WO2023074729A1 - 細胞吸着材料、及び細胞吸着カラム - Google Patents

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WO2023074729A1
WO2023074729A1 PCT/JP2022/039889 JP2022039889W WO2023074729A1 WO 2023074729 A1 WO2023074729 A1 WO 2023074729A1 JP 2022039889 W JP2022039889 W JP 2022039889W WO 2023074729 A1 WO2023074729 A1 WO 2023074729A1
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cell
adsorbing material
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lap
less
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PCT/JP2022/039889
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山下真梨子
韓愛善
坂口博一
上野良之
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東レ株式会社
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Publication date
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61M—DEVICES FOR INTRODUCING MEDIA INTO, OR ONTO, THE BODY; DEVICES FOR TRANSDUCING BODY MEDIA OR FOR TAKING MEDIA FROM THE BODY; DEVICES FOR PRODUCING OR ENDING SLEEP OR STUPOR
    • A61M1/00—Suction or pumping devices for medical purposes; Devices for carrying-off, for treatment of, or for carrying-over, body-liquids; Drainage systems
    • A61M1/36—Other treatment of blood in a by-pass of the natural circulatory system, e.g. temperature adaptation, irradiation ; Extra-corporeal blood circuits
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/22—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof comprising organic material
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/22—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof comprising organic material
    • B01J20/26—Synthetic macromolecular compounds
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/28—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof characterised by their form or physical properties

Definitions

  • the present invention relates to cell adsorption materials such as LAP-positive immune cells and cell adsorption columns.
  • lymphocytes which are classified into lymphocytes, granulocytes, and monocytes. Each leukocyte is further subdivided; for example, lymphocytes are classified into T cells, B cells, natural killer cells, and the like.
  • TGF- ⁇ transforming growth factor- ⁇
  • LAP latency associated peptide
  • the latent LAP-TGF- ⁇ complex is known to bind not only to cancer cells but also to the cell membranes of some immune cells. Immune cells to which this LAP-TGF- ⁇ complex binds are called LAP-positive immune cells, and also contribute to the escape of cancer cells from the immune system. In particular, among LAP-positive immune cells, LAP-positive T cells have attracted attention as a source of TGF- ⁇ for cancer cells, and the development of adsorbents to remove them has progressed.
  • platelets are also known to be one of the sources of TGF- ⁇ . Therefore, if LAP-positive T cells and LAP-positive platelets, which are the sources of the immunosuppressive substance TGF- ⁇ , can be removed simultaneously, it is expected that the therapeutic effect of cancer will be further enhanced.
  • Drugs that inhibit the transmission of immunosuppressive signals emitted by cancer cells have been developed as a method of treating cancer, but there are cases in which patients suffer from autoimmune diseases due to the side effects of drugs. It is
  • cell therapy is also being used to eliminate cancer cells using the patient's own white blood cells.
  • dendritic cell infusion therapy in which cancer-specific killer T cells are induced and treated by returning dendritic cells of a patient that have taken up cancer antigens outside the body to the patient.
  • this treatment method is considered to have insufficient therapeutic effect.
  • One of the reasons for this is presumed to be the enhancement of the immunosuppressive system.
  • LAP-positive immune cells which are the source of TGF- ⁇
  • TGF- ⁇ TGF- ⁇
  • Patent Document 1 discloses a leukocyte-removing filter made of a nonwoven fabric having a fiber diameter of less than 3 ⁇ m and a bulk density of more than 0.15 g/cm 3 and less than or equal to 0.50 g/cm 3 as a material for removing leukocytes. .
  • Patent Document 2 discloses a cell adsorption column filled with an adsorbent containing fibers having a fiber diameter of 0.5 ⁇ m or more and 10 ⁇ m or less and having a surface area of 0.5 m 2 or more and less than 10 m 2 , wherein the adsorbent packed volume is discloses a cell adsorption column characterized in that the is less than or equal to 100 mL.
  • Patent Document 3 discloses an immunosuppressive leukocyte-adsorbing material having a fiber surface with an arithmetic roughness of 0.1 ⁇ m or more and 3.0 ⁇ m or less.
  • Patent Document 1 removes leukocytes by filtration, there is a problem that all types of leukocytes are removed.
  • the adsorbent material of Patent Document 2 uses the phagocytic ability of granulocytes and monocytes to adsorb cells, it may be difficult to remove LAP-positive T cells.
  • Patent Document 3 discloses an adsorbent material that removes immunosuppressive leukocytes by controlling surface roughness, but does not disclose removal of LAP-positive platelets.
  • the object of the present invention is to provide a cell-adsorbing material that highly efficiently adsorbs cells such as LAP-positive T cells and LAP-positive immune cells such as LAP-positive platelets.
  • the cell-adsorbing material of the present invention which solves the above-mentioned problems, consists of the following.
  • Fibers or particles of a water-insoluble carrier bound with one or more nitrogen-containing compounds selected from the group consisting of polyamines and aliphatic amines The area within 1.0 ⁇ m from the outermost surface of the cross section of the fiber or the particle is defined as area A, the area within the radius of 0.5 ⁇ m from the center of gravity of the cross section of the fiber or particle is defined as area B, and the time-of-flight secondary ion mass A cell-adsorbing material, wherein the spectral intensity of 26 CN - when the spectral intensity of 25 C 2 H - in each region measured by an analytical method is 1, satisfies the following formulas (1) and (2).
  • the cell adsorption material of the present invention can highly efficiently adsorb and remove cells such as LAP-positive T cells and LAP-positive immune cells such as LAP-positive platelets.
  • FIG. 1 is a vertical cross-sectional view of an example of a radial flow type cell adsorption column.
  • FIG. 1 is an example of a cross-section of the cell-adsorbing material of Example 1, in which the mass spectrum of 26 CN ⁇ is mapped and the spectrum intensity of 26 CN ⁇ is analyzed.
  • FIG. 3 is an enlarged view of FIG. 2; An example of a plot profile of spectral intensity of 26 CN ⁇ in a cross-section of a cell-adsorbing material. It is an example of analysis of the convexity in the cross section of the cell-adsorbing material.
  • the present inventors bound a polyamine or an aliphatic amine to a fibrous or particulate water-insoluble carrier, and found that 25 C 2 in the cross section of the fiber or particle measured by time-of-flight secondary ion mass spectrometry. It was found that cells such as LAP-positive immune cells can be adsorbed and removed by setting the spectral intensity of 26 CN ⁇ to a predetermined range when the spectral intensity of H ⁇ is set to 1.
  • the present invention relates to fibers or particles of a water-insoluble carrier to which one or more nitrogen-containing compounds selected from the group consisting of polyamines and aliphatic amines are bound, wherein the fibers or particles are separated from the outermost surface of the cross section by 1.
  • the area within 0 ⁇ m is area A
  • the area within 0.5 ⁇ m radius from the center of gravity of the cross section of the fiber or particle is area B
  • the cell-adsorbing material satisfies the following formulas (1) and (2) with respect to the spectral intensity of 26 CN ⁇ when the spectral intensity of H 2 ⁇ is 1.
  • the present invention relates to cell-adsorbing materials such as LAP-positive immune cells.
  • a LAP-positive immune cell means a cell in which a LAP-TGF- ⁇ complex is bound to the cell membrane surface.
  • LAP-positive immune cells specifically mean LAP-positive T cells and LAP-positive platelets, but are not limited to the above as long as the LAP-TGF- ⁇ complex is bound to the cell membrane surface.
  • the cell-adsorbing material of the present invention is fibers or particles of a water-insoluble carrier bound with one or more nitrogen-containing compounds selected from the group consisting of polyamines and aliphatic amines.
  • the nitrogen-containing compound may be used singly or in combination of multiple types.
  • the nitrogen-containing compound may be directly bound to the water-insoluble carrier, or indirectly through a linker.
  • the nitrogen-containing compound in the cell-adsorbing material of the present invention is preferably a polyamine represented by general formula (I), since it has a high affinity with LAP-positive immune cells.
  • R 1 R 2 NX-NR 3 R 4 (I)
  • X is a saturated or unsaturated aliphatic hydrocarbon group having 2 to 20 carbon atoms, or a saturated or unsaturated aliphatic hydrocarbon group having 3 to 20 carbon atoms
  • a heteroatom-containing carbon chain in which 1 to 5 carbon atoms in the group are replaced with nitrogen atoms, and the hydrogen atom bonded to the nitrogen atom may be substituted with an alkyl group or an alkyl group having an amino group.
  • R 1 to R 4 are each independently a hydrogen atom or an alkyl group.
  • X is, for example, 2 to 20 (e.g., 16 or less, 14 or less, 12 or less, 10 or less, 8 or less, 6 or less, 4 or less) carbon atoms is a saturated or unsaturated aliphatic hydrocarbon group having
  • X is, for example, a saturated or unsaturated aliphatic hydrocarbon group having 3 to 20 (eg, 16 or less, 14 or less, 12 or less, 10 or less) carbon atoms is a heteroatom-containing carbon chain in which 1 to 5 (e.g., 1 to 3) carbon atoms are replaced with nitrogen atoms, and the hydrogen atom bonded to the nitrogen atom is an alkyl group or an alkyl group having an amino group ( For example, an alkyl group having 1 to 6 (preferably 1 to 4) carbon atoms.).
  • R 1 to R 4 are each independently a hydrogen atom or an alkyl group.
  • Alkyl groups have, for example, 1 to 6 (preferably 1 to 4) carbon atom
  • the polyamine represented by general formula (I) is more preferably a polyamine represented by any one of the following general formulas (II) to (VII), since it is highly reactive with water-insoluble carriers.
  • p1 is an integer of 2 to 12 (preferably 2 to 6, 2 to 5 or 2 to 4), and hydrogen atoms of primary amino groups at both ends are substituted with alkyl groups.
  • p1 and p2 are each independently an integer of 2 to 5 (preferably 2 to 4, 2 to 3, 2), and the hydrogen atom of the secondary amino group is an alkyl group or an amino may be substituted with an alkyl group having a group, and hydrogen atoms of primary amino groups at both terminals may be substituted with an alkyl group.
  • p1, p2 and p3 are each independently an integer of 2 to 5 (preferably 2 to 4, 2 to 3, 2), and the hydrogen atoms of the secondary amino groups are each independently may be substituted with an alkyl group or an alkyl group having an amino group, and hydrogen atoms of primary amino groups at both terminals may be substituted with an alkyl group.
  • p1, p2, p3 and p4 are each independently an integer of 2 to 5 (preferably 2 to 4, 2 to 3, 2), and the sum of p1, p2, p3 and p4 is 17 or less
  • the hydrogen atoms of the secondary amino group may be independently substituted with an alkyl group or an alkyl group having an amino group, and the hydrogen atoms of the primary amino groups at both ends are alkyl groups. may be substituted.
  • p1, p2, p3, p4 and p5 are each independently an integer of 2 to 5 (preferably 2 to 4, 2 to 3, 2), and p1, p2, p3, p4 and p5 is 16 or less
  • the hydrogen atoms of the secondary amino groups may each independently be substituted with an alkyl group or an alkyl group having an amino group
  • the hydrogen atoms of the primary amino groups at both ends may be substituted with an alkyl group.
  • the number of carbon atoms in the "alkyl group or alkyl group having an amino group” that can be bonded to the nitrogen atom of the secondary amino group is, for example, 1 to 6, preferably 1. to 5, more preferably 1 to 4, still more preferably 1 to 3.
  • the number of carbon atoms of the "alkyl group” that can be bonded to the nitrogen atoms of the primary amino groups at both ends is, for example, 1 to 6, preferably 1 to 5. Yes, preferably 1 to 4, preferably 1 to 3.
  • These "alkyl groups" are preferably linear or branched.
  • polyamines represented by general formula (I) include ethylenediamine, N-ethylethylenediamine, diethylenetriamine (hereinafter referred to as "DETA”), N-ethyldiethylenetriamine, triethylenetetramine, and tetraethylenepentamine.
  • DETA diethylenetriamine
  • N-ethyldiethylenetriamine triethylenetetramine
  • tetraethylenepentamine tetraethylenepentamine
  • the nitrogen-containing compound is an aliphatic amine
  • the nitrogen-containing compound is an aliphatic amine
  • primary Aliphatic amines or secondary aliphatic amines represented by general formula (IX) are preferred.
  • R 5 is a saturated or unsaturated aliphatic hydrocarbon group having 1-12 carbon atoms.
  • R 6 and R 7 are each independently a saturated or unsaturated aliphatic hydrocarbon group having 1 to 12 carbon atoms.
  • the aliphatic hydrocarbon group is preferably a linear or branched aliphatic hydrocarbon group. It is preferably a saturated aliphatic hydrocarbon group having a shape.
  • the number of carbon atoms in the aliphatic hydrocarbon group is preferably 1 to 8, preferably 1 to 6, and preferably 1 to 4.
  • Aliphatic amines suitable as nitrogen-containing compounds include, for example, monoalkylamines such as ethylamine, propylamine, butylamine, pentylamine, hexylamine, heptylamine, octylamine, nonylamine, decylamine, diethylamine, dipropylamine, dibutylamine. , diheptylamine, dioctylamine and dicyclohexylamine.
  • monoalkylamines such as ethylamine, propylamine, butylamine, pentylamine, hexylamine, heptylamine, octylamine, nonylamine, decylamine, diethylamine, dipropylamine, dibutylamine.
  • diheptylamine, dioctylamine and dicyclohexylamine include, for example, monoalkylamines such as ethylamine,
  • nitrogen-containing compounds include, for example, ethylamine, ethylenediamine, diethylamine, N-ethylethylenediamine, DETA, N-ethyldiethylenetriamine, triethylenetetramine, and tetraethylenepentamine.
  • ethylenediamine, DETA, triethylenetetraamine, or tetraethylenepentamine is preferable as the nitrogen-containing compound, since linear nitrogen-containing compounds having primary amines at both ends have high reactivity.
  • the nitrogen-containing compound a commercially available one or one produced by a known method or a method based thereon can be used.
  • a plurality of amino groups may be bound to the water-insoluble carrier to form a crosslinked structure. That is, when a polyamine represented by general formula (I) as a nitrogen-containing compound is bound to a water-insoluble carrier, at least two of the amino groups in the polyamine bind to the water-insoluble carrier to form a crosslinked structure. Become.
  • a method for binding the nitrogen-containing compound to the water-insoluble carrier includes, for example, a method of covalently binding the surface of the water-insoluble carrier via a linker by a chemical method.
  • the covalent bond is an electric bond such as an amide bond, a urea bond, an ether bond, or an ester bond because of its high reactivity with the nitrogen-containing compound.
  • Those having a neutral chemical bond are preferable, and those having an amide bond or a urea bond are more preferable.
  • the linker before bonding the nitrogen-containing compound and the water-insoluble carrier via the linker that is, the linker before the reaction preferably has a reactive functional group.
  • Examples of reactive functional groups possessed by the linker before the reaction include active halogen groups such as halomethyl groups, haloacetyl groups, haloacetamidomethyl groups or halogenated alkyl groups, epoxy groups, carboxyl groups, isocyanate groups, thioisocyanate groups, or and an acid anhydride group.
  • active halogen groups especially haloacetyl groups
  • active halogen groups are easy to produce, have moderately high reactivity, can carry out the immobilization reaction of nitrogen-containing compounds under mild conditions, and the resulting covalent bonds are chemically stable. Therefore, it is preferable.
  • Examples of the water-insoluble carrier into which a linker having a reactive functional group is introduced include polystyrene to which a chloroacetamidomethyl group is added, polysulfone to which a chloroacetamidomethyl group is added, and polyetherimide to which a chloroacetamidomethyl group is added. be done. These polymers are soluble in organic solvents and have the advantage of being easy to mold.
  • the amount of the linker introduced depends on the structure of the linker, for example, in the case of a chloroacetamidomethyl group, it is preferably 1 mmol or more and 10 mmol or less per 1 g of the water-insoluble carrier.
  • the amount of the linker introduced is more preferably 2 mmol or more, still more preferably 3 mmol or more, because it affects the binding amount of the nitrogen-containing compound to the water-insoluble carrier. Moreover, from the viewpoint of maintaining the strength of the water-insoluble carrier, the amount of the linker introduced is more preferably 8 mmol or less, still more preferably 7 mmol or less. Any preferred lower limit can be combined with any preferred upper limit.
  • a method of introducing a linker having a reactive functional group into a water-insoluble carrier includes a method of pre-reacting a linker having a reactive functional group with the water-insoluble carrier.
  • the water-insoluble carrier is polystyrene and the linker having a reactive functional group is a chloroacetamidomethyl group
  • NMCA N-methylol- ⁇ -chloroacetamide
  • the nitrogen-containing compound in the cell-adsorbing material of the present invention is preferably bound to a water-insoluble carrier via an amino group (or nitrogen atom) in the nitrogen-containing compound.
  • the primary amino group, secondary amino group, tertiary amino group, and/or quaternary amino group is bound to It will be present in nitrogen-containing compounds.
  • the polyamine represented by general formula (I) is bound to a water-insoluble carrier, depending on the binding position in the polyamine, primary amino groups, secondary amino groups, tertiary amino groups, and/or 4 Secondary amino groups will be present in the polyamine after coupling.
  • the amino groups in the cell adsorption material include primary amino groups, secondary amino groups, tertiary amino groups, and quaternary amino groups derived from nitrogen-containing compounds thus produced.
  • the amino groups in the cell-adsorbing material are primary amino groups, secondary amino groups, tertiary amino groups, and quaternary amino groups derived from the linker. including.
  • the "amino group amount” means the amount of primary amino groups, secondary amino groups, tertiary amino groups, and quaternary amino groups in the cell-adsorbing material.
  • the amount of amino groups in the cell-adsorbing material of the present invention is preferably 20 ⁇ mol/g or more and 200 ⁇ mol/g or less.
  • the amino group content is more preferably 30 ⁇ mol/g or more, still more preferably 50 ⁇ mol/g or more, from the viewpoint of imparting sufficient cell adsorption performance.
  • the amount of amino groups is more preferably 150 ⁇ mol/g or less. It is preferably 100 ⁇ mol/g or less. Any preferred lower limit can be combined with any preferred upper limit.
  • the amount of amino groups in the cell adsorption material can be determined, for example, by measuring the amino groups using acid-base back titration to determine the amount of primary amino groups, the amount of secondary amino groups, the amount of tertiary amino groups, and the amount of quaternary amino groups. It can be determined as the sum of the amounts of groups (quaternary ammonium groups). That is, an excess amount of aqueous sodium hydroxide solution is used to desalinate salt-added amino groups in the cell-adsorbing material, and the cell-adsorbing material is sufficiently washed and dried until it becomes neutral. Amino groups in the resulting cell adsorbent material are reacted with a fixed amount of standard solution containing excess acid.
  • the amount of amino groups can be determined by titrating the amount of acid remaining without reacting with amino groups with a standard solution containing a base. More specifically, it can be determined by the method described in "Measurement of Amino Group Content" below. In this method, the amount containing a quaternary amino group can be measured, but in this example, the quaternary amino group is not included due to the structure of the nitrogen-containing compound used, It is the sum of the amount of amino groups and the amount of tertiary amino groups.
  • the amount of amino groups in the cell adsorption material can be adjusted, for example, by adjusting the binding amount of reactive functional groups introduced directly or via a linker into the water-insoluble carrier, the type of nitrogen-containing compound, and the amount of nitrogen-containing compound used. You can control it.
  • the binding amount of the reactive functional group introduced via the linker to the water-insoluble carrier can be controlled by, for example, the type of reactive functional group possessed by the linker, the type of solvent, or reaction conditions such as immersion temperature or immersion time.
  • a cross-linking agent can be used to control the bondable sites of the water-insoluble carrier and the reactive functional group or linker having a reactive functional group.
  • the ratio of the amount of amino groups to the amount of amide groups in the cell-adsorbing material is 0.5. 008 or more and 0.080 or less.
  • the ratio of the amount of amino groups to the amount of amide groups is more preferably 0.010 or more, still more preferably 0.015 or more, and particularly preferably 0.020 or more. be.
  • the ratio of the amount of amino groups to the amount is more preferably 0.070 or less, still more preferably 0.060 or less, and particularly preferably 0.050 or less. Any preferred lower limit can be combined with any preferred upper limit.
  • the amount of amide groups in the cell-adsorbing material can be measured, for example, by hydrolyzing the amide groups in the cell-adsorbing material and then performing titration. Specifically, it can be determined by the method described in "Measurement of amino group/amide group ratio" described later.
  • the amount of amide groups in the cell-adsorbing material can be controlled, for example, by using a linker having an amide group as a reactive functional group and adjusting the amount of the linker introduced into the water-insoluble carrier.
  • an amide group can be imparted to the water-insoluble carrier by introducing NMCA, which is a linker having a reactive functional group and an amide group, into the water-insoluble carrier.
  • the amount of amide groups is preferably 2500 ⁇ mol/g or more, more preferably 2800 ⁇ mol/g or more, from the viewpoint of increasing the amount of nitrogen-containing compounds introduced and improving cell adsorption performance.
  • the amount of amide groups is preferably 5000 ⁇ mol/g or less, more preferably 4000 ⁇ mol/g. It is below. Any preferred lower limit can be combined with any preferred upper limit.
  • water-insoluble carrier means a carrier that does not cause a change in mass when immersed in water at room temperature (25°C). A carrier that is 5% or less is preferred.
  • Materials for the water-insoluble carrier include, for example, polyaromatic vinyl compounds represented by polystyrene, polyethersulfone, polysulfone, polyarylethersulfone, polyetherimide, polyimide, polyamide, and polyphenylene sulfide.
  • polystyrene polyethersulfone, polysulfone, polyarylethersulfone, polyetherimide, polyimide, polyamide, and polyphenylene sulfide.
  • commercially available materials or materials manufactured by known methods or methods based thereon can be used. These macromolecular materials are materials that do not substantially have hydroxyl groups, which are believed to facilitate the activation of complement when in contact with blood.
  • polystyrene is preferable as a material for the water-insoluble carrier because it has a large number of aromatic rings per unit mass and can easily immobilize a nitrogen-containing compound.
  • the water-insoluble carrier is preferably a polymeric material containing a polyaromatic vinyl compound such as polystyrene.
  • polystyrene is preferred because it is easy to introduce a linker such as an active halogen group for immobilizing a nitrogen-containing compound into the polystyrene portion, it is easy to handle because the strength is reinforced by the polyolefin portion, and it is chemically resistant.
  • polyolefin copolymers such as polystyrene and polyethylene or polystyrene and polypropylene.
  • the polymer material may be a blend or an alloy, and in particular, a polymer alloy of polystyrene and polyolefin, such as a polymer alloy of polystyrene and polyethylene or a polymer alloy of polystyrene and polypropylene, has chemical resistance and physical properties. It is preferable from the viewpoint of easy retention of the shape. Among them, a polymer alloy of polystyrene and polypropylene, which has been used in extracorporeal blood circulation therapy, is preferable. Also, the water-insoluble carrier to be used preferably has substantially no amino group.
  • the amount of nitrogen-containing compound immobilized in the cell adsorption material is, for example, the introduction amount of a reactive functional group or a linker having a reactive functional group to the water-insoluble carrier, the type of nitrogen-containing compound, or the amount of nitrogen-containing compound used.
  • the introduction amount of the linker having a reactive functional group can be controlled by, for example, the type of linker having a reactive functional group, the type of solvent, or reaction conditions such as immersion temperature or immersion time.
  • a cross-linking agent can be used to control the possible attachment points of reactive functional groups or linkers having reactive functional groups.
  • the water-insoluble carrier in the cell-adsorbing material of the present invention is fibers or particles.
  • fibers are preferable because they can increase the contact area with blood while securing blood flow paths by high-order processing.
  • the water-insoluble carrier is a fiber
  • it is preferably a sea-island type composite fiber
  • a sea-island type composite in which the islands are the reinforcing material and the sea is an alloy of the water-insoluble polymer and the reinforcing material.
  • a fiber is preferable, and a sea-island composite fiber in which the islands are polypropylene and the sea is an alloy of polystyrene and polypropylene is more preferable.
  • reinforcing materials include polyamide, polyacrylonitrile, polyethylene, polypropylene, nylon, polymethylmethacrylate, and polytetrafluoroethylene.
  • polypropylene is preferable because of its high chemical resistance and excellent thermoplasticity. These polymers may be used alone or in combination of multiple types.
  • the water-insoluble carrier is a fiber
  • it is preferably a knitted fabric that is a highly processed product.
  • a knitted fabric can secure a blood flow path by controlling the stitches thereof, and therefore can reduce pressure loss when blood passes through the fibers.
  • the number of doubling yarns is preferably 10 or more and 100 or less, more preferably 30 or more and 80 or less.
  • LAP-positive immune cells can easily enter into the fiber bundle, thereby improving the adsorption performance.
  • the number of doubling yarns is 10 or more, the retention of the shape of the knitted fabric is improved. It should be noted that any preferred lower limit can be combined with any preferred upper limit.
  • fibers bound with a nitrogen-containing compound ie, a cell-adsorbing material and fibers with no bound nitrogen-containing compound, may be combined.
  • the long diameter of the fibers or particles of the water-insoluble carrier in the cell-adsorbing material of the present invention is preferably 15 ⁇ m or more and 50 ⁇ m or less.
  • the long diameter of the fibers or particles that are water-insoluble carriers in the cell-adsorbing material is 15 ⁇ m or more and 50 ⁇ m or less, blood per unit volume of the cell-adsorbing material is maintained while maintaining an appropriate packing density in the column of the cell-adsorbing material. Since the contact area can be increased, it is presumed that non-specific adsorption of platelets, leukocytes, etc. is suppressed and the adsorption performance of LAP-positive immune cells is improved. Therefore, the long diameter of the fibers or particles that are water-insoluble carriers in the cell-adsorbing material is more preferably 17 ⁇ m or more, still more preferably 18 ⁇ m or more, and particularly preferably 19 ⁇ m or more. On the other hand, the length of the fibers or particles is more preferably 40 ⁇ m or less, still more preferably 35 ⁇ m or less, and particularly preferably 30 ⁇ m or less. Any preferred lower limit can be combined with any preferred upper limit.
  • the "long diameter of the fiber” is obtained by taking a photograph of the cross section perpendicular to the fiber stretching direction at a magnification of 1000 times or more and 3000 times or less using a scanning electron microscope or the like, and analyzing the image of the obtained fiber cross section. can be measured. Specifically, it can be measured by the method described in "Measurement of long diameter of fiber" described later.
  • the average value of these values (the average value of the long diameters of a total of 100 particles) is calculated as the “long diameter of the particles”. In addition, the average value uses the value rounded off to the first decimal place.
  • the area within 1.0 ⁇ m from the outermost surface of the cross-section of the fiber or particle as the cell-adsorbing material is the area A, and the radius within 0.5 ⁇ m from the center of gravity of the cross-section of the fiber or particle as the cell-adsorbing material. is defined as region B, and the spectral intensity of 26 CN ⁇ when the spectral intensity of 25 C 2 H ⁇ in each region measured by time-of-flight secondary ion mass spectrometry is set to 1 is expressed by the following formula (1) and (2) are satisfied.
  • the spectral intensity of 26 CN ⁇ in region A exceeds 3.0, it is presumed that the amount of nitrogen-containing compounds bound to the surface of the water-insoluble carrier is excessive, and monocytes, a type of leukocyte, Adsorption of cells such as LAP-positive immune cells may be inhibited by adsorption of granulocytes and the like. In addition, there is a concern that the adsorption of anticoagulants such as heparin increases, and blood coagulation is likely to occur. If the spectral intensity of 26 CN ⁇ in region A/the spectral intensity of 26 CN ⁇ in region B is less than 3.0, sufficient adsorption performance for cells such as LAP-positive immune cells cannot be obtained.
  • the spectral intensity of 26 CN ⁇ in region A is preferably 0.6 or higher, more preferably 0.9 or higher, and still more preferably 1.2 or higher. On the other hand, it is preferably 2.5 or less, more preferably 2.0 or less, even more preferably 1.8 or less, and particularly preferably 1.6 or less.
  • the spectral intensity of 26 CN ⁇ in region A/the spectral intensity of 26 CN ⁇ in region B is preferably 5.0 or more, more preferably 6.0 or more. On the other hand, it is preferably 15.0 or less, more preferably 12.0 or less, still more preferably 9.0 or less, and particularly preferably 7.0 or less. Any preferred lower limit can be combined with any preferred upper limit.
  • Spectral intensity of 26 CN ⁇ in region A and region B is a time-of-flight secondary ion mass spectrometry ( TOF- It can be obtained by measuring by SIMS method: Time of Flight Secondary Ion Mass Spectrometry), mapping the respective intensities, and analyzing them. More specifically, it can be determined by the method described in "Measurement of Spectral Intensity of 26 CN- " below.
  • the spectral intensity of 26 CN - in region A and the spectral intensity of 26 CN - in region B depend on the amount of nitrogen-containing compound introduced into the water-insoluble carrier, the type of reaction solvent when binding the nitrogen-containing compound to the water-insoluble carrier, etc. can be controlled by For example, the lower the affinity between the reaction solvent and the water-insoluble carrier, the smaller the spectral intensity of 26 CN ⁇ in region B.
  • the mode pore radius of the fibers or particles that are the cell adsorption material of the present invention is 10 nm or more and 100 nm or less, and the number of pores with a pore radius of 10 nm or more and 250 nm or less with respect to the total volume of all pores in the cell adsorption material. It is preferable that the total volume is 50% or more and 100% or less.
  • the term "modal pore radius" as used herein means the pore radius with the highest frequency when measuring the frequency of pore radii of fibers or particles that are cell-adsorbing materials.
  • the total volume of all pores of the cell-adsorbing material means the total volume of all pores observed during measurement.
  • the total volume of pores with a pore radius of 10 nm or more and 250 nm or less means the sum of the volumes of all pores having the corresponding radius. Then, the total volume of pores with a pore radius of 10 nm or more and 250 nm or less with respect to the total volume of all pores in the cell adsorption material, that is, "total volume of pores with a pore radius of 10 nm or more and 250 nm or less" / "cell adsorption The "total volume of all pores in the material" is referred to as the total volume ratio.
  • the reason and mechanism for obtaining the effect of the present invention when the most frequent pore radius and total volume ratio of the cell adsorption material are within a predetermined range are presumed as follows.
  • the most frequent pore radius of the cell-adsorbing material is less than 10 nm, proteins are likely to be adsorbed, which may promote non-specific adsorption of immune cells.
  • the most frequent pore radius of the cell-adsorbing material exceeds 100 nm, the unevenness of the surface of the cell-adsorbing material becomes small, and the adsorption performance of cells such as LAP-positive immune cells may decrease.
  • the most frequent pore radius and the total volume ratio of the cell-adsorbing material are preferably within a predetermined range.
  • the modal pore radius and total volume ratio can be controlled by immersing the water-insoluble carrier in an organic solvent and by the type of reaction solvent used when binding the nitrogen-containing compound to the water-insoluble carrier. For example, the higher the affinity between the reaction solvent and the water-insoluble carrier, the smaller the mode pore radius and total volume ratio.
  • the most frequent pore radius of the fibers or particles that are the cell-adsorbing material is more preferably 15 nm or more, still more preferably 20 nm or more, even more preferably 30 nm or more, and particularly preferably 40 nm or more.
  • the most frequent pore radius is more preferably 95 nm or less, still more preferably 85 nm or less, and particularly preferably 75 nm or less. Any preferred lower limit can be combined with any preferred upper limit.
  • the ratio of the total volume of pores having a pore radius of 10 nm or more and 250 nm or less to the total volume of all pores in the cell-adsorbing material is more preferably 70% or more, and more preferably It is 80% or more, and particularly preferably 90% or more.
  • Modular pore radius “total volume of pores with a pore radius of 10 nm or more and 250 nm or less”, and “total volume of all pores of the cell adsorption material” are measured by differential scanning calorimetry (DSC method: Differential It can be calculated by measuring and analyzing Scanning Calorimetry. Specifically, it can be obtained by the method described in "Measurement of modal pore radius and total volume ratio" described later.
  • the cross-sectional circularity of the fibers or particles that are the cell-adsorbing material of the present invention is preferably 0.75 or more and 0.95 or less.
  • the roundness of the cross section of the cell-adsorbing material is more preferably 0.77 or more, more preferably 0.80 or more. On the other hand, the roundness is more preferably 0.90 or less. Any preferred lower limit can be combined with any preferred upper limit.
  • the roundness of the cross section is in the range of 0.75 or more and 0.95 or less, non-specific adsorption of monocytes and granulocytes to the cell adsorption material is suppressed, and LAP-positive immune cells can be removed with high efficiency. guessed.
  • “Circularity” is an index that indicates how much the cell-adsorbing material, which is a target circular body, deviates from a perfect circle.
  • the roundness takes a value of 0.00 or more and 1.00 or less, and the closer the value is to 1.00, the closer the target circular shape is to a perfect circle.
  • the roundness can be calculated by analyzing the image of the fiber cross section or the whole particle with image analysis software. Specifically, it can be calculated by the method described in "Measurement of roundness" described later.
  • the roundness can be controlled by immersing the water-insoluble carrier in an organic solvent and by the type of reaction solvent used when binding the nitrogen-containing compound to the water-insoluble carrier. For example, the lower the affinity between the reaction solvent and the water-insoluble carrier, the greater the circularity.
  • the cross-sectional convexity of the fibers or particles that are the cell-adsorbing material of the present invention is preferably 0.92 or more and 1.00 or less. By reducing the unevenness of the surface of the cell-adsorbing material, non-specific adsorption of monocytes and granulocytes to the cell-adsorbing material is suppressed, and the cell-adsorbing performance is improved. It is more preferably 0.94 or more, and still more preferably 0.96 or more.
  • Convexity is an index that expresses the degree of dents in the cross section of the cell-adsorbing material, which is the target shape.
  • the convexity takes a value of 0.00 or more and 1.00 or less, that is, the upper limit is 1.00.
  • Convexity can be calculated by analyzing cross-sectional images of fibers or particles with image analysis software. Specifically, it can be calculated by the method described in "Measurement of convexity" described later.
  • the convexity can be controlled by immersing the water-insoluble carrier in an organic solvent and by the type of reaction solvent used when binding the nitrogen-containing compound to the water-insoluble carrier. For example, the lower the affinity between the reaction solvent and the water-insoluble carrier, the greater the convexity.
  • the surface arithmetic mean roughness of the fibers or particles of the water-insoluble carrier, which is the adsorbent material of the present invention is preferably 0.01 ⁇ m or more and 1.0 ⁇ m or less.
  • the arithmetic mean roughness of the surface of the water-insoluble carrier is more preferably 0.01 ⁇ m or more and 1.00 ⁇ m or less.
  • the arithmetic mean roughness of the surface of the cell-adsorbing material is in the range of 0.01 ⁇ m or more and 1.00 ⁇ m or less, the adsorption performance of LAP-positive cells is maintained, and non-specific adsorption of monocytes and granulocytes is suppressed. It is presumed to be possible.
  • the arithmetic average roughness of the surface of the water-insoluble carrier is more preferably 0.05 ⁇ m or more, still more preferably 0.10 ⁇ m or more, even more preferably 0.20 ⁇ m or more, particularly preferably 0.30 ⁇ m or more, and most preferably 0.40 ⁇ m or more.
  • the arithmetic average roughness of the surface of the cell-adsorbing material is more preferably 0.90 ⁇ m or less, still more preferably 0.80 ⁇ m or less. Any preferred lower limit can be combined with any preferred upper limit.
  • the preferred long diameter of the fiber or particle of the cell-adsorbing material, the preferred roundness and convexity of the cell-adsorbing material, and the preferred arithmetic mean roughness of the surface of the cell-adsorbing material can be combined arbitrarily.
  • the arithmetic mean roughness of the surface of the cell adsorption material can be controlled by immersing the water-insoluble carrier in an organic solvent.
  • a method of immersing a polymer obtained by kneading a polyaromatic vinyl compound and polypropylene as a water-insoluble carrier in a solvent in which a part of the polyaromatic vinyl compound is soluble and polypropylene is insoluble mentioned.
  • the arithmetic mean roughness of the surface of the cell-adsorbing material can be controlled by the type of polymer, molecular weight of polymer, type of solvent, immersion temperature, immersion time, and the like.
  • a method of controlling the solubility in a solvent by introducing a cross-linking agent can also be adopted.
  • the above reaction can be carried out simultaneously with the introduction reaction of the nitrogen-containing compound.
  • the cell-adsorbing material of the present invention is preferably a cell-adsorbing material that adsorbs immune cells.
  • the immune cells are a cell-adsorbing material that adsorbs LAP-positive immune cells.
  • LAP-positive immune cells it is preferably a cell-adsorbing material that adsorbs LAP-positive T cells or LAP-positive platelets, and is a cell-adsorbing material that adsorbs LAP-positive CD4-positive T cells or LAP-positive CD42b-positive platelets. is more preferable.
  • the adsorption rate of LAP-positive T cells is preferably 60% or higher, more preferably 70% or higher, and even more preferably 80% or higher.
  • the adsorption rate of LAP-positive platelets is preferably 70% or higher, more preferably 80% or higher, and still more preferably 90% or higher.
  • the LAP-positive T cells are CD4-positive T cells
  • the platelets are CD42b-positive platelets.
  • the test system for the adsorption rate include an adsorption column flow-through type immune cell adsorption test using human blood (see this example).
  • analysis by flow cytometry using surface antigens of immune cells as indicators see this example
  • the cell adsorption column of the present invention incorporates the cell adsorption material of the present invention.
  • a "cell adsorption column” has at least a blood inlet portion, a case portion, and a blood outlet portion, and means that the case portion is filled with a cell adsorption material.
  • Examples of cell adsorption columns include radial flow type cell adsorption columns.
  • the shape of the cell-adsorbing material is preferably fiber, and preferably knitted fabric.
  • reference numeral 1 denotes a container body, which has an inlet 2 and an outlet 3 at its longitudinal front and rear ends.
  • a filter 4 and a disk-shaped partition plate 5 are provided inside the inlet 2
  • a filter 6 and a disk-shaped partition plate 7 are provided inside the outlet 3 .
  • the front (inlet side) partition plate 5 is provided with an opening 5a at the center
  • the rear partition plate 7 is provided with a support projection 7a at the center.
  • a large number of through holes 7b are intermittently provided in the outer periphery of the partition plate 7 in the circumferential direction.
  • a single pipe 8 is laid between the opening 5a of the partition plate 5 and the support projection 7a of the partition plate 7. As shown in FIG.
  • the pipe 8 has a flow path 9 for guiding blood therein and has a large number of through holes 10 in its peripheral wall.
  • the pipe 8 communicates with the opening 5a of the partition plate 5 at its front end, and is closed by the support projection 7a of the partition plate 7 at its rear end.
  • a cell-adsorbing material 11 is wound around the pipe 8 in multiple layers.
  • the target adsorbed substance (LAP-positive immune cells) is removed by the internal cell-adsorbing material 11, which flows out from the outflow port 3, and is circulated so as to be returned to the blood pool.
  • the blood that enters the channel 9 from the inlet 2 through the filter 4 sequentially enters the cell adsorption material 11 through the through holes 10 while moving through the channel 9 . Then, it adsorbs cells in the blood moving in any radial direction.
  • the blood from which cells and the like have been removed flows out from a large number of through holes 7b on the outer circumference of the partition plate 7, passes through the filter 6, and flows out from the outflow port 3.
  • the blood flows through the passage 9 in the pipe 8 from the opening 5a and flows out from the through hole 10. may be supplied and flowed out from the inlet 2.
  • the blood linear velocity in the column is also important. That is, when the blood linear velocity is high, it may be difficult for the LAP-positive immune cells to sufficiently interact with the cell-adsorbing material. On the other hand, when the blood linear velocity is slow, other blood components such as platelets and proteins may non-specifically adhere to the cell-adsorbing material, inhibiting the interaction between the cell-adsorbing material and LAP-positive immune cells. . Therefore, when the flow velocity S in at the cell adsorption column inlet is 50 cm 3 /min, the maximum blood linear velocity in the cell adsorption material is preferably 50 cm/min or less, preferably 25 cm/min or less.
  • the minimum blood linear velocity in the cell adsorption material is preferably 0.1 cm/min or more, more preferably 0.5 cm/min or more. is preferred.
  • the blood linear velocity is obtained by calculation.
  • V max the maximum blood linear velocity (V max ) in the cell adsorption material is It is calculated by the following formula (4) from the total area (S p ) of the openings on the sides and the flow rate S in (50 cm 3 /min) at the inlet of the cell adsorption column.
  • V max (cm/min) S in (cm 3 /min)/ Sp (cm 2 ) Equation (4)
  • the minimum value (V min ) is obtained by the following formula (5) from the area (S o ) of the outermost peripheral surface of the cell adsorption material wound around the center pipe and the flow rate S in (50 cm 3 /min) at the cell adsorption column inlet. Calculated.
  • the cell adsorption column of the present invention comprises a central pipe provided with through holes provided on the longitudinal side surfaces thereof for the outflow of supplied blood, and a cell adsorption material filled around the central pipe.
  • a cage arranged to communicate the inflowing blood through the central pipe to the upstream end of the central pipe to prevent the blood from contacting cell adsorbent material without passing through the central pipe;
  • a radial flow type cell adsorption column is preferably provided with a plate A arranged to close the downstream end of the central pipe and a plate B arranged to fix the cell adsorbing material in the space around the central pipe.
  • the aperture ratio of the through-holes is preferably 20% or more and 80% or less, and preferably 30% or more and 60% or less.
  • Ring flow type refers to the way blood flows inside the column. When blood flows vertically at the inlet and outlet of the column, and when there is horizontal blood flow inside the column, it is called a radial flow type.
  • Open area ratio of through holes means the value obtained by the following formula (6).
  • the cell adsorption column of the present invention can be used for blood purification therapy.
  • LAP-positive immune cells and the like can be removed from blood with high efficiency while suppressing non-specific adsorption of platelets, leukocytes, and the like.
  • LAP-positive immune cells and the like can be removed from blood with high efficiency by extracorporeally circulating blood and passing it through the cell adsorption column of the present invention.
  • the cell adsorption column of the present invention can be used as a column for extracorporeal circulation. More specifically, the cell adsorption column of the present invention can be used for cancer treatment by removing LAP-positive immune cells from the blood of cancer patients. It can also be used in combination with cell infusion therapy that activates dendritic cells and natural killer cells.
  • Measuring device TOF.
  • SIMS 5 manufactured by ION-TOF
  • Primary ion Bi 3 ++
  • Primary ion acceleration voltage 30 kV
  • Pulse width 125.0ns
  • Secondary ion polarity positive and negative Number of scans: 96 scan/cycle Cycle Time: 230 ⁇ s
  • Measurement range 50 x 50 ⁇ m2
  • the mass spectrum of 26 CN ⁇ in the cross section of the cell-adsorbing material was also mapped in the same manner as image X (image Y).
  • image Y the imaging region was selected so that the cross-sectional image of one cell-adsorbing material could be completely included in the field of view of 50 ⁇ m ⁇ 50 ⁇ m.
  • ImageJ an image analysis software.
  • the cross-section of the cell-adsorbing material was selected by enclosing the perimeter 21, and the center of gravity 22 of the cross-section of the cell-adsorbing material was measured.
  • the mode pore radius is the logarithmic differential pore volume (dV/d (logr)) with respect to the pore radius of the cell adsorption material, where V is the pore volume per 1 g of the cell adsorption material, r is the pore radius ) is plotted, it is the pore radius with the maximum value of the logarithmic differential pore volume, that is, the pore radius with the highest frequency.
  • the pore radius and pore volume were obtained by measuring the freezing point depression due to capillary aggregation of water in the pores using a DSC device (DSC Q100, manufactured by TA Instruments).
  • Pore radius (nm) (33.30 ⁇ 0.3181 ⁇ melting point depression amount [° C.])/melting point depression amount [° C.] Equation (7)
  • the pore volume was calculated from the following formula (8).
  • Vfp is the pore volume per gram of the cell adsorption material
  • r is the pore radius
  • the total volume of all pores was obtained by totaling the volume of all pores per 1 g of the cell adsorption material observed by DSC measurement.
  • the total volume of pores with a pore radius of 10 nm or more and 250 nm or less is the same as the total volume of all pores.
  • the pore volume was summed and determined.
  • the ratio of the total volume of pores with a pore radius of 10 nm or more and 250 nm or less to the total volume of all pores was calculated to calculate the total volume ratio.
  • reference was made to the literature Karlo Ishikiriyama et al.; JOURNAL OF COLLOID AND INTERFACE SCIENCE, VOL. 171, 103-111 (1995)).
  • ⁇ Measurement of long diameter of fiber> "Long diameter of fiber” was obtained by the following method. 100 samples of a fiber-shaped water-insoluble carrier, which is a cell-adsorbing material, are randomly collected, and a photograph of a cross section (a cross section perpendicular to the direction in which the fiber extends) is taken at a magnification of 3000 using a scanning electron microscope. One photograph was taken for each. Next, the major diameter of each fiber cross section was measured using ImageJ of image analysis software. Then, the average value of those values (the average value of the long diameters of the cross sections of a total of 100 fibers) was calculated, and the value obtained by rounding off to the first decimal place was defined as the long diameter of the fiber.
  • S A is the cross-sectional area of the cell-adsorbing material
  • SC is the area of the convex hull 41 with respect to the outer circumference of the cross-section of the cell-adsorbing material.
  • a convex hull means the smallest convex polygon that contains all the given points.
  • the mass of the adsorbent material after drying was measured, 40 mL of 0.1 mol/L hydrochloric acid was added, and the mixture was stirred at room temperature for 30 minutes. After stirring, 5 mL of the remaining solution (hereinafter referred to as "dispensing solution 1") after removing the cell adsorption material was extracted, and 0.1 mL of 0.1 mol/L sodium hydroxide aqueous solution was added dropwise (hereinafter “measurement solution 1"). called). After dropping, the solution was stirred for 10 minutes, and the pH of the measurement solution 1 was measured. Stirring for 10 minutes after dropping and pH measurement were repeated in the same manner until the pH of the measurement solution 1 exceeded 8.5.
  • the titration amount per 1 g of the cell-adsorbing material was defined as the amount of the aqueous sodium hydroxide solution dropped when the pH of the measurement solution 1 exceeded 8.5. Using the appropriate amount per 1 g of the cell-adsorbing material and the following formula (11), the amount of amino groups was calculated, and the value rounded to the first decimal place was used.
  • Amino group amount ( ⁇ mol/g) per gram of cell-adsorbing material V HCl-1 /V S1 ⁇ V F /M S1 ⁇ C NaOH-1 ⁇ 1000 Formula (11)
  • V HCl-1 is the amount of 0.1 mol / L hydrochloric acid added (40 mL)
  • V S1 is the amount of dispensed solution 1 (5 mL)
  • VF is the titration amount (mL)
  • M S1 Mass (g) of cell adsorption material after drying
  • C NaOH-1 means sodium hydroxide aqueous solution concentration (0.1 mol/L).
  • the amide group weight was obtained by the following method. First, 100 mL of 6 mol/L hydrochloric acid was added to 1.0 g of the dried cell-adsorbing material and hydrolyzed at 110° C. for 20 hours. The cell-adsorbing material after hydrolysis was washed with ion-exchanged water, and 50 mL of a 6 mol/L sodium hydroxide aqueous solution was added. After stirring the above cell-adsorbing material by overturning for 30 minutes or more, ion-exchanged water was added and washed.
  • the cell-adsorbing material After repeating washing until the pH of the ion-exchanged water added to the cell-adsorbing material reaches 7, the cell-adsorbing material was allowed to stand under reduced pressure at 25° C. for 48 hours to dry. Next, the mass of the dried cell-adsorbing material was measured, 30 mL of 0.1 mol/L hydrochloric acid was added, and the mixture was inverted and stirred for 30 minutes. A methyl red solution and a phenolphthalein solution were added (hereinafter referred to as "measurement solution 2") to the solution remaining after removal of the cell-adsorbing material (hereinafter referred to as "dispensing solution 2").
  • a 0.02 mol/L sodium hydroxide aqueous solution was added dropwise to the measurement solution, and the time point when the color of the measurement solution turned yellow was taken as the end point.
  • the amount of amide groups per 1 g of the cell-adsorbing material was calculated from the following formula (12), and the value rounded to the first decimal place was used.
  • V S2 is the amount (mL) of dispensed solution 2
  • C HCl-2 is the concentration of hydrochloric acid added for the second time (0.1 mol / L)
  • C NaOH-2 is added dropwise to measurement solution 2.
  • the concentration of the aqueous sodium hydroxide solution (0.02 mol / L)
  • V NaOH-2 is the amount (mL) of the aqueous sodium hydroxide solution added dropwise to the measurement solution 2
  • V HCl-2 is the amount of hydrochloric acid added for the second time ( mL)
  • MS2 means the mass (g) of the cell adsorbent material after drying.
  • the amino group/amide group ratio was calculated, and the value rounded to the fourth decimal place was used.
  • ⁇ Adsorption test of LAP-positive immune cells The adsorption rate of LAP-positive immune cells in the cell adsorption material was measured by an adsorption column flow-through immune cell adsorption test using human blood. Flow cytometry (FACSLyric, manufactured by Becton Dickinson) was used for the analysis.
  • the packed portion (diameter 10 mm, height 14 mm) of the cell adsorption column was filled with a dry mass of 0.3 g of cell adsorption material and physiological saline, and autoclave sterilization (117°C, 105 minutes) was performed. Thereafter, a heparinized physiological saline solution with a final concentration of 50 units/mL was passed through the cell adsorption column at 1.54 mL/min for 2.5 minutes to perform a priming treatment. Next, blood collected from a healthy human subject (with heparin added at a final concentration of 5 units/mL) was passed through at 0.31 mL/min, and the blood at the column outlet was collected after 10 minutes.
  • Blood on the inlet side of the column was also collected after 10 minutes. 100 ⁇ L of the collected blood was dispensed into 5 mL polypropylene tubes (manufactured by FALCON), and various fluorescence-labeled antibodies were added to stain immune cells.
  • fluorescence-labeled antibodies examples include fluorescein isothiocyanate (hereinafter referred to as "FITC”)-labeled anti-human CD4 antibody (manufactured by BioLegend), phycoerythrin (hereinafter referred to as “PE”)-labeled anti-human CD42b antibody (manufactured by BioLegend), A phycocyanin (hereinafter referred to as “APC”)-labeled anti-human LAP antibody (manufactured by R&D) was used.
  • FITC fluorescein isothiocyanate
  • PE phycoerythrin
  • APC phycocyanin-labeled anti-human LAP antibody
  • a flow cytometer was used to detect the number of LAP-positive immune cells.
  • CD4-positive and LAP-positive cells were evaluated as LAP-positive T cells
  • CD42b-positive and LAP-positive cells were evaluated as LAP-positive platelets.
  • the adsorption rate of LAP-positive T cells was calculated by the following formula (13), and the value rounded to the first decimal place was used.
  • Adsorption rate (%) of LAP-positive T cells (1-number of LAP-positive T cells in blood to which cell-adsorbing material was added/number of LAP-positive T-cells in blood to which no cell-adsorbing material was added) x 100... ⁇ Formula (13)
  • the adsorption rate of LAP-positive platelets was calculated by the following formula (14).
  • Adsorption rate (%) of LAP-positive platelets (1-Number of LAP-positive platelets in blood to which cell-adsorbing material was added/Number of LAP-positive platelets in blood to which no cell-adsorbing material was added) x 100 Formula ( 14) ⁇ Preparation of original knitted fabric (water-insoluble carrier) and intermediate (linker-bonded water-insoluble carrier)>
  • a water-insoluble carrier there are 264 island components made of polypropylene (Prime Polymer Co., Ltd.; J105WT), polystyrene (weight average molecular weight: 181,000) 90% by mass, and polypropylene (Prime Polymer Co., Ltd.; J105WT) 10% by mass.
  • a sea-island composite fiber (fiber diameter: 20 ⁇ m) having a sea component consisting of and a ratio (mass ratio) of islands to sea of 50:50 was spun. Thirty-six of the obtained fibers were combined to form a knitted fabric (hereinafter referred to as "original knitted fabric").
  • original knitted fabric The arithmetic mean roughness of the fiber surface is affected by the number of islands, the sea-island ratio, the molecular weight of polystyrene and polypropylene, and the like.
  • intermediate body ⁇ -chloroacetamidomethylated knitted fabric
  • Example 1 DETA (23.3 mL) was dissolved in ion-exchanged water (405.0 mL) to prepare a 500 mmol/L DETA aqueous solution.
  • the intermediate (10 g) was immersed in this DETA aqueous solution and stirred at 40° C. for 3 hours. After that, it was immersed in methanol and ion-exchanged water, washed, and dried to obtain cell adsorption material E1.
  • Example 2 After mixing ion-exchanged water (364.8 mL) and dimethyl sulfoxide (hereinafter referred to as “DMSO”, 63.8 mL), DETA (23.3 mL) was added to obtain a 500 mmol/L DETA-10 wt% DMSO aqueous solution. prepared. The intermediate (10 g) was immersed in this DETA-10 mass % DMSO aqueous solution and stirred at 40° C. for 3 hours. It was washed and dried in the same manner as in Example 1 to obtain cell-adsorbing material E2.
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • Example 3 DETA (0.9 mL) was dissolved in ion-exchanged water (427.6 mL) to prepare a 20 mmol/L DETA aqueous solution.
  • the intermediate (10 g) was immersed in this 20 mmol/L DETA aqueous solution and stirred at 40° C. for 3 hours. It was washed and dried in the same manner as in Example 1 to obtain cell adsorption material E3.
  • the spectrum intensity of 26 CN ⁇ the spectrum intensity of 26 CN ⁇ , the mode pore radius, the total volume of pores with a pore radius of 10 nm or more and 250 nm or less, and the true Circularity, convexity, major diameter, surface arithmetic mean roughness, amino group content, amino group/amide group ratio, and adsorption rate of LAP-positive T cells and LAP-positive platelets were measured.
  • Table 1 shows the results.
  • the cell adsorption material and cell adsorption column of the present invention can adsorb cells such as LAP-positive immune cells with high efficiency. Therefore, application to cancer treatment is expected.
  • the cell-adsorbing material and cell-adsorbing column of the present invention can also be used in combination with cell infusion therapy for activating dendritic cells, natural killer cells, and the like.

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Abstract

本発明は、ＬＡＰ陽性Ｔ細胞及びＬＡＰ陽性血小板のようなＬＡＰ陽性免疫細胞などの細胞を高効率に吸着する細胞吸着材料を提供することを目的とする。ポリアミン及び脂肪族アミンからなる群より選択される１種以上の窒素含有化合物が結合した水不溶性担体の繊維又は粒子であり、上記繊維又は上記粒子の断面の最表面から１．０μｍ以内の領域を領域Ａ、上記繊維又は上記粒子の断面の重心から半径０．５μｍ以内の領域を領域Ｂとし、飛行時間型２次イオン質量分析法により測定された上記各領域の２５Ｃ２Ｈ－のスペクトル強度を１としたときの２６ＣＮ－のスペクトル強度が、下記式（１）及び（２）を満たす、細胞吸着材料。　０．５≦上記領域Ａにおける２６ＣＮ－のスペクトル強度≦３．０　・・・式（１）　３．０≦上記領域Ａにおける２６ＣＮ－のスペクトル強度／上記領域Ｂにおける２６ＣＮ－のスペクトル強度≦２０．０　・・・式（２）

Description

細胞吸着材料、及び細胞吸着カラム
　本発明は、ＬＡＰ陽性免疫細胞などの細胞吸着材料及び細胞吸着カラムに関する。
　がんは、免疫と密接に関係していることが明らかとなってきており、近年、多くの進行がんで免疫抑制性の血液成分が上昇していることが報告されている。その血液成分の一つが白血球であり、リンパ球、顆粒球、単球に分類される。それぞれの白血球は、さらに細分化され、例えば、リンパ球は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞などに分類される。
　がん細胞は、Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ－β（以下「ＴＧＦ－β」という）に代表される免疫抑制物質を産生することで、免疫抑制性のＴ細胞を誘導し、免疫機構から逃避する機構を備えていることが知られている。ＴＧＦ－βは、分子量７．５万のＬａｔｅｎｃｙ　Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　Ｐｅｐｔｉｄｅ（以下「ＬＡＰ」という）と非共有結合で会合した、生理活性のない潜在型ＬＡＰ－ＴＧＦ－β複合体として産生される。タンパク質分解酵素や細胞接着分子によりＬＡＰが切断されると、ＴＧＦ－βは各種細胞上のＴＧＦ－β受容体に結合できるようになり、生理機能を発揮する。
　潜在型ＬＡＰ－ＴＧＦ－β複合体は、がん細胞だけでなく、一部の免疫細胞の細胞膜にも結合していることが知られている。このＬＡＰ－ＴＧＦ－β複合体が結合している免疫細胞はＬＡＰ陽性免疫細胞と呼ばれ、がん細胞の免疫機構からの逃避の一因にもなっている。特に、ＬＡＰ陽性免疫細胞の内、ＬＡＰ陽性Ｔ細胞は、がん細胞に対するＴＧＦ－βの供給源として着目されており、これを除去するための吸着材の開発が進められてきた。
　一方、血小板もＴＧＦ－βの供給源の一つであることが知られている。そのため、免疫抑制物質ＴＧＦ－βの供給源であるＬＡＰ陽性Ｔ細胞及びＬＡＰ陽性血小板を合わせたＬＡＰ陽性免疫細胞を同時に除去できれば、がんの治療効果がより高まることが予想される。
　がんを治療する方法として、免疫チェックポイント抗体など、がん細胞から発せられる免疫抑制シグナルの伝達を阻害する薬剤が開発されているが、薬剤の副作用により、自己免疫疾患に罹患する例も認められている。
　また、副作用を低減しつつ免疫機能を向上させるために、患者自身の白血球でがん細胞を排除する細胞療法も行われている。代表的な方法として、体外でがん抗原を取り込ませた患者の樹状細胞を患者に戻すことで、がん特異的キラーＴ細胞を誘導して治療する樹状細胞輸注療法がある。しかしながら、現状では、この治療法は治療効果が不十分であるとされている。その理由の一つとして、免疫抑制系の亢進が推測されている。
　一方で、ＴＧＦ－βの供給源であるＬＡＰ陽性免疫細胞を除去することができれば、がん細胞に対する免疫応答が維持され、がん細胞の死滅やがんの進展抑制が可能になると期待される。
　特許文献１は、白血球を除去する材料として、繊維の直径が３μｍ未満で、嵩密度が０．１５ｇ／ｃｍ３を超え０．５０ｇ／ｃｍ３以下の不織布からなる白血球除去フィルターを開示している。
　特許文献２は、繊維径が０．５μｍ以上１０μｍ以下の繊維を含み、かつ表面積が０．５ｍ２以上１０ｍ２未満である吸着体を充填してなる細胞吸着カラムであって、吸着体充填容積が１００ｍＬ以下であることを特徴とする細胞吸着カラムを開示している。
　特許文献３は、繊維表面の算術粗さが０．１μｍ以上３．０μｍ以下である免疫抑制性白血球の吸着材料を開示している。
特開昭６０－１９３４６８号公報 国際公開第２００８／０３８７８５号 国際公開第２０１９／０４９９６２号
　しかしながら、特許文献１のフィルターは、ろ過により白血球を除去するため、全ての種類の白血球が除去されてしまう問題がある。特許文献２の吸着材料は、顆粒球や単球の貪食能を利用して細胞を吸着するため、ＬＡＰ陽性Ｔ細胞を除去することが困難な可能性がある。特許文献３は、表面粗さを制御することで免疫抑制性白血球を除去する吸着材料を開示しているが、ＬＡＰ陽性血小板の除去については開示されていない。
　上記の理由により、ＬＡＰ－ＴＧＦ－β複合体が結合している免疫細胞を吸着除去可能な材料の開発が望まれている。
　そこで、本発明は、ＬＡＰ陽性Ｔ細胞及びＬＡＰ陽性血小板のようなＬＡＰ陽性免疫細胞などの細胞を高効率に吸着する細胞吸着材料を提供することを目的とする。
　上述の課題を解決する本発明の細胞吸着材料は、以下の構成からなる。
　ポリアミン及び脂肪族アミンからなる群より選択される１種以上の窒素含有化合物が結合した水不溶性担体の繊維又は粒子であり、
　上記繊維又は上記粒子の断面の最表面から１．０μｍ以内の領域を領域Ａ、上記繊維又は上記粒子の断面の重心から半径０．５μｍ以内の領域を領域Ｂとし、飛行時間型２次イオン質量分析法により測定された上記各領域の２５Ｃ２Ｈ－のスペクトル強度を１としたときの２６ＣＮ－のスペクトル強度が、下記式（１）及び（２）を満たす、細胞吸着材料。
　０．５≦上記領域Ａにおける２６ＣＮ－のスペクトル強度≦３．０　・・・式（１）
　３．０≦上記領域Ａにおける２６ＣＮ－のスペクトル強度／上記領域Ｂにおける２６ＣＮ－のスペクトル強度≦２０．０　・・・式（２）
　本発明の細胞吸着材料は、ＬＡＰ陽性Ｔ細胞及びＬＡＰ陽性血小板のようなＬＡＰ陽性免疫細胞などの細胞を高効率に吸着除去できる。
ラジアルフロー型の細胞吸着カラムの一例の縦断面図である。 ２６ＣＮ－の質量スペクトルをマッピングし、２６ＣＮ－のスペクトル強度を解析した実施例１の細胞吸着材料の断面の一例である。 図２の拡大図である。 細胞吸着材料の断面における２６ＣＮ－のスペクトル強度のプロットプロファイルの一例である。 細胞吸着材料の断面における凸度の解析の一例である。
　本発明者らは、繊維状又は粒子状の水不溶性担体にポリアミン又は脂肪族アミンを結合させ、かつ飛行時間型２次イオン質量分析法により測定された上記繊維又は上記粒子の断面における２５Ｃ２Ｈ－のスペクトル強度を１としたときの２６ＣＮ－のスペクトル強度を所定の範囲とすることにより、ＬＡＰ陽性免疫細胞などの細胞を吸着除去可能であることを見出した。
　つまり本発明は、ポリアミン及び脂肪族アミンからなる群より選択される１種以上の窒素含有化合物が結合した水不溶性担体の繊維又は粒子であり、上記繊維又は上記粒子の断面の最表面から１．０μｍ以内の領域を領域Ａ、上記繊維又は上記粒子の断面の重心から半径０．５μｍ以内の領域を領域Ｂとし、飛行時間型２次イオン質量分析法により測定された上記各領域の２５Ｃ２Ｈ－のスペクトル強度を１としたときの２６ＣＮ－のスペクトル強度が、下記式（１）及び（２）を満たす、細胞吸着材料である。
　０．５≦上記領域Ａにおける２６ＣＮ－のスペクトル強度≦３．０　・・・式（１）
　３．０≦上記領域Ａにおける２６ＣＮ－のスペクトル強度／上記領域Ｂにおける２６ＣＮ－のスペクトル強度≦２０．０　・・・式（２）
　本発明は、ＬＡＰ陽性免疫細胞などの細胞吸着材料に関する。ＬＡＰ陽性免疫細胞とは、細胞膜表面にＬＡＰ－ＴＧＦ－β複合体が結合した細胞を意味する。ＬＡＰ陽性免疫細胞は、具体的にはＬＡＰ陽性Ｔ細胞、ＬＡＰ陽性血小板を意味するが、細胞膜表面にＬＡＰ－ＴＧＦ－β複合体が結合していれば、上記に限定されるものではない。
　本発明の細胞吸着材料は、ポリアミン及び脂肪族アミンからなる群より選択される１種以上の窒素含有化合物が結合した水不溶性担体の繊維又は粒子である。
　窒素含有化合物は、１種を単独で用いてもよく、複数種を組み合わせて用いてもよい。窒素含有化合物は、水不溶性担体に直接的に結合させてもよく、又はリンカーを介して間接的に結合させてもよい。
　本発明の細胞吸着材料における窒素含有化合物は、ＬＡＰ陽性免疫細胞との親和性が高いことから、一般式（Ｉ）で表されるポリアミンであることが好ましい。
　Ｒ１Ｒ２Ｎ－Ｘ－ＮＲ３Ｒ４　　・・・（Ｉ）
一般式（Ｉ）中、Ｘは、２～２０個の炭素原子を有する飽和若しくは不飽和の脂肪族炭化水素基、又は、３～２０個の炭素原子を有する飽和若しくは不飽和の脂肪族炭化水素基において１～５個の炭素原子を窒素原子で置き換えたヘテロ原子含有炭素鎖であり、該窒素原子に結合する水素原子は、アルキル基又はアミノ基を有するアルキル基で置換されていてもよい。Ｒ１～Ｒ４は、それぞれ独立に、水素原子又はアルキル基である。
　一般式（Ｉ）において、Ｘは、例えば、２～２０個（例えば、１６個以下、１４個以下、１２個以下、１０個以下、８個以下、６個以下、４個以下）の炭素原子を有する飽和又は不飽和の脂肪族炭化水素基である。一般式（Ｉ）において、Ｘは、例えば、３～２０個（例えば、１６個以下、１４個以下、１２個以下、１０個以下）の炭素原子を有する飽和又は不飽和の脂肪族炭化水素基において１～５個（例えば、１～３個）の炭素原子を窒素原子で置き換えたヘテロ原子含有炭素鎖であり、該窒素原子に結合する水素原子は、アルキル基又はアミノ基を有するアルキル基（例えば１～６個（好ましくは１～４個）の炭素原子を有するアルキル基。）で置換されていてもよい。そしてＲ１～Ｒ４は、それぞれ独立に、水素原子又はアルキル基である。アルキル基は、例えば１～６個（好ましくは１～４個）の炭素原子を有する。脂肪族炭化水素基は、直鎖状であってもよく、分岐鎖状であってもよい。
　一般式（Ｉ）で表されるポリアミンは、水不溶性担体との反応性が高いことから、下記一般式（ＩＩ）～（ＶＩＩ）のいずれかで表されるポリアミンであることがより好ましい。
　Ｈ２Ｎ－（ＣＨ２）ｐ１－ＮＨ２　・・・（ＩＩ）
一般式（ＩＩ）中、ｐ１は、２～１２（好ましくは２～６、２～５又は２～４）の整数であり、両末端の１級アミノ基の水素原子はアルキル基で置換されていてもよい。
　Ｈ２Ｎ－（ＣＨ２）ｐ１－ＮＨ－（ＣＨ２）ｐ２－ＮＨ２　・・・（ＩＩＩ）
一般式（ＩＩＩ）中、ｐ１及びｐ２は、それぞれ独立に、２～５（好ましくは２～４、２～３、２）の整数であり、２級アミノ基の水素原子は、アルキル基又はアミノ基を有するアルキル基で置換されていてもよく、両末端の１級アミノ基の水素原子はアルキル基で置換されていてもよい。
　Ｈ２Ｎ－（ＣＨ２）ｐ１－ＮＨ－（ＣＨ２）ｐ２－ＮＨ－（ＣＨ２）ｐ３－ＮＨ２　・・・（ＩＶ）
一般式（ＩＶ）中、ｐ１、ｐ２及びｐ３は、それぞれ独立に、２～５（好ましくは２～４、２～３、２）の整数であり、２級アミノ基の水素原子は、それぞれ独立に、アルキル基又はアミノ基を有するアルキル基で置換されていてもよく、両末端の１級アミノ基の水素原子はアルキル基で置換されていてもよい。
　Ｈ２Ｎ－（ＣＨ２）ｐ１－ＮＨ－（ＣＨ２）ｐ２－ＮＨ－（ＣＨ２）ｐ３－ＮＨ－（ＣＨ２）ｐ４－ＮＨ２　・・・（Ｖ）
一般式（Ｖ）中、ｐ１、ｐ２、ｐ３及びｐ４は、それぞれ独立に、２～５（好ましくは２～４、２～３、２）の整数であり、ｐ１、ｐ２、ｐ３及びｐ４の和は１７以下であり、２級アミノ基の水素原子は、それぞれ独立に、アルキル基又はアミノ基を有するアルキル基で置換されていてもよく、両末端の１級アミノ基の水素原子はアルキル基で置換されていてもよい。
　Ｈ２Ｎ－（ＣＨ２）ｐ１－ＮＨ－（ＣＨ２）ｐ２－ＮＨ－（ＣＨ２）ｐ３－ＮＨ－（ＣＨ２）ｐ４－ＮＨ－（ＣＨ２）ｐ５－ＮＨ２　・・・（ＶＩ）
一般式（ＶＩ）中、ｐ１、ｐ２、ｐ３、ｐ４及びｐ５は、それぞれ独立に、２～５（好ましくは２～４、２～３、２）の整数であり、ｐ１、ｐ２、ｐ３、ｐ４及びｐ５の和は１６以下であり、２級アミノ基の水素原子は、それぞれ独立に、アルキル基又はアミノ基を有するアルキル基で置換されていてもよく、両末端の１級アミノ基の水素原子はアルキル基で置換されていてもよい。
　Ｈ２Ｎ－（ＣＨ２）ｐ１－ＮＨ－（ＣＨ２）ｐ２－ＮＨ－（ＣＨ２）ｐ３－ＮＨ－（ＣＨ２）ｐ４－ＮＨ－（ＣＨ２）ｐ５－ＮＨ－（ＣＨ２）ｐ６－ＮＨ２　・・・（ＶＩＩ）
一般式（ＶＩＩ）中、ｐ１、ｐ２、ｐ３、ｐ４、ｐ５及びｐ６は、それぞれ独立に、２～５（好ましくは２～４、２～３、２）の整数であり、ｐ１、ｐ２、ｐ３、ｐ４、ｐ５及びｐ６の和は１５以下であり、２級アミノ基の水素原子は、それぞれ独立に、アルキル基又はアミノ基を有するアルキル基で置換されていてもよく、両末端の１級アミノ基の水素原子はアルキル基で置換されていてもよい。
　一般式（ＩＩ）～（ＶＩＩ）において、２級アミノ基の窒素原子に結合し得る「アルキル基又はアミノ基を有するアルキル基」の炭素原子数は、例えば１～６個であり、好ましくは１～５個であり、より好ましくは１～４個であり、さらに好ましくは１～３個である。一般式（ＩＩ）～（ＶＩＩ）において、両末端の１級アミノ基の窒素原子に結合し得る「アルキル基」の炭素原子数は、例えば１～６個であり、好ましくは１～５個であり、好ましくは１～４個であり、好ましくは１～３個である。これらの「アルキル基」は、直鎖状又は分岐鎖状であることが好ましい。
　一般式（Ｉ）で表されるポリアミンとしては、例えば、エチレンジアミン、Ｎ－エチルエチレンジアミン、ジエチレントリアミン（以下「ＤＥＴＡ」という）、Ｎ－エチルジエチレントリアミン、トリエチレンテトラアミン、テトラエチレンペンタミンが挙げられる。また、その他にも、３，３’－ジアミノジプロピルアミン、１，３－ジアミノプロパン、ノルスペルミジン、ホモスペルミジン、アミノプロピルカダベリン、アミノブチルカダベリン、ノルスペルミン、テルモスペルミン、アミノプロピルホモスペルミジン、カナバルミン、ホモスペルミン、アミノペンチルノルスペルミジン、Ｎ，Ｎ－ビス（アミノプロピル）カダベリン、カルドペンタミン、ホモカルドペンタミン、テルモペンタミン、カルドヘキサミン、ホモカルドヘキサミン、テルモヘキサミン、ホモテルモヘキサミン、Ｎ４－アミノプロピルノルスペルミジン、Ｎ４－アミノプロピルスペルミジン、Ｎ４－アミノプロピルノルスペルミンなどのポリアミンが挙げられる。
　本発明の細胞吸着材料において、窒素含有化合物が脂肪族アミンの場合、水不溶性担体との反応性及びＬＡＰ陽性免疫細胞との親和性の観点から、一般式（ＶＩＩＩ）で表される第１級脂肪族アミン又は一般式（ＩＸ）で表される第２級脂肪族アミンであることが好ましい。
　ＮＨ２Ｒ５　・・・（ＶＩＩＩ）
一般式（ＶＩＩＩ）中、Ｒ５は、１～１２個の炭素原子を有する飽和又は不飽和の脂肪族炭化水素基である。
　ＮＨＲ６Ｒ７　・・・（ＩＸ）
一般式（ＩＸ）中、Ｒ６及びＲ７は、それぞれ独立して、１～１２個の炭素原子を有する飽和又は不飽和の脂肪族炭化水素基である。
　一般式（ＶＩＩＩ）又は（ＩＸ）で表される脂肪族アミンにおいて、脂肪族炭化水素基は、直鎖状又は分岐鎖状の脂肪族炭化水素基であることが好ましく、直鎖状又は分岐鎖状の飽和脂肪族炭化水素基であることが好ましい。脂肪族炭化水素基の炭素数は、１～８個であることが好ましく、１～６個であることが好ましく、１～４個であることが好ましい。
　窒素含有化合物として好適な脂肪族アミンとしては、例えば、エチルアミン、プロピルアミン、ブチルアミン、ペンチルアミン、ヘキシルアミン、ヘプチルアミン、オクチルアミン、ノニルアミン、デシルアミンなどのモノアルキルアミン、ジエチルアミン、ジプロピルアミン、ジブチルアミン、ジヘプチルアミン、ジオクチルアミン、ジシクロヘキシルアミンなどのジアルキルアミンが挙げられる。
　また、その他の好適な窒素含有化合物としては、例えば、エチルアミン、エチレンジアミン、ジエチルアミン、Ｎ－エチルエチレンジアミン、ＤＥＴＡ、Ｎ－エチルジエチレントリアミン、トリエチレンテトラアミン又はテトラエチレンペンタミンが挙げられる。これらの中でも、両末端が１級アミンである直鎖状窒素含有化合物は反応性が高いことから、窒素含有化合物はエチレンジアミン、ＤＥＴＡ、トリエチレンテトラアミン又はテトラエチレンペンタミンが好ましい。窒素含有化合物は、市販されているもの又は公知の方法若しくはそれに準じた方法により製造したものを用いることができる。
　窒素含有化合物として一般式（Ｉ）で表されるポリアミンを用いる場合、複数のアミノ基が水不溶性担体に結合して、架橋構造を形成していてもよい。すなわち、窒素含有化合物として、一般式（Ｉ）で表されるポリアミンを水不溶性担体に結合させた場合、ポリアミン中のアミノ基の少なくとも２つが水不溶性担体に結合すると、架橋構造を形成することになる。
　窒素含有化合物を水不溶性担体に結合させる方法は、例えば、化学的方法により水不溶性担体の表面にリンカーを介して共有結合させる方法が挙げられる。
　窒素含有化合物と水不溶性担体とが直接的に共有結合している場合の共有結合としては、窒素含有化合物との反応性が高いことから、アミド結合、尿素結合、エーテル結合又はエステル結合などの電気的に中性の化学結合を有しているものが好ましく、アミド結合又は尿素結合を有しているものがより好ましい。
　窒素含有化合物がリンカーを介して水不溶性担体に結合している場合、つまり窒素含有化合物がリンカーと上記共有結合により結合している場合、水不溶性担体への窒素含有化合物の導入効率を上げる観点から、窒素含有化合物と水不溶性担体とをリンカーを介して結合する前のリンカー、すなわち反応前のリンカーが反応性官能基を有することが好ましい。反応前のリンカーが有する反応性官能基としては、例えば、ハロメチル基、ハロアセチル基、ハロアセトアミドメチル基若しくはハロゲン化アルキル基などの活性ハロゲン基、エポキシ基、カルボキシル基、イソシアネート基、チオイソシアネート基、又は酸無水物基などが挙げられる。これらの中でも、活性ハロゲン基（特にハロアセチル基）は、製造が容易であり、反応性が適度に高く、窒素含有化合物の固定化反応を温和な条件で遂行でき、生じる共有結合が化学的に安定であるため、好ましい。反応性官能基を有するリンカーを導入した水不溶性担体としては、例えば、クロルアセトアミドメチル基を付加したポリスチレン、クロルアセトアミドメチル基を付加したポリスルホン、又はクロルアセトアミドメチル基を付加したポリエーテルイミドなどが挙げられる。なお、これらの高分子は有機溶媒に対し可溶であり、成型しやすい利点がある。リンカーの導入量の目安は、リンカーの構造にもよるが、例えば、クロルアセトアミドメチル基の場合、水不溶性担体１ｇに対して、１ｍｍｏｌ以上１０ｍｍｏｌ以下が好ましい。リンカーの導入量は、水不溶性担体への窒素含有化合物の結合量に影響を与えるため、より好ましくは２ｍｍｏｌ以上であり、さらに好ましくは３ｍｍｏｌ以上である。また、水不溶性担体の強度を維持する観点から、リンカーの導入量は、より好ましくは８ｍｍｏｌ以下であり、さらに好ましくは７ｍｍｏｌ以下である。いずれの好ましい下限値もいずれの好ましい上限値と組み合わせることができる。
　水不溶性担体に反応性官能基を有するリンカーを導入する方法としては、反応性官能基を有するリンカーと水不溶性担体とを予め反応させる方法が挙げられる。例えば、水不溶性担体がポリスチレンで、反応性官能基を有するリンカーがクロルアセトアミドメチル基の場合は、ポリスチレンとＮ－メチロール－α－クロルアセトアミド（以下「ＮＭＣＡ」という）を反応させることでクロルアセトアミドメチル基を付加したポリスチレンを得ることができる。
　本発明の細胞吸着材料における窒素含有化合物は、該窒素含有化合物中のアミノ基（又は窒素原子）を介して水不溶性担体に結合していることが好ましい。
　窒素含有化合物が水不溶性担体に結合する際、窒素含有化合物中の結合位置に依存して、１級アミノ基、２級アミノ基、３級アミノ基、及び／又は４級アミノ基が結合後の窒素含有化合物中に存在することになる。例えば、一般式（Ｉ）で表されるポリアミンが水不溶性担体に結合する際、ポリアミン中の結合位置に依存して、１級アミノ基、２級アミノ基、３級アミノ基、及び／又は４級アミノ基が結合後のポリアミン中に存在することになる。
　細胞吸着材料中のアミノ基は、そのように生じた窒素含有化合物由来の１級アミノ基、２級アミノ基、３級アミノ基、及び４級アミノ基を含む。窒素含有化合物がリンカーを介して水不溶性担体と結合している場合、細胞吸着材料中のアミノ基は、リンカー由来の１級アミノ基、２級アミノ基、３級アミノ基、及び４級アミノ基を含む。また、本明細書において、「アミノ基量」とは、細胞吸着材料中の１級アミノ基、２級アミノ基、３級アミノ基、及び４級アミノ基量を意味する。
　本発明の細胞吸着材料中のアミノ基量は、２０μｍｏｌ／ｇ以上２００μｍｏｌ／ｇ以下であることが好ましい。アミノ基量は、十分な細胞吸着性能を付与する観点から、より好ましくは３０μｍｏｌ／ｇ以上であり、さらに好ましくは５０μｍｏｌ／ｇ以上である。また、白血球の一種である単球や顆粒球の吸着を抑制する観点やヘパリンなどの抗血液凝固剤の吸着を抑制できる観点から、アミノ基量は、より好ましくは１５０μｍｏｌ／ｇ以下であり、さらに好ましくは１００μｍｏｌ／ｇ以下である。いずれの好ましい下限値もいずれの好ましい上限値と組み合わせることができる。
　細胞吸着材料中のアミノ基量は、例えば、酸塩基逆滴定を利用してアミノ基を測定することにより、１級アミノ基量、２級アミノ基量、３級アミノ基量、及び４級アミノ基（４級アンモニウム基）量の和として求めることができる。すなわち、過剰量の水酸化ナトリウム水溶液を用いて、細胞吸着材料中の塩が付加されたアミノ基を脱塩し、中性になるまで十分に細胞吸着材料を洗浄、乾燥する。得られた細胞吸着材料中のアミノ基を、過剰の酸を含む標準溶液の一定量と反応させる。この際、アミノ基と反応せずに残った酸の量を、塩基を含む標準溶液で滴定することでアミノ基量を求めることができる。さらに具体的には、後述する「アミノ基量の測定」に記載の方法により求めることができる。なお、当該方法では、４級アミノ基を含む量が測定され得るが、本実施例では、４級アミノ基は用いる窒素含有化合物の構造上含まれることはなく、１級アミノ基量、２級アミノ基量、及び３級アミノ基量の和となる。
　細胞吸着材料中のアミノ基量は、例えば、水不溶性担体に直接又はリンカーを介して導入した、反応性官能基の結合量、窒素含有化合物の種類、窒素含有化合物の使用量を調整することで制御できる。水不溶性担体にリンカーを介して導入した反応性官能基の結合量は、例えば、リンカーが有する反応性官能基の種類、溶媒の種類、又は浸漬温度若しくは浸漬時間などの反応条件により制御できる。例えば、水不溶性担体がポリ芳香族ビニルを含む場合は、架橋剤を用いて、水不溶性担体と反応性官能基又は反応性官能基を有するリンカーの結合可能箇所を制御することもできる。
　本発明の細胞吸着材料において、窒素含有化合物がアミド基を有するリンカーを介して結合している場合、細胞吸着材料におけるアミド基量に対するアミノ基量の比率（アミノ基／アミド基比率）は０．００８以上０．０８０以下であることが好ましい。十分な細胞吸着性能を付与する観点から、アミド基量に対するアミノ基量の比率は、より好ましくは０．０１０以上であり、さらに好ましくは０．０１５以上であり、特に好ましくは０．０２０以上である。また、白血球の一種である単球や顆粒球の吸着を抑制し、ＬＡＰ陽性免疫細胞などの細胞を高効率で除去できることや、ヘパリンなどの抗血液凝固剤の吸着を抑制する観点から、アミド基量に対するアミノ基量の比率は、より好ましくは０．０７０以下であり、さらに好ましくは０．０６０以下であり、特に好ましくは０．０５０以下である。いずれの好ましい下限もいずれの好ましい上限値と組み合わせることができる。
　細胞吸着材料中のアミド基量は、例えば、細胞吸着材料中のアミド基を加水分解した後に滴定を行うことで測定できる。具体的には、後述する「アミノ基／アミド基比率の測定」に記載の方法により求めることができる。
　細胞吸着材料中のアミド基量は、例えば、反応性官能基としてアミド基を有するリンカーを使用し、水不溶性担体への該リンカーの導入量を調整することなどにより制御できる。より具体的な例としては、反応性官能基を有し、かつアミド基を有するリンカーであるＮＭＣＡを水不溶性担体に導入することにより、水不溶性担体にアミド基を付与できる。
　本発明の細胞吸着材料において、窒素含有化合物の導入量を増加し、細胞吸着性能を向上させる観点から、アミド基量は、２５００μｍｏｌ／ｇ以上が好ましく、より好ましくは２８００μｍｏｌ／ｇ以上である。一方で、リンカー導入反応による水不溶性担体の表面粗さの増大を抑制し、非特異的な吸着の増加を抑制する観点から、アミド基量は５０００μｍｏｌ／ｇ以下が好ましく、より好ましくは４０００μｍｏｌ／ｇ以下である。いずれの好ましい下限もいずれの好ましい上限値と組み合わせることができる。
　「水不溶性担体」とは、常温（２５℃）の水に浸漬した場合に質量変化を起こさない担体を意味し、具体的には、２５℃の水に１時間浸漬させた際の質量変化が５％以下である担体であることが好ましい。
　水不溶性担体の材料としては、例えば、ポリスチレンに代表されるポリ芳香族ビニル化合物、ポリエーテルスルホン、ポリスルホン、ポリアリールエーテルスルホン、ポリエーテルイミド、ポリイミド、ポリアミド、又はポリフェニレンサルファイドなどが好ましく挙げられる。水不溶性担体の材料は、市販されているもの又は公知の方法若しくはそれに準じた方法により製造したものを用いることができる。これらの高分子材料は、血液と接触した際に補体を活性化しやすいとされている水酸基を実質的に有しない材料である。これらの中でも単位質量当たりの芳香環の数が多く、窒素含有化合物を固定化しやすいことから、水不溶性担体の材料としてはポリスチレンが好ましい。これらの高分子材料は、単独で用いてもよく、複数種を組み合わせて用いてもよい。また、水不溶性担体は、ポリ芳香族ビニル化合物、例えば、ポリスチレンを含む高分子材料であることが好ましい。水不溶性担体としては、ポリスチレン部分に窒素含有化合物を固定化するための活性ハロゲン基などのリンカーを導入し易い点、ポリオレフィン部分により強度が補強され扱い易い点、及び耐薬品性の点から、ポリスチレンとポリオレフィンの共重合体、例えば、ポリスチレンとポリエチレンの共重合体又はポリスチレンとポリプロピレンの共重合体が好ましい。また、高分子材料は、ブレンド又はアロイ化したものでもよく、特に、ポリスチレンとポリオレフィンのポリマーアロイ、例えば、ポリスチレンとポリエチレンのポリマーアロイ又はポリスチレンとポリプロピレンのポリマーアロイは、耐薬品性を有し、物理形状を保持し易い観点から、好ましい。その中でも、血液体外循環療法で使用実績のあるポリスチレンとポリプロピレンのポリマーアロイが好ましい。また、用いる水不溶性担体は、アミノ基を実質的に有さないことが好ましい。
　細胞吸着材料中の窒素含有化合物の固定化量は、例えば、水不溶性担体への反応性官能基若しくは反応性官能基を有するリンカーの導入量、窒素含有化合物の種類、又は窒素含有化合物の使用量を調整することで制御できる。反応性官能基を有するリンカーの導入量は、例えば、反応性官能基を有するリンカーの種類、溶媒の種類、又は浸漬温度若しくは浸漬時間などの反応条件で制御できる。例えば、水不溶性担体がポリ芳香族ビニルを含む場合は、架橋剤を用いて、反応性官能基又は反応性官能基を有するリンカーの結合可能箇所を制御することもできる。
　本発明の細胞吸着材料における水不溶性担体は、繊維又は粒子である。特に、高次加工により血液流路を確保しつつ、血液との接触面積を増大させることが可能である点で、繊維が好ましい。
　水不溶性担体が繊維の場合、海島型の複合繊維であることが好ましく、材料としての強度を保つ観点から、島が補強材、海が水不溶性高分子と補強材のアロイである海島型の複合繊維が好ましく、さらに島がポリプロピレンであり、海がポリスチレンとポリプロピレンのアロイである海島型の複合繊維が好ましい。補強材としては、例えば、ポリアミド、ポリアクリロニトリル、ポリエチレン、ポリプロピレン、ナイロン、ポリメチルメタクリレート、又はポリテトラフルオロエチレンなどが挙げられる。なかでも、耐薬品性が高く、熱可塑性にも優れていることから、ポリプロピレンが好ましい。これらの高分子は、単独で用いてもよく、複数種を組み合わせて用いてもよい。
　水不溶性担体が繊維の場合、その高次加工品である編み地とすることが好ましい。編み地は、その編み目を制御することで血液流路を確保できるため、血液が繊維を通過する際の圧力損失を低減させることができる。また、繊維を合糸させて編み地を形成させる場合、合糸本数は好ましくは１０本以上１００本以下であり、より好ましくは３０本以上８０本以下である。合糸本数が１００本以下である場合、ＬＡＰ陽性免疫細胞が繊維束内に進入しやすくなるため、吸着性能が向上する。また、合糸本数が１０本以上である場合、編み地の形状の保持性が向上する。なお、いずれの好ましい下限値もいずれの好ましい上限値と組み合わせることができる。なお、編み地を作製する場合や合糸をさせる場合において、窒素含有化合物が結合した繊維、すなわち細胞吸着材料と窒素含有化合物が結合していない繊維を組み合わせてもよい。
　本発明の細胞吸着材料における水不溶性担体の繊維又は粒子の長径は、１５μｍ以上５０μｍ以下であることが好ましい。
　細胞吸着材料における水不溶性担体である繊維又は粒子の長径が１５μｍ以上５０μｍ以下の場合、細胞吸着材料のカラムへの充填密度を適切な大きさに維持しながら、細胞吸着材料の単位体積当たりの血液接触面積を大きくできるため、血小板や白血球などの非特異的な吸着を抑制し、かつＬＡＰ陽性免疫細胞の吸着性能が向上すると推測される。そのため、細胞吸着材料における水不溶性担体である繊維又は粒子の長径は、より好ましくは１７μｍ以上であり、さらに好ましくは１８μｍ以上であり、特に好ましくは１９μｍ以上である。一方で、繊維又は粒子の長径は、より好ましくは４０μｍ以下であり、さらに好ましくは３５μｍ以下であり、特に好ましくは３０μｍ以下である。いずれの好ましい下限値もいずれの好ましい上限値と組み合わせることができる。
　「繊維の長径」は、走査型電子顕微鏡などを用いて１０００倍以上３０００倍以下の倍率で繊維の伸長方向に垂直な断面の写真を撮影し、得られた繊維断面の画像を解析することで測定できる。具体的には、後述する「繊維の長径の測定」に記載の方法で測定できる。
　「粒子の長径」は、粒子のサンプル群１０個をランダムに採取して、走査型電子顕微鏡などを用いて１０００倍以上３０００倍以下の倍率で写真をサンプル群１個につきそれぞれ１枚撮影する。次に、写真１枚当たり１０個の粒子の長径を繊維断面の長径測定と同様の方法で測定する。そして、それらの値の平均値（計１００個の粒子の長径の平均値）を算出することにより、「粒子の長径」とする。なお、平均値は小数点第１位を四捨五入した値を用いる。
　本発明の細胞吸着材料は、細胞吸着材料である繊維又は粒子の断面の最表面から１．０μｍ以内の領域を領域Ａ、細胞吸着材料である繊維又は粒子の断面の重心から半径０．５μｍ以内の領域を領域Ｂとし、飛行時間型２次イオン質量分析法により測定された各領域の２５Ｃ２Ｈ－のスペクトル強度を１としたときの２６ＣＮ－のスペクトル強度が、下記式（１）及び（２）を満たす。
　０．５≦領域Ａにおける２６ＣＮ－のスペクトル強度≦３．０　・・・（１）
　３．０≦領域Ａにおける２６ＣＮ－のスペクトル強度／領域Ｂにおける２６ＣＮ－のスペクトル強度≦２０．０　・・・式（２）
　領域Ａにおける２６ＣＮ－のスペクトル強度が０．５未満である場合、水不溶性担体の表面に結合している窒素含有化合物量が少ないと推測され、十分なＬＡＰ陽性免疫細胞などの細胞の吸着性能が得られない。一方、領域Ａにおける２６ＣＮ－のスペクトル強度が３．０を超える場合には、水不溶性担体の表面に結合している窒素含有化合物量が過剰であると推測され、白血球の一種である単球や顆粒球などの吸着によりＬＡＰ陽性免疫細胞などの細胞の吸着が阻害される可能性がある。また、ヘパリンなどの抗血液凝固剤の吸着が多くなり、血液凝固が起こりやすくなる懸念がある。領域Ａにおける２６ＣＮ－のスペクトル強度／領域Ｂにおける２６ＣＮ－のスペクトル強度が３．０未満である場合は、十分なＬＡＰ陽性免疫細胞などの細胞の吸着性能が得られない。一方、領域Ａにおける２６ＣＮ－のスペクトル強度／領域Ｂにおける２６ＣＮ－のスペクトル強度が２０．０を超える場合は、領域Ａにおける２６ＣＮ－のスペクトル強度が２．０を超える場合と同様に、不溶性担体の表面に結合している窒素含有化合物量が過剰であると推測され、白血球の一種である単球や顆粒球などの吸着によりＬＡＰ陽性免疫細胞などの細胞の吸着が阻害される可能性がある。したがって、細胞吸着材料である繊維又は粒子の断面における２６ＣＮ－のスペクトル強度が式（１）及び式（２）を満たすことが要求されるものと推測される。領域Ａにおける２６ＣＮ－のスペクトル強度は、好ましくは０．６以上であり、より好ましくは０．９以上であり、さらに好ましくは１．２以上である。一方で、好ましくは２．５以下であり、より好ましくは２．０以下であり、さらに好ましくは１．８以下であり、特に好ましくは１．６以下である。領域Ａにおける２６ＣＮ－のスペクトル強度／領域Ｂにおける２６ＣＮ－のスペクトル強度は、好ましくは５．０以上であり、より好ましくは６．０以上である。一方で、好ましくは１５．０以下であり、より好ましくは１２．０以下であり、さらに好ましくは９．０以下であり、特に好ましくは７．０以下である。いずれの好ましい下限値もいずれの好ましい上限値と組み合わせることができる。
　「領域Ａ及び領域Ｂにおける２６ＣＮ－のスペクトル強度」は、細胞吸着材料の断面における２５Ｃ２Ｈ－の質量スペクトル及び２６ＣＮ－の質量スペクトルを飛行時間型２次イオン質量分析法（ＴＯＦ－ＳＩＭＳ法：Ｔｉｍｅ　ｏｆ　Ｆｌｉｇｈｔ　Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ　Ｉｏｎ　Ｍａｓｓ　Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）により測定し、それぞれの強度をマッピングし、解析することで求めることができる。より具体的には、後述する「２６ＣＮ－のスペクトル強度の測定」に記載の方法により求めることができる。
　領域Ａにおける２６ＣＮ－のスペクトル強度及び領域Ｂにおける２６ＣＮ－のスペクトル強度は、水不溶性担体への窒素含有化合物導入量や、水不溶性担体へ窒素含有化合物を結合する際の反応溶媒の種類などにより制御できる。例えば、反応溶媒と水不溶性担体との親和性が低いほど、領域Ｂにおける２６ＣＮ－のスペクトル強度は小さくなる。
　本発明の細胞吸着材料である繊維又は粒子の最頻細孔半径は１０ｎｍ以上１００ｎｍ以下であり、かつ細胞吸着材料における全細孔の総体積に対する、細孔半径が１０ｎｍ以上２５０ｎｍ以下の細孔の総体積が５０％以上１００％以下であることが好ましい。本明細書における「最頻細孔半径」とは、細胞吸着材料である繊維又は粒子の細孔半径の頻度を測定した時に、最も多くの頻度をもつ細孔半径を意味する。なお、細胞吸着材料の全細孔の総体積とは、測定時に観測された全ての細孔の体積を合計したものを意味する。細孔半径が１０ｎｍ以上２５０ｎｍ以下の細孔の総体積とは、該当する半径を有する全ての細孔の体積を合計したものを意味する。そして、細胞吸着材料における全細孔の総体積に対する、細孔半径が１０ｎｍ以上２５０ｎｍ以下の細孔の総体積、つまり「細孔半径が１０ｎｍ以上２５０ｎｍ以下の細孔の総体積」／「細胞吸着材料の全細孔の総体積」のことを、総体積比、という。
　細胞吸着材料の最頻細孔半径及び総体積比が所定の範囲に含まれる場合に、本発明の効果が得られる理由・メカニズムについては、以下のように推測される。細胞吸着材料の最頻細孔半径が１０ｎｍ未満である場合、タンパク質が吸着されやすくなることで、免疫細胞の非特異的な吸着が促進される可能性がある。一方、細胞吸着材料の最頻細孔半径が１００ｎｍを超える場合、細胞吸着材料の表面の凹凸が小さくなり、ＬＡＰ陽性免疫細胞などの細胞の吸着性能が低下する可能性がある。また、細胞吸着材料における全細孔の総体積に対する、細孔半径が１０ｎｍ以上２５０ｎｍ以下の細孔の総体積が占める割合が５０％未満である場合、同じくタンパク質や免疫細胞の非特異的な吸着を誘発する可能性がある。したがって、細胞吸着材料の最頻細孔半径及び総体積比が、所定の範囲に含まれることが好ましいものと推測される。
　最頻細孔半径及び総体積比は、水不溶性担体を有機溶媒に浸漬させることや水不溶性担体へ窒素含有化合物を結合する際の反応溶媒の種類などにより制御できる。例えば、反応溶媒と水不溶性担体との親和性が高いほど、最頻細孔半径及び総体積比は小さくなる。
　細胞吸着材料である繊維又は粒子の最頻細孔半径は、より好ましくは１５ｎｍ以上であり、さらに好ましくは２０ｎｍ以上であり、さらにより好ましくは３０ｎｍ以上であり、特に好ましくは４０ｎｍ以上である。一方で、最頻細孔半径は、より好ましくは９５ｎｍ以下であり、さらに好ましくは８５ｎｍ以下であり、特に好ましくは７５ｎｍ以下である。いずれの好ましい下限値もいずれの好ましい上限値と組み合わせることができる。また、細胞吸着材料における全細孔の総体積に対する、細孔半径が１０ｎｍ以上２５０ｎｍ以下の細孔の総体積が占める割合、つまり総体積比は、より好ましくは７０％以上であり、さらに好ましくは８０％以上であり、特に好ましくは９０％以上である。
　「最頻細孔半径」、「細孔半径が１０ｎｍ以上２５０ｎｍ以下の細孔の総体積」、及び「細胞吸着材料の全細孔の総体積」は、示差走査熱量測定法（ＤＳＣ法：Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ　Ｓｃａｎｎｉｎｇ　Ｃａｌｏｒｉｍｅｔｒｙ）を測定し、解析することで算出できる。具体的には後述する「最頻細孔半径及び総体積比の測定」に記載の方法により求めることができる。
　本発明の細胞吸着材料である繊維又は粒子の断面の真円度は、０．７５以上０．９５以下であることが好ましい。細胞吸着材料の断面の真円度はより好ましくは０．７７以上であり、さらに好ましくは０．８０以上である。一方で、真円度は、より好ましくは０．９０以下である。いずれの好ましい下限値もいずれの好ましい上限値と組み合わせることができる。断面の真円度が０．７５以上０．９５以下の範囲である場合、単球や顆粒球の細胞吸着材料への非特異的吸着が抑制され、ＬＡＰ陽性免疫細胞が高効率で除去できると推測される。
　「真円度」とは、対象の円形形体である細胞吸着材料が真円からどれだけ逸脱しているかを表す指標である。真円度は０．００以上１．００以下の値をとり、１．００に近い値であるほど、対象の円形形体が真円に近い形体であることを意味する。真円度は、繊維断面又は粒子全体の画像を画像解析ソフトウェアで解析することで算出できる。具体的には後述する「真円度の測定」に記載の方法で算出できる。
　真円度は、水不溶性担体を有機溶媒に浸漬させることや水不溶性担体へ窒素含有化合物を結合する際の反応溶媒の種類などにより制御できる。例えば、反応溶媒と水不溶性担体との親和性が低いほど、真円度は大きくなる。
　本発明の細胞吸着材料である繊維又は粒子の断面の凸度は、０．９２以上１．００以下であることが好ましい。細胞吸着材料表面の凹凸を少なくすることにより、単球や顆粒球の細胞吸着材料への非特異的吸着が抑制され、細胞吸着性能が向上することから、細胞吸着材料の断面の凸度は、より好ましくは０．９４以上であり、さらに好ましくは０．９６以上である。
　「凸度」とは、対象の形体である細胞吸着材料の断面における凹みの少なさを表す指標である。凸度は０．００以上１．００以下の値をとる、すなわち上限は１．００であり、１．００に近い値であるほど、対象の形体の凹みが少ないことを意味する。凸度は、繊維又は粒子の断面の画像を画像解析ソフトウェアで解析することで算出できる。具体的には後述する「凸度の測定」に記載の方法で算出できる。
　凸度は、真円度と同様に、水不溶性担体を有機溶媒に浸漬させることや水不溶性担体へ窒素含有化合物を結合する際の反応溶媒の種類などにより制御できる。例えば、反応溶媒と水不溶性担体との親和性が低いほど、凸度は大きくなる。
　本発明の吸着材料である水不溶性担体の繊維又は粒子における、表面の算術平均粗さは、０．０１μｍ以上１．０μｍ以下であることが好ましい。
　「算術平均粗さ」とは、粗さ曲線から、その平均線の方向に基準長さＬのみを抜き取り、この抜き取り部分の平均線の方向にｘ軸を、縦倍率の方向にｙ軸を取り、粗さ曲線をｙ＝ｆ（ｘ）で表した時に、以下の式（３）で求められる値であり、ＪＩＳ　Ｂ　０６０１－２００１の算術平均粗さ（Ｒａ）を意味する。算術平均粗さは、例えば、形状測定レーザーマイクロスコープで測定できる。測定状態としては、細胞吸着材料が乾燥した状態で行うことが好ましい。また、繊維のように配向性のある場合は、長手方向の値を測定する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000001
　水不溶性担体の表面の算術平均粗さは、０．０１μｍ以上１．００μｍ以下がより好ましい。細胞吸着材料の表面の算術平均粗さが０．０１μｍ以上１．００μｍ以下の範囲である場合、ＬＡＰ陽性細胞の吸着性能を維持し、かつ単球や顆粒球の非特異的な吸着を抑制することが可能であると推測される。そのため、水不溶性担体の表面の算術平均粗さは、より好ましくは０．０５μｍ以上、さらに好ましくは０．１０μｍ以上、さらにより好ましくは０．２０μｍ以上、特に好ましくは０．３０μｍ以上、最も好ましくは０．４０μｍ以上である。一方で、細胞吸着材料の表面の算術平均粗さは、より好ましくは０．９０μｍ以下、さらに好ましくは０．８０μｍ以下である。いずれの好ましい下限値もいずれの好ましい上限値と組み合わせることができる。なお、細胞吸着材料である繊維又は粒子の好ましい長径、細胞吸着材料の好ましい真円度及び凸度、並びに細胞吸着材料の表面の好ましい算術平均粗さの値は、任意に組み合わせることができる。
　細胞吸着材料の表面の算術平均粗さは、水不溶性担体を有機溶媒に浸漬させることなどにより制御できる。例えば、水不溶性担体としてポリ芳香族ビニル化合物とポリプロピレンを混練させて得た高分子を、ポリ芳香族ビニル化合物の一部が可溶であり、かつ、ポリプロピレンが不溶である溶媒に浸漬する方法が挙げられる。細胞吸着材料の表面の算術平均粗さは、高分子の種類、高分子の分子量、溶媒の種類、浸漬温度、浸漬時間などで制御できる。さらには、ポリ芳香族ビニルについては、架橋剤を導入することにより、溶媒への可溶性を制御するなどの方法も採用することができる。さらには、上記の反応は、窒素含有化合物の導入反応と同時に行うことも可能である。
　本発明の細胞吸着材料は、免疫細胞を吸着する細胞吸着材料であることが好ましい。また、免疫細胞がＬＡＰ陽性免疫細胞を吸着する細胞吸着材料であることが好ましい。そして、ＬＡＰ陽性免疫細胞のなかでも、ＬＡＰ陽性Ｔ細胞又はＬＡＰ陽性血小板を吸着する細胞吸着材料であることが好ましく、ＬＡＰ陽性ＣＤ４陽性Ｔ細胞又はＬＡＰ陽性ＣＤ４２ｂ陽性血小板を吸着する細胞吸着材料であることがより好ましい。
　本発明の細胞吸着材料においては、ＬＡＰ陽性Ｔ細胞の吸着率は、６０％以上であることが好ましく、より好ましくは７０％以上であり、さらに好ましくは８０％以上である。ＬＡＰ陽性血小板の吸着率は、７０％以上であることが好ましく、より好ましくは８０％以上であり、さらに好ましくは９０％以上である。ここで、ＬＡＰ陽性Ｔ細胞としては、ＣＤ４陽性Ｔ細胞を対象とし、血小板としては、ＣＤ４２ｂ陽性血小板とする。上記の吸着率の試験系としては、例えば、ヒト血液を用いた吸着カラム通液式免疫細胞吸着試験（本実施例参照）が挙げられる。また、評価系としては、例えば、免疫細胞の表面抗原を指標としたフローサイトメトリーによる分析（本実施例参照）が挙げられる。
　本発明の細胞吸着カラムは、本発明の細胞吸着材料を内蔵する。
　「細胞吸着カラム」とは、少なくとも血液入口部、ケース部、血液出口部を有しており、ケース部には細胞吸着材料が充填されているものを意味する。細胞吸着カラムとしては、例えば、ラジアルフロー型の細胞吸着カラムが挙げられる。上述したように、細胞吸着材料の形状としては、繊維が好ましく、編み地が好ましい。
　本発明の細胞吸着カラムの内部の構成の一例を、図１に沿って説明する。図１において、１は容器本体であり、その長手方向の前端と後端とに流入口２と流出口３とを有する。流入口２の内側には、フィルター４と円板状の仕切板５が設けられ、また、流出口３の内側には、フィルター６と円板状の仕切板７が設けられている。２枚の仕切板５、７のうち、前側（流入口側）の仕切板５には中心部に開口５ａが設けられ、また、後側の仕切板７の中心部には支持突起７ａが設けられている。また、仕切板７の外周には、多数の透孔７ｂが周方向に間欠的に設けられている。さらに仕切板５の開口５ａと仕切板７の支持突起７ａとの間に、１本のパイプ８が掛け渡されている。パイプ８は血液を誘導する流路９を内側に形成し、かつ周壁に多数の貫通孔１０を有する。また、パイプ８は、その前端で仕切板５の開口５ａに連通しており、また、その後端は仕切板７の支持突起７ａにより閉止されている。このパイプ８の外周に、細胞吸着材料１１が何重にも複数層に巻き付けられている。この細胞吸着カラムを循環法に使用するときは、流入口２と流出口３に、血液プールとの間に循環回路を形成したチューブを連結し、その血液プールから取り出される血液を流入口２に供給し、内部の細胞吸着材料１１で対象吸着物質（ＬＡＰ陽性免疫細胞）を除去して流出口３から流出し、再び血液プールに戻すように循環させる。カラム内では、流入口２からフィルター４を経て流路９に侵入した血液は、流路９を移動しながら貫通孔１０から順次細胞吸着材料１１に浸入する。そして、半径方向のいずれかへ移動する血液中の細胞などを吸着する。細胞などが除去された血液は、仕切板７の外周の多数の透孔７ｂから流出し、フィルター６を経て流出口３から流出する。上記の例では血液が開口５ａからパイプ８内の流路９を流動しながら貫通孔１０から流出するが、細胞吸着カラムにおける血液の移動方向は、上記とは逆にして、流出口３から血液を供給し、流入口２から流出させるようにしてもよい。
　ＬＡＰ陽性免疫細胞などの吸着率を上げるためには、カラム内の血液線速度も重要である。すなわち、血液線速度が速い場合、ＬＡＰ陽性免疫細胞が細胞吸着材料と十分に相互作用するのが困難となる可能性がある。一方、血液線速度が遅い場合、血小板やタンパク質などの他の血液成分が細胞吸着材料に非特異的に付着し、細胞吸着材料とＬＡＰ陽性免疫細胞などとの相互作用が阻害される場合がある。したがって、細胞吸着カラム入口の流速Ｓｉｎが５０ｃｍ３／分のときの細胞吸着材料内の血液線速度の最大値は５０ｃｍ／分以下であることが好ましく、２５ｃｍ／分以下であることが好ましい。また、細胞吸着カラム入口の流速が５０ｃｍ３／分であるときの細胞吸着材料内の血液線速度の最小値は、０．１ｃｍ／分以上であることが好ましく、０．５ｃｍ／分以上であることが好ましい。ここで、血液線速度は、計算によって求められるものであり、例えば、下記のラジアルフロー型の細胞吸着カラムの場合、細胞吸着材料内の血液線速度の最大値（Ｖｍａｘ）は、中心パイプの側面に空いた開口部の合計面積（Ｓｐ）と細胞吸着カラム入口の流速Ｓｉｎ（５０ｃｍ３／分）から、下記式（４）により算出される。
　Ｖｍａｘ（ｃｍ／分）＝　Ｓｉｎ（ｃｍ３／分）／Ｓｐ（ｃｍ２）・・・式（４）
　また、最小値（Ｖｍｉｎ）は中心パイプに巻き付けた細胞吸着材料の最外周面の面積（Ｓｏ）と細胞吸着カラム入口の流速Ｓｉｎ（５０ｃｍ３／分）から、下記式（５）により算出される。
　Ｖｍｉｎ（ｃｍ／分）＝　Ｓｉｎ（ｃｍ３／分）／Ｓｏ（ｃｍ２）・・・式（５）
　さらには、本発明の細胞吸着カラムとしては、供給された血液を流出するために設けられた貫通孔を長手方向の側面に備える中心パイプと、上記中心パイプの周りに細胞吸着材料が充填されており、流入する上記血液が、上記中心パイプの中を通るように上記中心パイプの上流端に連通され、上記血液が上記中心パイプを通過せずに細胞吸着材料と接触するのを防ぐように配置されたプレートＡと、上記中心パイプの下流端を封鎖し、細胞吸着材料を上記中心パイプの周りの空間に固定するように配置されたプレートＢと、を備えるラジアルフロー型の細胞吸着カラムが好ましい。これは、血液が細胞吸着材料を均一に流れるようにするためである。なお、上記中心パイプの貫通孔の開口率が低い場合、この部分で圧力損失が生じ易くなるために、顆粒球、単球及び血小板が活性化し、これらが細胞吸着材料に非特異的に付着しやすくなる。そのため、ＬＡＰ陽性免疫細胞などの吸着選択性が低下する可能性がある。また、開口率が高い場合は、パイプの強度が低下すること、血液入口部付近の貫通孔でショートパスを起こしやすくなるなどの課題が出てくる可能性がある。したがって、貫通孔の開口率は２０％以上８０％以下であることが好ましく、３０％以上６０％以下であることが好ましい。
　「ラジアルフロー型」とは、カラム内部の血液の流れ方をいう。カラムの入口と出口に血液が垂直方向に流した場合、カラム内部で、水平方向の血液流れが存在する場合に、ラジアルフロー型と呼ぶ。
　「貫通孔の開口率」とは、下記式（６）で求められる値を意味する。
　貫通孔の開口率（％）＝パイプの長手方向の側面に形成された貫通孔の面積の和／パイプの側面の面積×１００・・・式（６）
　本発明の細胞吸着カラムは、血液浄化療法に用いることができる。本発明の細胞吸着カラムを血液浄化用カラムとして使用することで、血小板や白血球などの非特異的な吸着を抑制しつつ、血液中からＬＡＰ陽性免疫細胞などを高効率で除去できる。例えば、血液を体外循環させて、本発明の細胞吸着カラムに通すことにより、血液中からＬＡＰ陽性免疫細胞などを高効率で除去できる。すなわち、本発明の細胞吸着カラムは、体外循環用カラムとして用いることができる。より具体的には、本発明の細胞吸着カラムは、がん患者の血液中からＬＡＰ陽性免疫細胞を除去するがん治療に用いることができる。また、樹状細胞やナチュラルキラー細胞などを活性化させる細胞輸注治療と併用することも可能である。
　以下、実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明はこれらの例によって限定されるものではない。
　＜２６ＣＮ－のスペクトル強度の測定＞
　乾燥させた吸着材料である窒素含有化合物が結合した水不溶性担体の繊維又は粒子を樹脂包埋し、ウルトラミクロトームを用いて吸着材料の断面を作製した。上記水不溶性担体が繊維である場合は、繊維の伸長方向に対して垂直な断面を作製し、上記水不溶性担体が粒子である場合は、粒子の長軸方向に対して垂直な断面を作製した。上記断面全体に対して、以下の条件でＴＯＦ－ＳＩＭＳ法を用いて、一次イオンの照射により上記断面から放出された負二次イオンの一種である２５Ｃ２Ｈ－の質量スペクトル及び２６ＣＮ－の質量スペクトルを測定した。
　測定装置：ＴＯＦ．ＳＩＭＳ　５（ＩＯＮ－ＴＯＦ社製）
　一次イオン：Ｂｉ３ ＋＋
　１次イオン加速電圧：３０ｋＶ
　パルス幅：１２５．０ｎｓ
　２次イオン極性：正及び負
　スキャン数：９６　ｓｃａｎ／ｃｙｃｌｅ
　Ｃｙｃｌｅ　Ｔｙｍｅ：２３０μｓ
　測定範囲：５０×５０μｍ２
　質量範囲（ｍ／ｚ）：０～８００
　細胞吸着材料の断面における２５Ｃ２Ｈ－の質量スペクトル強度を細胞吸着材料の断面の画像にそれぞれマッピングした（画像Ｘ）。次に細胞吸着材料の断面における２６ＣＮ－の質量スペクトルについても、画像Ｘと同様にマッピングした（画像Ｙ）。このとき、画像Ｘ及び画像Ｙにおいて、５０μｍ×５０μｍの視野に１つの細胞吸着材料の断面像が完全に入るように、撮影領域を選定した。さらに、画像Ｘ及び画像Ｙのそれぞれについて、画像解析ソフトウェアのＩｍａｇｅＪを用いて、以下の計測を行った。まず、図２に示すように細胞吸着材料の断面の外周２１を囲って選択し、細胞吸着材料の断面の重心２２を測定した。次に、上記重心２２を通り、細胞吸着材料の断面を縦断又は横断する直線２３を引いた。上記直線２３と細胞吸着材料の断面の外周２１との２つの交点２４ａ、２４ｂから、それぞれ１．０μｍ以内の領域を領域Ａ（３１）と定め、細胞吸着材料の断面の重心から半径０．５μｍ以内の領域を領域Ｂ（３２）と定めた（図３）。領域Ａ及び領域Ｂのそれぞれについて、画像Ｘの輝度を１としたときの画像Ｙの輝度を求め、領域Ａ及び領域Ｂにおける２６ＣＮ－のスペクトル強度とした。その一例を図４に示した。細胞吸着材料の断面を縦断又は横断する異なる直線を４５°毎に合計４本引き、各直線について上記の測定を行い、得られた値の平均値を領域Ａ及び領域Ｂにおける２６ＣＮ－のスペクトル強度とした。なお、平均値は小数点以下第２位を四捨五入した値を用いた。
　＜最頻細孔半径及び総体積比の測定＞
　最頻細孔半径は、細胞吸着材料の細孔半径に対して、対数微分細孔体積（ｄＶ／ｄ（ｌｏｇｒ）、ここでＶは細胞吸着材料１ｇ当たりの細孔体積、ｒは細孔半径を示す）をプロットした図上において、対数微分細孔体積の値が最大となる細孔半径、すなわち最も多くの頻度をもつ細孔半径である。細孔半径及び細孔体積は、ＤＳＣ装置（ＤＳＣ　Ｑ１００、ＴＡ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社製）を用いて、細孔内の水の毛管凝集による氷点降下度を測定し、求めた。まず、蒸留水に浸漬した状態の細胞吸着材料から過剰な表面付着水を除去し、ＤＳＣ装置を用いて細胞吸着材料を－５５℃に急冷後、０．３℃／分で５℃まで昇温させて測定し、得られた融点分布曲線のピークトップ温度を融点として、融点降下量を求め、下記式（７）より細孔半径を算出した。なお、細孔半径は、小数点第１位を四捨五入した値を用いた。
　細孔半径（ｎｍ）＝（３３．３０－０．３１８１×融点降下量［℃］）／融点降下量［℃］・・・式（７）
　細孔体積は、下記式（８）より算出した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000002
式（８）中、Ｖｆｐは細胞吸着材料１ｇ当たりの細孔体積、ｒは細孔半径である。
　全細孔の総体積は、ＤＳＣ測定で観測された細胞吸着材料１ｇ当たりの全ての細孔の体積を合計し、求めた。細孔半径が１０ｎｍ以上２５０ｎｍ以下の細孔の総体積は、全細孔の総体積と同様に、ＤＳＣ測定で観測された細胞吸着材料１ｇ当たりの細孔半径が１０ｎｍ以上２５０ｎｍ以下の全ての細孔の体積を合計し、求めた。全細孔の総体積に対する細孔半径が１０ｎｍ以上２５０ｎｍ以下の細孔の総体積の割合を計算し、総体積比を算出した。なお、上記測定、算出方法については、文献（Ｋａｚｕｈｉｋｏ　Ｉｓｈｉｋｉｒｉｙａｍａ　ｅｔ　ａｌ．；　ＪＯＵＲＮＡＬ　ＯＦ　ＣＯＬＬＯＩＤ　ＡＮＤ　ＩＮＴＥＲＦＡＣＥ　ＳＣＩＥＮＣＥ，ＶＯＬ．１７１，１０３－１１１（１９９５））の記載を参照した。
　＜繊維の長径の測定＞
　「繊維の長径」は、以下の方法により求めた。細胞吸着材料である、繊維形状の水不溶性担体のサンプル１００本をランダムに採取し、走査型電子顕微鏡を用いて３０００の倍率で断面（繊維の伸長方向に垂直な断面）の写真をサンプル１本につきそれぞれ１枚撮影した。次に、画像解析ソフトウェアのＩｍａｇｅＪを用いてそれぞれの繊維断面の長径を測定した。そして、それらの値の平均値（計１００本の繊維断面の長径の平均値）を算出し、小数点第１位を四捨五入した値を、繊維の長径とした。
　＜真円度の測定＞
　細胞吸着材料が繊維である場合、以下の方法で測定した。上述の「２６ＣＮ－のスペクトル強度の測定」で得られた対象の円形形体である細胞吸着材料の断面の画像Ｙを画像解析ソフトウェアのＡｖｉｚｏ及びＩｍａｇｅＪを使用し、画像Ｙ中の対象の円形形体である細胞吸着材料の外周を囲い、周長を測定し、下記式（９）より真円度を算出し、小数点第３位を四捨五入した値を用いた。
　真円度＝４π×Ｓ／ａ２　・・・式（９）
式（９）中、Ｓは、対象の円形形体の面積、ａは、対象の円形形体の周長である。
　＜凸度の測定＞
　上述の「２６ＣＮ－のスペクトル強度の測定」で得られた細胞吸着材料の断面の画像Ｙを画像解析ソフトウェアのＡｖｉｚｏ及びＩｍａｇｅＪを使用し、解析を行った。その一例を図５に示した。画像Ｙ中の細胞吸着材料の断面の外周２１を囲い、細胞吸着材料の断面積及び細胞吸着材料の断面の外周に対する凸包４１の面積を求め、下記式（１０）より凸度を算出し、小数点第３位を四捨五入した値を用いた。
　凸度＝ＳＡ／ＳＣ　・・・式（１０）
式（１０）中、ＳＡは、細胞吸着材料の断面積、ＳＣは、細胞吸着材料の断面の外周に対する凸包４１の面積である。凸包とは、与えられた点をすべて包含する最小の凸多角形を意味する。
　＜算術平均粗さの測定＞
　形状測定レーザー顕微鏡（カラー３Ｄレーザー顕微鏡 ＶＫ－９７００、キーエンス社製）を用いて、１００倍の倍率で、乾燥状態の細胞吸着材料の表面を観察し、粗さ曲線を測定した。得られた粗さ曲線において、その平均線の方向に基準長さＬのみを抜き取り、この抜き取り部分の平均線の方向にｘ軸を、縦倍率の方向にｙ軸を取り、粗さ曲線をｙ＝ｆ（ｘ）で表し、下記式（３）により算術平均粗さを算出した（ＪＩＳ　Ｂ　０６０１－２００１準拠）。基準長さＬを５０μｍとし、位置が異なる１０箇所で測定した値の平均値を、細胞吸着材料の表面の算術平均粗さとし、小数点第３位を四捨五入した値を用いた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000003
　＜アミノ基量の測定＞
　まず、細胞吸着材料１．０ｇに６ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム水溶液を５０ｍＬ添加し、室温で１時間撹拌した。上記細胞吸着材料にイオン交換水５０ｍＬを添加して洗浄し、上記イオン交換水のｐＨが７になるまで洗浄を繰り返すことで、脱塩処理された細胞吸着材料を得た。脱塩後の細胞吸着材料を２５℃の減圧下で４８時間静置して乾燥した。乾燥後の吸着材料の質量を測定し、０．１ｍｏｌ／Ｌ塩酸を４０ｍＬ加え、室温で３０分間撹拌した。撹拌後、細胞吸着材料を取り出して残った溶液（以下「分注溶液１」という）のみを５ｍＬ抜き取り、０．１ｍｏｌ／Ｌの水酸化ナトリウム水溶液を０．１ｍＬ滴下した（以下「測定溶液１」という）。滴下後１０分間撹拌し、測定溶液１のｐＨを測定した。測定溶液１のｐＨが８．５を超えるまで、滴下後１０分間の撹拌及びｐＨ測定を同様に繰り返した。測定溶液１のｐＨが８．５を超えた際の水酸化ナトリウム水溶液の滴下量を細胞吸着材料１ｇ当たりの滴定量とした。細胞吸着材料１ｇ当たりの適定量と下記式（１１）を用いて、アミノ基量を算出し、小数点第１位を四捨五入した値を用いた。
細胞吸着材料１ｇ当たりのアミノ基量（μｍｏｌ／ｇ）＝ＶＨＣｌ－１／ＶＳ１×ＶＦ／ＭＳ１×ＣＮａＯＨ－１×１０００　・・・式（１１）
式（１１）中、ＶＨＣｌ－１は添加した０．１ｍｏｌ／Ｌ塩酸の量（４０ｍＬ）、ＶＳ１は分注溶液１の量（５ｍＬ）、ＶＦは滴定量（ｍＬ）、ＭＳ１は乾燥後の細胞吸着材料の質量（ｇ）、ＣＮａＯＨ－１は水酸化ナトリウム水溶液濃度（０．１ｍｏｌ／Ｌ）を意味する。
　＜アミノ基／アミド基比率の測定＞
　アミド基量は、下記の方法で求めた。まず、乾燥させた細胞吸着材料１．０ｇに６ｍｏｌ／Ｌ塩酸を１００ｍＬ添加し、１１０℃で２０時間加水分解した。加水分解後の細胞吸着材料をイオン交換水で洗浄し、６ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム水溶液５０ｍＬを添加した。上記細胞吸着材料を３０分以上転倒撹拌した後、イオン交換水を添加して洗浄した。上記細胞吸着材料に添加したイオン交換水のｐＨが７になるまで洗浄を繰り返した後、上記細胞吸着材料を２５℃の減圧下で４８時間静置して乾燥させた。次に、乾燥後の細胞吸着材料の質量を測定し、０．１ｍｏｌ／Ｌ塩酸を３０ｍＬ加え、３０分間転倒撹拌した。細胞吸着材料を取り出して残った溶液（以下「分注溶液２」という）に対し、メチルレッド溶液及びフェノールフタレイン溶液を添加した（以下「測定溶液２」という）。測定溶液に０．０２ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム水溶液を滴下していき、測定溶液の色が黄色になった時点を終点とした。細胞吸着材料１ｇ当たりのアミド基の量は、下記式（１２）から算出し、小数点第１位を四捨五入した値を用いた。
　細胞吸着材料１ｇ当たりのアミド基量（μｍｏｌ／ｇ）＝（ＶＳ２×ＣＨＣｌ－２／ＣＮａＯＨ－２－ＶＮａＯＨ－２）×ＣＮａＯＨ－２×（ＶＨＣｌ－２／ＶＳ２）／ＭＳ２×１０００　・・・式（１２）
式（１２）中、ＶＳ２は分注溶液２の量（ｍＬ）、ＣＨＣｌ－２は２回目に添加した塩酸の濃度（０．１ｍｏｌ／Ｌ）、ＣＮａＯＨ－２は測定溶液２に滴下した水酸化ナトリウム水溶液の濃度（０．０２ｍｏｌ／Ｌ）、ＶＮａＯＨ－２は測定溶液２に滴下した水酸化ナトリウム水溶液の量（ｍＬ）、ＶＨＣｌ－２は２回目に添加した塩酸の量（ｍＬ）、ＭＳ２は乾燥後の細胞吸着材料の質量（ｇ）を意味する。
　上述の「アミノ基量の測定」で算出したアミノ基量を用いて、アミノ基／アミド基比率を算出し、小数点第４位を四捨五入した値を用いた。
　＜ＬＡＰ陽性免疫細胞の吸着試験＞
　細胞吸着材料におけるＬＡＰ陽性免疫細胞の吸着率を、ヒト血液を用いた吸着カラム通液式免疫細胞吸着試験により測定した。また、分析にはフローサイトメトリー（ＦＡＣＳＬｙｒｉｃ、ベクトン・ディッキンソン社製）を用いた。
　まず、細胞吸着カラムの充填部（直径１０ｍｍ、高さ１４ｍｍ）に乾燥質量０．３ｇの細胞吸着材料及び生理食塩水を充填し、高圧蒸気滅菌（１１７℃、１０５分）を行った。その後、細胞吸着カラムに対し、終濃度５０単位／ｍＬのヘパリン添加生理食塩水を１．５４ｍＬ／分で２．５分間通液して、プライミング処理をした。次に、ヒト健常者から採血した血液（終濃度５単位／ｍＬのヘパリンを添加）を０．３１ｍＬ／分で通液し、１０分後のカラム出口の血液を採取した。カラム入口側の血液についても１０分後に採取した。採取した血液を容量５ｍＬのポリプロピレン製チューブ（ＦＡＬＣＯＮ社製）に１００μＬずつ分注し、各種蛍光標識抗体を添加して免疫細胞を染色した。各種蛍光標識抗体としては、フルオレセインイソチオシアネート（以下「ＦＩＴＣ」という）標識抗ヒトＣＤ４抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社製）、フィコエリスリン（以下「ＰＥ」という）標識抗ヒトＣＤ４２ｂ抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社製）、アロフィコシアニン（以下「ＡＰＣ」という）標識抗ヒトＬＡＰ抗体（Ｒ＆Ｄ社製）を用いた。ＬＡＰ陽性免疫細胞数の検出には、フローサイトメーターを用いた。ＬＡＰ陽性Ｔ細胞としてはＣＤ４陽性かつＬＡＰ陽性の細胞を、ＬＡＰ陽性血小板としてはＣＤ４２ｂ陽性かつＬＡＰ陽性の細胞を評価対象とした。
　ＬＡＰ陽性Ｔ細胞の吸着率は、下記式（１３）により算出し、小数点第１位を四捨五入した値を用いた。
　ＬＡＰ陽性Ｔ細胞の吸着率（％）＝（１－細胞吸着材料を添加した血液中のＬＡＰ陽性Ｔ細胞数／細胞吸着材料を添加していない血液中のＬＡＰ陽性Ｔ細胞数）×１００・・・式（１３）
　ＬＡＰ陽性血小板の吸着率は、下記式（１４）により算出した。
　ＬＡＰ陽性血小板の吸着率（％）＝（１－細胞吸着材料を添加した血液中のＬＡＰ陽性血小板数／細胞吸着材料を添加していない血液中のＬＡＰ陽性血小板数）×１００・・・式（１４）
　＜原編み地（水不溶性担体）及び中間体（リンカー結合水不溶性担体）の作製＞
　水不溶性担体として、ポリプロピレン（株式会社プライムポリマー；Ｊ１０５ＷＴ）からなる島成分を２６４島有し、ポリスチレン（重量平均分子量：１８１，０００）９０質量％及びポリプロピレン（株式会社プライムポリマー；Ｊ１０５ＷＴ）１０質量％からなる海成分を有し、島と海の比率（質量比）が５０：５０である、海島複合繊維（繊維の直径：２０μｍ）を紡糸した。得られた繊維３６本を合糸して編み地を形成した（以下「原編み地」という）。なお、繊維表面の算術平均粗さは、島数や海島比率、ポリスチレンやポリプロピレンの分子量などによって影響を受ける。
　ニトロベンゼン（２０ｍＬ）と硫酸（１３ｍＬ）の混合溶液にパラホルムアルデヒド（以下「ＰＦＡ」という、２ｇ）を１０℃で溶解させた（以下「ＰＦＡ溶液」という）。さらに、ニトロベンゼン（２５９ｍＬ）と硫酸（１６９ｍＬ）の混合溶液にＮＭＣＡ（４７ｇ）を１０℃で溶解させた（以下「ＮＭＣＡ溶液」という）。原編み地（１０ｇ）をＰＦＡ溶液に浸漬した後、速やかにＮＭＣＡ溶液を添加し、撹拌した。１時間浸漬・撹拌した後、編み地を取り出し、過剰量のニトロベンゼンで洗浄後、メタノールで置換・洗浄し、さらにイオン交換水で洗浄して、α－クロルアセトアミドメチル化した編み地（以下「中間体」という）を得た。ＰＦＡ溶液の調製からメタノールを用いた編み地の洗浄までの一連の操作は１５℃以下で実施した。
　［実施例１］
　ＤＥＴＡ（２３．３ｍＬ）をイオン交換水（４０５．０ｍＬ）に溶かし、５００ｍｍｏｌ／ＬのＤＥＴＡ水溶液を調製した。このＤＥＴＡ水溶液に、中間体（１０ｇ）を浸漬し、４０℃で３時間撹拌した。その後、メタノール、イオン交換水に浸漬して洗浄し、乾燥させ、細胞吸着材料Ｅ１を得た。
　［実施例２］
　イオン交換水（３６４．８ｍＬ）とジメチルスルホキシド（以下「ＤＭＳＯ」という、６３．８ｍＬ）を混合した後、ＤＥＴＡ（２３．３ｍＬ）を添加して、５００ｍｍｏｌ／ＬのＤＥＴＡ－１０質量％ＤＭＳＯ水溶液を調製した。このＤＥＴＡ－１０質量％ＤＭＳＯ水溶液に、中間体（１０ｇ）を浸漬し、４０℃で３時間撹拌した。実施例１と同様に洗浄、乾燥させ、細胞吸着材料Ｅ２を得た。
　［実施例３］
　ＤＥＴＡ（０．９ｍＬ）をイオン交換水（４２７．６ｍＬ）に溶かし、２０ｍｍｏｌ／ＬのＤＥＴＡ水溶液を調製した。この２０ｍｍｏｌ／ＬのＤＥＴＡ水溶液に、中間体（１０ｇ）を浸漬し、４０℃で３時間撹拌した。実施例１と同様に洗浄、乾燥させ、細胞吸着材料Ｅ３を得た。
　［比較例１］
　イオン交換水（４２８．６ｍＬ）に、中間体（１０ｇ）を浸漬し、４０℃で３時間撹拌した。実施例１と同様に洗浄、乾燥させ、細胞吸着材料Ｃ１を得た。
　［比較例２］
　ＤＭＳＯ（３９８．４ｍＬ）にトリエチルアミン（２８．６ｍＬ）を添加した後、ＤＥＴＡ（０．０４６ｍＬ）を添加して、１ｍｍｏｌ／ＬのＤＥＴＡ－ＤＭＳＯ溶液を調製した。このＤＥＴＡ－ＤＭＳＯ溶液に、中間体（１０ｇ）を浸漬し、４０℃で３時間撹拌した。その後、ＤＭＳＯ、メタノール、次いで水に浸漬して洗浄し、乾燥させ、細胞吸着材料Ｃ２を得た。
　細胞吸着材料（Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３、Ｃ１、Ｃ２）について、上述の方法により、２６ＣＮ－のスペクトル強度、最頻細孔半径、細孔半径が１０ｎｍ以上２５０ｎｍ以下の細孔の総体積、真円度、凸度、長径、表面の算術平均粗さ、アミノ基量、アミノ基／アミド基比率、並びにＬＡＰ陽性Ｔ細胞及びＬＡＰ陽性血小板の吸着率を測定した。結果を表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　表中の略号は以下の通りである。
ＤＥＴＡ：ジエチレントリアミン
ＤＭＳＯ：ジメチルスルホキシド
　本発明の細胞吸着材料及び細胞吸着カラムは、ＬＡＰ陽性免疫細胞などの細胞を高効率で吸着することができる。そのため、がん治療への適用が期待される。また、本発明の細胞吸着材料及び細胞吸着カラムは、樹状細胞やナチュラルキラー細胞などを活性化させる細胞輸注治療と併用することも可能である。
　１　　容器本体
　２　　流入口
　３　　流出口
　４　　フィルター
　５　　仕切板
　５ａ　仕切板の開口
　６　　フィルター
　７　　仕切板
　７ａ　仕切板の支持突起
　７ｂ　仕切板の透孔
　８　　パイプ
　９　　流路
１０　　貫通孔
１１　　細胞吸着材料
　Ｑ　　血液流れ
２１　　細胞吸着材料の断面の外周
２２　　細胞吸着材料の断面の重心
２３　　細胞吸着材料の断面の重心２２を通り、かつ断面を縦断又は横断する直線
２４ａ、２４ｂ　直線２３と細胞吸着材料の断面の外周２１との交点
３１　　領域Ａ
３２　　領域Ｂ
４１　　細胞吸着材料の断面の外周に対する凸包
 

Claims (12)

  1. 　ポリアミン及び脂肪族アミンからなる群より選択される１種以上の窒素含有化合物が結合した水不溶性担体の繊維又は粒子であり、
    　前記繊維又は前記粒子の断面の最表面から１．０μｍ以内の領域を領域Ａ、前記繊維又は前記粒子の断面の重心から半径０．５μｍ以内の領域を領域Ｂとし、飛行時間型２次イオン質量分析法により測定された前記各領域の２５Ｃ２Ｈ－のスペクトル強度を１としたときの２６ＣＮ－のスペクトル強度が、下記式（１）及び（２）を満たす、細胞吸着材料。
    　０．５≦前記領域Ａにおける２６ＣＮ－のスペクトル強度≦３．０　・・・式（１）
    　３．０≦前記領域Ａにおける２６ＣＮ－のスペクトル強度／前記領域Ｂにおける２６ＣＮ－のスペクトル強度≦２０．０　・・・式（２）
  2. 　前記繊維又は前記粒子の最頻細孔半径が１０ｎｍ以上１００ｎｍ以下であり、
    　前記繊維又は前記粒子における全細孔の総体積に対する、細孔半径が１０ｎｍ以上２５０ｎｍ以下の細孔の総体積が５０％以上１００％以下である、請求項１記載の細胞吸着材料。
  3. 　前記繊維又は前記粒子の断面の真円度が０．７５以上０．９５以下である、請求項１又は２記載の細胞吸着材料。
  4. 　前記繊維又は前記粒子の長径が１５μｍ以上５０μｍ以下である、請求項１又は請求項２記載の細胞吸着材料。
  5. 　前記繊維又は前記粒子の表面の算術平均粗さが０．０１μｍ以上１．００μｍ以下である、請求項１又は２記載の細胞吸着材料。
  6. 　前記窒素含有化合物が、下記一般式（Ｉ）で表されるポリアミンである、請求項１又は２記載の細胞吸着材料。
    　Ｒ１Ｒ２Ｎ－Ｘ－ＮＲ３Ｒ４　　・・・（Ｉ）
    ［一般式（Ｉ）中、Ｘは、２～２０個の炭素原子を有する飽和若しくは不飽和の脂肪族炭化水素基、又は、３～２０個の炭素原子を有する飽和若しくは不飽和の脂肪族炭化水素基において１～５個の炭素原子を窒素原子で置き換えたヘテロ原子含有炭素鎖であり、該窒素原子に結合する水素原子は、アルキル基又はアミノ基を有するアルキル基で置換されていてもよい。Ｒ１～Ｒ４は、それぞれ独立に、水素原子又はアルキル基である。］
  7. 　前記窒素含有化合物は、リンカーを介して前記水不溶性担体に結合している、請求項１又は２記載の細胞吸着材料。
  8. 　前記細胞が免疫細胞である、請求項１又は２記載の細胞吸着材料。
  9. 　前記免疫細胞がＬＡＰ陽性免疫細胞である、請求項８記載の細胞吸着材料。
  10. 　前記ＬＡＰ陽性免疫細胞は、ＬＡＰ陽性Ｔ細胞又はＬＡＰ陽性血小板である、請求項９に記載の細胞吸着材料。
  11. 　請求項１又は２記載の細胞吸着材料を内蔵した細胞吸着カラム。
  12. 　血液浄化療法に用いるための、請求項１１に記載の細胞吸着カラム。
     
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Kim Synthesis and engineering of polymeric latex particles for medical applications

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