KR20200051586A - 면역 억제성 단백질 흡착 재료 및 흡착 칼럼 - Google Patents

면역 억제성 단백질 흡착 재료 및 흡착 칼럼 Download PDF

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카즈마사 오가사와라
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도레이 카부시키가이샤
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Abstract

본 개시는 담체 재료의 물리적 강도가 유지되고, 면역 억제성 단백질을 효율적으로 흡착하는 흡착 재료를 제공하는 것을 목적으로 하고 있다. 본 개시는 소정 식으로 나타내어지는 폴리아민 및 소정 식으로 나타내어지는 지방족 아민으로부터 선택되는 1종 이상의 질소 함유 화합물이 결합한 수불용성 담체를 포함하고, 상기 수불용성 담체 상의 아미노기의 총량은 1g당 0μmol 초과 2500μmol 이하이며, 또한 상기 수불용성 담체 상의 1급 아미노기의 양은 1g당 450μmol 이하인 면역 억제성 단백질의 흡착 재료를 제공한다.

Description

면역 억제성 단백질 흡착 재료 및 흡착 칼럼
본 개시는 면역 억제성 단백질의 흡착 재료 및 그것을 포함하는 흡착 칼럼에 관한 것이다.
암은 면역과 밀접하게 관계되어 있는 것이 명백하게 되어 와 있으며, 최근 많은 진행암에서 면역 억제성의 혈액 성분의 농도가 상승하고 있는 것이 보고되어 와 있다.
면역 억제성의 혈액 성분 중에서도 대표적인 것이 TGF-β(Transforming Growth Factor-β)이다. 최근, 암의 진전에 관여하는 분자 중 하나인 TGF-β가 관여하는 면역 억제 시그널이 항진함으로써 암세포는 면역계로부터의 공격을 면하고, 그 결과 암이 진행되는 것이 명백해져 있다. TGF-β는 단독으로는 분자량 25000 정도의 단백질이며, 5개의 아이소폼(TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, TGF-β4, TGF-β5)이 존재한다. TGF-β는 혈액 중에서는 분자량 75000 정도의 Latency Associated Peptide(이하, LAP라고 칭한다)라고 불리는 단백질과 결합하여 존재하고 있다 (이하, LAP 결합형 TGF-β라고 칭한다).
암을 치료하는 방법으로서는 암세포로부터 방출되는 TGF-β가 관여하는 면역 억제 시그널을 블록하는 약이 개발되어 와 있지만 아직 유효한 치료법이 되기까지에는 도달해 있지 않다.
한편, TGF-β를 제거하면 암세포가 면역계로부터 면하는 시그널이 해제되어 환자의 면역력이 높아져 종양의 퇴축이나 암 진행의 억제를 기대할 수 있다.
단백질을 흡착하는 재료로서 수불용성 담체에 화합물을 고정화한 재료가 몇가지 개시되어 있다. 예를 들면. 특허문헌 1에는 크링글 배열을 갖는 단백질 또는 펩티드를 흡착하는 재료로서 수불용성 담체에 리신을 고정화한 재료가 개시되어 있다. 또한, 특허문헌 2에는 하이 모빌리티 그룹 단백 등의 염증성 사이토카인을 흡착하는 아미노기를 갖는 관능기가 도입된 흡착 담체가 개시되어 있다. 또한, 특허문헌 3에는 변성 저밀도 리포 단백질 및/또는 종말당화산물을 제거하기 위한 소정 식으로 나타내어지는 폴리아민 유도체를 유효 성분으로서 포함하는 흡착제가 개시되어 있다. 또한, 특허문헌 4에는 사이토카인 및/또는 슈퍼 항원을 흡착하는 재료로서 폴리아민을 갖는 기재로 이루어지는 흡착 재료가 개시되어 있다.
또한, 특허문헌 5 및 6에는 LAP 결합형 TGF-β를 흡착하는 재료로서 수불용성 담체에 친수성 아미노기(4급 암모늄기)를 고정한 흡착재가 개시되어 있다.
특허문헌 7에는 백혈구 및 사이토카인을 흡착 또는 제거하기 위한 소정의 구멍 지름과 구멍 용적률을 갖는 친수성 아민 잔기가 결합해 있는 흡착기가 개시되어 있다.
일본 특허공개 2012-062259호 공보 일본 특허공개 2012-005827호 공보 일본 특허공개 2011-139806호 공보 일본 특허공개 2006-272075호 공보 국제공개 2003/101511호 일본 특허공개 2003-339854호 공보 일본 특허공개 2007-202634호 공보
그러나 특허문헌 1~4에서는 TGF-β 등의 면역 억제성 단백질의 흡착성을 높이기 위한 기술의 개시는 없다. 또한, 특허문헌 5~7에 개시되는 재료에 고정되는 4급 암모늄기나 친수성 아민 잔기는 친수성이 높기 때문에 담체 재료의 물리적 강도를 유지하면서 흡착 효율을 높이는 것이 곤란한 경우가 생각된다.
그 때문에 담체 재료의 물리적 강도를 유지하면서 혈액 중의 TGF-β 또는 LAP 결합형 TGF-β를 효율적으로 흡착할 수 있는 흡착 재료의 개발이 요구되어 있다.
그래서 본 개시는 담체 재료의 물리적 강도가 유지되고, 면역 억제성 단백질을 효율적으로 흡착하는 흡착 재료를 제공하는 것을 목적으로 하고 있다.
본 발명자들은 수불용성 담체에 폴리아민 잔기 또는 지방족 아민 잔기를 함유시킴으로써 면역 억제성 단백질이 흡착하는 것을 발견했다. 또한, 수불용성 담체에 폴리아민 잔기 또는 지방족 아민 잔기를 함유시키는 것에 추가하여 수불용성 담체 상의 아미노기의 총량 및 상기 수불용성 담체 상의 1급 아미노기의 양을 소정의 범위로 한 경우 담체 재료의 물리적 강도가 유지되고, 또한 면역 억제성 단백질(특히, TGF-β 또는 LAP 결합형 TGF-β)을 효율적으로 흡착할 수 있는 것을 발견하여 본 개시에 도달했다.
본 실시형태의 실시형태예를 이하에 기재한다.
[1] 이하의 식 (1)로 나타내어지는 폴리아민, 이하의 식 (2)로 나타내어지는 제 1급 지방족 아민, 및 식 (3)으로 나타내어지는 제 2급 지방족 아민으로부터 선택되는 1종 이상의 질소 함유 화합물이 결합한 수불용성 담체를 포함하고,
상기 수불용성 담체 상의 아미노기의 총량은 1g당 0μmol 초과 2500μmol 이하이며, 또한 상기 수불용성 담체 상의 1급 아미노기의 양은 1g당 450μmol 이하인 면역 억제성 단백질의 흡착 재료.
R1R2N-X-NR3R4···식 (1)
[식 (1) 중 X는 2~20개의 탄소 원자를 갖는 포화 또는 불포화의 지방족 탄화수소기 또는 3~20개의 탄소 원자를 갖는 포화 또는 불포화의 지방족 탄화수소기에 있어서 1~5개의 탄소 원자를 질소 원자로 치환한 헤테로 원자 함유 탄소쇄이며, 상기 질소 원자에 결합하는 수소 원자는 아미노기를 갖고 있어도 좋은 알킬기로 치환되어 있어도 좋고, R1~R4는 각각 독립적으로 수소 원자 또는 알킬기이다]
NH2R5···식 (2)
[식 (2) 중 R5는 1~12개의 탄소 원자를 갖는 포화 또는 불포화의 지방족 탄화수소기이다]
NHR6R7···식 (3)
[식 (3) 중 R6 및 R7은 각각 독립적으로 1~12개의 탄소 원자를 갖는 포화 또는 불포화의 지방족 탄화수소기이다]
[2] [1]에 있어서, 상기 질소 함유 화합물은 상기 식 (1)로 나타내어지는 폴리아민을 포함하는 흡착 재료.
[3] [1] 또는 [2]에 있어서, 상기 질소 함유 화합물은 링커를 통해 상기 수불용성 담체에 결합하고 있는 흡착 재료.
[4] [1] 내지 [3] 중 어느 하나에 있어서, 상기 아미노기의 총량은 1g당 30~2400μmol인 흡착 재료.
[5] [4]에 있어서, 상기 아미노기의 총량에 대한 상기 1급 아미노기의 양의 비율(1급 아미노기의 양/아미노기의 총량)은 0.30 이하인 흡착 재료.
[6] [1] 내지 [5] 중 어느 하나에 있어서, 상기 수불용성 담체의 형상은 섬유 또는 입자이며,
상기 섬유 또는 상기 입자의 직경은 15~50㎛이며,
상기 수불용성 담체의 표면의 산술 평균 거칠기는 0.1~3.0㎛인 흡착 재료.
[7] [1] 내지 [6] 중 어느 하나에 있어서, 상기 면역 억제성 단백질은 TGF-β 또는 LAP 결합형 TGF-β인 흡착 재료.
[8] [1] 내지 [7] 중 어느 하나에 기재된 흡착 재료를 구비하는 흡착 칼럼.
[9] [8]에 있어서, 혈액 정화 요법에 사용하기 위한 흡착 칼럼.
(발명의 효과)
본 개시에 의해 담체 재료의 물리적 강도가 유지되고, 또한 면역 억제성 단백질(특히, TGF-β 또는 LAP 결합형 TGF-β)을 효율적으로 흡착하는 흡착 재료를 제공할 수 있다.
도 1은 디에틸렌트리아민을 수불용성 담체 상에 고정화한 경우에 얻어지는 구조예를 나타내는 개념도이다.
도 2는 레이디얼 플로형의 흡착 칼럼의 일례의 종단면도이다.
이하, 본 실시형태에 대해서 더 상세하게 설명한다. 본 명세서의 전체에 걸쳐 단수형의 표현은 특별히 언급하지 않는 한 그 복수형의 개념도 포함하는 것이 이해되어야 한다. 따라서, 단수형의 관사(예를 들면, 영어의 경우에는 「a」, 「an」, 「the」 등)는 특별히 언급하지 않는 한 그 복수형의 개념도 포함하는 것이 이해되어야 한다. 또한, 본 명세서에 있어서 사용되는 용어는 특별히 언급하지 않는 한 상기 분야에서 통상 사용되는 의미로 사용되는 것이 이해되어야 한다. 따라서, 그 외에 정의되지 않는 한 본 명세서 중에서 사용되는 모든 전문 용어 및 과학 기술 용어는 본 개시가 속하는 분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 모순되는 경우 본 명세서(정의를 포함해서)가 우선된다.
본 실시형태에 의한 흡착 재료는 면역 억제성 단백질을 흡착하기 위한 면역 억제성 단백질 흡착 재료에 관한다. 또한, 본 실시형태에 의한 흡착 재료는 식 (1)로 나타내어지는 폴리아민, 식 (2)로 나타내어지는 제 1급 지방족 아민, 및 식 (3)으로 나타내어지는 제 2급 지방족 아민으로부터 선택되는 1종 이상의 질소 함유 화합물이 결합한 수불용성 담체를 포함한다. 또한, 본 실시형태에 의한 흡착 재료에 있어서 수불용성 담체 상의 아미노기의 총량이 흡착 재료 1g당 0μmol 초과 2500μmol 이하이며, 또한 수불용성 담체 상의 1급 아미노기의 양이 흡착 재료 1g당 450μmol 이하이다.
「수불용성 담체 상의 아미노기」는 수불용성 담체 상에 존재하는 1급 아미노기(-NH2), 2급 아미노기, 3급 아미노기, 및 4급 아미노기(4급 암모늄기)를 의미한다. 질소 함유 화합물이 수불용성 담체에 결합할 때 질소 함유 화합물 중의 결합 위치에 의존하여 1급 아미노기, 2급 아미노기, 3급 아미노기, 및/또는 4급 아미노기가 결합 후의 질소 함유 화합물 중에 존재한다. 예를 들면, 식 (1)로 나타내어지는 폴리아민이 수불용성 담체에 결합할 때 폴리아민 중의 결합 위치에 의존하여 1급 아미노기, 2급 아미노기, 3급 아미노기, 및/또는 4급 아미노기가 결합 후의 폴리아민 중에 존재하게 된다. 또한, 질소 함유 화합물은 상기 화합물 중의 아미노기(또는 질소 원자)를 통해 수불용성 담체에 결합하고 있는 것이 바람직하다. 본 명세서에 있어서 「수불용성 담체 상의 아미노기」는 그와 같이 발생한 질소 함유 화합물 유래의 1급 아미노기, 2급 아미노기, 3급 아미노기, 및 4급 아미노기를 적어도 포함하는 개념이다. 질소 함유 화합물이 링커를 통해 결합하고 있을 경우 「수불용성 담체 상의 아미노기」는 링커 유래의 1급 아미노기, 2급 아미노기, 3급 아미노기, 및 4급 아미노기를 포함한다.
또한, 「아미노기의 총량」이란 수불용성 담체 상의 1급 아미노기, 2급 아미노기, 3급 아미노기, 및 4급 아미노기의 총량(μmol)을 의미한다. 또한, 「수불용성 담체 상의 1급 아미노기」란 수불용성 담체 상에 존재하는 1급 아미노기를 의미한다. 「수불용성 담체 상의 1급 아미노기」는 질소 함유 화합물(예를 들면, 폴리아민) 중의 반응하지 않고 남은 1급 아미노기를 적어도 포함하는 개념이다.
「질소 함유 화합물 잔기」란 본 명세서에서 사용될 경우 질소 함유 화합물을 수불용성 담체에 직접적 또는 간접적으로 결합시켜서 얻어지는 기를 의미한다. 마찬가지로, 「폴리아민 잔기」란 식 (1)로 나타내어지는 폴리아민을 수불용성 담체에 직접적 또는 간접적으로 결합시켜서 얻어지는 기를 의미하고, 「지방족 아민 잔기」란 식 (2) 또는 식 (3)으로 나타내어지는 지방족 아민(지방족 아민이라고도 칭한다)을 수불용성 담체에 직접적 또는 간접적으로 결합시켜서 얻어지는 기를 의미한다.
질소 함유 화합물은 식 (1)로 나타내어지는 폴리아민, 식 (2)로 나타내어지는 제 1급 지방족 아민, 및 식 (3)으로 나타내어지는 제 2급 지방족 아민으로부터 선택된다. 질소 함유 화합물은 1종을 단독으로 사용해도 좋고, 복수종을 조합하여 사용해도 좋다.
일실시형태에 있어서 질소 함유 화합물은 식 (1)로 나타내어지는 폴리아민이다.
R1R2N-X-NR3R4···식 (1)
[식 (1) 중 X는 2~20개의 탄소 원자를 갖는 포화 또는 불포화의 지방족 탄화수소기 또는 3~20개의 탄소 원자를 갖는 포화 또는 불포화의 지방족 탄화수소기에 있어서 1~5개의 탄소 원자를 질소 원자로 치환한 헤테로 원자 함유 탄소쇄이며, 상기 질소 원자에 결합하는 수소 원자는 아미노기를 갖고 있어도 좋은 알킬기로 치환 되어 있어도 좋고, R1~R4는 각각 독립적으로 수소 원자 또는 알킬기이다]
식 (1)에 있어서 X는, 예를 들면 2~20개(예를 들면, 16개 이하, 14개 이하, 12개 이하, 10개 이하, 8개 이하, 6개 이하, 4개 이하)의 탄소 원자를 갖는 포화 또는 불포화의 지방족 탄화수소기이다. 식 (1)에 있어서 X는, 예를 들면 3~20개(예를 들면, 16개 이하, 14개 이하, 12개 이하, 10개 이하)의 탄소 원자를 갖는 포화 또는 불포화의 지방족 탄화수소기에 있어서 1~5개(예를 들면, 1~3개)의 탄소 원자를 질소 원자로 치환한 헤테로 원자 함유 탄소쇄이며, 상기 질소 원자에 결합하는 수소 원자는 아미노기를 갖고 있어도 좋은 알킬기(예를 들면, 1~6개(바람직하게는 1~4개)의 탄소 원자를 갖는다)로 치환되어 있어도 좋다. R1~R4는 각각 독립적으로 수소 원자 또는 알킬기이다. 알킬기는, 예를 들면 1~6개(바람직하게는 1~4개)의 탄소 원자를 갖는다. 지방족 탄화수소기는 직쇄상이어도 좋고, 분기쇄상이어도 좋다.
식 (1)로 나타내어지는 폴리아민은 하기 식 (1-1)~(1-6) 중 어느 하나로 나타내어지는 폴리아민인 것이 바람직하다.
H2N-(CH2)p1-NH2 ···식 (1-1)
[식 (1-1) 중 p1은 2~12(바람직하게는 2~6, 2~5, 또는 2~4)의 정수이며, 양 말단의 1급 아미노기의 수소 원자 중 적어도 1개는 알킬기로 치환되어 있어도 좋다],
H2N-(CH2)p1-NH-(CH2)p2-NH2 ···식 (1-2)
[식 (1-2) 중 p1 및 p2는 각각 독립적으로 2~5(바람직하게는 2~4, 2~3, 2)의 정수이며, 2급 아미노기의 수소 원자는 아미노기를 갖고 있어도 좋은 알킬기로 치환되어 있어도 좋고, 양 말단의 1급 아미노기의 수소 원자 중 적어도 1개는 알킬기로 치환되어 있어도 좋다],
H2N-(CH2)p1-NH-(CH2)p2-NH-(CH2)p3-NH2 ···식 (1-3)
[식 (1-3) 중 p1, p2, 및 p3은 각각 독립적으로 2~5(바람직하게는 2~4, 2~3, 2)의 정수이며, 2급 아미노기의 수소 원자는 각각 독립적으로 아미노기를 갖고 있어도 좋은 알킬기로 치환되어 있어도 좋고, 양 말단의 1급 아미노기의 수소 원자 중 적어도 1개는 알킬기로 치환되어 있어도 좋다],
H2N-(CH2)p1-NH-(CH2)p2-NH-(CH2)p3-NH-(CH2)p4-NH2 ···식 (1-4)
[식 (1-4) 중 p1, p2, p3, 및 p4는 각각 독립적으로 2~5(바람직하게는 2~4, 2~3, 2)의 정수이며, p1, p2, p3, 및 p4의 합은 17 이하이며, 2급 아미노기의 수소 원자는 각각 독립적으로 아미노기를 갖고 있어도 좋은 알킬기로 치환되어 있어도 좋고, 양 말단의 1급 아미노기의 수소 원자 중 적어도 1개는 알킬기로 치환되어 있어도 좋다],
H2N-(CH2)p1-NH-(CH2)p2-NH-(CH2)p3-NH-(CH2)p4-NH-(CH2)p5-NH2 ···식 (1-5)
[식 (1-5) 중 p1, p2, p3, p4, 및 p5는 각각 독립적으로 2~5(바람직하게는 2~4, 2~3, 2)의 정수이며, p1, p2, p3, p4, 및 p5의 합은 16 이하이며, 2급 아미노기의 수소 원자는 각각 독립적으로 아미노기를 갖고 있어도 좋은 알킬기로 치환되어 있어도 좋고, 양 말단의 1급 아미노기의 수소 원자 중 적어도 1개는 알킬기로 치환되어 있어도 좋다],
H2N-(CH2)p1-NH-(CH2)p2-NH-(CH2)p3-NH-(CH2)p4-NH-(CH2)p5-NH-(CH2)p6-NH2 ···식 (1-6)
[식 (1-6) 중 p1, p2, p3, p4, p5, 및 p6은 각각 독립적으로 2~5(바람직하게는 2~4, 2~3, 2)의 정수이며, p1, p2, p3, p4, p5, 및 p6의 합은 15 이하이며, 2급 아미노기의 수소 원자는 각각 독립적으로 아미노기를 갖고 있어도 좋은 알킬기로 치환되어 있어도 좋고, 양 말단의 1급 아미노기의 수소 원자 중 적어도 1개는 알킬기로 치환되어 있어도 좋다]
식 (1-2)~(1-6)에 있어서 2급 아미노기의 질소 원자에 결합할 수 있는 「아미노기를 갖고 있어도 좋은 알킬기」의 탄소 원자수는, 예를 들면 1~6개이며, 바람직하게는 1~5개이며, 바람직하게는 1~4개이며, 바람직하게는 1~3개이다. 식 (1-1)~(1-6)에 있어서 양 말단의 1급 아미노기의 질소 원자에 결합할 수 있는 「알킬기」의 탄소 원자수는, 예를 들면 1~6개이며, 바람직하게는 1~5개이며, 바람직하게는 1~4개이며, 바람직하게는 1~3개이다. 이들의 「알킬기」는 직쇄상 또는 분기쇄상인 것이 바람직하다.
식 (1)로 나타내어지는 폴리아민으로서는, 예를 들면 에틸렌디아민, N-에틸 에틸렌디아민, 디에틸렌트리아민, N-에틸디에틸렌트리아민, 트리에틸렌테트라아민, 테트라에틸렌펜타민을 들 수 있다. 또한, 그 외에도 이하의 폴리아민을 들 수 있다. 3,3'-디아미노디프로필아민; 1,3－디아미노프로판; 놀스페르미딘; 호모스페르미딘; 아미노프로필카다베린; 아미노부틸카다베린; 놀스페르민; 테르모페르민; 아미노프로필호모스페르미딘; 카나발민; 호모스페르민; 아미노펜틸놀스페르미딘; N,N-비스(아미노프로필)카다베린; 카르도펜타민; 호모카르도펜타민; 테르모펜타민; 카르도헥사민; 호모카르도헥사민; 테르모헥사민; 호모테르모헥사민; N4-아미노프로필놀스페르미딘; N4-아미노프로필스페르미딘; N4-아미노프로필놀스페르민.
일실시형태에 있어서 질소 함유 화합물은 식 (2)로 나타내어지는 제 1급 지방족 아민 또는 식 (3)으로 나타내어지는 제 2급 지방족 아민이다.
NH2R5···식 (2)
[식 (2) 중 R5는 1~12개의 탄소 원자를 갖는 포화 또는 불포화의 지방족 탄화수소기이다],
NHR6R7···식 (3)
[식 (3) 중 R6 및 R7은 각각 독립적으로 1~12개의 탄소 원자를 갖는 포화 또는 불포화의 지방족 탄화수소기이다]
식 (2) 또는 (3)으로 나타내어지는 지방족 아민에 있어서 지방족 탄화수소기는 직쇄상 또는 분기쇄상의 지방족 탄화수소기인 것이 바람직하며, 직쇄상 또는 분기쇄상의 포화 지방족 탄화수소기인 것이 바람직하다. 지방족 탄화수소기의 탄소수는 1~8개인 것이 바람직하며, 1~6개인 것이 바람직하며, 1~4개인 것이 바람직하다.
지방족 아민의 구체예로서는 에틸아민, 프로필아민, 부틸아민, 펜틸아민, 헥실아민, 헵틸아민, 옥틸아민, 노닐아민, 데실아민 등의 모노알킬아민; 디에틸아민, 디프로필아민, 디부틸아민, 디헵틸아민, 디옥틸아민, 디시클로헥실아민 등의 디알킬아민을 들 수 있다.
질소 함유 화합물로서는, 예를 들면 에틸아민, 에틸렌디아민, 디에틸아민, N-에틸에틸렌디아민, 디에틸렌트리아민, N-에틸디에틸렌트리아민, 트리에틸렌테트라아민 또는 테트라에틸렌펜타민을 들 수 있다. 이들 중에서도 바람직하게는 에틸렌디아민, 디에틸렌트리아민, 트리에틸렌테트라아민 또는 테트라에틸렌펜타민을 들 수 있다. 질소 함유 화합물은 시판되어 있거나 또는 공지의 방법 또는 그것에 준한 방법에 의해 제조할 수 있다.
질소 함유 화합물이 결합한 수불용성 담체란 상기 질소 함유 화합물이 직접적으로 공유 결합하고 있는 수불용성 담체 또는 링커를 통해 간접적으로 결합하고 있는 수불용성 담체의 양쪽을 포함한다. 또한, 질소 함유 화합물이 결합한 수불용성 담체에는 상기 폴리아민 및 상기 지방족 아민으로부터 선택되는 각각 상이한 2종 이상의 질소 함유 화합물이 결합하고 있는 것도 포함한다.
질소 함유 화합물로서 식 (1)로 나타내어지는 폴리아민을 사용하는 경우 복수의 아미노기가 수불용성 담체에 결합하여 가교 구조를 형성하고 있어도 좋다. 즉, 질소 함유 화합물로서 식 (1)로 나타내어지는 폴리아민을 수불용성 담체에 결합시킨 경우 폴리아민 중 아미노기의 적어도 2개가 수불용성 담체에 결합하면 가교 구조를 형성하게 된다. 예로서, 식 (1)로 나타내어지는 폴리아민의 대표적인 화합물인 디에틸렌트리아민(이하, DETA라고도 칭한다)을 수불용성 담체 상에 고정화한 경우에 얻어지는 구조예를 도 1에 나타낸다. 도 1의 예에서는 N-메틸올-α-클로로아세트아미드(이하, NMCA라고도 칭한다)를 링커로서 사용하고 있다. 도 1에 나타내는 바와 같이 디에틸렌트리아민의 아미노기 중 양 말단 1급 아미노기가 반응한 경우, 편 말단 1급 아미노기 및 2급 아미노기가 반응한 경우, 모든 아미노기(양 말단 1급 아미노기 및 2급 아미노기)가 반응한 경우에 있어서 가교 구조가 얻어진다.
「면역 억제성 단백질」이란 면역계를 억제하는 기능을 갖는 단백질을 의미하고, 예를 들면 TGF-β, LAP 결합형 TGF-β, 면역 억제 산성 단백, 암 태아성 항원, 인돌아민산소 첨가 효소(Indoleamine2,3-Dioxygenase: IDO), 유도형 일산화 질소 합성 효소(inducible nitric oxide synthase: iNOS), 아르기나아제(arginase: ARG), 인터류킨4, 인터류킨6, 인터류킨10, 인터류킨13, 종양 괴사 인자 등을 들 수 있다. 이들 중에서도 암 환자의 종양의 퇴축이나 암 진행의 억제를 목적으로 한 치료의 효과를 최대화한다는 점에서 본 실시형태에 의한 흡착 재료는 TGF-β와 LAP 결합형 TGF-β를 혈액 중으로부터 선택적으로 흡착하는 것이 바람직하다. 또한, 「선택적으로 흡착하는」이란 흡착 재료를 충전한 칼럼에 면역 억제성 단백질(예를 들면, TGF-β 또는 LAP 결합형 TGF-β)을 포함하는 액체(예를 들면, 혈액 또는 혈액 세포 혼합액)를 통하게 했을 때 통과한 액체 중 면역 억제성 단백질의 농도가 통과 전보다 감소하고, 흡착한 단백질 중 면역 억제성 단백질의 존재 비율이 통과 전보다 증가하는 것을 의미한다.
「수불용성 담체」란 상온(25℃)의 물에 침지한 경우에 형상 변화를 일으키지 않는 담체를 가리키며, 구체적으로는 25℃의 물에 1시간 침지시켰을 때의 중량 변화가 5% 이하인 담체인 것이 바람직하다. 수불용성 담체의 재료로서는 특별히 제한되는 것은 아니지만 폴리스티렌으로 대표되는 폴리 방향족 비닐 화합물, 폴리에테르술폰, 폴리술폰, 폴리아릴에테르술폰, 폴리에테르이미드, 폴리이미드, 폴리아미드, 폴리페닐렌술피드 등을 바람직하게 들 수 있다. 수불용성 담체의 재료는 시판되어 있거나 또는 공지의 방법 또는 그것에 준한 방법에 의해 제조할 수 있다. 이들의 재료는 혈액과 접촉했을 때에 보체를 활성화하기 쉽다고 하는 수산기를 실질적으로 갖지 않는 재료이다. 이들 중에서도 단위 중량당 방향환의 수가 많고, 아미노기를 고정화하기 쉬운 점에서 폴리스티렌이 바람직하다. 이들 고분자 재료는 단독으로 사용해도 좋고, 복수종을 조합해서 사용해도 좋다. 또한, 수불용성 담체는 폴리 방향족 비닐 화합물(예를 들면, 폴리스티렌)을 포함하는 고분자 재료인 것이 바람직하다. 수불용성 담체로서는 폴리스티렌 부분에 아미노기를 고정화하기 위한 활성 할로겐기 등의 링커를 도입하기 쉬운 점, 및 폴리올레핀 부분에 의한 강도 보강에 의한 취급의 용의함, 및 내약품성의 점으로부터 폴리스티렌과 폴리올레핀의 공중합체(예를 들면, 폴리스티렌과 폴리에틸렌의 공중합체 또는 폴리스티렌과 폴리프로필렌의 공중합체)가 바람직하다. 또한, 고분자 재료는 블렌드 또는 알로이화한 것이어도 좋고, 특히 폴리스티렌과 폴리올레핀의 폴리머 알로이(예를 들면, 폴리스티렌과 폴리에틸렌의 폴리머 알로이 또는 폴리스티렌과 폴리프로필렌의 폴리머 알로이)는 내약품성을 갖고, 물리 형상을 유지하기 쉬운 관점으로부터 바람직하다. 그 중에서도 혈액 체외 순환 요법에서 사용 실적이 있는 폴리스티렌과 폴리프로필렌의 폴리머 알로이가 바람직하다. 또한, 사용하는 수불용성 담체는 아미노기를 실질적으로 갖지 않는 것이 바람직하다.
질소 함유 화합물은 수불용성 담체에 직접적으로 결합해도 좋고, 링커를 통해 간접적으로 수불용성 담체에 결합해도 좋다. 질소 함유 화합물을 수불용성 담체에 결합시키는 방법은 특별히 제한되는 것은 아니고, 예를 들면 화학적 방법에 의해 수불용성 담체 표면에 링커를 통해 공유 결합시키는 방법을 들 수 있다. 링커로서는, 예를 들면 반응성 관능기를 사용할 수 있다. 또한, 링커로서는 아미드 결합, 요소 결합, 에테르 결합 또는 에스테르 결합 등의 전기적으로 중성의 화학 결합을 갖고 있는 것이 바람직하며, 아미드 결합 또는 요소 결합을 갖고 있는 것이 바람직하다. 링커로서의 반응성 관능기로서는, 예를 들면 할로메틸기, 할로아세틸기, 할로아세트아미드메틸기 또는 할로겐화알킬기 등의 활성 할로겐기, 에폭시기, 카복실기, 이소시아네이트기, 티오이소시아네이트기 또는 산무수물기 등을 들 수 있다. 이들 중에서도 활성 할로겐기(특히, 할로아세틸기)는 제조가 용이하며, 반응성이 적절히 높아 아미노기의 고정화 반응이 온화한 조건에서 수행할 수 있고, 발생하는 공유 결합이 화학적으로 안정되기 때문에 바람직하다. 반응성 관능기를 도입한 폴리머의 구체적인 예로서는 클로로아세트아미드메틸기를 부가한 폴리스티렌, 클로로아세트아미드메틸기를 부가한 폴리술폰, 클로로아세트아미드메틸기를 부가한 폴리에테르이미드 등을 들 수 있다. 또한, 이들의 폴리머는 유기 용매에 대하여 가용이며, 성형하기 쉬운 이점이 있다. 질소 함유 화합물의 첨가량의 기준은 링커의 구조에도 의하지만, 예를 들면 수불용성 담체 1g에 대하여 10~10000μmol이다. 또한, 질소 함유 화합물은 과잉량으로 사용해도 좋다.
반응성 관능기는 미리 수불용성 담체와 반응시킴으로써 도입할 수 있다. 예를 들면, 수불용성 담체가 폴리스티렌이며, 반응성 관능기가 클로로아세트아미드메틸기인 경우에는 폴리스티렌과 N-메틸올-α-클로로아세트아미드를 반응시킴으로써 클로로아세트아미드메틸기를 부가한 폴리스티렌을 얻을 수 있다.
수불용성 담체 상의 아미노기의 총량은 흡착 재료 1g당 0μmol 초과 2500μmol 이하이다. 아미노기의 총량은 흡착 재료 1g당, 예를 들면 10μmol 이상, 20μmol 이상, 30μmol 이상, 40μmol 이상, 50μmol 이상, 100μmol 이상, 200μmol 이상, 300μmol 이상, 400μmol 이상, 500μmol 이상, 또는 600μmol 이상이다. 또한, 아미노기의 총량은 흡착 재료 1g당, 예를 들면 2400μmol 이하, 2300μmol 이하, 2200μmol 이하, 2100μmol 이하, 2000μmol 이하, 1700μmol 이하, 또는 1500μmol 이하이다. 예시한 어느 하한값도 예시한 어느 상한값과 조합할 수 있다. 예를 들면, 아미노기의 총량은 흡착 재료 1g당, 예를 들면 0μmol 초과 2400μmol 이하, 10μmol 이상 2400μmol 이하(10~2400μmol), 20μmol 이상 2400μmol 이하(20~2400μmol), 30μmol 이상 2400μmol 이하(30~2400μmol)이다. 수불용성 담체 상의 면역 억제성 단백질과 효과적으로 상호 작용할 수 있는 아미노기가 전혀 존재하지 않을 경우 흡착 성능이 낮아진다. 또한, 아미노기의 총량이 흡착 재료 1g당 2500μmol을 초과하는 경우에도 흡착 성능이 낮아진다. 이것은 이하의 이유에 의한 것으로 추측하고 있다. 단백질의 표면 전하 분포는 불균일하며, 단백질은 부분적으로 정전하나 부전하를 갖고 있다. 그 때문에 액 중에서 양(正)으로 대전한 아미노기의 고정화 밀도가 높으면 양으로 대전한 단백질 표면과 정전 반발을 일으키고, 결과적으로 단백질은 표면에 흡착되기 어려워진다. 또한, 상기 추측에 의해 본 실시형태가 제한되는 경우는 없다.
수불용성 담체 상의 아미노기의 총량은, 예를 들면 아미노기를 산염기 역적정을 이용해서 측정함으로써 1급 아미노기의 양, 2급 아미노기의 양, 3급 아미노기의 양, 및 4급 아미노기(4급 암모늄기)의 양의 합으로서 구할 수 있다. 즉, 우선 폴리프로필렌제 용기에 흡착 재료 및 과잉량의 수산화나트륨 수용액을 첨가하여 실온에서 충분 교반하고, 흡착 재료 중의 염이 부가된 아미노기를 탈염한다. 이어서, 흡착 재료를 이온 교환수로 용액이 중성으로 될 때까지 충분하게 세정하고, 중량 변화가 1% 이하가 될 때까지 건조한다. 이어서, 건조된 흡착 재료 중의 아미노기를 과잉의 산을 포함하는 표준 용액의 일정량과 반응시킨다. 이어서, 아미노기와 반응하지 않고 남은 산의 양을 염기를 포함하는 표준 용액으로 적정한다. 이 방법에 의해 아미노기의 총량(μmol)을 구할 수 있다. 또한, 구체적으로는 수불용성 담체 상의 아미노기의 총량은 하기 실시예에 있어서 기재된 방법에 의해 구할 수 있다.
또한, 수불용성 담체 상의 1급 아미노기의 양은 흡착 재료 1g당 450μmol 이하이며, 바람직하게는 400μmol 이하이며, 바람직하게는 350μmol 이하이며, 바람직하게는 300μmol 이하이며, 바람직하게는 250μmol 이하이며, 바람직하게는 200μmol 이하이다. 1급 아미노기가 흡착 재료 1g당 450μmol보다 많으면 액 중에서의 담체의 친수성이 높아지고, 담체의 물리적 강도가 저하되어 미립자가 발생하기 쉬워진다. 또한, 상기 바람직한 수불용성 담체 상의 아미노기의 총량과 상기 바람직한 수불용성 담체 상의 1급 아미노기의 양은 임의로 조합할 수 있다.
1급 아미노기의 양은, 예를 들면 수불용성 담체로의 반응성 관능기의 결합량, 질소 함유 화합물의 종류, 질소 함유 화합물의 사용량을 조정함으로써 제어할 수 있다. 반응성 관능기의 결합량은, 예를 들면 반응성 관능기의 종류 또는 용매의 종류, 침지 온도 또는 침지 시간 등의 반응 조건에서 제어할 수 있다. 예를 들면, 수불용성 담체가 폴리 방향족 비닐 화합물을 포함할 경우에는 가교제를 사용하여 반응성 관능기의 결합 가능 개소를 제어할 수도 있다. 또한, 질소 함유 화합물의 고정화량은 질소 함유 화합물의 종류나 반응성 관능기의 결합량에 추가하여 용매의 종류, 침지 온도, 침지 시간 등의 반응 조건에서 제어할 수 있다.
수불용성 담체 상의 1급 아미노기의 양은, 예를 들면 티올 화합물의 존재하에서 1급 아미노기와 특이적으로 반응하여 형광 분자를 생성하는 o-프탈알데히드 (이하, OPA)를 사용하여 흡착 재료 중의 1급 아미노기를 역적정함으로써 측정할 수 있다. 즉, 우선 폴리프로필렌제 용기 중에 건조시킨 흡착 재료를 배치한다. 또한, 80체적% 메탄올 및 20체적% 탄산염 pH 표준액(pH 10.01) 중에 과잉의 OPA 및 티올 화합물의 디티오트레이톨(이하, DTT)을 용해시켜서 혼합 용액을 조제한다. 상기 혼합 용액을 상기 흡착 재료가 배치된 폴리프로필렌제 용기 중에 첨가하고, 실온에서 충분 교반한다. 교반 후, 용액을 회수하여 측정 샘플로 한다. 또한, 검량선용 샘플로서 기지 농도가 되도록 첨가한 OPA, DTT, 80체적% 메탄올 및 20체적% 탄산염 pH 표준액(pH 10.01)을 포함하는 혼합 용액을 준비한다. 측정 샘플 및 검량선용 샘플을 n-프로필아민 및 DTT를 포함하는 탄산염 pH 표준액(pH 10.01)과 혼합하고, 희석 후의 측정 샘플 및 희석 후의 검량선용 샘플을 얻는다. 일정 시간 후, 희석 후의 측정 샘플 및 희석 후의 검량선용 샘플에 대해서 340㎚에 있어서의 흡광도를 분광 광도계로 측정하고, 양자를 비교함으로써 수불용성 담체 상의 1급 아미노기의 양(μmol)을 산출할 수 있다. 구체적으로는 수불용성 담체 상의 1급 아미노기의 양은 하기 실시예에 있어서 기재한 방법에 의해 구할 수 있다.
흡착 재료 1g당 아미노기의 총량에 대한 1급 아미노기의 양의 비율(1급 아미노기의 양/아미노기의 총량)은 0.30 이하인 것이 바람직하며, 0.25 이하인 것이 바람직하며, 0.20 이하인 것이 바람직하다.
「섬유의 직경」은 이하의 방법에 의해 구할 수 있다. 우선, 섬유의 샘플 100개를 랜덤으로 채취하고, 주사형 전자 현미경을 사용하여 1000~3000의 배율로 단면(섬유의 신장 방향에 수직인 단면)의 사진을 샘플 1개에 대해 각각 1장 촬영한다. 이어서, 각각의 섬유 단면의 직경을 측정한다. 그리고 그들의 값의 평균값(합계 100개의 섬유 단면의 직경의 평균값)을 산출함으로써 「섬유의 직경」을 구한다. 섬유 단면이 원이 아닐 경우에는 그 단면적과 동일 면적을 갖는 원의 직경을 섬유의 직경으로 한다.
「입자의 직경」은 이하의 방법에 의해 구할 수 있다. 우선, 입자의 샘플군 10개를 랜덤으로 채취하고, 주사형 전자 현미경을 사용하여 1000~3000의 배율로 사진을 샘플군 1개에 대해 각각 1장 촬영한다. 이어서, 사진 1장당 10개의 입자의 직경을 측정한다. 그리고 그들의 값의 평균값(합계 100개의 입자의 직경의 평균값)을 산출함으로써 「입자의 직경」을 구한다. 입자의 사진 형상이 원이 아닐 경우에는 그 입자 면적과 동일 면적을 갖는 원의 직경을 입자의 직경으로 한다.
섬유 또는 입자의 직경을 15㎛ 이상으로 함으로써 흡착 재료의 칼럼으로의 충전 밀도를 적당히 저하시킬 수 있고, 그 결과 혈소판이나 백혈구 등의 각종 세포가 섬유 또는 입자에 흡착되기 어려워진다. 또한, 백혈구 중에서도 과립구나 단구는 탐식능을 갖기 때문에 섬유 또는 입자의 직경을 15㎛ 이상으로 함으로써 섬유 또는 입자가 이물로서 인식되기 어려워지고, 그 결과 백혈구가 섬유 또는 입자에 흡착되기 어려워진다. 섬유 또는 입자의 직경이 50㎛ 이하인 경우 흡착 재료의 칼럼으로의 충전 밀도가 적당히 향상되기 때문에 흡착 재료의 단위 체적당 혈액접촉 면적이 커지고, 그 결과 면역 억제성 단백질의 흡착량을 향상시킬 수 있다. 이상의 이유에 의해 수불용성 담체를 구성하는 섬유 또는 입자의 직경은 바람직하게는 15㎛ 이상 50㎛ 이하(15~50㎛)이며, 바람직하게는 16㎛ 이상 40㎛ 이하(16~40㎛)이며, 바람직하게는 17㎛ 이상 35㎛ 이하(17~35㎛)이다. 어느 바람직한 하한값도 어느 바람직한 상한값과 조합할 수 있다.
「산술 평균 거칠기」란 거칠기 곡선으로부터 그 평균선의 방향으로 기준 길이 L만큼 빼내고, 이 빼냄 부분의 평균선으로부터 측정 곡선까지의 편차의 절대값의 평균값을 의미하고, JIS B 0601-2001의 산술 평균 거칠기(Ra)를 의미한다. 산술 평균 거칠기는, 예를 들면 형상 측정 레이저 마이크로스코프로 측정할 수 있다. 측정 환경으로서는 수불용성 담체가 물에 젖은 상태로 행하는 것이 바람직하다. 또한, 섬유와 같이 배향성이 있는 경우에는 길이 방향의 값을 측정한다.
수불용성 담체의 표면의 산술 평균 거칠기가 3.0㎛ 이하인 경우 탐식능을 갖는 과립구나 단구가 수불용성 담체의 요철을 이물로서 인식하기 어려워지기 때문에 표면에 흡착하기 어려워진다. 또한, 혈소판의 부착 야기도 작아진다. 그 때문에 면역 억제성 단백질의 흡착 성능을 향상할 수 있다. 한편, 수불용성 담체의 표면의 산술 평균 거칠기가 0.1㎛ 이상인 경우도 면역 억제성 단백질의 흡착 성능을 향상할 수 있다. 이 이유에 대해서는 면역 억제성 단백질이 재료 표면과 접촉할 수 있는 면적이 커지기 때문으로 추측하고 있다. 이상의 이유로부터 수불용성 담체(또는 흡착 재료)의 표면의 산술 평균 거칠기는 바람직하게는 0.1㎛ 이상 3.0㎛ 이하(0.1~3.0㎛)이며, 바람직하게는 0.5㎛ 이상 2.0㎛ 이하(0.5~2.0㎛)이다. 어느 바람직한 하한값도 어느 바람직한 상한값과 조합할 수 있다. 또한, 상기 섬유 또는 상기 입자의 바람직한 직경과 상기 수불용성 담체의 표면의 바람직한 산술 평균 거칠기는 임의로 조합할 수 있다.
수불용성 담체의 표면의 산술 평균 거칠기는, 예를 들면 수불용성 담체를 유기 용매에 침지시킴으로써 제어할 수 있다. 수불용성 담체의 표면의 산술 평균 거칠기를 제어하는 방법으로서는, 예를 들면 수불용성 담체로서 폴리 방향족 비닐 화합물과 폴리프로필렌을 혼련시켜서 얻은 폴리머를 폴리 방향족 비닐 화합물을 일부가용시키고, 또한 폴리프로필렌을 녹이지 않는 용매에 침지하는 방법을 들 수 있다. 수불용성 담체의 표면의 산술 평균 거칠기는 폴리머의 종류, 폴리머의 분자량, 용매의 종류, 침지 온도, 침지 시간 등으로 제어할 수 있다. 또한, 폴리 방향족 비닐에 대해서는 가교제를 도입함으로써 용매로의 가용성을 제어하는 등의 방법도 채용할 수 있다. 또한, 상기 반응은 질소 함유 화합물의 도입 반응과 동시에 행하는 것도 가능하다.
수불용성 담체의 형상은, 예를 들면 섬유, 입자 또는 이들의 고차 가공품을 들 수 있다. 그 중에서도 섬유는 고차 가공에 의해 혈액 유로를 확보하면서 혈액과의 접촉 면적을 증대시키는 것이 가능하다는 점에서 바람직하다. 그 중에서도 해도형 복합 섬유가 바람직하며, 재료로서의 강도를 유지하는 관점으로부터 도가 보강재, 해가 수불용성 폴리머와 보강재의 알로이인 해도형 복합 섬유가 바람직하고, 또한 도가 폴리프로필렌이며, 해가 폴리스티렌과 폴리프로필렌의 알로이인 해도형 복합 섬유가 바람직하다.
보강재로서는 특별히 한정되는 것은 아니지만, 예를 들면 폴리아미드, 폴리아크릴로니트릴, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 나일론, 폴리메틸메타크릴레이트, 폴리테트라플루오르에틸렌 등을 들 수 있다. 그 중에서도 폴리프로필렌이 바람직하다. 이들의 폴리머는 단독으로 사용해도 좋고, 복수종을 조합해서 사용해도 좋다.
또한, 수불용성 담체의 형상이 섬유인 경우 수불용성 담체는 고차 가공품인 편지인 것이 바람직하다. 편지는 그 코를 제어함으로써 혈액 유로를 확보할 수 있기 때문에 편지를 사용함으로써 혈액이 섬유를 통과할 때의 압력 손실을 저감시킬 수 있다. 또한, 섬유를 합사시켜서 편지를 형성시키는 경우 합사 개수는 바람직하게는 10개 이상 100개 이하이며, 바람직하게는 30개 이상 80개 이하이다. 합사 개수를 100개 이하로 함으로써 혈액이 효율 좋게 섬유 다발 심부의 섬유에 접촉하기 쉽기 때문에 면역 억제성 단백질의 흡착량이 향상된다. 또한, 합사 개수를 10개 이상으로 함으로써 편지의 유지성이 향상된다. 어느 바람직한 하한값도 어느 바람직한 상한값과 임의로 조합할 수 있다.
본 실시형태의 흡착 재료는 면역 억제성 단백질(특히, TGF-β 또는 LAP 결합형 TGF-β)의 흡착용 담체에 사용할 수 있고, 흡착 칼럼의 충전제로서 사용할 수 있다.
또한, 본 실시형태에 있어서 흡착 재료 1g당 TGF-β 또는 LAP 결합형 TGF-β의 흡착량은 7.0ng 이상인 것이 바람직하며, 10.0ng 이상인 것이 바람직하며, 11.0ng 이상인 것이 바람직하다. 흡착 재료의 흡착량의 시험계로서는, 예를 들면TGF-β 용액을 사용한 배치식 흡착 시험을 들 수 있고, 평가계로서는 Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay(이하, ELISA법)에 의한 분석을 들 수 있다.
또한, 체외 순환으로의 용도를 생각했을 때 흡착 재료의 일부가 분리되어 발생하는 미립자가 적은 것이 바람직하다. 따라서, 흡착 재료로부터 발생하는 미립자 수는 가능한 한 적은 것이 바람직하다. 흡착 재료의 물리적 강도가 유지되면 흡착 재료로부터 발생하는 미립자 수가 적어진다. 한편, 흡착 재료의 물리적 강도가 저하되면 흡착 재료로부터 발생하는 미립자 수가 많아진다. 흡착 재료로부터의 미립자 발생을 조사하는 시험계로서는, 예를 들면 제 15 개정 일본 약국방 수재(2006년 3월 31일 후생노동성 고시 제 285호)의 일반 시험법 6.07 주사제의 불용성 미립자 시험법을 들 수 있고, 평가계로서는 광차폐형 자동 미립자 측정 장치에서의 미립자 발생 수(개)를 측정하는 방법을 들 수 있다.
또한, 체외 순환으로의 용도를 생각했을 때 흡착 재료에 흡착되는 혈액 항응고제의 양은 적은 것이 바람직하다. 일반적으로 체외 순환을 행하기 전에는 체외 순환 시에 혈액 중에 용해시킨 혈액 항응고제가 흡착 재료에 흡착되어 칼럼 내에서 혈액이 응고되는 것을 방지하기 위해서 혈액 항응고제를 용해시킨 생리 식염수를 흡착 재료가 충전된 혈액 정화 칼럼에 통과시켜서 흡착 재료에 미리 혈액 항응고제를 흡착시킨다. 흡착 재료에 미리 흡착시키는 혈액 항응고제의 양이 적은 편이 혈액 항응고제의 사용량을 저감할 수 있음과 아울러, 일단 흡착 재료에 흡착시킨 혈액 항응고제가 혈액 중에 과잉으로 누출될 가능성을 저하시킬 수 있다. 혈액 항응고제로서는 특별히 한정되는 것은 아니지만 헤파린, 구연산 나트륨, 메실산, 불화나트륨, EDTA-2K 등을 들 수 있다. 그 중에서도 헤파린이 바람직하다. 흡착 재료에 의한 혈액 항응고제의 흡착률의 평가 방법으로서는, 예를 들면 혈액 항응고제를 용해시킨 생리 식염수를 사용한 배치식 흡착 시험을 들 수 있다. 혈액 항응고제가 헤파린인 경우 분광 광도계를 사용한 비색 분석법에 의한 분석을 바람직하게 사용할 수 있다. 즉, 폴리프로필렌제 용기에 흡착 재료와 헤파린을 용해시킨 생리 식염수를 첨가하고, 37℃의 인큐베이터 내에서 2시간 전도(轉倒) 혼화한다. 혼화 후, 용액을 회수하여 측정 샘플로 한다. 또한, 검량선용 샘플로서 기지 농도가 되도록 헤파린 생리 식염수를 준비한다. 측정 샘플 및 검량선용 샘플에 대해서 210㎚에 있어서의 흡광도를 분광 광도계로 측정하고, 양자를 비교함으로써 측정 샘플에 있어서의 헤파린 농도를 산출할 수 있다. 흡착 재료에 의한 헤파린의 흡착률은 인큐베이트 전의 헤파린 농도로부터 인큐베이트 후의 헤파린 농도를 뺀 것을 인큐베이트 전의 헤파린 농도로 나눈 값의 백분률로서 산출할 수 있다. 구체적으로는 흡착 재료에 의한 헤파린의 흡착률은 하기 실시예에 있어서 기재된 방법에 의해 구할 수 있다.
혈액 항응고제의 흡착률의 관점으로부터 수불용성 담체 상의 아미노기의 총량은 흡착 재료 1g당 바람직하게는 1800μmol 이하이며, 바람직하게는 1000μmol 이하이며, 바람직하게는 700μmol 이하이며, 바람직하게는 600μmol 이하이며, 바람직하게는 500μmol 이하이며, 바람직하게는 400μmol 이하이며, 바람직하게는 300μmol 이하이며, 바람직하게는 250μmol 이하이며, 바람직하게는 150μmol 이하이다. 또한, 혈액 항응고제의 흡착률의 관점으로부터 수불용성 담체 상의 1급 아미노기의 양은 흡착 재료 1g당 바람직하게는 400μmol 이하이며, 바람직하게는 200μmol 이하이며, 바람직하게는 100μmol 이하이며, 바람직하게는 75μmol 이하이며, 바람직하게는 50μmol 이하이며, 바람직하게는 30μmol 이하이다.
본 실시형태의 흡착 칼럼은 본 실시형태의 흡착 재료를 포함한다.
「흡착 칼럼」이란 적어도 혈액 입구부, 케이스부, 혈액 출구부를 갖고 있으며, 케이스부에는 흡착 재료가 충전되어 있는 것을 의미한다. 흡착 칼럼으로서는, 예를 들면 레이디얼 플로형의 흡착 칼럼을 들 수 있다. 상술한 바와 같이 흡착 재료의 형상으로서는 섬유가 바람직하며, 편지가 바람직하다.
흡착 칼럼의 내부의 구성의 일례를 도 2를 따라 설명한다. 도 2에 있어서 1은 용기 본체이며, 그 길이 방향의 전단과 후단에 유입구(2)와 유출구(3)를 갖는다. 유입구(2)의 내측에는 필터(4)와 원판상의 구획판(5)이 설치되고, 또한 유출구(3)의 내측에는 필터(6)와 원판상의 구획판(7)이 설치되어 있다. 2장의 구획판(5, 7) 중 전방측(유입구측)의 구획판(5)에는 중심부에 개구(5a)가 형성되고, 또한 후측의 구획판(7)의 중심부에는 지지 돌기(7a)가 형성되어 있다. 또한, 구획판(7)의 외주에는 다수의 투공(透孔)(7b)이 둘레 방향으로 간헐적으로 형성되어 있다. 또한, 구획판(5)의 개구(5a)와 구획판(7)의 지지 돌기(7a) 사이에 1개의 파이프(8)가 걸쳐 놓여있다. 파이프(8)는 혈액을 유도하는 유로(9)를 내측에 형성하고, 또한 둘레벽에 다수의 관통 구멍(10)을 갖는다. 또한, 파이프(8)는 그 전단에서 구획판(5)의 개구(5a)에 연통되어 있으며, 또한 그 후단은 구획판(7)의 지지 돌기(7a)에 의해 폐지되어 있다. 이 파이프(8)의 외주에 흡착 재료(11)가 겹겹이 복수층으로 권취되어 있다. 이 흡착 칼럼을 순환법에 사용할 때는 유입구(2)와 유출구(3)에 혈액풀과의 사이에 순환 회로를 형성한 튜브를 연결하여 그 혈액풀로부터 인출되는 혈액을 유입구(2)에 공급하고, 내부의 흡착 재료(11)로 대상 흡착 물질(면역 억제성 단백질)을 제거해서 유출구(3)로부터 유출하여 다시 혈액풀로 되돌리도록 순환시킨다. 칼럼 내에서는 유입구(2)로부터 필터(4)를 거쳐 유로(9)에 침입한 혈액은 유로(9)를 이동하면서 관통 구멍(10)으로부터 순차 흡착 재료(11)에 침입하고, 반지름 방향 중 어느 하나로 이동하면서 세포 등을 흡착한다. 세포 등이 제거된 혈액은 구획판(7)의 외주의 다수의 투공(7b)으로부터 유출되어 필터(6)를 거쳐 유출구(3)로부터 유출된다. 상기 예에서는 혈액이 개구(5a)로부터 파이프(8) 내의 유로(9)를 유동하면서 관통 구멍(10)으로부터 유출되지만 흡착 칼럼에 있어서의 혈액의 이동 방향은 상기와는 반대로 하여 유출구(3)로부터 혈액을 공급하고, 유입구(2)로부터 유출시키도록 해도 좋다.
면역 억제성 단백질의 흡착 효율을 높이기 위해서는 칼럼 내의 혈액 선속도도 중요하다. 즉, 혈액 선속도가 빠를 경우 면역 억제성 단백질이 흡착 재료와 충분한 상호 작용이 일어나기 어려워지는 경우가 있다. 한편, 혈액 선속도가 느릴 경우 혈소판이나 백혈구 등의 다른 혈액 성분이 흡착 재료에 비특이적으로 부착되어 흡착 재료와 면역 억제성 단백질의 상호 작용을 저해하는 경우가 있다. 따라서, 흡착 칼럼 입구의 유속이 50㎤/분일 때의 흡착 재료 내의 혈액 선속도의 최대값이 50㎝/분 이하인 것이 바람직하며, 25㎝/분 이하인 것이 바람직하다. 또한, 흡착 칼럼 입구의 유속이 50㎤/분일 때의 흡착 재료 내의 혈액 선속도의 최소값은 0.1㎝/분 이상인 것이 바람직하며, 0.3㎝/분 이상인 것이 바람직하다. 여기에서 혈액 선속도는 계산에 의해 구해지는 것이며, 예를 들면 레이디얼 플로형의 흡착 칼럼의 경우 흡착 재료 내의 혈액 선속도의 최대값(Vmax)은 중공 원기둥 형상의 중심 파이프의 측면에 열린 개구부의 합계 면적(Sp)과 흡착 칼럼 입구의 유속(50㎤/분)으로부터 하기 식 1에 의해 산출된다.
Vmax(㎝/분)=50(㎤/분)/Sp(㎠) ···식 1
또한, 최소값(Vmin)은 중심 파이프에 권취된 흡착 재료의 최외주면의 면적(So)과 흡착 칼럼 입구의 유속(50㎤/분)으로부터 하기 식 2에 의해 산출된다.
Vmin(㎝/분)=50(㎤/분)/So(㎠) ···식 2
한편, 흡착 칼럼이 입자나 단순히 섬유를 겹친 것뿐인 원기둥 형상의 흡착 칼럼일 경우 혈액의 흐름에 직교하는 흡착 재료의 단면적의 최소값과 최대값이 동일해지기 때문에 상기 최대값(Vmax)과 상기 최소값(Vmin)은 동일한 값이 된다.
또한, 흡착 칼럼으로서는 공급된 혈액을 유출하기 위해서 형성된 관통 구멍을 길이 방향의 측면에 구비하는 중심 파이프와, 상기 중심 파이프의 주변에 흡착 재료가 충전되어 있으며, 유입되는 상기 혈액이 상기 중심 파이프 안을 통하도록 상기 중심 파이프의 상류단에 연통되어 상기 혈액이 상기 중심 파이프를 통과하지 않고 흡착 재료와 접촉하는 것을 방지하도록 배치된 플레이트 A와, 상기 중심 파이프의 하류단을 봉쇄하여 흡착 재료를 상기 중심 파이프의 주변의 공간에 고정하도록 배치된 플레이트 B를 구비하는 레이디얼 플로형의 흡착 칼럼이 바람직하다. 이것은 혈액이 흡착 재료를 균일하게 흐르도록 하기 때문이다. 또한, 상기 중심 파이프의 관통 구멍의 개구율이 낮을 경우 이 부분에서 압력 손실이 발생하기 쉬워지기 때문에 과립구, 단구, 및 혈소판이 활성화되어 이들이 흡착 재료에 부착되기 쉬워진다. 그 때문에 면역 억제성 단백질의 흡착 성능이 저하되는 경우가 있다. 또한, 개구율이 높을 경우에는 파이프의 강도가 저하되는 것, 혈액 입구부 부근의 관통 구멍에서 쇼트 패스를 일으키기 쉬워지는 등의 문제가 생길 가능성이 있다. 따라서, 관통 구멍의 개구율은 20~80%인 것이 바람직하며, 30~60%인 것이 바람직하다.
「레이디얼 플로형」이란 칼럼 내부의 혈액의 흐름 방향을 말한다. 칼럼의 입구와 출구에 혈액을 수직 방향으로 흘린 경우, 칼럼 내부에서 수평 방향의 혈액 흐름이 존재할 경우에 레이디얼 플로형이라고 부른다.
「관통 구멍의 개구율」이란 하기 식 3으로 구해지는 값을 의미한다.
관통 구멍의 개구율(%)=파이프의 길이 방향의 측면에 형성된 관통 구멍의 면적의 합/파이프의 측면의 면적×100···식 3
혈소판의 부착은 상술한 바와 같이 면역 억제성 단백질의 흡착량이 저하되는 원인이 됨과 아울러, 칼럼의 막힘도 야기하기 때문에 혈소판은 흡착 재료에 되도록 부착하지 않는 것이 바람직하다. 따라서, 흡착 재료로의 혈소판의 부착률은 80% 이하인 것이 바람직하며, 70% 이하인 것이 바람직하며, 65% 이하인 것이 바람직하다. 혈소판의 부착률은, 예를 들면 배치식 시험에서 혈구 계측기를 사용하여 평가할 수 있다.
본 실시형태의 흡착 칼럼은 혈액 정화 요법에 사용할 수 있다. 본 실시형태의 흡착 칼럼을 혈액 정화용 칼럼으로서 사용함으로써 혈액 중으로부터 면역 억제성 단백질을 효율 좋게 제거할 수 있다. 예를 들면, 혈액을 체외 순환시켜서 본 실시형태의 흡착 칼럼에 통하게 함으로써 혈액 중으로부터 면역 억제성 단백질을 효율 좋게 제거할 수 있다. 즉, 본 실시형태의 흡착 칼럼은 체외 순환용 칼럼으로서 사용할 수 있다. 보다 구체적으로는 본 실시형태의 흡착 칼럼은 암 환자의 혈액 중으로부터 면역 억제성 단백질을 선택적으로 제거하는 치료에 사용할 수 있다. 즉, 본 실시형태의 흡착 칼럼은 암 치료용 칼럼으로서 사용할 수 있다.
본 실시형태의 흡착 칼럼은 면역 억제성 단백질을 흡착할 수 있다는 점에서 암 치료에 적합하게 사용된다. 또한, 수상 세포나 내추럴 킬러 세포 등을 활성화시키는 세포 수주 치료와 병용하는 것도 가능하다.
(실시예)
이하, 실시예를 들어서 본 실시형태를 설명하지만 본 실시형태는 이들의 예에 의해 한정되는 것은 아니다.
1. 면역 억제성 단백질 흡착 재료의 제작
수불용성 담체로서 폴리프로필렌(Prime Polymer Co., Ltd.; J105WT)으로 이루어지는 도 성분을 16도 갖고, 해 성분이 폴리스티렌(중량 평균 분자량: 181,000) 90중량% 및 폴리프로필렌(Prime Polymer Co., Ltd.; J105WT) 10중량%로 이루어지며, 도와 해의 비율(중량비)이 50:50인 해도형 복합 섬유(직경 20㎛)를 방사했다. 얻어진 섬유 42개를 합사하여 편지를 형성했다(이하, 원편지(原編地) 1). 또한, 섬유 표면의 거칠기는 도 수나 해도 비율, 폴리스티렌이나 폴리프로필렌의 분자량 등에 의해 영향을 받는다.
니트로벤젠 20mL와 황산 13.3mL의 혼합 용액에 파라포름알데히드(이하, PFA) 2g을 10℃에서 용해시켰다(이하, PFA 용액). 또한, 니트로벤젠 259.3mL와 황산 169.3mL의 혼합 용액에 46.9g의 N-메틸올-α-클로로아세트아미드를 10℃에서 용해시켰다(이하, NMCA 용액). 10g의 원편지 1을 PFA 용액에 침지시킨 후 신속하게 NMCA 용액을 첨가하여 교반했다. 교반하에서 2시간 침지시킨 후 편지를 인출하고, 과잉의 니트로벤젠으로 세정 후 메탄올로 치환·세정하고, 또한 물세척하여 α-클로로아세트아미드메틸화한 편지(이하, 중간체 1)를 얻었다. PFA 용액의 제작으로부터 메탄올을 사용한 편지의 세정까지의 일련의 조작은 15℃ 이하에서 실시했다.
(1) 면역 억제성 단백질 흡착 재료 1-1의 제작
디에틸렌트리아민(46μL)과 트리에틸아민(28.6mL)을 디메틸술폭시드(398mL)에 녹인 용액에 중간체 1(10g)을 담그고, 40℃에서 3시간 교반했다. 그 후 디에틸렌트리아민으로 처리한 중간체 1을 물세척하고, 건조시켜 면역 억제성 단백질 흡착 재료 1-1을 얻었다.
(2) 면역 억제성 단백질 흡착 재료 1-2의 제작
면역 억제성 단백질 흡착 재료 1-1과 마찬가지로 하여 면역 억제성 단백질 흡착 재료 1-2를 얻었다.
(3) 면역 억제성 단백질 흡착 재료 2-1의 제작
디에틸렌트리아민의 양을 232μL로 한 것 이외에는 면역 억제성 단백질 흡착 재료 1-1과 마찬가지로 하여 면역 억제성 단백질 흡착 재료 2-1을 얻었다.
(4) 면역 억제성 단백질 흡착 재료 2-2의 제작
면역 억제성 단백질 흡착 재료 2-1과 마찬가지로 하여 면역 억제성 단백질 흡착 재료 2-2를 얻었다.
(5) 면역 억제성 단백질 흡착 재료 3의 제작
디에틸렌트리아민의 양을 464μL로 한 것 이외에는 면역 억제성 단백질 흡착 재료 1-1과 마찬가지로 하여 면역 억제성 단백질 흡착 재료 3을 얻었다.
(6) 면역 억제성 단백질 흡착 재료 4-1의 제작
디에틸렌트리아민의 양을 929μL로 한 것 이외에는 면역 억제성 단백질 흡착 재료 1-1과 마찬가지로 하여 면역 억제성 단백질 흡착 재료 4-1을 얻었다.
(7) 면역 억제성 단백질 흡착 재료 4-2의 제작
면역 억제성 단백질 흡착 재료 4-1과 마찬가지로 하여 면역 억제성 단백질 흡착 재료 4-2를 얻었다.
(8) 면역 억제성 단백질 흡착 재료 5의 제작
디에틸렌트리아민(46μL) 대신에 에틸렌디아민(929μL)을 사용한 것 이외에는 면역 억제성 단백질 흡착 재료 1-1과 마찬가지로 하여 면역 억제성 단백질 흡착 재료 5를 얻었다.
(9) 면역 억제성 단백질 흡착 재료 6의 제작
디에틸렌트리아민(46μL) 대신에 테트라에틸렌펜타민(1863μL)을 사용한 것 이외에는 면역 억제성 단백질 흡착 재료 1-1과 마찬가지로 하여 면역 억제성 단백질 흡착 재료 6을 얻었다.
(10) 면역 억제성 단백질 흡착 재료 7-1의 제작
디에틸렌트리아민의 양을 1863μL로 한 것 이외에는 면역 억제성 단백질 흡착 재료 1-1과 마찬가지로 하여 면역 억제성 단백질 흡착 재료 7-1을 얻었다.
(11) 면역 억제성 단백질 흡착 재료 7-2의 제작
면역 억제성 단백질 흡착 재료 7-1과 마찬가지로 하여 면역 억제성 단백질 흡착 재료 7-2를 얻었다.
(12) 면역 억제성 단백질 흡착 재료 8-1의 제작
디에틸렌트리아민의 양을 4687μL로 한 것 이외에는 면역 억제성 단백질 흡착 재료 1-1과 마찬가지로 하여 면역 억제성 단백질 흡착 재료 8-1을 얻었다.
(13) 면역 억제성 단백질 흡착 재료 8-2의 제작
면역 억제성 단백질 흡착 재료 8-1과 마찬가지로 하여 면역 억제성 단백질 흡착 재료 8-2를 얻었다.
(14) 면역 억제성 단백질 흡착 재료 9의 제작
디에틸렌트리아민의 양을 9479μL로 한 것 이외에는 면역 억제성 단백질 흡착 재료 1-1과 마찬가지로 하여 면역 억제성 단백질 흡착 재료 9를 얻었다.
(15) 면역 억제성 단백질 흡착 재료 10의 제작
디에틸렌트리아민(46μL) 대신에 테트라에틸렌펜타민(4687μL)을 사용한 것 이외에는 면역 억제성 단백질 흡착 재료 1-1과 마찬가지로 하여 면역 억제성 단백질 흡착 재료 10을 얻었다.
(16) 면역 억제성 단백질 흡착 재료 11의 제작
디에틸렌트리아민의 양을 19388μL로 한 것 이외에는 면역 억제성 단백질 흡착 재료 1-1과 마찬가지로 하여 면역 억제성 단백질 흡착 재료 11을 얻었다.
(17) 면역 억제성 단백질 흡착 재료 12의 제작
디에틸렌트리아민의 양을 32964μL로 한 것 이외에는 면역 억제성 단백질 흡착 재료 1-1과 마찬가지로 하여 면역 억제성 단백질 흡착 재료 12를 얻었다.
(18) 면역 억제성 단백질 흡착 재료 13의 제작
수 평균 분자량이 약 600인 폴리에틸렌이민(8195μL)과 트리에틸아민(28.6mL)을 디메틸술폭시드(398mL)에 녹인 용액에 10g의 중간체 1을 담그고, 40℃에서 3시간 교반했다. 그 후 폴리에틸렌이민으로 처리한 중간체 1을 물세척하고, 건조하여 면역 억제성 단백질 흡착 재료 13을 얻었다.
(19) 면역 억제성 단백질 흡착 재료 14의 제작
수 평균 분자량이 약 750000인 폴리에틸렌이민 50중량% 수용액(16390μL)과 트리에틸아민(28.6mL)을 디메틸술폭시드(398mL)에 녹인 용액에 10g의 중간체 1을 담그고, 40℃에서 3시간 교반했다. 그 후 폴리에틸렌이민으로 처리한 중간체 1을 물세척하고, 건조하여 면역 억제성 단백질 흡착 재료 14를 얻었다.
(20) 면역 억제성 단백질 흡착 재료 15의 제작
수 평균 분자량이 약 65000인 폴리아릴아민 20중량% 수용액(2876μL)과 트리에틸아민(28.6mL)을 디메틸술폭시드(398mL)에 녹인 용액에 10g의 중간체 1을 담그고, 40℃에서 3시간 교반했다. 그 후 폴리아릴아민으로 처리한 중간체 1을 물세척하고, 건조하여 면역 억제성 단백질 흡착 재료 15를 얻었다.
2. 흡착 재료가 갖는 아미노기의 총량의 측정
제작한 흡착 재료 등에 대해서 수불용성 담체 상의 아미노기의 총량은 산염기 역적정에 의해 측정했다. 폴리프로필렌제 용기에 흡착 재료(1.0g) 및 6M 수산화나트륨 수용액(50mL)을 첨가하고, 실온에서 1시간 교반했다. 이어서, 이온 교환수(50mL)를 포함하는 별도의 폴리프로필렌제 용기에 상기 흡착 재료를 첨가하고, 실온에서 30분간 교반했다(세정). 흡착 재료를 첨가한 이온 교환수의 pH가 7이 될때까지 세정을 반복함으로써 탈염 처리된 흡착 재료를 얻었다. 탈염 후의 흡착 재료를 25℃의 감압하에서 48시간 정치하여 건조했다. 건조 후의 흡착 재료의 중량을 측정하고, 새로운 폴리프로필렌제 용기에 상기 흡착 재료와 0.1M의 염산을 40mL 첨가하고, 실온에서 30분간 교반했다. 교반 후 용액만을 5mL 빼내어 새로운 폴리프로필렌제 용기에 옮겼다. 이어서, 얻어진 용액에 대해서 0.1M의 수산화나트륨 수용액을 0.1mL 적하했다. 적하 후 10분간 교반하여 용액의 pH를 측정했다. 수산화나트륨의 적하, 10분간의 교반 및 pH 측정을 마찬가지로 100회 반복했다. 용액의 pH가 8.5을 초과했을 때의 수산화나트륨 수용액의 적하량을 적정량이라고 했다. 흡착 재료 1g당 적정량과 이하의 식 4을 사용해서 흡착 재료 1g당 아미노기의 총량을 산출했다.
흡착 재료 1g당 아미노기의 총량(μmol)={첨가한 0.1M 염산의 액량(40mL)/ 빼낸 염산의 액량(5mL)}×적정량(mL)÷건조 후의 흡착 재료의 중량(g)×수산화나트륨 수용액 농도(0.1M) ···식 4
3. 흡착 재료가 갖는 1급 아미노기의 양의 측정
수불용성 담체 상의 1급 아미노기의 양은 1급 아미노기와 특이적으로 반응하여 형광 물질을 발생하는 o-프탈알데히드(이하, OPA)를 이용해서 측정했다. 우선, 흡착 재료를 직경 6㎜의 원형이 되도록 펀치로 임의의 장수 구멍을 뚫고, 25℃의 감압하에서 48시간 정치하여 건조시켰다. 이어서, 건조 후의 흡착 재료의 중량을 측정하고, 폴리프로필렌제 용기 중에 상기 흡착 재료를 배치했다. 또한, 80체적% 메탄올 및 20체적% 탄산염 pH 표준액(pH 10.01) 중에 OPA 및 DTT를 각각 1.5mM 및 5mM의 농도가 되도록 용해시켜 혼합 용액을 조제했다. 상기 혼합 용액을 상기 흡착 재료가 배치된 폴리프로필렌제 용기 중에 첨가하고, 실온에서 3시간 교반했다. 교반 후, 100μL의 용액을 회수하여 측정 샘플로 했다. 검량선용 샘플로서 OPA(농도가 각각 0mM, 0.375mM, 0.75mM, 1.5mM이 되도록 조정했다), 5mM의 DTT, 80체적% 메탄올, 및 20체적% 탄산염 pH 표준액(pH 10.01)을 포함하는 혼합 용액을 준비했다. 측정 샘플 100μL 및 검량선용 샘플 100μL를 각각 6.1mM의 n-프로필아민 및 5mM의 DTT를 포함하는 탄산염 pH 표준액(pH 10.01) 1mL와 혼합하고, 희석 후의 측정 샘플 및 희석 후의 검량선용 샘플을 얻었다. 90초 후, 희석 후의 측정 샘플 및 희석 후의 검량선용 샘플에 대해서 340㎚에 있어서의 흡광도를 분광 광도계로 측정했다. 희석 후의 측정 샘플의 OPA 농도를 검량선으로부터 구하고, 희석 배율을 곱하여 희석 전의 측정 샘플의 OPA 농도(이하, 샘플의 OPA 농도)로 환산했다.
이하의 식 5를 사용하여 흡착 재료 1g당 1급 아미노기의 양을 산출했다.
흡착 재료 1g당 1급 아미노기의 양(μmol)={첨가한 OPA 농도(1.5mM)-샘플의 OPA 농도}×흡착 재료와 교반 반응시키는 혼합 용액의 양(mL)/건조 후의 흡착 재료의 중량(g) ···식 5
4. LAP 결합형 TGF-β1 흡착 성능 시험
면역 억제성 단백질 흡착 재료에 있어서의 흡착 반응의 전후의 용액 중의 LAP 결합형 TGF-β1 농도를 ELISA법으로 정량하고, 이하의 식 6에 따라서 재료 1g당 LAP 결합형 TGF-β1 흡착량을 산출했다. 즉, 직경 6㎜의 원판상으로 잘라낸 면역 억제성 단백질 흡착 재료 4장을 용량 2mL의 폴리프로필렌제의 용기에 넣었다. 이 용기에 소 혈청 알부민을 3.5중량%와 리콤비넌트 인간 LAP 결합형 TGF-β1(R&D Systems, Inc.)의 농도가 25ng/mL가 되도록 조정한 인산 완충 생리 식염수를 1.1mL 첨가하고, 37℃의 인큐베이터 내에서 2시간 전도 혼화했다. 흡착 섬유 담체를 용기로부터 제거한 후, Quantikine Human LAP(TGF-β1) ELISA Kit(R&D Systems, Inc.)를 사용하여 용액 중의 LAP 결합형 TGF-β1의 잔농도를 측정했다. 또한, 직경 6㎜의 원판상으로 잘라낸 면역 억제성 단백질 흡착 재료 4장을 25℃의 감압하에서 48시간 정치하여 건조시켰다. 건조 후의 수면역 억제성 단백질 흡착 재료 4장의 중량을 측정했다. 이하의 식 6에 따라서 LAP 결합형 TGF-β1 흡착량을 산출했다.
흡착 재료 1g당 LAP 결합형 TGF-β1 흡착량={(인큐베이트 전의 LAP 결합형 TGF-β1 농도)-(인큐베이트 후의 LAP 결합형 TGF-β1 농도)}/(인큐베이트 전의 LAP 결합형 TGF-β1 농도)×인산 완충 생리 식염수 양 1.1mL÷(직경 6mm의 원판상으로 잘라낸 흡착 재료 4장의 건조 중량) ···식 6
5. 단백질 흡착 재료를 흡착 담체로서 구비한 칼럼의 제작
폴리프로필렌-폴리에틸렌 공중합체제 레이디얼 플로형 칼럼(직경: 25㎜×길이: 133mm, 흡착 섬유 충전부 체적: 14.7㎤) 1개당 원편지 1 또는 면역 억제성 단백질 흡착 재료 1-1, 2-1, 3, 4-1, 5, 6, 7-1, 8-1, 9~15를 각각 4g 충전했다. 그 후, 칼럼 내를 생리 식염액으로 채운 후 고압 증기 멸균을 행하고, 각각 원편지 1을 흡착 담체로서 구비한 칼럼(이하, 「원편지 1 칼럼」) 및 면역 억제성 단백질 흡착 재료 1-1, 2-1, 3, 4-1, 5, 6, 7-1, 8-1, 9~15를 흡착 담체로서 구비한 칼럼(이하, 「칼럼 1~15」)을 얻었다.
6. 불용성 미립자 수 측정
제 15 개정 일본 약국방 수재(2006년 3월 31일 후생노동성 고시 제 285호)의 일반 시험법 6.07 주사제의 불용성 미립자 시험법(제 1 법: 광차폐 입자 계수법; pp.1-2)을 참고로 하여 실시했다. 포장 화물 및 용기의 진동 시험 방법(JIS Z 0232)을 참고로 하여 칼럼을 수평 및 수직 방향으로 각 1시간 진동했다. 진동 후의 칼럼을 시판된 인공 신장용 혈액 회로와 접속하고, 생리 식염액 2L를 사용하여 매분 100mL의 유속으로 세정했다. 또한, 사용하는 생리 식염액은 포어 사이즈 0.3㎛의 필터로 여과하고, 10㎛ 이상의 미립자가 0.5개/mL 이하이며, 또한 25㎛ 이상의 미립자가 0.2개/mL 이하인 것을 확인했다. 여과한 생리 식염액을 펌프를 사용하여 매분 50mL의 유속으로 1시간 본품에 송입하고, 그 유출액을 20분 마다 1L씩 합계 3회 채취(합계 3L)했다. 얻어진 유출액을 광차폐형 자동 미립자 측정 장치로 각각 300mL씩 공급하고, 미립자를 측정하여 1시간 송액했을 때의 미립자 수(개/mL)를 산출했다.
(실시예 1~10)
면역 억제성 단백질 흡착 재료 1-1, 2-1, 3, 4-1, 5, 6, 7-1, 8-1, 9, 10에 대해서 아미노기의 총량의 측정, 1급 아미노기의 양의 측정, 및 LAP 결합형 TGF-β1 흡착 성능 시험을 행했다. 또한, 칼럼 1~10을 사용하여 불용성 미립자 수를 측정했다. 결과를 표 1에 나타낸다.
면역 억제성 단백질 흡착 재료 1-1, 2-1, 3, 4-1, 5, 6, 7-1, 8-1, 9, 10은 불용성 미립자의 발생량이 적고, 또한 LAP 결합형 TGF-β1을 효율적으로 흡착할 수 있는 것이 확인되었다.
(비교예 1)
원편지 1 칼럼(원편지 1)에 대해서 아미노기의 총량의 측정, 1급 아미노기의 양의 측정, 및 LAP 결합형 TGF-β1 흡착 성능 시험을 행했다. 또한, 원편지 1 칼럼 을 사용하여 불용성 미립자 수를 측정했다. 결과를 표 2에 나타낸다.
원편지 1 칼럼(원편지 1)에서는 불용성 미립자의 발생량은 적었지만 LAP 결합형 TGF-β1을 효율적으로 흡착할 수 없었다.
(비교예 2~6)
면역 억제성 단백질 흡착 재료 11~15에 대해서 아미노기의 총량의 측정, 1급 아미노기의 양의 측정, 및 LAP 결합형 TGF-β1 흡착 성능 시험을 행했다. 또한, 칼럼 11~15를 사용하여 불용성 미립자 수를 측정했다. 결과를 표 2에 나타낸다.
면역 억제성 단백질 흡착 재료 11(비교예 2)에서는 불용성 미립자의 발생량은 적지만 LAP 결합형 TGF-β1을 효율적으로 흡착할 수 없었다.
면역 억제성 단백질 흡착 재료 12(비교예 3)에서는 불용성 미립자가 많이 발생하여 LAP 결합형 TGF-β1도 효율적으로 흡착할 수 없었다.
면역 억제성 단백질 흡착 재료 13~15(비교예 4~6)에서는 LAP 결합형 TGF-β1은 효율적으로 흡착할 수 있었지만 불용성 미립자가 많이 발생했다.
후기 표 중 이하의 약호를 사용한다.
EDA: 에틸렌디아민
DETA: 디에틸렌트리아민
TEPA: 테트라에틸렌펜타민
PEI600: 수 평균 분자량이 약 600인 폴리에틸렌이민
PEI750K: 수 평균 분자량이 약 750000인 폴리에틸렌이민
PAA: 수 평균 분자량이 약 65000인 폴리아릴아민
Figure pct00001
Figure pct00002
7. 표면의 산술 평균 거칠기의 측정
형상 측정 레이저 현미경(KEYENCE CORPORATION제; 컬러 3D 레이저 현미경 VK-9700)을 사용하여 100배의 배율로 건조시키지 않도록 물에 젖은 상태로 흡착 재료의 표면을 관찰하고, 표면의 산술 평균 거칠기를 측정했다(JIS B 0601-2001 준거). 기준 길이 L은 50㎛로 하고, 위치가 상이한 10개소에서 측정한 값의 평균값을 표면의 산술 평균 거칠기의 값이라고 했다.
8. 혈소판의 부착 시험
인간 혈액을 사용한 배치식 시험을 행하여 흡착 재료로의 혈소판의 부착성을 혈구 계측기에 의해 분석·산출했다. 즉, 직경 10㎜의 원판상으로 잘라낸 흡착 재료 5장을 폴리프로필렌제의 용기에 넣었다. 이 용기에 인간 건상자로부터 채혈한 혈액을 3.07mL 첨가하고, 37℃의 인큐베이터 내에서 1시간 전도 혼화했다. 흡착 재료를 용기로부터 제거한 후 나머지의 혈액 중에 포함되는 혈소판 수를 혈구 계측기에 의해 산출했다(이하, 면역 억제성 단백질 흡착 재료를 첨가한 혈액의 혈소판 수). 흡착 재료를 첨가하고 있지 않은 혈액으로 마찬가지의 조작을 행했다(이하, 면역 억제성 단백질 흡착 재료를 첨가하고 있지 않은 혈액의 혈소판 수). 이상의 값을 사용하여 혈소판의 부착률을 하기 식 7에 의해 산출했다.
혈소판의 부착률(%)=(면역 억제성 단백질 흡착 재료를 첨가하고 있지 않은 혈액의 혈소판 수-면역 억제성 단백질 흡착 재료를 첨가한 혈액의 혈소판 수)/면역 억제성 단백질 흡착 재료를 첨가하고 있지 않은 혈액의 혈소판 수×100···식 7
(실시예 11)
면역 억제성 단백질 흡착 재료 4-1에 대해서 표면의 산술 평균 거칠기의 측정 및 혈소판의 부착 시험을 행했다. 결과를 표 3에 나타낸다. 면역 억제성 단백질 흡착 재료 4-1에 있어서 혈소판의 부착률은 낮았다.
Figure pct00003
9. 혈액 항응고제 흡착 시험
면역 억제성 단백질 흡착 재료에 있어서의 흡착 반응의 전후의 용액 중의 헤파린 농도를 분광 광도계를 사용한 비색 분석법으로 정량하여 이하의 식 8에 따라서 흡착 재료에 의한 헤파린 흡착률을 산출했다. 즉, 직경 10㎜의 원판상으로 잘라낸 면역 억제성 단백질 흡착 재료 4장을 용량 2mL의 폴리프로필렌제의 용기에 넣었다. 또한, 면역 억제성 단백질 흡착 재료를 넣고 있지 않은 용량 2mL의 폴리프로필렌제의 용기를 준비했다. 흡착 재료를 넣은 용기와 흡착 재료를 넣고 있지 않은 용기 각각에 헤파린나트륨(AY Pharmaceuticals Co., Ltd.사)의 농도가 50단위/mL가 되도록 조제한 생리 식염수를 1.4mL 첨가하고, 37℃의 인큐베이터 내에서 2시간 전도 혼화했다. 전도 혼화 후 1mL의 용액을 회수하여 측정 샘플(각각, 흡착 재료를 넣은 샘플, 흡착 재료를 넣고 있지 않은 샘플)로 했다. 검량선용 샘플로서 농도가 각각 0단위/mL, 0.3125단위/mL, 0.625단위/mL, 1.25단위/mL, 2.5단위/mL가 되도록 조제한 생리 식염수를 준비했다. 각각의 측정 샘플 50μL를 생리 식염수 0.95mL와 혼합하고, 희석 후의 측정 샘플을 각각 얻었다. 희석 후의 각각의 측정 샘플 및 검량선용 샘플에 대해서 210㎚에 있어서의 흡광도를 분광 광도계로 측정했다. 희석 후의 측정 샘플의 헤파린 농도를 검량선으로부터 구하고, 희석 배율을 곱하여 희석 전의 측정 샘플의 헤파린 농도(이하, 각각 흡착 재료를 넣은 샘플의 헤파린 농도, 흡착 재료를 넣고 있지 않은 샘플의 헤파린 농도)로 환산했다. 이하의 식 8에 따라서 헤파린 흡착률을 산출했다.
흡착 재료에 의한 헤파린 흡착률(%)={(흡착 재료를 넣고 있지 않은 샘플의 헤파린 농도)-(흡착 재료를 넣은 샘플의 헤파린 농도)}/(흡착 재료를 넣고 있지 않은 샘플의 헤파린 농도)×100···식 8
(실시예 12~16)
면역 억제성 단백질 흡착 재료 1-2, 2-2, 4-2, 7-2, 8-2에 대해서 혈액 항응고제 흡착 시험을 행했다. 결과를 표 4에 나타낸다.
면역 억제성 단백질 흡착 재료 1-2, 2-2, 4-2, 7-2, 8-2(실시예 12~16)에서는 아미노기의 총량이 적은 편이 헤파린의 흡착률은 낮았다.
Figure pct00004
실시예 13, 15, 및 16에 대해서는 1급 아미노기의 양은 미측정이지만 이들의 실시예에서 사용한 흡착 재료 2-2, 7-2, 및 8-2는 상기 흡착 재료 2-1, 7-1, 및 8-1과 동일 프로세스에 의해 제작되어 있기 때문에 실시예 13, 15, 및 16에 있어서의 1급 아미노기의 양은 모두 450μmol 이하인 것이 추측된다.
(산업상 이용가능성)
본 실시형태의 흡착 재료 및 흡착 칼럼은 면역 억제성 단백질을 효율 좋게 흡착할 수 있다. 그 때문에 암 치료로의 적용이 기대된다. 또한, 본 실시형태의 흡착 재료 및 흡착 칼럼은 수상 세포나 내추럴 킬러 세포 등을 활성화시키는 세포 수주 치료와 병용하는 것도 가능하다.
1: 용기 본체 2: 유입구
3: 유출구 4: 필터
5: 구획판 5a: 구획판의 개구
6: 필터 7: 구획판
7a: 구획판의 지지 돌기 7b: 구획판의 투공
8: 파이프 9: 유로
10: 관통 구멍 11: 흡착 재료
Q: 혈액 흐름

Claims (9)

  1. 이하의 식 (1)로 나타내어지는 폴리아민, 이하의 식 (2)로 나타내어지는 제 1급 지방족 아민, 및 식 (3)으로 나타내어지는 제 2급 지방족 아민으로부터 선택되는 1종 이상의 질소 함유 화합물이 결합한 수불용성 담체를 포함하고,
    상기 수불용성 담체 상의 아미노기의 총량은 1g당 0μmol 초과 2500μmol 이하이며, 또한 상기 수불용성 담체 상의 1급 아미노기의 양은 1g당 450μmol 이하인 면역 억제성 단백질의 흡착 재료.
    R1R2N-X-NR3R4···식 (1)
    [식 (1) 중 X는 2~20개의 탄소 원자를 갖는 포화 또는 불포화의 지방족 탄화수소기 또는 3~20개의 탄소 원자를 갖는 포화 또는 불포화의 지방족 탄화수소기에 있어서 1~5개의 탄소 원자를 질소 원자로 치환한 헤테로 원자 함유 탄소쇄이며, 상기 질소 원자에 결합하는 수소 원자는 아미노기를 갖고 있어도 좋은 알킬기로 치환되어 있어도 좋고, R1~R4는 각각 독립적으로 수소 원자 또는 알킬기이다]
    NH2R5···식 (2)
    [식 (2) 중 R5는 1~12개의 탄소 원자를 갖는 포화 또는 불포화의 지방족 탄화수소기이다]
    NHR6R7···식 (3)
    [식 (3) 중 R6 및 R7은 각각 독립적으로 1~12개의 탄소 원자를 갖는 포화 또는 불포화의 지방족 탄화수소기이다]
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 질소 함유 화합물은 상기 식 (1)로 나타내어지는 폴리아민을 포함하는 흡착 재료.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 질소 함유 화합물은 링커를 통해 상기 수불용성 담체에 결합하고 있는 흡착 재료.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 아미노기의 총량은 1g당 30~2400μmol인 흡착 재료.
  5. 제 4 항에 있어서,
    상기 아미노기의 총량에 대한 상기 1급 아미노기의 양의 비율(1급 아미노기의 양/아미노기의 총량)은 0.30 이하인 흡착 재료.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 수불용성 담체의 형상은 섬유 또는 입자이며,
    상기 섬유 또는 상기 입자의 직경은 15~50㎛이며,
    상기 수불용성 담체의 표면의 산술 평균 거칠기는 0.1~3.0㎛인 흡착 재료.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 면역 억제성 단백질은 TGF-β 또는 LAP 결합형 TGF-β인 흡착 재료.
  8. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 기재된 흡착 재료를 구비하는 흡착 칼럼.
  9. 제 8 항에 있어서,
    혈액 정화 요법에 사용하기 위한 흡착 칼럼.
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