WO2012133399A1 - 免疫抑制性細胞捕集材及び免疫抑制性細胞捕集用カラム - Google Patents
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- B01J20/264—Synthetic macromolecular compounds derived from different types of monomers, e.g. linear or branched copolymers, block copolymers, graft copolymers
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- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
- B01J20/28—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof characterised by their form or physical properties
- B01J20/28014—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof characterised by their form or physical properties characterised by their form
- B01J20/28042—Shaped bodies; Monolithic structures
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- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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- A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
- A61K2239/46—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterised by the cancer treated
- A61K2239/53—Liver
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- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
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- A61K35/14—Blood; Artificial blood
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- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61M—DEVICES FOR INTRODUCING MEDIA INTO, OR ONTO, THE BODY; DEVICES FOR TRANSDUCING BODY MEDIA OR FOR TAKING MEDIA FROM THE BODY; DEVICES FOR PRODUCING OR ENDING SLEEP OR STUPOR
- A61M1/00—Suction or pumping devices for medical purposes; Devices for carrying-off, for treatment of, or for carrying-over, body-liquids; Drainage systems
- A61M1/36—Other treatment of blood in a by-pass of the natural circulatory system, e.g. temperature adaptation, irradiation ; Extra-corporeal blood circuits
- A61M1/3679—Other treatment of blood in a by-pass of the natural circulatory system, e.g. temperature adaptation, irradiation ; Extra-corporeal blood circuits by absorption
Definitions
- the present invention relates to an immunosuppressive cell collection material mainly used for medical use, an immunosuppressive cell collection column filled with the collection material, and a cancer treatment and prevention method using the collection material.
- Patent Document 1 reports an adsorbent adsorbing such TGF- ⁇ and immunosuppressive acid protein. Further, in Patent Document 2, when tumor-bearing rats were treated with extracorporeal circulation using a column packed with an adsorbent capable of adsorbing immunosuppressive proteins such as TGF- ⁇ 1 and S100A8 / A9, cell killing activity was enhanced and tumors were increased. It has been reported that lung metastases could be prevented.
- Non-patent Document 1 CD4 + and CD8 + CD25 + FoxP3 + regulatory T cells
- LAP latency-associated peptide
- the blood contains not only immunosuppressive cells but also a large amount of white blood cells that work to enhance immunity, and it is only possible to selectively remove only the immunosuppressive cells that are present in only about 10%. Not easy.
- a column of beads to which antibodies against immunosuppressive cells are immobilized is used, only immunosuppressive cells can be adsorbed.
- this column is sterilized by heat or radiation. There is a need to.
- antibodies are proteins that are denatured by sterilization and lose their function. There is currently no method for sterilizing protein-immobilized substances, and no therapeutic column is currently known that can remove immunosuppressive cells in the blood.
- the present invention provides a non-protein immunosuppressive cell collection material that selectively collects immunosuppressive cells, an immunosuppressive cell collection column packed with the collection material, and the collection It aims at providing the treatment and prevention method of the cancer which uses material.
- the present inventors have decomposed the polymer on the fiber surface.
- the knowledge that the said objective can be achieved was obtained by using the aminated polyethylene terephthalate fiber made porous.
- the plasma protein such as albumin is poorly adsorbed and immunosuppressive cells are selectively collected. I got the knowledge that I can do it.
- the present invention has been completed based on these findings, and has been completed.
- the following immunosuppressive cell collection material, immunosuppressive cell collection column, and cancer treatment and / or prevention method are provided. It is to provide.
- Immunosuppressive cell collection material (I-1) an easily hydrolyzable condensation polymer having an amino group, An immunosuppressive cell-trapping material comprising a hardly hydrolyzable polymer that coats the easily hydrolyzable condensation polymer, and a molded article comprising a ligand-bound hardly hydrolyzable polymer that coats the hardly hydrolyzable polymer.
- the ligand consists of NH 2 group, secondary amino group, tertiary amino group, polyamine residue, basic cyclic polypeptide residue, aminoglycoside compound residue, chloroquine, primaquine, mefloquine, imiquimod, and nystatin.
- An immunosuppressive cell trap wherein the amount of amino groups in the molded body is 150 ⁇ mol / g or less.
- I-2 The collecting material according to (I-1), wherein the ligand is not a quaternary ammonium group.
- II-3) The collecting material according to (I-1) or (I-2), wherein the easily hydrolyzable condensation polymer is polyester or polyurethane.
- II-4) The collecting material according to any one of (I-1) to (I-3), wherein the hardly hydrolyzable polymer is polysulfone, polyetherimide, polyimide, or a derivative thereof.
- (I-5) The collecting material according to any one of (I-1) to (I-4), wherein the easily hydrolyzable condensation polymer is polyester and the hardly hydrolyzable polymer is polysulfone.
- (I-6) The collection material according to any one of (I-1) to (I-5), wherein the immunosuppressive cell is a cell having a latency associated protein on the cell surface.
- (I-7) The collection material according to any one of (I-1) to (I-5), wherein the immunosuppressive cells are cells that highly express granulocyte antigen and CD11b antigen.
- Immunosuppressive cell collection column (II-1) An immunosuppressive cell collection column packed with the collection material according to any one of (I-1) to (I-7).
- II-2) The column according to (II-1), which is for extracorporeal circulation.
- III-3) The column according to (II-1), which is used for cell therapy.
- III-4) The column according to any one of (II-1) to (II-3), which is used for treating cancer.
- II-5) The column according to any one of (II-1) to (II-3), which is used for preventing recurrence of cancer after surgery for removing cancer.
- Cancer treatment and / or prevention method (III-1) A method for treating and / or preventing cancer, comprising bringing a patient's blood into contact with the collection material according to any one of (I-1) to (I-7).
- the collection material and column of the present invention can selectively collect immunosuppressive cells from blood and can reduce the concentration thereof. Therefore, the collection material and column of the present invention are expected to be applied to cancer treatment and cancer recurrence prevention.
- the collecting material of the present invention uses a non-proteinaceous material, it can be sterilized.
- the immunosuppressive cell trapping material of the present invention is An easily hydrolyzable condensation polymer having an amino group, A hardly hydrolyzable polymer that coats the easily hydrolyzable condensation polymer, and a molded body comprising a ligand-bound hardly hydrolyzable polymer that coats the hardly hydrolyzable polymer,
- the ligand consists of NH 2 group, secondary amino group, tertiary amino group, polyamine residue, basic cyclic polypeptide residue, aminoglycoside compound residue, chloroquine, primaquine, mefloquine, imiquimod, and nystatin. At least one selected from the group,
- the amount of amino groups in the molded product is 150 ⁇ mol / g or less.
- the immunosuppressive cells in the present invention mean blood cells that suppress the functions of killer cells and helper T cells. Specific examples thereof include LAP + CD4 + regulatory T cells and LAP + CD8 + regulatory T cells that are cells having LAP on the cell surface, cells that highly express granulocyte antigen and CD11b, that is, Gr1 high CD11b high And the like. These cells can be confirmed by flow cytometer analysis.
- the abundance of LAP + CD4 + regulatory T cells and LAP + CD8 + regulatory T cells in the peripheral blood varies depending on the individual organism, but is generally between 0.2% and 15% in each T cell subset .
- “selectively capture” means that when blood or a blood cell mixture is passed through a column packed with a collection material, the abundance ratio of immunosuppressive cells in the passed cell mixture is higher than that before passing. It means that the abundance ratio of immunosuppressive cells in the captured cells is increased from that before passage.
- the abundance ratio of LAP-positive T cells when contacted at a blood / collection material weight ratio of 20 is the abundance ratio before passage within the cell subset of CD4 + T or CD8 + T. Those having a capacity of 0.7 or less, particularly 0.5 or less, are preferred.
- a porous collection material is obtained by coating the surface of a readily hydrolyzable condensation polymer such as polyethylene terephthalate with a hardly hydrolyzable polymer and then treating with a polyamine. Since the pores present in the vicinity of the surface of the trapping material are formed after the polymer chain is removed, the pores are larger than the polymer molecules, and are suitable for collecting polymers. Further, since the pores are formed by aminolysis of an easily hydrolyzable condensation polymer with a polyamine, the polymer on the surface of the pores has an amino group.
- LAP on LAP-positive T cells has the property of binding to the polyleucine structure.
- Polyethylene terephthalate as a collection material has an aromatic nucleus and an ester group.
- the chemical structure is thought to be close to the bulkiness, hydrophobicity and polarity of the polyleucine structure, and LAP has a phosphate group in the sugar chain of its side chain, so it has an affinity for the amino group. It is presumed that
- Examples of the easily hydrolyzable condensation polymer used in the present invention include polymers that contain an ester bond or a urethane bond (-O-CONH-) in the main chain and that can be processed into a mechanically strong molded product. These polymers can be hydrolyzed under mild conditions. Such polymers include polyesters and polyurethanes. Among these, polyester is particularly preferable because of its high hydrolysis reactivity, high mechanical strength and processability, and easy availability of molded products. Specific examples of the polyester include polylactic acid, polyglycolic acid, polyethylene terephthalate, and polybutylene terephthalate. Among them, polyethylene terephthalate is preferable.
- the molecular weight of the polymer is not particularly limited as long as it can be molded, but is preferably from 10,000 to 1,000,000, particularly preferably from 20,000 to 200,000 because of good moldability.
- the “molded product” in the present invention means a “molded product” containing an easily hydrolyzable condensation polymer having an amino group, a hardly hydrolyzable polymer, and a ligand-bonded hardly hydrolyzable polymer. It may contain components and the like.
- the surface of the easily hydrolyzable condensation polymer having an amino group is coated with a hardly hydrolyzable polymer, and the surface of the hardly hydrolyzable polymer is further composed of a ligand-binding hardly hydrolyzable polymer. It is a coated molded body.
- the term “coating” means not only that the whole polymer is coated, but also that only a part of the polymer is coated.
- membrane form, a hollow fiber form, a granular form, and these high-order processed goods are mentioned, A shape is suitably selected according to a use. .
- “having an amino group” includes both that the amino group is directly bonded to the polymer and bonded via a spacer molecule.
- the hardly hydrolyzable polymer used in the present invention means a polymer that is less susceptible to hydrolysis than an easily hydrolyzable condensation polymer and is soluble in an organic solvent. Polymers that can withstand the conditions are preferred, and it is more preferred that there is further film-forming properties because the mechanical stability of the processed product is increased.
- the hardly hydrolyzable polymer examples include polysulfone composed of bisphenol A and diphenylsulfone- ⁇ (pC 6 H 4 ) -SO 2- (pC 6 H 4 ) -O- (pC 6 H 4 ) -C (CH 3 ) 2- (pC 6 H 4 ) -O ⁇ n- , poly (p-phenylene ether sulfone)- ⁇ (pC 6 H 4 ) -SO 2- (pC 6 H 4 ) -O- (pC 6 H 4 ) -O ⁇ n -,- ⁇ (pC 6 H 4 ) -SO 2- (pC 6 H 4 ) -O- (pC 6 H 4 ) -C (CF 3 ) 2- (pC 6 H 4 ) -O ⁇ Aromatic polysulfone polymers represented by n- and the like, polyether imides, polyimides, and derivatives thereof can be mentioned.
- polysulfone is particularly preferable because it is inexpensive, has high processability, has high mechanical strength, and has the ability to form a tough film, so that it is excellent as a medical material and easily introduces a functional group.
- polymers those which are soluble in non-chlorine and non-carcinogenic solvents such as tetrahydrofuran, dimethyl sulfoxide and N-methylpyrrolidone are particularly preferred for preventing environmental pollution and maintaining occupational health.
- the molecular weight of the polymer is not particularly limited as long as it can be molded, but is preferably 10,000 to 5,000,000, particularly preferably 20,000 to 200,000 in view of good moldability.
- the hardly hydrolyzable polymer those having a reactive functional group that forms a chemical bond with an amino group in the side chain are particularly preferable. Further, when the hardly hydrolyzable polymer has a ligand that determines the collection ability and the collection specificity, it helps to improve the performance of the collection material.
- the reactive functional groups include reactive functional groups such as chloromethyl groups, haloacetamidomethyl groups, carboxyl group acid halides, acid anhydrides or esters, which have high reactivity and stability during processing. From the balance, a chloroacetamidomethyl group, an iodoacetamidomethyl group, and a bromoacetamidomethyl group are particularly preferable.
- the ligand that should be possessed by the hardly hydrolyzable polymer according to the present invention is necessary for exhibiting the collecting function, and includes NH 2 group, secondary amino group, tertiary amino group, polyamine residue, basic One or more functional groups are selected from cyclic polypeptide residues, aminoglycoside compound residues and the like depending on the purpose.
- Preferred examples include secondary amino groups represented by NH 2 group, N-methyl-amino group, N-butyl-amino group, N, N-dimethylamino group, N-methyl-N-butylamino group, etc.
- Amino groups such as tertiary amino groups represented by groups; polyamines represented by diethylenetriamine, triethylenetetramine, tetraethylenepentamine, etc .; basic cyclic polypeptides represented by polymyxin B and colistin; amikacin, astro Aminoglycoside compounds represented by mycin, isepamicin, arbekacin, tobramycin, kanamycin, dibekacin, streptomycin, gentamicin, netilmicin, bekanamycin and the like; chloroquine, primaquine, mefloquine, imiquimod, nystatin and the like.
- those having a plurality of amino groups such as diethylenetriamine and cyclic polyamino compounds also act as crosslinking groups for the hardly hydrolyzable polymer.
- Such a crosslinking group is useful for enhancing heat resistance and solvent resistance during post-processing and promoting porosity.
- the trapping material of the present invention is preferable for medical safety, but in order to improve this, in general, the lower basicity of the amino group is better, and the lower the density of existence is Is good.
- the adsorptivity of plasma proteins such as albumin is as low as possible.
- the amino group of the trapping material stimulates the cells trapped in the trapping material to release cytokines or cause necrosis. From these viewpoints, the quaternary ammonium group is excluded from the ligand that the hardly hydrolyzable polymer should have.
- the amount of amino groups in the molded article of the present invention is preferably 150 ⁇ mol or less, more preferably 110 ⁇ mol or less, particularly preferably 1 to 110 ⁇ mol per 1 g.
- the amount of amino group in the present invention is a value determined by the amino group quantification method described in the examples.
- Patent Document 2 Japanese Patent Laid-Open No. 2010-201345
- quaternary ammonium groups are used as ligands.
- the amount of amino groups in the adsorbent is 357 ⁇ mol / g and 413 ⁇ mol, respectively. / g.
- the porous adsorbent disclosed in the example of Patent Document 2 is different from the collecting material of the present invention.
- the porous adsorbent of patent document 2 has high protein adsorbability
- the collection material of this invention has low protein adsorbability, and is different in the point of protein adsorbability.
- the collection material of the present invention can selectively capture immunosuppressive cells from a cell fluid composed of many types of blood cells. Moreover, since the collection material of the present invention does not contain a protein component, it does not lose its function in sterilization operations such as high-pressure steam sterilization and radiation sterilization, and can be used for aseptic operations.
- the easily hydrolyzable condensation polymer is directly treated under basic conditions, or the surface thereof is coated with a hardly hydrolyzable polymer, and then the basic conditions are satisfied.
- disassembling a part of easily hydrolyzable condensation polymer by processing by (A), and extracting the decomposition product is mentioned.
- a method of coating with a hardly hydrolyzable polymer a method of evaporating and removing the solvent after immersing the easily hydrolyzable condensation polymer in the hardly hydrolyzable polymer solution, or utilizing the difference in solubility depending on the temperature, 50 A method is adopted in which the easily hydrolyzable condensation polymer is immersed in a solution of a hardly hydrolyzable polymer at ⁇ 70 ° C. and then cooled and coated while gradually depositing the polymer.
- the latter method has the advantage that the coating is performed uniformly, and has the economic advantage of evaporating the solvent and eliminating the need for a device or a solvent recovery device.
- a commercially available polyethylene terephthalate nonwoven fabric is heated in a 0.5% by weight dimethyl sulfoxide solution of diethylenetriamine at 105 ° C. for 20 minutes to roughen the fiber surface along with surface cleaning (pretreatment step).
- the resulting nonwoven fabric is immersed in a tetrahydrofuran solution containing 10% chloroacetamidomethylpolysulfone (substitution rate: 10 mol%) of the fiber weight, and then the tetrahydrofuran is evaporated to apply a hardly hydrolyzable polymer.
- Product is obtained (primary coating process).
- the coated product is immersed in a solution of 1% by weight of diethylenetriamine and water (20% by weight) dimethyl sulfoxide and heated at 80 ° C. for 1 hour to obtain a porous molded product (a porous processing step). Further, this porous molded article was immersed in a dimethyl sulfoxide solution containing 0.2% by weight of chloroacetamidomethyl polysulfone (substitution rate 100 mol%), heated at 40 ° C. for 30 minutes, then pulled up and washed three times with dimethyl sulfoxide. After drying. Next, after heating at 40 ° C.
- the hardly hydrolyzable polymer to be coated is preferably dissolved in a low boiling point solvent such as tetrahydrofuran because the solvent can be easily removed by evaporation.
- the amount of the hardly hydrolyzable polymer to be coated is preferably 0.1 to 50% by weight based on the easily hydrolyzable polymer. A larger amount of coating increases the degree of porosity, but usually 5 to 20% by weight is more preferable.
- the easily hydrolyzable condensation polymer is chemically treated with an amine
- the amine used is preferably a polyamine, particularly preferably diethylenetriamine.
- the amount of diethylenetriamine used is small, the molecular weight of the degradation product oligomer increases, and therefore the size of the formed pores increases. Since the solubility of the formed oligomer varies depending on the solvent, the size and frequency of the formed pores are strongly dependent on the choice of solvent.
- the solvent that dissolves large oligomers is considered to have higher porosity, but if a poorly hydrolyzable polymer is dissolved in the solvent, it will lead to the removal of the coating polymer, so select a solvent that is difficult to dissolve the hardly hydrolyzable polymer.
- hydrous dimethyl sulfoxide is preferable as the solvent.
- the water content of dimethyl sulfoxide is appropriately selected according to the purpose, but is usually 0.1 to 50% by weight, preferably 5 to 20% by weight.
- the reaction temperature is lower than the glass transition point. However, if it is too high, the strength of the molded article will be reduced. Therefore, usually room temperature to 100 ° C., particularly room temperature to 80 ° C. is preferably used.
- the secondary coating process after porosity is performed for the purpose of introducing a new ligand. Moreover, it also has a role of protecting the surface of the easily hydrolyzable condensation polymer newly generated in the porous treatment process. Since the easily hydrolyzable condensation polymer is easily hydrolyzed, the structure is chemically and physically stabilized by coating the surface with the hardly hydrolyzable polymer, and can be suitably used in medical applications. When a polymer in which a ligand is bound to a secondary coating polymer is used, a cell-capturing function and a cell activation function specific to the ligand are imparted.
- Immunosuppressive cell collection column The immunosuppressive cell collection column of the present invention is filled with the immunosuppressive collection material described above.
- the packing density of the collection material of the present invention packed in the column is preferably 50 to 400 mg / cm 3 , particularly preferably 150 to 300 mg / cm. 3 .
- the cell collection efficiency, the selectivity, and the pressure loss at the time of liquid passage are in an appropriate range.
- pressure loss increases, red blood cells are hemolyzed.
- hemolysis is contraindicated in extracorporeal circulation.
- Pressure loss is positively correlated with filling density and blood flow rate. In order to complete extracorporeal circulation within 2 hours in humans, the blood flow rate must be at least 30 mL / min. Therefore, in order to prevent hemolysis of red blood cells, it is necessary to reduce the pressure loss to 100 mmHg or less.
- the column of the present invention can selectively collect immunosuppressive cells from blood by using it as a column for extracorporeal circulation, and its concentration can be lowered. Also, leukocytes prepared from blood treated with the column of the present invention and leukocytes treated with this column in advance of this column have improved CTL activity, so the column of the present invention is used for cell therapy against diseases such as cancer. It can also be used as a column.
- Examples of the container filled with the collection material of the present invention include glass, plastic, stainless steel, and the like, and the size of the container is appropriately selected according to the purpose of use.
- the column of the present invention can selectively collect immunosuppressive cells, it can also be used for the treatment of viral diseases and cancer, and the prevention of recurrence of cancer after surgery for removing the cancer.
- the column of the present invention can be used in combination with surgical therapy, radiation therapy, anticancer drug therapy, activated leukocyte therapy, vaccine therapy, etc., to improve these therapeutic effects, particularly for prevention of metastasis and recurrence. Can also be helpful.
- a 0.1 g sample of amino group was immersed in 10 mL of 0.1M picric acid / 70% ethanol solution and gently shaken for 2 hours. Next, the specimen was washed with a 70% ethanol solution until the yellow color of the washing solution disappeared. Next, the specimen was immersed in 10 to 50 mL of a 1% by weight diethylamine / 70% ethanol solution to elute picric acid. The concentration of picric acid was determined from the absorbance at 320 nm, and the amount of amino groups per gram was determined by dividing the adsorbed amount by the exact sample weight.
- Cell surface antigen was analyzed using FACSCaliber manufactured by Becton Dickinson.
- antibodies for cell surface staining include Becton Dickinson's phycoerythrin-labeled anti-human LAP, FITC-labeled anti-rat CD4, APC-labeled anti-rat CD4, e-Bioscience's FITC-labeled anti-rat granulocyte marker, APC-labeled anti-rat CD8, phycoerythrin-labeled anti-rat CD3, and Biolegend APC-labeled anti-rat CD11b / c were used.
- Rat extracorporeal circulation preparation of extracorporeal circulation column
- An extracorporeal circulation column was prepared by packing 0.3 g of the trapping material into a polypropylene cylindrical column having an inner diameter of 1 cm and an internal volume of 2 mL.
- the column and circuit were sterilized by passing 70% alcohol, and immediately before extracorporeal circulation, preparatory treatment was performed by flowing 40 mL of heparinized physiological saline (5 units / mL) at a rate of 2 mL / min.
- Extracorporeal circulation was performed for 1 hour at a blood flow rate of 2 mL / min. Heparin in the extracorporeal circulation was continuously administered at 100 units / hour.
- Rat Spleen Cells and Peripheral Blood Mononuclear Cells Rats were anesthetized with Nembutal, then blood was removed from the abdominal aorta and sacrificed, and the spleen was collected. The spleen was finely broken in a complete medium, and the cells were collected, and then treated with a low osmotic pressure solution to remove red blood cells, and the red blood cells were hemolyzed. The obtained cells were suspended in a complete medium to obtain a spleen cell solution.
- Peripheral blood was diluted with the same amount of physiological saline, layered on the same amount of lymphocyte separation solution 1077 (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) as the diluted solution, and centrifuged at 800 g for 20 minutes. The mononuclear cell layer was collected and treated with hypotonic solution to lyse the red blood cells.
- Example 1 (Preparation of hardly hydrolyzable polymer 1) After cooling a mixed solution of 20 mL of nitrobenzene and 40 mL of sulfuric acid to 0 ° C, 2.6 g (0.02 mol) of N-hydroxymethyl-2-chloroacetamide is added and dissolved at a temperature of 0 to 10 ° C. The mixture was added to a nitrobenzene solution of delpolysulfone P3500 (88.4 g: 0.2 mol / 1600 mL) with good stirring. Furthermore, after stirring at 20 ° C. for 2 hours, the reaction mixture was placed in a large excess of cold methanol to precipitate the polymer.
- the precipitate was extracted with methanol until the nitrobenzene odor disappeared, and then dried to obtain 90.0 g of a polymer.
- the polymer was dissolved in 2 L dimethylformamide, reprecipitated in a large excess of methanol and purified.
- the obtained polymer was dissolved in dimethylformamide, dimethyl sulfoxide and tetrahydrofuran.
- the presence of an amide group was confirmed by absorption at 3290-3310, 1670, and 1528 cm ⁇ 1 from the infrared absorption spectrum of a film prepared by dissolving this in chloroform and casting on a glass plate.
- the precipitate was extracted with methanol until the nitrobenzene odor disappeared, and then dried to obtain 62.0 g of a polymer.
- the polymer was dissolved in 1 L dimethylformamide, reprecipitated in a large excess of methanol and purified.
- the obtained polymer was soluble in dimethylformamide and dimethyl sulfoxide, but not in tetrahydrofuran. Elemental analysis: N: 2.1% Cl: 4.5%.
- the presence of amide groups was confirmed by absorption at 3290-3310, 1670 and 1528 cm ⁇ 1 in the infrared absorption spectrum of the potassium bromide pellet. From the 1 HNMR spectrum of a deuterated dimethyl sulfoxide solution of this polymer, it was confirmed that the substitution rate was 100% as in the case of the hardly hydrolyzable polymer 1.
- the non-woven fabric was taken out, washed with ethanol, washed with water, and vacuum-dried to obtain 9.6 g of a diethylenetriamined non-woven fabric (collecting material of the present invention-1).
- the amount of amino groups was 62 ⁇ mol / g.
- Example 2 (Collector synthesis: secondary coating treatment) A polymyxin solution was prepared by dissolving 500 mg of polymyxin B in 150 mL of 10% by weight hydrous dimethylsulfoxide. 2 g of the previously hardly hydrolyzable polymer 2 prepared was dissolved in 200 mL of dimethyl sulfoxide to give a concentration of 1% by weight. 10 g of the porous non-woven fabric-1 prepared previously was immersed in this solution and heated at 40 ° C. for 1 hour, and then the non-woven fabric was pulled up and washed with dimethyl sulfoxide three times.
- Example 3 (Collector synthesis: secondary coating treatment) A primaquine solution was prepared by dissolving 750 mg of primaquine phosphate in 150 mL of 10% by weight hydrous dimethylsulfoxide. 2 g of the previously hardly hydrolyzable polymer 2 prepared was dissolved in 200 mL of dimethyl sulfoxide to give a concentration of 1% by weight. 10 g of the porous non-woven fabric-1 prepared previously was immersed in this solution and heated at 40 ° C. for 1 hour, and then the non-woven fabric was pulled up and washed with dimethyl sulfoxide three times. This was immersed in the primaquine solution and heated in a bath at 40 ° C. for 1 hour.
- the non-woven fabric was taken out, washed with ethanol, washed with water, and vacuum-dried to obtain 9.6 g of a primaquinized non-woven fabric (collecting material of the present invention-3).
- the amount of amino groups was 48 ⁇ mol / g.
- Test Example 1 (Catchability evaluation test-1) WKAH / Hkm rats (male, 12 weeks old) were inoculated with 10 ⁇ 10 5 cancer cells KDH-8 subcutaneously in the back, and prepared tumor-bearing rats (body weight 354 g, tumor diameter 26 mm ⁇ 21 mm). 10 mL of blood was collected from the carotid artery using 500 units of heparin, and splenocytes were prepared from the spleen and suspended in complete medium to prepare a 500 ⁇ 10 4 cells / mL splenocyte solution.
- the cell reduction rate is almost the same from Table 1, the ratio of LAP-positive cells in CD4 + T cells is reduced in the collection material of the example, and therefore the collection material of the present invention is It can be seen that LAP + CD4 + T cells are selectively collected.
- the polyethylene terephthalate fiber nonwoven fabric collects cells, it can be seen that there is no selectivity at all.
- Test Example 2 (Catchability evaluation test-2) Pack 100 mg of collection material into a 10-mL syringe, and after flowing the complete medium, attach a 23-gauge syringe needle, flow 3 mL of the blood obtained in Test Example 1, and then flow 5 mL of the complete medium. did. Red blood cells were removed from the eluate, and the ratio of LAP positive cells in CD4 + T cells was determined with a flow cytometer, and the results shown in Table 2 were obtained. As Comparative Example 1, a polyethylene terephthalate fiber nonwoven fabric was washed and used.
- the collection material of the present invention selectively collects LAP + CD4 + T cells from whole blood. I understand that On the other hand, it can be seen that the polyethylene terephthalate fiber nonwoven fabric has no selectivity at all.
- the trapping material of the present invention selectively selects LAP positive T cells from whole blood. You can see that it is collected. It can also be seen that the proportion of granulocyte marker highly expressing cells in CD11bc + cells, which are said to be immunosuppressive cells, is also reduced by extracorporeal circulation.
- Table 4 shows that the ratio of LAP positive cells in CD4 + T cells is reduced to 39% of the initial value by extracorporeal circulation, and the ratio of LAP positive cells in CD8 + T cells is in vitro.
- the collection material of the present invention selectively collects LAP-positive T cells from whole blood because it is reduced to 20% of the initial value by circulation and the number of LAP-positive cells in the attached and collected cells is increased. I understand that
- TTL suppression experiment After inoculating 1 ⁇ 10 5 cancer cells KDH-8 subcutaneously in the back of WKAH / Hkm rats (male, 10 weeks old), 20 days later, the tumor diameter became 10 mm ⁇ 10 mm.
- Whole blood was collected from this rat, mononuclear cells were taken out, and a cell solution of 5 ⁇ 10 6 cells / mL was prepared.
- Adherent cells obtained by detaching the cells collected in the column in Test Example 4 were adjusted to a concentration of 5 ⁇ 10 6 cells / mL.
- CTL activity decreases in proportion to the amount of adherent cells added. Therefore, it can be seen that the cells collected in the column have strong immunosuppressive properties.
- a total of 6 ⁇ 10 7 mononuclear cells (tumor bearing rat PBMC) were obtained from the remaining two bloods.
- blood was collected from 3 WKAH / Hkm rats (male, 15 weeks old) and processed in the same manner to obtain a total of 7 ⁇ 10 7 mononuclear cells (normal rat PBMC). .
- Table 6 shows that rat peripheral blood mononuclear cells extracorporeally circulated with the collection material of the present invention completely inhibit cancer cell colonization, whereas untreated rat peripheral blood mononuclear cells have no inhibitory effect. I understand.
- Example 4 (Synthesis of collecting material: coating treatment with hardly hydrolyzable polymer) Dissolve 3.00 g of the previously poorly hydrolyzable polymer 1 in 300 mL of dimethyl sulfoxide at 60 ° C., soak 19.04 g of the pre-treated non-woven fabric-1 previously prepared in this solution and let stand for 1 hour. Then, it was cooled to 20 ° C. with shaking for 8 hours. At this time, the liquid was transparent and there was no polymer suspension. The nonwoven fabric was centrifuged to remove dimethyl sulfoxide, washed with water, and dried to obtain 21.25 g of primary coated nonwoven fabric-2.
- albumin was determined by the BCG method (Clinical® Chemistry® 1972: 18: 1537-1538), and TGF- ⁇ 1 was measured with an ELISA kit from R and D. The initial values of the albumin were 3.3 mg / dL for albumin and 8.5 mg / mL for TGF- ⁇ 1, respectively.
- WKAH / Hkm rats male, 12 weeks old were inoculated with 5 ⁇ 10 4 cancer cells KDH-8 subcutaneously on the right side of the back, and the tumor diameter became 3 mm after 35 days.
- This rat was subjected to extracorporeal circulation for 1 hour with 0.3 g of the present collection material-4 packed in a 1.6 mL cylindrical column (packing density 190 mg / cm 3 ).
- 1 mL of blood was collected before and after the start of extracorporeal circulation, and the surface antigens were analyzed for each blood and adherent collected cells, and the results shown in Table 8 were obtained.
- the ratio of LAP positive cells in CD4 + T cells is reduced to 31% of the initial value due to extracorporeal circulation using the column of the collection material-4 of the present invention, and the ratio of LAP positive cells in CD8 + T cells is Since the ratio has decreased to 59% of the initial value and the number of LAP positive cells in the attached and collected cells has increased, the collection material-4 of the present invention selectively collects LAP positive T cells from whole blood. I understand that
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Abstract
開示されているのは、アミノ基を有する易加水分解性縮合ポリマー、該易加水分解性縮合ポリマーを被覆する難加水分解性ポリマー、及び該難加水分解性ポリマーを被覆するリガンド結合難加水分解性ポリマーを備えた成型体からなる免疫抑制性細胞捕集材であって、該リガンドが、NH2基、第二級アミノ基、第三級アミノ基、ポリアミン残基、塩基性環状ポリペプチド残基、アミノグリコシド系化合物残基、クロロキン、プリマキン、メフロキン、イミキモド、及びナイスタチンからなる群から選択される少なくとも1種であり、該成型体中のアミノ基の量が150μmol/g以下である、免疫抑制性細胞捕集材、並びに該捕集材が充填された免疫抑制性細胞捕集用カラムである。
Description
本発明は、主として医療用途に用いる免疫抑制性細胞捕集材、該捕集材が充填された免疫抑制性細胞捕集用カラム、並びに該捕集材を使用する癌の治療及び予防方法に関する。
癌の克服は現代医学の大きな課題である。生体には癌細胞を除く機構が備わっており癌にならないはずであるが、何らかの原因で免疫が低下した時に癌が発症すると考えられる。
担癌哺乳動物の血液には、TGF-βやインターロイキン-10などの免疫抑制性タンパク質の濃度が増加していることが知られており、これら免疫抑制性タンパク質を吸着カラムでの体外循環によって除去すれば、免疫が向上して腫瘍の増殖を抑えられると考えられる。実際、特許文献１では、そのようなTGF-βや免疫抑制酸タンパク質に吸着する吸着材について報告されている。また、特許文献２では、TGF-β1やS100A8/A9等の免疫抑制性タンパク質を吸着できる吸着材が充填されたカラムで担癌ラットを体外循環治療すると、殺細胞活性が増強されたことや腫瘍の肺転移を防止できたことが報告されている。
最近、担癌生体の血液中に含まれる白血球の中には免疫抑制性のものがあることが分かってきている。そして、CD4+CD25+FoxP3+の制御性T細胞(非特許文献１)、細胞表面にレイタンシイ・アソシエイティッド・ペプチド(latency-associated peptide)(以下LAPと略称する)を発現したCD4+及びCD8+の制御性T細胞(非特許文献２、３)、及びGr1highCD11bhigh等のミエロイド由来抑制性細胞(非特許文献４)が免疫を抑えていることが明らかになっている。
これらの細胞はTGF-βやインターロイキン-10等の免疫抑制性タンパク質を大量に分泌しているので、これらの細胞を除去することは癌治療上、免疫抑制性タンパク質を除去する以上に重要であると考えられる。
しかし、血液中には免疫抑制性の細胞だけでなく、免疫を高めるように働く白血球が多量に含まれており、10%程度しか存在しない免疫抑制性の細胞だけを選択的に除去するのは容易でない。このような場合、免疫抑制性の細胞に対する抗体を固定したビーズのカラムを使えば、免疫抑制性の細胞だけを吸着できるが、このカラムを治療用器材として使用するためには熱や放射線で滅菌する必要がある。しかし、抗体はタンパク質であり、滅菌操作で変性し、機能を失ってしまう。タンパク質を固定化した物質を滅菌する方法は現在のところ存在せず、血液中の免疫抑制性の細胞を除去できる治療用カラムは現在のところ知られていない。
M. Beyer and J. L. Schultze, Blood 2006: 108: 804-811
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M. L. Chen, B. S. Yan, D. Kozoriz and H. L. Weiner, European Journal of Immunology 2009: 39: 3423-3435
P. Sinha, C. Okoro, D. Foell, H. H. Freeze, S. Ostrand-Rosenberg and G. Srikrishna, The Journal of Immunology 2008: 181: 4666-4675
そこで、本発明は、免疫抑制性細胞を選択的に捕集する非タンパク質性の免疫抑制性細胞捕集材、該捕集材が充填された免疫抑制性細胞捕集用カラム、並びに該捕集材を使用する癌の治療及び予防方法を提供することを目的とする。
本発明者らは、抗体を使用しないで血液中の免疫抑制性細胞を選択的に捕集する医療用のカラムを作る方法がないか種々検討した結果、繊維表面の高分子を分解することにより多孔化したアミノ化ポリエチレンテレフタレート繊維を使用することによって、上記目的を達成することができるという知見を得た。特に、第四級アンモニウム基以外のものをリガンドとして使用し、且つアミノ基の存在密度が低い場合に、アルブミンなどの血漿タンパク質の吸着性が低い上に、免疫抑制性細胞を選択的に捕集できるという知見を得た。
本発明は、これら知見に基づき、更に検討を重ねて完成されたものであり、次の免疫抑制性細胞捕集材、免疫抑制性細胞捕集用カラム、並びに癌の治療及び／又は予防方法を提供するものである。
(I) 免疫抑制性細胞捕集材
(I-1) アミノ基を有する易加水分解性縮合ポリマー、
該易加水分解性縮合ポリマーを被覆する難加水分解性ポリマー、及び
該難加水分解性ポリマーを被覆するリガンド結合難加水分解性ポリマー
を備えた成型体からなる免疫抑制性細胞捕集材であって、
該リガンドが、NH2基、第二級アミノ基、第三級アミノ基、ポリアミン残基、塩基性環状ポリペプチド残基、アミノグリコシド系化合物残基、クロロキン、プリマキン、メフロキン、イミキモド、及びナイスタチンからなる群から選択される少なくとも1種であり、
該成型体中のアミノ基の量が150μmol/g以下である、免疫抑制性細胞捕集材。
(I-2) 前記リガンドが第四級アンモニウム基ではない、(I-1)に記載の捕集材。
(I-3) 前記易加水分解性縮合ポリマーがポリエステル又はポリウレタンである、(I-1)又は(I-2)に記載の捕集材。
(I-4) 前記難加水分解性ポリマーがポリスルホン、ポリエーテルイミド、ポリイミド又はこれらの誘導体である、(I-1)～(I-3)のいずれかに記載の捕集材。
(I-5) 前記易加水分解性縮合ポリマーがポリエステルであり、且つ前記難加水分解性ポリマーがポリスルホンである、(I-1)～(I-4)のいずれかに記載の捕集材。
(I-6) 前記免疫抑制性細胞がレイタンシイ・アソシエイティッド・プロテインを細胞表面に有する細胞である、(I-1)～(I-5)のいずれかに記載の捕集材。
(I-7) 前記免疫抑制性細胞が顆粒球抗原とCD11b抗原を高発現する細胞である、(I-1)～(I-5)のいずれかに記載の捕集材。
(I-1) アミノ基を有する易加水分解性縮合ポリマー、
該易加水分解性縮合ポリマーを被覆する難加水分解性ポリマー、及び
該難加水分解性ポリマーを被覆するリガンド結合難加水分解性ポリマー
を備えた成型体からなる免疫抑制性細胞捕集材であって、
該リガンドが、NH2基、第二級アミノ基、第三級アミノ基、ポリアミン残基、塩基性環状ポリペプチド残基、アミノグリコシド系化合物残基、クロロキン、プリマキン、メフロキン、イミキモド、及びナイスタチンからなる群から選択される少なくとも1種であり、
該成型体中のアミノ基の量が150μmol/g以下である、免疫抑制性細胞捕集材。
(I-2) 前記リガンドが第四級アンモニウム基ではない、(I-1)に記載の捕集材。
(I-3) 前記易加水分解性縮合ポリマーがポリエステル又はポリウレタンである、(I-1)又は(I-2)に記載の捕集材。
(I-4) 前記難加水分解性ポリマーがポリスルホン、ポリエーテルイミド、ポリイミド又はこれらの誘導体である、(I-1)～(I-3)のいずれかに記載の捕集材。
(I-5) 前記易加水分解性縮合ポリマーがポリエステルであり、且つ前記難加水分解性ポリマーがポリスルホンである、(I-1)～(I-4)のいずれかに記載の捕集材。
(I-6) 前記免疫抑制性細胞がレイタンシイ・アソシエイティッド・プロテインを細胞表面に有する細胞である、(I-1)～(I-5)のいずれかに記載の捕集材。
(I-7) 前記免疫抑制性細胞が顆粒球抗原とCD11b抗原を高発現する細胞である、(I-1)～(I-5)のいずれかに記載の捕集材。
(II) 免疫抑制性細胞捕集用カラム
(II-1) (I-1)～(I-7)のいずれかに記載の捕集材が充填された免疫抑制性細胞捕集用カラム。
(II-2) 体外循環用である、(II-1)に記載のカラム。
(II-3) 細胞治療用である、(II-1)に記載のカラム。
(II-4) 癌の治療に使用される、(II-1)～(II-3)のいずれかに記載のカラム。
(II-5) 癌の摘出手術後の癌の再発予防に使用される、(II-1)～(II-3)のいずれかに記載のカラム。
(II-1) (I-1)～(I-7)のいずれかに記載の捕集材が充填された免疫抑制性細胞捕集用カラム。
(II-2) 体外循環用である、(II-1)に記載のカラム。
(II-3) 細胞治療用である、(II-1)に記載のカラム。
(II-4) 癌の治療に使用される、(II-1)～(II-3)のいずれかに記載のカラム。
(II-5) 癌の摘出手術後の癌の再発予防に使用される、(II-1)～(II-3)のいずれかに記載のカラム。
(III) 癌の治療及び／又は予防方法
(III-1) (I-1)～(I-7)のいずれかに記載の捕集材に患者の血液を接触させることを特徴とする、癌の治療及び／又は予防方法。
(III-1) (I-1)～(I-7)のいずれかに記載の捕集材に患者の血液を接触させることを特徴とする、癌の治療及び／又は予防方法。
本発明の捕集材及びカラムは、血液中から免疫抑制性細胞を選択的に捕集することができ、その濃度を下げることができる。そのため、本発明の捕集材及びカラムは癌治療や癌の再発予防への適用が期待される。
更に、本発明の捕集材は、非タンパク質性の材料を使用しているので滅菌操作が可能である。
以下、本発明について更に詳細に説明する。
免疫抑制性細胞捕集材
本発明の免疫抑制性細胞捕集材は、
アミノ基を有する易加水分解性縮合ポリマー、
該易加水分解性縮合ポリマーを被覆する難加水分解性ポリマー、及び
該難加水分解性ポリマーを被覆するリガンド結合難加水分解性ポリマー
を備えた成型体からなり、
該リガンドが、NH2基、第二級アミノ基、第三級アミノ基、ポリアミン残基、塩基性環状ポリペプチド残基、アミノグリコシド系化合物残基、クロロキン、プリマキン、メフロキン、イミキモド、及びナイスタチンからなる群から選択される少なくとも1種であり、
該成型体中のアミノ基の量が150μmol/g以下であることを特徴とする。
本発明の免疫抑制性細胞捕集材は、
アミノ基を有する易加水分解性縮合ポリマー、
該易加水分解性縮合ポリマーを被覆する難加水分解性ポリマー、及び
該難加水分解性ポリマーを被覆するリガンド結合難加水分解性ポリマー
を備えた成型体からなり、
該リガンドが、NH2基、第二級アミノ基、第三級アミノ基、ポリアミン残基、塩基性環状ポリペプチド残基、アミノグリコシド系化合物残基、クロロキン、プリマキン、メフロキン、イミキモド、及びナイスタチンからなる群から選択される少なくとも1種であり、
該成型体中のアミノ基の量が150μmol/g以下であることを特徴とする。
(捕集材の構成)
本発明における免疫抑制性細胞とは、キラー細胞及びヘルパーT細胞の機能を抑制する血液細胞を意味する。その具体例としてLAPを細胞表面に有する細胞であるLAP+CD4+制御性T細胞及びLAP+CD8+制御性T細胞、顆粒球抗原とCD11bを高発現している細胞、即ち、Gr1highCD11bhighの細胞などを挙げることができる。これらの細胞はフローサイトメーター分析で確認することが可能である。LAP+CD4+制御性T細胞及びLAP+CD8+制御性T細胞の末梢血液中の存在量は個々の生体により異なるが、一般的にはそれぞれのT細胞サブセット中の0.2%～15%である。
本発明における免疫抑制性細胞とは、キラー細胞及びヘルパーT細胞の機能を抑制する血液細胞を意味する。その具体例としてLAPを細胞表面に有する細胞であるLAP+CD4+制御性T細胞及びLAP+CD8+制御性T細胞、顆粒球抗原とCD11bを高発現している細胞、即ち、Gr1highCD11bhighの細胞などを挙げることができる。これらの細胞はフローサイトメーター分析で確認することが可能である。LAP+CD4+制御性T細胞及びLAP+CD8+制御性T細胞の末梢血液中の存在量は個々の生体により異なるが、一般的にはそれぞれのT細胞サブセット中の0.2%～15%である。
本発明における「選択的に捕捉する」とは、捕集材を充填したカラムに血液又は血液細胞混合液を通した時、通過した細胞混合液中の免疫抑制性細胞の存在比率が通過前より減少し、捕捉された細胞中の免疫抑制性細胞の存在比率が通過前より増加することを意味する。本発明の捕集材としては、血液／捕集材の重量比20で接触させた時のLAP陽性T細胞の存在比率が、CD4+T又はCD8+Tの細胞サブセット内で通過前の存在比率の0.7以下、特に0.5以下になる能力を有するものが好ましい。
ポリエチレンテレフタレートのような易加水分解性縮合ポリマーの表面を難加水分解性ポリマーで被覆した後、ポリアミンで処理することによって多孔性捕集材が得られる。この捕集材表面近傍に存在する孔はポリマー鎖の抜けた後に形成されるので、ポリマー分子以上の大きさになり、高分子の捕集用途に適している。また、孔は易加水分解性縮合ポリマーがポリアミンでアミノリシスされてできるので、孔の表面のポリマーはアミノ基を有するという特徴がある。
選択的捕集の機構としては、免疫抑制性細胞の一つであるLAP陽性T細胞上のLAPはポリロイシン構造に結合する性質があり、捕集材のポリエチレンテレフタレートは芳香核とエステル基を有しており、その化学構造がポリロイシン構造の嵩高さ、疎水性及び極性に近いと考えられること、LAPがその側鎖の糖鎖にリン酸基を持つことからアミノ基に親和性を持っていること等が推測される。
本発明で使用する易加水分解性縮合ポリマーとしては、主鎖にエステル結合又はウレタン結合(-O-CONH-)を含むポリマーであり、且つ機械的に強い成型体に加工でき得るポリマーが挙げられ、これらのポリマーは温和な条件で加水分解が可能である。このようなポリマーとしては、ポリエステル及びポリウレタンが含まれる。中でも、ポリエステルは加水分解反応性が高い上に、機械的強度及び加工性が高く、且つ成型品の入手が容易なので、特に好ましい。ポリエステルの具体例としては、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリエチレンテレフタレート、ポリブチレンテレフタレート等を挙げることができるが、中でもポリエチレンテレフタレートが好ましい。当該ポリマーの分子量は、成型できる範囲であれば特に制限されないが、成形性の良さから、通常1万～100万、特に2万～20万が好ましい。
本発明における「成型体」とは、アミノ基を有する易加水分解性縮合ポリマー、難加水分解性ポリマー、及びリガンド結合難加水分解性ポリマーを含む「成型体」を意味しており、他のポリマー成分等を含むものであっても良い。本発明の成型体の態様としては、アミノ基を有する易加水分解性縮合ポリマーの表面が難加水分解性ポリマーで被覆され、当該難加水分解性ポリマーの表面が更にリガンド結合難加水分解性ポリマーで被覆された成型体である。尚、本発明において被覆とはポリマー全体が被覆されていることだけでなく、ポリマーの一部のみが被覆されていることも意味する。
本発明の成型体の形状としては、特に限定されないが、繊維状、不織布状、膜状、中空糸状、粉粒状、及びこれらの高次加工品が挙げられ、形状は用途に応じ適宜選択される。
本発明において「アミノ基を有する」とは、アミノ基がポリマーに直接結合していること、及びスペーサー分子を介して結合していることの両方を包含する。
本発明で使用する難加水分解性ポリマーとは、易加水分解性縮合ポリマーより加水分解を受け難いポリマーであり、且つ有機溶媒に可溶なポリマーを意味し、特にガンマー線滅菌や高圧蒸気滅菌の条件に耐え得るポリマーが好ましく、加工品の機械的安定性が増すので更にフイルム形成性があるとより好ましい。難加水分解性ポリマーの具体例としては、ビスフェノールAとジフェニルスルホンからなるポリスルホン -{(p-C6H4)-SO2-(p-C6H4)-O-(p-C6H4)-C(CH3)2-(p-C6H4)-O}n-、ポリ(p-フェニレンエーテルスルホン)-{(p-C6H4)-SO2-(p-C6H4)-O-(p-C6H4)-O}n-、-{(p-C6H4)-SO2-(p-C6H4)-O-(p-C6H4)-C(CF3)2-(p-C6H4)-O}n-などで代表される芳香族ポリスルホン重合体、ポリエーテルイミド、ポリイミド、及びこれらの誘導体を挙げることができる。中でも、ポリスルホンは、安価で加工性が高く、自身の機械的強度も高く、強靭なフイルムを形成する能力があるので医療用材料として優れており、また官能基を導入し易いので、特に好ましい。また、上記ポリマーの中でも、テトラヒドロフラン、ジメチルスルホキサイド、N-メチルピロリドンなどの非塩素系且つ非発癌性溶剤に溶解するものが、環境汚染防止や労働衛生維持上、特に好ましい。当該ポリマーの分子量は、成型できる範囲であれば特に制限はないが、成形性の良さから、通常1万～500万、特に2万～20万が好ましい。
難加水分解性ポリマーとしては、アミノ基と化学結合を形成する反応性官能基を側鎖に持つものが特に好ましい。更に難加水分解性ポリマーが、捕集能力及び捕集特異性を決定するリガンドを併せ持つと捕集材の性能向上に役立つ。
上記反応性官能基としては、クロロメチル基、ハロアセトアミドメチル基、カルボキシル基の酸ハロゲン化物、酸無水物又はエステル等の反応性官能基が挙げられ、反応性の高さと加工中の安定性のバランスから、クロロアセトアミドメチル基、ヨードアセトアミドメチル基及びブロモアセトアミドメチル基が特に好ましい。
本発明にかかる難加水分解性ポリマーが有すべきリガンドは捕集機能の発揮のため必要なものであり、NH2基、第二級アミノ基、第三級アミノ基、ポリアミン残基、塩基性環状ポリペプチド残基、アミノグリコシド系化合物残基等の中から目的に応じて1個又は2個以上の官能基が選ばれる。
好ましい具体例としては、NH2基、N-メチル-アミノ基、N-ブチル-アミノ基などで代表される第二級アミノ基、N,N-ジメチルアミノ基、N-メチル-N-ブチルアミノ基などで代表される第三級アミノ基等のアミノ基；ジエチレントリアミン、トリエチレンテトラミン、テトラエチレンペンタミンなどで代表されるポリアミン；ポリミキシンB、コリスチンで代表される塩基性環状ポリペプチド；アミカシン、アストロマイシン、イセパマイシン、アルベカシン、トブラマイシン、カナマイシン、ジベカシン、ストレプトマイシン、ゲンタマイシン、ネチルマイシン、ベカナマイシンなどで代表されるアミノグリコシド系化合物；クロロキン、プリマキン、メフロキン、イミキモド、ナイスタチン等が挙げられる。
上記のリガンドの内、ジエチレントリアミンや環状ポリアミノ化合物等の複数のアミノ基を有するものは、難加水分解性ポリマーの架橋基としても作用する。そのような架橋基は、後加工時の耐熱性及び耐溶剤性を高めると共に多孔化を促進するために有用である。
本発明の捕集材の細胞選択性は高い方が医学的安全上好ましいが、これを向上させるためには一般的にアミノ基の塩基性度が低い方が良く、且つ、存在密度が低い方が良い。また、体外循環のように血液を直接処理して、生体に戻す使用方法の場合は、アルブミンなどの血漿タンパク質の吸着性ができるだけ低い方が良い。とりわけ、捕集材に捕捉された細胞を捕集材のアミノ基が刺激して、サイトカインを放出させることやネクローシスを起こさせることは医学的安全上避けなければならない。これらの観点から、第四級アンモニウム基は難加水分解性ポリマーが有すべきリガンドから除外される。そして、本発明の成型体中のアミノ基の量は、好ましくは1 g当たり150μmol以下、より好ましくは110μmol以下、特に好ましくは1～110μmolである。尚、本発明におけるアミノ基の量は、実施例に記載のアミノ基の定量方法で求められる値とする。
特許文献２(特開2010-201345号公報)の実施例１～３ではリガンドとして第四級アンモニウム基が使用され、実施例４及び５では吸着材のアミノ基の量は各々357μmol/g、413μmol/gとなっている。このように特許文献２の実施例で開示されている多孔性吸着材は本発明の捕集材とは異なる物である。そして、特許文献２の多孔性吸着材はタンパク質吸着性が高いのに対して、本発明の捕集材はタンパク質の吸着性が低く、タンパク質吸着性の点で異なっている。
本発明の捕集材は、多種類の血液細胞からなる細胞液から免疫抑制性細胞を選択的に捕捉することができる。また、本発明の捕集材はタンパク質成分を含まないので、高圧蒸気滅菌や放射線滅菌などの滅菌操作で機能を失わず、無菌操作に使用できる。
(捕集材の製造方法)
本発明の捕集材の製造方法としては、易加水分解性縮合ポリマーを直接、塩基性条件で処理することにより、又は、その表面を難加水分解性ポリマーで被覆し、次に、塩基性条件で処理することにより易加水分解性縮合ポリマーの一部を分解し、その分解産物を抽出することによってアミノ基を有する多孔構造を作る方法が挙げられる。
本発明の捕集材の製造方法としては、易加水分解性縮合ポリマーを直接、塩基性条件で処理することにより、又は、その表面を難加水分解性ポリマーで被覆し、次に、塩基性条件で処理することにより易加水分解性縮合ポリマーの一部を分解し、その分解産物を抽出することによってアミノ基を有する多孔構造を作る方法が挙げられる。
難加水分解性ポリマーでの被覆の方法としては、易加水分解性縮合ポリマーを難加水分解性ポリマー溶液に浸した後、溶媒を蒸発除去する方法、或いは、温度による溶解度差を利用して、50～70℃の難加水分解性ポリマーの溶液に易加水分解性縮合ポリマーを浸した後、冷却して徐々にポリマーを析出させながら被覆する方法が採用される。後者の方法は均一に被覆が行われる特長があり、また、溶媒を蒸発させ装置や溶媒回収装置を必要としない経済的利点がある。上記難加水分解性ポリマーを更にリガンド結合難加水分解性ポリマーで被覆するとより優れた捕集材が得られる。以下に具体例を示す。
まず、市販のポリエチレンテレフタレート不織布をジエチレントリアミンの0.5重量％ジメチルスルホキサイド溶液中、105℃で20分間加熱して、表面洗浄とともに繊維表面を粗面化する(前処理工程)。水洗浄・乾燥後、得られた不織布を繊維重量の10%量のクロロアセトアミドメチルポリスルホン(置換率10モル%)を含むテトラヒドロフラン溶液に浸した後、テトラヒドロフランを蒸発させて、難加水分解性ポリマー塗布物を得る(一次被覆工程)。次に、この塗布物をジエチレントリアミンの1重量%・含水(20重量%)ジメチルスルホキサイドの溶液に浸し、80℃で1時間加熱して、多孔化成型品を得る(多孔化処理工程)。更に、この多孔化成型品を0.2重量%クロルアセトアミドメチルポリスルホン(置換率100モル%)含有ジメチルスルホキサイド溶液に浸し40℃で30分間加熱した後、引き上げ、ジメチルスルホキサイドで3回洗浄した後、乾燥する。次に、1重量%ジエチレントリアミンのジメチルスルホキサイド溶液中40℃で1時間加熱した後、エタノール及び水で洗浄して、本発明の捕集材を得る(二次被覆工程)。ここでジエチレントリアミンの代わりに種々のリガンドを用いれば、様々な機能を持つ捕集材を得ることができる。
上記一次被覆工程においては、ポリエチレンテレフタレート繊維の表面アミノ基と被覆ポリマーのクロロアセトアミドメチル基の間で結合反応が起きる。この一次被覆が無いと、多孔化構造が安定化されないため多孔化の程度が低く、機械的強度も低くなる。被覆する難加水分解性ポリマーは、テトラヒドロフランのような低沸点溶媒に溶解すると、溶媒の蒸発除去が容易なので好ましい。被覆する難加水分解性ポリマーの被覆量は、易加水分解性ポリマーに対し0.1～50重量%の量が好ましく用いられる。被覆量が多い方が多孔化の程度は高くなるが、通常5～20重量%がより好ましい。
上記多孔化処理工程では、易加水分解性縮合ポリマーをアミンで化学処理を行うが、使用するアミンとしてはポリアミンが好ましく、ジエチレントリアミンが特に好ましい。ジエチレントリアミンの使用量が少ないと、分解産物のオリゴマーの分子量が大きくなるので、形成される孔の大きさが大きくなる。形成されるオリゴマーの溶解性は溶媒によって異なるので、形成される孔の大きさと頻度は溶剤の選択に強く依存する。大きなオリゴマーを溶解する溶媒ほど多孔性が高くなると考えられるが、一方、溶媒に難加水分解性ポリマーが溶解すると、被覆ポリマーの脱落に繋がるので、難加水分解性ポリマーが溶解し難い溶媒を選択する必要がある。そのような観点から溶媒としては含水ジメチルスルホキサイドが好ましい。ジメチルスルホキサイドの含水率は目的に応じて適宜選択されるが、通常0.1～50重量%、好ましくは5～20重量%が採用される。反応温度はガラス転移点より低い温度が採用されるが、高すぎると、成型体の強度低下に繋がるので、通常、室温から100℃、特に室温から80℃が好ましく用いられる。
多孔化後の二次被覆工程は新しいリガンドの導入の目的で行う。また、多孔化処理工程で新たに生成した易加水分解性縮合ポリマーの表面を保護する役割もある。易加水分解性縮合ポリマーは加水分解され易いので、表面を難加水分解性ポリマーで被覆することにより化学的及び物理的に構造が安定化され、医療用途でも好適に使用可能となる。二次被覆ポリマーにリガンドが結合したポリマーを用いると、リガンド特有の細胞捕集機能及び細胞活性化機能が付与される。
免疫抑制性細胞捕集用カラム
本発明の免疫抑制性細胞捕集用カラムは、上記の免疫抑制性捕集材が充填されたものであることを特徴とする。
本発明の免疫抑制性細胞捕集用カラムは、上記の免疫抑制性捕集材が充填されたものであることを特徴とする。
本発明の捕集材が繊維状や不織布の形状の場合、カラムに充填する本発明の捕集材の充填密度は、好ましくは50～400 mg/cm3、特に好ましくは150～300 mg/cm3である。この範囲であると、細胞捕集効率、選択率、及び通液時の圧損が適切な範囲となる。圧損が大きくなると、赤血球が溶血する。特に、溶血は体外循環では禁忌である。圧損は充填密度と血液流速に正の相関がある。ヒトで体外循環を2時間以内に終了するためには血液流速を少なくとも30 mL／分にする必要があるので、赤血球が溶血しないためには圧損を100 mmHg以下にすることが必要である。
本発明のカラムは、体外循環用カラムとして使用することで、血液中から免疫抑制性細胞を選択的に捕集することができ、その濃度を下げることができる。また、本発明のカラムで処理した血液から調製した白血球及び予め単離した白血球を当カラムで処理した白血球はCTL活性が向上しているので、本発明のカラムは癌等の疾患に対する細胞治療用カラムとしても使用できる。
本発明の捕集材を充填する容器としては、例えば、ガラス製、プラスチック製、ステンレス製等のものが挙げられ、容器のサイズは使用目的に応じて適宜選択される。
本発明のカラムは、免疫抑制性細胞を選択的に捕集することができることから、ウイルス疾患や癌の治療、及び癌の摘出手術後の癌の再発予防のためにも用いることができる。本発明のカラムを癌治療用に適用した場合、手術療法、放射線療法、抗癌剤療法、活性化白血球療法、ワクチン療法等と併用すれば、これらの治療効果向上に役立ち、特に転移や再発の予防にも役立つと考えられる。
以下、本発明を更に詳しく説明するため実施例を挙げる。しかし、本発明はこれら実施例等になんら限定されるものではない。
尚、本実施例中のアミノ基量の測定、細胞表面抗原の解析、担癌ラットの調製、ラットの体外循環、並びにラット脾細胞及び末梢血単核球の調製は、特に記載しない限り以下の方法で行った。
１．アミノ基量の測定
検体0.1 gを0.1M ピクリン酸・70%エタノール溶液10 mLに浸し、2時間緩やかに振とうした。次に、検体を70%エタノール溶液で洗浄し、洗浄液の黄色が消えるまで洗った。次に、検体を10～50 mLの1重量%ジエチルアミン・70%エタノール溶液に浸し、ピクリン酸を溶出させた。320 nmの吸光度からピクリン酸濃度を求め、吸着量を正確な検体重量で除して1グラム当たりのアミノ基量とした。
検体0.1 gを0.1M ピクリン酸・70%エタノール溶液10 mLに浸し、2時間緩やかに振とうした。次に、検体を70%エタノール溶液で洗浄し、洗浄液の黄色が消えるまで洗った。次に、検体を10～50 mLの1重量%ジエチルアミン・70%エタノール溶液に浸し、ピクリン酸を溶出させた。320 nmの吸光度からピクリン酸濃度を求め、吸着量を正確な検体重量で除して1グラム当たりのアミノ基量とした。
２．細胞表面抗原の解析
細胞の表面抗原の分析はベクトン・ディッキンソン社製のFACSCaliberを用いて行なった。細胞表面染色用抗体としては、ベクトン・ディッキンソン社のフィコエリスリン標識抗ヒトLAP、FITC標識抗ラットCD4、APC標識抗ラットCD4、e-Bioscience社のFITC標識抗ラット顆粒球マーカー、APC標識抗ラットCD8、フィコエリスリン標識抗ラットCD3、Biolegend社のAPC標識抗ラットCD11b/cを用いた。
細胞の表面抗原の分析はベクトン・ディッキンソン社製のFACSCaliberを用いて行なった。細胞表面染色用抗体としては、ベクトン・ディッキンソン社のフィコエリスリン標識抗ヒトLAP、FITC標識抗ラットCD4、APC標識抗ラットCD4、e-Bioscience社のFITC標識抗ラット顆粒球マーカー、APC標識抗ラットCD8、フィコエリスリン標識抗ラットCD3、Biolegend社のAPC標識抗ラットCD11b/cを用いた。
３．担癌ラットの調製
(KDH-8細胞の調製)
4-ジメチルアミノアゾベンゼン誘発肝癌細胞KDH-8(矢野 諭、北海道医誌、68巻5号、654-664(1993))を完全培地(RPMI1400培地：ウシ胎児血清10体積%、2-メルカプトエタノール50μg/L、ストレプトマイシン50μg/mL、ペニシリン-G50単位/mL)中で継代した。使用4日前に新しい150 cm2の培養フラスコに移して培養して用いた。
(KDH-8細胞の調製)
4-ジメチルアミノアゾベンゼン誘発肝癌細胞KDH-8(矢野 諭、北海道医誌、68巻5号、654-664(1993))を完全培地(RPMI1400培地：ウシ胎児血清10体積%、2-メルカプトエタノール50μg/L、ストレプトマイシン50μg/mL、ペニシリン-G50単位/mL)中で継代した。使用4日前に新しい150 cm2の培養フラスコに移して培養して用いた。
(担癌ラットの調製)
1-10×105個の癌細胞KDH-8を0.5 mLのPBS(-)に浮遊させ、WKAH/Hkmラット(雄、8-16週令)の背部皮下に接種して、担癌ラットを調製した。
1-10×105個の癌細胞KDH-8を0.5 mLのPBS(-)に浮遊させ、WKAH/Hkmラット(雄、8-16週令)の背部皮下に接種して、担癌ラットを調製した。
４．ラットの体外循環
(体外循環カラムの調製)
捕集材0.3 gを内径1 cm、内容積2 mLのポリプロピレン製円筒形カラムに充填し、体外循環カラムを作成した。カラムと回路に70%アルコールを通液して滅菌した後、体外循環直前にヘパリン添加生理食塩液(5単位/mL) 40 mLを2 mL/分の速度で流して前処理した。
(体外循環カラムの調製)
捕集材0.3 gを内径1 cm、内容積2 mLのポリプロピレン製円筒形カラムに充填し、体外循環カラムを作成した。カラムと回路に70%アルコールを通液して滅菌した後、体外循環直前にヘパリン添加生理食塩液(5単位/mL) 40 mLを2 mL/分の速度で流して前処理した。
(体外循環)
体重300～400 gの担癌ラットをネンブタールで全身麻酔し、左大腿の動脈と静脈にカニュレーションし、動脈から脱血し、マイクロチューブポンプを用いて、体外循環カラムを通過させ、静脈に返血した。血流速度2 mL/分で1時間体外循環した。体外循環中ヘパリンを100単位/時間で持続投与した。
体重300～400 gの担癌ラットをネンブタールで全身麻酔し、左大腿の動脈と静脈にカニュレーションし、動脈から脱血し、マイクロチューブポンプを用いて、体外循環カラムを通過させ、静脈に返血した。血流速度2 mL/分で1時間体外循環した。体外循環中ヘパリンを100単位/時間で持続投与した。
５．ラット脾細胞及び末梢血単核球の調製
ラットをネンブタールで麻酔した後、腹部大動脈から失血・屠殺させ、脾臓を採取した。脾臓を完全培地中で細かく砕き、細胞を採取した後、赤血球を除くため低浸透圧液で処理し、赤血球を溶血させた。得られた細胞を完全培地に浮遊させ、脾細胞液とした。
ラットをネンブタールで麻酔した後、腹部大動脈から失血・屠殺させ、脾臓を採取した。脾臓を完全培地中で細かく砕き、細胞を採取した後、赤血球を除くため低浸透圧液で処理し、赤血球を溶血させた。得られた細胞を完全培地に浮遊させ、脾細胞液とした。
末梢血を同量の生理食塩水で希釈し、希釈液と同量のリンパ球分離液1077(和光純薬工業社)上に積層し、800 gで20分間遠心した。単核球層を集め、低浸透圧液で処理し、赤血球を溶血させた。
［実施例１］
(難加水分解性ポリマー１の調製)
ニトロベンゼン20 mLと硫酸40 mLの混合溶液を0℃に冷却後、2.6 g(0.02モル)のN-ヒドロキシメチル-２-クロロアセトアミドを0～10℃の温度で加えて溶解し、この溶液をユーデルポリスルホンP3500のニトロベンゼン溶液(88.4 g：0.2モル/1600 mL)に良く撹拌しながら加えた。更に、20℃で2時間撹拌した後、反応混合物を大過剰の冷メタノール中に入れ、ポリマーを沈殿させた。沈殿物をニトロベンゼン臭が無くなるまでメタノールで抽出した後、乾燥して90.0 gのポリマーを得た。このポリマーを2Lのジメチルホルムアミドに溶解し、大過剰のメタノール中に入れて再沈殿させ、精製した。得られたポリマーはジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキサイド及びテトラヒドロフランに溶解した。これをクロロホルムに溶解し、ガラス板の上にキャストして作成したフイルムの赤外線吸収スペクトルから3290-3310、1670、1528 cm-1の吸収によりアミド基の存在を確認した。重水素化クロロホルム溶液の1HNMRスペクトルを測定し、ポリスルホン主鎖のイソプロピリデン基水素(6H)由来ピーク(1.66 ppm；シングレット)の面積に対するアミドメチル基のベンジル基のメチレン基水素(2H)由来のピーク(4.22 ppm)の面積の比率から置換率が10%であることを確認した。
(難加水分解性ポリマー１の調製)
ニトロベンゼン20 mLと硫酸40 mLの混合溶液を0℃に冷却後、2.6 g(0.02モル)のN-ヒドロキシメチル-２-クロロアセトアミドを0～10℃の温度で加えて溶解し、この溶液をユーデルポリスルホンP3500のニトロベンゼン溶液(88.4 g：0.2モル/1600 mL)に良く撹拌しながら加えた。更に、20℃で2時間撹拌した後、反応混合物を大過剰の冷メタノール中に入れ、ポリマーを沈殿させた。沈殿物をニトロベンゼン臭が無くなるまでメタノールで抽出した後、乾燥して90.0 gのポリマーを得た。このポリマーを2Lのジメチルホルムアミドに溶解し、大過剰のメタノール中に入れて再沈殿させ、精製した。得られたポリマーはジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキサイド及びテトラヒドロフランに溶解した。これをクロロホルムに溶解し、ガラス板の上にキャストして作成したフイルムの赤外線吸収スペクトルから3290-3310、1670、1528 cm-1の吸収によりアミド基の存在を確認した。重水素化クロロホルム溶液の1HNMRスペクトルを測定し、ポリスルホン主鎖のイソプロピリデン基水素(6H)由来ピーク(1.66 ppm；シングレット)の面積に対するアミドメチル基のベンジル基のメチレン基水素(2H)由来のピーク(4.22 ppm)の面積の比率から置換率が10%であることを確認した。
(難加水分解性ポリマー２の調製)
ニトロベンゼン130 mLと硫酸270 mLの混合溶液を0℃に冷却後、13.6 g(0.13モル)のN-ヒドロキシメチル-2-クロロアセトアミドを0～10℃の温度で加えて溶解し、この溶液をユーデルポリスルホンP3500のニトロベンゼン溶液(44.2 g：0.1モル/500 mL)に良く撹拌しながら加えた。更に、20℃で2時間撹拌した後、反応混合物を大過剰の冷メタノール中に入れ、ポリマーを沈殿させた。沈殿物をニトロベンゼン臭が無くなるまでメタノールで抽出した後、乾燥して62.0 gのポリマーを得た。このポリマーを1Lのジメチルホルムアミドに溶解し、大過剰のメタノール中に入れて再沈殿させ、精製した。得られたポリマーはジメチルホルムアミドやジメチルスルホキサイドに溶解するが、テトラヒドロフランには溶解しなかった。元素分析：N: 2.1% Cl: 4.5%。臭化カリウムペレットの赤外線吸収スペクトルで3290-3310、1670、1528 cm-1の吸収からアミド基の存在を確認した。このポリマーの重水素化ジメチルスルホキサイド溶液の１HNMRスペクトルから難加水分解性ポリマー１の場合と同様にして置換率が100%であることを確認した。
ニトロベンゼン130 mLと硫酸270 mLの混合溶液を0℃に冷却後、13.6 g(0.13モル)のN-ヒドロキシメチル-2-クロロアセトアミドを0～10℃の温度で加えて溶解し、この溶液をユーデルポリスルホンP3500のニトロベンゼン溶液(44.2 g：0.1モル/500 mL)に良く撹拌しながら加えた。更に、20℃で2時間撹拌した後、反応混合物を大過剰の冷メタノール中に入れ、ポリマーを沈殿させた。沈殿物をニトロベンゼン臭が無くなるまでメタノールで抽出した後、乾燥して62.0 gのポリマーを得た。このポリマーを1Lのジメチルホルムアミドに溶解し、大過剰のメタノール中に入れて再沈殿させ、精製した。得られたポリマーはジメチルホルムアミドやジメチルスルホキサイドに溶解するが、テトラヒドロフランには溶解しなかった。元素分析：N: 2.1% Cl: 4.5%。臭化カリウムペレットの赤外線吸収スペクトルで3290-3310、1670、1528 cm-1の吸収からアミド基の存在を確認した。このポリマーの重水素化ジメチルスルホキサイド溶液の１HNMRスペクトルから難加水分解性ポリマー１の場合と同様にして置換率が100%であることを確認した。
(捕集材合成：前処理)
ポリエチレンテレフタレート繊維不織布(密度48 mg/cm3；日本バイリーン)88.2 gを0.5重量%ジエチレントリアミン・ジメチルスルホキサイド溶液2Lに浸し、105℃で20分間加熱した。水洗後、乾燥して87.2 gの前処理不織布-１を得た。アミノ基量は1μmol/gであった。
ポリエチレンテレフタレート繊維不織布(密度48 mg/cm3；日本バイリーン)88.2 gを0.5重量%ジエチレントリアミン・ジメチルスルホキサイド溶液2Lに浸し、105℃で20分間加熱した。水洗後、乾燥して87.2 gの前処理不織布-１を得た。アミノ基量は1μmol/gであった。
(捕集材合成：難加水分解性ポリマー被覆処理)
先に調製した難加水分解性ポリマー１の6 gを800 mLのテトラヒドロフランに溶解し、この溶液に先に調製した前処理不織布-１の40 gを浸し、24時間静置した後、テトラヒドロフランを蒸発させ、46 gの一次被覆不織布-１を得た。
先に調製した難加水分解性ポリマー１の6 gを800 mLのテトラヒドロフランに溶解し、この溶液に先に調製した前処理不織布-１の40 gを浸し、24時間静置した後、テトラヒドロフランを蒸発させ、46 gの一次被覆不織布-１を得た。
(捕集材合成：抽出処理)
ジエチレントリアミン20 mL、水60 mL及びジメチルスルホキサイド320 mLからなる溶液に20 gの一次被覆不織布-１を浸し、75℃の水浴中で2時間加熱した。不織布を水洗後、60℃の温水で6回抽出した後、乾燥して、19 gの多孔化不織布-１を得た。アミノ基量は56μmol/gであった。
ジエチレントリアミン20 mL、水60 mL及びジメチルスルホキサイド320 mLからなる溶液に20 gの一次被覆不織布-１を浸し、75℃の水浴中で2時間加熱した。不織布を水洗後、60℃の温水で6回抽出した後、乾燥して、19 gの多孔化不織布-１を得た。アミノ基量は56μmol/gであった。
(捕集材合成：二次被覆処理)
先に調製した難加水分解性ポリマー２の2 gを200 mLのジメチルスルホキサイドに溶解し、0.2重量%濃度とする。この溶液に先に調製した10 gの多孔化不織布-１を浸し、50℃で1時間加熱した後、不織布を引き上げ、ジメチルスルホキサイドで3回洗浄した。これをジエチレントリアミン5 g含有ジメチルスルホキサイド200 mLに浸し、40℃のバス中で1時間加熱した。不織布を取り出して、エタノールで洗浄した後、水洗し、真空乾燥して、9.6 gのジエチレントリアミン化不織布(本発明捕集材-１)を得た。アミノ基量は62μmol/gであった。
先に調製した難加水分解性ポリマー２の2 gを200 mLのジメチルスルホキサイドに溶解し、0.2重量%濃度とする。この溶液に先に調製した10 gの多孔化不織布-１を浸し、50℃で1時間加熱した後、不織布を引き上げ、ジメチルスルホキサイドで3回洗浄した。これをジエチレントリアミン5 g含有ジメチルスルホキサイド200 mLに浸し、40℃のバス中で1時間加熱した。不織布を取り出して、エタノールで洗浄した後、水洗し、真空乾燥して、9.6 gのジエチレントリアミン化不織布(本発明捕集材-１)を得た。アミノ基量は62μmol/gであった。
［実施例２］
(捕集材合成：二次被覆処理)
500 mgのポリミキシンBを150 mLの10重量%含水ジメチルスルホキサイドに溶解してポリミキシン溶液を作成した。先に調製した難加水分解性ポリマー２の2 gを200 mLのジメチルスルホキサイドに溶解し、1重量%濃度とした。この溶液に先に調製した10 gの多孔化不織布-１を浸し、40℃で1時間加熱した後、不織布を引き上げ、ジメチルスルホキサイドで3回洗浄した。これをポリミキシン溶液に浸し、1モル濃度の水酸化ナトリウム水溶液を5 mL加え、40℃のバス中で1時間加熱した。不織布を取り出して、エタノールで洗浄した後、水洗し、真空乾燥して、9.4 gのポリミキシン化不織布(本発明捕集材-２)を得た。アミノ基量は55μmol/gであった。
(捕集材合成：二次被覆処理)
500 mgのポリミキシンBを150 mLの10重量%含水ジメチルスルホキサイドに溶解してポリミキシン溶液を作成した。先に調製した難加水分解性ポリマー２の2 gを200 mLのジメチルスルホキサイドに溶解し、1重量%濃度とした。この溶液に先に調製した10 gの多孔化不織布-１を浸し、40℃で1時間加熱した後、不織布を引き上げ、ジメチルスルホキサイドで3回洗浄した。これをポリミキシン溶液に浸し、1モル濃度の水酸化ナトリウム水溶液を5 mL加え、40℃のバス中で1時間加熱した。不織布を取り出して、エタノールで洗浄した後、水洗し、真空乾燥して、9.4 gのポリミキシン化不織布(本発明捕集材-２)を得た。アミノ基量は55μmol/gであった。
［実施例３］
(捕集材合成：二次被覆処理)
750 mgのプリマキン・リン酸を150 mLの10重量%含水ジメチルスルホキサイドに溶解してプリマキン溶液を作成した。先に調製した難加水分解性ポリマー２の2 gを200 mLのジメチルスルホキサイドに溶解し、1重量%濃度とした。この溶液に先に調製した10 gの多孔化不織布-１を浸し、40℃で1時間加熱した後、不織布を引き上げ、ジメチルスルホキサイドで3回洗浄した。これをプリマキン溶液に浸し、40℃のバス中で1時間加熱した。不織布を取り出して、エタノールで洗浄した後、水洗し、真空乾燥して、9.6 gのプリマキン化不織布(本発明捕集材-３)を得た。アミノ基量は48μmol/gであった。
(捕集材合成：二次被覆処理)
750 mgのプリマキン・リン酸を150 mLの10重量%含水ジメチルスルホキサイドに溶解してプリマキン溶液を作成した。先に調製した難加水分解性ポリマー２の2 gを200 mLのジメチルスルホキサイドに溶解し、1重量%濃度とした。この溶液に先に調製した10 gの多孔化不織布-１を浸し、40℃で1時間加熱した後、不織布を引き上げ、ジメチルスルホキサイドで3回洗浄した。これをプリマキン溶液に浸し、40℃のバス中で1時間加熱した。不織布を取り出して、エタノールで洗浄した後、水洗し、真空乾燥して、9.6 gのプリマキン化不織布(本発明捕集材-３)を得た。アミノ基量は48μmol/gであった。
［試験例１］(捕集能評価試験-１)
WKAH/Hkmラット(雄、12週令)の背部皮下に10×105個の癌細胞KDH-8を接種して、調製した担癌ラット(体重354 g、腫瘍径26 mm×21 mm)の頸動脈から500単位のヘパリンを用いて血液10 mLを採取し、また、脾臓から脾細胞を調製し、完全培地に浮遊させて、500×104個/mLの脾細胞液を調製した。
WKAH/Hkmラット(雄、12週令)の背部皮下に10×105個の癌細胞KDH-8を接種して、調製した担癌ラット(体重354 g、腫瘍径26 mm×21 mm)の頸動脈から500単位のヘパリンを用いて血液10 mLを採取し、また、脾臓から脾細胞を調製し、完全培地に浮遊させて、500×104個/mLの脾細胞液を調製した。
捕集材100 mgを10 mLの注射筒に詰め、完全培地を流した後、23ゲージの注射針を着け、10 mLの脾細胞液を流し、さらに10 mLの完全培地を流した。溶出液を遠心して10 mLの体積とし、細胞を数えると共に、CD4+T細胞中のLAP陽性細胞の割合をフローサイトメーターで求め、表１の結果を得た。比較例１としてポリエチレンテレフタレート繊維不織布を洗浄して用いた。
表１から細胞の減少率は殆ど同じであるにも拘らず、実施例の捕集材ではCD4+T細胞中のLAP陽性細胞の割合が低下していることから、本発明の捕集材はLAP+CD4+T細胞を選択的に捕集することが分かる。一方、ポリエチエンテレフタレート繊維不織布では細胞を捕集するが、全く選択性が無いことが分かる。
［試験例２］（捕集能評価試験-２）
捕集材100 mgを10 mLの注射筒に詰め、完全培地を流した後、23ゲージの注射針を着け、試験例１で得られた血液3 mLを流し、さらに5 mLの完全培地を流した。溶出液から赤血球を除去し、CD4+T細胞中のLAP陽性細胞の割合をフローサイトメーターで求め、表２の結果を得た。比較例１としてポリエチレンテレフタレート繊維不織布を洗浄して用いた。
捕集材100 mgを10 mLの注射筒に詰め、完全培地を流した後、23ゲージの注射針を着け、試験例１で得られた血液3 mLを流し、さらに5 mLの完全培地を流した。溶出液から赤血球を除去し、CD4+T細胞中のLAP陽性細胞の割合をフローサイトメーターで求め、表２の結果を得た。比較例１としてポリエチレンテレフタレート繊維不織布を洗浄して用いた。
表２から実施例の捕集材ではCD4+T細胞中のLAP陽性細胞の割合が低下していることから本発明の捕集材は全血からLAP+CD4+T細胞を選択的に捕集することが分かる。一方、ポリエチエンテレフタレート繊維不織布は全く選択性が無いことが分かる。
［試験例３］(治療実験-１)
WKAH/Hkmラット(雄、14週令)の背部皮下に1×105個の癌細胞KDH-8を接種した後、3週間後、腫瘍径が13 mm×13 mmになった。この担癌ラット(体重400 g)の動脈から1 mLを採血した後、0.3 gの本発明捕集材－１を充填したカラムで1時間体外循環を施行した。終了後全採血を行なって、血液15 mLを得た。体外循環後のカラムに500単位のヘパリンを加えた50 mLの生理リン酸緩衝液を逆に流し、付着細胞を回収した。25×106個の細胞が回収された。
WKAH/Hkmラット(雄、14週令)の背部皮下に1×105個の癌細胞KDH-8を接種した後、3週間後、腫瘍径が13 mm×13 mmになった。この担癌ラット(体重400 g)の動脈から1 mLを採血した後、0.3 gの本発明捕集材－１を充填したカラムで1時間体外循環を施行した。終了後全採血を行なって、血液15 mLを得た。体外循環後のカラムに500単位のヘパリンを加えた50 mLの生理リン酸緩衝液を逆に流し、付着細胞を回収した。25×106個の細胞が回収された。
体外循環前と後の血液および付着回収細胞について表面抗原を分析し、表３の結果を得た。
表３から本発明の捕集材ではCD4+T細胞中のLAP陽性細胞の割合が体外循環によって初期値の33%にまで低下していること、CD8+T細胞中のLAP陽性細胞の割合が体外循環によって初期値の19%にまで低下していること及び付着回収細胞中のLAP陽性細胞が増加していることから、本発明の捕集材は全血からLAP陽性T細胞を選択的に捕集することが分かる。また、免疫抑制性細胞と言われているCD11bc+細胞中の顆粒球マーカー高発現細胞の割合も体外循環によって低下することが分かる。
［試験例４］(治療実験-２)
WKAH/Hkmラット(雄、13週令)の背部皮下に2×105個の癌細胞KDH-8を接種した後、20日後、腫瘍径が23 mm×22 mmになった。この担癌ラット(体重350 g)の動脈から１mLを採血した後、0.3 gの本発明捕集材－１を充填したカラムで１時間体外循環を施行した。終了後全採血を行なって、血液15 mLを得た。体外循環後のカラムに500単位のヘパリンを加えた50 mLの生理リン酸緩衝液を逆に流し、付着細胞を回収した。28×106個の細胞が回収された。
WKAH/Hkmラット(雄、13週令)の背部皮下に2×105個の癌細胞KDH-8を接種した後、20日後、腫瘍径が23 mm×22 mmになった。この担癌ラット(体重350 g)の動脈から１mLを採血した後、0.3 gの本発明捕集材－１を充填したカラムで１時間体外循環を施行した。終了後全採血を行なって、血液15 mLを得た。体外循環後のカラムに500単位のヘパリンを加えた50 mLの生理リン酸緩衝液を逆に流し、付着細胞を回収した。28×106個の細胞が回収された。
体外循環前と後の血液および付着回収細胞について表面抗原を分析し、表４の結果を得た。
表４から本発明の捕集材ではCD4+T細胞中のLAP陽性細胞の割合が体外循環によって初期値の39%に低下していること、CD8+T細胞中のLAP陽性細胞の割合が体外循環によって初期値の20%に低下していること及び付着回収細胞中のLAP陽性細胞が増加していることから、本発明の捕集材は全血からLAP陽性T細胞を選択的に捕集することが分かる。
［試験例５］(CTL抑制実験)
WKAH/Hkmラット(雄、10週令)の背部皮下に1×105個の癌細胞KDH-8を接種した後、20日後、腫瘍径が10 mm×10 mmになった。このラットから全採血をし、単核球を取り出し、5×106個/mLの細胞液を調製した。試験例４でカラムに捕集された細胞を脱離させて得た付着細胞を5×106個/mLの濃度に調整した。
WKAH/Hkmラット(雄、10週令)の背部皮下に1×105個の癌細胞KDH-8を接種した後、20日後、腫瘍径が10 mm×10 mmになった。このラットから全採血をし、単核球を取り出し、5×106個/mLの細胞液を調製した。試験例４でカラムに捕集された細胞を脱離させて得た付着細胞を5×106個/mLの濃度に調整した。
生理リン酸緩衝液中に1×107個/mL濃度で浮遊させたKDH-8細胞液1 mLに3μLの5(6)-カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステルのジメチルスルホキシド溶液(5 mg/mL)を加え、37℃で15分間温めた。完全培地10 mLを加えて反応を停止させ、洗浄して、完全培地に浮遊させ、1×105個/mLのラベル化癌細胞液を調製した。
24ウエルの培養皿の各ウエルに17μLのラベル化癌細胞液と500μLの単核球液を加え、これに付着細胞液を0、50、100、150又は200μL加えて、37℃の炭酸ガスインキュベーターで40時間培養した。細胞をフローサイトメーターで分析し、FL-1陽性細胞の中のヨウ化プロピジウム陽性細胞を殺された癌細胞、陰性細胞を生きている癌細胞として、キラー活性(CTL活性)を算定した。実験はn=4で行なった。結果を表５に示す。
表から付着細胞の添加量に比例して、CTL活性が下がることが分かる。従って、カラムに捕集される細胞は強い免疫抑制性を持つことがわかる。
［試験例６］(細胞治療実験)
4匹のWKAH/Hkmラット(雄、12週令)の背部皮下に1×105個の癌細胞KDH-8を接種した後、3週間後、腫瘍径が10～13 mmになった。2匹の担癌ラットに0.3 gの本発明捕集材－１を充填したカラムで体外循環を1時間施行した。終了後全採血を行なって、血液15 mLを2本得た。遠心分離して単核球を分離した後、溶血操作をして赤血球を除去し、合計6×107個の単核球(治療ラットPBMC)が得られた。残りの2匹の血液からも合計6×107個の単核球(担癌ラットPBMC)が得られた。これと併行して、3匹のWKAH/Hkmラット(雄、15週令)のラットから採血し、同様に処理して合計7×107個の単核球(正常ラットPBMC)が得られた。
4匹のWKAH/Hkmラット(雄、12週令)の背部皮下に1×105個の癌細胞KDH-8を接種した後、3週間後、腫瘍径が10～13 mmになった。2匹の担癌ラットに0.3 gの本発明捕集材－１を充填したカラムで体外循環を1時間施行した。終了後全採血を行なって、血液15 mLを2本得た。遠心分離して単核球を分離した後、溶血操作をして赤血球を除去し、合計6×107個の単核球(治療ラットPBMC)が得られた。残りの2匹の血液からも合計6×107個の単核球(担癌ラットPBMC)が得られた。これと併行して、3匹のWKAH/Hkmラット(雄、15週令)のラットから採血し、同様に処理して合計7×107個の単核球(正常ラットPBMC)が得られた。
別の9匹のWKAH/Hkmラット(雄、9週令)の背部皮下に1×105個の癌細胞KDH-8を接種した後、3匹ずつの3群に分けて夫々、3×107個の治療ラットPBMC、担癌ラットPBMC、又は正常ラットPBMCを0.5 mLの生理リン酸緩衝液に分散して、同一場所に注射した。腫瘍増殖の観察結果を表６に示す。腫瘍直径が40 mmを超えたラットは深麻酔により安楽死させた。
表６から本発明の捕集材で体外循環したラットの末梢血単核球は癌細胞の定着を完全に抑制するが、無治療のラットの末梢血単核球は抑制効果が全くないことが分かる。
［実施例４］
(捕集材合成：難加水分解性ポリマー被覆処理)
先に調製した難加水分解性ポリマー１の3.00 gを300 mLのジメチルスルホキサイドに60℃で溶解し、この溶液に先に調製した前処理不織布-１の19.04 gを浸し、1時間静置した後、8時間かけて20℃まで震盪しながら冷却した。この際、液は透明で、ポリマー浮遊物は無かった。不織布を遠心して、ジメチルスルホキサイドを除き、水洗後、乾燥して，21.25 gの一次被覆不織布-２を得た。
(捕集材合成：難加水分解性ポリマー被覆処理)
先に調製した難加水分解性ポリマー１の3.00 gを300 mLのジメチルスルホキサイドに60℃で溶解し、この溶液に先に調製した前処理不織布-１の19.04 gを浸し、1時間静置した後、8時間かけて20℃まで震盪しながら冷却した。この際、液は透明で、ポリマー浮遊物は無かった。不織布を遠心して、ジメチルスルホキサイドを除き、水洗後、乾燥して，21.25 gの一次被覆不織布-２を得た。
(捕集材合成：抽出処理)
ジエチレントリアミン15 mL、水65 mL及びジメチルスルホキサイド320 mLからなる溶液に20.8 gの一次被覆不織布-２を浸し、70℃の水浴中で3時間加熱した。不織布を50℃の温水で洗浄液が透明になるまで、抽出した後、乾燥して、20.0 gの多孔化不織布-２を得た。アミノ基量は115μmol/gであった。
ジエチレントリアミン15 mL、水65 mL及びジメチルスルホキサイド320 mLからなる溶液に20.8 gの一次被覆不織布-２を浸し、70℃の水浴中で3時間加熱した。不織布を50℃の温水で洗浄液が透明になるまで、抽出した後、乾燥して、20.0 gの多孔化不織布-２を得た。アミノ基量は115μmol/gであった。
(捕集材合成：二次被覆処理)
先に調製した難加水分解性ポリマー２の1 gを200 mLのジメチルスルホキサイドに溶解し、0.5重量%濃度とする。この溶液に先に調製した10 gの多孔化不織布-２を浸し、50℃で1時間加熱した後、不織布を引き上げ、ジメチルスルホキサイドで3回洗浄した。これをジエチレントリアミン5 g含有50%ジメチルスルホキサイド水200 mLに浸し、40℃のバス中で1時間加熱した。不織布を取り出して、水洗し、真空乾燥して、9.8 gのジエチレントリアミン化不織布(本発明捕集材-４)を得た。アミノ基量は105μmol/gであった。
先に調製した難加水分解性ポリマー２の1 gを200 mLのジメチルスルホキサイドに溶解し、0.5重量%濃度とする。この溶液に先に調製した10 gの多孔化不織布-２を浸し、50℃で1時間加熱した後、不織布を引き上げ、ジメチルスルホキサイドで3回洗浄した。これをジエチレントリアミン5 g含有50%ジメチルスルホキサイド水200 mLに浸し、40℃のバス中で1時間加熱した。不織布を取り出して、水洗し、真空乾燥して、9.8 gのジエチレントリアミン化不織布(本発明捕集材-４)を得た。アミノ基量は105μmol/gであった。
［試験例７］(癌再発抑制実験)
(タンパク質吸着試験)
ヒトAB型血清(大日本住友製薬(株))を0.22μmのフィルターでろ過した後、この血清2 mLに50 mgの各本発明捕集材を浸して、37℃で2時間穏やかに振盪した。その後、血清中のアルブミンとTGF-β1の濃度を測定し、表７に結果を示した。
(タンパク質吸着試験)
ヒトAB型血清(大日本住友製薬(株))を0.22μmのフィルターでろ過した後、この血清2 mLに50 mgの各本発明捕集材を浸して、37℃で2時間穏やかに振盪した。その後、血清中のアルブミンとTGF-β1の濃度を測定し、表７に結果を示した。
アルブミン及びTGF-βの濃度低下は殆ど認められなかったことから本発明吸着材はタンパク質吸着性が低いことが分かった。尚、アルブミンはBCG法(Clinical Chemistry 1972: 18: 1537-1538)により求め、TGF-β1はRアンドD社のELISAキットで測定した。夫々の初期値は、アルブミンが3.3 mg/dL、TGF-β1が8.5 ng/mLであった。
WKAH/Hkmラット(雄、12週令)の背部右側皮下に5×104個の癌細胞KDH-8を接種し、35日後に腫瘍径が3 mmになった。このラットに対し0.3 gの本発明捕集材-４を容積1.6 mLの円筒形カラムに充填したもの(充填密度190 mg/cm3)で体外循環を1時間施行した。この際、体外循環開始前と終了後に1 mLの血液を採取し、それぞれの血液及び付着回収細胞について表面抗原を分析し、表８の結果を得た。
表８からCD4+T細胞中のLAP陽性細胞の割合が本発明捕集材-４のカラムによる体外循環によって初期値の31%に低下していること、CD8+T細胞中のLAP陽性細胞の割合が初期値の59%に低下していること及び付着回収細胞中のLAP陽性細胞が増加していることから本発明捕集材-４は全血からLAP陽性T細胞を選択的に捕集することが分かる。
(癌再発抑制実験)
8匹のWKAH/Hkmラット(雄、12週令)の背部右側皮下に5×104個の癌細胞KDH-8を接種した後、7週間後、腫瘍径が10～13 mmになった。全ラットの腫瘍をネンブタール麻酔下で外科的に切除した後、背部左側皮下に1×105個の癌細胞KDH-8を再接種した。直後、無作為に選んだ4匹の担癌ラットに対し、0.3 gの本発明捕集材-４を容積1.6 mLの円筒形カラムに充填したもの(充填密度190 mg/cm3)で体外循環を1時間施行し、その後の生存日数を体外循環治療の無いラットと比較した。手術後、感染予防のため切開部に0.1%ゲンタマイシン硫酸塩軟膏を塗布して、傷口を縫合した。表９に結果を示す。
8匹のWKAH/Hkmラット(雄、12週令)の背部右側皮下に5×104個の癌細胞KDH-8を接種した後、7週間後、腫瘍径が10～13 mmになった。全ラットの腫瘍をネンブタール麻酔下で外科的に切除した後、背部左側皮下に1×105個の癌細胞KDH-8を再接種した。直後、無作為に選んだ4匹の担癌ラットに対し、0.3 gの本発明捕集材-４を容積1.6 mLの円筒形カラムに充填したもの(充填密度190 mg/cm3)で体外循環を1時間施行し、その後の生存日数を体外循環治療の無いラットと比較した。手術後、感染予防のため切開部に0.1%ゲンタマイシン硫酸塩軟膏を塗布して、傷口を縫合した。表９に結果を示す。
表９から、体外循環治療が無いラットの平均生存日数が20日であったのに対し、本発明の捕集材で体外循環したラットは4匹中2匹で腫瘍が再発せず、完全治癒し、残りの2匹は45日と27日の生存日数を示したことから、本発明捕集材は顕著な癌再発抑制効果があることが分かる。
Claims (11)
- アミノ基を有する易加水分解性縮合ポリマー、
該易加水分解性縮合ポリマーを被覆する難加水分解性ポリマー、及び
該難加水分解性ポリマーを被覆するリガンド結合難加水分解性ポリマー
を備えた成型体からなる免疫抑制性細胞捕集材であって、
該リガンドが、NH2基、第二級アミノ基、第三級アミノ基、ポリアミン残基、塩基性環状ポリペプチド残基、アミノグリコシド系化合物残基、クロロキン、プリマキン、メフロキン、イミキモド、及びナイスタチンからなる群から選択される少なくとも1種であり、
該成型体中のアミノ基の量が150μmol/g以下である、免疫抑制性細胞捕集材。 - 前記リガンドが第四級アンモニウム基ではない、請求項１に記載の捕集材。
- 前記易加水分解性縮合ポリマーがポリエステル又はポリウレタンであり、前記難加水分解性ポリマーがポリスルホン、ポリエーテルイミド、ポリイミド又はこれらの誘導体である、請求項１に記載の捕集材。
- 前記免疫抑制性細胞がレイタンシイ・アソシエイティッド・プロテインを細胞表面に有する細胞である、請求項１に記載の捕集材。
- 前記免疫抑制性細胞が顆粒球抗原とCD11b抗原を高発現する細胞である、請求項１に記載の捕集材。
- 請求項１に記載の捕集材が充填された免疫抑制性細胞捕集用カラム。
- 体外循環用である、請求項６に記載のカラム。
- 細胞治療用である、請求項６に記載のカラム。
- 癌の治療に使用される、請求項６に記載のカラム。
- 癌の摘出手術後の癌の再発予防に使用される、請求項６に記載のカラム。
- 請求項１に記載の捕集材に患者の血液を接触させることを特徴とする、癌の治療及び／又は予防方法。
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