종종 요구될 것이다. 예를 들어, 바이러스 복제 기점 또는 내인성 발현 요소 및 선발가능 마커 유전자를 함유하는 발현 벡터를 사용하여 폴리펩타이드를 안정적으로 발현하는 세포주가 제조될 수 있다. 벡터의 도입 후, 세포는, 이들 세포가 선발 배지로 옮겨지기 전에, 농화된 배지 내에서 1 내지 2일 동안 성장하도록 허용될 수 있다. 선별 마커의 목적은 선택에 대한 저항성을 부여하는 것이며, 선별 마커의 존재는 선별 배지에서 도입 서열을 성공적으로 발현시키는 세포가 성장할 수 있게 한다. 안정적으로 형질감염된 저항성 세포는 세포 유형에 적합한 조직 배양 기술을 이용해 증식될 수 있다. 얻어진 형질감염 세포를 배양시키고, 생산된 항체를 회수하기 위한 방법 및 조건은 당업자에게 공지되어 있고, 본 설명에 기반하여 사용되는 특정 발현 벡터 및 포유류 숙주 세포에 따라, 변화되거나 최적화될 수 있다.
본원에 개시된 발현 벡터들 중 어느 하나를 포함하는 세포가 또한 본원에 제공된다. 일부 실시형태에서, 본 발명은 본원에 개시된 핵산 분자를 포함하는 숙주 세포를 특징으로 한다. 이러한 세포는 숙주 세포 또는 치료용 세포일 수 있다. 용어 "숙주 세포" 및 "재조합 숙주 세포"는 본원에서 상호교환가능하게 사용되며, 특정 대상체 세포뿐만 아니라 이러한 세포의 자손 또는 잠재적 자손도 나타낸다. 돌연변이 또는 환경적 영향으로 인해 다음 세대에서 소정 변형이 발생할 수 있기 때문에, 이러한 자손이 사실상 모 세포와 동일하지 않을 수 있지만, 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어의 범주 내에 여전히 포함된다.
일 실시형태에서, 숙주 세포는 hTREM2 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 코딩하는 핵산을 포함하도록 유전적으로 조작된다. 일 실시형태에서, 숙주 세포는 발현 카세트를 사용함으로써 유전적으로 조작된다. 어구 "발현 카세트"는 이러한 서열과 양립 가능한 숙주에서 유전자의 발현에 영향을 미칠 수 있는 뉴클레오타이드 서열을 나타낸다. 이러한 카세트에는 프로모터, 인트론이 있거나 인트론이 없는 오픈 리딩 프레임, 및 종결 신호가 포함될 수 있다. 발현을 초래하는 데 필요하거나 도움이 되는 추가 인자, 예컨대 유도성 프로모터가 또한 사용될 수 있다.
hTREM2 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 사슬의 보유 및 발현을 위한 숙주 세포는 진핵 세포 또는 원핵 세포, 예컨대 박테리아 세포, 곤충 세포 또는 인간 세포일 수 있지만, 이에 한정되지 않는다. 이. 콜라이는 본 발명의 폴리뉴클레오타이드를 클로닝하고 발현시키는 데 유용한 하나의 원핵 숙주이다. 사용에 적합한 다른 미생물 숙주는 바실루스, 예컨대 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 및 다른 장내세균, 예컨대 살모넬라(Salmonella), 세라티아(Serratia), 및 다양한 슈도모나스(Pseudomonas) 종을 포함한다. 이들 원핵 숙주에서, 전형적으로 숙주 세포와 양립가능한 발현 제어 서열(예를 들어, 복제 기점)을 함유하는 발현 벡터를 또한 제조할 수 있다. 또한, 많은 다양한 잘 알려진 프로모터, 예컨대 락토스 프로모터 시스템, 트립토판(trp) 프로모터 시스템, 베타-락타마아제 프로모터 시스템, 또는 파지 람다로부터의 프로모터 시스템이 존재할 것이다. 프로모터는 전형적으로, 선택적으로 오퍼레이터 서열과 함께 발현을 제어하고, 전사 및 번역의 개시 및 완료를 위한 리보솜 결합 부위 서열 등을 갖는다. 다른 미생물, 예컨대 효모가 또한, 본 발명의 hTREM2 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 발현시키기 위해 이용될 수 있다. 바큘로바이러스 벡터와 함께 곤충 세포를 또한 사용할 수 있다. 적합한 곤충 세포는 Sf9 세포를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
일 실시형태에서, 포유류 숙주 세포는 본 발명의 hTREM2 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 발현시키고 제조하는 데 사용된다. 예를 들어, 이것은 내인성 면역글로불린 유전자를 발현하는 하이브리도마 세포주(예를 들어, 1D6.C9 골수종 하이브리도마 세포) 또는 외인성 발현 벡터를 보유하는 포유류 세포주(예를 들어, SP2/0 골수종 세포)일 수 있다. 이것은 임의의 정상 사멸 또는 정상 또는 비정상적 불멸 동물 또는 인간 세포를 포함한다. 예를 들어, CHO 세포주, 다양한 Cos 세포주, HeLa 세포, 골수종 세포주, 형질변환된 B 세포 및 하이브리도마를 포함하여, 온전한 면역글로불린을 분비할 수 있는 다수의 적합한 숙주 세포주들이 개발되어 왔다. 폴리펩타이드를 발현시키기 위한 포유류 조직 세포 배양물의 사용은 일반적으로 예를 들어, 문헌[Winnacker, From Genes to Clones, VCH Publishers, N.Y., N.Y., 1987]에 논의되어 있다. 포유류 숙주 세포를 위한 발현 벡터는 발현 제어 서열, 예컨대 복제 기점, 프로모터 및 인핸서(예를 들어, 문헌[Queen, et al., Immunol. Rev. 89:49-68, 1986] 참조), 및 필요한 프로세싱 정보 부위, 예컨대 리보솜 결합 부위, RNA 스플라이스 부위, 폴리아데닐화 부위, 및 전사 종결자 서열을 포함할 수 있다. 이러한 발현 벡터들은 보통 포유류 유전자로부터 또는 포유류 바이러스로부터 유래된 프로모터를 함유한다. 적합한 프로모터는 구성적, 세포 유형-특이적, 단계-특이적, 및/또는 조정가능 또는 조절가능한 프로모터일 수 있다. 유용한 프로모터는 메탈로티오네인 프로모터, 구성적 아데노바이러스 주요 후기(major late) 프로모터, 덱사메타손-유도성 MMTV 프로모터, SV40 프로모터, MRP pol III 프로모터, 구성적 MPSV 프로모터, 테트라사이클린-유도성 CMV 프로모터(예컨대 인간 극초기 CMV 프로모터), 구성적 CMV 프로모터 및 당업계에 알려진 프로모터-인핸서 조합을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
숙주 세포는 인간 TREM2 단백질(즉, hTREM2)에 결합하는 항체를 생성하거나 발현하는 데 사용될 수 있다. 따라서, 본 개시내용은 또한 숙주 세포를 사용하여 hTREM2 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제조하는 방법을 특징으로 한다. 일 실시형태에서, 본 방법은 hTREM2 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 제조되도록, 적합한 배지에서 숙주 세포(항체를 코딩하는 재조합 발현 벡터가 도입된 숙주 세포)를 배양하는 단계를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 본 방법은 배지 또는 숙주 세포로부터 항체를 단리하는 단계를 추가로 포함한다. 적합한 진핵 세포에는 Vero 세포, HeLa 세포, COS 세포, CHO 세포, HEK293 세포, BHK 세포 및 MDCKII 세포가 포함되지만, 이에 한정되지 않는다. 관심 폴리뉴클레오타이드 서열을 함유하는 발현 벡터를 도입하는 방법은 세포 숙주의 유형에 따라 다르다. 예를 들어, 원핵 세포의 경우 염화칼슘 형질감염이 통상적으로 사용되는 반면, 다른 세포 숙주의 경우 인산칼슘 처리 또는 전기천공이 사용될 수 있다. (일반적으로, 상기 문헌[Sambrook et al.] 참조). 다른 방법은, 예를 들어 전기천공, 인산칼슘 처리, 리포좀-매개 형질전환, 주입 및 미세주입, 발리스틱(ballistic) 방법, 비로좀, 면역리포좀, 다가양이온:핵산 콘쥬게이트, 네이키드 DNA, 인공 비리온, 헤르페스 바이러스 구조 단백질 Vp22에 대한 융합(Elliot and O'Hare, Cell 88:223, 1997), DNA의 작용제-개선된 흡수, 및 생체외 형질도입을 포함한다. 재조합 단백질을 장기간 고수율로 제조하기 위해서는, 안정적인 발현이 흔히 요망될 것이다. 예를 들어, hTREM2 항체 사슬 또는 항원-결합 단편을 안정하게 발현하는 세포주는, 바이러스 복제 기원 또는 내인성 발현 요소 및 선별 마커 유전자를 함유하는 본 발명의 발현 벡터를 사용하여 제조될 수 있다. 벡터의 도입 후, 세포는, 이들 세포가 선발 배지로 옮겨지기 전에, 농화된 배지 내에서 1 내지 2일 동안 성장하도록 허용될 수 있다. 선별 마커의 목적은 선택에 대한 저항성을 부여하는 것이며, 선별 마커의 존재는 선별 배지에서 도입 서열을 성공적으로 발현시키는 세포가 성장할 수 있게 한다. 안정적으로 형질주입된 저항성 세포는 세포 유형에 적합한 조직 배양 기술을 이용해 증식될 수 있다.
조절 서열
당업자는 표적 세포 내 벡터의 하나 이상의 성분의 발현이 조절 서열을 필요로 할 수 있음을 인식할 수 있다.
일 실시형태에서, AAV 벡터 플라스미드는 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 hTREM2 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 발현에 효율적인 조절 서열을 포함한다.
일 실시형태에서, AAV 벡터 플라스미드는 표적화되는 세포에서 발현을 유도하는데 효율적인 조절 서열을 포함한다.
일 실시형태에서, AAV 벡터 플라스미드는 프로모터들과 같지만, 이들로 한정되지 않는 조절 서열을 포함한다. 비-제한적인 예로서, 프로모터는 (1) CMV 프로모터, (2) CBA 프로모터, (3) FRDA 또는 FXN 프로모터, (4) UBC 프로모터, (5) GUSB 프로모터, (6) NSE 프로모터, (7) 시냅신(Synapsin) 프로모터, (8) MeCP2 프로모터, (9) GFAP 프로모터, (10) HI 프로모터, (11) U6 프로모터, (12) NFL 프로모터, (13) NFH 프로모터, (14) SCN8A 프로모터, 또는 (15) PGK 프로모터일 수 있다.
프로모터
당업자는 표적 세포에서 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은, hTREM2 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 발현이 종-특이적, 유도성, 조직-특이적 또는 세포 주기-특이적인 프로모터를 포함하지만, 이들로 한정되지 않는 특정 프로모터를 필요로 할 수 있음을 인식할 수 있다(문헌[Parr et al., Nat. Med.3: 1145-9 (1997)]; 이의 내용은 그 전체가 본원에 참고로 포함됨).
일 실시형태에서, AAV 벡터 플라스미드는 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 hTREM2 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 발현에 효율적인 프로모터를 포함한다.
일 실시형태에서, AAV 벡터 플라스미드는 표적화되는 세포에서 발현을 유도하는데 효율적인 프로모터를 포함한다.
일 실시형태에서, 프로모터는 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 hTREM2 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 발현을 신경계 조직과 같지만 이들로 한정되지 않는 표적 조직에서 일정 기간 동안 제공한다. 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 hTREM2 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 발현은 1시간, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 7시간, 8시간, 9시간, 10시간, 11시간, 12시간, 13시간, 14시간, 15시간, 16시간, 17시간, 18시간, 19시간, 20시간, 21시간, 22시간, 23시간, 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 1주, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일, 2주, 15일, 16일, 17일, 18일, 19일, 20일, 3주, 22일, 23일, 24일, 25일, 26일, 27일, 28일, 29일, 30일, 31일, 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 7개월, 8개월, 9개월, 10개월, 11개월, 1년, 13개월, 14개월, 15개월, 16개월, 17개월, 18개월, 19개월, 20개월, 21개월, 22개월, 23개월, 2년, 3년, 4년, 5년, 6년, 7년, 8년, 9년, 10년, 11년, 12년, 13년, 14년, 15년, 16년, 17년, 18년, 19년, 20년, 21년, 22년, 23년, 24년, 25년, 26년, 27년, 28년, 29년, 30년, 31년, 32년, 33년, 34년, 35년, 36년, 37년, 38년, 39년, 40년, 41년, 42년, 43년, 44년, 45년, 46년, 47년, 48년, 49년, 50년, 55년, 60년, 65년, 또는 65년 초과의 기간 동안 될 수 있다. 본원에 기재된 바와 같은 hTREM2 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 발현은 1~5시간, 1~12시간, 1~2일, 1~5일, 1~2주, 1~3주, 1~4주, 1~2개월, 1~4개월, 1~6개월, 2~6개월, 3~6개월, 3~9개월, 4~8개월, 6~12개월, 1~2년, 1~5년, 2~5년, 3~6년, 3~8년, 4~8년 또는 5~10년 또는 10~15년, 또는 15~20년, 또는 20~25년, 또는 25~30년, 또는 30~35년, 또는 35~40년, 또는 40~45년, 또는 45~50년, 또는 50~55년, 또는 55~60년, 또는 60~65년 동안 될 수 있다.
일 실시형태에서, AAV 벡터 플라스미드는 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같이, 코딩된 hTREM2 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 제1 엑손의 약 5 kb 업스트림에 위치한 영역을 포함하며; 보다 구체적으로, FRDA 프로모터를 사용한 발현을 허용하기 위해 인코딩된 Frataxin 유전자의 제1 엑손의 대략 4.9 kb 업스트림에 위치한 17-bp 영역이 있다(예를 들어, 문헌[Puspasari et al. Long Range Regulation of human FXN Gene Expression, PLOS ONE, 2011]을 참고하며; 이의 내용은 본원에 그 전체가 참고로 포함됨).
일 실시형태에서, 프로모터는 1 kb 미만이다. 프로모터의 길이는 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680, 690, 700, 710, 720, 730, 740, 750, 760, 770, 780, 790, 800 또는 800 초과일 수 있다. 프로모터의 길이는 200~300, 200~400, 200~500, 200~600, 200~700, 200~800, 300~400, 300~500, 300~600, 300~700, 300~800, 400~500, 400~600, 400~700, 400~800, 500~600, 500~700, 500~800, 600~700, 600~800 또는 700~800일 수 있다.
일 실시형태에서, 프로모터는 CMV 및 CBA와 같지만, 이들로 한정되지 않는 동일하거나 상이한 프로모터의 둘 이상의 구성요소, 영역, 또는 서열의 조합일 수 있다. 각 구성요소의 길이는 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 381, 382, 383, 384, 385, 386, 387, 388, 389, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680, 690, 700, 710, 720, 730, 740, 750, 760, 770, 780, 790, 800 또는 800 초과일 수 있다. 각 구성요소의 길이는 200~300, 200~400, 200~500, 200~600, 200~700, 200~800, 300~400, 300~500, 300~600, 300~700, 300~800, 400~500, 400~600, 400~700, 400~800, 500~600, 500~700, 500~800, 600~700, 600~800 또는 700~800일 수 있다.
일 실시형태에서, 프로모터는 CMV-인핸서 서열, 예를 들어 즉시/초기 CMV 인핸서 서열(예를 들어 382-뉴클레오타이드 CMV-인핸서 서열) 및 닭 베타-액틴(CBA)-프로모터 서열(예를 들어 260개 뉴클레오타이드 CBA 프로모터 서열)의 조합이다.
일 실시형태에서, 프로모터는 CMV-인핸서 서열의 280-뉴클레오타이드 단편 및 닭 베타-액틴(CBA)-프로모터 서열의 266-뉴클레오타이드 단편의 조합이다. 일부 실시형태에서, CMV 인핸서 서열은 하기를 포함하며, 예를 들어 하기로 구성된다:
Figure pct00045
(서열 번호 134)
일부 실시형태에서, CBA 프로모터 서열은 하기를 포함하며, 예를 들어 하기로 구성된다:
Figure pct00046
(서열 번호 135)
일 실시형태에서, AAV 벡터는 하기를 포함하며, 예를 들어 하기로 구성된 하이브리드 CMV 인핸서/닭 베타 액틴 프로모터를 포함한다:
Figure pct00047
(서열 번호 136)
일 실시형태에서, AAV 벡터 플라스미드는 유비쿼터스 프로모터를 포함한다. 유비쿼터스 프로모터의 비제한적인 예는 CMV, CBA(유도체 CAG, CBh, 등 포함), EF-1a, PGK, UBC, GUSB (hGBp), 및 UCOE(HNRPA2B1-CBX3의 프로모터)를 포함한다. 일 실시형태에서, Yu, Soderblom, Gill, Husain, Passini, Xu, Drews 또는 Raymond에 의해 교시된 임의의 프로모터들이 본 발명에서 사용될 수 있다. Yu et al. (Molecular Pain 2011, 7:63; 그 내용은 그 전체가 본원에 참고로 포함됨)은 렌티바이러스 벡터를 사용하여 랫트 DRG 세포 및 일차 DRG 세포에서 CAG, EF-1a, PGK 및 UBC 프로모터 하에 eGFP의 발현을 평가하였으며, UBC가 다른 3개의 프로모터보다 약한 발현을 보였고, 모든 프로모터에 대해 10~12% 아교세포 발현만 있었음을 발견하였다.
Soderblom et al. (E. Neuro 2015; 그 내용은 그 전체가 본원에 참고로 포함됨)은 운동 피질에 주사한 후 CMV 및 UBC 프로모터에 의해 AAV8에서, 그리고 CMV 프로모터에 의해 AAV2에서, eGFP의 발현을 평가하였다. UBC 또는 EF-1a 프로모터를 함유하는 플라스미드의 비강 내 투여는 CMV 프로모터에 의한 발현보다 더 큰 지속적인 기도 발현을 나타냈다(예를 들어, 문헌[Gill et al., Gene Therapy 2001, Vol. 8, 1539- 1546] 참고; 이의 내용은 그 전체가 본원에 참고로 포함됨). Husain et al. (Gene Therapy 2009; 그 내용은 그 전체가 본원에 참고로 포함됨)은 hGUSB 프로모터, HSV-1LAT 프로모터 및 NSE 프로모터를 사용하여 ΗβΗ 작제물을 평가하였으며, ΗβΗ 작제물이 마우스 뇌에서 NSE보다 약한 발현을 나타냈음을 발견하였다. Passini 및 Wolfe(문헌[J. Virol. 2001, 12382-12392], 그 내용은 그 전체가 본원에 참고로 포함됨)은 신생아 마우스에서 심실내 주사 후 ΗβΗ 벡터의 장기적인 효과를 평가하고 적어도 1년 동안 지속적인 발현이 있었음을 발견하였다. NF-L 및 NF-H 프로모터가 사용된 경우, Xu et al.(문헌[Gene Therapy 2001, 8, 1323-1332], 그 내용은 그 전체가 본원에 참고로 포함됨)은 CMV-lacZ, CMV-luc, EF, GFAP, hENK, nAChR, PPE, PPE + wpre, NSE(0.3 kb), NSE(1.8 kb) 및 NSE(1.8 kb + wpre)와 비교했을때 모든 뇌 영역에서 낮은 발현을 발견하였다. Xu 등은 내림차순의 프로모터 활성이 NSE(1.8 kb), EF, NSE(0.3 kb), GFAP, CMV, hENK, PPE, NFL 및 NFH임을 발견하였다. NFL은 650-뉴클레오타이드 프로모터이고, NFH는 920 뉴클레오타이드 프로모터이며, 이들은 둘다 간에는 존재하지 않지만, NFH는 감각 고유수용 뉴런, 뇌 및 척수에 풍부하고, NFH는 심장에 존재한다. SCN8A는 DRG, 척수 및 뇌 전반에 걸쳐 발현되는 470개 뉴클레오타이드 프로모터로서 해마 뉴런 및 소뇌 Purkinje 세포, 피질, 시상 및 시상하부에서 특히 높은 발현을 보인다(예를 들어, 문헌[Drews et al. Identification of evolutionary conserved, functional noncoding elements in the promoter region of the sodium channel gene SCN8A, Mamm Genome (2007) 18:723-731]; 및 [Raymond et al. Expression of Alternatively Spliced Sodium Channel a-subunit genes, Journal of Biological Chemistry (2004) 279(44) 46234-4624] 참고; 그 내용은 그 전체가 본원에 참고로 포함됨).
일 실시형태에서, AAV 벡터 플라스미드는 세포 특이적이 아닌 프로모터를 포함한다. 일 실시형태에서, 프로모터는 신경 조직에서, 예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 hTREM2 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 지속적인 발현을 위한, 약한 프로모터(RNA 폴리머라제 및/또는 시그마 인자에 대한 그의 친화도 및 다른 프로모터 친화도에 따라 분류됨)이다. 일 실시형태에서, 프로모터는 신경 조직 및 아교 조직과 같지만, 이들로 한정되지 않는 신경계 조직에서 지속된 프라탁신(Frataxin) 발현을 위한 약한 프로모터이다.
일 실시형태에서, AAV 벡터 플라스미드는 프리드라이히 운동실조(Friedreich's Ataxia, FRDA) 프로모터를 포함한다.
일 실시형태에서, AAV 벡터 플라스미드는 유비퀴틴 c(UBC) 프로모터를 포함한다. UBC 프로모터는 300~350개 뉴클레오타이드의 크기를 가질 수 있다. 비-제한적인 예로서, UBC 프로모터는 332개 뉴클레오타이드이다.
일 실시형태에서, AAV 벡터 플라스미드는 β-글루쿠로니다제(GUSB) 프로모터를 포함한다. GUSB 프로모터는 350~400개 뉴클레오타이드의 크기를 가질 수 있다. 비-제한적인 예로서, GUSB 프로모터는 378개 뉴클레오타이드이다. 비-제한적인 예로서, AAV 벡터 플라스미드는 5'- 프로모터-CMV/글로빈 인트론-hFXN-RBG-3'일 수 있으며, 여기서 AAV 벡터 플라스미드는 자기-상보적일 수 있고 캡시드는 DJ 혈청형일 수 있다.
일 실시형태에서, AAV 벡터 플라스미드는 뉴로필라멘트(NFL) 프로모터를 포함한다. NFL 프로모터는 600~700개 뉴클레오타이드의 크기를 가질 수 있다. 비-제한적인 예로서, NFL 프로모터는 650개 뉴클레오타이드이다. 비-제한적인 예로서, AAV 벡터 플라스미드는 5'-프로모터- CMV/글로빈 인트론-hFXN-RBG-3일 수 있으며, 여기서 AAV 벡터 플라스미드는 자기-상보적일 수 있고 캡시드는 DJ 혈청형일 수 있다.
일 실시형태에서, AAV 벡터 플라스미드는 뉴로필라멘트 중(NFH) 프로모터를 포함한다. NFH 프로모터는 900~950개 뉴클레오타이드의 크기를 가질 수 있다. 비-제한적인 예로서, NFH 프로모터는 920개 뉴클레오타이드이다. 비-제한적인 예로서, AAV 벡터 플라스미드는 5'- 프로모터-CMV/글로빈 인트론-hFXN-RBG-3'일 수 있으며, 여기서 AAV 벡터 플라스미드는 자기-상보적일 수 있고 캡시드는 DJ 혈청형일 수 있다.
일 실시형태에서, AAV 벡터 플라스미드는 SCN8A 프로모터를 포함한다. SCN8A 프로모터는 450~500개 뉴클레오타이드의 크기를 가질 수 있다. 비-제한적인 예로서, SCN8A 프로모터는 470개 뉴클레오타이드이다. 비-제한적인 예로서, AAV 벡터 플라스미드는 d'-프로모터-CMV/글로빈 인트론-hFXN-RBG-3일 수 있으며, 여기서 AAV 벡터 플라스미드는 자기-상보적일 수 있고 캡시드는 DJ 혈청형일 수 있다.
일 실시형태에서, AAV 벡터 플라스미드는 프라탁신(FXN) 프로모터를 포함한다.
일 실시형태에서, AAV 벡터 플라스미드는 포스포글리세레이트 키나제 1(PGK) 프로모터를 포함한다.
일 실시형태에서, AAV 벡터 플라스미드는 닭 β-액틴(CBA) 프로모터를 포함한다.
일 실시형태에서, AAV 벡터 플라스미드는 급초기 거대세포바이러스(CMV) 프로모터를 포함한다.
일 실시형태에서, AAV 벡터 플라스미드는 H1 프로모터를 포함한다.
일 실시형태에서, AAV 벡터 플라스미드는 U6 프로모터를 포함한다.
일 실시형태에서, AAV 벡터 플라스미드는 간 또는 골격근 프로모터를 포함한다. 간 프로모터의 비-제한적인 예는 hAAT 및 TBG를 포함한다. 골격근 프로모터의 비-제한적인 예는 Desmin, MCK 및 C5-12를 포함한다.
일 실시형태에서, AAV 벡터 플라스미드는 조작된 프로모터, 예를 들어 본원에 기재된 프로모터로부터 유래되지만 이와 동일하지는 않은 프로모터를 포함한다.
강화 요소
일 실시형태에서, AAV 벡터 플라스미드는 적어도 하나의 인핸서 및/또는 발현 요소를 포함할 수 있다. 인핸서 또는 발현 요소는 조절 서열(예를 들어, 프로모터)과 조합하여 사용될 수 있다. 일 실시형태에서, AAV 벡터 플라스미드는 이식유전자 인핸서, 프로모터 및/또는 5'UTR 인트론을 포함한다. 본원에서 "인핸서"로도 지칭되는 이식유전자 인핸서는 CMV 인핸서(또는 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은, 이의 단편)일 수 있지만, 이로 한정되지 않는다. 프로모터는 CMV, CBA, UBC, GUSB, NSE, Synapsin, MeCP2, 및 GFAP 프로모터일 수 있지만, 이들로 한정되지 않는다. 5'UTR/인트론은 SV40, 및 CBA-MVM일 수 있지만, 이들로 한정되지 않는다.
일 실시형태에서, AAV 벡터는 프로모터 요소와, hTREM2 항체 또는 이의 항원-결합 단편(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같음)을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 사이에 선택적으로 배치된 인트론을 포함한다. 이론에 얽매임 없이, 5' 인트론의 포함은 hTREM2 항체 또는 이의 항원-결합 단편(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같음)을 코딩하는 mRNA의 수준 및 정상 상태를 향상시키는 것으로 나타났다. 실시형태에서, 인핸서는 SV40에서 유래된 5' 인트론이다. 일 실시형태에서, SV40 인트론은 하기 서열을 포함하며, 예를 들어, 하기 서열로 구성된다:
Figure pct00048
(서열 번호 137)
일 실시형태에서, (예를 들어, AAV 벡터의) AAV 벡터 플라스미드는 인핸서, 프로모터 및/또는 인트론 조합, 예컨대 (1) CMV 인핸서, CMV 프로모터, SV40 5'UTR 인트론(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같음); (2) CMV 인핸서, CBA 프로모터, SV40 5'UTR 인트론(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같음); (3) CMV 인핸서, CBA 프로모터, CBA-MVM 5'UTR 인트론(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같음)을 포함하지만, 이들로 한정되지 않는다.
이식유전자 향상
일 실시형태에서, AAV 벡터 플라스미드는 이식유전자 표적 특이성 및 발현을 향상시킬 수 있는 적어도 하나의 이식유전자 인핸서 요소를 포함한다(예를 들어, 문헌[Powell et al. Viral Expression Cassette Elements to Enhance Transgene Target Specificity and Expression in Gene Therapy, 2015] 참고; 그 내용은 그 전체가 본원에 참고로 포함됨). 이식유전자 표적 특이성 및 발현을 향상시키는 이식유전자 인핸서 요소의 비-제한적인 예는 프로모터, 내인성 miRNA, 전사 후 조절 요소(PRE), 폴리아데닐화(폴리 A) 신호 서열 및 업스트림 인핸서(USE), CMV 인핸서 및 인트론을 포함한다.
일 실시형태에서, AAV 벡터 플라스미드는 CMV 인핸서인 적어도 하나의 이식유전자 인핸서 요소를 포함한다. 일 실시형태에서, AAV 벡터 플라스미드는 프로모터인 적어도 하나의 이식유전자 인핸서 요소를 포함한다.
일 실시형태에서, AAV 벡터 플라스미드는 인트론인 적어도 하나의 이식유전자 인핸서 요소를 포함한다.
일 실시형태에서, AAV 벡터 플라스미드는 내인성 miRNA인 적어도 하나의 이식유전자 인핸서 요소를 포함한다.
일 실시형태에서, AAV 벡터 플라스미드는 전사 후 조절 요소(PRE)인 적어도 하나의 이식유전자 인핸서 요소를 포함한다.
일 실시형태에서, AAV 벡터 플라스미드는 폴리아데닐화(폴리 A) 신호 서열인 적어도 하나의 이식유전자 인핸서 요소를 포함한다. 실시형태에서, AAV 벡터의 AAV 벡터 플라스미드는 성장 호르몬 폴리 A 신호를 포함한다. 일 실시형태에서 성장 호르몬 폴리 A 신호는 소 성장 호르몬(BGH) 폴리 A 신호로부터 유래된다. BGH 폴리 A 신호 서열의 예는 하기이다:
Figure pct00049
(서열 번호 138)
실시형태에서, AAV 벡터 플라스미드는 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 hTREM2 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 다운스트림(예를 들어, 3'에서)의 폴리 A 신호(예를 들어, BGH 폴리 A 신호)를 포함한다.
일 실시형태에서, AAV 벡터 플라스미드는 업스트림 인핸서(USE)인 적어도 하나의 이식유전자 인핸서 요소를 포함한다.
조직-특이적 발현
일 실시형태에서, 벡터 게놈은 조직 및/또는 세포에서 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은, hTREM2 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 발현을 촉진하기 위해 조직-특이적 발현 요소를 포함할 수 있다. 비-제한적인 예로서, 프로모터는 조직-특이적 발현 요소일 수 있으며, 인간 신장 인자 la-서브유닛(EF-1a), 급초기 거대 세포 바이러스(CMV), 닭 β-액틴(CBA) 및 그의 유도체 CAG, β 글루쿠로니다제(GUSB), 및 유비퀴틴 C(UBC)을 포함하지만, 이들로 한정되지 않는다.
일 실시형태에서, 벡터 게놈은 발현을 뉴런, 성상세포, 또는 희소돌기아교세포로 제한하는데 사용될 수 있는 신경계 프로모터와 같지만, 이들로 한정되지 않는 특정 세포 유형으로 발현을 제한하는 데 사용될 수 있는 조직-특이적 발현 요소를 포함할 수 있다.
일 실시형태에서, 벡터 게놈은 뉴런-특이적 에놀라제(NSE), 혈소판-유래 성장 인자(PDGF), 혈소판-유래 성장 인자 B-사슬(PDGF-β), 시냅신(Syn), 메틸-CpG 결합 단백질 2(MeCP2), Ca<2+>/칼모듈린-의존성 단백질 키나제 II(CaMKII), 대사성 글루타메이트 수용체 2(mGluR2), NFL, NFH, ηβ2, PPE, Enk 및 EAAT2 프로모터와 같지만, 이들로 한정되지 않는, 뉴런에 대한 조직-특이적 발현 요소를 포함할 수 있다.
일 실시형태에서, 벡터 게놈은 아교 섬유질 산성 단백질(GFAP) 및 EAAT2 프로모터와 같지만, 이들로 한정되지 않는, 성상세포에 대한 조직-특이적 발현 요소를 포함할 수 있다.
일 실시형태에서, 벡터 게놈은 수초 염기성 단백질(MBP) 프로모터와 같지만, 이들로 한정되지 않는, 희소돌기아교세포에 대한 조직-특이적 발현 요소를 포함할 수 있다.
인트론
일 실시형태에서, AAV 벡터 플라스미드는 하나 이상의 인트론 또는 이의 일부와 같은, 이식유전자 발현을 향상시키기 위한 적어도 하나의 요소를 포함한다.
일 실시형태에서, 페이로드 작제물은 하나 이상의 인트론 또는 이의 일부와 같은, 이식유전자 발현을 향상시키기 위한 적어도 하나의 요소를 포함한다.
인트론의 비-제한적인 예는 MVM(67~97 bps), FIX 절단된 인트론 1(300 bps), β-글로빈 SD/면역글로불린 중쇄 스플라이스 수용체(250 bps), 아데노바이러스 스플라이스 공여체/면역글로빈 스플라이스 수용체(500 bps), SV40 후기 스플라이스 공여체/스플라이스 수용체(19S/16S)(180 bps) 및 하이브리드 아데노바이러스 스플라이스 공여체/IgG 스플라이스 수용체(230 bps)를 포함한다.
일 실시형태에서, 인트론 또는 인트론 부분은 길이가 100~500개 뉴클레오타이드일 수 있다. 인트론의 길이는 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 171 , 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490 또는 500일 수 있다. 인트론의 길이는 80~100, 80~120, 80~140, 80~160, 80~180, 80~200, 80~250, 80~300, 80~350, 80~400, 80~450, 80~500, 200~300, 200~400, 200~500, 300~400, 300~500, 또는 400~500일 수 있다.
일 실시형태에서, AAV 벡터는 프로모터 요소와, hTREM2 항체 또는 이의 항원-결합 단편(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같음)을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 사이에 선택적으로 배치된 인트론을 포함한다. 이론에 얽매임 없이, 5' 인트론의 포함은 hTREM2 항체 또는 이의 항원-결합 단편(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같음)을 코딩하는 mRNA의 수준 및 정상 상태를 향상시키는 것으로 나타났다. 실시형태에서, 인핸서는 SV40에서 유래된 5' 인트론이다. 일 실시형태에서, SV40 인트론은 하기 서열을 포함하며, 예를 들어, 하기 서열로 구성된다:
Figure pct00050
(서열 번호 137)
일 실시형태에서, AAV 벡터의 AAV 벡터 플라스미드는 (1) A CMV 인핸서(예를 들어, 서열 번호 134), (2) CBA 프로모터(예를 들어, 서열 번호 135), (3) SV40 인트론(예를 들어, 서열 번호 137), (4) hTREM2 항체 또는 이의 항원-결합 단편(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같음)을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 및 (5) BGH 폴리 A 신호(예를 들어, 서열 번호 138)를 포함한다. 일 실시형태에서, 요소들 (1) 내지 (5)는 5'로부터 3'까지 AAV 벡터 플라스미드 상에 배치된다. 실시형태에서, 요소들 (1) 내지 (5)는 ITR(예를 들어, 5' ITR 및 3' ITR)을 추가로 포함하는 AAV 벡터 플라스미드 상에 배치된다. 실시형태에서, ITR은 AAV2 ITR로부터 유래된다.
일 실시형태에서, AAV 벡터 플라스미드는 자기-상보적 AAV 벡터 플라스미드이다. "자기-상보적(self-complementary)" 또는 약어 "sc"는 자기-상보적을 지칭한다. "자기-상보적 AAV" 또는 "scAAV"는 재조합 AAV 핵산 서열에 의해 운반되는 코딩 영역이 분자 내 이중-가닥 DNA 주형을 형성하도록 설계된 작제물을 지칭한다. 이론에 얽매임 없이, 감염시 제2 가닥의 세포 매개 합성을 기다리기보다는 scAAV의 2개의 상보적인 반쪽이 결합하여 즉각적인 복제 및 전사를 위해 준비된 하나의 이중 가닥 DNA(dsDNA) 단위를 형성할 것이다. 예를 들어, 문헌[D M McCarty et al, "Self-complementary Recombinant adeno-associated virus (scAAV) vectors promote efficient transduction independently of DNA synthesis", Gene Therapy, (August 2001), Vol 8, Number 16, Pages 1248-1254](그 전체가 참고로 포함됨)을 참고한다. 자기-상보적 AAV는 예를 들어, 미국 특허 번호 제6,596,535호; 제7,125,717호; 및 제7,456,683호에 기재되어 있으며, 이들 각각은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다. 예를 들어, 5' ITR은 예를 들어, 게놈의 헤어핀 형성을 허용하기 위해 말단 분해 부위를 결실시킴으로써 돌연변이될 수 있다.
캡시드 및 캡시드 혈청형
일부 실시형태에서, 본 발명의 AAV 입자는 캡시드 구조로 패키징될 수 있거나 캡시드가 없을 수 있다. 이러한 캡시드가 없는 바이러스 벡터 공여체 및/또는 수용체 서열, 예컨대 AAV는 예를 들어, 미국 공개 2014/0107186에 기재되어 있으며, 그 내용은 그 전체가 참고로 포함된다.
일부 실시형태에서, 본 발명에 따라 생성된 AAV 입자는 중추 신경계에서 관심있는 특정 세포 유형으로의 개선된 형질도입, 연장된 이식유전자 발현 및/또는 안전성 프로파일을 갖는 하이브리드 혈청형을 포함할 수 있다. 하이브리드 혈청형은 트랜스캡시드화(transcapsidation), 캡시드 표면에 대한 이중-특이적 항체의 흡착, 모자이크 캡시드 및 키메라 캡시드 및/또는 다른 캡시드 단백질 변형에 의해 생성될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 AAV 입자는 캡시드 단백질의 합리적 돌연변이유발(예를 들어, 문헌[Pulicherla et al, Mol Ther, 201 1, 19: 1070-1078] 참고), 펩타이드 리간드의 캡시드, 예를 들어 향상된 역행 수송을 위한 NMDA 수용체 작용제로부터 유래된 펩타이드로의 통합(문헌[Xu et al., Virology, 2005, 341: 203-214]), 및 예를 들어, 증가된 CNS 형질도입을 위한 새로운 AAV 변이체를 생성하기 위한 유도 진화에 의해 특정 치료 적용을 향해 추가로 변형될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 발명에 따라 생성된 AAV 입자는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV 8, AAV9, AAV 10, 및 AAV11, AAV 12, AAVrh8, AAVrh10, AAV-DJ, 및 AAV-DJ/8 캡시드 혈청형, 또는 이의 변이체들(예를 들어, AAV3A 및 AAV3B)을 포함하지만, 이들로 한정되지 않는, 천연발생 및/또는 재조합의 상이한 캡시드 단백질을 포함할 수 있다. 본 발명에 유용한 하나 이상의 AAV 캡시드 단백질을 코딩하는 핵산 서열은 국제 공개 번호 WO2015191508에 개시되어 있으며, 이의 내용은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 AAV 입자는 임의의 천연 또는 재조합 AAV 혈청형을 포함하거나, 이로부터 유래될 수 있다. 본 발명에 따르면, AAV 입자는 하기 AAV1, AAV2, AAV2G9, AAV3, AAV3a, AAV3b, AAV3-3, AAV4, AAV4-4, AAV5, AAV6, AAV6.1, AAV6.2, AAV6.1.2, AAV7, AAV7.2, AAV8, AAV9, AAV9.11, AAV9.13, AAV9.16, AAV9.24, AAV9.45, AAV9.47, AAV9.61, AAV9.68, AAV9.84, AAV9.9, AAV10, AAV11, AAV 12, AAV16.3, AAV24.1, AAV27.3, AAV42.12, AAV42-lb, AAV42-2, AAV42-3a, AAV42-3b, AAV42-4, AAV42-5a, AAV42-5b, AAV42-6b, AAV42-8, AAV42-10, AAV42-11, AAV42-12, AAV42-13, AAV42-15, AAV42-aa, AAV43-1, AAV43-12, AAV43-20, AAV43- 21, AAV43-23, AAV43-25, AAV43-5, AAV44.1, AAV44.2, AAV44.5, AAV223.1, AAV223.2, AAV223.4, AAV223.5, AAV223.6, AAV223.7, AAVl-7/rh.48, AAVl-8/rh.49, AAV2- 15/rh.62, AAV2-3/rh.61, AAV2-4/rh.50, AAV2-5/rh.51, AAV3.1/hu.6, AAV3.1/hu.9, AAV3- 9/rh.52, AAV3-l l/rh.53, AAV4-8/r 11.64, AAV4-9/rh.54, AAV4-19/rh.55, AAV5-3/rh.57, AAV5-22/rh.58, AAV7.3/hu.7, AAV16.8/hu.10, AAV16.12/hu.11, AAV29.3/bb.1, AAV29.5/bb.2, AAV106.1/hu.37, AAV114.3/hu.40, AAV127.2/hu.41, AAV127.5/hu.42, AAV128.3/hu.44, AAV130.4/hu.48, AAV145.1/hu.53, AAV145.5/hu.54, AAV145.6/hu.55, AAV161.10/hu.60, AAV161.6/hu.61, AAV33.12/hu.17, AAV33.4/hu.15, AAV33.8/hu.16, AAV52/hu.19, AAV52.1/hu.20, AAV58.2/hu.25, AAV A3.3, AAV A3.4, AAV A3.5, AAV A3.7, AAVC1, AAVC2, AAVC5, AAV-DJ, AAV-DJ8, AAVF3, AAVF5, AAVH2, AAVrh.72, AAVhu.8, AAVrh.68, AAVrh.70, AAVpi.1, AAVpi.3, AAVpi.2, AAVrh.60, AAVrh.44, AAVrh.65, AAVrh.55, AAVrh.47, AAVrh.69, AAVrh.45, AAVrh.59, AAVhu.12, AAVH6, AAVLK03, AAVH-1/hu.1, AAVH-5/hu.3, AAVLG-10/rh.40, AAVLG-4/rh.38, AAVLG- 9/hu.39, AAVN721-8/rh.43, AAVCh.5, AAVCh.5Rl, AAVcy.2, AAVcy.3, AAVcy.4, AAVcy.5, AAVCy.5Rl, AAVCy.5R2, AAVCy.5R3, AAVCy.5R4, AAVcy.6, AAVhu.1, AAVhu.2, AAVhu.3, AAVhu.4, AAVhu.5, AAVhu.6, AAVhu.7, AAVhu.9, AAVhu.10, AAVhu.11, AAVhu.13, AAVhu.15, AAVhu.16, AAVhu.17, AAVhu.18, AAVhu.20, AAVhu.21, AAVhu.22, AAVhu.23.2, AAVhu.24, AAVhu.25, AAVhu.27, AAVhu.28, AAVhu.29, AAVhu.29R, AAVhu.31, AAVhu.32, AAVhu.34, AAVhu.35, AAVhu.37, AAVhu.39, AAVhu.40, AAVhu.41, AAVhu.42, AAVhu.43, AAVhu.44, AAVhu.44Rl, AAVhu.44R2, AAVhu.44R3, AAVhu.45, AAVhu.46, AAVhu.47, AAVhu.48, AAVhu.48Rl, AAVhu.48R2, AAVhu.48R3, AAVhu.49, AAVhu.51, AAVhu.52, AAVhu.54, AAVhu.55, AAVhu.56, AAVhu.57, AAVhu.58, AAVhu.60, AAVhu.61, AAVhu.63, AAVhu.64, AAVhu.66, AAVhu.67, AAVhu.14/9, AAVhu.t 19, AAVrh.2, AAVrh.2R, AAVrh.8, AAVrh.8R, AAVrh.10, AAVrh.12, AAVrh.13, AAVrh.13R, AAVrh.14, AAVrh.17, AAVrh.18, AAVrh.19, AAVrh.20, AAVrh.21, AAVrh.22, AAVrh.23, AAVrh.24, AAVrh.25, AAVrh.31, AAVrh.32, AAVrh.33, AAVrh.34, AAVrh.35, AAVrh.36, AAVrh.37, AAVrh.37R2, AAVrh.38, AAVrh.39, AAVrh.40, AAVrh.46, AAVrh.48, AAVrh.48.1, AAVrh.48.1.2, AAVrh.48.2, AAVrh.49, AAVrh.51, AAVrh.52, AAVrh.53, AAVrh.54, AAVrh.56, AAVrh.57, AAVrh.58, AAVrh.61, AAVrh.64, AAVrh.64Rl, AAVrh.64R2, AAVrh.67, AAVrh.73, AAVrh.74, AAVrh8R, AAVrh8R A586R 돌연변이체, AAVrh8R R533A 돌연변이체, AAAV, BAAV, 염소 AAV, 소 AAV, AAVhE1.1, AAVhEr1.5, AAVhER1.14, AAVhEr1.8, AAVhEr1.16, AAVhEr1.18, AAVhEr1.35, AAVhEr1.7, AAVhEr1.36, AAVhEr2.29, AAVhEr2.4, AAVhEr2.16, AAVhEr2.30, AAVhEr2.31, AAVhEr2.36, AAVhER1.23, AAVhEr3.1, AAV2.5T , AAV-PAEC, AAV-LK01, AAV-LK02, AAV-LK03, AAV-LK04, AAV-LK05, AAV-LK06, AAV-LK07, AAV-LK08, AAV-LK09, AAV-LK10, AAV-LK11, AAV-LK12, AAV-LK13, AAV-LK14, AAV-LK15, AAV-LK16, AAV-LK17, AAV-LK18, AAV-LK19, AAV-PAEC2, AAV-PAEC4, AAV-PAEC6, AAV-PAEC7, AAV-PAEC8, AAV-PAEC11, AAV-PAEC 12, AAV-2-pre-miRNA-lOl , AAV-8h, AAV-8b, AAV-h, AAV-b, AAV SM 10-2 , AAV 셔플 100-1 , AAV 셔플 100-3, AAV 셔플 100-7, AAV 셔플 10-2, AAV 셔플 10-6, AAV 셔플 10-8, AAV 셔플 100-2, AAV SM 10-1, AAV SM 10-8 , AAV SM 100-3, AAV SM 100-10, BNP61 AAV, BNP62 AAV, BNP63 AAV, AAVrh.50, AAVrh.43, AAVrh.62, AAVrh.48, AAVhu.19, AAVhu. l, AAVhu.53, AAV4-8/rh.64, AAVLG-9/hu.39, AAV54.5/hu.23, AAV54.2/hu.22, AAV54.7/hu.24, AAV54.1/hu.21, AAV54.4R/hu.27, AAV46.2/hu.28, AAV46.6/hu.29, AAV128.1/hu.43, 트루 타입 AAV(ttAAV), UPEN AAV 10 및/또는 재패니즈 AAV 10 혈청형, 및 이의 변이체들 중 어느 하나로부터 선택된 혈청형을 이용하거나 기초로 할 수 있다.
비-제한적인 예로서, 재조합 AAV 바이러스의 캡시드는 AAV2이다. 비-제한적인 예로서, 재조합 AAV 바이러스의 캡시드는 AAVrh10이다. 비-제한적인 예로서, 재조합 AAV 바이러스의 캡시드는 AAV9(hul4)이다. 비-제한적인 예로서, 재조합 AAV 바이러스의 캡시드는 AAV-DJ이다. 비-제한적인 예로서, 재조합 AAV 바이러스의 캡시드는 AAV9.47이다. 비-제한적인 예로서, 재조합 AAV 바이러스의 캡시드는 AAV-DJ8이다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 AAV 입자는 AAV1(US20030138772의 서열 번호 6 및 64), AAV2(US20030138772의 서열 번호 7 및 70), AAV3(US20030138772의 서열 번호 8 및 71), AAV4(US20030138772의 서열 번호 63), AAV5(US20030138772의 서열 번호 114), AAV6(US20030138772의 서열 번호 65), AAV7(US20030138772의 서열 번호 1~3), AAV 8(US20030138772의 서열 번호 4 및 95), AAV9(US20030138772의 서열 번호 5 및 100), AAV10(US20030138772의 서열 번호 117), AAV11(US20030138772의 서열 번호 118), AAV 12(US20030138772의 서열 번호 119), AAVrhlO(US20030138772의 서열 번호 81의 아미노산 1 내지 738), AAV16.3(US20030138772 서열 번호 10), AAV29.3/bb. l(US20030138772 서열 번호 11), AAV29.4(US20030138772 서열 번호 12), AAV29.5/bb.2(US20030138772 서열 번호 13), AAV1.3(US20030138772 서열 번호 14), AAV13.3(US20030138772 서열 번호 15), AAV24.1(US20030138772 서열 번호 16), AAV27.3(US20030138772 서열 번호 17), AAV7.2(US20030138772 서열 번호 18), AAVC1(US20030138772 서열 번호 19), AAVC3(US20030138772 서열 번호 20), AAVC5(US20030138772 서열 번호 21), AAVF1(US20030138772 서열 번호 22), AAVF3(US20030138772 서열 번호 23), AAVF5(US20030138772 서열 번호 24), AAVH6(US20030138772 서열 번호 25), AAVH2(US20030138772 서열 번호 26), AAV42-8(US20030138772 서열 번호 27), AAV42-15(US20030138772 서열 번호 28), AAV42-5b(US20030138772 서열 번호 29), AAV42-lb(US20030138772 서열 번호 30), AAV42-13(US20030138772 서열 번호 31), AAV42-3a(US20030138772 서열 번호 32), AAV42-4(US20030138772 서열 번호 33), AAV42-5a(US20030138772 서열 번호 34), AAV42-10(US20030138772 서열 번호 35), AAV42-3b(US20030138772 서열 번호 36), AAV42-11(US20030138772 서열 번호 37), AAV42-6b(US20030138772 서열 번호 38), AAV43-1(US20030138772 서열 번호 39), AAV43-5(US20030138772 서열 번호 40), AAV43-12(US20030138772 서열 번호 41), AAV43-20(US20030138772 서열 번호 42), AAV43-21(US20030138772 서열 번호 43), AAV43-23(US20030138772 서열 번호 44), AAV43-25(US20030138772 서열 번호 45), AAV44.1(US20030138772 서열 번호 46), AAV44.5(US20030138772 서열 번호 47), AAV223.1(US20030138772 서열 번호 48), AAV223.2(US20030138772 서열 번호 49), AAV223.4(US20030138772 서열 번호 50), AAV223.5(US20030138772 서열 번호 51), AAV223.6(US20030138772 서열 번호 52), AAV223.7(US20030138772 서열 번호 53), AAV A3.4(US20030138772 서열 번호 54), AAV A3.5(US20030138772 서열 번호 55), AAV A3.7(US20030138772 서열 번호 56), AAV A3.3(US20030138772 서열 번호 57), AAV42.12(US20030138772 서열 번호 58), AAV44.2(US20030138772 서열 번호 59), AAV42-2(US20030138772 서열 번호 9), 또는 이의 변이체와 같지만, 이들로 한정되지 않는, 미국 공개 공보 번호 US20030138772(이의 내용은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다)에 기재된 서열일 수 있거나 이를 가질 수 있는 AAV 혈청형을 포함하거나, 이로부터 유래될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 AAV 입자는 AAV2(US20150159173의 서열 번호 7 및 23), rh20(US20150159173의 서열 번호 1), rh32/33(US20150159173의 서열 번호 2), rh39(US20150159173의 서열 번호 3, 20 및 36), rh46(US20150159173의 서열 번호 4 및 22), rh73(US20150159173의 서열 번호 5), rh74(US20150159173의 서열 번호 6), AAV6.1(US20150159173의 서열 번호 29), rh.8(US20150159173의 서열 번호 41), rh.48.1(US20150159173의 서열 번호 44), hu.44(US20150159173의 서열 번호 45), hu.29(US20150159173의 서열 번호 42), hu.48(US20150159173의 서열 번호 38), rh54(US20150159173의 서열 번호 49), AAV2(US20150159173의 서열 번호 7), cy.5(US20150159173의 서열 번호 8 및 24), rh.10(US20150159173의 서열 번호 9 및 25), rh.13(US20150159173의 서열 번호 10 및 26), AAV1(US20150159173의 서열 번호 11 및 27), AAV3(US20150159173의 서열 번호 12 및 28), AAV6(US20150159173의 서열 번호 13 및 29), AAV7(US20150159173의 서열 번호 14 및 30), AAV 8(US20150159173의 서열 번호 15 및 31), hu.13(US20150159173의 서열 번호 16 및 32), hu.26(US20150159173의 서열 번호 17 및 33), hu.37(US20150159173의 서열 번호 18 및 34), hu.53(US20150159173의 서열 번호 19 및 35), rh.43(US20150159173의 서열 번호 21 및 37), rh2(US20150159173의 서열 번호 39), rh.37(US20150159173의 서열 번호 40), rh.64(US20150159173의 서열 번호 43), rh.48(US20150159173의 서열 번호 44), ch.5(US20150159173의 서열 번호 46), rh.67(US20150159173의 서열 번호 47), rh.58(US20150159173의 서열 번호 48), 또는, Cy5Rl, Cy5R2, Cy5R3, Cy5R4, rh.13R, rh.37R2, rh.2R, rh.8R, rh.48.1, rh.48.2, rh.48.1.2, hu.44Rl, hu.44R2, hu.44R3, hu.29R, ch.5R1, rh64R1, rh64R2, AAV6.2, AAV6.1, AAV6.12, hu.48Rl, hu.48R2, 및 hu.48R3을 포함하지만, 이들로 한정되지 않는 이의 변이체들과 같지만, 이들로 한정되지 않는, 미국 공개 공보 번호 US20150159173(이의 내용은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다)에 기재된 서열일 수 있거나 이를 가질 수 있는 AAV 혈청형을 포함하거나, 이로부터 유래될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 AAV 입자는 AAV9(미국 특허 제7198951호의 서열 번호 1~3), AAV2(미국 특허 제7198951호의 서열 번호 4), AAV1(미국 특허 제7198951호의 서열 번호 5), AAV3(미국 특허 제7198951호의 서열 번호 6), 및 AAV 8(미국 특허 제7198951호의 서열 번호 7)과 같지만, 이들로 한정되지 않는, 미국 특허 제7198951호(이의 내용은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다)에 기재된 서열일 수 있거나 이를 가질 수 있는 AAV 혈청형을 포함하거나, 이로부터 유래될 수 있다.
일부 실시형태에서, AAV 벡터는 AAV9.9, AAV9.11, AAV9.13, AAV9.16, AAV9.24, AAV9.45, AAV9.47, AAV9.61, AAV9.68, AAV9.84와 같지만, 이들로 한정되지 않는, N Pulicherla 등에 의해 기재된 바와 같은 (문헌[Molecular Therapy 19(6): 1070-1078 (2011)], 그 내용은 그 전체가 본원에 참고로 포함됨) AAV9 서열내 돌연변이일 수 있거나 이를 가질 수 있는 AAV 혈청형을 포함하거나, 이로부터 유래될 수 있다. 일부 실시형태에서, AAV 캡시드는 혈액-뇌 장벽을 가로질러 벡터를 전달하도록 조작된 하나 이상의 서열을 포함한다(예를 들어, 문헌[B.E. Deverman et al, Nature Biotech, Vol. 34, No. 2, p 204-211](2016년 2월 1일 온라인 공개) 참고, 및 Caltech press release, A. Wetherston, www.neurology-cenfrd.com/2016/02/10/successfd/brain-barrier; 또한, WO 2016/0492301 및 미국 특허 제8,734,809호 참고, 그 내용은 그 전체가 본원에 참고로 포함됨).
일부 실시형태에서, 본 발명의 AAV 입자는 AAV3B(미국 특허 제6156303호의 서열 번호 1 및 10), AAV6(미국 특허 제6156303호의 서열 번호 2, 7 및 11), AAV2(미국 특허 제6156303호의 서열 번호 3 및 8), AAV3A(미국 특허 제6156303호의 서열 번호 4 및 9), 또는 이의 유도체들과 같지만, 이들로 한정되지 않는, 미국 특허 제6156303호(이의 내용은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다)에 기재된 서열일 수 있거나 이를 가질 수 있는 AAV 혈청형을 포함하거나, 이로부터 유래될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 AAV 입자는 AAV 8(US20140359799의 서열 번호 1), AAVDJ(US20140359799의 서열 번호 2 및 3), 또는 이의 변이체들과 같지만, 이들로 한정되지 않는, US20140359799(이의 내용은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다)에 기재된 서열일 수 있거나 이를 가질 수 있는 AAV 혈청형을 포함하거나, 이로부터 유래될 수 있다.
일부 실시형태에서, AAV 입자는 Grimm et al.의 문헌([Journal of Virology 82(12): 5887-5911 (2008)], 그 내용은 그 전체가 본원에 참고로 포함됨)에 기재된 바와 같은 AAVDJ 또는 이의 변이체, 예컨대 AAVDJ8(또는 AAV-DJ8)과 같지만 이들로 한정되지 않는 혈청형으로부터의 캡시드를 포함할 수 있다. AAVDJ8의 아미노산 서열은 헤파린 결합 도메인(HBD)을 제거하기 위해 둘 이상의 돌연변이를 포함할 수 있다. 비-제한적인 예로서, 내용이 그 전체가 본원에 참고로 포함되는, 미국 특허 제7,588,772호에 서열 번호 1로 기재된 AAV-DJ 서열은 2개의 돌연변이를 포함할 수 있다: (1) R587Q(여기에서, 아미노산 587의 아르기닌(R; Arg)이 글루타민(Q; Gln)으로 변경됨) 및 (2) R590T(여기에서, 아미노산 590의 아르기닌(R; Arg)이 트레오닌(T; Thr)으로 변경됨). 또 다른 비-제한적인 예로서, 3개의 돌연변이를 포함할 수 있다: (1) K406R(여기에서, 아미노산 406의 라이신(K; Lys)이 아르기닌(R; Arg)으로 변경됨), (2) R587Q(여기에서, 아미노산 587의 아르기닌(R; Arg)이 글루타민(Q; Gln)으로 변경됨) 및 (3) R590T(여기에서, 아미노산 590의 아르기닌(R; Arg)이 트레오닌(T; Thr)으로 변경됨).
일부 실시형태에서, 본 발명의 AAV 입자는 AAV4(WO 1998011244의 서열 번호 1~20)와 같지만, 이들로 한정되지 않는, 국제 공개 공보 WO 1998011244(이의 내용은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다)에 기재된 서열일 수 있거나 이를 가질 수 있는 AAV 혈청형을 포함하거나, 이로부터 유래될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 AAV 입자는 국제 공개 공보 WO2014144229(이의 내용은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다)에 기재된 바와 같이, AAV2G9를 생성하기 위해 AAV2 서열 내 돌연변이일 수 있거나, 이를 가질 수 있는 AAV 혈청형을 포함하거나, 이로부터 유래될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 AAV 입자는 AAV3-3(WO2005033321의 서열 번호 217), AAV1(WO2005033321의 서열 번호 219 및 202), AAV106.1/hu.37(WO2005033321의 서열 번호 10), AAV114.3/hu.40(WO2005033321의 서열 번호 11), AAV127.2/hu.41(WO2005033321의 서열 번호6 및 8), AAV128.3/hu.44(WO2005033321의 서열 번호 81), AAV130.4/hu.48(WO2005033321의 서열 번호 78), AAV145.1/hu.53(WO2005033321의 서열 번호 176 및 177), AAV145.6/hu.56(WO2005033321의 서열 번호 168 및 192), AAV16.12/hu.11(WO2005033321의 서열 번호 153 및 57), AAV16.8/hu.10(WO2005033321의 서열 번호 156 및 56), AAV161.10/hu.60(WO2005033321의 서열 번호 170), AAV161.6/hu.61(WO2005033321의 서열 번호 174), AAV1- 7/rh.48(WO2005033321의 서열 번호 32), AAVl-8/rh.49 (WO2005033321의 서열 번호 103 및 25), AAV2(WO2005033321의 서열 번호 211 및 221), AAV2-15/rh.62(WO2005033321의 서열 번호 33 및 114), AAV2-3/rh.61(WO2005033321의 서열 번호 21), AAV2-4/rh.50(WO2005033321의 서열 번호 23 및 108), AAV2-5/rh.51(WO2005033321의 서열 번호 104 및 22), AAV3.1/hu.6(WO2005033321의 서열 번호 5 및 84), AAV3.1/hu.9(WO2005033321의 서열 번호 155 및 58), AAV3-l l/rh.53(WO2005033321의 서열 번호 186 및 176), AAV3-3(WO2005033321의 서열 번호 200), AAV33.12/hu.17(WO2005033321의 서열 번호 4), AAV33.4/hu.15(WO2005033321의 서열 번호 50), AAV33.8/hu.16(WO2005033321의 서열 번호 51), AAV3-9/rh.52(WO2005033321의 서열 번호 96 및 18), AAV4-19/rh.55(WO2005033321의 서열 번호 117), AAV4-4(WO2005033321의 서열 번호 201 및 218), AAV4-9/rh.54(WO2005033321의 서열 번호 116), AAV5(WO2005033321의 서열 번호 199 및 216), AAV52.1/hu.20(WO2005033321의 서열 번호 63), AAV52/hu. l9(WO2005033321의 서열 번호 133), AAV5-22/rh.58(WO2005033321의 서열 번호 27), AAV5-3/rh.57(WO2005033321의 서열 번호 105), AAV5- 3/rh.57(WO2005033321의 서열 번호 26), AAV58.2/hu.25(WO2005033321의 서열 번호 49), AAV6(WO2005033321의 서열 번호 203 및 220), AAV7(WO2005033321의 서열 번호 222 및 213), AAV7.3/hu.7(WO2005033321의 서열 번호 55), AAV 8(WO2005033321의 서열 번호 223 및 214), AAVH-l/hu.1(WO2005033321의 서열 번호 46), AAVH-5/hu.3(WO2005033321의 서열 번호 44), AAVhu.1(WO2005033321의 서열 번호 144), AAVhu.10(WO2005033321의 서열 번호 156), AAVhu.11(WO2005033321의 서열 번호 153), AAVhu.12 (WO2005033321 서열 번호 59), AAVhu.13(WO2005033321의 서열 번호 129), AAVhu.14/AAV9(WO2005033321의 서열 번호 123 및 3), AAVhu.15(WO2005033321의 서열 번호 147), AAVhu.16(WO2005033321의 서열 번호 148), AAVhu.17(WO2005033321의 서열 번호 83), AAVhu.18(WO2005033321의 서열 번호 149), AAVhu.19(WO2005033321의 서열 번호 133), AAVhu.2(WO2005033321의 서열 번호 143), AAVhu.20(WO2005033321의 서열 번호 134), AAVhu.21(WO2005033321의 서열 번호 135), AAVhu.22(WO2005033321의 서열 번호 138), AAVhu.23.2(WO2005033321의 서열 번호 137), AAVhu.24(WO2005033321의 서열 번호 136), AAVhu.25(WO2005033321의 서열 번호 146), AAVhu.27(WO2005033321의 서열 번호 140), AAVhu.29(WO2005033321의 서열 번호 132), AAVhu.3(WO2005033321의 서열 번호 145), AAVhu.31(WO2005033321의 서열 번호 121), AAVhu.32(WO2005033321의 서열 번호 122), AAVhu.34(WO2005033321의 서열 번호 125), AAVhu.35(WO2005033321의 서열 번호 164), AAVhu.37(WO2005033321의 서열 번호 88), AAVhu.39(WO2005033321의 서열 번호 102), AAVhu.4(WO2005033321의 서열 번호 141), AAVhu.40(WO2005033321의 서열 번호 87), AAVhu.41(WO2005033321의 서열 번호 91), AAVhu.42(WO2005033321의 서열 번호 85), AAVhu.43(WO2005033321의 서열 번호 160), AAVhu.44(WO2005033321의 서열 번호 144), AAVhu.45(WO2005033321의 서열 번호 127), AAVhu.46(WO2005033321의 서열 번호 159), AAVhu.47(WO2005033321의 서열 번호 128), AAVhu.48(WO2005033321의 서열 번호 157), AAVhu.49(WO2005033321의 서열 번호 189), AAVhu.51(WO2005033321의 서열 번호 190), AAVhu.52(WO2005033321의 서열 번호 191), AAVhu.53(WO2005033321의 서열 번호 186), AAVhu.54(WO2005033321의 서열 번호 188), AAVhu.55(WO2005033321의 서열 번호 187), AAVhu.56(WO2005033321의 서열 번호 192), AAVhu.57(WO2005033321의 서열 번호 193), AAVhu.58(WO2005033321의 서열 번호 194), AAVhu.6(WO2005033321의 서열 번호 84), AAVhu.60(WO2005033321의 서열 번호 184), AAVhu.61(WO2005033321의 서열 번호 185), AAVhu.63(WO2005033321의 서열 번호 195), AAVhu.64(WO2005033321의 서열 번호 196), AAVhu.66(WO2005033321의 서열 번호 197), AAVhu.67(WO2005033321의 서열 번호 198), AAVhu.7(WO2005033321의 서열 번호 150), AAVhu.8 (WO2005033321 서열 번호 12), AAVhu.9(WO2005033321의 서열 번호 155), AAVLG- 10/rh.40(WO2005033321의 서열 번호 14), AAVLG-4/rh.38(WO2005033321의 서열 번호 86), AAVLG-4/rh.38(WO2005033321의 서열 번호 7), AAVN721-8/rh.43(WO2005033321의 서열 번호 163), AAVN721-8/rh.43(WO2005033321의 서열 번호 43), AAVpi. l(WO2005033321 서열 번호 28), AAVpi.2(WO2005033321 서열 번호 30), AAVpi.3(WO2005033321 서열 번호 29), AAVrh.38(WO2005033321의 서열 번호 86), AAVrh.40(WO2005033321의 서열 번호 92), AAVrh.43(WO2005033321의 서열 번호 163), AAVrh.44(WO2005033321 서열 번호 34), AAVrh.45(WO2005033321 서열 번호 41), AAVrh.47(WO2005033321 서열 번호 38), AAVrh.48(WO2005033321의 서열 번호 115), AAVrh.49(WO2005033321의 서열 번호 103), AAVrh.50(WO2005033321의 서열 번호 108), AAVrh.51(WO2005033321의 서열 번호 104), AAVrh.52(WO2005033321의 서열 번호 96), AAVrh.53(WO2005033321의 서열 번호 97), AAVrh.55(WO2005033321 서열 번호 37), AAVrh.56(WO2005033321의 서열 번호 152), AAVrh.57(WO2005033321의 서열 번호 105), AAVrh.58(WO2005033321의 서열 번호 106), AAVrh.59(WO2005033321 서열 번호 42), AAVrh.60(WO2005033321 서열 번호 31), AAVrh.61(WO2005033321의 서열 번호 107), AAVrh.62(WO2005033321의 서열 번호 114), AAVrh.64(WO2005033321의 서열 번호 99), AAVrh.65(WO2005033321 서열 번호 35), AAVrh.68(WO2005033321 서열 번호 16), AAVrh.69(WO2005033321 서열 번호 39), AAVrh.70(WO2005033321 서열 번호 20), AAVrh.72(WO2005033321 서열 번호 9), 또는, AAVcy.2, AAVcy.3, AAVcy.4, AAVcy.5, AAVcy.6, AAVrh.12, AAVrh.17, AAVrh.18, AAVrh.19, AAVrh.21, AAVrh.22, AAVrh.23, AAVrh.24, AAVrh.25, AAVrh.25/42 15, AAVrh.31, AAVrh.32, AAVrh.33, AAVrh.34, AAVrh.35, AAVrh.36, AAVrh.37, AAVrhl4를 포함하지만, 이들로 한정되지 않는 이의 변이체와 같지만, 이들로 한정되지 않는, 국제 공개 공보 WO2005033321(이의 내용은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다)에 기재된 서열일 수 있거나 이를 가질 수 있는 AAV 혈청형을 포함하거나, 이로부터 유래될 수 있다. 변이체의 비제한적인 예는 WO2005033321(이의 내용은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다)의 서열 번호 13, 15, 17, 19, 24, 36, 40, 45, 47, 48, 51~54, 60~62, 64~77, 79, 80, 82, 89, 90, 93~95, 98, 100, 101, 109~113, 118~120, 124, 126, 131, 139, 142, 151,154, 158, 161, 162, 165~183, 202, 204~212, 215, 219, 224~236을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 AAV 입자는 AAVrh8R(WO2015168666의 서열 번호 9), AAVrh8R A586R 돌연변이체(WO2015168666의 서열 번호 10), AAVrh8R R533A 돌연변이체(WO2015168666의 서열 번호 11), 또는 이의 변이체들과 같지만, 이들로 한정되지 않는, 국제 공개 공보 번호 WO2015168666(이의 내용은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다)에 기재된 서열일 수 있거나 이를 가질 수 있는 AAV 혈청형을 포함하거나, 이로부터 유래될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 AAV 입자는 AAVhu68(예를 들어, WO2018160582의 서열 번호 2), 또는 이의 변이체들과 같지만, 이들로 한정되지 않는, 국제 공개 공보 번호 WO2018/160582(이의 내용은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다)에 기재된 서열일 수 있거나 이를 가질 수 있는 AAV 혈청형을 포함하거나, 이로부터 유래될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 AAV 입자는 AAVhE1.1(US9233131의 서열 번호 44), AAVhErl.5(US9233131의 서열 번호 45), AAVhER1.14(US9233131의 서열 번호 46), AAVhErl.8(US9233131의 서열 번호 47), AAVhEr1.16(US9233131의 서열 번호 48), AAVhEr1.18(US9233131의 서열 번호 49), AAVhEr1.35(US9233131의 서열 번호 50), AAVhEr1.7(US9233131의 서열 번호 51), AAVhEr1.36(US9233131의 서열 번호 52), AAVhEr2.29(US9233131의 서열 번호 53), AAVhEr2.4(US9233131의 서열 번호 54), AAVhEr2.16(US9233131의 서열 번호 55), AAVhEr2.30(US9233131의 서열 번호 56), AAVhEr2.31(US9233131의 서열 번호 58), AAVhEr2.36(US9233131의 서열 번호 57), AAVhER1.23(US9233131의 서열 번호 53), AAVhEr3.1(US9233131의 서열 번호 59), AAV2.5T(US9233131의 서열 번호 42), 또는 이의 변이체들과 같지만, 이들로 한정되지 않는, 미국 특허 US9233131(이의 내용은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다)에 기재된 서열일 수 있거나 이를 가질 수 있는 AAV 혈청형을 포함하거나, 이로부터 유래될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 AAV 입자는 AAV-PAEC(US20150376607의 서열 번호 1), AAV-LKOl(US20150376607의 서열 번호 2), AAV-LK02(US20150376607의 서열 번호 3), AAV-LK03(US20150376607의 서열 번호 4), AAV-LK04(US20150376607의 서열 번호 5), AAV-LK05(US20150376607의 서열 번호 6), AAV-LK06(US20150376607의 서열 번호 7), AAV-LK07(US20150376607의 서열 번호 8), AAV-LK08(US20150376607의 서열 번호 9), AAV-LK09(US20150376607의 서열 번호 10), AAV- LK10(US20150376607의 서열 번호 l), AAV-LK11(US20150376607의 서열 번호 12), AAV-LK12(US20150376607의 서열 번호 13), AAV-LK13(US20150376607의 서열 번호 14), AAV-LK14(US20150376607의 서열 번호 15), AAV-LK15(US20150376607의 서열 번호 16), AAV-LK16(US20150376607의 서열 번호 17), AAV-LK17(US20150376607의 서열 번호 18), AAV-LK18(US20150376607의 서열 번호 19), AAV- LK19(US20150376607의 서열 번호 20), AAV-PAEC2(US20150376607의 서열 번호 21), AAV-PAEC 4(US20150376607의 서열 번호 22), AAV-PAEC6(US20150376607의 서열 번호 23), AAV-PAEC7(US20150376607의 서열 번호 24), AAV-PAEC 8(US20150376607의 서열 번호 25), AAV-PAEC11(US20150376607의 서열 번호 26), AAV-PAEC 12(US20150376607의 서열 번호 27), 또는 이의 변이체들과 같지만, 이들로 한정되지 않는, 미국 특허 공개 번호 US20150376607(이의 내용은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다)에 기재된 서열일 수 있거나 이를 가질 수 있는 AAV 혈청형을 포함하거나, 이로부터 유래될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 AAV 입자는 AAV-2-pre-miRNA-101(미국 특허 제9163261호의 서열 번호 1), 또는 이의 변이체들과 같지만, 이들로 한정되지 않는, 미국 특허 제9163261호(이의 내용은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다)에 기재된 서열일 수 있거나 이를 가질 수 있는 AAV 혈청형을 포함하거나, 이로부터 유래될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 AAV 입자는 AAV-8h(US20150376240의 서열 번호 6), AAV-8b(US20150376240의 서열 번호 5), AAV-h(US20150376240의 서열 번호 2), AAV-b(US20150376240의 서열 번호 1), 또는 이의 변이체들과 같지만, 이들로 한정되지 않는, 미국 특허 공개 번호 US20150376240(이의 내용은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다)에 기재된 서열일 수 있거나 이를 가질 수 있는 AAV 혈청형을 포함하거나, 이로부터 유래될 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 AAV 입자는 AAV SM 10-2(US20160017295의 서열 번호 22), AAV 셔플(Shuffle) 100-1(US20160017295의 서열 번호 23), AAV 셔플 100-3(US20160017295의 서열 번호 24), AAV 셔플 100-7(US20160017295의 서열 번호 25), AAV 셔플 10-2(US20160017295의 서열 번호 34), AAV 셔플 10-6(US20160017295의 서열 번호 35), AAV 셔플 10-8(US20160017295의 서열 번호 36), AAV 셔플 100-2(US20160017295의 서열 번호 37), AAV SM 10-1(US20160017295의 서열 번호 38), AAV SM 10-8(US20160017295의 서열 번호 39), AAV SM 100-3(US20160017295의 서열 번호 40), AAV SM 100-10(US20160017295의 서열 번호 41), 또는 이의 변이체들과 같지만, 이들로 한정되지 않는, 미국 특허 공개 번호 US20160017295(이의 내용은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다)에 기재된 서열일 수 있거나 이를 가질 수 있는 AAV 혈청형을 포함하거나, 이로부터 유래될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 AAV 입자는 BNP61 AAV(US20150238550의 서열 번호 1), BNP62 AAV(US20150238550의 서열 번호 3), BNP63 AAV(US20150238550의 서열 번호 4), 또는 이의 변이체들과 같지만, 이들로 한정되지 않는, 미국 특허 공개 번호 US20150238550(이의 내용은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다)에 기재된 서열일 수 있거나 이를 가질 수 있는 AAV 혈청형을 포함하거나, 이로부터 유래될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 AAV 입자는 AAVrh.50(US20150315612의 서열 번호 108), AAVrh.43(US20150315612의 서열 번호 163), AAVrh.62(US20150315612의 서열 번호 114), AAVrh.48(US20150315612의 서열 번호 115), AAVhu.19(US20150315612의 서열 번호 133), AAVhu. l l(US20150315612의 서열 번호 153), AAVhu.53(US20150315612의 서열 번호 186), AAV4-8/rh.64(US20150315612의 서열 번호 15), AAVLG-9/hu.39(US20150315612의 서열 번호 24), AAV54.5/hu.23(US20150315612의 서열 번호 60), AAV54.2/hu.22(US20150315612의 서열 번호 67), AAV54.7/hu.24(US20150315612의 서열 번호 66), AAV54.1/hu.21(US20150315612의 서열 번호 65), AAV54.4R/hu.27(US20150315612의 서열 번호 64), AAV46.2/hu.28(US20150315612의 서열 번호 68), AAV46.6/hu.29(US20150315612의 서열 번호 69), AAV128.1/hu.43(US20150315612의 서열 번호 80), 또는 이의 변이체들과 같지만, 이들로 한정되지 않는, 미국 특허 공개 번호 US20150315612(이의 내용은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다)에 기재된 서열일 수 있거나 이를 가질 수 있는 AAV 혈청형을 포함하거나, 이로부터 유래될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 AAV 입자는 트루 타입 AAV (ttAAV)(WO2015121501의 서열 번호 2), "UPenn AAV10"(WO2015121501의 서열 번호 8), "재패니즈 AAV10"(WO2015121501의 서열 번호 9), 또는 이의 변이체들과 같지만, 이들로 한정되지 않는, 국제 공개 번호 WO2015121501(이의 내용은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다)에 기재된 서열일 수 있거나 이를 가질 수 있는 AAV 혈청형을 포함하거나, 이로부터 유래될 수 있다.
본 발명에 따르면, AAV 입자는 다양한 종으로부터 선택되거나 유래될 수 있는 AAV 캡시드 혈청형을 포함할 수 있다. 일 실시형태에서, AAV는 조류 AAV(AAAV)일 수 있다. AAAV 혈청형은 AAAV(US 9,238,800의 서열 번호 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 및 14), 또는 이의 변이체와 같지만, 이들로 한정되지 않는, 미국 특허 번호 US 9238800(이의 내용은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다)에 기재된 서열일 수 있거나 이를 가질 수 있다.
일 실시형태에서, AAV 입자는 소 AAV(BAAV)이거나, 이로부터 유래될 수 있는 AAV 캡시드 혈청형을 포함할 수 있다. BAAV 혈청형은 BAAV(US 9193769의 서열 번호 1 및 6), 또는 이의 변이체와 같지만, 이들로 한정되지 않는, 미국 특허 제9,193,769호에 기재된 서열일 수 있거나 이를 가질 수 있으며, 이의 내용은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다. BAAV 혈청형은 BAAV(US7427396의 서열 번호 5 및 6), 또는 이의 변이체와 같지만, 이들로 한정되지 않는, 미국 특허 제7427396호(이의 내용은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다)에 기재된 서열일 수 있거나 이를 가질 수 있다.
일 실시형태에서, AAV 입자는 염소 AAV이거나, 이로부터 유래될 수 있는 AAV 캡시드 혈청형을 포함할 수 있다. 염소 AAV 혈청형은 염소 AAV(US7427396의 서열 번호 3), 또는 이의 변이체와 같지만, 이들로 한정되지 않는, 미국 특허 제7427396호(이의 내용은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다)에 기재된 서열일 수 있거나 이를 가질 수 있다.
다른 실시형태에서, AAV 입자는 2개 이상의 모 혈청형으로부터 하이브리드 AAV로 조작될 수있는 AAV 캡시드 혈청형을 포함할 수 있다. 일 실시형태에서, AAV는 AAV2 및 AAV9로부터의 서열을 포함하는 AAV2G9일 수 있다. AAV2G9 AAV 혈청형은 미국 특허 공개 번호 US20160017005(이의 내용은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다)에 기재된 서열이거나, 이를 가질 수 있다.
일 실시형태에서, AAV 입자는 Pulicherla 등의 문헌[(Molecular Therapy 19(6): 1070-1078 (2011)](이의 내용은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다)에 기재된 바와 같이, 아미노산 390~627(VP1 넘버링)에 돌연변이를 갖는 AAV9 캡시드 라이브러리에 의해 생성될 수 있는 AAV 캡시드 혈청형을 포함할 수 있다. 혈청형 및 상응하는 뉴클레오타이드 및 아미노산 치환은 AAV9.1(G1594C; D532H), AAV6.2(T1418A 및 T1436X; V473D 및 I479K), AAV9.3(T1238A; F413Y), AAV9.4(T1250C 및 A1617T; F417S), AAV9.5(A1235G, A1314T, A1642G, C1760T; Q412R, T548A, A587V), AAV9.6(T1231A; F411I), AAV9.9(G1203A, G1785T; W595C), AAV9.10(A1500G, T1676C; M559T), AAV9.11(A1425T, A1702C, A1769T; T568P, Q590L), AAV9.13(A1369C, A1720T; N457H, T574S), AAV9.14(T1340A, T1362C, T1560C, G1713A; L447H), AAV9.16(A1775T; Q592L), AAV9.24(T1507C, T1521G; W503R), AAV9.26(A1337G, A1769C; Y446C, Q590P), AAV9.33(A1667C; D556A), AAV9.34(A1534G, C1794T; N512D), AAV9.35(A1289T, T1450A, C1494T, A1515T, C1794A, G1816A; Q430L, Y484N, N98K, V606I), AAV9.40(A1694T, E565V), AAV9.41(A1348T, T1362C; T450S), AAV9.44(A1684C, A1701T, A1737G; N562H, K567N), AAV9.45(A1492T, C1804T; N498Y, L602F), AAV9.46(G1441C, T1525C, T1549G; G481R, W509R, L517V), 9.47(G1241A, G1358A, A1669G, C1745T; S414N, G453D, K557E, T582I), AAV9.48(C1445T, A1736T; P482L, Q579L), AAV9.50(A1638T, C1683T, T1805A; Q546H, L602H), AAV9.53(G1301A, A1405C, C1664T, G1811T; R134Q, S469R, A555V, G604V), AAV9.54(C1531A, T1609A; L511I, L537M), AAV9.55(T1605A; F535L), AAV9.58(C1475T, C1579A; T492I, H527N), AAV.59(T1336C; Y446H), AAV9.61(A1493T; N498I), AAV9.64(C1531A, A1617T; L511I), AAV9.65(C1335T, T1530C, C1568A; A523D), AAV9.68(C1510A; P504T), AAV9.80(G1441A,;G481R), AAV9.83(C1402A, A1500T; P468T, E500D), AAV9.87(T1464C, T1468C; S490P), AAV9.90(A1196T; Y399F), AAV9.91(T1316G, A1583T, C1782G, T1806C; L439R, K528I), AAV9.93(A1273G, A1421G, A1638C, C1712T, G1732A, A1744T, A1832T; S425G, Q474R, Q546H, P571L, G578R, T582S, D611V), AAV9.94(A1675T; M559L) 및 AAV9.95(T1605A; F535L)일 수 있지만, 이들로 한정되지 않는다.
일 실시형태에서, 본 발명의 AAV 입자는 국제 공개 번호 WO2014160092(이의 내용은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다)의, 뇌에 대한 증가된 향성을 갖는, 서열 번호 1 및 3의 서열을 갖는 캡시드 단백질을 포함할 수 있다.
일 실시형태에서, 본 발명의 AAV 입자는 중추 신경계에서 희소돌기아교세포를 표적화할 수 있는 캡시드 단백질을 포함할 수 있다. 캡시드 단백질은 국제 공개 번호 WO2014052789(이의 내용은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다)의 서열 번호 1의 AAV 캡시드 코딩 서열 또는 서열 번호 2 내지 4의 아미노산 서열을 포함하는 AAV 캡시드 단백질을 포함할 수 있다.
일 실시형태에서, 본 발명의 AAV 입자는 미국 특허 번호 제8,927,514호(이의 내용은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다)에 개시된 바와 같이, CNS에서 혈액-뇌 장벽을 통과하는 능력이 증가된 캡시드 단백질을 포함할 수 있다. 이러한 캡시드 단백질의 아미노산 서열 및 핵산 서열은 각각 미국 특허 번호 제8,927,514호의 서열 번호 2~17 및 서열 번호 25~33을 포함할 수 있지만, 이들로 한정되지 않는다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 AAV 입자는 AAV2 캡시드 단백질 또는 이의 변이체를 포함할 수 있다. AAV2 캡시드 단백질을 갖는 AAV 입자는 뇌, 망막 및 척수에서 뉴런에 유전자를 효과적으로 전달하는 것으로 나타났다. 일 실시형태에서, AAV2 캡시드 단백질은 미국 특허 번호 제6,691,948호 및 제8,299,215호(이의 내용은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다)에 개시된 바와 같이, AAV 입자를 뇌 혈관 내피로 표적화하는 캡시드 단백질에 표적화 펩타이드를 첨가하는 것과 같이 추가로 변형될 수 있다. 이러한 AAV 입자는 예를 들어 본원에 기재된 바와 같은, 기능성 hTREM2 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 전달하는 데 사용될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 AAV 입자는 AAV5 캡시드 단백질 또는 이의 변이체를 포함할 수 있다. AAV5 캡시드 단백질을 포함하는 AAV 입자는 피질, 해마(HPC), 소뇌, 흑질(SN), 선조체, 담창구, 및 척수를 포함하는 CNS의 다양한 영역에 뉴런을 형질도입할 수 있다(문헌[Burger C et al, Mol Ther., 2004, 10(2): 302-317]; [Liu G et al, Mol Ther. 2007, 15(2): 242-247]; 및 [Colle M et al, Hum, Mol. Genet. 2010, 19(1): 147-158]). 일 실시형태에서, CNS에서 세포로의 형질도입이 증가된 AAV 5 캡시드 단백질을 갖는 AAV 입자는 미국 특허 번호 제7,056,502호(이의 내용은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다)로부터의 입자일 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 AAV 입자는 AAV6 캡시드 단백질 또는 이의 변이체를 포함할 수 있다. 재조합 AAV6 혈청형은 뇌실내(ICV) 주사에 의해 척수에서 운동 뉴런을 표적화할 수 있다(문헌[Dirren E et al., Hum Gene Ther., 2014, 25(2): 109-120]). 또한, San Sebastian 등의 연구에 따르면 AAV6 혈청형은 래트 뇌의 말단에서 신경 세포체로 역행적으로 이동될 수 있다(문헌[San Sebastian et al, Gen Ther., 2014, 20(12): 1178-1183]).
일부 실시형태에서, 본 발명의 AAV 입자는 AAV8 캡시드 단백질 또는 이의 변이체를 포함할 수 있다. AAV8 캡시드 단백질을 갖는 AAV 입자는 예를 들어 해마에서 뉴런을 형질도입할 수 있다(문헌[Klein RL et al, Mol Ther., 2006, 13(3): 517-527]). 일 실시형태에서, AAV8 캡시드 단백질은 미국 특허 번호 제8,318,480호(이의 내용은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다)의 서열 번호 2의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 AAV 입자는 AAV9 캡시드 단백질 또는 이의 변이체를 포함할 수 있다. AAV9 캡시드 혈청형 매개 유전자 전달은 CNS에 실질 내 주사 후 이식유전자의 효율적이고 장기적인 발현으로 뇌에서 관찰되었다(문헌[Klein RL et al, Eur J Neurosci., 2008, 27: 1615-1625]). AAV9 혈청형은 신생아 대상체에서 말초, 전신(예를 들어, 정맥 내) 투여 후 CNS 전체에 걸쳐 강력하고 광범위한 신경세포 전달을 생성할 수 있다(문헌[Foust KD et al, Nat. Biotechnol, 2009, 27: 59-65]; 및 [Duque S et al, Mol Ther., 2009, 17: 1187-1196]). AAV9 혈청형의 척수강 내(수조내 경로) 투여는 또한, 광범위한 척추 발현을 생성할 수 있다. 일 실시형태에서, AAV9 혈청형은 미국 특허 번호 제7,198,951호(이의 내용은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다)의 서열 번호 2의 아미노산 서열을 갖는 AAV 캡시드 단백질을 포함할 수 있다. 또 다른 양태에서, 미국 특허 공개 번호 US20130224836(이의 내용은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다)에 개시된 바와 같이, AAV9 혈청형은 서열 번호 2, 4 또는 6의 VP1 캡시드 단백질을 포함할 수 있으며, 아미노산 서열내 표면-발현된 티로신 잔기들 중 적어도 하나가 또 다른 아미노산 잔기로 치환된다. 실시형태에서, AAV9 캡시드를 포함하는 AAV 벡터는 전신적으로, 예를 들어 정맥 내로 투여된다. 실시형태에서, AAV9 캡시드를 포함하는 AAV 벡터는 뇌, 척추 또는 뇌척수액(CSF), 예를 들어, 척수강 내로 투여된다.
일부 실시형태에서, AAV 벡터는 특정 특성을 달성하도록 조작된 변이체 캡시드 단백질을 포함한다. 조작된 캡시드를 얻기 위한 이러한 방법은 예를 들어 특허 공개 WO2011038187(이의 내용은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다)에 설명되어 있다. 이러한 방법 및 벡터는 또한 예를 들어 특허 공개 WO2012112832 및 특허 출원 공개 WO2015054653(이의 내용은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다)에 기재되어 있다. 이러한 변이체 캡시드는 예를 들어, WO2015054653의 서열 번호 23, 또는 이의 변이체를 포함한다. 추가의 변이체 캡시드는 예를 들어 특허 공개 WO2017/019994(이의 내용은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다)에 기재된 캡시드 서열을 포함한다. 실시형태에서, AAV 벡터는 Anc80 AAV 캡시드 서열의 캡시드(예를 들어, WO2017019994의 서열 번호 1), 예를 들어, Anc80L65(예를 들어, WO2017019994의 서열 번호 23), 또는, 예를 들어, Anc110(예를 들어, WO2017019994의 서열 번호 42)을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 AAV 입자는 AAVrh10 캡시드 단백질 또는 이의 변이체를 포함할 수 있다. AAVrh10 캡시드 단백질을 포함하는 AAV 입자는 척수강 내(IT) 투여후 척수에서 뉴런과 다른 세포들을 표적화할 수 있다. 일 실시형태에서, AAVrh10 캡시드 단백질은 유럽 특허 번호 제2341068호의 서열 번호 81의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 AAV는 AAVDJ 캡시드 단백질, AAVDJ/8 캡시드 단백질, 또는 이의 변이체를 포함할 수 있다. Holehonnur 등은 AAVDJ/8 혈청형이 기저 및 외측 편도핵(BLA)내 뉴런을 표적화할 수 있음을 보여주었다(문헌[Holehonnur R et al., BMC Neurosci, 2014, Feb 18: 15:28]). 일 실시형태에서, AAVDJ 캡시드 단백질 및/또는 AAVDJ/8 캡시드 단백질은 제1 AAV 혈청형(예를 들어, AAV2)으로부터 유래된 제1 영역, 제2 AAV 혈청형(예를 들어, AAV8)으로부터 유래된 제2 영역, 및 제3 AAV 혈청형(예를 들어, AAV 9)으로부터 유래된 제3 영역을 포함하는 아미노산 서열을 포함할 수 있으며, 여기서 제1, 제2 및 제3 영역은 본 상세한 설명에 개시된 임의의 아미노산 서열들을 포함할 수 있다.
일 실시형태에서, 본 발명의 AAV 입자는 배근 신경절(DRG)을 형질도입하는 것으로 나타났거나, 형질도입하는 것으로 알려진 캡시드 단백질을 포함할 수 있다.
일 실시형태에서, 본 발명의 AAV 입자는 운동 뉴런을 형질도입하는 것으로 나타났거나, 형질도입하는 것으로 알려진 캡시드 단백질을 포함할 수 있다.
일 실시형태에서, AAV 입자는 자기-상보적(SC) 벡터 게놈을 포함한다.
일 실시형태에서, AAV 입자는 단일 가닥(SS) 게놈을 포함한다.
일 실시형태에서, 자기-상보적(sc) 벡터를 포함하는 AAV 입자를 사용하여 상응하는 단일 가닥 벡터 게놈을 포함하는 AAV 입자보다 더 높은 발현을 생성할 수 있다.
일 실시형태에서, 본원에 기재된 AAV 입자의 혈청형은 요구되는 원하는 분포, 형질도입 효율 및 세포 표적화에 의존할 수 있다. Sorrentino 등의 (문헌[comprehensive map of CNS transduction by eight adeno-associated virus serotypes upon cerebrospinal fluid administration in pigs, Molecular Therapy accepted article preview online 07 December 2015; doi: 10.1038/mt.2015.212]; 그 내용은 그 전체가 본원에 참고로 포함됨)에 기재된 바와 같이, AAV 혈청형은 상이한 분포, 형질도입 효율 및 세포 표적화를 제공하였다. 원하는 효능을 제공하기 위해 AAV 혈청형은 표적화할 세포뿐만 아니라 원하는 형질도입 효율 및 분포에 가장 잘 맞는 것을 선택할 필요가 있다.
일 실시형태에서, AAV 벡터는 AAV9 캡시드(본원에 기재된 바와 같음) 및 (1) AAV2로부터 유래된 ITR, (2) A CMV 인핸서(예를 들어, 서열 번호 134), (3) CBA 프로모터(예를 들어, 서열 번호 135), (4) SV40 인트론(예를 들어, 서열 번호 137), (5) hTREM2 항체 또는 이의 항원-결합 단편(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같음)을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 및 (6) BGH 폴리 A 신호(예를 들어, 서열 번호 138)를 포함하는 AAV 벡터 플라스미드를 포함한다. 일 실시형태에서, 요소들 (2) 내지 (6)은 5'로부터 3'까지 AAV 벡터 플라스미드 상에 배치된다. 실시형태에서, 요소들 (2) 내지 (6)은 5' ITR과 3' ITR 사이의 AAV 벡터 플라스미드 상에 배치된다. 일 실시형태에서, AAV 벡터는 scAAV 벡터이다.
단클론 항체의 생성
단클론 항체(mAb)는 종래의 단클론 항체 방법, 예를 들어 문헌[Kohler and Milstein, 1975 Nature 256: 495]의 표준 체세포 혼성화 기술을 포함하는 여러 가지 기술들에 의해 생성될 수 있다. 단클론 항체를 생성하기 위한 많은 기술들, 예를 들어 B 림프구의 바이러스 또는 종양형성(oncogenic) 형질전환이 이용될 수 있다.
하이브리도마를 제조하기 위한 동물 시스템으로는 뮤린 시스템이 있다. 마우스에서의 하이브리도마 생성은 잘 확립된 절차이다. 면역화 프로토콜, 및 융합을 위한 면역화된 비장세포의 단리 기술은 당업계에 알려져 있다. 융합 파트너(예컨대 뮤린 골수종 세포) 및 융합 절차가 또한 공지되어 있다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 항체는 인간화 단클론 항체이다. 본 발명의 키메라 또는 인간화 항체 및 이의 항원 결합 단편은 상기 기재된 바와 같이 제조된 뮤린 단클론 항체의 서열을 기초로 하여 제조될 수 있다. 중쇄 및 경쇄 면역글로불린을 코딩하는 DNA는 관심 뮤린 하이브리도마로부터 수득되고 비-뮤린(예컨대 인간) 면역글로불린 서열을 함유하도록 조작될 수 있다(표준 분자 생물학 기술을 사용). 예를 들어, 키메라 항체를 생성하기 위해, 뮤린 가변 영역은 당업계에 알려진 방법을 사용하여 인간 불변 영역에 연결될 수 있다(예를 들어, 미국 특허 제4,816,567호(Cabilly 등) 참조). 인간화된 항체를 생성하기 위해, 뮤린 CDR 영역은 당업계에 공지된 방법을 사용하여 인간 프레임워크 내로 삽입될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 제5,225,539호(Winter), 및 미국 특허 제5,530,101호; 미국 특허 제5,585,089호; 미국 특허 제5,693,762호 및 미국 특허 제6180370호(Queen 등)를 참조한다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 항체는 인간 단클론 항체이다. TREM2에 대해 유도된 이러한 인간 단클론 항체는 마우스 시스템보다는 인간 면역계의 부분을 지닌 트랜스제닉 또는 트랜스크로모조믹(transchromosomic) 마우스를 사용하여 발생될 수 있다. 이들 트랜스제닉 및 트랜스염색체 마우스에는 본원에서 각각 HuMAb 마우스 및 KM 마우스로 언급되는 마우스가 포함되고, 본원에서 "인간 Ig 마우스"로 통칭된다.
HuMAb Mouse®(Medarex, Inc.)는, 내인성 뮤 및 카파 사슬 유전자좌를 불활성화시키는 표적화된 돌연변이와 함께, 재배열되지 않은 인간 중쇄(뮤 및 감마) 및 카파 경쇄 면역글로불린 서열을 코딩하는 인간 면역글로불린 유전자 미니유전자좌(miniloci)를 함유한다(예를 들어, 문헌[Lonberg, et al., 1994 Nature 368 (6474): 856-859] 참조). 따라서, 마우스는 마우스 IgM 또는 IgK의 감소된 발현을 나타내고, 면역화에 반응하여, 도입된 인간 중쇄 및 경쇄 이식유전자는 클래스 스위칭 및 체세포 돌연변이를 겪어서 고 친화도 인간 IgG-카파 단클론을 생성한다(상기 문헌[Lonberg, N. et al., 1994]; 문헌[Lonberg, N., 1994 Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101]에 개관됨; 문헌[Lonberg, N. and Huszar, D., 1995 Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93], 및 문헌[Harding, F. and Lonberg, N., 1995 Ann. N.Y. Acad. Sci. 764:536-546]). HuMAb 마우스가 지닌 게놈 변형, 및 이러한 마우스의 제조 및 사용은 문헌[Taylor, L. et al., 1992 Nucleic Acids Research 20:6287-6295]; 문헌[Chen, J. et al., 1993 International Immunology 5: 647-656]; 문헌[Tuaillon et al., 1993 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:3720-3724]; 문헌[Choi et al., 1993 Nature Genetics 4:117-123]; 문헌[Chen, J. et al., 1993 EMBO J. 12: 821-830]; 문헌[Tuaillon et al., 1994 J. Immunol. 152:2912-2920]; 문헌[Taylor, L. et al., 1994 International Immunology 579-591]; 및 문헌[Fishwild, D. et al., 1996 Nature Biotechnology 14: 845-851]에 추가로 기재되어 있으며, 이들 모두의 내용은 그 전체가 본원에 구체적으로 참고로 포함된다. 추가로, 미국 특허 제5,545,806호; 미국 특허 제5,569,825호; 미국 특허 제5,625,126호; 미국 특허 제5,633,425호; 미국 특허 제5,789,650호; 미국 특허 제5,877,397호; 미국 특허 제5,661,016호; 미국 특허 제5,814,318호; 미국 특허 제5,874,299호; 및 미국 특허 제5,770,429호(전부 Lonberg 및 Kay); 미국 특허 제5,545,807호(Surani 등); PCT 공개 WO 92103918, WO 93/12227, WO 94/25585, WO 97113852, WO 98/24884 및 WO 99/45962(전부 Lonberg 및 Kay); 및 PCT 공개 WO 01/14424(Korman 등)를 참조한다.
일부 실시형태에서, 인간 항체는, 이식유전자 및 트랜스크로모좀 상에 인간 면역글로불린 서열을 지닌 마우스, 예컨대 인간 중쇄 이식유전자 및 인간 경쇄 트랜스크로모좀을 지닌 마우스를 사용하여 발생될 수 있다. 본원에서 "KM 마우스"로 지칭되는 이러한 마우스는 Ishida 등의 PCT 공개 WO 02/43478에 상세하게 기재되어 있다.
보다 나아가, 인간 면역글로불린 유전자를 발현하는 대안적인 트랜스제닉 동물 시스템은 당업계에서 입수가능하고, TREM2-결합 항체 및 이의 항원 결합 단편을 발생시키는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, Xenomouse(Abgenix, Inc.)로 언급되는 대안적인 트랜스제닉 시스템이 사용될 수 있다. 이러한 마우스는 예를 들어 미국 특허 제5,939,598호; 미국 특허 제6,075,181호; 미국 특허 제6,114,598호; 미국 특허 제6,150,584호 및 미국 특허 제6,162,963호(Kucherlapati 등)에 기재되어 있다.
더욱이, 인간 면역글로불린 유전자를 발현하는 대안적인 트랜스크로모조믹 동물 시스템은 당업계에서 입수가능하고, 본 발명의 TREM2-결합 항체를 발생시키는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, "TC 마우스"로 지칭되는, 인간 중쇄 트랜스크로모좀 및 인간 경쇄 트랜스크로모좀 둘 다를 지닌 마우스가 사용될 수 있으며; 이러한 마우스는 문헌[Tomizuka et al., 2000 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:722-727]에 기재되어 있다. 더욱이, 인간 중쇄 및 경쇄 이식염색체를 운반하는 소는 당업계에 기재되어 있으며(Kuroiwa et al., 2002 Nature Biotechnology 20:889-894), 본 발명의 TREM2-결합 항체를 생성하는 데 사용될 수 있다.
인간 단클론 항체는 또한, 인간 면역글로불린 유전자의 라이브러리를 스크리닝하기 위한 파지 디스플레이 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 인간 항체를 단리하기 위한 이러한 파지 디스플레이 방법은 당업계에 확립되어 있거나 하기 실시예에 기재되어 있다. 예를 들어, 미국 특허 제5,223,409호; 미국 특허 제5,403,484호; 미국 특허 제5,571,698호(Ladner 등); 미국 특허 제5,427,908호 및 미국 특허 제5,580,717호(Dower 등); 미국 특허 제5,969,108호 및 미국 특허 제6,172,197호(McCafferty 등); 및 미국 특허 제5,885,793호; 미국 특허 제6,521,404호; 미국 특허 제6,544,731호; 미국 특허 제6,555,313호; 미국 특허 제6,582,915호 및 미국 특허 제6,593,081호(Griffiths 등)를 참조한다.
본 발명의 인간 단클론 항체는 또한, 면역화시 인간 항체 반응이 발생될 수 있도록 SCID 마우스 내에 인간 면역 세포가 재구성된 것을 사용하여 제조될 수 있다. 이러한 마우스는 예를 들어 미국 특허 제5,476,996호 및 미국 특허 제5,698,767호(Wilson 등)에 기재되어 있다.
프레임워크 또는 Fc 조작
본 발명의 조작된 항체 및 이의 항원 결합 단편은, 예를 들어 항체의 특성을 개선시키기 위해 VH 및/또는 VL 내의 프레임워크 잔기에 변형이 이루어진 것들을 포함한다. 전형적으로, 이러한 프레임워크 변형은 항체의 면역원성을 저하시키기 위해 이루어진다. 예를 들어, 하나의 접근법은 하나 이상의 프레임워크 잔기를 상응하는 생식세포 계열 서열로 "역돌연변이화하는" 것이다. 보다 구체적으로, 체세포 돌연변이를 거친 항체는, 항체가 유래된 생식세포 계열 서열과 상이한 프레임워크 잔기를 함유할 수 있다. 이러한 잔기는 항체 프레임워크 서열을, 항체가 유래된 생식세포 계열 서열과 비교함으로써 확인될 수 있다. 프레임워크 영역 서열들을 이들의 생식세포 계열 배열로 복귀시키기 위해, 체세포 돌연변이는 예를 들어, 부위-지정 돌연변이유발에 의해 생식세포 계열 서열로 "역돌연변이화"될 수 있다. 이러한 "역돌연변이화된" 항체도 본 발명에 포함시키고자 한다.
또 다른 유형의 프레임워크 변형은, 프레임워크 영역 내의, 또는 심지어 하나 이상의 CDR 영역 내의 하나 이상의 잔기를 돌연변이화시켜, T 세포-에피토프를 제거하여, 이로써 항체의 잠재적인 면역원성을 감소시키는 것을 수반한다. 이러한 접근법은 또한, "탈면역화"로 지칭되고, Carr 등의 미국 특허 공개 공보 제20030153043호에 더 상세히 기재되어 있다.
프레임워크 또는 CDR 영역 내에서 이루어진 변형 외에도 또는 대안적으로, 본 발명의 항체는 전형적으로 항체의 하나 이상의 기능적 특성, 예컨대 혈청 반감기, 보체 고정, Fc 수용체 결합, 및/또는 항원 의존성 세포독성을 변경시키기 위해 Fc 영역 내에 변형을 포함하도록 조작될 수 있다. 더욱이, 본 발명의 항체는 화학적으로 변형될 수 있거나(예컨대 하나 이상의 화학적 모이어티가 항체에 부착될 수 있음), 항체의 글리코실화를 변경시키기 위해, 즉, 항체의 하나 이상의 기능적 특성을 변경시키기 위해 변형될 수 있다. 이들 실시형태는 각각 아래에 더 상세히 기술된다. Fc 영역 내의 잔기의 넘버링은 Kabat의 EU 인덱스의 넘버링이다.
일 실시형태에서, CH1의 힌지 영역은, 힌지 영역 내의 시스테인 잔기의 수가 변경되도록, 예를 들어 증가되거나 감소되도록 변형된다. 이러한 접근법은 미국 특허 제5,677,425호(Bodmer 등)에 추가로 기재되어 있다. CH1의 힌지 영역 내의 시스테인 잔기의 수는 예를 들어, 경쇄 및 중쇄의 어셈블리를 용이하게 하거나 항체의 안정성을 증가시키거나 저하하도록 변경된다.
또 다른 실시형태에서, 항체의 Fc 힌지 영역은 항체의 생물학적 반감기를 저하하도록 돌연변이된다. 보다 구체적으로, 하나 이상의 아미노산 돌연변이는, 항체가 천연 Fc-힌지 도메인 SpA 결합에 비해 나빠진 스타필로코커스 단백질 A(SpA) 결합성을 갖도록, Fc-힌지 단편의 CH2-CH3 도메인 계면 영역 내로 도입된다. 이러한 접근법은 미국 특허 제6,165,745호(Ward 등)에 더 상세하게 기재되어 있다.
또 다른 실시형태에서, 항체는 이의 생물학적 반감기를 증가시키도록 변형된다. 다양한 접근법들이 가능하다. 예를 들어, 하나 이상의 하기 돌연변이가 도입될 수 있다: T252L, T254S, T256F(Ward의 미국 특허 제6,277,375호에 기재된 바와 같음). 대안적으로, 생물학적 반감기를 증가시키기 위해, 항체는 IgG의 Fc 영역의 CH2 도메인의 2개의 루프로부터 취해진 구제(salvage) 수용체 결합 에피토프를 함유하도록 CH1 또는 CL 영역 내에서 변경될 수 있다(미국 특허 제5,869,046호 및 미국 특허 제6,121,022호(Presta 등)에 기재된 바와 같음).
일 실시형태에서, Fc 영역은 항체의 이펙터 기능을 변경시키기 위해 적어도 하나의 아미노산 잔기를 상이한 아미노산 잔기로 대체함으로써 변경된다. 예를 들어, 하나 이상의 아미노산은, 항체가 이펙터 리간드에 대해 변경된 친화도를 갖지만 모 항체의 항원-결합 능력은 보유하도록 상이한 아미노산 잔기로 대체될 수 있다. 친화도가 변경된 이펙터 리간드는 예를 들어, Fc 수용체 또는 보체의 C1 구성성분일 수 있다. 이러한 접근법은 미국 특허 제5,624,821호 및 미국 특허 제5,648,260호(둘 모두 Winter 등)에 더 상세하게 기재되어 있다.
또 다른 실시형태에서, 아미노산 잔기로부터 선택된 하나 이상의 아미노산은, 항체가 변경된 C1q 결합성 및/또는 감소되거나 소멸된 보체 의존성 세포독성(CDC)을 갖도록 상이한 아미노산 잔기로 대체될 수 있다. 이러한 접근법은 미국 특허 제6,194,551호(Idusogie 등)에 더 상세하게 기재되어 있다.
또 다른 실시형태에서, 하나 이상의 아미노산 잔기가 변경되어 항체가 보체를 고정시키는 능력을 변경시킨다. 이러한 접근법은 Bodmer 등의 PCT 공개 WO 94/29351에 추가로 기재되어 있다.
일부 실시형태에서, TREM2-결합 분자는 인간 IgG1 불변 영역을 함유한다. 일부 실시형태에서, 인간 IgG1 불변 영역은 Fc 영역을 포함한다.
일부 실시형태에서, TREM2-결합 분자의 Fc 영역은 항체-의존성 세포매개성 세포독성(ADCC) 또는 보체-의존성 세포독성(CDC)의 감소 또는 부재를 매개하는 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, IgG1 불변 영역의 아미노산 잔기 L234 및 L235는 A234 및 A235가 되도록 치환된다. 일부 실시형태에서, IgG1 불변 영역의 아미노산 잔기 N267은 A267이 되도록 치환된다. 일부 실시형태에서, IgG1 불변 영역의 아미노산 잔기 D265 및 P329는 A265 및 A329가 되도록 치환된다. 특정 실시형태에서, Fc 영역은 선택적으로, D265A, P329A, P329G, N297A, D265A/P329A, D265A/N297A, L234/L235A, P329A/L234A/L235A, 및 P329G/L234A/L235A 중 어느 하나로부터 선택되는, 감소된 이펙터 기능을 주는 돌연변이 또는 돌연변이 조합을 포함한다. 일부 실시형태에서, Fc 영역은 D265A, P329A, P329G, N297A, D265A/P329A, D265A/N297A, L234/L235A, P329A/L234A/L235A, 및 P329G/L234A/L235A(모든 위치는 EU 넘버링에 의한 것임) 중 어느 하나로부터 선택되는, 감소된 이펙터 기능을 주는 돌연변이 또는 돌연변이 조합을 포함한다.
또 다른 실시형태에서, Fc 영역은 하나 이상의 아미노산을 변형시킴으로써, 항체가 항체 의존성 세포매개성 세포독성(ADCC)을 매개하는 능력을 증가시키고/시키거나 Fc-감마 수용체에 대한 항체의 친화도를 증가시키도록 변형된다. 이러한 접근법은 Presta의 PCT 공개 WO 00/42072에 추가로 기재되어 있다. 더욱이, Fc-감마 RI, Fc-감마 RII, Fc-감마 RIII 및 FcRn에 대한 인간 IgG1 상의 결합 부위가 매핑되었으며, 향상된 결합성을 갖는 변이체가 기재되었다(문헌[Shields, R. L. et al., 2001 J. Biol. Chen. 276:6591-6604] 참조). 예를 들어, Fc 영역은 S239D, I332E, A330L, S298A, E333A, E333S, K334A, K236A, K236W, F243L, P247I, D280H, K290S, R292P, S298D, S298V, Y300L, V305I, A339D, A339Q, A339T, P396L(모든 위치는 EU 넘버링에 의한 것임) 중 어느 하나로부터 선택되는, 증가된 이펙터 기능을 주는 돌연변이 또는 돌연변이 조합을 포함할 수 있다.
또 다른 실시형태에서, 항체의 글리코실화가 변형된다. 예를 들어, 비글리코실화된 항체가 제조될 수 있다(즉, 항체에 글리코실화가 결여됨). 글리코실화는, 예를 들어 "항원"에 대한 항체의 친화도를 증가시키도록 변경될 수 있다. 이러한 탄수화물 변형은, 예를 들어 항체 서열 내의 하나 이상의 글리코실화 부위를 변경함으로써 이루어질 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 가변 영역 프레임워크 글리코실화 부위의 제거를 초래하여, 이로써 해당 부위에서 글리코실화를 제거하는 하나 이상의 아미노산 치환이 이루어질 수 있다. 이러한 비글리코실화는 항원에 대한 항체의 친화도를 증가시킬 수 있다. 이러한 접근법은 미국 특허 제5,714,350호 및 미국 특허 제6,350,861호(Co 등)에 더 상세하게 기재되어 있다.
추가로 또는 대안적으로, 변경된 유형의 글리코실화를 갖는 항체, 예컨대 감소된 양의 푸코실 잔기를 갖는 저푸코실화(hypofucosylated) 항체 또는 증가된 양분성(bisecting) GlcNac 구조를 갖는 항체가 제조될 수 있다. 이러한 변경된 글리코실화 패턴은 항체의 ADCC 능력을 증가시키는 것으로 증명되었다. 이러한 탄수화물 변형은 예를 들어, 변경된 글리코실화 기구를 갖는 숙주 세포에서 항체를 발현시킴으로써 달성될 수 있다. 변경된 글리코실화 기구를 갖는 세포는 당업계에 기재되어 있고, 본 발명의 재조합 항체를 발현시켜 이로써 변경된 글리코실화를 갖는 항체를 생성하는 숙주 세포로서 사용될 수 있다. 예를 들어, Hang 등의 유럽 특허 제1,176,195호에는 푸코실 트랜스퍼라아제를 코딩하는, 기능적으로 방해된 FUT8 유전자를 갖는 세포주(따라서 이러한 세포주에서 발현된 항체는 저푸코실화를 나타냄)가 기재되어 있다. Presta의 PCT 공개 WO03/035835에는 푸코스를 Asn(297)-연결된 탄수화물에 부착시키는 능력이 감소되어, 해당 숙주 세포에서 발현되는 항체의 저푸코실화를 또한 초래하는 변이형 CHO 세포주, LecI3 세포가 기재되어 있다(또한 문헌[Shields, R. L. et al., 2002 J. Biol. Chem. 277:26733-26740] 참조). Umana 등의 PCT 공개 WO 99/54342에는 당단백질-변형 글리코실 트랜스퍼라아제(예컨대 베타 (1,4)--N 아세틸글루코사미닐트랜스퍼라아제 III(GnTIII))를 발현하도록 조작된 세포주(따라서 조작된 세포주에서 발현된 항체는 증가된 양분성 GlcNac 구조를 나타내며 이는 항체의 증가된 ADCC 활성을 초래함)가 기재되어 있다(또한 문헌[Umana et al., 1999 Nat. Biotech. 17:176-180] 참조).
일부 실시형태에서, TREM2-결합 분자는 항체이다. 일부 실시형태에서, 항체는 (예를 들어, 상기 동일한 이소타입의 야생형 Fc 영역에 비해) 하나 이상의 돌연변이를 갖는 IgG1 이소타입을 갖는다. 일부 실시형태에서, 상기 하나 이상의 돌연변이는 N297A, N297Q(문헌[BoltS et al. (1993) Eur J Immunol 23:403-411]), D265A, L234A, L235A(문헌[McEarchern et al., (2007) Blood, 109:1185-1192]), C226S, C229S(문헌[McEarchern et al., (2007) Blood, 109:1185-1192]), P238S(문헌[Davis et al., (2007) J Rheumatol, 34:2204-2210]), E233P, L234V(문헌[McEarchern et al., (2007) Blood, 109:1185-1192]), P238A, A327Q, A327G, P329A(문헌[Shields RL. et al., (2001) J Biol Chem. 276(9):6591-604), K322A, L234F, L235E(문헌[Hezareh,et al., (2001) J Viral 75, 12161-12168]; 문헌[Oganesyan et al., (2008). Acta Crystallographica 64, 700-704]), P331S(문헌[Oganesyan et al., (2008) Acta Crystallographica 64, 700-704]), T394D(문헌[Wilkinson et al. (2013) MAbs 5(3): 406-417]), A330L, M252Y, S254T, 및/또는 T256E로부터 선택되며, 여기서 아미노산 위치는 EU 또는 Kabat 넘버링 협약에 따른다. 특정 실시형태에서, Fc 영역은 글리신 236(EU 또는 Kabat 넘버링 협약에 따름)에 상응하는 위치에서의 아미노산 결실을 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 항체는 C220S 돌연변이(EU 또는 Kabat 넘버링 협약에 따름)를 함유하는 중쇄 불변 영역을 갖는 IgG1 이소타입을 갖는다.
일부 실시형태에서, Fc 영역은 A330L, L234F; L235E, 및/또는 P331S(EU 또는 Kabat 넘버링 협약에 따름)로부터 선택되는 하나 이상의 추가의 돌연변이를 추가로 함유한다.
특정 실시형태에서, 항체는 IgG2 이소타입을 갖는다. 일부 실시형태에서, 항체는 인간 IgG2 불변 영역을 함유한다. 일부 실시형태에서, 인간 IgG2 불변 영역은 Fc 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, Fc 영역은 하나 이상의 변형을 함유한다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, Fc 영역은 (예를 들어, 상기 동일한 이소타입의 야생형 Fc 영역에 비해) 하나 이상의 돌연변이를 함유한다. 일부 실시형태에서, 상기 하나 이상의 돌연변이는 V234A, G237A, H268E, V309L, N297A, N297Q, A330S, P331S, C232S, C233S, M252Y, S254T, 및/또는 T256E로부터 선택되며, 여기서 아미노산 위치는 EU 또는 Kabat 넘버링 협약에 따른다.
특정 실시형태에서, 항체는 IgG4 이소타입을 갖는다. 일부 실시형태에서, 항체는 인간 IgG4 불변 영역을 함유한다. 일부 실시형태에서, 인간 IgG4 불변 영역은 Fc 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, Fc 영역은 하나 이상의 변형을 함유한다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, Fc 영역은 (예를 들어, 상기 이소타입의 야생형 Fc 영역에 비해) 하나 이상의 돌연변이를 함유한다. 일부 실시형태에서, 상기 하나 이상의 돌연변이는 E233P, F234V, L235A, G237A, E318A(문헌[Hutchins et al. (1995) Proc Nat/ A cad Sci USA, 92:11980-11984]), S228P, L236E, S241P, L248E(문헌[Reddy et al., (2000) J Immuno/,164:1925-1933]; 문헌[Angal et al., (1993) Mol Immunol. 30(1):105-8]; 미국 특허 제8614299 B2호), T394D, M252Y, S254T, T256E, N297A, 및/또는 N297Q로부터 선택되며, 여기서 아미노산 위치는 EU 또는 Kabat 넘버링 협약에 따른다.
일부 실시형태에서, Fc 영역은 M252Y, S254T, 및/또는 T256E로부터 선택되는 하나 이상의 추가 돌연변이를 추가로 함유하며, 여기서 아미노산 위치는 EU 또는 Kabat 넘버링 협약에 따른다.
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 IgG1 변이체 중 하나 이상은 보체 활성화를 없애기 위하여 A330L 돌연변이와 조합될 수 있거나(문헌[Lazaret al., (2006) Proc Natl Acad Sci USA, 103:4005-4010]), 또는 L234F, L235E, 및/또는 P331S 돌연변이 중 하나 이상과 조합될 수 있으며(문헌[Sazinsky et al., (2008) Proc Natl Acad Sci USA, 105:20167-20172]), 여기서 아미노산 위치는 EU 또는 Kabat 넘버링 협약에 따른다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 IgG 변이체는 인간 혈청 중 항체 반감기를 향상시키기 위하여 하나 이상의 돌연변이(예를 들어, M252Y, S254T,T256E 돌연변이(EU 또는 Kabat 넘버링 협약에 따름))와 조합될 수 있다(문헌[Dall' Acqua et al., (2006) J Biol Chem, 281:23514-23524]; 및 문헌[Strohl et al., (2009) Current Opinion in Biotechnology, 20:685-691]).
일부 실시형태에서, 본 발명의 IgG4 변이체는 항체 안정화를 향상시키기 위하여 S228P 돌연변이(EU 또는 Kabat 넘버링 협약에 따름)(문헌[Angal et al., (1993) Mol Immunol, 30:105-108]) 및/또는 문헌[Peters et al., (2012) J Biol Chem. 13;287(29):24525-33]에 기재된 하나 이상의 돌연변이와 조합될 수 있다.
일부 실시형태에서, 항체는 IgG2 Fc 영역, IgG4 Fc 영역, 또는 IgG2/IgG4 하이브리드 Fc 영역으로부터 선택되는 Fc 영역을 갖는다.
변경된 항체의 조작 방법
상기 고찰된 바와 같이, 본원에 제시된 VH 및 VL 서열 또는 전장 중쇄 및 경쇄 서열을 갖는 TREM2-결합 항체가 사용되어, 이에 부착된 전장 중쇄 및/또는 경쇄 서열, VH 및/또는 VL 서열 또는 불변 영역(들)을 변형시킴으로써 새로운 TREM2-결합 항체를 생성할 수 있다. 따라서, 본 발명의 또 다른 양태에서, 본 발명의 TREM2-결합 항체의 구조적 특징은, 본 발명의 항체 및 이의 항원 결합 단편의 적어도 하나의 기능적 특성, 예컨대 인간 TREM2에 결합하여 이를 안정화시키는 특성을 보유하는 구조적으로 관련된 TREM2-결합 항체를 생성하는 데 사용된다.
예를 들어, 본 발명의 항체 및 이의 항원 결합 단편 또는 이들의 돌연변이의 하나 이상의 CDR 영역은 공지된 프레임워크 영역 및/또는 다른 CDR과 재조합적으로 조합되어 본 발명의 추가의 재조합적으로 조작된 TREM2-결합 항체 및 이의 항원 결합 단편을 생성할 수 있으며, 이는 상기에 논의된 바와 같다. 다른 유형의 변형에는 이전의 섹션에서 기재된 것들이 포함된다. 조작 방법을 위한 시작 물질은 하나 이상의 본원에 제공된 VH 및/또는 VL 서열, 또는 이의 하나 이상의 CDR 영역이다. 조작된 항체를 생성하기 위해, 하나 이상의 본원에 제공된 VH 및/또는 VL 서열 또는 이의 하나 이상의 CDR 영역을 갖는 항체를 실제로 제조하는 것(즉, 단백질로서 발현시키는 것)이 필요하지 않다. 그보다는, 서열(들)에 함유된 정보는, 원래의 서열(들)로부터 유래된 "제2 발생" 서열(들)을 생성하기 위한 시작 물질로서 사용되고, 그 후에, "제2 발생" 서열(들)이 제조되고 단백질로서 발현된다.
변경된 항체 서열은 또한, US20050255552에 기재된 바와 같은 고정된 CDR3 서열 또는 최소 필수 결합 결정부위를 갖고 CDR1 및 CDR2 서열 상에 다양성을 갖는 항체 라이브러리를 스크리닝함으로써 제조될 수 있다. 스크리닝은 항체 라이브러리로부터 항체를 스크리닝하는 데 적절한 임의의 스크리닝 기술, 예컨대 파지 디스플레이 기술에 따라 수행될 수 있다.
변경된 항체 서열을 제조하고 발현하기 위해 표준 분자 생물학 기술을 사용할 수 있다. 변경된 항체 서열(들)에 의해 코딩되는 항체는 본원에 개시된 TREM2-결합 항체의 하나, 일부 또는 모든 기능적 특성을 보유하는 것이며, 이 기능적 특성은 인간 TREM2 단백질에 특이적으로 결합하고 이를 안정화시키는 것을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
변경된 항체의 기능적 특성은 당업계에서 입수가능하고/하거나 본원에 기재된 표준 분석법, 예컨대 실시예에 나타낸 것들(예컨대 ELISA)을 사용하여 평가될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 항체 및 이의 항원 결합 단편의 조작 방법, 돌연변이는 TREM2-결합 항체 코딩 서열의 전부 또는 일부를 따라 무작위로 또는 선택적으로 도입될 수 있고, 생성된 변형된 TREM2-결합 항체는 결합 활성 및/또는 다른 기능적 특성에 대해 스크리닝될 수 있으며, 이는 본원에 기재된 바와 같다. 돌연변이 방법은 당업계에 기재되어 있다. 예를 들어, Short의 PCT 공개 WO 02/092780은 포화도 돌연변이생성, 합성 연결 어셈블리 또는 이들의 조합을 사용하여 항체 돌연변이를 생성하고 스크리닝하기 위한 방법을 기재하고 있다. 대안적으로, Lazar 등의 PCT 공개 WO 03/074679는 항체의 생리화학적 특성을 최적화하기 위해 컴퓨터 스크리닝 방법을 사용하는 방법을 기재하고 있다.
본 발명의 항체의 특징화
본 발명의 항체 및 이의 항원 결합 단편은 다양한 기능성 분석법에 의해 특성화될 수 있다. 예를 들어, 이들은 TREM2에 결합하고, 이를 안정화시키는 이들의 능력에 의해 특징화될 수 있다.
TREM2에 결합하는 항체의 능력은 관심 항체를 직접적으로 표지화함으로써 검출될 수 있거나, 항체는 비표지화되고 당업계에 공지된 다양한 샌드위치 검정법 포맷을 사용하여 간접적으로 결합 검출될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 TREM2-결합 항체 및 이의 항원-결합 단편은 참조 TREM2-결합 항체를 TREM2 폴리펩타이드에 결합하는 것을 차단하거나 경쟁한다. 이들은 상기 기재된 완전 인간 또는 인간화 TREM2-결합 항체일 수 있다. 이들은 또한, 기준 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 다른 인간, 마우스, 키메라 또는 인간화 TREM2-결합 항체일 수 있다. 기준 항체 결합을 차단하거나 이와 경쟁하는 능력은, 테스트 중인 TREM2-결합 항체가 기준 항체에 의해 규정된 것과 동일하거나 유사한 에피토프, 또는 기준 TREM2-결합 항체가 결합하는 에피토프에 충분히 근접한 에피토프에 결합함을 나타낸다. 이러한 항체는 특히, 기준 항체에 대해 확인된 유리한 특성을 공유할 가능성이 있다. 기준 항체를 차단하거나 이와 경쟁하는 능력은 예를 들어, 경쟁 결합 분석법에 의해 결정될 수 있다. 경쟁 결합 검정법을 이용하여, 시험 하의 항체는, 공통적인 항원, 예컨대 TREM2 폴리펩타이드에 대한 참조 항체의 특이적 결합을 억제하는 능력에 대해 검사된다. 테스트 항체는, 과량의 테스트 항체가 기준 항체의 결합을 실질적으로 억제하는 경우, 항원에 대한 특이적 결합에 대해 기준 항체와 경쟁하는 것이다. 실질적인 억제는, 테스트 항체가 기준 항체의 특이적 결합을 통상적으로 적어도 10%, 25%, 50%, 75% 또는 90%만큼 감소시킴을 의미한다.
특정 단백질, 이 경우에는 TREM2에 결합하기 위해 참조 항체와 항체의 경쟁을 평가하는 데 사용될 수 있는 다수의 공지된 경쟁 결합 검정법들이 존재한다. 이들 분석법은 예를 들어, 고상 직접 또는 간접 방사면역분석법(RIA), 고상 직접 또는 간접 효소 면역분석법(EIA), 샌드위치 경쟁 분석법(문헌[Stahli et al., Methods in Enzymology 9:242-253, 1983] 참조); 고상 직접 비오틴-아비딘 EIA(문헌[Kirkland et al., J. Immunol. 137:3614-3619, 1986] 참조); 고상 직접 표지 분석법, 고상 직접 표지 샌드위치 분석법(상기 문헌[Harlow & Lane] 참조); I-125 표지를 사용하는 고상 직접 표지 RIA(문헌[Morel et al., Mol. Immunol. 25:7-15, 1988] 참조); 고상 직접 비오틴-아비딘 EIA(문헌[Cheung et al., Virology 176:546-552, 1990]); 및 직접 표지 RIA(문헌[Moldenhauer et al., Scand. J. Immunol. 32:77-82, 1990])를 포함한다. 전형적으로, 이러한 분석법은 이들, 비표지된 테스트 TREM2-결합 항체 및 표지된 기준 항체 중 어느 하나를 갖는 고체 표면 또는 세포에 결합되는 정제된 항원의 사용을 수반한다. 경쟁적 억제는 테스트 항체의 존재 하에 고체 표면 또는 세포에 결합된 표지체의 양을 결정함으로써 측정된다. 통상, 테스트 항체는 과량으로 존재한다. 경쟁 분석법에 의해 식별되는 항체(경쟁 항체)는, 기준 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체, 및 기준 항체에 의해 결합되는 에피토프에 충분히 인접함으로써 입체 장애가 발생하도록 하는 인접 에피토프에 대해 결합하는 항체를 포함한다.
선발된 TREM2-결합 단클론 항체가 독특한 에피토프에 결합하는지를 결정하기 위해, 각각의 항체는 구매가능한 시약(예컨대 미국 일리노이주 록포드 소재의 Pierce로부터의 시약)을 사용하여 비오티닐화될 수 있다. 비표지된 모노클로날 항체 및 비오틴화된 모노클로날 항체를 사용하는 경쟁 연구는 TREM2 폴리펩타이드 코팅된-ELISA 플레이트를 사용하여 수행될 수 있다. 비오틴화된 MAb 결합은 스트렙타비딘-알칼리 포스파타제 프로브를 이용하여 검출될 수 있다. 정제된 TREM2-결합 항체의 이소타입을 결정하기 위해, 이소타입 ELISA가 수행될 수 있다. 예를 들어, 마이크로타이터 플레이트의 웰들은 1 μg/ml의 항-인간 IgG를 이용하여 4℃에서 밤새 코팅될 수 있다. 플레이트는 1% BSA를 이용하여 블라킹된 후, 1 μg/ml 이하의 모노클로날 TREM2-결합 항체 또는 정제된 이소타입 대조군과 주위 온도에서 1 내지 2시간 동안 반응한다. 그 후에, 웰들을 인간 IgG1 또는 인간 IgM-특이적 알칼리 포스파타아제-콘쥬게이션된 프로브와 반응시킬 수 있다. 그 후에, 플레이트는 발색되고 분석되어, 정제된 항체의 이소타입이 결정될 수 있다.
모노클로날 TREM2-결합 항체와, TREM2 폴리펩타이드를 발현하는 살아 있는 세포의 결합을 나타내기 위해, 유세포분석이 사용될 수 있다. 간략하게는, TREM2를 발현하는 세포주(표준 성장 조건 하에 성장됨)는 0.1% BSA 및 10% 우태 혈청을 함유하는 PBS 내에서 다양한 농도의 TREM2-결합 항체와 혼합되고 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션될 수 있다. 세척 후, 세포는 1차 항체 염색과 동일한 조건 하에 플루오레세인-표지된 항-인간 IgG 항체와 반응한다. 샘플은 단일 세포를 게이트하기 위해 광 및 측면 산란(side scatter) 특성을 사용하여 FACScan 기기에 의해 분석될 수 있다. 형광 현미경을 사용하는 대안적인 분석법이 유세포 분석법에 더하여 또는 이것 대신에 사용될 수 있다. 세포는 상기 기재된 바와 같이 정확하게 염색되고, 형광 현미경에 의해 검사될 수 있다. 이러한 방법은 개별 세포의 시각화를 허용하지만, 항원의 밀도에 따라 저하된 감수성을 가질 수 있다.
본 발명의 TREM2-결합 항체 및 이의 항원-결합 단편은 TREM2 폴리펩타이드 또는 항원 단편과의 반응성에 대해 웨스턴 블로팅에 의해 더 시험될 수 있다. 간략하게는, TREM2를 발현하는 세포로부터의 정제된 TREM2 폴리펩타이드 또는 융합 단백질 또는 세포 추출물은 제조되고, 소듐 도데실 술페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 처리될 수 있다. 전기영동 후, 분리된 항원은 니트로셀룰로오스 막으로 옮겨지고, 10% 우태 혈청을 이용하여 차단되고, 테스트되는 단클론 항체를 이용하여 프로빙된다. 인간 IgG 결합은 항-인간 IgG 알칼리 포스파타아제를 사용하여 검출되고, BCIP/NBT 기질 정제(Sigma Chem. Co., 미국 미주리주 세인트 루이스 소재)를 이용하여 발색될 수 있다.
기능성 검정법의 예는 하기 실시예 단락에 기재되어 있다.
치료 방법
본원에 개시된 TREM2-결합 분자를 사용하여 TREM2 기능 상실과 관련된 질환을 치료하는 방법이 본원에 제공된다. 일부 실시형태에서, TREM2 기능 상실과 관련된 질환은 신경염증성 또는 신경변성 질병, 예컨대 알츠하이머병, 전두측두엽 치매, 파킨슨병, 근위축 측삭 경화증, 나수-하코라병, 다발성 경화증, 근위축 측삭 경화증(ALS), 항-NMDA 수용체 뇌염, 자폐증, 뇌 루푸스(NP-SLE), 화학-유도 말초 신경병증(CIPN), 포진 후 신경통, 만성 염증성 탈미엘린화 다발신경병증(CIDP), 간질, 길랑-바레 증후군(GBS), 봉입체 근육염, 리소좀 저장 질병, 예컨대 스핑고미엘린지질증(니만-픽 C) 및 점액다당질 축적증 II/IIIB, 이염색백색질 장애, 다초점성 운동 신경병증, 중증 근무력증, 신경-베체트병, 시신경척수염(NMO), 시신경염, 다발근육염, 피부근육염, 라스무센 뇌염, 레트 증후군, 뇌졸중, 횡단 척수염, 외상성 뇌 손상, 척수 손상, 바이러스성 뇌염, 또는 세균성 수막염이다. 일부 바람직한 실시형태에서, TREM2 기능 상실과 관련된 질환은 알츠하이머병, 전두측두엽 치매, 파킨슨병, 근위축 측삭 경화증, 또는 나수-하코라병으로 구성된 목록으로부터 선택된다.
또한 본원에 개시된 TREM2-결합 분자를 사용하여 비정상적인 TREM2 활성 및/또는 발현과 직접 또는 간접적으로 관련된 TREM2 관련 장애를 치료하는 방법이 본원에 제공된다. Trem2-관련 장애에는 CNS 관련 질병, PNS 관련 질병, 전신 염증 및 염증에 관련된 다른 질병, 화학 성분의 남용에 의해 유도되는 통증 및 금단 증상이 포함되며, CNS에 관련된 질병 또는 장애에는 일반 불안 장애, 인지 장애, 학습 및 기억력 결핍 및 기능부전, 알츠하이머병(경도, 중등도 및 중증), 주의력 결핍 및 과잉행동 장애, 파킨슨병, 파킨슨병에서의 치매, 헌팅턴병, ALS, 프리온 신경변성 장애, 예컨대 크로츠펠트-야콥병 및 구루병, 질 드라 투렛 증후군, 정신병, 우울증 및 우울 장애, 조증, 조울증, 정신분열병, 정신분열병에서의 인지 결핍, 강박성 충동 장애, 공황 장애, 섭식 장애, 기면증, 통각, AIDS-치매, 노인성 치매, 노화에 관련된 경도 인지 장애(MCI), 노화 연관 기억력 장애, 자폐증, 읽기장애, 지연성 이상운동, 간질, 및 경련 장애, 외상 후 스트레스 장애, 일시적 무산소증, 가성치매, 생리-전 증후군, 후기 황체기 증후군, 만성 피로 증후군 및 시차가 포함된다. 일부 바람직한 실시형태에서, Trem2-관련 장애는 알츠하이머병, 전두측두엽 치매, 파킨슨병, 근위축 측삭 경화증, 또는 나수-하코라병으로 구성된 목록으로부터 선택된다.
Trem2-관련 장애에는 또한: 면역학적 장애, 특히 염증 장애가 관여되는 것(예컨대, 박테리아 감염, 진균 감염, 바이러스 감염, 원충 또는 다른 기생충 감염, 건선, 패혈증, 뇌 말라리아, 염증성 대장 질병, 관절염, 예컨대 류마티스성 관절염, 모낭염, 농가진, 육아종, 지질성 폐렴, 혈관염, 및 골관절염), 자가면역 장애(예컨대, 류마티스 관절염, 갑상샘염, 예컨대 하시모토 갑상샘염 및 그레이브스병, 인슐린-내성 당뇨병, 악성 빈혈, 애디슨병, 물집증, 백반증, 궤양성 장염, 전신 홍반성 루푸스(SLE), 쇼그렌 증후군, 다발성 경화증, 피부근육염, 혼합 연결 조직 질병, 피부경화증, 다발근육염, 이식 거부, 예컨대 동종이식 거부), T 세포 장애(예컨대, AIDS), 알러지성 염증 장애(예컨대, 피부 및/또는 점막 알러지, 예컨대 알러지성 비염, 천식, 건선), 신경학적 장애, 눈 장애, 태아 장애, 또는 비정상적인 TREM2 활성 및/또는 발현과 직접적으로 또는 간접적으로 연관되는 임의의 다른 장애(예컨대, 종양, 암, 백혈병, 골수 질병, 및 외상)가 포함된다.
일부 실시형태에서, TREM2-관련 장애는 TREM2의 광범위한 단백분해 절단 또는 TREM2 수용체의 이상 또는 돌연변이된 변이체를 발현하는 세포에 의해 매개되거나 이와 연관되는 자가면역, 염증, 또는 악성 장애이다. 자가면역 질병의 예에는 비제한적으로 관절염(예를 들어 류마티스 관절염, 만성 진행성 관절염 및 변형 관절염) 그리고 염증성 질환 및 뼈 손실이 관여되는 류마티스 질병을 포함하는 류마티스 질병, 염증통, 강직성 척추염을 포함하는 척추 관절병증, 라이터 증후군, 반응성 관절염, 건선 관절염, 및 장병원성 관절염, 과민증(기도 과민증 및 피부 과민증을 모두 포함함) 및 알러지가 포함된다. 자가면역 질환에는 자가면역 혈액 장애(예컨대 용혈성 빈혈, 재생불량성 빈혈, 진정 적혈구계 빈혈 및 특발성 혈소판감소증), 전신 홍반성 루푸스, 염증성 근육 장애, 다발연골염, 경화부종, 베게너 육아종증, 피부근육염, 만성 활성 간염, 중증 근무력증, 건선, 스티븐-존슨 증후군, 특발성 스프루, 내분비 눈병증, 그레이브스병, 사르코이드증, 다발성 경화증, 원발성 담관 간경화, 소아 당뇨병(I형 진성 당뇨병), 포도막염(전방 및 후방), 건성 각막결막염 및 봄철 각막결막염, 간질 폐 섬유증, 건선 관절염 및 사구체신염(예컨대 통풍, 랑게르한스 세포 조직구증, 특발성 신증후군 또는 최소 변화 신장병증을 포함하는 신증후군을 포함하거나 포함하지 않음), 종양, 피부 및 각막의 염증성 질병, 근육염, 뼈 임플란트의 이완, 대사 장애, 예컨대 죽상경화, 당뇨병, 및 이상지질혈증이 포함된다.
일부 실시형태에서, TREM2-관련 장애는 천식, 기관지염, 진폐증, 폐기종, 특발성 폐 섬유증 또는 COPD를 포함하는 기도의 다른 폐색성 또는 염증성 질병으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, TREM2-관련 장애는 조혈 또는 간형성 악성 장애, 예컨대 급성 골수 백혈병, 만성 골수 백혈병, 골수증식성 장애, 골수형성이상 증후군, 다발 골수종, 발작성 야간 헤모글로빈뇨, 판코니 빈혈, 중증 지중해빈혈, 비스코트-올드리치 증후군, 적혈구포식성 림프조직구증식증이다.
일부 실시형태에서, TREM2-관련 장애는 천식, 뇌염, 염증성 대장 질병, 만성 폐색성 폐 질병(COPD), 알러지 장애, 패혈성 쇼크, 폐 섬유증, 미분화 척추관절병증, 미분화 관절병증, 관절염, 염증성 골용해, 또는 만성 바이러스성 또는 박테리아성 감염으로 일어나는 만성 염증으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, TREM2-관련 장애는 치매, 전두측두엽 치매, 알츠하이머병, 혈관성 치매, 혼합 치매, 크로츠펠트-야콥병, 정상압 수두증, 근위축 측삭 경화증, 헌팅턴병, 타우병증 질병, 나수-하코라병, 뇌졸중, 급성 외상, 만성 외상, 루푸스, 급성 및 만성 장염, 상처 치유, 크론병, 염증성 대장 질병, 궤양성 장염, 비만, 말라리아, 본태성 떨림, 중추 신경계 루푸스, 베체트병, 파킨슨병, 레위 소체를 갖는 치매, 다중 시스템 아트로피, 샤이-드래거 증후군, 진행성 핵상 마비, 피질 기저 신경절 변성, 급성 파종 뇌척수염, 육아종성 장애, 사르코이드증, 노화 질병, 발작, 척수 손상, 외상성 뇌 손상, 노화 관련 황반 변성, 녹내장, 색소 망막염, 망막 변성, 호흡기 감염, 패혈증, 눈 감염, 전신 감염, 루푸스, 관절염, 다발성 경화증, 낮은 뼈 밀도, 골다공증, 뼈형성, 골화성 질병, 뼈의 파제트병, 및 암으로부터 선택된다. 일부 바람직한 실시형태에서, TREM2-관련 장애는 알츠하이머병, 전두측두엽 치매, 파킨슨병, 근위축 측삭 경화증, 또는 나수-하코라병으로 구성된 목록으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, TREM2-관련 장애는 치매, 전두측두엽 치매, 알츠하이머병, 나수-하코라병, 및 다발성 경화증으로부터 선택된다. 일부 바람직한 실시형태에서, TREM2-관련 장애는 치매, 예컨대 전두측두엽 치매, 알츠하이머병, 파킨슨병, 혈관성 치매, 의미적 치매, 또는 레비 소체를 갖는 치매이다.
일부 실시형태에서, 이러한 방법들은 TREM2 단백질의 IgSF 도메인, 예를 들어 서열 번호 1, 2, 및 3 중 어느 하나의 아미노산 잔기 19 내지 132에 특이적으로 결합하고, TREM2 단백질을 안정화시키는 치료적 유효량의 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, TREM2 기능 상실과 관련된 질환을 치료하는 이러한 방법들은: (1) 대상체로부터 얻은 샘플, 예를 들어, 대상체로부터 얻은 뇌척수액 샘플 내 세포 표면 TREM2 수준을 분석하는 단계; (2) 세포 표면 TREM2 수준이 기준 수준보다 낮은 대상체를 선별하는 단계로서, 기준 수준이 건강한 대상체로부터 얻은 샘플, 예를 들어, 건강한 대상체로부터 얻은 뇌척수액 샘플 내 세포 표면 TREM2 수준인, 단계; 및 (3) TREM2 단백질의 IgSF 도메인에 특이적으로 결합하고 TREM2 단백질을 안정화시키는 치료적 유효량의 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 대상체에 투여하는 단계. TREM2 단백질의 IgSF 도메인에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 세포 표면 상의 TREM2 단백질을 안정화시키고/시키거나 TREM2 단백질의 엑토도메인의 부분절단을 감소시킬 수 있다. 이러한 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 경구, 정맥 내, 두개 내, 척수강 내, 피하, 또는 비강 내 경로를 통해 대상체에게 투여된다. 샘플에서 세포 표면 TREM2의 수준은 당분야에 알려져 있는 검정, 예컨대, 유세포측정, 면역조직화학, 웨스턴 블롯팅, 면역형광 검정, 방사선면역검정(RIA), 효소-연관 면역흡착 검정(ELISA), 동종성 시간 분해 형광(HTRF), 양전자 방출 단층촬영(PET), 또는 TREM2에 대한 항체 또는 항체 단편을 이용하는 임의의 다른 면역 검출에 의해 결정될 수 있다.
조합 치료법
상술된 다양한 치료는 다른 치료 파트너, 예컨대 TREM2 기능 상실과 관련된 질환의 현재의 표준 케어, 예컨대, 알츠하이머병, 전두측두엽 치매, 파킨슨병, 근위축 측삭 경화증, 또는 나수-하코라병의 현재의 표준 케어와 조합될 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 hTREM2 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 BACE 억제제, 항-Tau 항체, 항-아밀로이드 베타 항체, 핀골리모드, BG12, 인터페론 베타 또는 타이사브리 중 하나 이상과 조합될 수 있다. 따라서, 본원에서 기재되는 TREM2 기능 상실과 관련된 질환을 치료하는 방법에는 치료를 필요로 하는 대상체에 제2 제제를 투여하는 단계가 추가로 포함될 수 있다.
용어 "조합"은 하나의 투여량 단위 형태의 고정 조합물, 또는 본 발명의 화합물과 조합 파트너(예를 들어 "치료제" 또는 "공동-제제"로도 나타내는, 아래에 설명된 바와 같은 또 다른 약물)가 동시에 독립적으로 또는 시간 간격 내에서 별도로(특히 이들 시간 간격이 조합 파트너로 하여금 협동 효과, 예를 들어 상승 효과를 나타낼 수 있도록 하는 경우) 투여될 수 있는 조합 투여를 나타낸다. 단일 성분들은 키트로 또는 개별적으로 패키징될 수 있다. 성분들(예를 들어 분말 또는 액체) 중 하나 또는 둘 다는 투여 전에 요망되는 용량으로 재구성되거나 희석될 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "공동-투여" 또는 "조합 투여" 등은 선택된 조합 파트너를 그를 필요로 하는 단일 대상체(예를 들어 환자)에게 투여하는 것을 포괄하는 것으로 의도되고, 제제들이 반드시 동일한 투여 경로에 의해 또는 동시에 투여될 필요는 없는 치료 요법을 포함하는 것으로 의도된다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "약제학적 조합물"은, 하나 초과의 치료제의 혼합 또는 조합으로부터 생성된 생성물을 의미하고, 치료제의 고정 및 비-고정 조합물 둘 다를 포함한다. 용어 "고정 조합물"은 치료제, 예를 들어 본 발명의 화합물 및 조합 파트너가 둘 다 단일 엔티티 또는 투여형으로 환자에게 동시에 투여되는 것을 의미한다. 용어 "비-고정 조합물"은 치료제, 예를 들어 본 발명의 화합물 및 조합 파트너가 둘 다 개별 대상물로서 동시에, 공동으로, 또는 특정 시간 제한을 두지 않고 순차적으로 환자에게 투여되는 것을 의미하며, 여기서 이러한 투여는 환자의 신체에서 치료 유효 수준의 2가지 화합물을 제공한다. 후자는 또한 칵테일 치료법, 예를 들어 3가지 이상의 치료제의 투여에 적용된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "제약 조합물"은 하나의 투여 단위 형태의 고정 조합물, 또는 비고정 조합물 또는 조합 투여를 위한 부분들의 키트를 지칭하며, 여기서 2가지 이상의 치료제가 독립적으로 동시에 또는 시간 간격 내에서 별개로 투여될 수 있고, 특히 이러한 시간 간격은 조합 파트너가 협동 효과, 예컨대 상승 효과를 나타낼 수 있게 한다.
용어 "병용 요법"은 본 발명에 기재된 치료 병태 또는 장애를 치료하기 위한 2가지 이상의 치료제의 투여를 지칭한다. 이러한 투여는 이들 치료제를 실질적으로 동시적인 방식으로, 예컨대 고정된 비의 활성 성분을 갖는 단일 캡슐로 공동-투여하는 것을 포괄한다. 대안적으로, 이러한 투여는 각각의 활성 성분을 위한 다수의 또는 개별적인 용기(예를 들어, 정제, 캡슐, 분말, 및 액체)로 공동-투여하는 것을 포괄한다. 분말 및/또는 액체는 투여 전에 원하는 용량으로 재구성될 수 있거나 희석될 수 있다. 추가적으로, 이러한 투여는 또한 대략 동일한 시간에 또는 상이한 시간에 각 유형의 치료제를 순차적인 방식으로 사용하는 것을 포괄한다. 어느 경우든, 치료 요법은 본원에서 기재되는 병태 또는 장애를 치료하는 데 있어서 약물 조합의 유익한 효과를 제공할 것이다.
샘플 제조
본원에서 기재되는 방법에서 사용되는 샘플은 당분야에 알려진 임의의 방법을 사용하여, 예컨대 생검 또는 수술에 의해 대상체로부터 수득될 수 있다. 예를 들어, 뇌척수액을 포함하는 샘플은 요추 천자에 의해 수득될 수 있고, 여기서 주사기에 부착된 미세 바늘이 요추 영역의 척추관 내로 삽입되고 진공이 생성되어 뇌척수액이 바늘을 통해 흡입되고 주사기에 수집될 수 있다. CT 조영, 초음파, 또는 내시경이 이러한 유형의 절차를 가이드하기 위해 사용될 수 있다. 샘플은 이후 사용을 위해 급속 냉동되어 -80℃에서 보관될 수 있다. 샘플은 또한 고정제, 예컨대 포름알데히드, 파라포름알데히드, 또는 아세트산/에탄올로 고정될 수 있다. RNA 또는 단백질은 분석을 위해 신선, 냉동 또는 고정 샘플로부터 추출될 수 있다.
약제학적 조성물, 투여량, 및 투여 방법
또한, TREM2 관련 질환의 치료에 사용하기 위한 조성물, 예를 들어 약제학적 조성물이 본원에 제공된다. 이러한 조성물은 본원에 기재된 바와 같은 하나 이상의 hTREM2 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함한다. 이러한 조성물에는 또 다른 제제, 예컨대 치료될 질환에 대한 현재의 표준 케어가 추가로 포함될 수 있다.
약제학적 조성물에는 전형적으로 약제학적으로 허용되는 담체가 포함된다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "약제학적으로 허용되는 담체"에는 약학적 투여와 상용성인 식염수, 용매, 분산 매질, 코팅, 항균제 및 항진균제, 등장화제 및 흡수 지연제 등이 포함된다. 약제학적 조성물은 전형적으로 의도되는 투여 경로와 상용성이도록 제형화된다. 투여 경로의 예에는 비경구(예컨대, 정맥 내, 동맥내, 복강내), 경구, 두개 내, 경막 내, 또는 비강 내(예컨대, 흡입), 피내, 피하, 또는 경점막 투여가 포함된다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 혈액-뇌 장벽을 통과하는 hTREM2 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공하도록 제형화된다.
일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은, 예컨대 이온 교환제, 알루미나, 스테아르산알루미늄, 레시틴, 혈청 단백질, 예컨대 인간 혈청 알부민, 완충 성분, 예컨대 포스페이트, 글리신, 소르브산, 소르브산칼륨, 포화 식물성 지방산의 부분 글리세라이드 혼합물, 물, 염 또는 전해질, 예컨대 황산프로타민, 인산수소이나트륨, 인산수소칼륨, 염화나트륨, 아연 염, 콜로이드성 실리카, 삼규산마그네슘, 폴리비닐 피롤리돈, 셀룰로오스계 성분, 폴리에틸렌 글리콜, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오스, 폴리아크릴레이트, 왁스, 폴리에틸렌-폴리옥시프로필렌-블록 중합체, 폴리에틸렌 글리콜, 및 울 지방을 포함하는 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다.
적합한 약제학적 조성물의 제형화 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어 문헌[Remington: The Science and Practice of Pharmacy. 21st ed., 2005]; 및 시리즈 형태의 책인 문헌[Drugs and the Pharmaceutical Sciences: a Series of Textbooks and Monographs (Dekker, NY)]을 참조한다. 예를 들어, 비경구, 피내 또는 피하 적용에 사용되는 용액 또는 현탁액은 하기 성분을 포함할 수 있다: 살균 희석제, 예컨대 주사용수, 식염수 용액, 고정유, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 기타 합성 용매; 항균제, 예컨대 벤질 알코올 또는 메틸 파라벤; 항산화제, 예컨대 아스코르브산 또는 중아황산나트륨; 킬레이팅제, 예컨대 에틸렌디아민테트라아세트산; 완충제, 예컨대 아세테이트, 시트레이트 또는 포스페이트 및 긴장성 조정제, 예컨대 염화나트륨 또는 덱스트로스. pH는 산 또는 염기, 예컨대 염산 또는 수산화나트륨으로 조정될 수 있다. 비경구 제조물은 유리 또는 플라스틱으로 제조된 앰플, 일회용 주사기 또는 다회 용량 바이알에 봉입될 수 있다.
주사용 용도에 적합한 약제학적 조성물에는 멸균 수용액(수용성인 경우) 또는 멸균 주사 용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 분산액 및 멸균 분말이 포함될 수 있다. 정맥 내 투여를 위해, 적합한 담체에는 생리 식염수, 정균수, Cremophor EL™(BASF, Parsippany, NJ) 또는 인산염 완충 식염수(PBS)가 포함된다. 모든 경우, 조성물은 멸균성이어야 하며 용이한 주사 가능성이 존재하는 정도까지 유체여야 한다. 이는 제조 및 보관 조건 하에 안정해야 하며, 미생물, 예컨대 박테리아 및 진균의 오염 작용에 대해 보존되어야 한다. 담체는, 예를 들어, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 및 이의 적합한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 예를 들어, 코팅, 예컨대 레시틴의 사용에 의해, 분산액의 경우에는 요구되는 입자 크기의 유지에 의해 그리고 계면활성제의 사용에 의해 적절한 유동성이 유지될 수 있다. 미생물의 작용 방지는 다양한 항균제 및 항진균제, 예를 들어, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 아스코르브산, 티메로살 등에 의해 달성될 수 있다. 많은 경우, 등장화제, 예를 들어, 당, 폴리알코올, 예컨대 만니톨, 소르비톨, 염화나트륨을 조성물에 포함하는 것이 바람직할 것이다. 흡수를 지연시키는 제제, 예를 들어, 모노스테아르산알루미늄 및 젤라틴을 주사용 조성물에 포함시킴으로써, 주사용 조성물의 연장된 흡수를 야기할 수 있다.
필요에 따라 상기 열거된 성분들 중 하나 또는 조합과 함께, 요구되는 양의 활성 화합물을 적절한 용매 중에 혼입한 후, 여과 살균함으로써 살균 주사용 용액이 제조될 수 있다.
일반적으로, 분산액은 기본 분산 매질 및 상기 열거된 것들으로부터의 요구되는 다른 성분을 함유하는 살균 비히클 내로 활성 화합물을 혼입시킴으로써 제조된다. 살균 주사용 용액의 제조를 위한 살균 분말의 경우, 바람직한 제조 방법은 미리 살균-여과된 용액으로부터 활성 성분 + 임의의 추가적인 요망되는 성분의 분말을 산출하는 진공 건조 및 냉동-건조이다.
비경구 제형은 단회 볼루스 용량, 주입 또는 로딩 볼루스 용량에 이어 유지 용량일 수 있다. 이들 조성물은 특정한 고정 또는 가변 간격, 예컨대, 일일 1회, 또는 "필요에 따른" 기준으로 투여될 수 있다.
주사에 적합한 약제학적 조성물은 완충액(예컨대, 아세테이트, 포스페이트 또는 시트레이트 완충액), 계면활성제(예컨대, 폴리소르베이트), 선택적으로 안정화제(예컨대, 인간 알부민) 등을 포함할 수 있다. 말초 투여를 위한 제제에는 살균 수성 또는 비-수성 용액, 현탁액, 및 에멀젼이 포함된다. 비-수성 용매의 예로는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 식물성 오일, 예컨대 올리브 오일, 및 주사용 유기 에스테르, 예컨대 에틸 올레에이트가 있다. 수성 담체에는, 예컨대, 식염수 및 완충 매질을 포함하는, 물, 알코올성/수성 용액, 에멀젼 또는 현탁액이 포함된다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 0.01~0.1 M 포스페이트 완충액 또는 0.8% 식염수를 포함한다. 다른 일반적인 비경구 비히클에는 인산나트륨 용액, 링거 덱스트로스, 덱스트로스 및 염화나트륨, 락테이트화 링거, 또는 고정유가 포함된다. 정맥 내 비히클에는 유체 및 영양소 보충제, 전해질 보충제, 예컨대 링거 덱스트로스 기반 보충제 등이 포함된다. 보존제 및 다른 첨가제, 예컨대, 항균제, 항산화제, 킬레이팅제, 및 불활성 기체 등이 또한 존재할 수 있다.
경구 조성물에는 일반적으로 불활성 희석제 또는 식용 담체가 포함된다. 치료적 경구 투여의 목적을 위해, 활성 화합물은 부형제와 함께 포함될 수 있고 정제, 트로키, 또는 캡슐, 예컨대, 젤라틴 캡슐 형태로 사용될 수 있다. 경구 조성물은 또한 구강세척제로 사용하기 위해 유체 담체를 사용하여 제조될 수 있다. 약학적으로 상용성인 결합제, 및/또는 아주반트 물질이 조성물의 일부로 포함될 수 있다. 정제, 환제, 캡슐, 트로키 등은 하기 성분 또는 유사한 성질의 화합물 중 임의의 것을 함유할 수 있다: 결합제, 예컨대 미세결정성 셀룰로스, 트래거캔스 검 또는 젤라틴; 부형제, 예컨대 전분 또는 락토스, 붕해제, 예컨대 알긴산, 프리모겔(Primogel), 또는 옥수수 전분; 윤활제, 예컨대 스테아르산마그네슘 또는 스테로테스(Sterotes); 활택제, 예컨대 콜로이드성 이산화규소; 감미제, 예컨대 수크로스 또는 사카린; 또는 풍미제, 예컨대 페퍼민트, 메틸 살리실레이트, 또는 오렌지 풍미제.
흡입에 의한 투여를 위해, 화합물은 적합한 추진제, 예컨대, 기체, 예컨대 이산화탄소를 함유하는 가압 용기 또는 분배기, 또는 분무기로부터 에어로졸 스프레이 형태로 전달될 수 있다. 이러한 방법에는 미국 특허 번호 6,468,798에 기재된 것들이 포함된다. 본원에서 기재된 바와 같은 치료 화합물의 전신 투여는 또한 경점막 또는 경피 수단에 의할 수 있다. 경점막 또는 경피 투여를 위해, 투과될 장벽에 적절한 투과제가 제형물에서 사용된다. 이러한 투과제는 일반적으로 당분야에 알려져 있으며, 예를 들어, 경점막 투여, 세제, 담즙산염, 및 푸시딘산 유도체가 포함된다. 경점막 투여는 비강 스프레이 또는 좌약의 사용을 통해 달성될 수 있다. 경피 투여를 위??, 활성 화합물은 당분야에 일반적으로 알려진 바와 같은 연고, 고약, 겔, 또는 크림으로 제형화된다.
일 실시형태에서, 치료 화합물은 신체로부터의 신속한 제거에 대해 치료 화합물을 보호할 담체와 함께, 예컨대 임플란트 및 마이크로캡슐화 전달 시스템을 포함하는 제어 방출 제형물로 제조된다.
약제학적 조성물은 투여 지침과 함께 용기, 팩, 또는 분배기에 포함될 수 있다.
비제한적 예에서, 적어도 하나의 약학 제제를 함유하는 약제학적 조성물은 액체(예컨대, 열경화성 액체)로서, 고체 성분(예컨대, 분말 또는 생분해성 생체적합성 중합체(예컨대, 양이온성 생분해성 생체적합성 중합체))으로서, 또는 겔 성분(예컨대, 생분해성 생체적합성 중합체)으로서 제형화된다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나의 약학 제제를 함유하는 적어도 조성물은 알기네이트 겔(예컨대, 알긴산나트륨), 셀룰로스계 겔(예컨대, 카복시메틸 셀룰로스 또는 카복시에틸 셀룰로스), 또는 키토산계 겔(예컨대, 키토산 글리세로포스페이트) 군으로부터 선택되는 겔로서 제형화된다. 또한, 본원에서 기재되는 임의의 약제학적 조성물을 제형화하기 위해 사용될 수 있는 약물-용출 중합체의 비제한적 예에는 카라기난, 카복시메틸셀룰로스, 하이드록시프로필셀룰로스, 폴리비닐 알코올과 조합된 덱스트란, 폴리아크릴산과 조합된 덱스트란, 폴리갈락투론산, 갈락투론산 다당류, 폴리살락트산, 폴리글리콜산, 타마린드 검, 잔탄 검, 셀룰로스 검, 구아 검(카복시메틸 구아), 펙틴, 폴리아크릴산, 폴리메타크릴산, N-이소프로필폴리아크릴로마이드, 폴리옥시에틸렌, 폴리옥시프로필렌, 플루론산, 폴리락트산, 사이클로덱스트린, 사이클로아밀로스, 레실린, 폴리부타디엔, N-(2-하이드록시프로필)메타크릴아미드(HPMA) 공중합체, 말레산 무수물-알킬 비닐 에테르, 폴리뎁시펩타이드, 폴리하이드록시부티레이트, 폴리카프로락톤, 폴리디옥사논, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리오르가노포스파젠, 폴리오르소 에스테르, 폴리비닐피롤리돈, 폴리락트산-코-글리콜산(PLGA), 폴리무수물, 폴리실라민, 폴리 N-비닐 카프로락탐, 및 겔란이 포함된다.
"유효량"은 유익하거나 요망되는 결과를 초래하기에 충분한 양이다. 예를 들어, 치료량은 요망되는 치료 효과를 달성하는 양이다. 상기 양은 질환 또는 질환 증상의 발병을 방지하는 데 필요한 양인 예방적 유효량과 동일하거나 상이할 수 있다. 유효량은 하나 이상의 투여, 적용 또는 투여량으로 투여될 수 있다. 치료 화합물의 "치료적 유효량"(즉, 유효 투여량)은 선택되는 치료 화합물에 의존한다. 조성물은 2일 1회를 포함하여, 1일 1회 이상 내지 1주 1회 이상 투여될 수 있다. 당업자는, 대상체의 질환 또는 장애의 중증도, 이전 치료, 일반 건강 및/또는 연령, 및 존재하는 다른 질병을 포함하지만 이에 한정되지 않는 특정 요인이 대상체를 효과적으로 치료하기 위해 요구되는 투여량 및 타이밍에 영향을 미칠 수 있음을 이해할 것이다. 또한, 본원에서 기재되는 치료 화합물의 치료적 유효량을 이용한 대상체의 치료는 단회 치료 또는 일련의 치료를 포함할 수 있다.
치료 화합물의 투여량, 독성 및 치료 효능은 세포 배양물 또는 실험 동물에서 표준 약학 절차, 예컨대 LD50(집단의 50%에 대한 치사 용량) 및 ED50(집단의 50%에서 치료적으로 유효한 용량)을 결정하는 절차에 의해 결정될 수 있다. 독성 및 치료 효과 간 용량 비는 치료 지수이며 비 LD50/ED50으로 표현될 수 있다. 높은 치료 지수를 나타내는 화합물이 바람직하다. 독성 부작용을 나타내는 화합물이 사용될 수 있지만, 감염되지 않은 세포에 대한 잠재적 손상을 최소화하고, 이에 의해 부작용을 감소시키기 위해, 이환 조직 부위로 이러한 화합물을 표적화하는 전달 시스템을 설계하기 위해 주의를 기울여야 한다.
세포 배양 분석 및 동물 연구로부터 수득되는 데이터가 인간에서의 사용을 위한 투여량 범위를 제형화하는 데 사용될 수 있다. 이러한 화합물의 투여량은 바람직하게는 독성이 거의 또는 전혀 없는 ED50을 포함하는 순환 농도 범위 내에 놓인다. 투여량은 채택되는 투여량 형태 및 이용되는 투여 경로에 따라 상기 범위 내에서 변할 수 있다. 본 발명의 방법에서 사용되는 임의의 화합물에 있어서, 치료적 유효 용량은 처음에 세포 배양 분석으로부터 추정될 수 있다. 세포 배양에서 결정되는 IC50(즉, 증상의 반치 최대 억제를 달성하는 테스트 화합물의 농도)를 포함하는 순환 혈장 농도 범위를 달성하도록 동물 모델에서 용량이 제형화될 수 있다. 이러한 정보는 인간에서 유용한 용량을 보다 정확히 결정하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 혈장에서의 수준이 측정될 수 있다.
키트
본원에 제공된 조성물 중 하나 이상 및 사용 설명서를 포함하는 키트가 또한 본원에 제공된다. 사용 지침에는 TREM2-관련 질환의 진단 또는 치료 지침이 포함될 수 있다. 본원에서 제공된 바와 같은 키트가 본원에서 기재되는 임의의 방법에 따라 사용될 수 있다. 당업자는 본원에 제공되는 키트에 대한 다른 적합한 용도를 인지할 것이며, 이러한 용도를 위해 키트를 이용할 수 있을 것이다. 본원에 제공된 바와 같은 키트에는 또한 분석용 샘플을, 예컨대, 실험실로 돌려보내기 위해 사용될 수 있는 메일러(예컨대, 운송료 지불필 봉투 또는 운송 팩)가 포함될 수 있다. 키트에는 샘플을 위한 하나 이상의 용기가 포함될 수 있거나, 샘플은 표준 혈액 수집 바이알에 있을 수 있다. 키트에는 또한 사전 동의서 양식, 평가 요청 양식, 및 본원에서 기재되는 방법에서 키트를 어떻게 사용하는지에 대한 설명서 중 하나 이상이 포함될 수 있다. 이러한 키트를 사용하는 방법이 또한 본원에 포함된다. 하나 이상의 양식(예컨대, 평가 요청 양식) 및 샘플을 보유하는 용기는, 예를 들어, 샘플을 제공한 대상체를 확인하기 위한 바 코드로 코드화될 수 있다.
당업자는 본 발명의 실시에서 사용될 수 있는, 본원에서 기재되는 것들과 유사하거나 동등한 여러 방법 및 재료를 인식할 것이다. 실제로, 본 발명은 설명된 방법 및 재료에 결코 제한되지 않는다.
실시형태
1. 골수 세포 상에서 발현되는 인간 유발 2(hTREM2) 단백질의 면역글로불린 수퍼패밀리(IgSF) 도메인에 결합하고, hTREM2 단백질(예를 들어 서열 번호 1, 2 또는 3)을 안정화시키는 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
2. 실시형태 1에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 hTREM2의 D39, S40, M41, K42, W44, G45, R46, R47, H67, N68, L69, W70, L71, L72, F74, L75, R77, D87, T88, L89 및 G90으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 잔기와 결합하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
3. 실시형태 1에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 hTREM2의 D39, S40, M41, K42, W44, G45, R46 및 R47로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 잔기, H67, N68, L69, W70, L71, L72, F74, L75 및 R77로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 잔기, 및 D87, T88, L89 및 G90으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 잔기와 결합하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
4. 실시형태 1에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 hTREM2의 D39, S40, M41, K42, W44, G45, R46 및 R47로 구성된 군으로부터 선택되는 5개 이상의 잔기, H67, N68, L69, W70, L71, L72, F74, L75 및 R77로 구성된 군으로부터 선택되는 4개 이상의 잔기, 및 D87, T88, L89 및 G90으로 구성된 군으로부터 선택되는 3개 이상의 잔기와 결합하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
5. 실시형태 1에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 hTREM2의 D39, S40, M41, K42, W44, G45, R46 및 R47로 구성된 군으로부터 선택되는 7개 이상의 잔기, H67, N68, L69, W70, L71, L72, F74, L75 및 R77로 구성된 군으로부터 선택되는 4개 이상의 잔기, 및 D87, T88, L89 및 G90으로 구성된 군으로부터 선택되는 3개 이상의 잔기와 결합하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
6. 실시형태 1에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 hTREM2의 D39, S40, M41, K42, W44, G45, R46 및 R47로 구성된 군으로부터 선택되는 5개 이상의 잔기, H67, N68, L69, W70, L71, L72, F74, L75 및 R77의 모든 잔기들, 및 D87, T88, L89 및 G90으로 구성된 군으로부터 선택되는 3개 이상의 잔기와 결합하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
7. 실시형태 1에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 hTREM2의 S40, M41, W44, G45, W70, L71, L72, F74, T88 및 L89로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 잔기와 결합하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
8. 실시형태 1에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 hTREM2의 S40, M41, W44, G45, W70, L71, L72, F74, T88 및 L89로 구성된 군으로부터 선택되는 2개 이상의 잔기와 결합하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
9. 실시형태 1에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 hTREM2의 S40, M41, W44, G45, W70, L71, L72, F74, T88 및 L89로 구성된 군으로부터 선택되는 3개 이상의 잔기와 결합하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
10. 실시형태 1에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 hTREM2의 S40, M41, W44, G45, W70, L71, L72, F74, T88 및 L89로 구성된 군으로부터 선택되는 4개 이상의 잔기와 결합하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
11. 실시형태 1에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 hTREM2의 S40, M41, W44, G45, W70, L71, L72, F74, T88 및 L89로 구성된 군으로부터 선택되는 5개 이상의 잔기와 결합하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
12. 실시형태 1에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 hTREM2의 S40, M41, W44, G45, W70, L71, L72, F74, T88 및 L89로 구성된 군으로부터 선택되는 6개 이상의 잔기와 결합하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
13. 실시형태 1에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 hTREM2의 S40, M41, W44, G45, W70, L71, L72, F74, T88 및 L89로 구성된 군으로부터 선택되는 7개 이상의 잔기와 결합하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
14. 실시형태 1에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 hTREM2의 S40, M41, W44, G45, W70, L71, L72, F74, T88 및 L89로 구성된 군으로부터 선택되는 8개 이상의 잔기와 결합하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
15. 실시형태 1에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 hTREM2의 S40, M41, W44, G45, W70, L71, L72, F74, T88 및 L89로 구성된 군으로부터 선택되는 9개 이상의 잔기와 결합하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
16. 실시형태 1에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 hTREM2의 S40, M41, W44, G45, W70, L71, L72, F74, T88 및 L89의 모든 잔기와 결합하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
17. 실시형태 7 내지 16 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 hTREM2의 D39, K42, R46 및 G90으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 잔기와 결합하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
18. 실시형태 7 내지 16 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 hTREM2의 D39, K42, R46 및 G90으로 구성된 군으로부터 선택되는 2개 이상의 잔기와 결합하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
19. 실시형태 7 내지 16 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 hTREM2의 D39, K42, R46 및 G90으로 구성된 군으로부터 선택되는 3개 이상의 잔기와 결합하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
20. 실시형태 7 내지 15 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 hTREM2의 D39, K42, R46 및 G90의 모든 잔기와 결합하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
21. 실시형태 1에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 hTREM2의 S40, M41, W44, G45, W70, L71, L72, F74, T88, L89, D39, K42, R46 및 G90의 모든 잔기와 결합하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
22. 실시형태 7 내지 16 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 hTREM2의 R47, H67, N68, L69, L75, R77 및 D87로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 잔기와 결합하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
23. 실시형태 7 내지 16 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 hTREM2의 R47, H67, N68, L69, L75, R77 및 D87로 구성된 군으로부터 선택되는 2개 이상의 잔기와 결합하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
24. 실시형태 7 내지 16 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 hTREM2의 R47, H67, N68, L69, L75, R77 및 D87로 구성된 군으로부터 선택되는 3개 이상의 잔기와 결합하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
25. 실시형태 7 내지 16 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 hTREM2의 R47, H67, N68, L69, L75, R77 및 D87로 구성된 군으로부터 선택되는 4개 이상의 잔기와 결합하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
26. 실시형태 7 내지 16 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 hTREM2의 R47, H67, N68, L69, L75, R77 및 D87로 구성된 군으로부터 선택되는 5개 이상의 잔기와 결합하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
27. 실시형태 7 내지 15 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 hTREM2의 R47, H67, N68, L69, L75, R77 및 D87로 구성된 군으로부터 선택되는 6개 이상의 잔기와 결합하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
28. 실시형태 1에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 hTREM2의 S40, M41, W44, G45, W70, L71, L72, F74, T88, L89, R47, H67, N68, L69, L75, R77 및 D87의 모든 잔기와 결합하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
29. 실시형태 1 내지 28 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 hTREM2를 활성화시키는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
30. 실시형태 1 내지 29 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 TREM2 발현 세포 내 하나 이상의 hTREM2-의존성 생리학적 활성을 촉진시키는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
31. 실시형태 1 내지 30 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은:
a) 예를 들어, hTREM2-발현 세포에서 식세포작용을 증가시키며, 예를 들어, 상기 TREM2 발현 세포는 hM2A 대식세포 또는 인간 iPS-유래된 미세아교세포-유사 세포이며,
b) 예를 들어, hTREM2-발현 세포에서 화학주성을 증가시키며, 예를 들어, 상기 TREM2 발현 세포는 hM2a 대식세포 또는 인간 iPS-유래된 미세아교세포-유사 세포이며,
c) 인간 단핵구 세포주에서 NFAT-기반 리포터 유전자 활성을 증가시키고,
d) 예를 들어, hTREM2-발현 세포에서 Syk 인산화를 증가시키며, 예를 들어, 상기 TREM2 발현 세포는 hM2A 대식세포이며, 또는
e) a) 내지 d) 중 둘 이상의 임의의 조합을 증가시키는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
32. 실시형태 1 내지 31 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 예를 들어, hM2a 대식세포 상에서 FACS 분석에 의해 측정되는 바와 같이, 예를 들어, 세포 표면 상에서, 1 nM 이하의 최대 유효 농도의 절반(EC50)으로, hTREM2에 결합하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
33. 실시형태 1 내지 32 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 예를 들어, hM2a 대식세포 상에서 FACS 분석에 의해 측정되는 바와 같이, 예를 들어, 세포 표면 상에서, 0.59 nM 이하의 최대 유효 농도의 절반(EC50)으로, hTREM2에 결합하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
34. 실시형태 1 내지 33 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 예를 들어, 표면 플라즈몬 공명(SPR)으로 측정되는 바와 같이, 150 pM 이하의 해리 상수(KD)로 hTREM2와 결합하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
35. 실시형태 1 내지 34 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 예를 들어, 표면 플라즈몬 공명(SPR)으로 측정되는 바와 같이, 50 pM 이하의 해리 상수(KD)로 hTREM2와 결합하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
36. 실시형태 1 내지 35 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 hTREM2-발현 세포의 세포 표면 상에서 hTREM2 단백질을 안정화시키는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
37. 실시형태 36에 있어서, 상기 hTREM2-발현 세포는 대식세포, 예를 들어, M2a 대식세포, 수지상 세포, 파골세포, 미세아교세포, 비만 세포, 단핵구, 폐 상피 세포, 피부의 랑게르한스 세포, 쿠퍼 세포, 호중구 또는 간암 세포인, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
38. 실시형태 1 내지 37 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 hM2A 대식세포에서 100 nM 이하의 농도로 hTREM2 단백질의 엑토도메인의 부분절단을 감소시키는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
39. 실시형태 1 내지 38 중 어느 하나에 있어서, 상기 TREM2 세포 표면 발현은 3배 이상 증가되는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
40. 실시형태 1 내지 39 중 어느 하나에 있어서, hTREM2의 IgSF 도메인은 서열 번호 1, 2, 및 3 중 어느 하나의 아미노산 잔기 19 내지 132를 포함하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
41. 실시형태 1 내지 40 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은:
a) 서열 번호 41 또는 서열 번호 44 또는 서열 번호 45 또는 서열 번호 47을 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 중쇄 가변 영역 CDR1; 서열 번호 42 또는 서열 번호 46 또는 서열 번호 48을 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 중쇄 가변 영역 CDR2; 서열 번호 43 또는 서열 번호 49를 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 중쇄 가변 영역 CDR3; 서열 번호 54 또는 서열 번호 57 또는 서열 번호 60을 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 경쇄 가변 영역 CDR1; 서열 번호 55 또는 서열 번호 58을 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 경쇄 가변 영역 CDR2; 및 서열 번호 56 또는 서열 번호 59를 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 경쇄 가변 영역 CDR3;
b) 서열 번호 4 또는 서열 번호 7 또는 서열 번호 8 또는 서열 번호 10을 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 중쇄 가변 영역 CDR1; 서열 번호 5 또는 서열 번호 9 또는 서열 번호 11을 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 중쇄 가변 영역 CDR2; 서열 번호 6 또는 서열 번호 12를 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 중쇄 가변 영역 CDR3; 서열 번호 17 또는 서열 번호 20 또는 서열 번호 23을 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 경쇄 가변 영역 CDR1; 서열 번호 18 또는 서열 번호 21을 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 경쇄 가변 영역 CDR2; 및 서열 번호 19 또는 서열 번호 22를 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 경쇄 가변 영역 CDR3;
c) 서열 번호 4 또는 서열 번호 7 또는 서열 번호 8 또는 서열 번호 10을 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 중쇄 가변 영역 CDR1; 서열 번호 5 또는 서열 번호 9 또는 서열 번호 11을 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 중쇄 가변 영역 CDR2; 서열 번호 6 또는 서열 번호 12를 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 중쇄 가변 영역 CDR3; 서열 번호 17 또는 서열 번호 20 또는 서열 번호 23을 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 경쇄 가변 영역 CDR1; 서열 번호 18 또는 서열 번호 21을 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 경쇄 가변 영역 CDR2; 및 서열 번호 78 또는 서열 번호 79를 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 경쇄 가변 영역 CDR3; 또는
d) 서열 번호 84 또는 서열 번호 87 또는 서열 번호 88 또는 서열 번호 90을 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 중쇄 가변 영역 CDR1; 서열 번호 85 또는 서열 번호 89 또는 서열 번호 91을 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 중쇄 가변 영역 CDR2; 서열 번호 86 또는 서열 번호 92를 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 중쇄 가변 영역 CDR3; 서열 번호 97 또는 서열 번호 100 또는 서열 번호 103을 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 경쇄 가변 영역 CDR1; 서열 번호 98 또는 서열 번호 101을 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 경쇄 가변 영역 CDR2; 및 서열 번호 99 또는 서열 번호 102를 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 경쇄 가변 영역 CDR3을 포함하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
42. hTREM2 단백질의 IgSF 도메인에 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편으로서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은:
a) 서열 번호 41 또는 서열 번호 44 또는 서열 번호 45 또는 서열 번호 47을 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 중쇄 가변 영역 CDR1; 서열 번호 42 또는 서열 번호 46 또는 서열 번호 48을 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 중쇄 가변 영역 CDR2; 서열 번호 43 또는 서열 번호 49를 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 중쇄 가변 영역 CDR3; 서열 번호 54 또는 서열 번호 57 또는 서열 번호 60을 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 경쇄 가변 영역 CDR1; 서열 번호 55 또는 서열 번호 58을 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 경쇄 가변 영역 CDR2; 및 서열 번호 56 또는 서열 번호 59를 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 경쇄 가변 영역 CDR3;
b) 서열 번호 4 또는 서열 번호 7 또는 서열 번호 8 또는 서열 번호 10을 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 중쇄 가변 영역 CDR1; 서열 번호 5 또는 서열 번호 9 또는 서열 번호 11을 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 중쇄 가변 영역 CDR2; 서열 번호 6 또는 서열 번호 12를 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 중쇄 가변 영역 CDR3; 서열 번호 17 또는 서열 번호 20 또는 서열 번호 23을 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 경쇄 가변 영역 CDR1; 서열 번호 18 또는 서열 번호 21을 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 경쇄 가변 영역 CDR2; 및 서열 번호 19 또는 서열 번호 22를 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 경쇄 가변 영역 CDR3;
c) 서열 번호 4 또는 서열 번호 7 또는 서열 번호 8 또는 서열 번호 10을 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 중쇄 가변 영역 CDR1; 서열 번호 5 또는 서열 번호 9 또는 서열 번호 11을 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 중쇄 가변 영역 CDR2; 서열 번호 6 또는 서열 번호 12를 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 중쇄 가변 영역 CDR3; 서열 번호 17 또는 서열 번호 20 또는 서열 번호 23을 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 경쇄 가변 영역 CDR1; 서열 번호 18 또는 서열 번호 21을 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 경쇄 가변 영역 CDR2; 및 서열 번호 78 또는 서열 번호 79를 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 경쇄 가변 영역 CDR3; 또는
d) 서열 번호 84 또는 서열 번호 87 또는 서열 번호 88 또는 서열 번호 90을 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 중쇄 가변 영역 CDR1; 서열 번호 85 또는 서열 번호 89 또는 서열 번호 91을 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 중쇄 가변 영역 CDR2; 서열 번호 86 또는 서열 번호 92를 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 중쇄 가변 영역 CDR3; 서열 번호 97 또는 서열 번호 100 또는 서열 번호 103을 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 경쇄 가변 영역 CDR1; 서열 번호 98 또는 서열 번호 101을 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 경쇄 가변 영역 CDR2; 및 서열 번호 99 또는 서열 번호 102를 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 경쇄 가변 영역 CDR3을 포함하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
43. 실시형태 1 내지 42 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은
a) 서열 번호 13 또는 서열 번호 50에 대하여 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 VH 폴리펩타이드 서열, 및 서열 번호 24 또는 서열 번호 61에 대하여 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 VL 폴리펩타이드 서열; 또는
b) 서열 번호 13 또는 서열 번호 93에 대하여 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 VH 폴리펩타이드 서열, 및 서열 번호 80 또는 서열 번호 104에 대하여 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 VL 폴리펩타이드 서열을 포함하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
44. 실시형태 1 내지 43 중 어느 하나에 있어서,
a) 서열 번호 7을 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 중쇄 가변 영역 CDR1; 서열 번호 5를 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 중쇄 가변 영역 CDR2; 서열 번호 6을 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 중쇄 가변 영역 CDR3; 서열 번호 17을 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 경쇄 가변 영역 CDR1; 서열 번호 18을 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 경쇄 가변 영역 CDR2; 및 서열 번호 19를 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 경쇄 가변 영역 CDR3;
b) 서열 번호 44를 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 중쇄 가변 영역 CDR1; 서열 번호 42를 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 중쇄 가변 영역 CDR2; 서열 번호 43을 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 중쇄 가변 영역 CDR3; 서열 번호 54를 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 경쇄 가변 영역 CDR1; 서열 번호 55를 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 경쇄 가변 영역 CDR2; 및 서열 번호 56을 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 경쇄 가변 영역 CDR3;
c) 서열 번호 7을 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 중쇄 가변 영역 CDR1; 서열 번호 5를 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 중쇄 가변 영역 CDR2; 서열 번호 6을 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 중쇄 가변 영역 CDR3; 서열 번호 17을 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 경쇄 가변 영역 CDR1; 서열 번호 18을 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 경쇄 가변 영역 CDR2; 및 서열 번호 78을 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 경쇄 가변 영역 CDR3; 또는
d) 서열 번호 87을 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 중쇄 가변 영역 CDR1; 서열 번호 85를 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 중쇄 가변 영역 CDR2; 서열 번호 86을 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 중쇄 가변 영역 CDR3; 서열 번호 97을 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 경쇄 가변 영역 CDR1; 서열 번호 98을 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 경쇄 가변 영역 CDR2; 및 서열 번호 99를 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 경쇄 가변 영역 CDR3을 포함하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
45. 실시형태 1 내지 43 중 어느 하나에 있어서,
a) 서열 번호 8의 중쇄 가변 영역 CDR1; 서열 번호 9를 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 중쇄 가변 영역 CDR2; 서열 번호 6을 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 중쇄 가변 영역 CDR3; 서열 번호 20을 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 경쇄 가변 영역 CDR1; 서열 번호 21을 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 경쇄 가변 영역 CDR2; 및 서열 번호 22를 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 경쇄 가변 영역 CDR3;
b) 서열 번호 45를 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 중쇄 가변 영역 CDR1; 서열 번호 46을 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 중쇄 가변 영역 CDR2; 서열 번호 43을 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 중쇄 가변 영역 CDR3; 서열 번호 57을 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 경쇄 가변 영역 CDR1; 서열 번호 58을 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 경쇄 가변 영역 CDR2; 및 서열 번호 59를 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 경쇄 가변 영역 CDR3;
c) 서열 번호 8을 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 중쇄 가변 영역 CDR1; 서열 번호 9를 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 중쇄 가변 영역 CDR2; 서열 번호 6을 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 중쇄 가변 영역 CDR3; 서열 번호 20을 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 경쇄 가변 영역 CDR1; 서열 번호 21을 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 경쇄 가변 영역 CDR2; 및 서열 번호 79를 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 경쇄 가변 영역 CDR3; 또는
d) 서열 번호 88을 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 중쇄 가변 영역 CDR1; 서열 번호 89를 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 중쇄 가변 영역 CDR2; 서열 번호 86을 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 중쇄 가변 영역 CDR3; 서열 번호 100을 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 경쇄 가변 영역 CDR1; 서열 번호 101을 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 경쇄 가변 영역 CDR2; 및 서열 번호 102를 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 경쇄 가변 영역 CDR3을 포함하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
46. 실시형태 1 내지 43 중 어느 하나에 있어서,
a) 서열 번호 10을 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 중쇄 가변 영역 CDR1; 서열 번호 11을 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 중쇄 가변 영역 CDR2; 서열 번호 12를 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 중쇄 가변 영역 CDR3; 서열 번호 23을 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 경쇄 가변 영역 CDR1; 서열 번호 21을 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 경쇄 가변 영역 CDR2; 및 서열 번호 19를 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 경쇄 가변 영역 CDR3;
b) 서열 번호 47을 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 중쇄 가변 영역 CDR1; 서열 번호 48을 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 중쇄 가변 영역 CDR2; 서열 번호 49를 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 중쇄 가변 영역 CDR3; 서열 번호 60을 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 경쇄 가변 영역 CDR1; 서열 번호 58을 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 경쇄 가변 영역 CDR2; 및 서열 번호 56을 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 경쇄 가변 영역 CDR3;
c) 서열 번호 10을 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 중쇄 가변 영역 CDR1; 서열 번호 11을 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 중쇄 가변 영역 CDR2; 서열 번호 12를 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 중쇄 가변 영역 CDR3; 서열 번호 23을 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 경쇄 가변 영역 CDR1; 서열 번호 21을 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 경쇄 가변 영역 CDR2; 및 서열 번호 78을 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 경쇄 가변 영역 CDR3; 또는
d) 서열 번호 90을 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 중쇄 가변 영역 CDR1; 서열 번호 91을 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 중쇄 가변 영역 CDR2; 서열 번호 92를 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 중쇄 가변 영역 CDR3; 서열 번호 103을 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 경쇄 가변 영역 CDR1; 서열 번호 101을 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 경쇄 가변 영역 CDR2; 및 서열 번호 99를 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 경쇄 가변 영역 CDR3을 포함하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
47. 실시형태 1 내지 43 중 어느 하나에 있어서,
a) 서열 번호 4를 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 중쇄 가변 영역 CDR1; 서열 번호 5를 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 중쇄 가변 영역 CDR2; 서열 번호 6을 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 중쇄 가변 영역 CDR3; 서열 번호 17을 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 경쇄 가변 영역 CDR1; 서열 번호 18을 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 경쇄 가변 영역 CDR2; 및 서열 번호 19를 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 경쇄 가변 영역 CDR3;
b) 서열 번호 41을 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 중쇄 가변 영역 CDR1; 서열 번호 42를 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 중쇄 가변 영역 CDR2; 서열 번호 43을 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 중쇄 가변 영역 CDR3; 서열 번호 54를 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 경쇄 가변 영역 CDR1; 서열 번호 55를 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 경쇄 가변 영역 CDR2; 및 서열 번호 56을 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 경쇄 가변 영역 CDR3;
c) 서열 번호 4를 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 중쇄 가변 영역 CDR1; 서열 번호 5를 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 중쇄 가변 영역 CDR2; 서열 번호 6을 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 중쇄 가변 영역 CDR3; 서열 번호 17을 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 경쇄 가변 영역 CDR1; 서열 번호 18을 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 경쇄 가변 영역 CDR2; 및 서열 번호 78을 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 경쇄 가변 영역 CDR3; 또는
d) 서열 번호 84를 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 중쇄 가변 영역 CDR1; 서열 번호 85를 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 중쇄 가변 영역 CDR2; 서열 번호 86을 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 중쇄 가변 영역 CDR3; 서열 번호 97을 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 경쇄 가변 영역 CDR1; 서열 번호 98을 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 경쇄 가변 영역 CDR2; 및 서열 번호 99를 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 경쇄 가변 영역 CDR3을 포함하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
48. 실시형태 1 내지 47 중 어느 하나에 있어서,
a) 서열 번호 13을 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 VH 및 서열 번호 24를 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 VL; 또는
b) 서열 번호 50을 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 VH 및 서열 번호 61을 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 VL; 또는
c) 서열 번호 13에 대하여 적어도 95% 상동성을 갖는 서열을 포함하는, 예를 들어 이들로 구성된 VH 및 서열 번호 24에 대하여 적어도 95% 상동성을 갖는 서열을 포함하는, 예를 들어 이들로 구성된 VL; 또는
d) 서열 번호 50에 대하여 적어도 95% 상동성을 갖는 서열을 포함하는, 예를 들어 이들로 구성된 VH 및 서열 번호 61에 대하여 적어도 95% 상동성을 갖는 서열을 포함하는, 예를 들어 이들로 구성된 VL; 또는
e) 서열 번호 13으로부터 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개의 아미노산이 상이한 서열을 포함하는, 예를 들어 이들로 구성된 VH 및 서열 번호 24로부터 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개의 아미노산이 상이한 서열을 포함하는, 예를 들어 이들로 구성된 VL; 또는
f) 서열 번호 50으로부터 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개의 아미노산이 상이한 서열을 포함하는, 예를 들어 이들로 구성된 VH 및 서열 번호 61로부터 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개의 아미노산이 상이한 서열을 포함하는, 예를 들어 이들로 구성된 VL.
g) 서열 번호 13을 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 VH 및 서열 번호 80을 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 VL; 또는
h) 서열 번호 93을 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 VH 및 서열 번호 104를 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 VL; 또는
i) 서열 번호 13에 대하여 적어도 95% 상동성을 갖는 서열을 포함하는, 예를 들어 이들로 구성된 VH 및 서열 번호 80에 대하여 적어도 95% 상동성을 갖는 서열을 포함하는, 예를 들어 이들로 구성된 VL; 또는
j) 서열 번호 93에 대하여 적어도 95% 상동성을 갖는 서열을 포함하는, 예를 들어 이들로 구성된 VH 및 서열 번호 104에 대하여 적어도 95% 상동성을 갖는 서열을 포함하는, 예를 들어 이들로 구성된 VL; 또는
k) 서열 번호 13으로부터 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개의 아미노산이 상이한 서열을 포함하는, 예를 들어 이들로 구성된 VH 및 서열 번호 80으로부터 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개의 아미노산이 상이한 서열을 포함하는, 예를 들어 이들로 구성된 VL; 또는
l) 서열 번호 93으로부터 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개의 아미노산이 상이한 서열을 포함하는, 예를 들어 이들로 구성된 VH 및 서열 번호 104로부터 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개의 아미노산이 상이한 서열을 포함하는, 예를 들어 이들로 구성된 VL을 포함하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
49. 실시형태 1 내지 48 중 어느 하나에 있어서,
a) 서열 번호 15, 서열 번호 29, 서열 번호 33, 서열 번호 35, 서열 번호 37, 또는 서열 번호 39를 포함하는, 예를 들어 이들로 구성된 중쇄 아미노산 서열, 및 서열 번호 26을 포함하는, 예를 들어 이들로 구성된 경쇄 아미노산 서열;
b) 서열 번호 52, 서열 번호 66, 서열 번호 70, 서열 번호 72, 서열 번호 74, 또는 서열 번호 76을 포함하는, 예를 들어 이들로 구성된 중쇄 아미노산 서열, 및 서열 번호 63을 포함하는, 예를 들어 이들로 구성된 경쇄 아미노산 서열;
c) 서열 번호 15, 서열 번호 29, 서열 번호 33, 서열 번호 35, 서열 번호 37, 또는 서열 번호 39에 대하여 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 중쇄 아미노산 서열, 및 서열 번호 26에 대하여 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 경쇄 아미노산 서열;
d) 서열 번호 52, 서열 번호 66, 서열 번호 70, 서열 번호 72, 서열 번호 74, 또는 서열 번호 76에 대하여 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 중쇄 아미노산 서열, 및 서열 번호 63에 대하여 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 경쇄 아미노산 서열;
e) 서열 번호 15를 포함하는, 예를 들어 이들로 구성된 중쇄 아미노산 서열, 및 서열 번호 82를 포함하는, 예를 들어 이들로 구성된 경쇄 아미노산 서열;
f) 서열 번호 95를 포함하는, 예를 들어 이들로 구성된 중쇄 아미노산 서열, 및 서열 번호 106을 포함하는, 예를 들어 이들로 구성된 경쇄 아미노산 서열;
g) 서열 번호 15에 대하여 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 중쇄 아미노산 서열, 및 서열 번호 82에 대하여 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 경쇄 아미노산 서열; 또는
h) 서열 번호 95에 대하여 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 중쇄 아미노산 서열, 및 서열 번호 106에 대하여 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 경쇄 아미노산 서열을 포함하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
50. 골수 세포 상에서 발현되는 인간 유발 2(hTREM2)의 면역글로불린 수퍼패밀리(IgSF) 도메인에 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편으로서,
a) 서열 번호 15를 포함하는, 예를 들어 이들로 구성된 중쇄 서열, 및 서열 번호 26을 포함하는, 예를 들어 이들로 구성된 경쇄 서열;
b) 서열 번호 29를 포함하는, 예를 들어 이들로 구성된 중쇄 서열, 및 서열 번호 26을 포함하는, 예를 들어 이들로 구성된 경쇄 서열;
c) 서열 번호 33을 포함하는, 예를 들어 이들로 구성된 중쇄 서열, 및 서열 번호 26을 포함하는, 예를 들어 이들로 구성된 경쇄 서열;
d) 서열 번호 35를 포함하는, 예를 들어 이들로 구성된 중쇄 서열, 및 서열 번호 26을 포함하는, 예를 들어 이들로 구성된 경쇄 서열;
e) 서열 번호 37을 포함하는, 예를 들어 이들로 구성된 중쇄 서열, 및 서열 번호 26을 포함하는, 예를 들어 이들로 구성된 경쇄 서열;
f) 서열 번호 39를 포함하는, 예를 들어 이들로 구성된 중쇄 서열, 및 서열 번호 26을 포함하는, 예를 들어 이들로 구성된 경쇄 서열;
g) 서열 번호 52를 포함하는, 예를 들어 이들로 구성된 중쇄 서열, 및 서열 번호 63을 포함하는, 예를 들어 이들로 구성된 경쇄 서열;
h) 서열 번호 66을 포함하는, 예를 들어 이들로 구성된 중쇄 서열, 및 서열 번호 63을 포함하는, 예를 들어 이들로 구성된 경쇄 서열;
i) 서열 번호 70을 포함하는, 예를 들어 이들로 구성된 중쇄 서열, 및 서열 번호 63을 포함하는, 예를 들어 이들로 구성된 경쇄 서열;
j) 서열 번호 72를 포함하는, 예를 들어 이들로 구성된 중쇄 서열, 및 서열 번호 63을 포함하는, 예를 들어 이들로 구성된 경쇄 서열;
k) 서열 번호 74를 포함하는, 예를 들어 이들로 구성된 중쇄 서열, 및 서열 번호 63을 포함하는, 예를 들어 이들로 구성된 경쇄 서열;
l) 서열 번호 76을 포함하는, 예를 들어 이들로 구성된 중쇄 서열, 및 서열 번호 63을 포함하는, 예를 들어 이들로 구성된 경쇄 서열;
m) 서열 번호 15를 포함하는, 예를 들어 이들로 구성된 중쇄 서열, 및 서열 번호 82를 포함하는, 예를 들어 이들로 구성된 경쇄 서열; 또는
n) 서열 번호 95를 포함하는, 예를 들어 이들로 구성된 중쇄 서열, 및 서열 번호 106을 포함하는, 예를 들어 이들로 구성된 경쇄 서열을 포함하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
51. hTREM2 단백질에 대한 결합을 위해 실시형태 1 내지 50 중 어느 하나의 임의의 항체 또는 이의 항원-결합 단편과 경쟁하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
52. 실시형태 1 내지 51 중 어느 하나의 임의의 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 에피토프와 중첩하는 에피토프에 결합하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
53. 실시형태 1 내지 52 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체는 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 이소타입을 갖는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
54. 실시형태 1 내지 52 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 IgG1 Fc 영역, IgG2 Fc 영역, IgG4 Fc 영역, 또는 IgG2/IgG4 하이브리드 Fc 영역으로부터 선택되는 Fc 영역을 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
55. 실시형태 1 내지 49 또는 51 내지 54 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 모 항체와 비교하여 감소된 항체-의존성 세포매개성 세포독성(ADCC) 또는 보체-의존성 세포독성(CDC) 활성을 갖는 변형 Fc 영역을 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
56. 실시형태 1 내지 55 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 인간 또는 인간화 항체 또는 이의 단편인, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
57. 실시형태 1 내지 56 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 추가의 모이어티에 콘쥬게이션되는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
58. 실시형태 1 내지 57 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체는 IgG1 이소타입을 갖는, 항체.
59. 실시형태 1 내지 56 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체는 인간 또는 인간화 항체인, 항체.
60. 실시형태 1 내지 57 중 어느 하나에 있어서, 상기 항원-결합 단편은 Fab, F(ab')2, Fv 단편, scFv, 미니바디, 또는 디아바디로부터 선택되는, 항체의 항원-결합 단편.
61. 실시형태 1 내지 60 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 단클론인, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
62. 실시형태 1 내지 61 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체는 다중특이적 항체, 예를 들어, 이중특이적 항체인, 항체.
63. 실시형태 62에 있어서, 상기 다중특이적 항체, 예를 들어, 이중특이적 항체는, hTREM2 및 인간 DAP12(12 kDa의 DNAX-활성화 단백질)에 특이적으로 결합하는, 항체.
64. 실시형태 1 내지 63 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체는 Fc 영역의 돌연변이를 통한 변경된 이펙터 기능을 갖는, 항체.
65. 실시형태 1 내지 64 중 어느 하나에 따른 항체 또는 이의 항원-결합 단편 중 어느 하나를 코딩하는 핵산 분자 또는 핵산 분자 세트.
66. 실시형태 65에 있어서, 상기 핵산은 DNA인, 핵산 분자.
67. 실시형태 65 또는 66에 있어서, 서열 번호 14, 28, 51, 65, 16, 30, 34, 36, 38, 40, 53, 67, 71, 73, 75, 77, 25, 31, 62, 68, 27, 32, 64, 69, 13, 93, 15, 95, 80, 104, 82 또는 106 중 하나 이상을 포함하는, 핵산 분자 또는 핵산 분자 세트.
68. 실시형태 65 내지 67 중 어느 하나에 따른 핵산 분자를 포함하는 벡터.
69. 실시형태 68에 있어서, 상기 벡터는 클로닝 벡터 또는 발현 벡터인, 벡터.
70. 실시형태 68 또는 69에 있어서, 상기 벡터는 적어도 하나의 CDR 영역을 코딩하는 서열 번호 14, 28, 51, 65, 16, 30, 34, 36, 38, 40, 53, 67, 71, 73, 75, 77, 25, 31, 62, 68, 27, 32, 64, 69, 13, 93, 15, 95, 80, 104, 82 또는 106 중 하나 이상, 또는 이의 단편을 포함하는, 벡터.
71. 실시형태 68 내지 70 중 어느 하나에 있어서, 상기 벡터는 원핵 및/또는 진핵 세포 내에서 복제할 수 있는, 벡터.
72. 실시형태 68 내지 71 중 어느 하나에 있어서, 상기 벡터는 DNA 벡터, RNA 벡터, 플라스미드, 코스미드, 또는 바이러스 벡터로부터 선택되는, 벡터.
73. 실시형태 68 내지 72 중 어느 하나에 있어서, 검출가능한 및/또는 선별가능한 마커를 추가로 포함하는, 벡터.
74. 실시형태 68 내지 73 중 어느 하나에 따른 2개 발현 벡터의 세트로서,
한 벡터는 a) 서열 번호 13 또는 50을 포함하는 적어도 하나의 VH 도메인을 코딩하고, 다른 벡터는 서열 번호 24 또는 61을 포함하는 적어도 하나의 VL 도메인을 코딩하거나; b) 서열 번호 13 또는 93을 포함하는 적어도 하나의 VH 도메인을 코딩하고, 다른 벡터는 서열 번호 80 또는 104를 포함하는 적어도 하나의 VL 도메인을 코딩하는, 2개 발현 벡터의 세트.
75. 실시형태 68 내지 74 중 어느 하나에 있어서, 상기 벡터는 바이러스 벡터이며, 선택적으로 바이러스 벡터는 렌티바이러스, 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스(AAV), 단순 포진 바이러스(HSV), 파보바이러스, 레트로바이러스, 백시니아 바이러스, 신비스(Sinbis) 바이러스, 인플루엔자 바이러스, 레오바이러스, 뉴캐슬병 바이러스(NDV), 홍역 바이러스, 수포성 구내염 바이러스(VSV), 폴리오바이러스, 폭스바이러스, 세네카 밸리(Seneca Valley) 바이러스, 콕사키바이러스, 엔테로바이러스, 점액종 바이러스, 또는 마라바 바이러스인, 벡터.
76. 실시형태 75에 있어서, 상기 벡터는 AAV 벡터인, 벡터.
77. 실시형태 68 내지 76 중 어느 하나에 있어서, 상기 벡터는 프로모터를 추가로 포함하는, 벡터.
78. 실시형태 68 내지 77 중 어느 하나에 있어서, 상기 벡터는 (1) AAV2로부터 유래된 ITR, (2) CMV 인핸서(예를 들어, 서열 번호 134 포함), (3) CBA 프로모터(예를 들어, 서열 번호 135 포함), (4) SV40 인트론(예를 들어, 서열 번호 137 포함), (5) hTREM2 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같음), 및 (6) BGH 폴리 A 신호(예를 들어, 서열 번호 138 포함)를 포함하는 AAV 벡터 플라스미드 및 AAV9 캡시드를 포함하는, 벡터.
79. 실시형태 78에 있어서, 요소들 (2) 내지 (6)은 5'로부터 3'까지 AAV 벡터 플라스미드 상에 배치되는, 벡터.
80. 실시형태 78 또는 79에 있어서, 요소들 (2) 내지 (6) 중 임의의 것은 5' ITR과 3' ITR 사이의 AAV 벡터 플라스미드 상에 배치되는, 벡터.
81. 실시형태 78 내지 80 중 어느 하나에 있어서, 상기 AAV 벡터는 scAAV 벡터인, 벡터.
82. 실시형태 68 내지 75 중 어느 하나에 있어서, 상기 벡터는 렌티바이러스 벡터인, 벡터.
83. 실시형태 64 내지 66 중 어느 하나에 따른 핵산 분자 또는 핵산 분자 세트 또는 실시형태 68 내지 82 중 어느 하나의 벡터를 포함하는 세포.
84. hTREM2 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 제조 방법으로서, (i) 실시형태 83의 세포를 배양하는 단계 및 (ii) 배양액으로부터 hTREM2 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 분리하는 단계를 포함하는, 방법.
85. 실시형태 1 내지 64 중 어느 하나의 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 실시형태 65 내지 67 중 어느 하나의 핵산 분자 또는 핵산 분자 세트, 실시형태 68 내지 82 중 어느 하나의 벡터, 또는 실시형태 83의 세포 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
86. 의약으로 사용하기 위한, 실시형태 1 내지 64 중 어느 하나의 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 실시형태 65 내지 67 중 어느 하나의 핵산 분자 또는 핵산 분자 세트, 실시형태 68 내지 82 중 어느 하나의 벡터, 실시형태 83의 세포, 또는 실시형태 85의 약제학적 조성물.
87. hTREM2 기능 상실과 관련된 질환의 치료에 사용하기 위한, 실시형태 1 내지 64 중 어느 하나의 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 실시형태 65 내지 67 중 어느 하나의 핵산 분자 또는 핵산 분자 세트, 실시형태 68 내지 82 중 어느 하나의 벡터, 실시형태 83의 세포, 또는 실시형태 85의 약제학적 조성물.
88. hTREM2 기능 상실과 관련된 질환의 치료를 위한 약제를 제조하기 위한, 실시형태 1 내지 64 중 어느 하나의 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 실시형태 65 내지 67 중 어느 하나의 핵산 분자 또는 핵산 분자 세트, 실시형태 68 내지 82 중 어느 하나의 벡터, 실시형태 83의 세포, 또는 실시형태 85의 약제학적 조성물의 용도.
89. 실시형태 87 또는 88에 있어서, 상기 질환이 신경염증성 또는 신경변성 질환이고, 선택적으로 상기 신경염증성 또는 신경변성 질환이 알츠하이머병, 전두측두엽 치매, 파킨슨병, 근위축 측삭 경화증, 나수-하코라병, 다발성 경화증, 근위축 측삭 경화증(ALS), 항-NMDA 수용체 뇌염, 자폐증, 뇌 루푸스(NP-SLE), 화학-유도 말초 신경병증(CIPN), 포진 후 신경통, 만성 염증성 탈미엘린화 다발신경병증(CIDP), 간질, 길랑-바레 증후군(GBS), 봉입체 근육염, 리소좀 저장 질병, 스핑고미엘린지질증(니만-픽 C), 점액다당질 축적증 II/IIIB, 이염색백색질 장애, 다초점성 운동 신경병증, 중증 근무력증, 신경-베체트병, 시신경척수염(NMO), 시신경염, 다발근육염, 피부근육염, 라스무센 뇌염, 레트 증후군, 뇌졸중, 횡단 척수염, 외상성 뇌 손상, 척수 손상, 바이러스성 뇌염, 또는 세균성 수막염인, 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 핵산 분자 또는 핵산 분자 세트, 벡터, 세포, 또는 약제학적 조성물, 또는 용도.
90. 실시형태 87 또는 88에 있어서, 상기 질환은 알츠하이머병인, 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 핵산 분자 또는 핵산 분자 세트, 벡터, 세포, 또는 약제학적 조성물, 또는 용도.
91. 실시형태 87 또는 88에 있어서, 상기 질환은 파킨슨병인, 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 핵산 분자 또는 핵산 분자 세트, 벡터, 세포, 또는 약제학적 조성물, 또는 용도.
92. 실시형태 87 또는 88에 있어서, 상기 질환은 다발성 경화증인, 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 핵산 분자 또는 핵산 분자 세트, 벡터, 세포, 또는 약제학적 조성물, 또는 용도.
93. 실시형태 87 또는 88에 있어서, 상기 질환은 전두측두엽 치매인, 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 핵산 분자 또는 핵산 분자 세트, 벡터, 세포, 또는 약제학적 조성물, 또는 용도.
94. 실시형태 87 또는 88에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 핵산 분자 또는 핵산 분자 세트, 벡터, 세포, 또는 약제학적 조성물은 경구, 정맥 내, 두개 내, 척수강 내, 피하, 또는 비강 내 경로를 통해 대상체에게 투여되는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 핵산 분자 또는 핵산 분자 세트, 벡터, 세포, 또는 약제학적 조성물, 또는 용도.
95. 실시형태 87 또는 88에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 핵산 분자 또는 핵산 분자 세트, 벡터, 세포, 또는 약제학적 조성물은 적어도 하나의 추가의 치료제 또는 과정과 조합하여 대상체에게 투여되는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 핵산 분자 또는 핵산 분자 세트, 벡터, 세포, 또는 약제학적 조성물, 또는 용도.
96. 실시형태 87 또는 88에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 핵산 분자 또는 핵산 분자 세트, 벡터, 세포, 또는 약제학적 조성물은 적어도 하나의 추가의 치료제와 조합하여 대상체에게 투여되며, 상기 치료제는 BACE 억제제, 항-Tau 항체, Tau 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 항-아밀로이드 베타 항체, 핀골리모드, BG12 또는 디메틸 푸마레이트, 인터페론 베타 또는 타이사브리 중 하나 이상을 포함하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 핵산 분자 또는 핵산 분자 세트, 벡터, 세포, 또는 약제학적 조성물, 또는 용도.
97. 치료를 필요로 하는 대상체에서 hTREM2 기능 상실과 관련된 질환을 치료하는 방법으로서, 치료적 유효량의 실시형태 1 내지 64 중 어느 하나의 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 실시형태 65 내지 67 중 어느 하나의 핵산 분자 또는 핵산 분자 세트, 실시형태 68 내지 82 중 어느 하나의 벡터, 실시형태 83의 세포, 또는 실시형태 85의 약제학적 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
98. 실시형태 97에 있어서, 상기 방법은:
a) 대상체로부터 얻은 샘플 내 세포 표면 hTREM2 수준을 분석하는 단계;
b) 세포 표면 hTREM2 수준이 기준 수준보다 낮은 대상체를 선별하는 단계로서, 기준 수준이 건강한 대상체로부터 얻은 샘플 내 세포 표면 hTREM2 수준인, 단계; 및
c) 치료적 유효량의 실시형태 1 내지 64 중 어느 하나의 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 실시형태 65 내지 67 중 어느 하나의 핵산 분자 또는 핵산 분자 세트, 실시형태 68 내지 82 중 어느 하나의 벡터, 실시형태 83의 세포, 또는 실시형태 85의 약제학적 조성물을 선별된 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
99. 실시형태 98에 있어서, 상기 샘플이 뇌척수액을 포함하는, 방법.
100. 실시형태 98 또는 99에 있어서, 상기 샘플에서의 세포 표면 TREM2 수준이 유세포측정, 면역조직화학, 웨스턴 블롯팅, 면역형광 검정, 방사선면역검정(RIA), 효소-연관 면역흡착 검정(ELISA), 동종성 시간 분해 형광(HTRF), 또는 양전자 방출 단층촬영(PET)으로부터 선택되는 검정에 의해 결정되는 방법.
101. 실시형태 97 내지 100 중 어느 하나에 있어서, TREM2 기능 상실과 관련된 질환은 신경염증성 또는 신경변성 질환이며, 선택적으로 상기 신경염증성 또는 신경변성 질환은 알츠하이머병, 전두측두엽 치매, 파킨슨병, 근위축 측삭 경화증, 나수-하코라병, 다발성 경화증, 근위축 측삭 경화증(ALS), 항-NMDA 수용체 뇌염, 자폐증, 뇌 루푸스(NP-SLE), 화학-유도 말초 신경병증(CIPN), 포진 후 신경통, 만성 염증성 탈미엘린화 다발신경병증(CIDP), 간질, 길랑-바레 증후군(GBS), 봉입체 근육염, 리소좀 저장 질병, 스핑고미엘린지질증(니만-픽 C), 점액다당질 축적증 II/IIIB, 이염색백색질 장애, 다초점성 운동 신경병증, 중증 근무력증, 신경-베체트병, 시신경척수염(NMO), 시신경염, 다발근육염, 피부근육염, 라스무센 뇌염, 레트 증후군, 뇌졸중, 횡단 척수염, 외상성 뇌 손상, 척수 손상, 바이러스성 뇌염, 또는 세균성 수막염인, 방법.
102. 실시형태 97 내지 101 중 어느 하나에 있어서, 상기 질환은 알츠하이머병인, 방법.
103. 실시형태 97 내지 101 중 어느 하나에 있어서, 상기 질환은 파킨슨병인, 방법.
104. 실시형태 97 내지 101 중 어느 하나에 있어서, 상기 질환은 다발성 경화증인, 방법.
105. 실시형태 97 내지 101 중 어느 하나에 있어서, 상기 질환은 전두측두엽 치매인, 방법.
106. 실시형태 97 내지 105 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 핵산 분자 또는 핵산 분자 세트, 벡터, 세포, 또는 약제학적 조성물이 경구, 정맥 내, 두개 내, 척수강 내, 피하, 또는 비강 내 경로를 통해 대상체에게 투여되는, 방법.
107. 대상체에서 hTREM2 단백질을 안정화시키는 방법으로서, hTREM2를 안정화시키는데 유효한 양으로 실시형태 1 내지 64 중 어느 하나의 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 실시형태 65 내지 67 중 어느 하나의 핵산 분자 또는 핵산 분자 세트, 실시형태 68 내지 82 중 어느 하나의 벡터, 실시형태 83의 세포, 또는 실시형태 85의 약제학적 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
108. 실시형태 97 내지 107 중 어느 하나에 있어서, 상기 방법은 대상체에게 적어도 하나의 추가 치료제를 투여하는 단계 또는 적어도 하나의 추가 치료 과정을 수행하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
109. 실시형태 108에 있어서, 상기 추가 치료제는 BACE 억제제, 항-Tau 항체, Tau 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 항-아밀로이드 베타 항체, 핀골리모드, BG12 또는 디메틸 푸마레이트, 인터페론 베타 또는 타이사브리 중 하나 이상을 포함하는, 방법.
110. 실시형태 108 또는 109에 있어서, 실시형태 1 내지 64 중 어느 하나의 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 실시형태 65 내지 67 중 어느 하나의 핵산 분자 또는 핵산 분자 세트, 실시형태 68 내지 82 중 어느 하나의 벡터, 실시형태 83의 세포, 또는 실시형태 85의 약제학적 조성물이 추가 치료제와 동시에, 이전에, 또는 이후에 투여되는, 방법.
111. 실시형태 97 내지 110 중 어느 하나에 있어서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 핵산 분자 또는 핵산 분자 세트, 벡터, 세포, 또는 약제학적 조성물의 투여는 하기 효과 a~d 중 하나 이상을 갖는 방법:
a) 식세포작용 및 화학주성과 같은 TREM2-의존성 세포 활동 증가,
b) TREM2-의존성 유전자 전사 유발,
c) Syk-인산화를 통한 TREM2-의존성 세포 내 신호전달 경로 증가,
d) 세포 잔해의 제거 증가.
실시예
본 발명은 하기 실시예에서 추가로 설명되며, 이는 청구범위에 기재된 본 발명의 범주를 제한하는 것이 아니다.
실시예 1: 인간 TREM2를 위한 항체 생성
물질 및 방법
시약
인간, 마우스 및 사이노몰구스 TREM2를 인식하는 항체의 선택을 위해, 다중 패닝 전략을 사용하였다. TREM2 단백질에 대한 항체는 HuCAL®을 기반으로 하는 파지미드 라이브러리 HuCAL PLATINUM®을 사용하여 높은 결합 친화도를 갖는 클론을 선택하여 생성되었다(Prassler et al. 2011; Rothe et al. 2008; Knappik et al. 2000). MorphoSys 파지 디스플레이 라이브러리는 파지 표면에 Fab를 표시하기 위해 CysDisplay™ 기술을 사용한다(WO 01/05950). 항-TREM2 항체의 분리를 위해, 표준 및 RapMAT 성숙 패닝 전략은 고체상, 용액, 전체 세포 및 차등 전체 세포 패닝 접근법을 사용하여 수행하였다.
초기 패닝
항원 TREM2 용액으로 결합하는 초기 후보를 수용하기 위해, Fc 포획 패닝 및 차등 전체 세포 패닝을 수행하였다.
[표 2]
Figure pct00051
Fc 포획 패닝
항원 선택 과정 전에, 최적의 항원 코팅 농도를 결정하기 위해 코팅 검사 ELISA의 수행이 필수이다. 포획 패닝의 경우, 항원(hTREM1 IgSF-hTREM2 스톡(stalk)-hFc, hTREM2 ECD (19-174)-hFc 또는 hTREM2 ECD-His)을 적당한 포획 항체를 통해 96-웰 플레이트 상에 고정시켰으며, 이는 각각의 항원에 융합된 태그에 따라 다르다(Fc 태그된 항원에 대한 염소 및 마우스 항-인간 Fc, 자세한 내용은 표 2 참조).
웰의 수는 사용된 서브-라이브러리 풀의 수에 따라 달랐다. 웰 제조와 병행하여, 0.05%Tween-20을 함유하는 케미블로커(Chemiblocker)로 파지를 차단하고; 차단 완충액에 추가의 차단 시약을 추가하여 태그 또는 포획 항체(Fc 포획 패닝을 위한 인간, 염소 및 마우스 γ 글로불린)에 대한 항체 선택을 피하였다. 차단된 파지의 사전-클리어링을 위해, 96-웰 플레이트의 적당한 수의 웰을 hTREM2-IgSF-hTREM1 스톡-hFc로 코팅하였다. 파지를 첨가하고, 실온에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 상청액을 다른 반대-표적 코팅된 웰로 옮기고, 인큐베이션을 3회 반복하였다. 차단 및 사전-클리어링 과정 후, 파지 믹스를 각각의 항원 코팅된 웰에 첨가하고, 파지-항체를 실온에서 1.5시간 동안 항원에 결합시켰다. PBS/Tween 20 및 PBS를 사용하여 세척하면, 비특이적으로 결합된 파지가 제거된 다음, 특이적으로 결합된 파지가 DTT를 사용하여 용출된다. 용리물은 파지 감염을 위해 이. 콜라이 TG1 배양물로 옮겨졌다. 37℃에서 45분 동안 인큐베이션한 후에, 배양물은 원심분리되고, 박테리아 펠릿은 새로운 배지에 재현탁되고, 한천 플레이트에서 플레이팅되었다. 성장 후, 콜로니를 플레이트에서 긁어 내고, 하기 설명한 바와 같이 파지 구출, 선택된 클론의 다클론 증폭 및 파지 생성에 사용하였다. 정제된 파지를 이용하여 다음 패닝 라운드를 시작하였다.
포획 패닝의 제2 및 제3 라운드는 제1 패닝 라운드의 프로토콜에 따라 수행하였다. 항원의 양이 감소하고 엄격도가 증가된 세척 조건을 적용하였다.
모 결합제 MOR041874는 본 패닝 전략에서 유도되었다.
스트렙타비딘-결합된 자성 비드를 사용한 솔루션 패닝
솔루션 패닝을 위한 전제조건은 항원의 비오티닐화와 비오티닐화된 항원의 활성 유지 확인이었다. 솔루션 패닝 동안 Fab 디스플레이 파지와 비오티닐화된 항원을 용액에서 인큐베이션하여, 파지에 의한 항원의 접근성을 용이하게 했다.
적당한 양의 스트렙타비딘 비드를 케미블로커로 차단하였다. 동시에, 0.05%Tween-20 및 인간 감마 글로불린 #1(0.05 mg/ml)을 함유하는 케미블로커로 적당량의 파지를 차단하여, hFc-결합 클론의 선택을 피하였다. 스트렙타비딘- 또는 비드-결합 파지의 제거를 위해, 차단 스트렙타비딘 비드를 사용하여 차단 파지 입자의 사전 흡착을 수행하였다. 그 후, 비오티닐화 TREM2를 사전 흡착되고 차단된 파지 입자에 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 파지-항체가 용액 중 항원에 결합하도록 하였다. 파지-항원 복합체는 차단된 스트렙타비딘 비드를 사용하여 포획하였고, 스트렙타비딘 비드에 결합된 파지 입자는 자기 분리기로 수집하였다. 비특이적으로 결합된 파지를 여러 세척 단계에서 세척 제거하였다. DTT를 첨가하여, 비특이적으로 결합된 파지를 스트렙타비딘으로부터 용리하였다. 용리물은 파지 감염을 위해 이. 콜라이 TG1 배양물로 옮겨졌다. 37℃에서 45분 동안 인큐베이션한 후에, 배양물은 원심분리되고, 박테리아 펠릿은 새로운 배지에 재현탁되고, 한천 플레이트에서 플레이팅되었다. 성장 후, 콜로니를 플레이트에서 긁어 내고, 하기 설명한 바와 같이 파지 구출, 선택된 클론의 다클론 증폭 및 파지 생성에 사용하였다. 정제된 파지를 이용하여 다음 패닝 라운드를 시작하였다.
비드-기반 솔루션 패닝의 제2 및 제3 라운드는 제1 패닝 라운드의 프로토콜에 따라 수행하였다. 엄격도가 증가된 세척 조건이 적용되었다. 모 결합제 MOR042492, MOR042493 및 MOR042556은 이러한 패닝 전략으로부터 유도되었다.
차등 전체 세포 패닝(Differential Whole Cell Panning, dWCP)
패닝 전날, 세포를 5 μM DPC333으로 하룻밤동안 전처리하여(문헌[Qian et al. 2007. Drug Metab and Disp 35:1916-1925]) TREM2의 표면 발현을 증가시켰다. 각각의 패닝에 대해, 적당한 양의 파지를 세척 완충액(DPBS+ / 5%FCS / 0.02% NaN3)으로 차단하고, Fc 포획 패닝에 대해 위에서 설명한 방법에 따라 사전-클리어링했다. 동시에, 항원 TREM2(1x107 세포/서브코드)를 발현하는 적당한 양의 표적 세포 및 파지 풀 당 항원 TREM2의 발현이 없는 적당한 양의 흡착 세포를 세척 완충액으로 차단하였다. 차단된 표적 세포를 스핀다운시키고, 사전 차단된 파지 입자에 재현탁시키고, 4℃에서 2시간 동안 파지-항체를 세포 상에 제시된 항원에 결합하도록 하여, 수용체 내재화를 피하였다. 파지-세포 복합체를 수 회 세척하였다. 세포를 원심분리하고 50 mM 시트레이트 완충액 pH 3.5 / 150 mM NaCl에 펠릿을 재현탁함으로써 표적 세포로부터 특이적으로 결합된 파지가 용출되었고, 실온에서 10분 동안 인큐베이션하였다. 원심분리 후, 상청액(용출액)은 2 M 트리스-염기(Tris-base)를 이용하여 중화하고, (흡착 후) 표적 항원 이외의 세포 표면 분자에 결합하는 파지를 제거하기 위해 흡착 세포에 적용하였다. 특이적으로 결합된 파지는 DTT를 사용하여 표적 세포로부터 용출되었고, 최종 상청액은 상기 기술된 바와 같이 파지 감염을 위해 E. coli TG1 배양물로 옮겼다.
제2 패닝 라운드는 위에서 설명한 솔루션 패닝에 따라 수행하였다. 전체 세포 패닝의 제3 라운드는 제1 패닝 라운드의 프로토콜에 따라 수행하였다.
모 결합제 MOR042596, MOR042752 및 MOR042765가 본 패닝 전략으로부터 유도되었다.
Fab-제시 파지 입자의 생산
표면에서 Fab 단편을 제시하는 새로운 파지 입자는 각각의 선택 회차에 대해 생성되었다. 각각의 파지 준비를 위해, 12 ml 2x YT/Cam/Glc 배지는 상응하는 라이브러리 글리세롤 스톡으로부터 박테리아로 접종되어서 OD600이 0.1 내지 0.2이 되었다. 0.45 내지 0.55의 OD600에 도달될 때까지 배양물은 120 rpm에서 37℃에서 30분 내지 90분 동안 진탕되었다. 이후, 헬퍼 파지는 박테리아 배양물에 10의 다중 감염도로 첨가된 후에, 진탕 없이 37℃에서 30분 동안 및 이후 160 rpm에서 진탕되면서 37℃에서 30분 동안 항온처리되었다. 박테리아는 스핀 다운되고, 상청액을 함유하는 헬퍼 파지를 버렸다. 파지 감염된 박테리아는 400 ml의 2x YT/Cam/Kan/IPTG 배지에 재현탁되고, 120 rpm에서 진탕되면서 22℃에서 항온처리되었다. 다음날, 밤샘 배양물로부터의 박테리아는 펠릿화되고, Fab-제시 파지를 함유하는 상청액은 수집되었다. 예비 냉각된 PEG/NaCl의 총 부피의 1/5를 파지-함유 상청액에 첨가하여 파지 침전이 수행되었다. 침전하는 파지의 구름이 보여질 때까지 샘플은 얼음에서 적어도 30분 동안 항온처리되었다. 침전된 파지는 스핀 다운되고, PBS에 재현탁되었다. 파지 역가는 스팟 적정에 의해 결정하였다.
친화도 성숙 전 PTM 제거
모 후보체 MOR042492가 HCDR3에 중요한 번역후 변형(PTM)을 포함했기 때문에, 이 후보체는 친화도 결정에 들어가기 전에 수선되었다. 따라서, 올리고뉴클레오타이드 교환에 의해 3개의 수선된 변이체가 생성되었고, 성공적으로 수행된 올리고뉴클레오타이드 교환은 시퀀싱으로 확인되었다. 수선된 변이체는 hTREM2-ECD (19-174)-hFc 상의 Fab-함유 미정제 박테리아 용해물로 테스트하였다. 유사한 결합 프로파일을 나타내는 변이체를 친화도 성숙을 위해 풀링하였다(MOR043962 및 MOR043963).
HuCAL PLATINUM® 성숙 라이브러리 및 HuCAL PLATINUM® RapMAT 라이브러리의 생성
선택된 항체의 친화도 및 생물학적 활성을 증가시키기 위해, CDR-L3 및 CDR-H2 영역은 트리뉴클레오티드 유도 돌연변이유발을 사용하여 카세트 돌연변이유발에 의해 최적화한 반면 프레임워크 영역은 일정하게 유지하였다(문헌[Virnek
Figure pct00052
s et al. (1994) Nucleic Acids Res 22, 5600-5607]).
성숙 라이브러리의 클로닝은 모 Fab 단편을 암호화하는 CysDisplay™ 벡터에서 수행되었다. CysDisplay™ 벡터에 아직 존재하지 않는 경우, 모 Fab 단편을 코딩하는 DNA 서열은 라이브러리 클로닝 전에 제한 소화 및 결찰을 통해 각 벡터로 전달되었다.
HuCAL PLATINUM® 성숙 라이브러리의 생성이 각 성숙 후보에 대해 개별적으로 수행되거나, 라이브러리 생성 전에 서로 다른 모 항체 세트를 풀링하였다. CDR-L3 최적화를 위해, 경쇄의 불변 영역뿐만 아니라 CDR-L3, 프레임워크 4도 코딩하는 대략 400 bp DNA 단편을 제한효소 분해에 의해 모 항체 코딩 서열로부터 제거하고, 프레임워크 4 및 불변 도메인과 함께 다양한 CDR-L3 영역들을 코딩하는 DNA 단편들의 레퍼토리로 대체하였다.
두 번째 라이브러리 세트에서 CDR-H2-코딩 서열을 다양화한 반면, 연결 프레임워크 영역은 일정하게 유지하였다. 모 비다양화 서열의 배경을 줄이기 위해, 모 CDR-H2 및 프레임워크 3 서열을 포함하는 대략 150 bp DNA 단편을 제한효소 분해 및 라이게이션을 통해 대략 590 bp 더미(dummy) 서열로 대체한 후, 다양화 CDR-H2 카세트(프레임워크 3을 포함함)도 제한효소 분해 및 라이게이션을 통해 삽입하였다. 이 방법은 MOR042556을 제외한 모든 성숙 후보에 사용되었다.
선택된 클론(모 후보 MOR042556)에 대해 HuCAL PLATINUM® RapMAT 라이브러리의 생성을 수행하였다 따라서, phoA 신호로부터 프레임워크 3(H-CDR1 및 CDR-H2 포함)으로의 DNA 서열을 통합시키는 약 370 bp DNA 단편을 제한 소화로 제거하고, 다양한 CDR-H2 영역 및 다양하지 않은 프레임워크-특이적 CDR-H1을 코딩하는 DNA 단편들의 레퍼토리에 의해 대체되었다. MC1061F' 세포에서의 결찰 혼합물의 전기천공은 5x106개 초과의 독립 콜로니에서 대략 108 내지 109를 생성하였다. 라이브러리의 증폭을 이전에 설명된 바와 같이 수행하였다(문헌[Rauchenberger et al. 2003]). 품질 제어를 위해 라이브러리당 대략 10~20개의 단일 클론을 무작위로 골라 내고, 서열결정하였다.
성숙 패닝
이전에 선택된 항체 단편의 친화도 및 생물학적 활성을 증가시키기 위해, CDR-L3 및 CDR-H2 영역들을 상기 기재된 바와 같이 다양한 카세트/모듈(Prassler et al. 2009)로 동시에 교환하였다. 필요한 경우, 친화도 성숙을 위한 라이브러리 클로닝 전에 모 Fab 단편들을 해당 발현 벡터로부터 CysDisplay™ 벡터로 전달하였다.
친화성이 향상된 후보를 선발하기 위해 성숙 라이브러리로부터 유래된 파지에 3회의 라운드의 성숙 패닝을 적용하였다. 솔루션 패닝 및 dWCP를 상기 기재된 대로, 및 표 3에 기재된 조건에 따라 수행하였다.
[표 3]
Figure pct00053
Figure pct00054
패닝 엄격성은 각각의 패닝 라운드에서 항원 농도를 낮춤으로써 증가시켰다(문헌[Low et al. 1996]). 항원 감소에 더하여, 제3 패닝 라운드에서 오프-레이트(off-rate) 선발을 수행하고(문헌[Hawkins et al. 1992): 항원-파지 복합체는 과량의 비오티닐화되지않은 TREM2 항원과 함께 인큐베이션되어 고-아핀 결합제만을 풍부하게 하였으며; 약한 결합제는 용액에서 과잉 항원을 우선적으로 결합시킬 것으로 예상되어 제거될 수 있었다. 이것은 광범위한 세척 단계와 결합되었다. 자기 비드에 커플링된 TREM2에서 고친화성 파지의 용출은 DTT로 수행되었다.
이. 콜라이를 위한 Fab-발현 벡터 내로의 디스플레이 벡터로부터의 서브클로닝
이. 콜라이에서의 가용성 Fab의 신속한 발현을 촉진하기 위해, 선발된 HuCAL PLATINUM® 파지의 Fab 코딩 삽입물을 pMORPH®30 디스플레이 벡터로부터 Fab-발현 벡터 pMORPH®x11_Fab-FH 내로 서브클로닝하였다. EcoRI │ XbaI │ BmtI를 통해 삼중 분해에 의해 서브클로닝을 수행하였다.
HKB11 세포에 대한 IgG 및 FabCys 발현 벡터 내로의 서브클로닝
HKB11 세포 내 전장 IgG 또는 1가 FabCys 발현을 위해, 선택된 후보 또는 후보 풀은 원하는 특징/태그를 포함하는 각각의 발현 벡터로 클로닝하였다. IgG 및 FabCys 포맷과 사용가능한 각 벡터의 요약은 표 4에 기재되어 있다.
다량의 서열-고유 Fab 클론의 IgG 포맷으로의 편리하고 효율적인 변환을 위한 2단계 방법으로 서브클로닝을 수행하였다.
[표 4]
Figure pct00055
HuCAL PLATINUM® RapCLONE®으로부터의 서브클로닝
첫 번째 클로닝 단계에서, 진핵 발현 카세트를 디스플레이 벡터로, 또는 BsiWI │ MfeI(κ 풀의 경우) 또는 HpaI │ MfeI(λ 풀의 경우) 소화 및 이후의 결찰을 통해 이. 콜라이(E. coli) 내 Fab 발현을 위한 벡터로 도입하였다. 이어서 EcoRV │ BlpI(κ 및 λ 풀)을 사용하여 발현 카세트를 함유하는 Fab 풀을 소화시킨 다음, 포유류 세포에서 발현을 위해 수용체 벡터로 클로닝하는 두 번째 클로닝 단계가 이어졌다.
이. 콜라이( E. coli )에서의 생산
미정제 박테리아 용해물을 함유하는 Fab의 생성
성장 배지(클로람페니콜, IPTG 및 저 글루코스를 함유하는 2xYT)로 미리 채워진 96-웰/384-웰 마이크로타이터 플레이트를 접종하였다. 박테리아 증식을 위해 플레이트를 37℃에서 인큐베이션하고, Fab 발현을 위해 22℃에서 하룻밤동안 진탕하였다. 다음날 보레이트 완충제, EDTA 및 리소자임을 함유하는 BEL 완충액을 첨가하여 발현 배양물을 용해시켰다. 용해물이 민감한 세포 스크리닝에 사용된 경우 EDTA는 생략되었다.
His-태그된 Fab 단편의 탐색 규모의 생산
이. 콜라이 TG1 F- 세포에서 박테리아 발현 벡터에 의해 코딩된 Fab 단편의 발현은 0.1% 글루코스 및 34 μg/mL의 클로람페니콜이 보충된 500 mL의 2xYT 배지를 사용하여 진탕 플라스크 배양에서 수행하였다. OD600이 0.5의 값에 도달할 때까지 배양물을 진탕하였다. IPTG(이소프로필-ß-D-티오갈락토피라노시드)를 첨가하고 20시간 동안 추가로 배양하여, Fab 발현을 유도하였다. 세포를 수확하고, 리소자임을 사용하여 파괴하였다. IMAC(Bio-Rad)를 통해 His6-태그된 Fab 단편을 단리시키고, 이미다졸을 사용하여 용출하였다. ‘PD10' 컬럼(GE Healthcare)을 사용하여 1x 둘베코 PBS(pH 7.2)로의 완충액 교환을 수행하였다. 샘플을 멸균 여과하였다(0.2 μm). 단백질 농도를 UV 분광광도법으로 측정하고 IgG의 순도는 CE-SDS(LabChip GXII, Perkin Elmer)를 사용하여 변성, 환원 및 비환원 조건 하에서 분석하였다. HP-SEC를 수행하여 천연 상태에서 IgG 제제를 분석하였다.
HKB11 세포에서 IgG의 생산
IgG의 고급 마이크로규모 생산
진핵 HKB11 세포는 IgG의 중쇄 및 경쇄 둘 다를 코딩하는 포유류 발현 벡터 DNA로 형질감염시켰다. 형질감염 후 7일차에 세포 배양 상청액을 수확하고, 단백질 A 친화성 크로마토그래피(MabSelect SURE™, GE Healthcare)를 실시하였다. 샘플은 중화된 용출 완충액(NaPS: 137 mM 인산나트륨, 81 mM NaCl, pH 7)에 남아 있었다. 샘플을 멸균 여과하였다(0.2 μm). 단백질 농도를 UV 분광광도법으로 측정하고 IgG의 순도는 CE-SDS(LabChip GXII™, Perkin Elmer)를 사용하여 변성, 환원 조건 하에서 분석하였다. HP-SEC를 수행하여 천연 상태에서 IgG 제제를 분석하였다.
IgG의 탐색 규모 생산
진핵 HKB11 세포는 IgG의 중쇄 및 경쇄 둘 다를 코딩하는 포유류 발현 벡터 DNA로 형질감염시켰다. 형질감염 후 3일차 또는 6일차에 세포 배양 상청액을 수확하고 표준 단백질 A 친화성 크로마토그래피(MabSelect SURE, GE Healthcare)를 실시하였다. 완충액 교환을 1x 둘베코 PBS(pH 7.2, Invitrogen)로 수행하고, 샘플을 살균 여과하였다(0.2 μm). 단백질 농도를 UV 분광광도법으로 측정하고 IgG의 순도는 CE-SDS(LabChip GXII, Perkin Elmer)를 사용하여 변성, 환원 및 비환원 조건 하에서 분석하였다. HP-SEC를 수행하여 천연 상태에서 IgG 제제를 분석하였다.
생체 내 특성화를 위한 재료 생산
진핵 HKB11 세포는 IgG의 중쇄 및 경쇄 둘 다를 코딩하는 포유류 발현 벡터 DNA로 형질감염시켰다. 형질감염 후 6일차에 세포 배양 상청액을 수확하고, 단백질 A 친화성 크로마토그래피(MabSelect SURE, GE Healthcare)를 실시하였다. 필요한 경우, 2차 정제 단계(예비 SEC, Superdex 200, GE Healthcare)를 수행하여 응집체를 제거하였다. 완충액 교환을 1x 둘베코 PBS(pH 7.2, Invitrogen)로 수행하고, 샘플을 살균 여과하였다(0.2 μm). 단백질 농도를 UV 분광광도법으로 측정하고 IgG의 순도는 CE-SDS(LabChip GXII, Perkin Elmer)를 사용하여 변성, 환원 및 비환원 조건 하에서 분석하였다. HP-SEC를 수행하여 천연 상태에서 IgG 제제를 분석하였다. KQCL 분석(Lonza)에 의해 내독소 수준을 결정하였다. 단백질 아이덴티티는 질량 분석법을 사용하여 확인하였다.
HKB11 세포에서 FabCys의 생산
태그없는 FabCys의 탐색 규모 생산
진핵 HKB11 세포는 이황화-가교된 FabCys의 중쇄 및 경쇄 둘 다를 코딩하는 포유류 발현 벡터 DNA로 형질감염시켰다. 형질감염 후 3일차에 또는 7일차에 세포 배양 상청액을 수확하고, CH1 친화성 크로마토그래피(Capture Select IgG-CH1, Thermo Scientific)를 실시하였다. 완충액 교환을 1x 둘베코 PBS(pH 7.2, Invitrogen)로 수행하고, 샘플을 살균 여과하였다(0.2 μm 기공 크기). 단백질 농도를 UV 분광광도법으로 측정하고 FabCys의 순도는 CE-SDS(LabChip GXII, Perkin Elmer)를 사용하여 변성, 환원 및 비환원 조건 하에서 분석하였다. HP-SEC를 수행하여 천연 상태에서 FabCys 제제를 분석하였다.
AviHis-태그된 FabCys의 탐색 규모 생산
진핵 HKB11 세포는 이황화-가교된 FabCysAviHis의 중쇄 및 경쇄 둘 다를 코딩하는 포유류 발현 벡터 DNA로 형질감염시켰다. 형질감염 후 3일차 또는 7일차에 세포 배양 상청액을 수확하고, 금속 이온 친화성 크로마토그래피(Protino Ni-NTA, Macherey Nagel)를 실시하였다. 완충액 교환을 1x 둘베코 PBS(pH 7.2, Invitrogen)로 수행하고, 샘플을 살균 여과하였다(0.2 μm 기공 크기).
단백질 농도를 UV 분광광도법으로 측정하고 FabCysAviHis의 순도는 CE-SDS(LabChip GXII, Perkin Elmer)를 사용하여 변성, 환원 및 비환원 조건 하에서 분석하였다. HP-SEC를 수행하여 천연 상태에서 FabCysAviHis 제제를 분석하였다.
패닝 전략 요약
TREM2, IgSF 도메인 및 스톡 영역의 세포 외 도메인 둘 다에 대한 항체의 선택을 목표로 하는 초기 및 백업 패닝 전략. 따라서, 완전한 TREM2 ECD에 대한 전략과 스톡 영역 선택 및 심지어 부분절단효소 절단 부위 특정 클론을 위한 보다 구체적인 전략이 포함되었다. 각각의 표적화된 TREM2 도메인 특이성에 대해, 3가지 상이한 항원 제시 모드를 적용하였다: 비오티닐화된 항원을 사용한 솔루션 패닝, Fc 포획 패닝 및 제1 및 제3 패닝 라운드에서의 항원 발현 세포 및 제2 패닝 라운드에서의 재조합 항원을 사용한 차등 전체 세포 패닝. 스톡 영역 특이성은 TREM2 스톡 영역과 조합된 TREM1 IgSF 도메인으로 구성된, 또는 역으로 패닝 항원으로서 (hTREM1 IgSF-hTREM2 스톡) 또는 차단을 위해 (hTREM2 IgSF-hTREM1 스톡) 스위치 작제물을 사용하여 달성할 수 있다. 매핑 실험에 기초하여, 부분절단효소 절단 부위 영역은 TREM2 스톡 영역의 막곁(juxtamembrane) 부분에 20 aa를 포함하고; 상응하는 펩타이드 78을 사용하여 절단 부위 특이적 클론을 풍부하게 하였다.
모든 표적화된 TREM2 ECD 영역에 대한 항체가 확인될 수 있다. 그러나, 안정화 활성에 대한 가장 유망한 프로필(즉, 사이노 교차-반응성 및 세포 결합과 조합된 스톡 영역 특이성)을 갖는 적은 수의 클론만 선택하였다.
스크리닝 결과 요약
1차 스크리닝
초기 패닝의 모든 서브코드는 Intellicyt 장치를 사용하여 다중화 접근방식으로 비오티닐화된 hTREM2, mTREM2, hTREM1 IgSF-hTREM2 스톡, hTREM2 IgSF-hTREM1 스톡 및 hTREM1 상에서 스크리닝되었다(서브코드 당 368개의 클론). 초기 패닝으로부터 총 9200개의 클론을 스크리닝하여, 736개의 1차 히트를 선택하였다. 대부분의 IgSF 도메인 특이적 클론은 hTREM2 상의 솔루션 패닝으로부터 유래하는 반면, 대부분의 스톡 영역 특이적 항체는 차등 전체 세포 패닝으로부터 유래한다.
백업 패닝은 초기 패닝과 유사한 방식으로 스크리닝되었다. 동시에, 세포 패닝 라운드(들)을 포함하는 모든 서브코드는 모 CHO-DAP12 및 CHO-DAP12-hTREM2 세포에서 스크리닝되었다. 또한, - 세포 패닝 라운드에 사용된 세포 유형에 따라 - 일부 서브코드는 CHO-DAP12-cyTREM2, CHO-DAP12-mTREM2, CHO-DAP12-hTREM1 IgSF-hTREM2 스톡, HEK-DAP12-hTREM2 융합 및 THP1-NFAT-luc 세포 상에서 추가로 스크리닝되었다. 총 10304개의 클론을 스크리닝하여 402개의 1차 히트를 선택하였다.
2차 스크리닝 및 다양성 결정
초기 패닝(상이한 재조합 단백질 및 세포주들을 사용하여 hu/cy/mu TREM2에 결합, TREM2/TREM1 스위치 작제물 및 절단 부위 펩타이드 78을 사용한 도메인 특이성, TREM1 카운터-스크린)으로부터 736개의 1차 히트의 2차 스크리닝에 기반하여, VH 시퀀싱을 위해 284개의 클론들을 선택하였다. 이들 중, 104개의 클론들이 고유한 HCDR3 서열들을 가졌다. 이와 유사하게, 백업 패닝으로부터의 402개의 1차 히트는 선택된 클론들의 2차 스크리닝 및 VH 시퀀싱을 거쳐, 186개의 새로운, HDR3 고유 클론들이 생성되었다. 초기 캠페인에서 이미 알려진 5개의 서열들만 확인되었다.
고유 클론의 확인 및 추가 특성화
추가 확인 스크리닝 분석에 의해, 초기 캠페인으로부터의 104개 중 81개의 고유 클론들 및 백업 캠페인으로부터의 186개 중 165개의 고유 클론들을 hTREM2 특이적 항체 클론으로 정의하고, 후속 기능적 특성화를 위해 선택하였다(총 246개 클론). 이들의 결합 거동에 따라, 이러한 클론들은 상이한 프로파일 그룹으로 나뉠 수 있었다. 대부분의 클론들은 IgSF 도메인 특이적이었다(173개의 클론, 70%). 이러한 클론들의 대부분은 TREM2 과발현 세포에 특이적으로 결합하고, 사이노 TREM2(157개 클론)에 교차-반응성이다. 또한, 53개(22%) 스톡 영역 특이적 항체가 확인되었다. 53개 중 19개의 클론들은 절단 부위 펩타이드 78에 결합하지 않으므로, "스톡(외부 절단 부위)" 항체라고 불리며; 이들 클론들 중 14개는 TREM2 특이적 세포 결합을 나타낸다. 53개 중 34개의 클론들은 그의 절단 부위 영역내에서 TREM2와 결합한다("스톡(절단 부위)" 항체). 남은 20개의 클론들(8%)은 TREM2-ECD와 결합하지만, 두 스위치 작제물들 중 어느 하나에도 결합하지 않으므로, "ECD내의 불분명한 도메인" 결합 항체로서 지정되며; 20개 중 10개의 클론들은 TREM2 과발현 세포에 특이적으로 결합한다.
성숙 후보들의 선택
성숙 후보의 선택은 주로 확인된 항체의 기능적 특성에 기반을 두었다. TREM2는 선천성 면역 수용체 계열에 속하므로, LPS 및 기타 박테리아 표면 단백질과 상호작용하는 것으로 알려져 있다. 따라서, 관련 기능 분석에 적합한 물질을 생성하기 위해서는 항-TREM2 항체 생산을 위해 박테리아에서 포유류 플랫폼으로 전환하는 것이 필수적이었다.
IgG 특성화
결합 특성들(도메인 특이성, 종 교차-반응성, 특이적 세포 결합, 카운터-표적 결합, 친화도, 에피토프 결합) 외에, 다양한 기능적 양태들(다른 세포 시스템에서 TREM2 세포 표면 수준의 안정화, NFAT RGA에서 신호 활성화, 내재화, 리간드 결합과의 경쟁, 식세포작용)을 다뤘다.
TREM2 안정화 효과를 갖는, 즉 TREM2 엑토도메인 부분절단으로부터 보호하는 항체는 극히 드물다. 다른 모든 기준을 고려하여, 5개의 유망한 TREM2 안정화 항체가 확인되었다: MOR042492, MOR042493 및, MOR042589, MOR042596, MOR042556.
안정화 후보에 더해, TREM2 신호 활성화 항체가 확인될 수 있었다. 다시 다른 관련 기준을 고려할때, 가장 흥미로운 후보는 MOR041874, MOR042785, MOR042752, MOR042765이었다.
이들 9개의 후보들이 표 5에 개시되어 있다.
[표 5]
Figure pct00056
Figure pct00057
PTM 제거
9개의 성숙 후보 중 2개(MOR042492, MOR042589)가 HCDR3에 번역 후 변형(PTM)을 포함했기 때문에, 이들 클론은 친화성 성숙 전에 수선되었다. 따라서, 올리고뉴클레오타이드 교환에 의해 성숙 후보당 3개의 수선된 변이체가 생성되었고, 성공적으로 수행된 올리고뉴클레오타이드 교환은 시퀀싱으로 확인되었다. 수선된 변이체는 BEL 스크리닝을 통해 기능에 대해 추가로 테스트되었다. 유사한 결합 프로파일을 나타내는 변이체를 친화도 성숙을 위해 풀링하였다. 변이체가 그들의 모 클론보다 더 낮은 결합을 나타내었기 때문에 친화성 성숙을 위해 모 MOR042589가 추가로 사용되었다.
친화도 성숙 라이브러리의 생성
마지막으로, 6개의 리드 후보로 구성된 9개의 성숙 라이브러리(표 6 참조)가 별도로 성숙에 들어갔다. 선택에는 최대 3개의 클론으로 구성된 3개의 풀도 포함되었다. 이들은 동일한 에피토프를 표적으로 하는 동일한 프레임워크를 가진 클론이거나 PTM 제거에 의해 하나의 모 클론에서 유래된 자손 클론이었다.
[표 6]
Figure pct00058
성숙 패닝 요약
대부분의 성숙 후보는 초기 패닝 동안 솔루션 또는 차등 전체 세포 패닝에서 유래되었기 때문에, 라이브러리 생성 후 개선된 결합제를 확인하기 위해 주로 높은 엄격성 하에서 솔루션 패닝과 세포 패닝을 수행하였다. 따라서, 초기 패닝에서 가장 성공적인 전략이었던 솔루션 패닝은 각 클론의 모든 VH 및 VL 라이브러리를 개별적으로 사용하여 3회에 걸쳐 수행되었다. 또한, 제1 라운드의 솔루션 패닝에서 유래된 패닝 출력이 풀링되었다. 이러한 방식으로, 각 패닝 라이브러리의 VH 및 VL 성숙 서브코드와, 유사한 결합 프로파일을 나타내는 클론의 VH 및 VL 라이브러리가 제2 패닝 라운드에 들어가기 전에 풀링되었다. 풀은 TREM2 수준을 낮추기 위해 DPC333 처리없이 CHO-DAP12-cyTREM2 세포를 사용하여 세포 패닝에 들어가서, 이러한 세포 패닝의 엄격성을 증가시켰다. 이러한 패닝은 고친화성 세포 결합제의 생성을 보장해야 하며, 여러 후보의 풀에 적용된 뮤린 BV2 세포를 사용한 패닝은 hu/m/cy 교차-반응성 클론을 받기 위해 수행되었다. 용액에서 비오티닐화되지 않은 항원과의 경쟁에 의해 제3 라운드 동안 koff 선택뿐만 아니라 항원 농도의 감소에 의해 3회 패닝 라운드에 걸친 엄격성의 증가가 달성되었다. 또한, 이전 패닝 라운드의 출력에 따라 패닝 동안 항원 농도의 후속 조정으로 인해 적합한 패닝 출력 및 고친화성 결합제의 농축이 보장되었다. 요약하면, 표 7에 열거된 클론이 확인되었다.
[표 7]
Figure pct00059
스크리닝 및 특성화
ELISA
ELISA 기술은 표적 항원에 대한 패닝 출력으로부터 확인된 단일 Fab 클론의 스크리닝과 정제된 항체의 특성화 모두에 사용되었다.
항원 직접 코팅
항원을 마이크로타이터 플레이트 상에 고정시켰다(표 8 참조). 플레이트를 차단하고, 미정제 이.콜라이 용해물을 함유하는 Fab 또는 정제된 Fab 또는 IgG 샘플과 같은 항체와 함께 인큐베이션하였다. 결합된 항체는 ‘AttoPhos' 형광 기질과 조합된 각각의 알칼리-포스파타제(AP) 결합 2차 항체를 사용하여 검출되었다. 개별 분석 단계들 사이에 여러 세척 단계를 수행하였다.
[표 8]
Figure pct00060
항원 포획 ELISA
다른 ELISA 설정에서, 마이크로타이터 플레이트 상에 코팅된 태그-특이적 항체(예를 들어 항-Fc)를 통해 항원(cyTREM2-ECD (19-174)-hFc, 1.0 μg/ml)을 플레이트 상에 포획하였다. 결합된 항체는 ‘AttoPhos' 형광 기질과 조합된 각각의 알칼리-포스파타제(AP) 결합 2차 항체를 사용하여 검출되었다. 개별 분석 단계들 사이에 여러 세척 단계를 수행하였다.
Fab-발현 체크
미정제 박테리아 용해물에서 Fab 발현을 확인하기 위해, 플레이트를 Fd-단편 특이적 항체로 코팅하였다. 결합된 Fab는 ‘AttoPhos' 형광 기질과 조합된 각각의 알칼리-포스파타제(AP) 결합 항-Fab 특이적 항체를 사용하여 검출되었다. 개별 분석 단계들 사이에 여러 세척 단계를 수행하였다.
IntelliCyt에 의한 멀티플렉싱
종 교차-반응성 및/또는 반대 표적에 대한 원치 않는 결합을 동시에 평가하기 위해, HTFC/iQue 스크리닝 플랫폼(IntelliCyt)을 사용하여 384-웰 플레이트 형식의 스크리닝을 수행하였다.
재조합 단백질 커버된 비드에 대한 스크리닝
다양한 양의 고유 형광을 가진 비드를 항원에 결합하고, 단일 현탁액으로 물리적으로 조합시키고, 테스트할 항체와 함께 인큐베이션하였다. 코팅된 각 비드의 형광을 통해 개별 항원을 확인하였다. SPHERO 스트렙타비딘 형광 입자들을 비오티닐화된 항원들과 조합하여 사용하였으며, 도구 항체를 사용하여 사전실험에서 최적의 코팅 밀도를 시험하였다. 미정제 박테리아 세포 용해물을 항원 코팅된(표 9 참조) 및 차단된 비드와 조합시키고, 암실에서 실온에서 1시간 동안 조심스럽게 진탕하면서 인큐베이션하였다. 형광 표지된 2차 항체와 함께 후속 배양한 후, IntelliCyt HTFC/iQue 장치로 측정을 수행하였다. 인큐베이션 단계 사이에는 세척이 필요하지 않았다. 원시 데이터는 ‘ForeCyt' 소프트웨어를 사용하여 평가하였다.
[표 9]
Figure pct00061
재조합 단백질 커버된 비드에 대한 EC 50 결정
동시에 다중 항원을 포함하여 정제된 항체의 EC50 값을 평가하기 위해 비드 기반 분석을 사용하였다. 이에 따라, 다양한 양의 고유 형광을 가진 비드를 항원에 결합하고, 단일 현탁액으로 물리적으로 조합시키고, 테스트할 다양한 항체 농도로 인큐베이션하였다. 코팅된 각 비드의 형광을 통해 개별 항원을 확인하였다. SPHERO 스트렙타비딘 형광 입자들을 비오티닐화된 항원들과 조합하여 사용하였으며(표 10 참조), 도구 항체를 사용하여 사전실험에서 최적의 코팅 밀도를 시험하였다. 항체 및 검출 항체와 함께 인큐베이션한 후 세척 단계를 수행하였다.
[표 10]
Figure pct00062
FACS
유세포 분석을 사용하여, EC50 값의 평가를 위해 상이한 농도의 정제된 항체뿐만 아니라 패닝 출력으로부터의 미정제 이.콜라이 용해물을 사용하여 세포 표면 발현된 항원에 대한 결합 이벤트를 확인하였다. FACS 분석에 사용되는 세포주는 표 11에 열거되어 있다.
[표 11]
Figure pct00063
설정에 따라 세포는 항체와 함께 배양하기 전에 24시간 동안 DPC333으로 전처리하였다. 모든 단계는 수용체 내재화를 방지하기 위해 FCS 및 아지드를 포함하는 FACS 완충액에서 수행하였다. 세포 현탁액을 마이크로타이터 플레이트로 옮기고, 항체 샘플을 첨가한 후, 플레이트를 4℃에서 1시간 동안 조심스럽게 진탕하면서 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 세포를 스핀다운시키고, FACS 완충액으로 세척하였다. 결합된 항체의 검출을 위해 형광단-콘쥬게이션된 2차 시약을 사용하였다. Intellicyt HTFC/iQue 시스템을 사용하여 플레이트를 측정하고, 적당한 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석하였다.
세포 상의 스크리닝
또한 다중 표적 세포주에 대한 결합의 평가 또는 원치 않는/비특이적 결합의 평가를 위해 HTFC/iQue 스크리닝 시스템을 동시에 사용하였다. Calcein 또는 Cell-Tracker Green과 같은 뚜렷한 양의 형광 염료로 사전 라벨링하여 서로 다른 세포 집단을 구별하여, 각 세포 집단의 형광 강도의 고유한 시그니처 = 형광 바코드를 설정했다. 그 다음, 색상-코드된 세포주를 물리적으로 결합하고, 시험할 미정제 박테리아 용해물을 함유하는 Fab와 함께 혼합하였다. 사전 라벨링된 각 세포주의 형광을 통해 개별 세포주를 확인하였다. 미정제 박테리아 세포 용해물을 세포들(CHO-hDAP12-hTREM2 및 CHO-DAP12)과 조합시키고, 암실에서 4℃에서 조심스럽게 진탕하면서 1시간 동안 인큐베이션하였다. IntelliCyt HTFC/iQue 장치를 사용하여 형광 측정을 수행하였다. 인큐베이션 단계 사이에는 세척이 필요하지 않았다. 원시 데이터는 ‘ForeCyt' 소프트웨어를 사용하여 평가하였다. 데이터 수집 후, 각 샘플로부터의 세포주를 그의 형광 시그니처에 따라 식별하고, 항체 결합에 대해 개별적으로 평가하였다. 결과는 CHO-hDAP12-hTREM2 및 CHO-hDAP12-mTREM2 세포 상에서 IgG의 적정에 표시되어, EC50 값을 결정하는데 사용되었다.
에피토프 비닝
옥텟(Octet)을 통한 시간-분해된 에피토프 비닝
Octet (QK384 또는 HTX) 기기에서 시간-분해 에피토프 비닝을 수행하여 IgG 샘플을 동일하거나 상당히 중첩되는 에피토프 그룹, 즉 서로의 결합을 억제할 수 있는 항체로 분류했다. SPR(Biacore)을 통한 라벨없는 동역학에 의한 KD 결정에 대해 설명된대로 적용된 KD 결정과 동일한 샘플 전제 조건. 부모 가족당 한 명의 대표 후보가 선정되었다.
항체 샘플은 전체 요인 분석 설계에서 쌍으로 테스트되었는데, 예를 들어 2개의 항체 샘플 A 및 B의 경우 하기 쌍 결합 이벤트가 필요했다: A-A, A-B, B-A, B-B. "샌드위치" 분석 설정에서 에피토프 비닝을 위해, 옥텟(Octet) 센서 팁은 샘플 세트에 존재하는 모든 다른 항체 샘플로 변형되었다. 중간 내지 높은 고정화 수준이 적용되었다. 서로 다른 항체를 포함하는 센서에 단량체 항원을 로드한 다음, 항체 샘플 중 하나를 사용하여 포획된 항원에 대한 결합을 확인하였다. 두 번째 항체가 다른 에피토프를 인식하는 경우에만 추가 결합이 발생할 것으로 예상되었다.
평가를 위해, 항원 로딩 및 2차 항체 결합 종료시 신호를 모니터링하고, 충분한 항원 로딩 및 항원의 가능한 해리 측면에서 곡선을 검사하였다. 대조군, 즉 동일한 항체(A-A, B-B)의 이중 결합 단계의 경우; 2차 항체에 대한 추가 결합은 예상되지 않았다. 모든 다른 항체 샘플 쌍의 이중 결합 이벤트를 일관성에 대해 비교하였으며, 예를 들어 샘플 순서 A-B(다른 에피토프)에서 B의 추가 결합이 관찰되면, 샘플 순서 B-A도 A의 추가 결합을 초래할 것으로 예상되었다. 이러한 불일치를 생성하는 가능한 원인은 예를 들어, 부분적으로 중첩하는 에피토프, 또는 항원의 불충분한 로딩이었다. 결과를 표 12에 나타내었다.
[표 12]
Figure pct00064
내재화 분석
항체-수용체 복합체의 내재화를 분석하기 위해, 인간 Fc-특이적 pHrodo-표지 Fab("MorpHin")를 사용하였다. MorpHin은 분석된 항체에 결합하고, 표적 인식 및 내재화 후 산성 환경(리소좀 구획)에서 상승하는 적색 형광 신호(방출 최대값: 566~590 nm)를 통해 항체 복합체를 검출할 수 있다.
CHO-hDAP12-hTREM2 세포를 96-웰 플레이트에 시딩하고(50 μl/웰, 4.0E+05 세포/ml), 37℃ 및 5% CO2에서 하룻밤동안 부착시켰다. 다음날, 플레이트를 얼음 위에서 30~60분 동안 냉각시켰다. IgG(배양 배지에서 40 nM)을 200 nM pHrodo 표지된 Fab MorpHin(각각 70 μl)과 37℃에서 30분 동안 사전-인큐베이션하고, 이후에 얼음 위에서 15분 간 냉각시킨 후, 50 μl의 각 혼합물을 세포에 첨가하고, 37℃ 및 5% CO2에서 6시간 동안 인큐베이션하였다. DPBS(100 μl/웰)로 세포를 2회 세척한 후, 아큐타제(Accutase)를 사용하여 세포를 분리하였다(50 μl/웰, 20~30분, 37℃, 5% CO2). 150 μl 세척 완충액(DPBS+/ 3% FBS/ 0.02% NaN3)을 첨가한 후, 세포를 원심분리하고, 100 μl 세척 완충액에 재현탁시켰다. FACS 어레이 장치(96-웰, 532 nm, 황색/ PE-채널)를 사용하여 형광을 측정하고, FlowJo 소프트웨어를 사용하여 결과를 분석하였다. MOR03207은 음성 대조군으로서 사용되었다. 결과를 표 13에 나타내었다.
[표 13]
Figure pct00065
안정화 분석 - CHO-hDAP12-hTREM2에 대한 PMA-유도된 부분절단
PMA-유도된 부분절단에 대해 세포 표면에서 TREM2 수용체를 안정화시키는 개발된 IgG의 능력을 조사하기 위해, CHO-hDAP12-hTREM2 세포를 FACS 기반 안정화 분석에 사용하였다. PMA의 불활성화를 피하기 위해, 항체와 대조군을 아지드-없는 분석 완충액(최종 농도 200 nM 및 20 nM)에 희석하고, 사전 냉각된 세포(웰당 5.0x104개의 세포, 아지드-없는 분석 완충액에 희석됨)와 함께 300 rpm에서 진탕하면서, 30℃에서 45분 동안 인큐베이션하였다. 부분절단효소 자극제 PMA를 50 ng/ml의 최종 농도로 첨가하고, 300 rpm에서 진탕하면서, 4℃에서 30분 동안 세포-항체-혼합물과 함께 인큐베이션하였다. 세척 후, 4℃에서 1시간 동안 형광 표지된 검출 항체(염소 항-인간 IgG-Alexa 647; 마우스 항-염소 IgG-Alexa 647)와 함께 인큐베이션하여, 결합된 IgG를 검출하였다. iQUE 장치에서 ForeCyt 소프트웨어를 사용하여 형광을 측정하였다(384-웰, ~37 μL, 한 모금 시간 1초).
안정화 분석 - CHO-hDAP12-hTREM2에 대한 구성적 부분절단
세포 표면에서 TREM2 수용체를 안정화시키는 개발된 IgG의 능력을 조사하기 위해, CHO-hDAP12-hTREM2 세포뿐만 아니라 모 세포주 CHO-hDAP12를 FACS 기반 안정화 분석에 사용하였다. 웰당 3.0x104개의 세포를 96-웰 세포 배양 플레이트로 옮기고, 37℃ 및 5% CO2에서 약 5~6시간 동안 부착시켰다. IgG 및 대조군 항체(MOR03207, 다중클론 염소 항-hTREM2 항체(R&D Systems; Af1828))를 배양 배지에 희석시키고, 100 nM 및 10 nM의 최종 농도로 세포에 첨가하였다. 부분절단효소 억제제 DPC 333을 양성 대조군으로 사용하였다(배양 배지내 5 μM). 세포 배양 플레이트를 37℃ 및 5% CO2에서 o/n 인큐베이션하였다.
다음날, 상청액을 제거하고, 37℃ 및 5% CO2에서 약 20~30분 동안 웰당 50 μL 아큐타제를 사용하여 부착 세포를 분리하였다. 세척 후, 4℃에서 1시간 동안 형광 표지된 검출 항체(염소 항-인간 IgG-Alexa 647; 마우스 항-염소 IgG-Alexa 647)와 함께 인큐베이션하여, 결합된 IgG를 검출하였다. iQUE 장치상에서 ForeCyt 소프트웨어를 사용하여 형광을 측정하였다(384-웰, ~37 μL, 한 모금 시간 2초).
리드 후보
57개의 성숙된 IgG의 심층 특성화시, 23개의 클론을 리드 후보로 선택하였다. 23개의 선택된 후보에 대한 개요가 표 14에 개시되어 있다.
[표 14]
Figure pct00066
실시예 2: 항-TREM2 항체에 의한 세포 표면 TREM2의 안정화
재료 및 방법
용액 평형 적정(SET)
용액에서의 친화도 측정은 기본적으로 문헌에 기재된 대로 수행하였다(문헌[Friguet, B et al. J Immunol Methods, 1985. 77(2):p.305-319]). SET 방법의 민감도와 정확도를 향상시키기 위해 기존 ELISA에서 ECL-기반 기술로 이전했다(문헌[Haenel, C et al. Anal Biochem, 2005. 339(1):p.182-184]).
1 mg/mL 염소-항-인간 Fab 단편 특이적 항체(Bethyl)를 제조업체의 지침에 따라 MSD Sulfo TAGTM NHS-에스테르(Meso Scale Discovery │ Gaithersburg │ MD │ USA)로 표지하였다.
분석 완충액으로서 0.5% BSA 및 0.02% Tween20을 함유하는 PBS(GIBCO 14190 │ pH 7.0~7.2)와 폴리프로필렌 마이크로타이터 플레이트에서 실험을 수행하였다. 비표지 항원의 연속 희석액은 예상되는 KD보다 적어도 10배 더 높은 농도로 시작하여 준비되었다. 항원이 없는 웰을 사용하여 Bmax 값을 결정하고; 분석 완충액만을 함유하는 웰을 사용하여 배경을 결정했다. 적당한 양의 결합제(예상 KD와 유사하거나 그 이하의 항체 농도, 최종 부피 60 μL)를 첨가한 후, 혼합물을 실온에서 하룻밤동안 배양하였다.
MSD 플레이트를 PBS 중의 3% BSA로 차단하고, 스트렙타비딘 플레이트(웰 당 30 μL) 상에서 비오티닐화된 항원(hTREM2 ECD (19-174)-hFc-bio)으로 코딩하였다. 0.05% Tween 20이 있는 PBS로 플레이트를 세척한 후, 평형화된 샘플을 플레이트로 옮기고, 20분 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, MSD-Sulfo-태그 표지된 검출 항체(항-인간 Fab │ 최종 희석, 일반적으로 1:2,000)의 웰 당 30 μL를 세척된 MSD 플레이트에 첨가하고, 에펜도르프(Eppendorf) 셰이커(700 rpm) 상에서 실온에서 60분 동안 인큐베이션하였다.
MSD 플레이트를 세척하고 계면 활성제와 함께 30 μL/웰 MSD 판독 완충액 T를 첨가한 후, Sector Imager 6000(Meso Scale Discovery, Gaithersburg, MD, USA)을 사용하여 전기화학발광 신호를 검출하였다.
데이터는 맞춤형 피팅 모델을 적용한 XLfit(IDBS) 소프트웨어로 평가하였다. Fab 분자의 KD 결정을 위해, 문헌[Haenel, 2005]에 따른 적합 모델을 사용하였다(문헌[Haenel, C et al. Anal Biochem, 2005. 339(1):p.182-184]). IgG 분자 및 단량체 항원의 KD 결정을 위해, IgG에 대한 적합 모델을 사용하였으며, 문헌[Piehler, J et al. J Immunol Methods, 1997. 201:P.189-206)]에 따라 변형시켰다. 방정식에 대해서는 또한, 문헌[Della Ducata, D et al. J Biomol Screening, 2015. 20(10):p. 1256-1267]을 참고한다. SET 스크리닝(문헌[Della Ducata, D et al. J Biomol Screening, 2015. 20(10):p. 1256-1267])은 원칙적으로 위에서 설명한대로 수행되었다. 솔루션 평형 적정(Solution Equilibrium Titration)에 의해 성숙된 결합제의 순위를 매기기 위해, Haenel 및 동료들의 문헌에 기재된 원칙을 기반으로 모델을 적용하였다(문헌[Haenel, C et al. Anal Biochem, 2005. 339(1):p.182-184]). 일정량의 희석된 BEL 추출물(붕산염 완충액, EDTA 및 리소자임 함유)을 다양한 농도의 항원으로 밤새 평형화하였다.
그 다음, 혼합물을 항원으로 미리 코팅한 MSD 플레이트로 옮기고, 인큐베이션 및 세척 후 적합한 MSD-설포-태그 표지 검출 항체를 첨가하였다.
이어서, Sector Imager 6000(Meso Scale Discovery │ Gaithersburg │ MD │ USA)을 사용하여 ECL 검출을 통해 결합되지 않은 Fab의 농도를 정량화하였다.
결과는 XLfit(IDBS) 소프트웨어를 사용하여 처리하였으며, 상기 기술된 바와 같이 상응하는 적합 모델을 적용하여 친화도를 추정하고 따라서 성숙에 의해 가장 개선된 클론을 확인하였다.
SPR(Biacore)을 통한 무표지 동역학(Label-free Kinetics)에 의한 K D 의 결정
KD 측정을 위해, 항체 단백질(IgG)의 단량체 분획을 사용하였다(분석 SEC에 의해 분석된 바와 같이 최소 90% 단량체 함량).
운동 속도 상수를 결정하여 친화도를 결정하는 방법은 하기와 같이 SPR(Biacore T200) 기기에 의해 수행하였다.
항체 포획 설정을 통한 K D 결정
예를 들어, EDC/NHS 화학을 사용하여 적당한 포획 리간드를 CM5 칩(Biacore, GE Healthcare) 상에 공유 고정시켜 적당한 고용량 포획 표면을 제조하였다. 적당한 포획 시스템의 예로는 항-hu-Fc 항체(Biacore │ GE Healthcare), 또는 MabSelect SuRe 리간드(GE Healthcare)가 있었다.
Fab 단편의 KD 결정을 위해, hTREM2 ECD (19-174)-hFc를 리간드로서 포획하고, Fab 단편을 용액내 분석물로서 사용하였다. IgG 샘플의 KD 결정을 위해, IgG를 리간드로서 포획하고, 단량체 TREM2 단백질을 용액내 분석물로서 사용하였다(예를 들어 hTREM2 ECD (19-174)-His, mTREM2 ECD (19-168)-His, 또는 cyTREM2 ECD (19-174)-APP-Avi).
6 내지 8개의 상이한 분석물 농도(예를 들어 2-배 연속 희석)를 동역학 실험동안 사용하였다. 각 사이클 후, 포획 표면의 무결성을 유지하면서 센서 표면을 재생하여 포획된 항체/항원 복합체를 제거하였다. 참조를 위해 실행 완충액의 빈 주입이 사용되었다.
데이터 평가
센서그램은 해당 기기의 평가 소프트웨어, 즉 각각 Biacore T200 평가 소프트웨어 2.x 또는 3.x로 평가하였다(Biacore, GE Healthcare). 모든 센서그램은 KD를 계산하는 데 사용된 kon 및 koff 속도 상수를 결정하기 위해 1:1 결합 모델에 핏팅되었다.
단백질 패널 프로파일링(3P)
단백질 패널 프로파일링(Frese, K. et al. mAbs, 2013. 5(2):P.279-287)을 위해, 4℃에서 하룻밤동안 32개의 서로 다른 단백질들 및 대조군을 1.0 μg/mL의 농도로 2개의 384-웰 MSD 표준 플레이트 상에 코팅하였다.
코팅 용액을 버리고, 마이크로타이터 플레이트 셰이커(~500 rpm)에서 실온에서 1시간 동안 플레이트를 PBS 중의 50 μL 3% (w/v) BSA로 차단한 후, 50 μL 세척 완충액(0.05% (v/v) Tween 20을 갖는 PBS)으로 3회 세척 단계를 수행하였다.
항체 샘플(Fab 단편 또는 IgG)을 분석 완충액(0.5% (w/v) BSA, 0.05% (v/v) Tween 20을 갖는 PBS)에서 100 nM 및 10 nM로 희석하였다. 대조군으로서, MOR 참조 mAb 항-리소자임 MOR03207 Fab 또는 IgG(샘플 포맷에 따라 다름) 및 분석 완충액을 사용하였다. 샘플 및 대조군을 웰당 30 μL 첨가하고, 마이크로타이터 플레이트 셰이커에서 실온에서 3시간 동안 인큐베이션하였다.
플레이트를 3회 세척하고, 웰당 30 μL 검출 항체(ECL-표지된 항-인간 Fab)를 첨가하고, 마이크로타이터 플레이트 셰이커(~500 rpm)에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. MSD 플레이트를 세척하고 계면 활성제와 함께 35 μL/웰 MSD 판독 완충액 T를 첨가한 후, Sector Imager 6000(Meso Scale Discovery, Gaithersburg, MD, USA)을 사용하여 전기화학발광 신호를 검출하였다.
평가를 위해, 특정 단백질에 대한 항체 샘플의 신호를 참조 mAb MOR03207의 각 신호로 나누어, 결합 비율(BR)을 산출하였다. 그후 대조군(총 25개)을 제외한 모든 단백질들의 누적 결합 비율(CBR)을 계산하였다.
인간 원형질막 단백질 세포 어레이를 사용한 결합 프로파일 평가
배경 스크린
인간 HEK293 세포를 유리 슬라이드 상에서 성장시키고, 고정시켰다. 시험 항체를 2 μg/ml으로 첨가하였다. 이후, 슬라이드를 AlexaFluor647 표지된 항-인간 IgG Fc 검출 항체와 함께 인큐베이션한 다음, 형광 이미징을 수행하였다. 이러한 검출 항체는 인간 IgG 및 인간 Fc 융합 단백질을 검출하기 위한 Retrogenix 시스템에 사용하기 위해 이전에 검증되었었다.
1차 선별
각각 ZsGreen1 및 전장 인간 원형질막 단백질을 코딩하는 4955개의 비스시스트론 발현 벡터를 슬라이드에 중복하여 스팟팅하고, 인간 HEK293 세포를 역-형질감염시켰다(항체 당 14개의 슬라이드 세트). 선별된 4955개의 인간 원형질막 단백질 중 3500개 이상이 고유한 유전자이다.
세포 고정 후 각 슬라이드에 시험 항체를 첨가하고, 1차 선별에서 사용한 것과 동일한 형광 2차 항체를 사용하여 결합을 검출하였다. ZsGreen1형광 신호를 사용하여 적당한 형질감염을 확인하고, 형질감염된 세포의 지점(spot)을 국소화하였다. 단백질 ‘히트(hit)'는 배경 수준(Alexa 647 채널)과 비교하여 상승된 신호를 보여주는 중복 지점으로 정의된다. 이것은 ImageQuant 소프트웨어에 격자로 표시된 이미지를 사용하여 육안 검사를 통해 이루어진다. 히트는 중복 지점의 강도에 따라 '강함, 중간, 약함 또는 매우 약함'으로 분류되었다.
세포주
hTREM2 및 hDAP12 단백질 발현 CHO 세포주를 표준 세포 배양 절차에 따라 생산하였다. 인간 hDAP12 및 hTREM2를 위한 cDNA를 함유하는 진핵 발현 벡터로 CHO 세포를 순차적으로 형질감염시켰다. 10% 소 태아 혈청, 0.2 mg/ml G418 및 0.2 mg/mL 하이그로마이신이 보충된 DMEM/F12 배지내에서 상기 생성된 CHO-hTREM2/hDAP12 이중 형질감염된 세포(CHO-hTREM2)를 성장시켰다. 융합성 CHO 세포를 세포 해리 완충액(Gibco 13151-014)에 의해 수확하고, 세포 표면 TREM2를 하기 기재된 바와 같이 유세포 분석법으로 정량화하였다. 유사하게, hDAP12 및 마우스TREM2 또는 hDAP12 및 사이노몰구스 TREM2를 재조합적으로 발현하는 CHO 클론 세포주가 생성되었다.
표준 클로닝 절차를 사용하여 키메라 인간 TREM2-인간 TREM1 작제물이 생성되었다. TREM2-IGSF-TREM1 스톡 작제물은 TREM2의 IGSF 도메인, TREM1의 스톡 영역에 이어, TREM2의 TM 및 세포 내 도메인을 포함하였다. TREM1-IGSF-TREM2 스톡 작제물은 TREM1의 IGSF 도메인, TREM2의 스톡 영역에 이어, TREM2의 TM 및 세포 내 도메인을 포함하였다. TREM2의 경우 uniprot Q9NZC2를, 그리고 TREM1의 경우 Q9NP99를 사용하여, 도메인-경계가 결정되었다. 각 작제물로부터 키메라 작제물 및 hDAP12를 안정적으로 발현하는 안정적인 클론 세포주가 생성되었다. 세포 해리 완충액(Gibco 13151-014)을 사용하여 융합 부착성 CHO 세포 클론을 수확하고, 세포 표면 발현된 키메라 hTREM2스톡-hTREM1-IGSF 또는 TREM1-IGSF-TREM2 스톡을 하기 기재된 바와 같이 유세포 분석법으로 정량화하였다.
TREM2-세포 외 도메인과 DAP12로 구성된 키메라 수용체를 안정적으로 발현하는 HEK 세포주는 문헌[Kleinberger et al. 2014]에 먼저 기재되어 있었다(문헌[Kleinberger, G et al. Sci Transl Med, 2014. 6(243):p.243ra86]). 유사하게 인간 TREM2/DAP12 키메라 수용체 발현 세포주는 표준 세포 배양 절차에 따라 Novartis 과학자들에 의해 생산되었다.
THP1 세포는 내인성으로 TREM2 및 DAP12를 발현하는 인간 단핵구 세포이다. 이들 세포는 NFAT 프로모터에 의해 구동되는 루시퍼라제 유전자로 표준 세포 배양 절차에 따라 형질감염되었다. 제한된 희석 후에 PMA/이오노마이신(ionomycine)으로 클론들을 자극하고, 리포터 유전자 활성(RGA)이 10배 초과 증가한 하나의 클론(THP1-B5)을 선택하였다.
대식세포 생성
제조사 프로토콜에 따라 easySep™ 인간 단핵구 분리 키트(Stemcell technologies)를 사용하여, 음성 선택에 의해 완전히 익명화된 버피-코트로부터 인간 단핵구를 분리하였다. 단핵구는 MCSF 40 ng/mL(R&D systems, 216-MC-025) 및 50ng/mL IL4(R&D systems, 204-IL-050) 분화-배지와 함께 RPMI내 hM2A(10% 소 태아 혈청, 글루타맥스(1x, Gibco, 61870-044), 피루브산 나트륨(Gibco, 11360-070), 비필수 아미노산, HEPES가 보충됨)로 5~6일에 걸쳐 분화되었다. M2A 대식세포를 세포 해리 완충액(Gibco 13151-014)에 의해 수확하고, 세포 표면 TREM2를 하기 기재된 바와 같이 유세포 분석법으로 정량화하였다. 대부분의 실험에서 항체는 서로 다른 두 공여자의 버피 코트에 대해 동시에 평가되었다.
FACS
hM2A, CHO-hTREM2 또는 CHO-사이노TREM2 상의 항체의 세포 EC50을 결정하기 위해, 세포를 5 μM DPC333으로 처리하였다(ADAM10 및 17 억제제; 문헌[Qian, M et al. Drug Metab Dispos, 2007. 35:p.1916-1925]). 대식세포를 아큐타제(Biolegend, 423201)로 단리시킨 후, 50 μg/ml Fc 블록(BD, 564220)이 보충된 FACS 완충액(PBS, 2% FBS, 0.5 mM EDTA, pH 8.0)내에 현탁시키고, 얼음 위에서 적어도 20분간 인큐베이션하였다. 다음 세포는 넓은 농도 범위의 다른 항-TREM2 항체를 사용하여 동일한 완충액에서 4℃에서 1시간 동안 염색한 후, PBS(250 g, 4℃, 3분)로의 세척 단계에 들어갔다. 다음으로, 세포를 4℃에서 30분 동안, 405 nm 여기(Molecular Probes, L34966)를 위해, AlexaFluor® 647 AffiniPure F(ab')₂단편 염소 항-인간 IgG, F(ab')₂단편(Jackson Immuno Research, 109-606-097) 및 LIVE/DEAD® Fixable Aqua 사멸 세포 염색 키트와 함께 FACS/Fc 블록 완충액에서 인큐베이션하였다. PBS(250 g, 4℃, 3분)로 2번째 세척 단계후, 세포를 실온에서 15분 동안 고정 완충액(Biolegend, 420801)으로 고정하고, 다시 세척하고, BD FACS Canto II(BD, V96300323) 또는 FacsCalibur 유세포 분석기를 사용하여 형광을 평가하였다. 세포에 결합된 TREM2 항체의 정도에 해당하는 중앙 형광 강도는 FlowJo 소프트웨어(Millipore INC)를 사용하여 평가하였다.
안정화 분석 - CHO-hDAP12-hTREM2에 대한 구성적 부분절단
안정화시키는 개발된 IgG의 능력을 조사하기 위해, CHO-hDAP12-hTREM2 세포뿐만 아니라 모 세포주 CHO-hDAP12의 세포 표면에서 TREM2 수용체를 FACS 기반 안정화 분석에 사용하였다. 웰당 3.0x10^4개의 세포를 96-웰 세포 배양 플레이트의 웰로 옮기고, 37℃에서 세포 배양 인큐베이터에서 약 5~6시간 동안 부착시켰다. IgG 이소타입 대조군 및 대조군 항체(MOR03207, 다중클론 염소 항-hTREM2 항체(R&D Systems; Af1828))를 배양 배지에 희석시키고, 도면에 도시된 최종 농도로 세포에 첨가하였다. 부분절단효소 억제제 DPC333을 양성 대조군으로 사용하였다(배양 배지내 5 μM). 세포 배양 플레이트를 37℃에서 세포 배양 인큐베이터에서 o/n 인큐베이션하였다.
다음날, 상청액을 제거하고, 37℃ 및 5% CO2에서 약 20~30분 동안 웰당 50 μL 아큐타제를 사용하여 부착 세포를 분리하였다. 세척 후, 4℃에서 1시간 동안 형광 표지된 검출 항체(염소 항-인간 IgG-Alexa 647; 마우스 항-염소 IgG-Alexa 647)와 함께 인큐베이션하여, 결합된 IgG를 검출하였다. iQUE 장치에서 ForeCyt 소프트웨어를 사용하여 형광을 측정하였다(384-웰, ~37 μL, 한 모금 시간 2초). 대안적으로 안정화 항체와 독립적인 TREM2의 직접 검출은 비-가교차단 MOR041895 Fab 단편을 사용하여 달성되었다.
항-TREM2 항체에 의한 hM2A에서 발현된 TREM2의 안정화
M2A 분화된 대식세포를 아큐타제(Biolegend, 423201)로 단리시킨 후, PBS로 1회 세척하고, 그후 50 μg/ml Fc 블록(Fab 단편 항-Fc 수용체, Novartis에 의해 제조됨)이 보충된 FACS 완충액(PBS, 2% FBS, 0.5 mM EDTA, pH 8.0)내에 재현탁시키고, 실온에서 적어도 20분간 인큐베이션하였다. 다음으로, 항-TREM2 항체를 세포(도면에 표시된 농도)에 첨가한 후 37℃의 세포 배양 인큐베이터에서 24시간 인큐베이션했다. 다음 날, 세포를 FACS 분석에 적용하였다. 안정화에 사용된 항-TREM2 항체를 직접 염색하거나 안정화에 사용되는 항체와 관련하여 TREM2에서 다른 비-중첩 에피토프를 인식하는 항-TREM2 Fab-His 단편(MOR041895)으로 염색하여 FACS 염색을 수행하였다. M2A 대식세포를 PBS/1mM EDTA로 2회 세척하여 과잉 혈청을 제거하고, FACS 완충액으로 1회 세척한 다음, 50 μg/ml Fc 블록(BD, 564220)을 첨가하였다. 안정화에 사용되었던 결합된 항-TREM2 항체를 검출하기 위해, AlexaFluor® 647 AffiniPure F(ab')₂단편 염소 항-인간 IgG, F(ab')₂(Jackson Immuno Research, 109-606-097) 및 LIVE/DEAD® Fixable Aqua Dead Cell Stain(Molecular Probes, L34966)을 얼음 위에서 30분 간 첨가하였다. TREM2를 직접 염색하기 위해, 다른 샘플을 His 표지된 Fab 단편 MOR041895(100 nM)로 얼음 위에서 10분 간 처리한 다음, 항-His PE(Miltenyi, 130-092-691) 및 LIVE/DEAD® Fixable Aqua Dead Cell Stain(Molecular Probes, L34966)을 첨가하였다. 얼음 위에서 30분 후에 세포를 FACS 완충액으로 1회 세척한 다음, 실온에서 15분 동안 고정 완충액(Biolegend, 420801)으로 고정하고, 다시 세척하고, BD FACS Canto II(BD, V96300323) 또는 FacsCalibur 유세포 분석기를 사용하여 형광을 평가하였다. 세포에 결합된 Fab 단편의 TREM2 항체의 정도에 해당하는 중앙 형광 강도는 FlowJo 소프트웨어(Millipore INC)를 사용하여 평가하였다.
식세포작용 분석(FACS)
M2A 분화된 대식세포를 아큐타제(Biolegend, 423201)로 분리시키고, 조직 배양 플레이트에 Fc 블록(20 μ/ml)이 보충된 분화-배지에 시딩하였다. 37℃의 가습 세포 배양 인큐베이터에서 2.5시간 후, 항체를 도면에 표시된 농도로 대식세포에 첨가하고, 37℃의 가습 세포 배양 인큐베이터에서 추가로 18시간 동안 인큐베이션하였다. 세포 배양 배지를 제거하고, 대식세포를 PBS로 2회 세척하고, 분화 배지에 재현탁하였다. 다음으로, pHrodo Red 스타필로코쿠스 아우레우스(S. aureus) 바이오입자(Conjugate for Phagocytosis, Molecular Probes, A10010)가 보충된 동일한 부피의 분화 배지를 첨가하고, 용액을 원심분리하여(1분, 500 g), 식세포작용을 동기화한 다음, 37℃의 가습 세포 배양 인큐베이터에서 2.5시간 인큐베이션하였다. 세포를 PBS로 2회 세척하고, 아큐타제로 분리시키고, FACS 완충액으로 얼음 위에서 다시 세척하고, FACS 완충액에서 얼음 위에서 재현탁시킨 다음, FACS Canto II (BD)에서 FACS 분석을 수행하였다. 세포가 흡수한 식균 작용 정도에 해당하는 중앙 형광 강도는 FlowJo 소프트웨어(Millipore INC)를 사용하여 평가하였다. 실험에는 항상 동일한 Fc 침묵 돌연변이를 가진 이소타입 대조군(MOR03207) 항체가 포함되었다. 이 항체는 hM2A 대식세포의 에피토프를 인식하지 못한다.
식세포작용 분석( Incucyte )
인간 M2A 분화된 대식세포 또는 인간 iPS 유래 미세아교세포를 아큐타제 StemPro(Gibco #A11105-01, Lot#1648949)로 분리하고, M2a 대식세포 완전 배지에 현탁시켰다. 세포 배양 배지를 제거하고, 세포를 RPMI + 0.5%FCS에 재현탁시켰다. 50 μL의 준비된 세포 현탁액을 96 웰 블랙 클리어 플레이트, 폴리-D-라이신, BD 플레이트(7500 (M2A) - 10000 (iPS 유래 미세아교세포) 세포/웰)의 각 삽입물에 플레이팅하고, 37℃에서 3시간 동안 부착되도록 하였다. pHrodo 표지된 바이오입자(Either: pHrodoGreen 스타필로코쿠스 아우레우스(S. aureus) 바이오입자 - Essen Bioscience #4620 또는 pHrodoGreen 표지된 세포사멸 SH-SY5Y 세포들(1.2 x 10^5 세포/웰))를 첨가하고, 분석이 끝날 때까지 플레이트를 37℃/5% CO2에서 세포 인큐베이터내에 보관된 IncuCyte ZOOM 플랫폼으로 옮겼다. 3개의 기술 복제물에서 웰당 2개의 이미지를 10X 대물 렌즈를 사용하여 30분마다 20시간 동안 촬영한 다음, IncuCyteTM Basic 소프트웨어를 사용하여 분석하였다.
화학주성 분석(Incucyte)
M2A 분화된 대식세포, 또는 인간 iPS 유래 미세아교세포를 트랜스웰 플레이트(Essen Bioscience) 사전코팅된 Matrigel(GFR -Corning #354230 Lot: 631008)에서 5000(M2A 대식세포) 또는 7500(iPS 유래 미세아교세포) 세포/웰에서 완전 배지에 플레이팅하였다. 항체 처리를 통한 이동 분석의 경우, 각 항-TREM2 항체는 100 nM에서, 또는 상응하는 이소타입 대조군은 100 nM에서 미세아교세포를 보충하였다. 20 ng/ml 재조합 C5a 또는 100 ng/ml 재조합 C5a를 갖는 200 μl의 완전 배지를 함유하는 저장소 플레이트에 트랜스웰을 넣었다. 트랜스웰 이동을 모니터링하고, Incucyte S3® 소프트웨어(Essen Bioscience)를 사용하여 분석하였다.
리포터 유전자 분석
RGA 활성을 자극하기 위해 전장 항체를 10 μg/ml의 농도로 고-단백질-결합 세포 배양 플레이트(Greiner # 781094)에 8~16시간 동안 코팅하였다. 플레이트를 세척한 후, 전체 배양 배지에서 DPC333으로 16시간 동안 처리된 THP-B5 세포를 항체 코팅된 384-웰-플레이트 상에 16시간 동안 시딩하였다. 다음으로, 제조사 프로토콜(Steadylite 플러스 루시퍼라제 검출 시약, Perkin Elmer, # 6066751)에 따라 steadylite 플러스를 사용하여 루시퍼라제 활성을 결정하였다. 결과는 대조군 Ab(IgG 이소타입)에 대한 자극 배수로 표현한다.
Syk 인산화 분석
2 μM DPC333을 함유하는 배양 배지에서 6개의 웰 디쉬에 웰당 2×106개의 인간 M2A 대식세포를 시딩하였다. 24시간 후 세포를 PBS로 1회 세척하고, 분석 완충액(1% FCS, 10 mM HEPES, 2 μM DPC333 및 50 μg/ml 항-Fc Fab 블록이 보충된 RPMI)을 첨가하였다. 세포를 37℃에서 4시간 동안 인큐베이션하였다. 다음으로, 세포를 인큐베이터에서 제거하고, 얼음 위에 놓고 빙냉 PBS로 1회 세척하였다. 그런 다음, 이소타입 대조군 항체 또는 항-TREM2 항체(100 nM)를 함유하는 1 ml 분석 완충액을 첨가하였다. 상업용으로 사용가능한 항-TREM2 항체도 포함되었다(래트 단클론 IgG2B, R&D, MAB17291). 얼음 위에서 인큐베이션을 18분 동안 계속하였다. 그 후 배지를 제거하고, 세포를 빙냉 PBS로 세척하여 잉여의 결합되지 않은 TREM2 항체를 제거하였다. 그런 다음, 항-Fc 차단없이 100 nM의 가교 항체가 보충된 1 ml의 예열된 분석 완충액(래트 항-TREM2 제1 항체의 경우: Jackson Immuno Research #112005008, 염소 항 래트 IgG Fc-감마 단편; 인간 항-TREM2 항체의 경우: Jackson Immuno Research #109-005-008, 염소 항 인간 IgG Fc-감마 단편)을 첨가하였다. 37℃에서 10분 동안 인큐베이션을 계속하였다. 다음 플레이트를 얼음 위에 놓고, 냉 PBS와, 프로테아제/포스포스톱(phosphostop)(Thermo scientific, #1861281, 정지 프로테아제(Halt protease) 및 포스파타제 억제제 칵테일; 1:100)이 보충된 차가운 용해 완충액(800 μl/웰; Thermo scientific, #78501, M-PER 포유류 단백질 추출 시약)으로 1회 세척하였다. 세포 용해를 5분 동안 수행한 후 4℃에서 10,000 g에서 20분 동안 원심분리하였다. 상청액을 항-syk 항체(세포 신호전달, 클론 D3Z1E -XP, #13198; 2.45 μg/ml)와 실온에서 1시간 동안 부드럽게 교반하면서 인큐베이션하였다. 50 μl 단백질 A/G 비드(Thermo Scientific, #88802)를 각 샘플에 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 부드럽게 교반하면서 인큐베이션을 계속하였다. 다음 샘플을 자석(Thermo Scientific)에 넣고, 상청액을 제거하였다. 비드를 PBS-T(PBS + 0.1% Tween20)로 3회 세척하고, 결합된 단백질을 30 μl 1x WB 로딩 염료(NuPAGE, LDS Sample Buffer Novex, NP0008)로 용출시켰다.
다음 샘플을 70℃에서 10분 동안 가열하고, 자석으로 분리시키고, 러닝 완충액으로서 MES(NuPAGE MES, Novex, NP0002)를 사용하여 각 샘플 25 μl를 4~12% 겔(NuPAGE 4-12% Bis-Tris Midi Protein Gels, 10-웰, Novex, WG1403BOX) 상에 로딩하였다. 단백질을 PVDF 막으로 옮기고, 막을 3% TopBlock 완충액(LuBio, PBS-T 0.1% 중)으로 1시간 동안 차단한 다음, 항 포스포-티로신 AB 4G10(마우스 단클론, Millipore #05-1050)과 함께 4℃에서 하룻밤 인큐베이션하였다. 막을 세척하고, 깨끗한 블롯 항체(Clean-Blot, IP Detection Reagent (HRP), 21230)와 함께 실온에서 1시간 동안 인큐베이션한 다음, 또 다른 세척 단계를 수행하고, 제조업체 프로토콜에 따라 ECL(ECL Select 시약, GE Healthcare, RPN 2235)을 사용한 검출을 수행하였다.
총 Syk의 검출을 위해, 막을 Restore 스트리핑 완충액(stripping buffer)으로 처리한 다음, 토끼 항 인간 Syk 항체(Cell Signaling #2712) 및 클린 블롯 검출 시약을 사용하여 총 Syk를 검출하였다.
인간 TREM2(hTREM2 KI)의 CRISPR 녹-인( KI )
인간화 TREM2 마우스는 소 성장 호르몬 폴리A 신호를 포함하는 인간 TREM2 cDNA(이소형 1, UniProt: Q9NZC2-1)를 CRISPR에 의해 엑손1내 마우스 TREM2 유전자의 ATG에 도입함으로써 생성된다. 파운더 동물은 hTREM2 발현에 대해 PCR에 의해 스크리닝되고 동형접합성으로 사육된다. 골수 유래 대식세포는 다른 파운더 동물에서 생성되며, hTREM2의 발현과 마우스 TREM2의 부족은 FACS 분석에 의해 확인된다. 하나의 파운더 라인을 선택하고, TREM2 유전자좌의 서열 분석을 거쳐 TREM2 cDNA가 게놈에 올바르게 삽입되었는지 확인한다.
인간화 TREM2 Crispr-녹-인 마우스에서 큐프리존 모델
큐프리존 모델에서 뮤린화된 MOR44698 TREM2 항체의 예방적/수반되는 치료
큐프리존 모델은 말초 면역계의 경미한 관여만으로 CNS에서 수초화 과정을 연구하기 위한 독소-유도 탈수초화 모델이다. 구리 킬레이터인 큐프리존은 미토콘드리아 손상을 유발하고 결국 희소돌기아교세포 세포사를 유도하는 반면, 희소돌기아교세포 전구체 세포는 영향을 받지 않고 여전히 적절한 기능(증식, 성숙 및 재수초화)을 발휘할 수 있다. 설치류에서 큐프리존에 의해 유도된 중독은 신경염증, 신경 손상 및 탈수초화를 유도한 후 회복된다. 큐프리존 모델은 예를 들어 말초 면역 세포의 침범과 무관하게 재수초화를 향상시키는 MS와 같은 탈수초성 질환에 대한 재생 치료 패러다임을 테스트하는 데 적합하다.
인간화 TREM2 Crispr-녹-인 마우스(hTREM-KI)를; (식품 중 0.2%) 큐프리존(비스(사이클로헥사논) 옥살디하이드라존, Sigma-Aldrich)으로 7주일 동안 처리하고, 1일 전 및 이후 주 2회 44698 및 이소타입 대조군 MOR03207(짧은: 3207) 복강내, 30 mg/kg로 처리하였다. 연구 기간 동안 각각 수초와 신경염을 검출하는 것으로 간주되는, 자화 전달 비율(MTR)과 강도/대비를 측정하는 종적 비침습적 자기 공명 영상(MRI)을 수행하였다. 항체와 큐프리존으로 7주 예방/병용 치료 후 동물을 죽이고, 관상 뇌 파라핀 절편에 대한 조직학을 수행하였다. Iba1 항체는 미세아교세포 수와 형태를 평가하는 데 사용되었으며, Luxol 패스트 블루 염색(fast blue staining)은 수초 함량을 분석하는데 사용하였다.
큐프리존 모델에서 뮤린화된 MOR44698 TREM2 항체의 치료적 치료
hTREM-KI 마우스를 5주 동안 큐프리존(식품 중 0.2%)으로 처리한 다음, 정상 식품으로 전환하고, 2주 동안 44698 및 이소타입 대조군 3207 복강내, 30 mg/kg으로 매주 2회 처리하였다. 연구 기간 동안 자화 전달 비율(MTR)과 강도/대비를 측정하는 종적 비침습적 자기 공명 영상(MRI)을 수행하였다. 5주 큐프리존 중독후 항체로 2주 치료적 치료 후 동물을 죽이고, 관상 뇌 파라핀 절편에 대한 조직학을 수행하였다. Iba1 항체는 미세아교세포 수와 형태를 평가하는 데 사용되었으며, Luxol 패스트 블루 염색(fast blue staining)은 수초 함량을 분석하는데 사용하였다.
MRI: 7 T에서 작동하는 Biospec 70/30 분광계(Bruker Medical Systems, 독일 에틀링겐 소재)로 측정을 수행한다. 스캐너의 작동 소프트웨어는 Paravision 5.1(Bruker)이다. 마우스 뇌 원형 편광 코일(Bruker, Model 1P T20063 V3; 내경 23 mm)을 사용하여 마취되고 자발적으로 호흡하는 동물로부터 무선 주파수 여기 및 감지를 위해 이미지를 획득한다. 심장 또는 호흡기 유발이 적용되지 않는다. 박스에서의 짧은 도입 기간 후, 노즈콘을 통해 투여된 산소 중 1.5% 이소플루란(Abbott, 스위스 챔 소재)으로 동물을 마취 상태로 유지시킨다. MRI 신호를 획득하는 동안, 플렉시글라스(Plexiglas)로 제조된 받침대에 동물을 엎드린 자세로 놓고, 가열 패드를 사용하여 체온을 37±1℃로 유지하고, 호흡을 모니터링한다. 해부학적 방향을 결정하고 신호 강도를 평가하기 위해, AT2-가중치, 2차원 멀티 슬라이스 RARE(Rapid Acquisition with Relaxation Enhancement) 서열을 사용한다. 그 다음에는 MTR 평가를 위해 2회 - 차원 다중 슬라이스 구배 - 회수된 FLASH(Fast Low--Angle Shot) 획득이 이어진다. 두 시퀀스가 동일한 해부학적 파라미터를 가지므로, 평가를 위한 관심 영역의 선택은 RARE 영상에서 이루어지고, 그런 다음 FLASH 영상으로 전송된다. MRI 이미지는 ParaVision 소프트웨어를 사용하여 분석한다. 획득 파라미터는 다음과 같다: (a) RARE 서열: 유효 에코 시간 80 밀리초(ms), 반복 시간 3280 ms, RARE 인자 16, 12개 평균, 영상 범위 20 × 18 mm2, 매트릭스 크기 213 × 192, 픽셀 크기 0.094 × 0.094 mm2, 절편 두께 0.5 mm, 15개의 인접한 절편. 지속시간/대역폭 1 ms/5400 Hz 및 0.64 ms/5344 Hz의 Hermite 펄스가 각각 고주파 여기 및 재 포커싱에 사용된다. 2.61 ms/1051 Hz 지속시간/대역폭의 가우스 512 펄스에 이은 2 ms 길이의 기울기 스포일러에 의해 지방 억제가 달성된다. 총 획득 시간은 7 분 52.3초이다; (b) FLASH 서열: 에코 시간 2.8 ms, 반복 시간 252.8 ms, 4개 평균, 영상 범위 20 × 18 mm2, 매트릭스 크기 213 × 192, 픽셀 크기 0.094 × 0.094 mm2, 절편 두께 0.5 mm, 15개의 인접한 절편. 0.9 ms/6000 Hz 지속시간/대역폭 및 플립 각 30°의 Hermite 펄스가 고주파 여기에 사용된다. 7.5 μT의 고주파 피크 진폭 및 2500 Hz의 조사 오프셋이 적용된 15 ms/182.7 Hz 지속시간/대역폭의 가우스 펄스에 의해 MTR 대조가 도입된다. 그런 다음, MTR 대조는 도입하지 않고 동일한 파라미터로 획득을 반복한다. 그런 다음, 식 MTR= (S0-SMTR)/S0(여기서 S0 및 SMTR은 각각 MTR 대조 도입이 없는 FLASH 획득 및 MTR 대조 도입이 있는 FLASH 획득의 신호 강도를 나타냄)을 이용하여 MTR을 계산한다. 두 데이터 세트의 총 획득 시간은 6분 31.6초이다.
동물을 죽이기 전에 인산염 완충 식염수(PBS)에 의해, 그리고 어떤 경우에는 4% 파라포름알데히드(PFA)로 심장을 관류한다. 뇌 또는 반뇌가 후속적으로 분리되고, 4℃에서 48시간 동안 4% PFA에 고정된다. 일부 반뇌는 깊게 동결된다.
조직학: 고정 후, 에탄올 계열 증가를 통한 탈수에 의해 뇌를 파라핀 포매에 대해 처리한다. 파라핀 박편의 자동화된 면역조직화학을 SuperFrost+ 슬라이드(Thermo Fisher Scientific)에 고정시킨 3 μm 파라핀 박편에 수행하고, Discovery XT 기술(Ventana, Roche Diagnostics)을 사용하여 자동으로 면역염색한다. 박편을 탈파라핀화하고, 재수화시키고, 항체에 따라 28 내지 68분 동안 CC1 세포 조정 완충액과 함께 가열하여 항원성을 복원하고, 항체 희석제(Ventana)에 희석된 1차 항체와 함께 실온에서 항체에 따라서 1 내지 3시간 동안 인큐베이션 하고, 항체 희석제에 희석된 각각의 비오틴 부착된 2차 항체와 인큐베이션 하고, DAB- Mab 키트와 반응시키고 헤마톡실린 II 및 청색착색제 시약(Ventana)으로 대비염색하였다. 슬라이드를 뜨거운 수돗물에서 비누로 세척하고 흐르는 차가운 수돗물로 헹구어 비누를 제거한 다음, 탈수시키고 Pertex로 포매시켰다. LFB 염색을 위하여, 슬라이드는 파라핀을 제거하고 95% 에탄올로 재수화된다. 그런 다음 슬라이드를 95% 에탄올 및 10% 아세트산(Sigma 695092)의 LFB 용액(Solvent Blue 38(Sigma S3382))에서 60℃에서 하룻밤동안 인큐베이션하고, 95% 에탄올에서 1분 동안, 증류수에서 2분 동안, 그리고 0.05% 탄산 리튬에서 5초 동안 헹군다. 그 후, 슬라이드를 70% 에탄올에서 10초 동안 2회 헹구고, 증류수에서 2분 동안 헹군다. 백질의 청색(수초)과 무색의 회백질이 뚜렷하게 대비될 때까지 신선하게 준비된 0.05% 탄산 리튬(Merck 105680), 70% 에탄올 및 증류수로 헹굼을 반복한다. 마지막으로 슬라이드는 95% 에탄올로 시작하여 탈수되고 Pertex에 장착된다.
항체: 1차 항체는 토끼 항-마우스 MBP(Dako A0623) 1:1000; 토끼 항-마우스 GST-π(MBL 312) 1:500; 토끼 항-Iba1(Wako 019-19741, 50 μg/100 μl) 1:500; 토끼 항-GFAP(Dako Z0334) 1:5000; 토끼 항-마우스 MOG(abcam ab32760) 1:100; 토끼 항-dMBP(Millipore AB5864) 1:3000; 마우스 항-뉴로필라멘트(Covance SMI312) 1:5000; 토끼 항-마우스 ALDH1L1(abcam ab87117) 1:1000; 토끼 항-마우스 NeuN(Milli- pore ABN78) 1:2000; 래트 항-마우스 CD107a(Biorad MCA4707T) 1:200; 토끼 항-마우스 NG2(abcam ab129051) 1:200; 염소 항-Iba1(Thermo Fisher Scientific PA5-18039) 1:250이다. 2차 검출 항체는 비오티닐화된 염소 항-토끼 IgG(Jackson ImmunoResearch 111-065-144) 1:1000; 비오티닐화된 염소 항-토끼 IgG(벡터 BA-1000) 1:200 또는 1:1000; 비오티닐화된 염소 항-마우스 IgG(벡터 BA-9200) 1:1000; 비오티닐화된 염소 항-래트(벡터 BA-9400) 1:200이다.
조직학적 이미지의 분석: 조직학적 염색된 뇌 박편으로부터의 영상 분석을 기초로 한 미세아교세포/별아교세포 수 및 형태의 정량적 평가를 위하여, 독자적인 영상 분석 플랫폼(ASTORIA, Automated Stored Image Analysis, Novartis Pharma AG)을 MS Visual Studio 2010 및, Matrox MIL V9 라이브러리(Matrox Inc)의 여러 기능을 기초로 하여 개발하였다. 세포체, 근위 및 원위 프로세스 검출 및 분석을 위하여 다음의 일련의 단계를 수행한다: 1. (갈색) 면역조직화학적으로 염색된 미세아교세포(Iba1) 또는 별아교세포(GFAP) 세포체, 및 이들의 근위 및 원위 프로세스의 평가를 위하여, 뇌 박편이 있는 슬라이드를 Aperio의 Scanscope(Leica Biosystems AG)로 20배의 배율로 스캐닝하였다. 2. 각 이미지는 다음 단계에 따라 ImageScope 소프트웨어(V12.1.0.5029, Aperio, Leica Biosystems AG)를 사용하여 처리된다: A: 청색없이 갈색 염색을 얻기 위한 색상 디컨볼루션; B: 임계값 처리, 형태학적 폐쇄, 구멍 메우기, 너무 작은 객체 열기 및 제거를 통하여 흰색 배경으로부터 뇌 조직을 분할하여, 유효한 조직 및 샘플 영역의 이진 마스크를 생성한다; C: (세포체를 나타내는) 충분히 어두운 영역에서 색상 디컨볼루션된 갈색 이미지의 파란색 채널의 평균 회색 값을 기초로 하여, 세포체의 개별 세분화를 위한 적응 임계값. 계산된 임계값은 이진화에 사용되고, 크기 필터링 후 (유효한 샘플 영역 내에서) 세포체 마스크 이미지를 생성하였다; D: 세분화된 프로세스를 선택하는 크기를 가진 형태학적 토팟 변형을 통한 프로세스의 세분화. (이전에 결정된 갈색 개체의 회색 평균을 사용하여) 프로세스를 분할하기 위해 적응 임계값이 다시 적용되고, 결과 개체의 탑 햇 이미지의 이진화 및 크기 필터링이 뒤따른다; E: 실제 프로세스의 이미지 마스크를 얻기 위해 (탑 햇 임계화에 의해 선택되었을 수도 있는) 세포체의 감산; F: 길이 계산을 위한 프로세스의 궁극적인 세분화; G: 근위 프로세스: 사전 정의된 수의 세포체 확장은 근위 세포체에 대한 기준(마커) 영역을 정의하는 데 사용되며, 세포체 중심 주위에 원을 사용하여 근위 프로세스에 대한 컷오프 경계를 정의한다. 확장된 세포체에 마커가 있고 원형 영향 영역("근위 세분화된 프로세스"의 집합)에 의해 제한되는 세분화된 근위 프로세스는 그런 다음 세포체 중심 주변에서 재구성된다. "최종 근위 프로세스"는 "근위 세분화된 프로세스" 세트에 마커가 있는 모든 프로세스의 재구성을 통해 수집된다; H: 세포체는 "가시적 미세아교세포" 세트를 얻기 위해 근위 프로세스에 추가된다; I: 원위 프로세스: 근위 프로세스에서만 프로세스를 재구성한 다음(즉, 배경 또는 다른 초점 평면의 세포체에서 프로세스 무시), 근위 프로세스를 정의하는 원형 영역을 빼서, 원위 프로세스 세트를 생성한다; J: 세포체에 대한 광학 밀도 계산뿐만 아니라 "가시적 미세아교세포"(원형 참조 영역 내에서 개별 세포체+근위 프로세스 복합체, 로컬 배경(비가시성 미세아교세포)를 참조로 사용한다; K: 형태계량학적 특성(크기, 형태 인자, 길이)이 세포체, 근위 및 원위 프로세스에 대해 계산된다.
CSF1R 키나제 억제제 BLZ945를 사용한 미세아교세포 고갈 및 재증식
BLZ945 고갈 모델은 TREM2의 영양 활성을 지원하는 항-TREM2 항체의 효능을 평가할 수 있다.
콜로니 자극 인자 1 수용체(CSF1R) 신호전달 경로는 미세아교세포 생존에 필수적이다. CSF1R 키나제 억제제 BLZ945는 미세아교세포의 고갈을 유도하고, BLZ945 제거시 미세아교세포가 뇌를 재증식한다. BLZ945 처리 및 분석은 이전에 설명한대로 수행된다(문헌[Beckmann,N et al., Acta Neuropathol Commun, 2018. 6(1)]).
동물을 적어도 5일 동안 1일 1회(qd), 경구로(p.o.) 10 ml/kg으로 169 mg/kg의 BLZ945로 처리하였다. BLZ945는 물 중 0.5% 메틸셀룰로스 및 0.1% 트윈-80에 제조되었다. 동물은 사료와 물을 자유롭게 이용할 수 있게 하였다.
동물들을 30 mg/kg 복강내 매주 1회 항체 또는 이소타입 대조군으로, BLZ945로의 처리(적어도 1일) 전에, (적어도 5일 동안)동안 또는 적어도 3일 동안 처리한 후 처리하였다. 동물을 죽이기 전에 인산염 완충 식염수(PBS)에 의해, 그리고 어떤 경우에는 4% 파라포름알데히드(PFA)로 심장을 관류하였다. 뇌 또는 반뇌가 후속적으로 분리되었고, 4℃에서 48시간 동안 4% PFA에 고정되었다. 일부 반뇌는 깊게 동결되거나, 냉 PBS에 새로 넣었다.
조직학: 고정 후, 에탄올 계열 증가를 통한 탈수에 의해 뇌를 파라핀 포매에 대해 처리하였다. 파라핀 박편의 자동화된 면역조직화학을 SuperFrost+ 슬라이드(Thermo Fisher Scientific)에 고정시킨 3 μm 파라핀 박편에 수행하였고, Discovery XT 기술(Ventana, Roche Diagnostics)을 사용하여 자동으로 면역염색하였다. 박편을 탈파라핀화하고, 재수화시키고, 항체에 따라 28 내지 68분 동안 CC1 세포 조정 완충액과 함께 가열하여 항원성을 복원하고, 항체 희석제(Ventana)에 희석된 1차 항체와 함께 실온에서 항체에 따라 1 내지 3시간 동안 인큐베이션 하고, 항체 희석제에 희석된 각각의 비오틴 부착된 2차 항체와 인큐베이션 하고, DAB-Mab 키트와 반응시키고 헤마톡실린 II 및 청색착색제 시약(Ventana)으로 대비염색하였다. 슬라이드를 뜨거운 수돗물에서 비누로 세척하고 흐르는 차가운 수돗물로 헹구어 비누를 제거한 다음, 탈수시키고 Pertex로 포매시켰다. LFB 염색을 위해, 슬라이드는 파라핀을 제거하고 95% 에탄올로 재수화하였다. 그런 다음 슬라이드를 95% 에탄올 및 10% 아세트산(Sigma 695092)의 LFB 용액(Solvent Blue 38(Sigma S3382))에서 60℃에서 하룻밤동안 인큐베이션하고, 95% 에탄올에서 1분 동안, 증류수에서 2분 동안, 그리고 0.05% 탄산 리튬에서 5초 동안 헹궜다. 그 후, 슬라이드를 70% 에탄올에서 10초 동안 2회 헹구고, 증류수에서 2분 동안 헹구었다. 백질의 청색(수초)과 무색의 회백질이 뚜렷하게 대비될 때까지 신선하게 준비된 0.05% 탄산 리튬(Merck 105680), 70% 에탄올 및 증류수로 헹굼을 반복하였다. 마지막으로 슬라이드는 95% 에탄올로 시작하여 탈수되고 Pertex에 장착되었다.
항체: 1차 항체는 토끼 항-Iba1(Wako 019-19741, 50 μg/100 μl) 1:500; 토끼 항-GFAP(Dako Z0334) 1:5000; 마우스 항-뉴로필라멘트(Covance SMI312) 1:5000; 토끼 항-마우스 ALDH1L1(abcam ab87117) 1:1000; 토끼 항-마우스 NeuN(Milli-pore ABN78) 1:2000; 래트 항-마우스 CD107a(Biorad MCA4707T) 1:200; 염소 항-Iba1(Thermo Fisher Scientific PA5-18039) 1:250이다. 2차 검출 항체는 비오티닐화된 염소 항-토끼 IgG(Jackson ImmunoResearch 111-065-144) 1:1000; 비오티닐화된 염소 항-토끼 IgG(벡터 BA-1000) 1:200 또는 1:1000; 비오티닐화된 염소 항-마우스 IgG(벡터 BA-9200) 1:1000; 비오티닐화된 염소 항-래트(벡터 BA-9400) 1:200이다.
조직학적 이미지의 분석: 조직학적 염색된 뇌 박편으로부터의 영상 분석을 기초로 한 미세아교세포/별아교세포 수 및 형태의 정량적 평가를 위하여, 독자적인 영상 분석 플랫폼(ASTORIA, Automated Stored Image Analysis, Novartis Pharma AG)을 MS Visual Studio 2010 및, Matrox MIL V9 라이브러리(Matrox Inc)의 여러 기능을 기초로 하여 개발하였다. 세포체, 근위 및 원위 프로세스 검출 및 분석을 위하여 다음의 일련의 단계를 수행하였다: 1. (갈색) 면역조직화학적으로 염색된 미세아교세포(Iba1) 또는 별아교세포(GFAP) 세포체, 및 이들의 근위 및 원위 프로세스 평가를 위하여 뇌 박편이 있는 슬라이드를 Aperio의 Scanscope(Leica Biosystems AG)로 20배의 배율로 스캐닝하였다. 2. 각 이미지는 다음 단계에 따라 ImageScope 소프트웨어(V12.1.0.5029, Aperio, Leica Biosystems AG)를 사용하여 처리되었다: A: 청색없이 갈색 염색을 얻기 위한 색상 디컨볼루션; B: 임계값 처리, 형태학적 폐쇄, 구멍 메우기, 너무 작은 객체 열기 및 제거를 통하여 흰색 배경으로부터 뇌 조직을 분할하여, 유효한 조직 및 샘플 영역의 이진 마스크를 생성한다; C: (세포체를 나타내는) 충분히 어두운 영역에서 색상 디컨볼루션된 갈색 이미지의 파란색 채널의 평균 회색 값을 기초로 하여, 세포체의 개별 세분화를 위한 적응 임계값. 계산된 임계값은 이진화에 사용되고, 크기 필터링 후 (유효한 샘플 영역 내에서) 세포체 마스크 이미지를 생성하였다; D: 세분화된 프로세스를 선택하는 크기를 가진 형태학적 토팟 변형을 통한 프로세스의 세분화. (이전에 결정된 갈색 개체의 회색 평균을 사용하여) 프로세스를 분할하기 위해 적응 임계값이 다시 적용되고, 결과 개체의 탑 햇 이미지의 이진화 및 크기 필터링이 뒤따랐다; E: 실제 프로세스의 이미지 마스크를 얻기 위해 (탑 햇 임계화에 의해 선택되었을 수도 있는) 세포체의 감산; F: 길이 계산을 위한 프로세스의 궁극적인 세분화; G: 근위 프로세스: 사전 정의된 수의 세포체 확장은 근위 세포체에 대한 기준(마커) 영역을 정의하는 데 사용되었으며, 세포체 중심 주위에 원을 사용하여 근위 프로세스에 대한 컷오프 경계를 정의한다. 확장된 세포체에 마커가 있고 원형 영향 영역("근위 세분화된 프로세스"의 집합)에 의해 제한되는 세분화된 근위 프로세스는 그런 다음 세포체 중심 주변에서 재구성되었다. "최종 근위 프로세스"는 "근위 세분화된 프로세스" 세트에 마커가 있는 모든 프로세스의 재구성을 통해 수집되었다; H: 세포체는 "가시적 미세아교세포" 세트를 얻기 위해 근위 프로세스에 추가되었다; I: 원위 프로세스: 근위 프로세스에서만 프로세스를 재구성한 다음(즉, 배경 또는 다른 초점 평면의 세포체에서 프로세스 무시), 근위 프로세스를 정의하는 원형 영역을 빼서, 원위 프로세스 세트를 생성한다; J: 세포체에 대한 광학 밀도 계산뿐만 아니라 "가시적 미세아교세포"(원형 참조 영역 내에서 복잡한 개별 세포체+근위 프로세스 복합체, 로컬 배경(비가시성 미세아교세포)를 참조로 사용하였다; K: 형태계량학적 특성(크기, 형태 인자, 길이)이 세포체, 근위 및 원위 프로세스에 대해 계산되었다.
인간화 TREM2 Crispr-녹-인 마우스에서 MPTP 모델
1-메틸-4-페닐-1,2,3,6-테트라하이드로피리딘(MPTP)은 인간에게 파킨슨 병과 유사한 증상을 유발할 수 있는 독소이다. MPTP는 성상세포 모노아민 산화효소-B에 의해 대사되어 활성 대사산물인 1-메틸-4-페닐피리디늄(MPP+)을 생성한 다음, 도파민(DA) 수송체(DAT)를 통해 뉴런에 흡수된다. 무엇보다도, MPP+는 미토콘드리아 기질에 축적되어, 미토콘드리아 ATP 생성을 손상시키는 호흡 사슬의 복합체 I를 억제한다. 이러한 ATP 고갈은 복합체 I 억제로 인한 과도한 활성 산소 종(ROS) 형성과 함께 세포사를 초래한다. 전신 MPTP 투여는 증가된 신경염증을 동반하는 마우스에서 특히 도파민성 세포 사멸을 유도한다. MPTP 모델은 이전에 설명되었다(문헌[Ren, M et al., Exp Neurol, 2018. 302:p.205-213]).
인간화 TREM2 Crispr-녹-인 마우스(hTREM-KI)를 2시간 간격의 15 mg/kg 복강내 주사로 1일 동안 4회 MPTP로 처리하였다. 44698 및 이소타입 대조군 MOR03207(짧음: 3207) 복강내 30 mg/kg 주사를 MPTP 처리 전날, MPTP 처리후 2일 및 4일 후에 수행하였다. MPTP 처리 7일 후 동물을 죽이고, 관상 뇌 자유-부동 섹션에서 면역형광을 수행하였다. 티로신 하이드록실라제(TH)를 항체로 염색하고, (10배 대물렌즈로) 현미경 사진을 찍고, 선조체에서 염색된 영역을 Fiji 소프트웨어로 정량화하였다.
동물을 죽이기 전에 인산염 완충 식염수(PBS)에 의해, 그리고 어떤 경우에는 4% 파라포름알데히드(PFA)로 심장을 관류하였다. 뇌 또는 반뇌가 후속적으로 분리되었고, 4℃에서 24~48시간 동안 4% PFA에 고정되었다. 일부 반뇌는 깊게 동결되거나, 냉 PBS에 새로 넣었다.
조직학: 고정 후 뇌를 PBS의 2% 아가로스에 매립하고, 자유 부유 섹션(적어도 20~30 μm 두께)을 생성하였다. 슬라이스를 24-웰 플레이트에 옮기고, PBS로 세척하고, 1% (w/v) 소 혈청 알부민(BSA) 및 0.3% (v/v) Triton X-100(본원에서 1일 완충액이라고도 함)이 보충된 PBS에서 2% (v/v) 정상 염소 또는 말 혈청(Vector Laboratories)에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 그 다음, 슬라이스를 각각의 1차 항체(토끼 항-티로신 하이드록실라제(TH), Millipore Ab152)를 함유하는 1일 완충액에 하룻밤동안 두었다. 다음 날, 슬라이스를 0.3% BSA 및 0.1% Triton X-100(본원에서 2일 완충액이라고도 함)이 보충된 PBS로 2회 세척하고, 2일 완충액에서 각각의 2차 형광-표지된 항체와 함께 1시간 동안 인큐베이션하고, 2일 완충액으로 2회, PBS로 3회 세척한 다음, 유리 슬라이드에 장착하고 커버 슬립을 덮었다. 면역염색된 슬라이스를 ImageJ로 분석하였다.
사이노몰구스 원숭이의 PK 연구
비인간 영장류에서 항체의 PK를 평가하고 인간에서 PK 모델링을 가능하게 하기 위해, 사이노몰구스 원숭이에서 PK 연구를 수행하였다. 각각 3마리의 동물이 있는 4개의 그룹을 1일차 및 106일차에 비히클, 10, 30 또는 100 mg/kg의 MOR044698로 처리하였다. CSF는 투여전, 및 투여후 48 및 168 후에 취하였다. 혈액을 투여전 및 투여후 0.5, 4, 8, 24, 48, 72, 96, 및 168시간 후에, 및 추가로 투여후 15, 29, 43, 57, 71, 85, 및 99일 후에 취하였다.
CSF 및 혈액내 항체 농도는 Elisa를 통해 평가될 뿐만 아니라, 두 구획에서 sTREM2에 대한 항체의 결합을 평가할 것이다.
결과
초기 및 백업 패닝에서 유래된 항체의 특성
패닝 실험에 뒤이은 스크리닝 시도는 시험관 내에서 TREM2의 인간 세포 외 도메인에 nM 친화성으로 결합하는 항체를 확인했다(표 15). 항체가 TREM2 또는 IgSF 도메인의 스톡 영역을 인식하는지 여부를 확인하기 위해, 2개의 다른 TREM2-TREM1 키메라 단백질을 사용하여 ELISA 분석에서 항체를 평가하였다. 한 작제물은 TREM2 IgSF 도메인에 이어 TREM1 스톡 영역을 함유하고, 다른 단백질은 TREM1 IgSF 도메인에 이어 TREM2 스톡 영역에 의해 조립되었다. 대부분의 항체는 TREM2-IgSF-TREM1스톡 작제물을 인식한다. MOR041874는 TREM2의 스톡 영역에 결합하고, hTREM2 IgSF-T1 스톡 단백질을 인식하지 못한다. MOR041895는 전장 TREM2에만 결합한다.
항체는 또한, nM 친화도로 CHO 세포에서 재조합적으로 발현된 인간 TREM2에 결합하고, THP1-B5 세포에서 NFAT 프리모터(premotor)를 통해 TREM2 의존적 신호전달을 활성화한다(표 15).
항체는 또한 인간 M2A 대식세포에서 내인적으로 발현되는 TREM2에 결합한다(표 15, 마지막 컬럼).
[표 15]
Figure pct00067
항-TREM2 항체의 안정화 특성을 평가하기 위해 CHO-hDAP12-hTREM2 세포를 100 nM의 항체로 약 16시간 동안 처리하였다. 그후 TREM2 세포 표면 발현을 FACS 분석으로 평가하였다.
도 2에 도시된 바와 같이, IgSF 결합제 중 일부는 TREM2 세포 표면 발현을 증가시켰으며, 이는 ADAM17에 의한 TREM2의 부분절단이 손상되었음을 나타낸다(예를 들어 MOR042492, MOR042493, MOR042556, MOR042589, MOR042596, MOR042752, MOR042765).
다음 단계에서, 항체 MOR042492 및 MOR042589에 대해 PTM를 제거하고, 여러 안정화 항체에서 친화성 성숙을 수행하였다.
[표 16]
Figure pct00068
Figure pct00069
인간 TREM2에서 친화성 성숙된 항체의 결합 친화도에 대한 대략적인 추정으로서, SET 스크리닝 실험은 hTREM2 ECD(19-174)를 사용하여 수행하였다. 몇몇 항체는 이 시험관 내 분석에서 재조합적으로 발현된 인간 TREM2에서 나노몰 이하 결합 친화도를 갖는다(표 16).
[표 17]
Figure pct00070
Figure pct00071
다음 항체는 FACS 분석을 사용하여 상이한 공여체로부터의 hM2A 대식세포에서 내인성으로 발현된 TREM2에 대한 결합에 대해 스크리닝되었다. 몇몇 항체는 2 nM 미만인 결합 EC50을 나타낸다. 또한 대부분의 항체는 모 (형질감염되지 않은) CHO 세포 또는 TREM2 발현이 없도록 CRISPR에 의해 유전적으로 조작된 THP-1 세포에 결합하지 않았다(표 17).
[표 18]
Figure pct00072
재조합 발현 시스템과 대조적으로, 인간 M2A 대식세포는 TREM2 및 DAP12를 내인적으로 발현한다. 이 세포 시스템에서 TREM2 단백질은 번역 후 처리되고 인간의 생체 내 상황과 매우 유사하게 발현된다.
항체의 EC50은 hM2A 대식세포에서 내인적으로 발현된 인간 TREM2에서 결정되었다(표 18). n은 서로 다른 실험의 수를 나타내며, 모든 실험에서 CD14+ 단핵구와 차별된 대식세포는 서로 다른 공여체로부터 유래되었다. 결과는 FACS 분석을 사용하여 인간 M2A에 대한 대부분의 항체의 나노몰 미만 항체 결합 친화도를 나타낸다. 각 공여체에 대한 개별 값이 제공된다. 가장 놀랍게도, 일부 항체는 서로 다른 공여체, 예를 들어 44724, 44713, 44735 및 44716간의 결합 친화도에서 높은 가변성을 보여주는 반면, 다른 것들은 테스트된 다른 공여자들, 예를 들어 MOR044746 및 MOR44698 중에서 일관된 결합 패턴을 보여준다.
[표 19]
Figure pct00073
Figure pct00074
재조합 생산된 단백질을 이용하여, 항-TREM2 항체가 TREM2(스톡 영역의 IGSF)의 어떤 단백질 도메인을 인식하는지 조사하였다(표 19). 모든 항체는전장 세포 외 TREM2 작제물에 대해 5배 초과의 신호:배경 비율로 결합한다. 항체 MOR044743, MOR044741, MOR0044742 및 MOR044744는 TREM2의 스톡 영역과 강하게 상호작용하는 반면, 대부분의 다른 항체는 IGSF 결합제이다.
이들 실험은 또한 이들 항체와 사이노몰구스 TREM2의 ECD와의 교차-반응성을 보여준다(표 19).
[표 20]
Figure pct00075
Figure pct00076
항체의 생화학적 및 생물물리적 특성을 추가로 특성화하기 위해, 항체의 단량체 함량, 등전점, 융점 및 소수성을 평가하였다(표 20).
몇몇 항체, 예를 들어 MOR044746, MOR044698, MOR044724, MOR044722, MOR044716, MOR044705, MOR044713은 우수한 생화학적 및 생물물리적 특성(즉, 단량체 함량 > 94%, pI>7.1, TM>75 및 소수성 >0.4)을 나타냈다.
[표 21]
Figure pct00077
항체의 결합 친화도를 정확하게 평가하기 위해 운동 속도 상수의 측정에 의한 친화도-결정을 SPR로 수행하였다. 또한, 사이노몰구스 TREM2와의 비교를 수행하였다(표 21). 이러한 실험을 수행하기 전에, 항체 단백질(IgG)의 단량체 분획의 양을 분석하였다(분석적 SEC에 의한 적어도 90% 단량체 함량).
재조합적으로 발현된 사이노몰구스 또는 인간 TREM2 ECD 도메인에서 항체의 KD 결정은 pM 친화성을 나타낸다. 이러한 친화도는 인간 및 사이노몰구스 TREM2를 비교할 때 유사하다.
TREM2 항체의 특이성을 추가로 평가하기 위해, 인간 M2A 대식세포를 PMA로 처리하고, 이러한 대식세포에 대한 항체의 결합을 FACS 분석을 사용하여 평가하였다(도 3). PMA는 ADAM17과 같은 프로테아제를 활성화하여 hM2A에서 TREM2 ECD를 부분절단하는 것으로 나타났다(문헌[Feuerbach, D et al. Neurosci Lett, 2017. 92:p.202-209]). PMA 처리 후, AF1828 Ab는 더 이상 M2A 대식세포에 결합하지 않는다(제1 바아와 제2 바아 비교).
그러나, 몇몇 항체들(예를 들어 MOR44728, MOR46021, MOR46022, MOR46023, MOR46025, MOR46026, MOR46028, MOR46029 및 MOR46030)은 여전히 인간 M2A 대식세포의 세포 표면의 구조에 결합하며, 이는 비특이적 결합을 나타낸다. 몇몇 항체는 PMA 처리 후 인간 M2A 대식세포에 대한 결합이 부족하다(예를 들어 MOR44694, MOR44698, MOR44705, MOR44746).
항체의 비-표적 관련 결합 특성을 추가로 조사하기 위해, 선택된 항체 세트를 단백질 패널 프로파일링에 적용하였다. 결과는 항체의 누적 결합 비율이 150 미만임을 보여주며, 이는 검출 가능한 비특이적 결합이 없는 IgG를 나타낸다(표 22).
[표 22]
Figure pct00078
키메라 TREM2-TREM1 작제물을 재조합적으로 발현하는 CHO 세포를 사용하여 TREM2 단백질내 항체의 결합 부위를 확인하였다. FACS 분석을 사용하여, 모든 항체가 전장 WT-인간 TREM2에 결합함을 입증하였다(도 4a). 항체 MOR044698, MOR044713, MOR044716, MOR044724 및 MOR044746은 TREM2-IgSF-TREM1 스톡 단백질(도 4b)을 발현하는 세포주에는 결합하지만, TREM1-IgSF-TREM2 스톡 단백질(도 4c)을 발현하는 세포주에는 결합하지 않는다. 항체 MOR44743 및 MOR041874는 역 결합 패턴을 나타냈으며, 즉 TREM1-IgSF-TREM2 스톡 단백질에는 결합하지만 TREM2-IgSF-TREM1 스톡 단백질 발현 세포주에는 결합하지 않는다. MOR3207은 이소타입 대조군 항체이며, 항-인간은 단지 2차 FACS-염색 항체이다.
다음 실험 세트에서 재조합 세포 발현 시스템을 사용하는 항체의 효능을 평가하였다. 사이노몰구스 또는 인간 TREM2를 재조합적으로 발현하는 CHO 세포에서 FACS 분석을 사용하여 항체의 EC50을 결정하였다(표 23). 인간 TREM2를 발현하는 CHO 세포에서 항체는 나노몰 미만의 결합 친화성을 나타내는 것으로 나타났다. 사이노몰구스 TREM2를 발현하는 세포주에서, 결합 친화도는 인간 TREM2를 발현하는 세포와 비교하여 유사한 범위내에 있다.
[표 23]
Figure pct00079
상이한 공여체로부터의 hM2A를 100 nM의 항-TREM2 항체로 o/n 처리하였다. 다음으로, 비-가교차단 Fab 단편 MOR041895를 사용하여 세포 표면에서의 TREM2 발현을 평가하였다. 항체 MOR044746, MOR044698, MOR044713, MOR044716 및 MOR044724와의 인큐베이션은 항체 MOR044741, MOR044743과 대조적으로 세포 표면에서 TREM2의 안정화를 수반했다. 모든 항체는 (이전에 결정된대로) 나노몰 이하 친화도 및 TREM2와 유사한 Bmax를 나타낸다. 그러나, MOR044746, MOR044698, MOR044713, MOR044716 및 MOR044724는 IgSF 도메인에 결합하는 반면, MOR044741 및 MOR044743은 TREM2의 스톡 영역에 결합한다(도 5). 표 24는 이소타입 대조군(MOR03207)과 관련하여 TREM2 세포 표면 발현의 배수 증가를 보여준다. n은 서로 다른 실험의 수를 나타내며, 모든 실험에서 대식세포는 서로 다른 공여체로부터 유래되었다.
이들 데이터는 TREM2의 IgSF 도메인에 결합하는 항체가 ADAM17과 같은 부분절단효소에 의한 엑토도메인 방출을 억제하고, TREM2의 세포 표면 발현을 증가시킨다는 것을 나타낸다.
[표 24]
Figure pct00080
상이한 공여자로부터의 hM2A를 100 nM(도 6a) 또는 10 nM(도 6b)의 항-TREM2 항체로 처리하였다. 16~20시간 후 세포를 먹이로서 pHrodo 표지된 황색포도상구균(staph-aureus) 바이오입자를 사용하여 식세포작용 분석을 실시하였다. TREM2 세포 표면 발현을 안정화시킨 항체(MOR044746, MOR044698, MOR044713, MOR044716 및 MOR044724)는 hM2A에서 식세포작용을 촉진한다. 대조적으로, 세포 표면 발현을 증가시키지 않은 MOR044741 및 MOR044743은 또한 pHrodo 황색포도상구균(staph-aureus) 바이오입자의 흡수를 향상시키지 않는다. 항체 MOR044746, MOR044698, MOR044713, MOR044716 및 MOR044724는 또한 10 nM에서 식세포작용 분석에서 효과적이었다(도 6b). 이들 데이터는 TREM2의 IgSF 도메인에 결합하는 항체가 hM2A의 식세포작용 능력을 증가시킨다는 것을 나타낸다.
다음, 상이한 농도의 TREM2 안정화 항체를 hM2A 대식세포와 함께 인큐베이션한 다음, 16~20시간 후에 식세포작용 분석을 수행하였다. 항체 44698 및 44716은 이소타입 대조군과 비교하여, 두 공여체 모두에서 가장 낮은 시험 농도(1 nM)에서도 hM2A로의 pHrodo 황색포도상구균 바이오입자의 흡수를 강화시켰다. 항체 44746 및 44713에 대한 최저 활성 농도는 또한, 1 nM이었지만, 1개의 공여체뿐이었다. 44694의 가장 낮은 활성 농도는 3 nM이었지만, 1개의 공여체뿐이었다(도 7a, b).
도 8은 항체에 의해 THP1-B5 세포에서 내인적으로 발현된 TREM2의 활성화가 NFAT 프로모터 구동 루시퍼라제 활성을 유도함을 보여준다. 플레이트를 이소타입 대조군 또는 상이한 항-TREM2 항체로 코팅하였다. 항체 MOR044746, MOR044698, MOR044713, MOR044716 및 MOR044724는 TREM2 의존성 유전자 전사를 활성화한다.
도 9(a, b)는 이소타입 대조군 항체(MOR03207 또는 래트IC) 또는 항-TREM2 항체(MOR044698 또는 래트hT2)로 처리한 후 인간 M2A 대식세포로부터의 웨스턴 블롯에 의해 결정된 바와 같은 Syk 인산화를 나타낸다. 지시된 경우(X-연결: +), 이를 이후 항-Fc 가교 항체(x-연결)로 처리하였다.
도 9a에 도시된 바와 같이, TREM2 항체 44698은 인간 M2A 대식세포에서 TREM2-유도된 Syk 인산화를 증가시킨다. MOR044698 및 상업용으로 이용가능한 R&D 래트 항-인간 TREM2 항체는 항-Fc 가교 항체의 부재하에도 Syk 인산화를 개선시킨다(도 9a에서 레인 1을 2와 비교하고, 레인 5를 레인 6과 비교). 이 효과는 가교 항체를 첨가할 때 강하게 강화된다(레인 3과 4, 레인 7과 8 비교). 가교 항체 MOR044698을 첨가한 후, 래트 항 인간 TREM2 항체에 비해 syk 인산화에 대한 더 강한 효과가 관찰되었다(레인 4 및 8 참조).
이들 실험은 Ab MOR044698이 내인성 TREM2 발현을 갖는 인간 세포 시스템에서 TREM2 안정화 활성과 함께 TREM2 작용 활성을 나타낸다는 것을 나타낸다.
다음 세트의 실험에서, 고 분자량 종, 저 분자량 종의 존재 및 정제된 항체의 순도를 평가하였다(표 25). 크기 배제 크로마토그래피(SEC)를 사용하여 네이티브 조건에서 크기가 다른 단클론 항체 변이체를 분리했다. 단기 응집은 저 분자량 종(LMW)의 형성으로 표현된다. 단기 응집은 저 분자량 종(LMW)의 형성으로 표현된다. 고 분자량 종(HMW)은 크기 배제 크로마토그래피(SEC) 및 소듐 도데실 설페이트(CE-SDS)를 사용하는 모세관 겔 전기영동으로 측정되며,항체가 응집체를 형성하는 경향을 나타내며, 이는 특히 면역원성 이유로 요망되지 않는다. 고 분자량 종(HMW)은 정제된 물질의 원치 않는 특성을 나타낸다. 소듐 도데실 설페이트(CE-SDS)를 사용하는 모세관 겔 전기영동은 분자량 차이에 따라 단백질을 분리하는 데 사용되었으며, 비-환원 또는 환원 조건에서 수행할 수 있다. 분해 산물, 클리핑을 포함한 저 분자량 종(LMW) 및 부산물(HMW)의 함량은 정제된 물질의 품질을 나타낸다. 아래에 표시된 바와 같이, 모든 분자는 개발 가능성과 관련하여 유리한 품질 속성을 보여준다.
[표 25]
Figure pct00081
추가 실험에서, 정제된 항체의 분자 질량, 당화(glycation), 글리코실화(glycosylation), 클리핑 생성물 및 서열 변이체를 조사하였다(표 26). 단백질 당화는 환원당(예를 들어, 글루코스, 갈락토오스 및 프룩토스)과 단백질 아민 기 사이의 비-효소적 글리코실화이다. 치료 단백질의 경우, 당화의 잠재적인 효과에는 생물학적 기능 부위를 차단하거나 응집을 유도하는 추가 분해가 포함된다. 단백질 번역 후 변형의 일반적인 형태인 글리코실화는 올리고당 측쇄가 아스파라긴(N-연결) 또는 세린/트레오닌(O-연결)의 측쇄에 공유적으로 부착되는 다양한 효소 매개 과정이다. 치료용 당 단백질의 탄수화물 성분은 종종 안정성, 용해도/생체이용률, 생체 내 활성, 약동학 및 면역원성을 포함한 그의 약리학적 특성을 결정하는 데 중요하다. 클리핑(단편화)은 재조합 치료 단백질의 일반적인 생화학적 분해 유형이다. 이는 종종 숙주 세포주에서 프로테아제 활성과 연결되며, 단백질 의약품의 품질, 물리적 안정성 및 잠재적 면역원성에 영향을 미친다. 아래에 표시된 바와 같이, 모든 분자는 개발 가능성과 관련하여 유리한 MS 프로파일을 보여준다.
[표 26]
Figure pct00082
다음 실험 세트는 정제된 항체의 생물물리적 특성(즉, 차등 상호작용 매개변수, 점도, 소수성, 용융 온도 및 등전점)을 평가하였다(표 27). 차등 상호작용 매개변수(DIP)는 콜로이드 안정성의 척도이며, 이는 분자가 소수성 표면 잔기 등과의 약한 인력으로 인해 결합하는 경향이다. 이는 분자의 점도와 관련될 수 있다. 점도는 유체가 움직일 때 발생하는 내부 마찰력으로 인한 유동 저항이다. 그것은 분자의 개발가능성과 관리에 강한 영향을 미친다. 단백질의 표면 소수성을 측정하는 직접적인 방법은 황산 암모늄으로 용출하는 동안 머무름 시간을 결정하는 것이다. 소수성은 농축 과정동안 단백질 응집 및 불리한 영향의 주요 위험 요소이다. 시차 주사 형광측정법(DSF)은 증가하는 온도 구배를 적용하여 단백질의 전이 전개 온도를 결정한다. 열 안정성(pH 5.5에서 시차 주사 형광측정법 DSF로 측정한 용융 온도 Tm)는 일반적으로 소수성 코어의 노출로 인해 단백질이 온도에 따라 응집 및/또는 전개되는 경향이다. 열적으로 유도된 전개는 접힌 상태와 전개된 상태 사이에 급격한 전환이 있는 전형적인 2-상태 모델로, 여기서 Tm 값은 단백질-전개 전환의 온도 중간점으로 정의된다. Fab의 Tm은 보고되어 있으며, 분자의 열 안정성에 대한 지표이다. 전개 개시는 단백질이 전개되기 시작하는 온도를 결정하는, 분자의 열 안정성에 대한 추가 지표이다. 등전점(pI)은 항체에 순 전하가 없는 pH이며, 그 값은 항체에 포함된 하전된 아미노산에 따라 달라진다. 그것은 분자의 정제 과정에 영향을 미친다. mAb의 pI는 신생아 Fc 수용체인 FcRn에 의해 매개되는 재순환과 무관하게 PK 거동에 실질적인 영향을 미치는 것으로 알려져 있다. 8~9 범위의 pI 값을 갖는 치료용 항체는 생리학적 pH가 7.4이기 때문에 투여 후 적절하게 흡수된다. 아래에 표시된 바와 같이, 모든 분자는 개발 가능성과 관련하여 유리한 생물물리적 특성을 보여준다.
[표 27]
Figure pct00083
항-TREM2 항체를 인간 원형질막 단백질 결합 세포 어레이에서 프로파일링하여 그들의 선택성을 테스트하였다(표 28). MOR044716은 TYRO3, SEZ6L2 및 TGM2를 발현하는 세포에 결합되었다. 형질감염되지 않은 세포에 대한 MOR044716의 배경 신호는 이러한 오프-표적 중 하나의 내인성 발현과 관련이 있을 수 있다. SEZL2 및 TGM2와 달리, TYRO3은 Retrogenix 화면에서 종종 식별되며, 이 플랫폼에서 "끈적한" 수용체로 간주된다. 그럼에도 불구하고 신호 강도(약함/중간)는 잠재적인 특정 오프-표적으로 간주할만큼 충분히 강하다. MOR044724는 CD36 및 CRHBP를 발현하는 세포에 결합되었다.
TREM2는 MOR044746, MOR044698 및 MOR044713의 유일한 특이적 표적이었으며, 이러한 항체의 높은 수준의 선택성을 시사한다. 이들의 기본 표적 외에도, MOR044716 및 MOR044724는 각각 3 및 2개의 관련 오프-표적들을 인식한다.
[표 28]
Figure pct00084
FACS 분석과 무관한 기술을 사용하여 항-TREM2 항체로 전처리한 후 인간 M2A 대식세포에서 식세포작용 실험을 수행하였다(도 10). 또한, 두 가지 다른 이소형 대조군 항체(MOR3207 및 ACE27716)와 상업용으로 사용가능한 TREM2 항혈청(TREM2 R & D)을 사용하였다. FACS-기반 식세포작용 분석과는 대조적으로, 식세포작용은 3시간에 걸쳐 추적되었고, 세포 내 pHrodo 바이오입자의 축적을 위한 곡선 아래 면적을 평가하였다. MOR044746 및 MOR044698은 hIgG 이소형 대조군 항체와 비교하여 식세포작용의 통계적으로 유의한 촉진을 나타냈다.
상업용으로 사용가능한 pHrodo 표지된 황색포도상구균(Staph. Aureus)를 먹이로 사용하여 hM2A 대식세포에서 식세포작용을 촉진하는 것이 입증되었다(도 6, 7, 및 10 참조). TREM2에 결합하고(문헌[Kober, C and Bret, TJ J Mol Biol, 2017. 429(11):p.1607-1629]), 원형질 막의 세포사멸 세포에 노출되어 있는 리간드로서 포스파티딜세린이 기재되어 있다. 또한, 생체 내 TREM2는 세포 잔해 제거에 관여하는 것으로 보인다. 따라서, 세포사멸 SH-SY5Y 세포는 pH 민감성 염료 pHrodo로 표지되어, 식세포 먹이로 사용되었다(도 11). 유사하게, 항-TREM2 항체 MOR044698 및 MOR044746와 사전-배양한 pHrodo 표지된 황색포도상구균(Staph. Aureus)으로 얻은 결과로 2개의 이소타입 대조군 항체 MOR03207 및 ACE27716과 비교하여 3~12시간에 걸쳐 M2A 대식세포의 식세포 능력을 증가시켰다.
요컨대, 도 6, 7, 10 및 11은 항-TREM2 항체 MOR044698 및 MOR044746이 2개의 다른 먹이와 2개의 다른 실험 판독값을 사용할 때 M2A 대식세포의 식세포 능력을 증가시킨다는 것을 입증한다
TREM2는 파골세포의 화학주성 반응에 관여하는 것으로 나타났다(문헌[Humphrey et al. J Bone Min Res, 2006. 21:237-245. 201(4):p.647-657]). 따라서, 항-TREM2 항체가 화학주성 반응에 미치는 영향은 인간 M2a 대식세포에서 평가되었다. 20 ng/ml의 화학유인제 C5a를 100 nM MOR044698 또는 MOR044746과 함께 사용하면, 두 이소형 대조군 항체 MOR03207 및 ACE27716과 비교하여 화학주성의 통계적으로 유의한 향상이 관찰되었다(도 12 참조).
이 실험은 MOR044698 및 MOR044746이 두 번째 TREM2 의존성 생리학적 세포 판독(화학주성)에서 인간 M2A 대식세포에서 효능을 나타냄을 보여준다.
유사하게, 항-TREM2 항체 MOR044698 및 MOR044746을 갖는 인간 iPS 유래 미세아교세포 유사 세포의 인간 M2A 대식세포 사전배양으로 얻은 결과에 대해, 2개의 이소타입 대조군 항체 MOR03207 및 ACE27716과 비교하여 20시간에 걸쳐 pHrodo 표지된-세포사멸 SH-SY5Y 세포의 식세포 용량을 증가시켰다(도 13 참조).
TREM2는 미세아교세포의 화학주성 반응에 관여하는 것으로 나타났다(문헌[Takahashi, K et al. J Exp Med, 2005. 201(4):p.647-657]). 따라서, 항-TREM2 항체가 화학주성 반응에 미치는 영향은 인간 iPS 유래 미세아교세포 유사 세포에서 평가되었다. 20 ng/ml의 화학유인제 C5a를 100nM MOR044698 또는 MOR044746과 함께 사용하면, 두 이소형 대조군 항체 MOR03207 및 ACE27716과 비교하여 화학주성의 통계적으로 유의한 향상이 관찰되었다(도 14 참조).
이들 실험은 MOR044698 또는 MOR044746이 다른 인간 유래 세포 시스템(미세아교세포) 및 제2 TREM2 의존성 생리학적 세포 판독(화학주성)에서 식세포 효능을 증가시킨다는 것을 보여준다.
인간화 TREM2 Crispr-녹-인 마우스에서 큐프리존 모델
큐프리존 모델에서 뮤린화된 MOR44698 TREM2 항체의 예방적/수반되는 치료
도 15a에 도시된 바와 같이, Luxol 패스트 블루(fast blue)는 뇌량(CC)내 수초의 차이를 감지하지 못했다. 이는 MRI(도 15b)에 따른 것으로, CC에서 MTR의 뚜렷한 차이를 보이지 않았다. 미세아교세포 마커 Iba1에 대한 정량적 면역조직학적 분석은 이소타입보다 44698 처리된 마우스에서 CC에서 감소된 수(도 15c) 및 더 낮은 활성화 상태(도 15d)를 보여주었다. 이것은 CC에서 감소된 MRI 강도를 관찰한 MRI와 일치하는 것이다(도 15e).
큐프리존 모델에서 뮤린화된 MOR44698 TREM2 항체의 치료적 치료
도 15a에 도시된 바와 같이, Luxol 패스트 블루(fast blue)는 3207에 비해 CC에서 수초의 유의한 증가를 감지하였다. 이는 44698 처리된 CC에서 MTR의 증가를 보이지 않았던 MRI와 일치하는 것이다(도 15b). 미세아교세포 마커 Iba1에 대한 정량적 면역조직학적 분석은 이소타입 대조군과 비교하여 44698 처리된 마우스에서 CC에서 수(도 15c) 및 활성화 상태(도 15d)에 차이가 없음을 보여주었다. 이것은 치료 그룹간 CC에서 MRI 강도의 변화가 없었던 MRI와 일치하는 것이다(도 15e).
이러한 데이터는 44698 항-TREM2 항체가 치료적으로 제공되는 경우 수초화 과정에 유익한 효과를 가지며, 미세아교세포 수 및 활성화를 변경시킴을 나타내며, 이는 임상적 고립 증후군, 원발성 진행성 MS, 재발-완화성 MS, 마르부르크 다발성 경화증 및 이차 진행성 Ms를 포함하는 다발성 경화증, 길랑-바레(Guillain-Barr
Figure pct00085
) 증후군 및 그의 만성 카운터파트, 만성 염증성 탈수초성 다발신경병증, 항-MAG 말초 신경병증, 샤르코-마리-투스(Charcot-Marie-Tooth)병 및 그의 카운터파트, 욕창에 대한 책임이 있는 그에 상응하는 유전성 신경병증, 비타민 B12 결핍-관련 신경병증, 발로(Balo) 동심성 경화증, 쉴더(Schilder)의 미만성 경화증, 및 데빅(Devic)병, 중심성 뇌교 수초 용해증, 척수매독과 같은 척수병증(매독성 척수병증), 백혈병증, 예컨대 진행성 다초점 백질뇌병증(JC 바이러스 활성화로 인함), 백질이영양증, 시신경염, 횡척수염, 시신경 척수염, 구리 결핍-관련 병태(말초 신경병증, 척수병증 및 시신경병증), 진행성 염증성 말초 신경병증, 만성 염증성 탈수초성 다발신경병증(CIDP) 및, 염증성 탈수초성 질환이라는 용어로 요약되는 기타 면역계 관련 장애를 포함하지만, 이들로 한정되지 않는 중추 또는 말초 신경계 모두에서 탈수초화가 발생하거나 재수초화가 바람직한 임의의 질환에서 TREM2 항체의 잠재적인 치료적 이점을 의미한다.
인간화 TREM2 Crispr-녹-인 마우스에서 MPTP 모델
MPTP 처리 7일 후 동물을 죽이고, 관상 뇌 자유-부동 섹션에서 면역형광을 수행하였다. 티로신 하이드록실라제(TH)를 항체로 염색하고, 현미경 사진을 찍고, 선조체에서 염색된 영역을 Fiji 소프트웨어로 정량화하였다. TH는 도파민성 뉴런에 의해 특이적으로 발현되며, 사망시 흑질에 존재하는 도파민성 세포가 긴 축삭으로 돌출되는 선조체에서 TH 감소가 관찰될 수 있다.
도 16a에 도시된 바와 같이, MPTP 및 이소타입 대조군 3207로 처리된 동물은 나이브 동물(처리되지 않은 대조군 야생형)에 비해 선조체(% 영역)에서 상당히 감소된 TH-양성 염색을 보였고, 44698-처리된 마우스는 이소타입 대조군을 가진 동물보다 실질적으로 더 많은 TH 염색을 나타냈다. 도 16b는 상이한 처리 군으로부터 선조체의 대표적인 현미경 형광 사진(배율 10배)이다.
이 데이터는 파킨슨 병, 다계통 위축증, 진행성 핵상마비, 피질 기저핵변성, 및 루이체 치매(DLB), 시뉴클레인병증, 타우병증, 윌슨 병, 뇌 철분 축적을 동반한 신경변성, 특발성 기저핵 석회화, 전두측두엽 치매 및 17번 염색체와 관련된 파킨슨증, 취약X 관련 떨림/운동 실조 증후군, 허혈성 뇌졸중, 출혈성 뇌졸중, 일시적인 허혈 발작, 운동 뉴런 질환(MND) 또는 루게릭(Lou Gehrig's)병으로도 알려져 있는 근위축성 측삭경화증(ALS), 원발성측삭경화증(PLS), 진행성 근위축증(PMA), 진행성 구마비, 가성구마비, 및 단지양 근위축증(MMA), 전두측두엽 치매(FTD), 행동장애형 전두측두엽 치매, 의미 변이 원발 진행 실어증, 비유창 변이 원발 진행 실어증, 피질기저핵 증후군, 진행성 핵상마비, 및 운동 뉴런 질환, 픽(Pick's)병, 전두측두엽 변성, 알코올성 치매, 혈관성 치매, 피질기저핵 변성 및 크로이츠 펠트-야콥(Creutzfeldt-Jakob)병과 관련된 FTD를 포함하지만 이들로 한정되지 않은 신경변성 질환에 대한 일반적인 잠재적 이점을 암시하는 TREM2 항체의 잠재적인 신경보호 효과를 나타낸다.
실시예 3: 교차-차단 실험
재료 및 방법
CHO-hDAP12-hTREM2 세포를 사용하여 전체 IgG MOR041877(IgSF 결합제), MOR41895 (결합을 위해 스톡 및 IgSF 필요), MOR042596(IgSF 결합제 및 MOR044698의 모체), MOR044698 및 MOR03207(이소타입 대조군)과 함께 Fab MOR041877 또는 Fab MOR041895 또는 Fab MOR042596의 교차-차단 활성을 평가하였다. TREM2의 세포 표면 발현을 증가시키기 위해 5 μM DPC333이 보충된 배양 배지에서 CHO-hDAP12-hTREM2 세포를 밤새 배양하였다. 다음날, CHO-hDAP12-hTREM2 세포를 아큐타제로 분리하고, PBS로 1회 세척한 다음, FACS 완충액(PBS, 2% FBS, 0.5 mM EDTA, pH 8.0)에 4×106 세포/ml의 농도로 재현탁하였다. Fab 단편들 MOR041877, MOR041895 및 MOR042596을 Invitrogen으로부터의 제조업체 프로토콜 MAN0006869에 따라 Alexa Fluor 647(AF647)로 표지하였다. 100 nM의 전체 IgG 항체를 15 μl의 세포 현탁액과 30 μl의 총 부피로 혼합하고, 얼음 위에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 세포를 PBS로 1회 세척하고, 100 nM의 AF647-표지된 Fab 단편과 함께 얼음 위에서 30분 동안 인큐베이션하고, PBS로 2회 세척하고, 세포 고정 완충액(Biolegend)으로 고정시키고, FACS 완충액에 재현탁하였다. 획득을 BD FACS canto 장치에서 수행하였다.
결과
Fab 단편 MOR041877의 결합은 MOR041895(도 17a)와의 사전 인큐베이션에 의해 영향을 받지 않는데, 이는 이소형 대조군 MOR03207과의 사전 인큐베이션에서 또는 임의의 사전 처리(마지막 컬럼) 없이 유사한 신호가 달성되기 때문이다. MOR042596 및 MOR044698과의 사전 인큐베이션은 Fab MOR041877의 결합을 강하게 감소시켜, 이들 3개의 항체에 대한 중첩 에피토프를 보여준다. Fab MOR41895의 결합은 MOR041877, MOR044698 또는 MOR042596이 아닌, 이 Fab가 유래된 전체 IgG와의 사전 인큐베이션에 의해 감소된다. 전체 IgG MOR041877, MOR044698 및 MOR042596과 TREM2의 결합은 Fab41895에 대한 접근을 용이하게 하여 신호 강도를 증가시키는 것으로 보인다(도 17b). 마지막으로, 전체 IgG MOR041877, MOR044698 또는 MOR042596의 사전-결합은 Fab MOR042596의 이후 결합을 완전히 억제하여, MOR041877 및 MOR044698이 MOR042596과 동일한 에피토프를 공유함을 입증한다(도 17c). 요약하면, 이들 실험은 친화성 성숙된 MOR044698이 모 항체 MOR042596과 동일한 에피토프에 결합함을 보여준다.
실시예 4: MOR041877 및 MOR042596의 특성화
항체 MOR041877 및 MOR042596은 CHO-hDAP12-hTREM2 세포에서 재조합적으로 발현된 인간 TREM2 뿐만 아니라 인간 M2A 대식세포에서 발현된 TREM2에 결합하며, THP-B5 세포에서 TREM2 의존적 리포터-유전자 활성을 활성화한다(표 29 참조). 이 데이터는 두 항체 모두 TREM2에 대한 높은 친화성을 나타내고, TREM2를 직접 활성화한다는 것을 보여준다.
[표 29]
Figure pct00086
또한, hM2A 대식세포를 100 nM의 항-TREM2 항체 MOR042596 또는 이소타입 대조군(MOR03207)으로 처리하였다. 16~20시간 후, 세포를 식세포 먹이로서 다양한 농도의 pHrodo-표지된 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)을 사용하여 식세포작용 분석을 수행하였다. MOR042596은 사용된 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)의 전체 농도 범위에 걸쳐 hM2A 대식세포의 식세포 능력을 크게 증가시켰다(도 18). 이것은 MOR042596이 M2A 대식세포에서 TREM2 신호전달 및 TREM2 의존적 이펙터 기능을 증가시킨다는 것을 나타낸다.
실시예 5: 인간 TREM2/MOR042596 Fab 복합체의 X-선 결정 구조
MOR042596의 Fab 단편(서열 번호 15의 잔기 1~222, 및 서열 번호 82의 잔기 1~214)에 결합된 인간 TREM2(서열 번호 1의 잔기 19~174, 이어서 His-tag; 서열 번호 139)의 결정 구조를 결정하였다. 하기에 설명된 바와 같이, 복합체의 개별 구성요소는 별도의 발현 시스템을 사용하여 생산되었으며, 결합되어 정제된 복합체를 생성하였다. 그런 다음 X-선 결정학을 사용하여 MOR042596에 결합된 TREM2에 대한 회절 데이터를 생성하여, 항원-결합 부위를 설명하였다.
서열 번호 139
Figure pct00087
단백질 생산
인간 TREM-2 (서열 번호 1의 잔기 19~174, 이어서 His-tag; 서열 번호 139)를 대규모 일시적 형질감염에 의해 포유동물 세포에서 발현하였다. 간단히 말해, 플라스미드 DNA를 폴리에틸렌 아민(PEI 25k, PolyScience)과 1:2로 혼합하고, 30분 동안 미셸 복합체를 형성하도록 하였다. 개시 시딩 배양액은 1L 배양액 당 2 mg DNA 및 4 mg PEI를 가졌다. HEK 293-6E 세포(Invitrogen)에 상기 혼합물을 2 μg DNA: 3×106 세포의 비율로 첨가하여, 형질감염을 달성하였다. 37℃ 및 5% CO2의 통기 플라스크에서 진탕하면서 V3 배지(Bioconcept Ltd. Amimed)에서 세포를 성장시켰다. 형질감염 후 130시간에 배양 상청액을 수집하고, 50 mM Tris pH 8.5, 300 mM NaCl, 5% 글리세롤 및 10 mM 이미다졸을 첨가하여 변형한 다음, NiNTA-친화성 크로마토그래피를 사용하여 정제하였다. 20 mM 이미다졸을 함유하는 동일한 완충액을 사용하여 컬럼에서 단백질을 세척하고, 250 mM 이미다졸에서 용리하였다. 50 mM Tris pH 7.5, 150 mM NaCl, 10% 글리세롤을 함유하는 완충액으로 크기 배제 크로마토그래피(superdex 75)에 의해 TREM2를 추가로 정제하였다. 생성된 단백질은 SDS-PAGE로 평가했을때 >90% 순수했다.
MOR042596의 생산을 위해, 진핵 HEK293-T 세포는 이황화-가교된 FabCys의 중쇄 및 경쇄 둘 다를 코딩하는 포유류 발현 벡터 DNA로 형질감염시켰다. 형질감염 후 7일차에 세포 배양 상청액을 수확하고, CH1 친화성 크로마토그래피(Capture Select IgG-CH1, Thermo Scientific)를 실시하였다. 완충액 교환을 20 mM Tris, 100 mM NaCl pH 7.5로 수행하고, 샘플을 살균 여과하였다(0.2 μm 기공 크기). 단백질 농도를 UV 분광광도법으로 측정하고 FabCys의 순도는 SDS-PAGE를 사용하여 변성, 환원 및 비환원 조건 하에서 분석하였다. HP-SEC를 수행하여 천연 상태에서 FabCys 제제를 분석하였다.
TREM2 - MOR042596 Fab 복합체의 시험관 내 재구성
다음, 정제된 TREM2를 1:1의 몰비(OD A280에 의해 농도 측정함)로 MOR042596 Fab와 혼합하였다. 그 다음 복합체를 농축시킨 다음, 50 mM Tris pH 7.5, 150 mM NaCl, 5% 글리세롤로 평형화된 Superdex 75 컬럼(GE Healthcare Life Sciences) 상에 로딩하였다. 피크 분획을 SDS-PAGE로 분석하고, 선택된 분획은 결정화 시험을 위해 결합시켰다.
결정화 및 구조 결정
TREM2-MOR042596 Fab 복합체를 7.5 mg/ml로 농축한 다음, 20,000 × g에서 10분 동안 원심분리한 다음, 결정화 스크린을 분배하였다. 시팅 드롭 증기 확산 셋업(sitting drop vapor diffusion setup)을 사용하여 20℃에서 결정을 성장시켰다. 0.2 μl의 TREM2-MOR42596 복합체를 20% PEG3350, 0.2M 칼륨 나트륨 타르트레이트를 함유하는 0.2 μl의 저장소 용액과 혼합하고, 80 μl의 저장소 용액에 대해 드롭을 평형화하였다. 20% 글리세롤을 극저온 증착제로 사용하여 모액에서 결정을 수확하고 액체 질소에서 직접 순간-동결시켰다.
스위스 광원 빔라인 X10SA(스위스 소재의 Villigen)에서 PILATUS 6M 검출기로 1.000 Å 파장에서 데이터 세트를 수집하였다. 0.25° 진동 각 웨지에서 기록된 회절 이미지는 XDS 및 XSCALE(문헌[Kabsch W, 1993. Automatic processing of rotation diffraction data from crystals of initially unknown symmetry and cell constants J.Appl.Cryst. 26: 795-800])을 각각 APRV 프로그램 제품군(문헌[Kroemer M, Dreyer MK, Wendt KU 2004. APRV - a program for automated data processing, refinement and visualization. Acta Cryst. D60: 1679-82])에서 사용하여 처리 및 스케일링하였다. 페이저(Phaser)(문헌[McCoy AJ, Grosse-Kunstleve RW, Adams PD et al. 2007. Phaser crystallographic software. J.Appl.Cryst. 40: 658-74]) 및 연구 모델로서의 Fab 및 TREM2 Ig 도메인의 상동성 모델을 사용하여, 분자 대체에 의해 초기 구조를 수득하였다. 모델의 수동 재구축 및 후속 구조 개선은 쿠트(Coot)(Emsley P, Cowtan K (2004) Coot: model-building tools for molecular graphics. Acta Cryst. D60: 2126-32.) 및 오토부스터(autoBuster)(Bricogne G, Blanc E, Brandl M et al. (2009) BUSTER, 버전 2.8.0. Cambridge, UK, Global Phasing Ltd.)에서 각각 수행하였다.
hTREM2에 대한 MOR042596-결합 에피토프의 설명
상기 기재한 바와 같이, 본 발명자들은 인간 TREM2/MOR042596 Fab 복합체의 X-선 공-결정 구조를 수득하였다. 도 19는 MOR042596과 상호작용하는 TREM2 잔기의 개요를 보여준다.
TREM2/MOR042596-Fab 복합체 구조로부터, 본 발명자들은 표 30에 제공된 huTREM 상의 3개의 개별 서열 영역을 포함하는 TREM2 에피토프를 추론한다. 모든 hTREM2 이소형(서열 번호 1~3)은 신호 펩타이드 및 전체 IgSF 도메인을 포함하는 제1 161개의 잔기를 공통적으로 가지며; 따라서, 하기(예를 들어 표 30, 31 및 33)에서와 같이 본 범위내 에피토프 및 잔기 넘버링(즉, 잔기 R161까지 및 포함)은 3개의 모든 hTREM2 이소형과 동일하다.
[표 30]
Figure pct00088
MOR044698과 MOR042596 사이의 유사성 및 MOR044698에 결합하는 hTREM2 에피토프
도 19에 도시된 바와 같이, hTREM2는 MOR042596의 중쇄 및 경쇄 둘 다와 상호작용한다. 밀접하게 관련된 Fab MOR044698은 MOR042596을 갖는 6개의 TREM2-결합 부위 중 5개, 즉 HCDR1, HCDR2, HCDR2, LCDR1 및 LCDR2에 동일한 서열을 공유하며, LCDR3만 상이하다. TREM2/MOR042596 Fab 복합체 구조에서 5 Å 거리 내에 있는 TREM2 잔기 뿐만 아니라 이러한 루프의 서열은 표 31에 제공되며, MOR042596 및 MOR044698의 LCDR3 서열들의 비교는 표 32에 제공된다.
[표 31]
Figure pct00089
[표 32]
Figure pct00090
두 Fab 간의 LCDR3 차이의 구조적 의미를 측정하기 위해 MOR044698에 대한 상동성 모델을 구축하였다. 본 발명자들은 MOR042596의 결정 구조를 템플릿으로 사용하고, 표준 설정에서 모델링 소프트웨어로 CCG MOE 릴리스 2018.01을 사용하여 모델을 구축하였다[Molecular Operating Environment (MOE), 2018.01; Chemical Computing Group ULC: Montreal, QC, Canada, 2018]. 도 20은 TREM2에 대한 두 Fab의 인터페이스를 보여준다. HCDR1-3 및 LCDR1-2이 동일하며, 논의할 유일한 차이점은 LCDR3이다. 표 32에서 수집될 수 있는, 몇 가지 보존된 잔기들(예를 들어 LCDR3 루프 형태에 결정적으로 영향을 미치는 Pro95)이 있다. TREM2와 2개의 Fab의 인터페이스에서 MOR042596과 MOR044698을 비교하는 주요 변경/돌연변이가 발생하는 세 위치가 있다: 글리신 92는 아르기닌으로 변경, 세린 94는 메티오닌으로 변경 및 MOR044698의 경우, 위치 95a에 세린 삽입. 세린 95a 삽입은 주요 형태 변화를 일으키지 않고 단백질 백본의 약간의 적응을 유발한다. 위치 92 및 94의 나머지 두 가지 주요 아미노산 변화는 측쇄의 주요 변화를 나타내면서, MOR042596 결정 구조에서 관찰되는 LCDR3의 기존 루프 구조에 TREM2와의 충돌이나 바람직하지 않은 접촉을 일으키지 않고 구축될 수 있다. 위치 89, 91 및 96에는 추가 차이가 있다. 위치 89 및 96은 TREM2와의 어떠한 접촉에도 관여하지 않으며, 위치 91에서의 히스티딘-티로신 돌연변이는 측쇄 형태의 작은 적응만으로 허용된다. 전체적으로, 중쇄가 동일하고 경쇄가 LCDR1 및 LCDR2에서 동일하며, LCDR3은 MOR044698에서 TREM2에 대한 변경되지 않은 루프 형태 및 보존된 접촉을 갖는 것으로 나타나므로, 본 발명자들은 TREM2 에피토프가 2개의 Fab MOR042596과 MOR044698 사이에서 동일한 것으로 결론지었다.
인간 TREM2/MOR041877 Fab 복합체의 X-선 결정 구조
MOR041877의 Fab 단편(서열 번호 95의 잔기 1~224, 및 서열 번호 106의 잔기 1~216)에 결합된 인간 TREM2(서열 번호 1의 잔기 19~174, 이어서 His-tag; 서열 번호 139)의 결정 구조를 결정하였다. 하기에 설명된 바와 같이, 복합체의 개별 구성요소는 별도의 발현 시스템을 사용하여 생산되었으며, 결합되어 정제된 복합체를 생성하였다. 그런 다음 X-선 결정학을 사용하여 MOR041877에 결합된 TREM2에 대한 회절 데이터를 생성하여, 항원-결합 부위를 설명하였다.
단백질 생산
인간 TREM-2 단백질은 MOR042596에 대해 상기 기재한 바와 같이 발현 및 정제하였다.
MOR041877의 생산을 위해, 진핵 HKB11 세포는 이황화-가교된 FabCys의 중쇄 및 경쇄 둘 다를 코딩하는 포유류 발현 벡터 DNA로 형질감염시켰다. 형질감염 후 3일차에 또는 7일차에 세포 배양 상청액을 수확하고, CH1 친화성 크로마토그래피(Capture Select IgG-CH1, Thermo Scientific)를 실시하였다. 완충액 교환을 1X 둘베코 PBS(pH 7.2, Invitrogen)로 수행하고, 샘플을 살균 여과하였다(0.2 μm 기공 크기). 단백질 농도를 UV 분광광도법으로 측정하고 FabCys의 순도는 CE-SDS(LabChip GXII, Perkin Elmer)를 사용하여 변성, 환원 및 비환원 조건 하에서 분석하였다. HP-SEC를 수행하여 천연 상태에서 FabCys 제제를 분석하였다.
TREM2 - MOR041877 Fab 복합체의 시험관 내 재구성
다음, 정제된 TREM2를 1:1의 몰비(OD A280에 의해 농도 측정함)로 MOR042596 Fab와 혼합하였다. 그 다음 복합체를 농축시킨 다음, 50 mM Tris pH 7.5, 150 mM NaCl, 5% 글리세롤로 평형화된 Superdex 75 컬럼(GE Healthcare Life Sciences) 상에 로딩하였다. 피크 분획을 SDS-PAGE로 분석하고, 선택된 분획은 결정화 시험을 위해 결합시켰다.
결정화 및 구조 결정
TREM2-MOR042596 복합체를 7.5 mg/ml로 농축한 다음, 20,000 × g에서 10분 동안 원심분리한 다음, 결정화 스크린을 분배하였다. 시팅 드롭 증기 확산 셋업(sitting drop vapor diffusion setup)을 사용하여 20℃에서 결정을 성장시켰다. 0.2 μl의 TREM2-MOR41877 복합체를 20% PEG3350, 0.2M 칼륨 나트륨 타르트레이트를 함유하는 0.2 μl의 저장소 용액과 혼합하고, 80 μl의 저장소 용액에 대해 드롭을 평형화하였다. 20% 글리세롤을 극저온 증착제로 사용하여 모액에서 결정을 수확하고 액체 질소에서 직접 순간-동결시켰다.
스위스 광원 빔라인 X10SA(스위스 소재의 Villigen)에서 PILATUS 6M 검출기로 1.000 Å 파장에서 데이터 세트를 수집하였다. 0.25° 진동 각 웨지에서 기록된 회절 이미지는 XDS 및 XSCALE(문헌[Kabsch WJ 1993])를 각각 APRV 프로그램 제품군(문헌[Kroemer M et al. 2004])에서 사용하여 처리 및 스케일링하였다. 페이저(Phaser)(문헌[McCoy AJ et al., 2007]) 및 연구 모델로서의 Fab 및 TREM2 Ig 도메인의 상동성 모델을 사용하여, 분자 대체에 의해 초기 구조를 수득하였다. 모델의 수동 재구축 및 후속 구조 개선은 쿠트(Coot)(문헌[Emsley P, Cowtan K (2004) Coot: 2004]) 및 오토버스터(autoBuster)(문헌[G et al. 2009])에서 각각 수행하였다.
hTREM2에 대한 MOR041877-결합 에피토프의 설명
상기 기재한 바와 같이, 본 발명자들은 인간 TREM2/MOR041877 Fab 복합체의 X-선 공-결정 구조를 수득하였다. 도 21은 MOR041877과 상호작용하는 TREM2 잔기의 개요를 보여준다.
TREM2/ MOR041877 Fab 복합체 구조로부터, 본 발명자들은 표 33에 도시된 바와 같이, MOR041877에 대한 TREM2 에피토프 결합을 추론한다.
[표 33]
Figure pct00091
TREM2/ MOR041877 Fab 복합체 구조에서 5 Å 거리 이내의 TREM2 잔기 뿐만 아니라 HCDR 및 LCDR 루프의 서열은 표 34에 제공된다.
[표 34]
Figure pct00092
실시예 6: 3-주 큐프리존 모델에서 뮤린화된 TREM2 항체(MOR044698-mu)의 예방적/수반되는 치료
큐프리존 모델은 말초 면역계의 경미한 관여만으로 CNS에서 수초화 과정을 연구하기 위한 독소-유도 탈수초화 모델이다. 구리 킬레이터인 큐프리존은 미토콘드리아 손상을 유발하고 결국 희소돌기아교세포 세포사를 유도하는 반면, 희소돌기아교세포 전구체 세포는 영향을 받지 않고 여전히 적절한 기능(증식, 성숙 및 재수초화)을 발휘할 수 있다. 큐프리존 모델은 예를 들어 말초 면역 세포를 침범하지 않고 재수초화를 향상시키는 MS와 같은 탈수초성 질환에 대한 재생 치료 패러다임을 테스트하는 데 적합하다.
인간화 TREM2 마우스는 CRISPR/Cas 기술에 의해 소 성장 호르몬 폴리A 신호 서열을 포함하는 인간 TREM2 cDNA를 마우스 TREM2 유전자의 ATG에 도입함으로써 생성되었다. 파운더 계통(Founder line)은 골수-유래 대식세포와 뇌의 미세아교세포에서 hTREM2의 발현을 특징으로 한다. 그런 다음, 이식 유전자의 통합은 표적 유전자좌 증폭(TLA)에 의해 확인되었다.
인간화 TREM2 Crispr-녹-인 마우스(hTREM-KI)를 3주 동안 큐프리존(식품 중 0.2%)으로 처리하고, 1일 전 및 이후 매주 2회 MOR044698-mu(서열 번호 140의 경쇄 서열 및 서열 번호 141의 중쇄 서열 포함) 및 이소타입 대조군 MOR03207(짧은: 3207) 복강내, 30 mg/kg로 처리하였다. 항체와 큐프리존으로 3주 예방/병용 치료 후 동물을 죽이고 관상 자유-부유 뇌 절편(20~30 μm 두께)에 대한 조직학을 수행하였다. TREM2 및 Iba1 항체는 미세아교세포 내 hTREM2 수준을 평가하는데 사용하였다.
도 22a, b에 도시된 바와 같이, 피질의 Iba1-양성 미세아교세포 내 hTREM2 수준은 3-주 큐프리존 모델에서의 이소타입보다 MOR044698-mu 처리된 동물에서 약 3배 더 높았다. hTREM2(AF1828 항체로 염색)의 정량화는 임계값(Iba1, 녹색: 10, TREM2, 적색: 15)을 사용하여 Fiji(8-비트로 전환)에 의해 형광 tiff 이미지(스택 최대화 및 이미지 조정없이 tiff 스냅샷으로 내보내기, 20X)를 정량화하여 수행하였다. 판독결과: % 영역; TREM2 %영역은 Iba1 %영역(x100), 동물 당 피질에서 평균 2개의 이미지 스택, 염색된 동물 당 2개의 뇌 섹션, 뇌 섹션 당 1개의 이미지 스택으로 정규화된다.
결론
이러한 데이터는 MOR044698을 사용한 전신 치료가 뇌에서 미세아교세포에서 TREM2를 안정화시켜 그의 수준을 증가시키고 TREM2 신호전달 및 기능을 향상시킬 수 있음을 나타낸다.
요약
요약하면, TREM2의 구성적 또는 염증-유발 부분절단을 감소시켜 TREM2의 세포 활성을 증가시킴으로써 인간 세포 시스템(즉, 대식세포 또는 미세아교세포)에서 TREM2의 기능을 촉진하는 TREM2 항체를 확인하기 위한 전략이 사용되었다. 이러한 항체는 다양한 신경변성 질환의 치료에 유용하다.
항-TREM2 항체(hTREM2 항체)가 확인되었으며, 이들은 인간 M2A 대식세포에 대한 나노몰 이하의 세포 친화도로 결합하며, 공여체 대 공여체 가변성을 거의 나타내지 않는다. 본 항체는 인간 TREM2의 IgSF 도메인에 결합하고, 사이노몰구스 TREM2도 인식한다. 이것은 시험관 내 ELISA 뿐만 아니라 세포주 모두에서 입증되었다. 놀랍게도, TREM2에 대한 이러한 항체의 결합은 인간 M2A 대식세포로부터 TREM2 엑토도메인의 부분절단을 억제하고, 결과적으로 세포 표면에서 TREM2 발현을 증가시킨다. 기능적으로, 본 TREM2 항체는 또한, 식세포 능력을 증가시키고, 또한 인간 대식세포에서 뿐만 아니라 인간 iPS 유래 미세아교세포-유사 세포에서 C5a 매개 화학주성을 향상시킨다. 또한, 본 항체는 또한, 인간 대식세포 뿐만 아니라 인간 iPS 유래 미세아교세포-유사 세포의 화학주성을 향상시킨다. 본 항체는 또한, NFAT 의존성 세포 리포터 유전자 분석 뿐만 아니라 TREM2 자극 후 인간 대식세포에서 증가된 syk 인산화에 의해 TREM2를 직접 활성화한다.
본 항체는 TREM2에 대해 높은 특이성을 나타내고, 임의의 다른 표적에 결합하지 않으며, 완전한 인간 항체이다. 본 항체는 IgSF 영역 내의 TREM2 상의 새로운 에피토프에 결합하는 것을 나타내며, TREM2를 안정화시키고 활성화시키는 것으로 나타났다.
본 항체는 또한, 개발에 대한 적합성을 기준으로 선택되었다: 예를 들어 본 항체는 CDR 내 번역 후 변형이 없고, 응집하지 않으며, 세포 시스템에 의해 다량으로 생산되며, 클리핑 생성물을 나타내지 않으며, 잘 정의된 융점 및 등전점을 나타낸다. 마지막으로, 그들의 증가된 반감기는 뇌에서 더 오래 지속되는 효과를 가져오며, 용량 최적화를 통해 원하는 임상 효과를 달성하고 투여 빈도를 줄여 환자 순응도를 높일 수 있게 한다.
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Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser 245 250 255 Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp 260 265 270 Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn 275 280 285 Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val 290 295 300 Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu 305 310 315 320 Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys 325 330 335 Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr 340 345 350 Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr 355 360 365 Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu 370 375 380 Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu 385 390 395 400 Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys 405 410 415 Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu 420 425 430 Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 435 440 445 Lys <210> 120 <211> 1347 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 120 gaggtgcaat tggtggaaag cggcggtggc ctggtgaaac caggcggcag cctgcgcctg 60 agctgcgccg cctccggatt caccttttct tcttacgcta tggactgggt gcgccaggcc 120 ccgggcaaag gtctcgagtg ggtgggccgt atcaaatcta aagctgactc ttacactgct 180 gactatgccg ccccagtgaa aggccgcttt accattagcc gcgatgattc gaaaaacacc 240 ctgtatctgc aaatgaacag cctgaaaacc gaagatacgg ccgtgtatta ttgcgcgcgt 300 tctcattact ctgctttcgc ttactggggc caaggcaccc tggtgactgt tagctcagcc 360 tccaccaagg gtccatcggt cttccccctg gcaccctcct ccaagagcac ctctgggggc 420 acagcggccc tgggctgcct ggtcaaggac tacttccccg aaccggtgac ggtgtcgtgg 480 aactcaggcg ccctgaccag cggcgtgcac accttcccgg ctgtcctaca gtcctcagga 540 ctctactccc tcagcagcgt ggtgaccgtg ccctccagca gcttgggcac ccagacctac 600 atctgcaacg tgaatcacaa gcccagcaac accaaggtgg acaagagagt tgagcccaaa 660 tcttgtgaca aaactcacac atgcccaccg tgcccagcac ctgaagcagc ggggggaccg 720 tcagtcttcc tcttcccccc aaaacccaag gacaccctca tgatctcccg gacccctgag 780 gtcacatgcg tggtggtgga cgtgagccac gaagaccctg aggtcaagtt caactggtac 840 gtggacggcg tggaggtgca taatgccaag acaaagccgc gggaggagca gtacaacagc 900 acgtaccggg tggtcagcgt cctcaccgtc ctgcaccagg actggctgaa tggcaaggag 960 tacaagtgca aggtctccaa caaagccctc ccagccccca tcgagaaaac catctccaaa 1020 gccaaagggc agccccgaga accacaggtg tacaccctgc ccccatcccg ggaggagatg 1080 accaagaacc aggtcagcct gacctgcctg gtcaaaggct tctatcccag cgacatcgcc 1140 gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag aacaactaca agaccacgcc tcccgtgctg 1200 gactccgacg gctccttctt cctctacagc aagctcaccg tggacaagag caggtggcag 1260 caggggaacg tcttctcatg ctccgtgatg catgaggctc tgcacaacca ctacacgcag 1320 aagagcctct ccctgtctcc gggtaaa 1347 <210> 121 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 121 Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn Ser Val Asn 1 5 10 <210> 122 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 122 Arg Asn Ser Asn Arg Pro Ser 1 5 <210> 123 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 123 Ser Ala Phe Asp Glu Ser Thr Lys Gly Val Val 1 5 10 <210> 124 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 124 Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn Ser 1 5 <210> 125 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 125 Arg Asn Ser 1 <210> 126 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 126 Phe Asp Glu Ser Thr Lys Gly Val 1 5 <210> 127 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 127 Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn Ser 1 5 <210> 128 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 128 Asp Ile Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn 20 25 30 Ser Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Arg Asn Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu Gln 65 70 75 80 Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ala Phe Asp Glu Ser Thr 85 90 95 Lys Gly Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 110 <210> 129 <211> 330 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 129 gatatcgtgc tgacccagcc gccgagcgtg agcggtgcac cgggccagcg cgtgaccatt 60 agctgtagcg gcagcagcag caacattggt tctaactctg tgaactggta ccagcagctg 120 ccgggcacgg cgccgaaact gctgatctac cgtaactcta accgcccgag cggcgtgccg 180 gatcgcttta gcggatccaa aagcggcacc agcgccagcc tggcgattac cggcctgcaa 240 gcagaagacg aagcggatta ttactgctct gctttcgacg aatctactaa aggtgttgtg 300 tttggcggcg gcacgaagtt aaccgtccta 330 <210> 130 <211> 216 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 130 Asp Ile Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn 20 25 30 Ser Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Arg Asn Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu Gln 65 70 75 80 Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ala Phe Asp Glu Ser Thr 85 90 95 Lys Gly Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln 100 105 110 Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu 115 120 125 Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr 130 135 140 Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys 145 150 155 160 Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr 165 170 175 Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His 180 185 190 Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys 195 200 205 Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser 210 215 <210> 131 <211> 648 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 131 gatatcgtgc tgacccagcc gccgagcgtg agcggtgcac cgggccagcg cgtgaccatt 60 agctgtagcg gcagcagcag caacattggt tctaactctg tgaactggta ccagcagctg 120 ccgggcacgg cgccgaaact gctgatctac cgtaactcta accgcccgag cggcgtgccg 180 gatcgcttta gcggatccaa aagcggcacc agcgccagcc tggcgattac cggcctgcaa 240 gcagaagacg aagcggatta ttactgctct gctttcgacg aatctactaa aggtgttgtg 300 tttggcggcg gcacgaagtt aaccgtccta ggtcagccca aggctgcccc ctcggtcact 360 ctgttcccgc cctcctctga ggagcttcaa gccaacaagg ccacactggt gtgtctcata 420 agtgacttct acccgggagc cgtgacagtg gcctggaagg cagatagcag ccccgtcaag 480 gcgggagtgg agaccaccac accctccaaa caaagcaaca acaagtacgc ggccagcagc 540 tatctgagcc tgacgcctga gcagtggaag tcccacagaa gctacagctg ccaggtcacg 600 catgaaggga gcaccgtgga gaagacagtg gcccctacag aatgttca 648 <210> 132 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 132 Ala His Val Glu His Ser Ile Ser Arg Ser 1 5 10 <210> 133 <211> 1076 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 133 gggcagcgcc tgacatgcct gatcctctct tttctgcagt tcaagggaaa gacgagatct 60 tgcacaaggc actctgcttc tgcccttggc tggggaaggg tggcatggag cctctccggc 120 tgctcatctt actctttgtc acagagctgt ccggagccca caacaccaca gtgttccagg 180 gcgtggcggg ccagtccctg caggtgtctt gcccctatga ctccatgaag cactggggga 240 ggcgcaaggc ctggtgccgc cagctgggag agaagggccc atgccagcgt gtggtcagca 300 cgcacaactt gtggctgctg tccttcctga ggaggtggaa tgggagcaca gccatcacag 360 acgataccct gggtggcact ctcaccatta cgctgcggaa tctacaaccc catgatgcgg 420 gtctctacca gtgccagagc ctccatggca gtgaggctga caccctcagg aaggtcctgg 480 tggaggtgct ggcagacccc ctggatcacc gggatgctgg agatctctgg ttccccgggg 540 agtctgagag cttcgaggat gcccatgtgg agcacagcat ctccaggagc ctcttggaag 600 gagaaatccc cttcccaccc acttccatcc ttctcctcct ggcctgcatc tttctcatca 660 agattctagc agccagcgcc ctctgggctg cagcctggca tggacagaag ccagggacac 720 atccacccag tgaactggac tgtggccatg acccagggta tcagctccaa actctgccag 780 ggctgagaga cacgtgaagg aagatgatgg gaggaaaagc ccaggagaag tcccaccagg 840 gaccagccca gcctgcatac ttgccacttg gccaccagga ctccttgttc tgctctggca 900 agagactact ctgcctgaac actgcttctc ctggaccctg gaagcaggga ctggttgagg 960 gagtggggag gtggtaagaa cacctgacaa cttctgaata ttggacattt taaacactta 1020 caaataaatc caagactgtc atatttagct ggataaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaa 1076 <210> 134 <211> 280 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 134 cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc cccgcccatt 60 gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc attgacgtca 120 atgggtggag tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt atcatatgcc 180 aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt atgcccagta 240 catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac 280 <210> 135 <211> 266 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 135 ccacgttctg cttcactctc cccatctccc ccccctcccc acccccaatt ttgtatttat 60 ttatttttta attattttgt gcagcgatgg gggcgggggg gggggggggg cgcgcgccag 120 gcggggcggg gcggggcgag gggcggggcg gggcgaggcg gagaggtgcg gcggcagcca 180 atcagagcgg cgcgctccga aagtttcctt ttatggcgag gcggcggcgg cggcggccct 240 ataaaaagcg aagcgcgcgg cgggcg 266 <210> 136 <211> 552 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 136 cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc cccgcccatt 60 gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc attgacgtca 120 atgggtggag tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt atcatatgcc 180 aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt atgcccagta 240 catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac tcgaggccac gttctgcttc 300 actctcccca tctccccccc ctccccaccc ccaattttgt atttatttat tttttaatta 360 ttttgtgcag cgatgggggc gggggggggg ggggggcgcg cgccaggcgg ggcggggcgg 420 ggcgaggggc ggggcggggc gaggcggaga ggtgcggcgg cagccaatca gagcggcgcg 480 ctccgaaagt ttccttttat ggcgaggcgg cggcggcggc ggccctataa aaagcgaagc 540 gcgcggcggg cg 552 <210> 137 <211> 97 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 137 gtaagtttag tctttttgtc ttttatttca ggtcccggat ccggtggtgg tgcaaatcaa 60 agaactgctc ctcagtggat gttgccttta cttctag 97 <210> 138 <211> 232 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 138 ctagagctcg ctgatcagcc tcgactgtgc cttctagttg ccagccatct gttgtttgcc 60 cctcccccgt gccttccttg accctggaag gtgccactcc cactgtcctt tcctaataaa 120 atgaggaaat tgcatcgcat tgtctgagta ggtgtcattc tattctgggg ggtggggtgg 180 ggcaggacag caagggggag gattgggaag acaatagcag gcatgctggg ga 232 <210> 139 <211> 162 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hTREM2 residues 19-174 plus His-tag <400> 139 His Asn Thr Thr Val Phe Gln Gly Val Ala Gly Gln Ser Leu Gln Val 1 5 10 15 Ser Cys Pro Tyr Asp Ser Met Lys His Trp Gly Arg Arg Lys Ala Trp 20 25 30 Cys Arg Gln Leu Gly Glu Lys Gly Pro Cys Gln Arg Val Val Ser Thr 35 40 45 His Asn Leu Trp Leu Leu Ser Phe Leu Arg Arg Trp Asn Gly Ser Thr 50 55 60 Ala Ile Thr Asp Asp Thr Leu Gly Gly Thr Leu Thr Ile Thr Leu Arg 65 70 75 80 Asn Leu Gln Pro His Asp Ala Gly Leu Tyr Gln Cys Gln Ser Leu His 85 90 95 Gly Ser Glu Ala Asp Thr Leu Arg Lys Val Leu Val Glu Val Leu Ala 100 105 110 Asp Pro Leu Asp His Arg Asp Ala Gly Asp Leu Trp Phe Pro Gly Glu 115 120 125 Ser Glu Ser Phe Glu Asp Ala His Val Glu His Ser Ile Ser Arg Ser 130 135 140 Leu Leu Glu Gly Glu Ile Pro Phe Pro Pro Thr Ser His His His His 145 150 155 160 His His <210> 140 <211> 215 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 140 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Arg Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Phe Gln Tyr Arg His Met Pro Ser 85 90 95 Gln Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Asp Ala 100 105 110 Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser 115 120 125 Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp 130 135 140 Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val 145 150 155 160 Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met 165 170 175 Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser 180 185 190 Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys 195 200 205 Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys 210 215 <210> 141 <211> 449 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 141 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr 20 25 30 His Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Val Ile Asn Pro Val Ser Gly Asn Thr Val Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ile Pro Ser Tyr Thr Tyr Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Ala Pro Ser Val Tyr 115 120 125 Pro Leu Ala Pro Val Cys Gly Asp Thr Thr Gly Ser Ser Val Thr Leu 130 135 140 Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Leu Thr Trp 145 150 155 160 Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu 165 170 175 Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Thr Ser Ser 180 185 190 Thr Trp Pro Ser Gln Ser Ile Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser 195 200 205 Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Glu Pro Arg Gly Pro Thr Ile Lys 210 215 220 Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys Pro Ala Pro Asn Leu Leu Gly Gly Pro 225 230 235 240 Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser 245 250 255 Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys Val Val Val Ala Val Ser Glu Asp Asp 260 265 270 Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn Val Glu Val His Thr 275 280 285 Ala Gln Thr Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val 290 295 300 Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu 305 310 315 320 Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Ala Ala Pro Ile Glu Arg 325 330 335 Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly Ser Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr Val 340 345 350 Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu Met Thr Lys Lys Gln Val Thr Leu Thr 355 360 365 Cys Met Val Thr Asp Phe Met Pro Glu Asp Ile Tyr Val Glu Trp Thr 370 375 380 Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro Val Leu 385 390 395 400 Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val Glu Lys 405 410 415 Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn Ser Tyr Ser Cys Ser Val Val His Glu 420 425 430 Gly Leu His Asn His His Thr Thr Lys Ser Phe Ser Arg Thr Pro Gly 435 440 445 Lys

Claims (111)

  1. 골수 세포 상에서 발현되는 인간 유발 2(hTREM2) 단백질의 면역글로불린 수퍼패밀리(IgSF) 도메인에 결합하고, hTREM2 단백질(예를 들어 서열 번호 1, 2 또는 3)을 안정화시키는 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 hTREM2의 D39, S40, M41, K42, W44, G45, R46, R47, H67, N68, L69, W70, L71, L72, F74, L75, R77, D87, T88, L89 및 G90으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 잔기와 결합하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 hTREM2의 D39, S40, M41, K42, W44, G45, R46 및 R47로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 잔기, H67, N68, L69, W70, L71, L72, F74, L75 및 R77로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 잔기, 및 D87, T88, L89 및 G90으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 잔기와 결합하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 hTREM2의 D39, S40, M41, K42, W44, G45, R46 및 R47로 구성된 군으로부터 선택되는 5개 이상의 잔기, H67, N68, L69, W70, L71, L72, F74, L75 및 R77로 구성된 군으로부터 선택되는 4개 이상의 잔기, 및 D87, T88, L89 및 G90으로 구성된 군으로부터 선택되는 3개 이상의 잔기와 결합하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 hTREM2의 D39, S40, M41, K42, W44, G45, R46 및 R47로 구성된 군으로부터 선택되는 7개 이상의 잔기, H67, N68, L69, W70, L71, L72, F74, L75 및 R77로 구성된 군으로부터 선택되는 4개 이상의 잔기, 및 D87, T88, L89 및 G90으로 구성된 군으로부터 선택되는 3개 이상의 잔기와 결합하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 hTREM2의 D39, S40, M41, K42, W44, G45, R46 및 R47로 구성된 군으로부터 선택되는 5개 이상의 잔기, H67, N68, L69, W70, L71, L72, F74, L75 및 R77의 모든 잔기들, 및 D87, T88, L89 및 G90으로 구성된 군으로부터 선택되는 3개 이상의 잔기와 결합하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 hTREM2의 S40, M41, W44, G45, W70, L71, L72, F74, T88 및 L89로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 잔기와 결합하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 hTREM2의 S40, M41, W44, G45, W70, L71, L72, F74, T88 및 L89로 구성된 군으로부터 선택되는 2개 이상의 잔기와 결합하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 hTREM2의 S40, M41, W44, G45, W70, L71, L72, F74, T88 및 L89로 구성된 군으로부터 선택되는 3개 이상의 잔기와 결합하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 hTREM2의 S40, M41, W44, G45, W70, L71, L72, F74, T88 및 L89로 구성된 군으로부터 선택되는 4개 이상의 잔기와 결합하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  11. 제1항에 있어서,
    상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 hTREM2의 S40, M41, W44, G45, W70, L71, L72, F74, T88 및 L89로 구성된 군으로부터 선택되는 5개 이상의 잔기와 결합하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  12. 제1항에 있어서,
    상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 hTREM2의 S40, M41, W44, G45, W70, L71, L72, F74, T88 및 L89로 구성된 군으로부터 선택되는 6개 이상의 잔기와 결합하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  13. 제1항에 있어서,
    상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 hTREM2의 S40, M41, W44, G45, W70, L71, L72, F74, T88 및 L89로 구성된 군으로부터 선택되는 7개 이상의 잔기와 결합하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  14. 제1항에 있어서,
    상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 hTREM2의 S40, M41, W44, G45, W70, L71, L72, F74, T88 및 L89로 구성된 군으로부터 선택되는 8개 이상의 잔기와 결합하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  15. 제1항에 있어서,
    상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 hTREM2의 S40, M41, W44, G45, W70, L71, L72, F74, T88 및 L89로 구성된 군으로부터 선택되는 9개 이상의 잔기와 결합하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  16. 제1항에 있어서,
    상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 hTREM2의 S40, M41, W44, G45, W70, L71, L72, F74, T88 및 L89의 모든 잔기와 결합하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  17. 제7항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 hTREM2의 D39, K42, R46 및 G90으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 잔기와 결합하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  18. 제7항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 hTREM2의 D39, K42, R46 및 G90으로 구성된 군으로부터 선택되는 2개 이상의 잔기와 결합하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  19. 제7항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 hTREM2의 D39, K42, R46 및 G90으로 구성된 군으로부터 선택되는 3개 이상의 잔기와 결합하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  20. 제7항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 hTREM2의 D39, K42, R46 및 G90의 모든 잔기와 결합하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  21. 제1항에 있어서,
    상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 hTREM2의 S40, M41, W44, G45, W70, L71, L72, F74, T88, L89, D39, K42, R46 및 G90의 모든 잔기와 결합하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  22. 제7항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 hTREM2의 R47, H67, N68, L69, L75, R77 및 D87로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 잔기와 결합하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  23. 제7항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 hTREM2의 R47, H67, N68, L69, L75, R77 및 D87로 구성된 군으로부터 선택되는 2개 이상의 잔기와 결합하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  24. 제7항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 hTREM2의 R47, H67, N68, L69, L75, R77 및 D87로 구성된 군으로부터 선택되는 3개 이상의 잔기와 결합하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  25. 제7항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 hTREM2의 R47, H67, N68, L69, L75, R77 및 D87로 구성된 군으로부터 선택되는 4개 이상의 잔기와 결합하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  26. 제7항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 hTREM2의 R47, H67, N68, L69, L75, R77 및 D87로 구성된 군으로부터 선택되는 5개 이상의 잔기와 결합하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  27. 제7항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 hTREM2의 R47, H67, N68, L69, L75, R77 및 D87로 구성된 군으로부터 선택되는 6개 이상의 잔기와 결합하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  28. 제1항에 있어서,
    상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 hTREM2의 S40, M41, W44, G45, W70, L71, L72, F74, T88, L89, R47, H67, N68, L69, L75, R77 및 D87의 모든 잔기와 결합하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  29. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 hTREM2를 활성화시키는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  30. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 TREM2 발현 세포 내 하나 이상의 hTREM2-의존성 생리학적 활성을 촉진시키는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  31. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은:
    a) 예를 들어, hTREM2-발현 세포에서 식세포작용을 증가시키며, 예를 들어, 상기 TREM2 발현 세포는 hM2A 대식세포 또는 인간 iPS-유래된 미세아교세포-유사 세포이며,
    b) 예를 들어, hTREM2-발현 세포에서 화학주성을 증가시키며, 예를 들어, 상기 TREM2 발현 세포는 hM2a 대식세포 또는 인간 iPS-유래된 미세아교세포-유사 세포이며,
    c) 인간 단핵구 세포주에서 NFAT-기반 리포터 유전자 활성을 증가시키고,
    d) 예를 들어, hTREM2-발현 세포에서 Syk 인산화를 증가시키며, 예를 들어, 상기 TREM2 발현 세포는 hM2A 대식세포이며, 또는
    e) a) 내지 d) 중 둘 이상의 임의의 조합을 증가시키는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  32. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 예를 들어, hM2a 대식세포 상에서 FACS 분석에 의해 측정되는 바와 같이, 예를 들어, 세포 표면 상에서, 1 nM 이하의 최대 유효 농도의 절반(EC50)으로, hTREM2에 결합하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  33. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 예를 들어, hM2a 대식세포 상에서 FACS 분석에 의해 측정되는 바와 같이, 예를 들어, 세포 표면 상에서, 0.59 nM 이하의 최대 유효 농도의 절반(EC50)으로, hTREM2에 결합하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  34. 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 예를 들어, 표면 플라즈몬 공명(SPR)으로 측정되는 바와 같이, 150 pM 이하의 해리 상수(KD)로 hTREM2와 결합하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  35. 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 예를 들어, 표면 플라즈몬 공명(SPR)으로 측정되는 바와 같이, 50 pM 이하의 해리 상수(KD)로 hTREM2와 결합하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  36. 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 hTREM2-발현 세포의 세포 표면 상에서 hTREM2 단백질을 안정화시키는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  37. 제36항에 있어서,
    상기 hTREM2-발현 세포는 대식세포, 예를 들어, M2a 대식세포, 수지상 세포, 파골세포, 미세아교세포, 비만 세포, 단핵구, 폐 상피 세포, 피부의 랑게르한스 세포, 쿠퍼 세포, 호중구 또는 간암 세포인, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  38. 제1항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 hM2A 대식세포에서 100 nM 이하의 농도로 hTREM2 단백질의 엑토도메인의 부분절단을 감소시키는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  39. 제1항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 TREM2 세포 표면 발현은 3배 이상 증가되는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  40. 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서,
    hTREM2의 IgSF 도메인은 서열 번호 1, 2, 및 3 중 어느 하나의 아미노산 잔기 19 내지 132를 포함하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  41. 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은:
    a) 서열 번호 41 또는 서열 번호 44 또는 서열 번호 45 또는 서열 번호 47을 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 중쇄 가변 영역 CDR1; 서열 번호 42 또는 서열 번호 46 또는 서열 번호 48을 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 중쇄 가변 영역 CDR2; 서열 번호 43 또는 서열 번호 49를 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 중쇄 가변 영역 CDR3; 서열 번호 54 또는 서열 번호 57 또는 서열 번호 60을 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 경쇄 가변 영역 CDR1; 서열 번호 55 또는 서열 번호 58을 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 경쇄 가변 영역 CDR2; 및 서열 번호 56 또는 서열 번호 59를 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 경쇄 가변 영역 CDR3;
    b) 서열 번호 4 또는 서열 번호 7 또는 서열 번호 8 또는 서열 번호 10을 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 중쇄 가변 영역 CDR1; 서열 번호 5 또는 서열 번호 9 또는 서열 번호 11을 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 중쇄 가변 영역 CDR2; 서열 번호 6 또는 서열 번호 12를 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 중쇄 가변 영역 CDR3; 서열 번호 17 또는 서열 번호 20 또는 서열 번호 23을 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 경쇄 가변 영역 CDR1; 서열 번호 18 또는 서열 번호 21을 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 경쇄 가변 영역 CDR2; 및 서열 번호 19 또는 서열 번호 22를 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 경쇄 가변 영역 CDR3;
    c) 서열 번호 4 또는 서열 번호 7 또는 서열 번호 8 또는 서열 번호 10을 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 중쇄 가변 영역 CDR1; 서열 번호 5 또는 서열 번호 9 또는 서열 번호 11을 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 중쇄 가변 영역 CDR2; 서열 번호 6 또는 서열 번호 12를 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 중쇄 가변 영역 CDR3; 서열 번호 17 또는 서열 번호 20 또는 서열 번호 23을 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 경쇄 가변 영역 CDR1; 서열 번호 18 또는 서열 번호 21을 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 경쇄 가변 영역 CDR2; 및 서열 번호 78 또는 서열 번호 79를 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 경쇄 가변 영역 CDR3; 또는
    d) 서열 번호 84 또는 서열 번호 87 또는 서열 번호 88 또는 서열 번호 90을 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 중쇄 가변 영역 CDR1; 서열 번호 85 또는 서열 번호 89 또는 서열 번호 91을 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 중쇄 가변 영역 CDR2; 서열 번호 86 또는 서열 번호 92를 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 중쇄 가변 영역 CDR3; 서열 번호 97 또는 서열 번호 100 또는 서열 번호 103을 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 경쇄 가변 영역 CDR1; 서열 번호 98 또는 서열 번호 101을 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 경쇄 가변 영역 CDR2; 및 서열 번호 99 또는 서열 번호 102를 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 경쇄 가변 영역 CDR3을 포함하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  42. hTREM2 단백질의 IgSF 도메인에 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편으로서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은:
    a) 서열 번호 41 또는 서열 번호 44 또는 서열 번호 45 또는 서열 번호 47을 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 중쇄 가변 영역 CDR1; 서열 번호 42 또는 서열 번호 46 또는 서열 번호 48을 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 중쇄 가변 영역 CDR2; 서열 번호 43 또는 서열 번호 49를 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 중쇄 가변 영역 CDR3; 서열 번호 54 또는 서열 번호 57 또는 서열 번호 60을 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 경쇄 가변 영역 CDR1; 서열 번호 55 또는 서열 번호 58을 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 경쇄 가변 영역 CDR2; 및 서열 번호 56 또는 서열 번호 59를 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 경쇄 가변 영역 CDR3;
    b) 서열 번호 4 또는 서열 번호 7 또는 서열 번호 8 또는 서열 번호 10을 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 중쇄 가변 영역 CDR1; 서열 번호 5 또는 서열 번호 9 또는 서열 번호 11을 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 중쇄 가변 영역 CDR2; 서열 번호 6 또는 서열 번호 12를 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 중쇄 가변 영역 CDR3; 서열 번호 17 또는 서열 번호 20 또는 서열 번호 23을 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 경쇄 가변 영역 CDR1; 서열 번호 18 또는 서열 번호 21을 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 경쇄 가변 영역 CDR2; 및 서열 번호 19 또는 서열 번호 22를 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 경쇄 가변 영역 CDR3;
    c) 서열 번호 4 또는 서열 번호 7 또는 서열 번호 8 또는 서열 번호 10을 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 중쇄 가변 영역 CDR1; 서열 번호 5 또는 서열 번호 9 또는 서열 번호 11을 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 중쇄 가변 영역 CDR2; 서열 번호 6 또는 서열 번호 12를 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 중쇄 가변 영역 CDR3; 서열 번호 17 또는 서열 번호 20 또는 서열 번호 23을 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 경쇄 가변 영역 CDR1; 서열 번호 18 또는 서열 번호 21을 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 경쇄 가변 영역 CDR2; 및 서열 번호 78 또는 서열 번호 79를 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 경쇄 가변 영역 CDR3; 또는
    d) 서열 번호 84 또는 서열 번호 87 또는 서열 번호 88 또는 서열 번호 90을 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 중쇄 가변 영역 CDR1; 서열 번호 85 또는 서열 번호 89 또는 서열 번호 91을 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 중쇄 가변 영역 CDR2; 서열 번호 86 또는 서열 번호 92를 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 중쇄 가변 영역 CDR3; 서열 번호 97 또는 서열 번호 100 또는 서열 번호 103을 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 경쇄 가변 영역 CDR1; 서열 번호 98 또는 서열 번호 101을 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 경쇄 가변 영역 CDR2; 및 서열 번호 99 또는 서열 번호 102를 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 경쇄 가변 영역 CDR3을 포함하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  43. 제1항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은
    a) 서열 번호 13 또는 서열 번호 50에 대하여 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 VH 폴리펩타이드 서열, 및 서열 번호 24 또는 서열 번호 61에 대하여 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 VL 폴리펩타이드 서열; 또는
    b) 서열 번호 13 또는 서열 번호 93에 대하여 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 VH 폴리펩타이드 서열, 및 서열 번호 80 또는 서열 번호 104에 대하여 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 VL 폴리펩타이드 서열을 포함하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  44. 제1항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서,
    a) 서열 번호 7을 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 중쇄 가변 영역 CDR1; 서열 번호 5를 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 중쇄 가변 영역 CDR2; 서열 번호 6을 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 중쇄 가변 영역 CDR3; 서열 번호 17을 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 경쇄 가변 영역 CDR1; 서열 번호 18을 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 경쇄 가변 영역 CDR2; 및 서열 번호 19를 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 경쇄 가변 영역 CDR3;
    b) 서열 번호 44를 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 중쇄 가변 영역 CDR1; 서열 번호 42를 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 중쇄 가변 영역 CDR2; 서열 번호 43을 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 중쇄 가변 영역 CDR3; 서열 번호 54를 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 경쇄 가변 영역 CDR1; 서열 번호 55를 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 경쇄 가변 영역 CDR2; 및 서열 번호 56을 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 경쇄 가변 영역 CDR3;
    c) 서열 번호 7을 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 중쇄 가변 영역 CDR1; 서열 번호 5를 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 중쇄 가변 영역 CDR2; 서열 번호 6을 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 중쇄 가변 영역 CDR3; 서열 번호 17을 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 경쇄 가변 영역 CDR1; 서열 번호 18을 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 경쇄 가변 영역 CDR2; 및 서열 번호 78을 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 경쇄 가변 영역 CDR3; 또는
    d) 서열 번호 87을 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 중쇄 가변 영역 CDR1; 서열 번호 85를 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 중쇄 가변 영역 CDR2; 서열 번호 86을 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 중쇄 가변 영역 CDR3; 서열 번호 97을 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 경쇄 가변 영역 CDR1; 서열 번호 98을 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 경쇄 가변 영역 CDR2; 및 서열 번호 99를 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 경쇄 가변 영역 CDR3을 포함하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  45. 제1항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서,
    a) 서열 번호 8의 중쇄 가변 영역 CDR1; 서열 번호 9를 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 중쇄 가변 영역 CDR2; 서열 번호 6을 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 중쇄 가변 영역 CDR3; 서열 번호 20을 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 경쇄 가변 영역 CDR1; 서열 번호 21을 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 경쇄 가변 영역 CDR2; 및 서열 번호 22를 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 경쇄 가변 영역 CDR3;
    b) 서열 번호 45를 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 중쇄 가변 영역 CDR1; 서열 번호 46을 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 중쇄 가변 영역 CDR2; 서열 번호 43을 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 중쇄 가변 영역 CDR3; 서열 번호 57을 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 경쇄 가변 영역 CDR1; 서열 번호 58을 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 경쇄 가변 영역 CDR2; 및 서열 번호 59를 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 경쇄 가변 영역 CDR3;
    c) 서열 번호 8을 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 중쇄 가변 영역 CDR1; 서열 번호 9를 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 중쇄 가변 영역 CDR2; 서열 번호 6을 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 중쇄 가변 영역 CDR3; 서열 번호 20을 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 경쇄 가변 영역 CDR1; 서열 번호 21을 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 경쇄 가변 영역 CDR2; 및 서열 번호 79를 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 경쇄 가변 영역 CDR3; 또는
    d) 서열 번호 88을 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 중쇄 가변 영역 CDR1; 서열 번호 89를 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 중쇄 가변 영역 CDR2; 서열 번호 86을 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 중쇄 가변 영역 CDR3; 서열 번호 100을 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 경쇄 가변 영역 CDR1; 서열 번호 101을 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 경쇄 가변 영역 CDR2; 및 서열 번호 102를 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 경쇄 가변 영역 CDR3을 포함하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  46. 제1항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서,
    a) 서열 번호 10을 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 중쇄 가변 영역 CDR1; 서열 번호 11을 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 중쇄 가변 영역 CDR2; 서열 번호 12를 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 중쇄 가변 영역 CDR3; 서열 번호 23을 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 경쇄 가변 영역 CDR1; 서열 번호 21을 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 경쇄 가변 영역 CDR2; 및 서열 번호 19를 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 경쇄 가변 영역 CDR3;
    b) 서열 번호 47을 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 중쇄 가변 영역 CDR1; 서열 번호 48을 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 중쇄 가변 영역 CDR2; 서열 번호 49를 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 중쇄 가변 영역 CDR3; 서열 번호 60을 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 경쇄 가변 영역 CDR1; 서열 번호 58을 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 경쇄 가변 영역 CDR2; 및 서열 번호 56을 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 경쇄 가변 영역 CDR3;
    c) 서열 번호 10을 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 중쇄 가변 영역 CDR1; 서열 번호 11을 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 중쇄 가변 영역 CDR2; 서열 번호 12를 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 중쇄 가변 영역 CDR3; 서열 번호 23을 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 경쇄 가변 영역 CDR1; 서열 번호 21을 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 경쇄 가변 영역 CDR2; 및 서열 번호 78을 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 경쇄 가변 영역 CDR3; 또는
    d) 서열 번호 90을 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 중쇄 가변 영역 CDR1; 서열 번호 91을 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 중쇄 가변 영역 CDR2; 서열 번호 92를 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 중쇄 가변 영역 CDR3; 서열 번호 103을 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 경쇄 가변 영역 CDR1; 서열 번호 101을 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 경쇄 가변 영역 CDR2; 및 서열 번호 99를 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 경쇄 가변 영역 CDR3을 포함하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  47. 제1항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서,
    a) 서열 번호 4를 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 중쇄 가변 영역 CDR1; 서열 번호 5를 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 중쇄 가변 영역 CDR2; 서열 번호 6을 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 중쇄 가변 영역 CDR3; 서열 번호 17을 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 경쇄 가변 영역 CDR1; 서열 번호 18을 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 경쇄 가변 영역 CDR2; 및 서열 번호 19를 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 경쇄 가변 영역 CDR3;
    b) 서열 번호 41을 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 중쇄 가변 영역 CDR1; 서열 번호 42를 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 중쇄 가변 영역 CDR2; 서열 번호 43을 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 중쇄 가변 영역 CDR3; 서열 번호 54를 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 경쇄 가변 영역 CDR1; 서열 번호 55를 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 경쇄 가변 영역 CDR2; 및 서열 번호 56을 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 경쇄 가변 영역 CDR3;
    c) 서열 번호 4를 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 중쇄 가변 영역 CDR1; 서열 번호 5를 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 중쇄 가변 영역 CDR2; 서열 번호 6을 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 중쇄 가변 영역 CDR3; 서열 번호 17을 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 경쇄 가변 영역 CDR1; 서열 번호 18을 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 경쇄 가변 영역 CDR2; 및 서열 번호 78을 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 경쇄 가변 영역 CDR3; 또는
    d) 서열 번호 84를 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 중쇄 가변 영역 CDR1; 서열 번호 85를 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 중쇄 가변 영역 CDR2; 서열 번호 86을 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 중쇄 가변 영역 CDR3; 서열 번호 97을 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 경쇄 가변 영역 CDR1; 서열 번호 98을 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 경쇄 가변 영역 CDR2; 및 서열 번호 99를 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 경쇄 가변 영역 CDR3을 포함하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  48. 제1항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은:
    a) 서열 번호 13을 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 VH 및 서열 번호 24를 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 VL; 또는
    b) 서열 번호 50을 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 VH 및 서열 번호 61을 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 VL; 또는
    c) 서열 번호 13에 대하여 적어도 95% 상동성을 갖는 서열을 포함하는, 예를 들어 이들로 구성된 VH 및 서열 번호 24에 대하여 적어도 95% 상동성을 갖는 서열을 포함하는, 예를 들어 이들로 구성된 VL; 또는
    d) 서열 번호 50에 대하여 적어도 95% 상동성을 갖는 서열을 포함하는, 예를 들어 이들로 구성된 VH 및 서열 번호 61에 대하여 적어도 95% 상동성을 갖는 서열을 포함하는, 예를 들어 이들로 구성된 VL; 또는
    e) 서열 번호 13으로부터 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개의 아미노산이 상이한 서열을 포함하는, 예를 들어 이들로 구성된 VH 및 서열 번호 24로부터 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개의 아미노산이 상이한 서열을 포함하는, 예를 들어 이들로 구성된 VL; 또는
    f) 서열 번호 50으로부터 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개의 아미노산이 상이한 서열을 포함하는, 예를 들어 이들로 구성된 VH 및 서열 번호 61로부터 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개의 아미노산이 상이한 서열을 포함하는, 예를 들어 이들로 구성된 VL.
    g) 서열 번호 13을 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 VH 및 서열 번호 80을 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 VL; 또는
    h) 서열 번호 93을 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 VH 및 서열 번호 104를 포함하는, 예를 들어, 이들로 구성된 VL; 또는
    i) 서열 번호 13에 대하여 적어도 95% 상동성을 갖는 서열을 포함하는, 예를 들어 이들로 구성된 VH 및 서열 번호 80에 대하여 적어도 95% 상동성을 갖는 서열을 포함하는, 예를 들어 이들로 구성된 VL; 또는
    j) 서열 번호 93에 대하여 적어도 95% 상동성을 갖는 서열을 포함하는, 예를 들어 이들로 구성된 VH 및 서열 번호 104에 대하여 적어도 95% 상동성을 갖는 서열을 포함하는, 예를 들어 이들로 구성된 VL; 또는
    k) 서열 번호 13으로부터 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개의 아미노산이 상이한 서열을 포함하는, 예를 들어 이들로 구성된 VH 및 서열 번호 80으로부터 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개의 아미노산이 상이한 서열을 포함하는, 예를 들어 이들로 구성된 VL; 또는
    l) 서열 번호 93으로부터 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개의 아미노산이 상이한 서열을 포함하는, 예를 들어 이들로 구성된 VH 및 서열 번호 104로부터 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개의 아미노산이 상이한 서열을 포함하는, 예를 들어 이들로 구성된 VL을 포함하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  49. 제1항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은:
    a) 서열 번호 15, 서열 번호 29, 서열 번호 33, 서열 번호 35, 서열 번호 37, 또는 서열 번호 39를 포함하는, 예를 들어 이들로 구성된 중쇄 아미노산 서열, 및 서열 번호 26을 포함하는, 예를 들어 이들로 구성된 경쇄 아미노산 서열;
    b) 서열 번호 52, 서열 번호 66, 서열 번호 70, 서열 번호 72, 서열 번호 74, 또는 서열 번호 76을 포함하는, 예를 들어 이들로 구성된 중쇄 아미노산 서열, 및 서열 번호 63을 포함하는, 예를 들어 이들로 구성된 경쇄 아미노산 서열;
    c) 서열 번호 15, 서열 번호 29, 서열 번호 33, 서열 번호 35, 서열 번호 37, 또는 서열 번호 39에 대하여 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 중쇄 아미노산 서열, 및 서열 번호 26에 대하여 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 경쇄 아미노산 서열;
    d) 서열 번호 52, 서열 번호 66, 서열 번호 70, 서열 번호 72, 서열 번호 74, 또는 서열 번호 76에 대하여 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 중쇄 아미노산 서열, 및 서열 번호 63에 대하여 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 경쇄 아미노산 서열;
    e) 서열 번호 15를 포함하는, 예를 들어 이들로 구성된 중쇄 아미노산 서열, 및 서열 번호 82를 포함하는, 예를 들어 이들로 구성된 경쇄 아미노산 서열;
    f) 서열 번호 95를 포함하는, 예를 들어 이들로 구성된 중쇄 아미노산 서열, 및 서열 번호 106을 포함하는, 예를 들어 이들로 구성된 경쇄 아미노산 서열;
    g) 서열 번호 15에 대하여 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 중쇄 아미노산 서열, 및 서열 번호 82에 대하여 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 경쇄 아미노산 서열; 또는
    h) 서열 번호 95에 대하여 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 중쇄 아미노산 서열, 및 서열 번호 106에 대하여 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 경쇄 아미노산 서열을 포함하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  50. 골수 세포 상에서 발현되는 인간 유발 2(hTREM2)의 면역글로불린 수퍼패밀리(IgSF) 도메인에 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편으로서,
    a) 서열 번호 15를 포함하는, 예를 들어 이들로 구성된 중쇄 서열, 및 서열 번호 26을 포함하는, 예를 들어 이들로 구성된 경쇄 서열;
    b) 서열 번호 29를 포함하는, 예를 들어 이들로 구성된 중쇄 서열, 및 서열 번호 26을 포함하는, 예를 들어 이들로 구성된 경쇄 서열;
    c) 서열 번호 33을 포함하는, 예를 들어 이들로 구성된 중쇄 서열, 및 서열 번호 26을 포함하는, 예를 들어 이들로 구성된 경쇄 서열;
    d) 서열 번호 35를 포함하는, 예를 들어 이들로 구성된 중쇄 서열, 및 서열 번호 26을 포함하는, 예를 들어 이들로 구성된 경쇄 서열;
    e) 서열 번호 37을 포함하는, 예를 들어 이들로 구성된 중쇄 서열, 및 서열 번호 26을 포함하는, 예를 들어 이들로 구성된 경쇄 서열;
    f) 서열 번호 39를 포함하는, 예를 들어 이들로 구성된 중쇄 서열, 및 서열 번호 26을 포함하는, 예를 들어 이들로 구성된 경쇄 서열;
    g) 서열 번호 52를 포함하는, 예를 들어 이들로 구성된 중쇄 서열, 및 서열 번호 63을 포함하는, 예를 들어 이들로 구성된 경쇄 서열;
    h) 서열 번호 66을 포함하는, 예를 들어 이들로 구성된 중쇄 서열, 및 서열 번호 63을 포함하는, 예를 들어 이들로 구성된 경쇄 서열;
    i) 서열 번호 70을 포함하는, 예를 들어 이들로 구성된 중쇄 서열, 및 서열 번호 63을 포함하는, 예를 들어 이들로 구성된 경쇄 서열;
    j) 서열 번호 72를 포함하는, 예를 들어 이들로 구성된 중쇄 서열, 및 서열 번호 63을 포함하는, 예를 들어 이들로 구성된 경쇄 서열;
    k) 서열 번호 74를 포함하는, 예를 들어 이들로 구성된 중쇄 서열, 및 서열 번호 63을 포함하는, 예를 들어 이들로 구성된 경쇄 서열;
    l) 서열 번호 76을 포함하는, 예를 들어 이들로 구성된 중쇄 서열, 및 서열 번호 63을 포함하는, 예를 들어 이들로 구성된 경쇄 서열;
    m) 서열 번호 15를 포함하는, 예를 들어 이들로 구성된 중쇄 서열, 및 서열 번호 82를 포함하는, 예를 들어 이들로 구성된 경쇄 서열; 또는
    n) 서열 번호 95를 포함하는, 예를 들어 이들로 구성된 중쇄 서열, 및 서열 번호 106을 포함하는, 예를 들어 이들로 구성된 경쇄 서열을 포함하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  51. hTREM2 단백질에 대한 결합을 위해 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항의 임의의 항체 또는 이의 항원-결합 단편과 경쟁하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  52. 제1항 내지 제51항 중 어느 한 항의 임의의 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 에피토프와 중첩하는 에피토프에 결합하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  53. 제1항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항체는 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 이소타입을 갖는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  54. 제1항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 IgG1 Fc 영역, IgG2 Fc 영역, IgG4 Fc 영역, 또는 IgG2/IgG4 하이브리드 Fc 영역으로부터 선택되는 Fc 영역을 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  55. 제1항 내지 제49항 또는 제51항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 모 항체와 비교하여 감소된 항체-의존성 세포매개성 세포독성(ADCC) 또는 보체-의존성 세포독성(CDC) 활성을 갖는 변형 Fc 영역을 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  56. 제1항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 인간 또는 인간화 항체 또는 이의 단편인 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  57. 제1항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 추가의 모이어티에 콘쥬게이션되는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  58. 제1항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항체는 IgG1 이소타입을 갖는, 항체.
  59. 제1항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항체는 인간 또는 인간화 항체인, 항체.
  60. 제1항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항원-결합 단편은 Fab, F(ab')2, Fv 단편, scFv, 미니바디, 또는 디아바디로부터 선택되는, 항체의 항원-결합 단편.
  61. 제1항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 단클론인, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  62. 제1항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항체는 다중특이적 항체, 예를 들어, 이중특이적 항체인, 항체.
  63. 제62항에 있어서,
    상기 다중특이적 항체, 예를 들어, 이중특이적 항체는, hTREM2 및 인간 DAP12(12 kDa의 DNAX-활성화 단백질)에 특이적으로 결합하는, 항체.
  64. 제1항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항체는 Fc 영역의 돌연변이를 통한 변경된 이펙터 기능을 갖는, 항체.
  65. 제1항 내지 제64항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원-결합 단편 중 어느 하나를 코딩하는 핵산 분자 또는 핵산 분자 세트.
  66. 제65항에 있어서,
    상기 핵산은 DNA인, 핵산 분자.
  67. 제65항 또는 제66항에 있어서,
    서열 번호 14, 28, 51, 65, 16, 30, 34, 36, 38, 40, 53, 67, 71, 73, 75, 77, 25, 31, 62, 68, 27, 32, 64, 69, 13, 93, 15, 95, 80, 104, 82 또는 106 중 하나 이상을 포함하는, 핵산 분자 또는 핵산 분자 세트.
  68. 제65항 내지 제67항 중 어느 한 항에 따른 핵산 분자를 포함하는 벡터.
  69. 제68항에 있어서,
    상기 벡터는 클로닝 벡터 또는 발현 벡터인, 벡터.
  70. 제68항 또는 제69항에 있어서,
    상기 벡터는 적어도 하나의 CDR 영역을 코딩하는 서열 번호 14, 28, 51, 65, 16, 30, 34, 36, 38, 40, 53, 67, 71, 73, 75, 77, 25, 31, 62, 68, 27, 32, 64, 69, 13, 93, 15, 95, 80, 104, 82 또는 106 중 하나 이상, 또는 이의 단편을 포함하는, 벡터.
  71. 제68항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 벡터는 원핵 및/또는 진핵 세포 내에서 복제할 수 있는, 벡터.
  72. 제68항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 벡터는 DNA 벡터, RNA 벡터, 플라스미드, 코스미드, 또는 바이러스 벡터로부터 선택되는, 벡터.
  73. 제68항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서,
    검출가능한 및/또는 선별가능한 마커를 추가로 포함하는, 벡터.
  74. 제68항 내지 제73항 중 어느 한 항에 따른 2개 발현 벡터의 세트로서,
    한 벡터는 a) 서열 번호 13 또는 50을 포함하는 적어도 하나의 VH 도메인을 코딩하고, 다른 벡터는 서열 번호 24 또는 61을 포함하는 적어도 하나의 VL 도메인을 코딩하거나;
    b) 서열 번호 13 또는 93을 포함하는 적어도 하나의 VH 도메인을 코딩하고, 다른 벡터는 서열 번호 80 또는 104를 포함하는 적어도 하나의 VL 도메인을 코딩하는, 2개 발현 벡터의 세트.
  75. 제68항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 벡터는 바이러스 벡터이며, 선택적으로 바이러스 벡터는 렌티바이러스, 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스(AAV), 단순 포진 바이러스(HSV), 파보바이러스, 레트로바이러스, 백시니아 바이러스, 신비스(Sinbis) 바이러스, 인플루엔자 바이러스, 레오바이러스, 뉴캐슬병 바이러스(NDV), 홍역 바이러스, 수포성 구내염 바이러스(VSV), 폴리오바이러스, 폭스바이러스, 세네카 밸리(Seneca Valley) 바이러스, 콕사키바이러스, 엔테로바이러스, 점액종 바이러스, 또는 마라바 바이러스인, 벡터.
  76. 제75항에 있어서,
    상기 벡터는 AAV 벡터인, 벡터.
  77. 제68항 내지 제76항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 벡터는 프로모터를 추가로 포함하는, 벡터.
  78. 제68항 내지 제77항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 벡터는 (1) AAV2로부터 유래된 ITR, (2) CMV 인핸서(예를 들어, 서열 번호 134 포함), (3) CBA 프로모터(예를 들어, 서열 번호 135 포함), (4) SV40 인트론(예를 들어, 서열 번호 137 포함), (5) hTREM2 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같음), 및 (6) BGH 폴리 A 신호(예를 들어, 서열 번호 138 포함)를 포함하는 AAV 벡터 플라스미드 및 AAV9 캡시드를 포함하는, 벡터.
  79. 제78항에 있어서,
    요소들 (2) 내지 (6)은 5'로부터 3'까지 AAV 벡터 플라스미드 상에 배치되는, 벡터.
  80. 제78항 또는 제79항에 있어서,
    요소들 (2) 내지 (6) 중 임의의 것은 5' ITR과 3' ITR 사이의 AAV 벡터 플라스미드 상에 배치되는, 벡터.
  81. 제78항 내지 제80항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 AAV 벡터는 scAAV 벡터인, 벡터.
  82. 제68항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 벡터는 렌티바이러스 벡터인, 벡터.
  83. 제64항 내지 제66항 중 어느 한 항에 따른 핵산 분자 또는 핵산 분자 세트 또는 제68항 내지 제82항 중 어느 한 항의 벡터를 포함하는 세포.
  84. hTREM2 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 제조 방법으로서, (i) 제83항의 세포를 배양하는 단계 및 (ii) 배양액으로부터 hTREM2 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 분리하는 단계를 포함하는, 방법.
  85. 제1항 내지 제64항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 제65항 내지 제67항 중 어느 한 항의 핵산 분자 또는 핵산 분자 세트, 제68항 내지 제82항 중 어느 한 항의 벡터, 또는 제83항의 세포 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
  86. 의약으로 사용하기 위한, 제1항 내지 제64항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 제65항 내지 제67항 중 어느 한 항의 핵산 분자 또는 핵산 분자 세트, 제68항 내지 제82항 중 어느 한 항의 벡터, 제83항의 세포, 또는 제85항의 약제학적 조성물.
  87. hTREM2 기능 상실과 관련된 질환의 치료에 사용하기 위한, 제1항 내지 제64항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 제65항 내지 제67항 중 어느 한 항의 핵산 분자 또는 핵산 분자 세트, 제68항 내지 제82항 중 어느 한 항의 벡터, 제83항의 세포, 또는 제85항의 약제학적 조성물.
  88. hTREM2 기능 상실과 관련된 질환의 치료를 위한 약제를 제조하기 위한, 제1항 내지 제64항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 제65항 내지 제67항 중 어느 한 항의 핵산 분자 또는 핵산 분자 세트, 제68항 내지 제82항 중 어느 한 항의 벡터, 제83항의 세포, 또는 제85항의 약제학적 조성물의 용도.
  89. 제87항 또는 제88항에 있어서, 상기 질환이 신경염증성 또는 신경변성 질환이고, 선택적으로 상기 신경염증성 또는 신경변성 질환이 알츠하이머병, 전두측두엽 치매, 파킨슨병, 근위축 측삭 경화증, 나수-하코라병, 다발성 경화증, 근위축 측삭 경화증(ALS), 항-NMDA 수용체 뇌염, 자폐증, 뇌 루푸스(NP-SLE), 화학-유도 말초 신경병증(CIPN), 포진 후 신경통, 만성 염증성 탈미엘린화 다발신경병증(CIDP), 간질, 길랑-바레 증후군(GBS), 봉입체 근육염, 리소좀 저장 질병, 스핑고미엘린지질증(니만-픽 C), 점액다당질 축적증 II/IIIB, 이염색백색질 장애, 다초점성 운동 신경병증, 중증 근무력증, 신경-베체트병, 시신경척수염(NMO), 시신경염, 다발근육염, 피부근육염, 라스무센 뇌염, 레트 증후군, 뇌졸중, 횡단 척수염, 외상성 뇌 손상, 척수 손상, 바이러스성 뇌염, 또는 세균성 수막염인, 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 핵산 분자 또는 핵산 분자 세트, 벡터, 세포, 또는 약제학적 조성물, 또는 용도.
  90. 제87항 또는 제88항에 있어서,
    상기 질환은 알츠하이머병인, 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 핵산 분자 또는 핵산 분자 세트, 벡터, 세포, 또는 약제학적 조성물, 또는 용도.
  91. 제87항 또는 제88항에 있어서,
    상기 질환은 파킨슨병인, 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 핵산 분자 또는 핵산 분자 세트, 벡터, 세포, 또는 약제학적 조성물, 또는 용도.
  92. 제87항 또는 제88항에 있어서,
    상기 질환은 다발성 경화증인, 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 핵산 분자 또는 핵산 분자 세트, 벡터, 세포, 또는 약제학적 조성물, 또는 용도.
  93. 제87항 또는 제88항에 있어서,
    상기 질환은 전두측두엽 치매인, 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 핵산 분자 또는 핵산 분자 세트, 벡터, 세포, 또는 약제학적 조성물, 또는 용도.
  94. 제87항 또는 제88항에 있어서,
    상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 핵산 분자 또는 핵산 분자 세트, 벡터, 세포, 또는 약제학적 조성물은 경구, 정맥 내, 두개 내, 척수강 내, 피하, 또는 비강 내 경로를 통해 대상체에게 투여되는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 핵산 분자 또는 핵산 분자 세트, 벡터, 세포, 또는 약제학적 조성물, 또는 용도.
  95. 제87항 또는 제88항에 있어서,
    상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 핵산 분자 또는 핵산 분자 세트, 벡터, 세포, 또는 약제학적 조성물은 적어도 하나의 추가의 치료제 또는 과정과 조합하여 대상체에게 투여되는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 핵산 분자 또는 핵산 분자 세트, 벡터, 세포, 또는 약제학적 조성물, 또는 용도.
  96. 제87항 또는 제88항에 있어서,
    상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 핵산 분자 또는 핵산 분자 세트, 벡터, 세포, 또는 약제학적 조성물은 적어도 하나의 추가의 치료제와 조합하여 대상체에게 투여되며, 상기 치료제는 BACE 억제제, 항-Tau 항체, Tau 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 항-아밀로이드 베타 항체, 핀골리모드, BG12 또는 디메틸 푸마레이트, 인터페론 베타 또는 타이사브리 중 하나 이상을 포함하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 핵산 분자 또는 핵산 분자 세트, 벡터, 세포, 또는 약제학적 조성물, 또는 용도.
  97. 치료를 필요로 하는 대상체에서 hTREM2 기능 상실과 관련된 질환을 치료하는 방법으로서, 치료적 유효량의 제1항 내지 제64항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 제65항 내지 제67항 중 어느 한 항의 핵산 분자 또는 핵산 분자 세트, 제68항 내지 제82항 중 어느 한 항의 벡터, 제83항의 세포, 또는 제85항의 약제학적 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  98. 제97항에 있어서,
    상기 방법은:
    a) 대상체로부터 얻은 샘플 내 세포 표면 hTREM2 수준을 분석하는 단계;
    b) 세포 표면 hTREM2 수준이 기준 수준보다 낮은 대상체를 선별하는 단계로서, 기준 수준이 건강한 대상체로부터 얻은 샘플 내 세포 표면 hTREM2 수준인, 단계; 및
    c) 치료적 유효량의 제1항 내지 제64항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 제65항 내지 제67항 중 어느 한 항의 핵산 분자 또는 핵산 분자 세트, 제68항 내지 제82항 중 어느 한 항의 벡터, 제83항의 세포, 또는 제85항의 약제학적 조성물을 선별된 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  99. 제98항에 있어서,
    상기 샘플이 뇌척수액을 포함하는 방법.
  100. 제98항 또는 제99항에 있어서,
    상기 샘플에서의 세포 표면 TREM2 수준이 유세포측정, 면역조직화학, 웨스턴 블롯팅, 면역형광 검정, 방사선면역검정(RIA), 효소-연관 면역흡착 검정(ELISA), 동종성 시간 분해 형광(HTRF), 또는 양전자 방출 단층촬영(PET)으로부터 선택되는 검정에 의해 결정되는 방법.
  101. 제97항 내지 제100항 중 어느 한 항에 있어서,
    TREM2 기능 상실과 관련된 질환은 신경염증성 또는 신경변성 질환이며, 선택적으로 상기 신경염증성 또는 신경변성 질환은 알츠하이머병, 전두측두엽 치매, 파킨슨병, 근위축 측삭 경화증, 나수-하코라병, 다발성 경화증, 근위축 측삭 경화증(ALS), 항-NMDA 수용체 뇌염, 자폐증, 뇌 루푸스(NP-SLE), 화학-유도 말초 신경병증(CIPN), 포진 후 신경통, 만성 염증성 탈미엘린화 다발신경병증(CIDP), 간질, 길랑-바레 증후군(GBS), 봉입체 근육염, 리소좀 저장 질병, 스핑고미엘린지질증(니만-픽 C), 점액다당질 축적증 II/IIIB, 이염색백색질 장애, 다초점성 운동 신경병증, 중증 근무력증, 신경-베체트병, 시신경척수염(NMO), 시신경염, 다발근육염, 피부근육염, 라스무센 뇌염, 레트 증후군, 뇌졸중, 횡단 척수염, 외상성 뇌 손상, 척수 손상, 바이러스성 뇌염, 또는 세균성 수막염인, 방법.
  102. 제97항 내지 제101항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 질환은 알츠하이머병인, 방법.
  103. 제97항 내지 제101항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 질환은 파킨슨병인, 방법.
  104. 제97항 내지 제101항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 질환은 다발성 경화증인, 방법.
  105. 제97항 내지 제101항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 질환은 전두측두엽 치매인, 방법.
  106. 제97항 내지 제105항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 핵산 분자 또는 핵산 분자 세트, 벡터, 세포, 또는 약제학적 조성물이 경구, 정맥 내, 두개 내, 척수강 내, 피하, 또는 비강 내 경로를 통해 대상체에게 투여되는 방법.
  107. 대상체에서 hTREM2 단백질을 안정화시키는 방법으로서, hTREM2를 안정화시키는데 유효한 양으로 제1항 내지 제64항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 제65항 내지 제67항 중 어느 한 항의 핵산 분자 또는 핵산 분자 세트, 제68항 내지 제82항 중 어느 한 항의 벡터, 제83항의 세포, 또는 제85항의 약제학적 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  108. 제97항 내지 제107항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 방법은 대상체에게 적어도 하나의 추가 치료제를 투여하는 단계 또는 적어도 하나의 추가 치료 과정을 수행하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  109. 제108항에 있어서,
    상기 추가 치료제는 BACE 억제제, 항-Tau 항체, Tau 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 항-아밀로이드 베타 항체, 핀골리모드, BG12 또는 디메틸 푸마레이트, 인터페론 베타 또는 타이사브리 중 하나 이상을 포함하는, 방법.
  110. 제108항 또는 제109항에 있어서,
    제1항 내지 제64항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 제65항 내지 제67항 중 어느 한 항의 핵산 분자 또는 핵산 분자 세트, 제68항 내지 제82항 중 어느 한 항의 벡터, 제83항의 세포, 또는 제85항의 약제학적 조성물이 추가 치료제와 동시에, 이전에, 또는 이후에 투여되는, 방법.
  111. 제97항 내지 제110항 중 어느 한 항에 있어서,
    항체 또는 이의 항원 결합 단편, 핵산 분자 또는 핵산 분자 세트, 벡터, 세포, 또는 약제학적 조성물의 투여는 하기 효과 a~d 중 하나 이상을 갖는 방법:
    a) 식세포작용 및 화학주성과 같은 TREM2-의존성 세포 활동 증가,
    b) TREM2-의존성 유전자 전사 유발,
    c) Syk-인산화를 통한 TREM2-의존성 세포 내 신호전달 경로 증가,
    d) 세포 잔해의 제거 증가.
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