KR20190077103A - 접합된 생물학적 분자, 제약 조성물 및 방법 - Google Patents

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KR20190077103A
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ser
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마이클 니엔세 창
지안-시운 라이
완-펜 리
이-주 첸
이-치엔 트싸이
카이-추안 첸
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Abstract

본원에 개시된 글로보 시리즈 항원에 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편에 접합된 약물을 포함하는 항체 약물 접합체 (ADC), 뿐만 아니라 그의 사용 방법. 사용 방법은, 비제한적으로, 암 요법 및 진단법을 포함한다. 개시내용의 항체는 특정 암 세포 표면에 결합할 수 있다. 본원에 개시된 항체의 예시적인 표적은 암종, 예컨대 육종, 피부암, 백혈병, 림프종, 뇌암, 교모세포종, 폐암, 유방암, 구강암, 두경부암, 비인두암, 식도암, 위암, 간암, 담관암, 담낭암, 방광암, 췌장암, 장암, 결장직장암, 신장암, 자궁경부암, 자궁내막암, 난소암, 고환암, 협부암, 구인두암, 후두암 및 전립선암을 포함할 수 있다.

Description

접합된 생물학적 분자, 제약 조성물 및 방법
관련 출원
본 출원은 2016년 11월 21일에 출원된 미국 특허 가출원 번호 62/424,851의 이익을 주장하며, 이는 본원에 참조로 포함된다.
분야
본 개시내용은 암을 치료하기 위한 항체-약물 접합체 (ADC) 조성물 및 그의 사용 방법에 관한 것이다. 또한, 병리학적 상태와 연관된 포유동물 세포의 치료를 위해 항체-약물 접합체 화합물을 사용하는 방법이 본원에 기재된다. 본 개시내용은 글로보(Globo) 시리즈 항원 (글로보 H, SSEA-3 및 SSEA-4)에 대한 항체 및 그의 결합 단편, 및 상기 항체 및/또는 결합 단편을 포함하는 제약 조성물에 관한 것이다. 또한, 암 세포를 억제하는데 유효한 양으로 ADC를 대상체에게 투여하는 방법이 제공된다.
수많은 표면 탄수화물이 악성 종양 세포에서 발현된다. 예를 들어, 탄수화물 항원 글로보 H (Fucα1→2 Galβ1→3 GalNAcβ1→3 Galα1→4 Galβ1→4 Glc)는 세라미드-연결된 당지질로서 최초로 단리되었고, 유방암 MCF-7 세포로부터 1984년에 확인되었다 (Bremer E G, et al. (1984) J Biol Chem 259:14773-14777). 이전의 연구들은 또한 글로보 H 및 스테이지-특이적 배아 항원 3 (Galβ1→ 3GalNAcβ1→ 3Galα1→ 4Galβ1→ 4Glcβ1) (SSEA-3, Gb5로도 불림)이 유방암 세포 및 유방암 줄기 세포 상에서 관찰되었다는 것을 제시하였다 (WW Chang et al. (2008) Proc Natl Acad Sci USA, 105(33): 11667-11672). 또한, SSEA-4 (스테이지-특이적 배아 항원-4) (Neu5Acα2→ 3Galβ1→ 3GalNAcβ1→ 3Galα1→ 4Galβ1→ 4Glcβ1)는 통상적으로 만능 인간 배아 줄기 세포에 대한 세포 표면 마커로서 사용되었고, 중간엽 줄기 세포를 단리하고 신경 전구 세포를 풍부화하는데 사용되었다 (Kannagi R et al. (1983) EMBO J, 2:2355-2361). 이들 발견은 글로보 시리즈 항원 (글로보 H, SSEA-3 및 SSEA-4)이 암 요법을 위한 고유한 표적이며, 치료제가 암 세포를 효과적으로 표적화하도록 지시하는데 사용될 수 있다는 것을 지지한다. 암과 연관되고/거나 암을 예측하는 글리칸 마커를 확인하고, 넓은 스펙트럼의 암을 진단하고 치료하는데 사용하기 위한 마커에 대한 항체-약물 접합체 (ADC)를 개발하는 것이 큰 관심 대상이다. 글로보 시리즈 항원은 그의 특이적 항체를 상이한 링커를 통해 치료제와 조합하는 것에 의해 ADC로 설계될 수 있다.
암의 치료에서 세포독성제 또는 세포증식억제제, 예를 들어 종양 세포를 사멸시키거나 억제하는 약물의 국부 전달을 위한 항체-약물 접합체 (ADC)의 사용 (Syrigos and Epenetos (1999) Anticancer Research 19:605-614; Niculescu-Duvaz and Springer (1997) Adv. Drg. Del. Rev. 26:151-172; 미국 특허 번호 4975278)은 이론적으로는 종양으로의 약물 모이어티의 표적화된 전달, 및 그 안에의 세포내 축적을 가능하게 하지만, 이들 비접합된 약물 작용제의 전신 투여는 제거하고자 하는 종양 세포뿐만 아니라 정상 세포에 대해 허용되지 않는 독성 수준을 야기할 수 있다 (Baldwin et al., 1986, Lancet pp. (Mar. 15, 1986):603-05; Thorpe, 1985, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review," in Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, A. Pinchera et al. (ed.s), pp. 475-506). 따라서, 최소 독성으로의 최대 효능이 추구된다. 폴리클로날 항체 및 모노클로날 항체 둘 다는 이들 전략에 유용한 것으로 보고되어 있다 (Rowland et al., 1986, Cancer Immunol. Immunother. 21:183-87). 이들 방법에 사용되는 약물은 다우노마이신, 독소루비신, 메토트렉세이트, 및 빈데신을 포함한다 (Rowland et al., 1986, 상기 문헌). 일부 세포독성 약물은 대형 항체 또는 단백질 수용체 리간드에 접합되는 경우에 불활성이거나 활성이 낮은 경향이 있다.
아우리스타틴 펩티드, 아우리스타틴 E (AE) 및 모노메틸아우리스타틴 (MMAE), 돌라스타틴의 합성 유사체가 하기에 접합되었다: (i) 키메라 모노클로날 항체 cBR96 (암종 상의 루이스 Y에 특이적임); (ii) 혈액 악성종양 상의 CD30에 특이적인 cAC10 (Klussman, et al. (2004), Bioconjugate Chemistry 15(4):765-773; Doronina et al. (2003) Nature Biotechnology 21(7):778-784; "Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands"; Francisco et al. (2003) Blood 102(4):1458-1465; 미국 공개 2004/0018194; (iii) CD20-발현 암 및 면역 장애의 치료를 위한 항-CD20 항체 예컨대 리툭산(RITUXAN)® (WO 04/032828); (iv) 결장직장암의 치료를 위한 항-EphB2 항체 2H9 및 항-IL-8 (Mao, et al. (2004) Cancer Research 64(3):781-788); (v) E-셀렉틴 항체 (Bhaskar et al. (2003) Cancer Res. 63:6387-6394); 및 (vi) 다른 항-CD30 항체 (WO 03/043583).
따라서, 본 개시내용은 글로보 시리즈 항원이 넓은 스펙트럼의 암에서 비정상적으로 발현되지만, 정상 세포에서는 그렇지 않다는 발견에 기초한다. 글로보 시리즈 항원을 발현하는 암은 육종, 피부암, 백혈병, 림프종, 뇌암, 교모세포종, 폐암, 유방암, 구강암, 두경부암, 비인두암, 식도암, 위암, 간암, 담관암, 담낭암, 방광암, 췌장암, 장암, 결장직장암, 신장암, 자궁경부암, 자궁내막암, 난소암, 고환암, 협부암, 구인두암, 후두암 및 전립선암을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
한 측면에서, 본 개시내용은 글로보 시리즈 항원에 특이적인 항체 또는 그의 결합 단편을 특색으로 한다.
특정 실시양태에서, 항체는 항-글로보 H 항체이다.
특정 실시양태에서, 항-글로보 H 항체는 OBI-888이다. 예시적인 OBI 항체 888은 US2017/0101462 (WO2017/062792)에 기재된 바와 같고, 그의 내용은 그 전문이 참조로 포함된다.
특정 실시양태에서, 항체는 항-SSEA4 항체이다.
특정 실시양태에서, 항-SSEA4 항체는 OBI-898이다. 예시적인 OBI 항체 898은 US 2017/283488 (WO2017/172990)에 기재된 바와 같고, 그의 내용은 그 전문이 참조로 포함된다.
한 측면에서, 본 발명은 세포독성제 예컨대 화학요법제, 약물, 성장 억제제, 독소 (예를 들어, 박테리아, 진균, 식물 또는 동물 기원의 효소적 활성 독소 또는 그의 단편) 또는 방사성 동위원소 (즉, 방사성접합체)에 접합된 항체를 포함하는 항체-약물 접합체 (ADC)를 제공한다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용은 글로보 시리즈 항원에 특이적인 그의 항체-약물 접합체 (ADC)를 특색으로 한다.
특정 실시양태에서, 약물은 모노메틸 아우리스타틴 E (MMAE)이다.
한 측면에서, 본 개시내용은 암 세포의 증식 억제를 필요로 하는 대상체에게 유효량의 예시적인 ADC (OBI-999)를 투여하는 것을 포함하며, 여기서 암 세포의 증식이 억제되는 것인, 암 세포의 증식을 억제하는 방법을 제공한다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용은 암의 치료를 필요로 하는 대상체에게 유효량의 예시적인 본원에 기재된 ADC (OBI-999)를 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 암을 치료하는 방법을 제공한다.
개시된 조성물에서, ADC 또는 임의의 다른 관련 성분 둘 다는 면역원성 유효량으로 존재한다. 각각의 특이적 ADC에 대해, 최적의 면역원성 유효량은 실험적으로 결정되어야 한다 (주어진 환자 및/또는 치료 유형의 특이적 특징이 고려됨). 일반적으로, 이러한 양은 글로보 시리즈 항원을 특이적으로 표적화하는 항체의 체중 킬로그램당 0.01 μg-250 mg의 범위이다. 일부 실시양태에서, 치료 조성물의 치료 유효량 (즉, 유효 투여량)은 약 0.001 μg/kg 내지 약 250 mg/kg, 0.01 μg/kg 내지 100 mg/kg, 또는 0.1 μg/kg 내지 50 mg/kg의 범위 또는 약 또는 적어도: 환자 체중 킬로그램당 0.001, 0.002, 0.003, 0.004, 0.005, 0.006, 0.007, 0.008, 0.009; 0.01, 0.02, 0.03, 0.04, 0.05, 0.06, 0.07, 0.08, 0.09; 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 또는 250 그램 또는 마이크로그램, 또는 본원에 열거된 임의의 숫자 사이의 임의의 범위, 또는 과도한 실험없이 통상의 기술자에게 명백하고 그에 의해 이해될 다른 범위일 수 있다. 통상의 기술자는 질환 또는 장애의 중증도, 선행 치료, 대상체의 전반적 건강 또는 연령, 및 존재하는 다른 질환을 포함하나 이에 제한되지는 않는 특정 인자가 대상체를 효과적으로 치료하는데 요구되는 투여량 및 시기에 영향을 미칠 수 있다는 것을 인지할 것이다.
특정 실시양태에서, 암은 육종, 피부암, 백혈병, 림프종, 뇌암, 교모세포종, 폐암, 유방암, 구강암, 두경부암, 비인두암, 식도암, 위암, 간암, 담관암, 담낭암, 방광암, 췌장암, 장암, 결장직장암, 신장암, 자궁경부암, 자궁내막암, 난소암, 고환암, 협부암, 구인두암, 후두암 및 전립선암으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 하나 이상의 실시양태의 상세내용이 하기 설명에 제시된다. 본 발명의 다른 특색 또는 이점은 하기 도면 및 여러 실시양태의 상세한 설명, 및 또한 첨부된 청구범위로부터 명백할 것이다.
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도 1은 OBI-888 (도 1A) 및 ADC (OBI-999) (도 1B)에 대한 소수성 상호작용 크로마토그램 (HIC)을 보여준다.
도 2는 OBI-888 (도 2A) 및 ADC (OBI-999) (도 2B)에 대한 크기 배제 크로마토그램 (SEC)을 보여준다.
도 3은 OBI-888 및 ADC (OBI-999)의 SDS-PAGE 분석을 보여준다. 레인 M: 노벡스 샤프 마커(Novex Sharp Marker); 레인 1: 제제 완충제 중 천연 OBI-888; 레인 2: 반응 완충제 중 천연 OBI-888; 레인 3: ADC (OBI-999).
도 4는 MCF-7 이식된 암컷 누드 (nu/nu) 마우스에서의 종양 성장 곡선을 보여준다. 시험 물질을 10 mg/kg으로 매주 1회 x 2주 (도 4A) 및 보다 낮은 용량으로 3, 1, 및 0.3 mg/kg 매주 1회 x 6주 (도 4B) 투여하였다. T/C 값 ≤ 42%를 비히클 군과 비교하여 유의한 항종양 활성 (#)으로 간주하였다. 비히클 및 시험 물질-처리군 사이의 비교를 위해 이원 ANOVA에 이어 본페로니 사후 검정을 적용하였다. 차이는 *p<0.05에서 유의한 것으로 간주된다.
도 5는 MCF-7 이식된 암컷 누드 (nu/nu) 마우스에서의 체중 변화를 보여준다. 시험 물질을 10 mg/kg으로 매주 1회 x 2주 (도 5A) 및 보다 낮은 용량으로 3, 1, 및 0.3 mg/kg 매주 1회 x 6주 (도 5B) 투여하였다. T/C 값 ≤ 42%를 비히클 군과 비교하여 유의한 항종양 활성 (#)으로 간주하였다. 비히클 및 시험 물질-처리군 사이의 비교를 위해 이원 ANOVA에 이어 본페로니 사후 검정을 적용하였다. 차이는 *p<0.05에서 유의한 것으로 간주된다.
도 6은 비히클 (25 mM 시트르산나트륨, pH 6.5+100 mM NaCl) 10 mL/kg, IV, 매주 1회 x 6주에 의한 처리 후 MCF-7 이식된 종양을 갖는 암컷 (nu/nu) 누드 마우스의 사진을 보여준다.
도 7은 비히클 (25 mM 시트르산나트륨, pH 6.5+100 mM NaCl) 10 mL/kg, IV, 매주 1회 x 2주에 의한 처리 후 MCF-7 이식된 종양을 갖는 암컷 (nu/nu) 누드 마우스의 사진을 보여준다.
도 8은 ADC (OBI-999) 10 mg/kg, IV, 매주 1회 x 2주에 의한 처리 후 MCF-7 이식된 종양을 갖는 암컷 (nu/nu) 누드 마우스의 사진을 보여준다.
도 9는 ADC (OBI-999) 0.3 mg/kg, IV, 매주 1회 x 6주에 의한 처리 후 MCF-7 이식된 종양을 갖는 암컷 (nu/nu) 누드 마우스의 사진을 보여준다.
도 10은 ADC (OBI-999) 1 mg/kg, IV, 매주 1회 x 6주에 의한 처리 후 MCF-7 이식된 종양을 갖는 암컷 (nu/nu) 누드 마우스의 사진을 보여준다.
도 11은 ADC (OBI-999) 3 mg/kg, IV, 매주 1회 x 6주에 의한 처리 후 MCF-7 이식된 종양을 갖는 암컷 (nu/nu) 누드 마우스의 사진을 보여준다.
도 12는 OBI-888 10 mg/kg, IV, 매주 1회 x 2주에 의한 처리 후 MCF-7 이식된 종양을 갖는 암컷 (nu/nu) 누드 마우스의 사진을 보여준다.
도 13은 OBI-888 0.3 mg/kg, IV, 매주 1회 x 6주에 의한 처리 후 MCF-7 이식된 종양을 갖는 암컷 (nu/nu) 누드 마우스의 사진을 보여준다.
도 14는 OBI-888 1 mg/kg, IV, 매주 1회 x 6주에 의한 처리 후 MCF-7 이식된 종양을 갖는 암컷 (nu/nu) 누드 마우스의 사진을 보여준다.
도 15는 OBI-888 3 mg/kg, IV, 매주 1회 x 6주에 의한 처리 후 MCF-7 이식된 종양을 갖는 암컷 (nu/nu) 누드 마우스의 사진을 보여준다.
도 16은 MMAE 0.057 mg/kg, IV, 매주 1회 x 2주에 의한 처리 후 MCF-7 이식된 종양을 갖는 암컷 (nu/nu) 누드 마우스의 사진을 보여준다.
도 17은 NCI-N87 이식된 암컷 누드 (nu/nu) 마우스에서의 종양 성장 곡선을 보여준다. 비히클 및 시험 물질을 연구 설계에 상세화된 바와 같이 투여하였다. T/C 값 ≤ 42%를 비히클 군과 비교하여 유의한 항종양 활성 (#)으로 간주하였다. 비히클 및 시험 물질-처리군 사이의 비교를 위해 이원 ANOVA에 이어 본페로니 사후 검정을 적용하였다. 차이는 *p<0.05에서 유의한 것으로 간주된다.
도 18은 NCI-N87 이식된 암컷 누드 (nu/nu) 마우스에서의 체중 변화를 보여준다. 비히클 및 시험 물질을 연구 설계에 상세화된 바와 같이 투여하였다. 제100일까지 매주 2회 체중을 측정하고 기록하였다.
도 19는 비히클 (25 mM 시트르산나트륨, pH 6.5+100 mM NaCl) 10 mL/kg, IV, 매주 1회 x 4주 + 비히클 (PBS, pH 7.4) 10 mL/kg, IP, 매주 1회 x 4주에 의한 처리 후 NCI-N87 이식된 종양을 갖는 암컷 (nu/nu) 누드 마우스의 사진을 보여준다.
도 20은 ADC (OBI-999) 1 mg/kg, IV, 매주 1회 x 4주에 의한 처리 후 NCI-N87 이식된 종양을 갖는 암컷 (nu/nu) 누드 마우스의 사진을 보여준다.
도 21은 ADC (OBI-999) 3 mg/kg, IV, 매주 1회 x 4주에 의한 처리 후 NCI-N87 이식된 종양을 갖는 암컷 (nu/nu) 누드 마우스의 사진을 보여준다.
도 22는 ADC (OBI-999) 10 mg/kg, IV, 매주 1회 x 4주에 의한 처리 후 NCI-N87 이식된 종양을 갖는 암컷 (nu/nu) 누드 마우스의 사진을 보여준다.
도 23은 OBI-888 10 mg/kg, IV, 매주 1회 x 4주에 의한 처리 후 NCI-N87 이식된 종양을 갖는 암컷 (nu/nu) 누드 마우스의 사진을 보여준다.
도 24는 OBI-910 (항-CD30 ADC) 3 mg/kg, IV, 매주 1회 x 4주에 의한 처리 후 NCI-N87 이식된 종양을 갖는 암컷 (nu/nu) 누드 마우스의 사진을 보여준다.
도 25는 MMAE 0.191 mg/kg, IP, 매주 1회 x 4주 + OBI-888 10 mg/kg, IV, 매주 1회 x 4주에 의한 처리 후 NCI-N87 이식된 종양을 갖는 암컷 (nu/nu) 누드 마우스의 사진을 보여준다.
도 26은 MMAE 0.191 mg/kg, IP, 매주 1회 x 4주에 의한 처리 후 NCI-N87 이식된 종양을 갖는 암컷 (nu/nu) 누드 마우스의 사진을 보여준다.
도 27은 NCI-H526 이식된 암컷 누드 (nu/nu) 마우스에서의 종양 성장 곡선을 보여준다. 비히클 및 시험 물질을 연구 설계에 상세화된 바와 같이 투여하였다. T/C 값 ≤ 42%를 비히클 군과 비교하여 유의한 항종양 활성 (#)으로 간주하였다. 비히클 및 시험 물질-처리군 사이의 비교를 위해 이원 ANOVA에 이어 본페로니 사후 검정을 적용하였다. 차이는 *p<0.05에서 유의한 것으로 간주된다.
도 28은 NCI-H526 이식된 암컷 누드 (nu/nu) 마우스에서의 체중 변화를 보여준다. 비히클 및 시험 물질을 연구 설계에 상세화된 바와 같이 투여하였다. 제45일까지 매주 2회 체중을 측정하고 기록하였다.
도 29는 비히클 (25 mM 시트르산나트륨, pH 6.5+100 mM NaCl) 10 mL/kg, IV, 매주 1회 x 4주 + 비히클 (PBS, pH 7.4) 10 mL/kg, IP, 매주 1회 x 4주에 의한 처리 후 NCI-H526 이식된 종양을 갖는 암컷 (nu/nu) 누드 마우스의 사진을 보여준다.
도 30은 ADC (OBI-999) 10 mg/kg, IV, 매주 1회 x 4주에 의한 처리 후 NCI-H526 이식된 종양을 갖는 암컷 (nu/nu) 누드 마우스의 사진을 보여준다.
도 31은 OBI-888 10 mg/kg, IV, 매주 1회 x 4주에 의한 처리 후 NCI-H526 이식된 종양을 갖는 암컷 (nu/nu) 누드 마우스의 사진을 보여준다.
도 32는 MMAE 0.191 mg/kg, IP, 매주 1회 x 4주 + OBI-888 10 mg/kg, IV, 매주 1회 x 4주에 의한 처리 후 NCI-H526 이식된 종양을 갖는 암컷 (nu/nu) 누드 마우스의 사진을 보여준다.
도 33은 MMAE 0.191 mg/kg, IP, 매주 1회 x 4주에 의한 처리 후 NCI-H526 이식된 종양을 갖는 암컷 (nu/nu) 누드 마우스의 사진을 보여준다.
도 34는 HPAC 확립된 종양을 보유하는 수컷 BALB/c 누드 마우스의 상이한 처리군에서의 종양 성장 곡선을 보여준다. 비히클 및 시험 물질을 연구 설계에 상세화된 바와 같이 투여하였다. 데이터 포인트는 군 평균을 나타내고, 오차 막대는 평균의 표준 오차 (SEM)를 나타낸다.
도 35는 HPAC 확립된 종양을 보유하는 수컷 BALB/c 누드 마우스의 상이한 처리군에서의 체중 변화를 보여준다. 비히클 및 시험 물질을 연구 설계에 상세화된 바와 같이 투여하였다. 데이터 포인트는 군 평균 체중을 나타낸다. 오차 막대는 평균의 표준 오차 (SEM)를 나타낸다.
도 36은 HPAC 확립된 종양을 보유하는 수컷 BALB/c 누드 마우스에서의 상이한 처리군의 사진을 보여준다.
따라서, 넓은 스펙트럼의 암을 진단하고 치료하는데 사용하기 위한 마커에 관한 항체-약물 접합체 (ADC) 방법 및 조성물이 제공된다. 글로보 시리즈 항원에 결합하는 항체 또는 항원-결합 단편에 접합된 약물을 포함하는 항체-약물 접합체 (ADC)가 개발되어 본원에 개시된다. 사용 방법은 암 요법 및 진단법을 비제한적으로 포함한다. 본원에 기재된 ADC는 넓은 스펙트럼의 글로보 시리즈 항원-발현 암 세포에 결합할 수 있으며, 그로 인해 암 진단 및 치료를 용이하게 한다. 항체에 의해 표적화될 수 있는 세포는 암종, 예컨대 피부암, 혈액암, 림프절암, 뇌암, 폐암, 유방암, 구강암, 식도암, 위암, 간암, 담관암, 췌장암, 결장암, 신장암, 자궁경부암, 난소암, 전립선암 등에서의 것을 포함한다.
일반적 정의
본 발명의 실시는, 달리 나타내지 않는 한, 관련 기술분야의 기술 내에 있는 분자 생물학, 미생물학, 재조합 DNA 및 면역학의 통상적인 기술을 사용할 것이다. 이러한 기술은 문헌에 상세하게 설명되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2nd Ed., ed. by Sambrook, Fritsch and Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989); DNA Cloning, Volumes I and II (D. N. Glover ed., 1985); Culture Of Animal Cells (R. I. Freshney, Alan R. Liss, Inc., 1987); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, 1986); B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); the treatise, Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.); Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (J. H. Miller and M. P. Calos eds., 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); Methods In Enzymology, Vols. 154 and 155 (Wu et al. eds.), Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Mayer and Walker, eds., Academic Press, London, 1987); Antibodies: A Laboratory Manual, by Harlow and Lane s (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988); 및 Handbook Of Experimental Immunology, Volumes I-IV (D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds., 1986)]을 참조한다.
본원에 사용된 용어 "글리칸"은 폴리사카라이드 또는 올리고사카라이드를 지칭한다. 글리칸은 또한 당접합체, 예컨대 당단백질, 당지질, 당펩티드, 글리코프로테옴, 펩티도글리칸, 리포폴리사카라이드 또는 프로테오글리칸의 탄수화물 부분을 지칭하는 것으로 본원에서 사용된다. 글리칸은 통상적으로 모노사카라이드 사이의 O-글리코시드 연결만으로 이루어진다. 예를 들어, 셀룰로스는 β-1,4-연결된 D-글루코스로 구성된 글리칸 (또는 보다 구체적으로는 글루칸)이고, 키틴은 β-1,4-연결된 N-아세틸-D-글루코사민으로 구성된 글리칸이다. 글리칸은 모노사카라이드 잔기의 단독 또는 이종중합체일 수 있으며, 선형 또는 분지형일 수 있다. 글리칸은 당단백질 및 프로테오글리칸에서와 같이 단백질에 부착된 것으로 발견될 수 있다. 이들은 일반적으로 세포의 외부 표면 상에서 발견된다. O- 및 N-연결된 글리칸은 진핵생물에서 매우 통상적이지만, 또한 원핵생물에서도 보다 덜 통상적이긴 하지만 발견될 수 있다. N-연결된 글리칸은 시퀀에서 아스파라긴의 R-기 질소 (N)에 부착된 것으로 발견된다. 시퀀은 Asn-X-Ser 또는 Asn-X-Thr 서열이며, 여기서 X는 프랄린을 제외한 임의의 아미노산이다.
본원에 사용된 용어 "항원"은 면역 반응을 도출할 수 있는 임의의 물질로서 정의된다.
본원에 사용된 용어 "면역원성"은 면역 반응을 자극하기 위한 면역원, 항원 또는 백신의 능력을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "에피토프"는 항체 또는 T 세포 수용체의 항원 결합 부위와 접촉하는 항원 분자의 부분으로서 정의된다.
본원에 사용된 용어 "백신"은 완전 질환-유발 유기체 (사멸 또는 약화된 것) 또는 이러한 유기체의 성분, 예컨대 단백질, 펩티드 또는 폴리사카라이드로 이루어진 항원을 함유하며, 유기체가 유발하는 질환에 대한 면역을 부여하는데 사용되는 제제를 지칭한다. 백신 제제는 천연이거나, 합성이거나, 또는 재조합 DNA 기술에 의해 유래될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "항원 특이적"은 특정한 항원 또는 항원의 단편의 공급이 특이적 세포 증식을 발생시키도록 하는 세포 집단의 특성을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "특이적 결합"은 결합 쌍 (예를 들어, 항체 및 항원) 사이의 상호작용을 지칭한다. 다양한 경우에, 특이적 결합은 약 10-6 몰/리터, 약 10-7 몰/리터, 또는 약 10-8 몰/리터, 또는 그 미만의 친화도 상수에 의해 구현될 수 있다.
본원에 사용된 어구 "실질적으로 유사한", "실질적으로 동일한", "동등한", 또는 "실질적으로 동등한"은 관련 기술분야의 통상의 기술자가 값 (예를 들어, Kd 값, 항-바이러스 효과 등)에 의해 측정된 생물학적 특징의 맥락 내에서 2개의 값 사이의 차이를 생물학적 및/또는 통계적 유의성이 거의 또는 전혀 없는 것으로 간주하도록 하는, 2개의 수치값 (예를 들어, 하나는 분자와 연관되고, 다른 것은 참조/비교 분자와 연관됨) 사이의 충분히 높은 정도의 유사성을 나타낸다. 상기 2개의 값 사이의 차이는 참조/비교 분자에 대한 값의 함수로서, 예를 들어 약 50% 미만, 약 40% 미만, 약 30% 미만, 약 20% 미만 및/또는 약 10% 미만이다.
본원에 사용된 어구 "실질적으로 감소된" 또는 "실질적으로 상이한"은 관련 기술분야의 통상의 기술자가 값 (예를 들어, Kd 값)에 의해 측정된 생물학적 특징의 맥락 내에서 2개의 값 사이의 차이를 통계적 유의성을 갖는 것으로 간주하도록 하는, 2개의 수치 값 (일반적으로 하나는 분자와 연관되고, 다른 것은 참조/비교 분자와 연관됨) 사이의 충분히 높은 정도의 차이를 나타낸다. 상기 2개의 값 사이의 차이는 참조/비교 분자에 대한 값의 함수로서, 예를 들어 약 10% 초과, 약 20% 초과, 약 30% 초과, 약 40% 초과 및/또는 약 50% 초과이다.
"결합 친화도"는 일반적으로, 분자 (예를 들어, 항체)의 단일 결합 부위와 그의 결합 파트너 (예를 들어, 항원) 사이의 비공유 상호작용의 총 합계의 강도를 지칭한다. 달리 나타내지 않는 한, 본원에 사용된 "결합 친화도"는 결합 쌍의 구성원들 (예를 들어, 항체 및 항원) 사이의 1:1 상호작용을 반영하는 내인성 결합 친화도를 지칭한다. 분자 X의 그의 파트너 Y에 대한 친화도는 일반적으로 해리 상수 (Kd)로 나타내어질 수 있다. 친화도는 본원에 기재된 것들을 포함한, 관련 기술분야에 공지된 통상의 방법에 의해 측정될 수 있다. 저-친화도 항체는 일반적으로 항원에 느리게 결합하고 용이하게 해리되는 경향이 있는 반면에, 고-친화도 항체는 일반적으로 항원에 보다 신속하게 결합하고 보다 오랫동안 결합된 채로 남아있는 경향이 있다. 결합 친화도를 측정하는 다양한 방법이 관련 기술분야에 공지되어 있으며, 이 중 임의의 것이 본 발명의 목적을 위해 사용될 수 있다. 구체적인 예시적 실시양태가 하기에 기재된다.
"항체" (Ab) 및 "이뮤노글로불린" (Ig)은 동일한 구조적 특징을 갖는 당단백질이다. 항체는 특정 항원에 대해 결합 특이성을 나타내지만, 이뮤노글로불린은 항체, 및 일반적으로 항원 특이성이 결여된 다른 항체-유사 분자 둘 다를 포함한다. 후자 종류의 폴리펩티드는, 예를 들어 림프계에 의해 낮은 수준으로 및 골수종에 의해 증가된 수준으로 생산된다.
용어 "항체" 및 "이뮤노글로불린"은 가장 넓은 의미에서 상호교환가능하게 사용되고, 모노클로날 항체 (예를 들어, 전장 또는 무손상 모노클로날 항체), 폴리클로날 항체, 1가 항체, 다가 항체, 다중특이적 항체 (예를 들어, 목적하는 생물학적 활성을 나타내는 한 이중특이적 항체)를 포함하고, 또한 특정 항체 단편 (본원에서 보다 상세히 기재된 바와 같음)을 포함할 수 있다. 항체는 키메라 항체, 인간 항체, 인간화 항체 및/또는 친화도 성숙 항체일 수 있다.
항체의 "가변 영역" 또는 "가변 도메인"은 항체의 중쇄 또는 경쇄의 아미노-말단 도메인을 지칭한다. 이들 도메인은 일반적으로 항체의 가장 가변적인 부분이고, 항원-결합 부위를 함유한다.
용어 "가변"은 가변 도메인의 특정 부분이 항체마다 서열에 있어서 광범위하게 상이하고, 각각의 특정한 항체의 그의 특정한 항원에 대한 결합 및 특이성에 사용된다는 사실을 지칭한다. 그러나, 가변성은 항체의 가변 도메인 전반에 걸쳐 고르게 분포되지 않는다. 이는 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 둘 다에서 상보성-결정 영역 (CDR) 또는 초가변 영역으로 불리는 3개의 절편에 농축되어 있다. 가변 도메인의 보다 고도로 보존된 부분은 프레임워크 (FR)로 불린다. 천연 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인은, 루프 연결부를 형성하고 일부 경우에 베타-시트 구조의 부분을 형성하는 3개의 CDR에 의해 연결된, 주로 베타-시트 형상을 취하는 4개의 FR 영역을 각각 포함한다. 각각의 쇄에서의 CDR은 FR 영역에 근접하게 함께 유지되어 있고, 다른 쇄로부터의 CDR과 함께 항체의 항원-결합 부위의 형성에 기여한다 (문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, National Institute of Health, Bethesda, Md. (1991)] 참조). 불변 도메인은 항체가 항원에 결합하는 것에 직접적으로 수반되지는 않지만, 항체-의존성 세포 독성에서의 항체의 참여와 같은 다양한 이펙터 기능을 나타낸다.
항체의 파파인 소화는 "Fab" 단편으로 불리는, 각각 단일 항원-결합 부위를 갖는 2개의 동일한 항원-결합 단편, 및 명칭이 용이하게 결정화되는 그의 능력을 반영한 것인 잔류 "Fc" 단편을 생성한다. 펩신 처리에 의해, 2개의 항원-결합 부위를 갖고 여전히 항원에 가교-연결될 수 있는 F(ab')2 단편이 생성된다.
"Fv"는 완전한 항원-인식 및 -결합 부위를 함유하는 최소 항체 단편이다. 2-쇄 Fv 종에서, 이러한 영역은 1개의 중쇄 및 1개의 경쇄 가변 도메인이 단단하게 비공유적으로 회합된 이량체로 이루어진다. 단일-쇄 Fv 종에서, 1개의 중쇄 및 1개의 경쇄 가변 도메인은 경쇄 및 중쇄가 2-쇄 Fv 종에서의 경우와 유사한 "이량체" 구조로 회합할 수 있도록 가요성 펩티드 링커에 의해 공유 연결될 수 있다. 이 형상에서, 각각의 가변 도메인의 3개의 CDR은 상호작용하여 VH-VL 이량체의 표면 상에 항원-결합 부위를 정의한다. 집합적으로, 6개의 CDR이 항체에 항원-결합 특이성을 부여한다. 그러나, 심지어 단일 가변 도메인 (또는 항원에 특이적인 단지 3개의 CDR만을 포함하는 Fv의 절반)도 전체 결합 부위보다 친화도가 낮긴 하지만 항원을 인식하고 결합하는 능력을 갖는다.
Fab 단편은 또한 경쇄의 불변 도메인 및 중쇄의 제1 불변 도메인 (CH1)을 함유한다. Fab' 단편은 항체 힌지 영역으로부터의 1개 이상의 시스테인을 포함한 중쇄 CH1 도메인의 카르복시 말단에서의 몇몇 잔기의 부가에 의해 Fab 단편과 상이하다. Fab'-SH는 불변 도메인의 시스테인 잔기(들)가 유리 티올 기를 보유하고 있는, Fab'에 대한 본원의 명칭이다. F(ab')2 항체 단편은 원래 이들 사이에 힌지 시스테인을 갖는 Fab' 단편의 쌍으로서 생성되었다. 항체 단편의 다른 화학적 커플링이 또한 공지되어 있다.
임의의 척추동물 종으로부터의 항체 (이뮤노글로불린)의 "경쇄"는 그의 불변 도메인의 아미노산 서열에 기초하여, 카파 (κ) 및 람다 (λ)로 불리는 2가지 명확히 별개의 유형 중 하나에 할당될 수 있다.
중쇄 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라, 항체 (이뮤노글로불린)는 상이한 부류로 할당될 수 있다. 5가지 주요 부류의 이뮤노글로불린: IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM이 존재하고, 이들 중 몇가지는 하위부류 (이소형), 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2로 추가로 나누어질 수 있다. 상이한 부류의 이뮤노글로불린에 상응하는 중쇄 불변 도메인은 각각 α, δ, ε, γ 및 μ로 불린다. 상이한 부류의 이뮤노글로불린의 서브유닛 구조 및 3-차원 형상은 널리 공지되어 있고 일반적으로 예를 들어, 문헌 [Abbas et al. Cellular and Mol. Immunology, 4th ed. (2000)]에 기재되어 있다. 항체는 항체와 1종 이상의 다른 단백질 또는 펩티드의 공유 또는 비-공유 회합에 의해 형성되는, 보다 큰 융합 분자의 부분일 수 있다.
용어 "전장 항체", "무손상 항체" 및 "완전 항체"는, 하기에 정의된 바와 같은 항체 단편이 아닌, 실질적으로 무손상 형태의 항체를 지칭하는 것으로 본원에서 상호교환가능하게 사용된다. 용어는 특히 Fc 영역을 함유하는 중쇄를 갖는 항체를 지칭한다.
"항체 단편"은 무손상 항체 내에 존재할 때 그 부분과 정상적으로 연관된 기능 중 적어도 하나 및 많게는 대부분 또는 모두를 유지하는 무손상 항체의 부분만을 포함한다. 한 실시양태에서, 항체 단편은 무손상 항체의 항원 결합 부위를 포함하므로 항원에 결합하는 능력을 유지한다. 또 다른 실시양태에서, 항체 단편, 예를 들어 Fc 영역을 포함하는 항체 단편은, 무손상 항체 내에 존재하는 경우에 Fc 영역과 정상적으로 연관된 생물학적 기능들, 예컨대 FcRn 결합, 항체 반감기 조정, ADCC 기능 및 보체 결합 중 적어도 하나의 기능을 유지한다. 한 실시양태에서, 항체 단편은 무손상 항체와 실질적으로 유사한 생체내 반감기를 갖는 1가 항체이다. 예를 들어, 이러한 항체 단편은 단편에 생체내 안정성을 부여할 수 있는 Fc 서열에 연결된 항원 결합 아암을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "모노클로날 항체"는 실질적으로 동종 항체의 집단으로부터 수득된 항체를 지칭하며, 즉, 집단을 구성하는 개별 항체는 미량으로 존재할 수 있는 가능한 자연 발생 돌연변이를 제외하고 동일하다. 따라서, 수식어 "모노클로날"은 개별 항체의 혼합물이 아닌 것으로서의 항체의 특징을 나타낸다. 이러한 모노클로날 항체는 전형적으로 표적에 결합하는 폴리펩티드 서열을 포함하는 항체를 포함하며, 여기서 표적-결합 폴리펩티드 서열은 복수의 폴리펩티드 서열로부터 단일 표적 결합 폴리펩티드 서열의 선택을 포함하는 방법에 의해 수득된 것이다. 예를 들어, 선택 방법은 복수의 클론, 예컨대 하이브리도마 클론, 파지 클론 또는 재조합 DNA 클론의 풀로부터 고유한 클론을 선택하는 것일 수 있다. 선택된 표적 결합 서열을 추가로 변경시켜, 예를 들어 표적에 대한 친화도를 개선시키고, 표적 결합 서열을 인간화하고, 세포 배양물 중에서의 그의 생성을 개선시키고, 생체내에서 그의 면역원성을 감소시키고, 다중특이적 항체를 생성할 수 있으며, 변경된 표적 결합 서열을 포함하는 항체도 또한 본 발명의 모노클로날 항체라는 것을 이해해야 한다. 상이한 결정기 (에피토프)에 대해 지시된 상이한 항체를 전형적으로 포함하는 폴리클로날 항체 제제와는 달리, 모노클로날 항체 제제의 각각의 모노클로날 항체는 항원 상의 단일 결정기에 대해 지시된다. 모노클로날 항체 제제는 그의 특이성에 추가로 다른 이뮤노글로불린에 의해 전형적으로 오염되지 않는다는 점에서 유리하다. 수식어 "모노클로날"은 실질적으로 동종인 항체의 집단으로부터 수득됨에 따른 항체의 특징을 나타내며, 임의의 특정한 방법에 의한 항체의 제조를 필요로 하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 예를 들어, 본 발명에 따라 사용될 모노클로날 항체는, 예를 들어 하이브리도마 방법 (예를 들어, 문헌 [Kohler et al., Nature, 256: 495 (1975); Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988); Hammerling et al., in: Monoclonal Antibodies and T-Cell hybridomas 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981)]), 재조합 DNA 방법 (예를 들어, 미국 특허 번호 4,816,567 참조), 파지 디스플레이 기술 (예를 들어, 문헌 [Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1992); Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004); Lee et al., J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472 (2004); 및 Lee et al., J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132 (2004)] 참조), 및 동물에서 인간 이뮤노글로불린 유전자좌 또는 인간 이뮤노글로불린 서열을 코딩하는 유전자 중 일부 또는 모두를 갖는 인간 또는 인간-유사 항체를 생산하는 기술 (예를 들어, WO98/24893; WO96/34096; WO96/33735; WO91/10741; 문헌 [Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 2551 (1993); Jakobovits et al., Nature 362: 255-258 (1993); Bruggemann et al., Year in Immunol. 7:33 (1993)]; 미국 특허 번호 5,545,807; 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,661,016; 문헌 [Marks et al., Bio. Technology 10: 779-783 (1992); Lonberg et al., Nature 368: 856-859 (1994); Morrison, Nature 368: 812-813 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnol. 14: 845-851 (1996); Neuberger, Nature Biotechnol. 14: 826 (1996) 및 Lonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93 (1995)] 참조)을 포함한 다양한 기술에 의해 제조될 수 있다.
본원에서 모노클로날 항체는 구체적으로 중쇄 및/또는 경쇄의 일부분이 특정한 종으로부터 유래되거나 특정한 항체 부류 또는 하위부류에 속하는 항체에서의 상응하는 서열과 동일하거나 그에 상동이고, 쇄(들)의 나머지 부분은 또 다른 종으로부터 유래되거나 또 다른 항체 부류 또는 하위부류에 속하는 항체에서의 상응하는 서열과 동일하거나 그에 상동인 "키메라" 항체, 뿐만 아니라 목적하는 생물학적 활성을 나타내는 한 이러한 항체의 단편을 포함한다 (미국 특허 번호 4,816,567; 및 문헌 [Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984)]).
본 발명의 항체는 또한 본 발명의 항체에서 생성된 키메라화 또는 인간화 모노클로날 항체를 포함다.
항체는 전장일 수 있거나, Fab, F(ab')2, Fab', F(ab)', Fv, 단일 쇄 Fv (scFv), 2가 scFv (비-scFv), 3가 scFv (트리-scFv), Fd, dAb 단편 (예를 들어, 문헌 [Ward et al., Nature, 341: 544-546 (1989)]), CDR, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디, 선형 항체, 단일-쇄 항체 분자, 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체를 포함하나 이에 제한되지 않는 항원-결합 부분을 갖는 항체의 단편 (또는 단편들)을 포함할 수 있다. 재조합 방법, 또는 합성 링커를 사용하여 항체 단편을 결합시킴으로써 제조된 단일 쇄 항체는 또한 본 발명에 의해 포함된다. 문헌 [Bird et al. Science, 1988, 242:423-426. Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1988, 85:5879-5883].
본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 단일특이적, 이중-특이적 또는 다중특이적일 수 있다.
IgG (예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), IgM, IgA (IgA1, IgA2), IgD 또는 IgE를 포함한 모든 항체 이소형은 본 개시내용에 의해 포함된다 (모든 부류 및 하위부류가 본 발명에 의해 포함된다). 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 포유동물 (예를 들어, 마우스, 인간) 항체 또는 그의 항원-결합 부분일 수 있다. 항체의 경쇄는 카파 또는 람다 유형의 것일 수 있다.
따라서, 본 발명의 항암 항체는 본 발명의 항체에 혼입될 수 있는 비-뮤린 기원, 바람직하게는 인간 기원의 중쇄 또는 경쇄 가변 영역, 중쇄 또는 경쇄 불변 영역, 프레임워크 영역 또는 그의 임의의 부분과의 조합을 포함한다.
항체는 참조 항체에 의해 생산된 항체의 가변 중쇄 영역 및 가변 경쇄 영역에 대해 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 81%, 적어도 약 82%, 적어도 약 83%, 적어도 약 84%, 적어도 약 85%, 적어도 약 86%o, 적어도 약 87%>, 적어도 약 88%>, 적어도 약 89%>, 적어도 약 90%>, 적어도 약 91 >, 적어도 약 92%>, 적어도 약 93%>, 적어도 약 94%>, 적어도 약 95%), 적어도 약 96%>, 적어도 약 97%>, 적어도 약 98%>, 적어도 약 99%> 또는 약 100% 상동성인 가변 중쇄 영역 및 가변 경쇄 영역을 갖고, 또한 글로보 시리즈 항원 (글로보 H, SSEA-3 및 SSEA-4)에 결합할 수 있다. 상동성은 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열 수준으로 존재할 수 있다.
항체 또는 항원-결합 부분은 펩티드일 수 있다. 이러한 펩티드는 생물학적 활성, 예를 들어, 탄수화물 항원의 결합을 나타내는 펩티드의 변이체, 유사체, 오르토로그, 상동체 및 유도체를 포함할 수 있다. 펩티드는 아미노산 (예를 들어, 비-자연 발생 아미노산, 비관련된 생물학적 계에서 단지 자연적으로 발생하는 아미노산, 포유동물 계로부터의 변형된 아미노산 등을 포함함)의 1종 이상의 유사체, 치환된 연결을 갖는 펩티드, 뿐만 아니라 관련 기술분야에 공지된 다른 변형을 함유할 수 있다.
또한, 특정 아미노산이 치환되거나, 결실되거나, 부가된 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 본 발명의 범주 내에 있다. 예시적 실시양태에서, 이들 변경은 펩티드의 생물학적 특성 예컨대 결합 친화도에 대해 실질적 효과를 갖지 않는다. 또 다른 예시적 실시양태에서, 항체는 예컨대, 항원에 대한 항체의 결합 친화도를 개선하기 위해 프레임워크 영역 내에 아미노산 치환을 가질 수 있다. 또 다른 예시적 실시양태에서, 선택된, 소수의 수용자 프레임워크 잔기는 상응하는 공여자 아미노산에 의해 대체될 수 있다. 공여자 프레임워크는 성숙 또는 배선 인간 항체 프레임워크 서열 또는 컨센서스 서열일 수 있다. 표현형적 침묵 아미노산 치환을 어떻게 만드는지에 관한 안내는 문헌 [Bowie et al., Science, 247: 1306-1310 (1990). Cunningham et al., Science, 244: 1081-1085 (1989). Ausubel (ed.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc. (1994). T. Maniatis, E. F. Fritsch and J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989). Pearson, Methods Mol. Biol. 243:307-31 (1994). Gonnet et al., Science 256: 1443-45 (1992)]에 제공되어 있다.
항체, 또는 그의 항원-결합 부분은 또 다른 기능적 분자에 유도체화되거나 연결될 수 있다. 예를 들어, 항체는 1종 이상의 다른 분자적 실체, 예컨대 또 다른 항체, 검출가능한 작용제, 세포독성제, 제약 작용제, 또 다른 분자 (예컨대 스트렙타비딘 코어 영역 또는 폴리히스티딘 태그)와의 회합을 매개할 수 있는 단백질 또는 펩티드, 아미노산 링커, 신호 서열, 면역원성 담체, 또는 단백질 정제에 유용한 리간드, 예컨대 글루타티온-S-트랜스퍼라제, 히스티딘 태그, 및 스타필로코쿠스 단백질 A에 기능적으로 (화학적 커플링, 유전적 융합, 비공유 상호작용 등에 의해) 연결될 수 있다. 유도체화 단백질의 한 가지 유형은 (동일한 유형의 또는 상이한 유형의) 2종 이상의 단백질을 가교시킴으로써 제조된다. 적합한 가교제는 적절한 스페이서에 의해 분리된 2개의 별개의 반응성 기를 갖는 이종이관능성 (예를 들어, m-말레이미도벤조일-N-히드록시숙신이미드 에스테르), 또는 동종이관능성 (예를 들어, 디숙신이미딜 수베레이트)의 것들을 포함한다. 이러한 링커는 록포드 111 소재 피어스 케미칼 캄파니(Pierce Chemical Company)로부터 입수가능하다. 단백질이 유도체화될 (또는 표지될) 수 있는 유용한 검출가능한 작용제는 형광 화합물, 다양한 효소, 보결분자단, 발광 물질, 생물발광 물질, 및 방사성 물질을 포함한다. 비-제한적인, 예시적인 형광 검출가능한 작용제는 플루오레세인, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민, 및 피코에리트린을 포함한다. 단백질 또는 항체는 또한 검출가능한 효소, 예컨대 알칼리성 포스파타제, 양고추냉이 퍼옥시다제, 베타-갈락토시다제, 아세틸콜린에스테라제, 글루코스 옥시다제 등으로 유도체화될 수 있다. 단백질은 또한 보결분자단 (예를 들어, 스트렙타비딘/비오틴 및 아비딘/비오틴)으로 유도체화될 수 있다.
본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 부분의 기능적 활성 변이체를 코딩하는 핵산은 또한 본 발명에 의해 포함된다. 이들 핵산 분자는 중간 엄격성, 높은 엄격성, 또는 매우 높은 엄격성 조건 하에서 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 부분 중 임의의 것을 코딩하는 핵산과 혼성화할 수 있다. 혼성화 반응을 수행하기 위한 안내는 문헌 [Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. 6.3.1-6.3.6, 1989]에서 발견될 수 있으며, 이는 본원에 참조로 포함된다. 본원에 언급된 특이적 혼성화 조건은 하기와 같다: (1) 중간 엄격성 혼성화 조건: 약 45℃에서 6 X SSC, 이어서 60℃에서 0.2 X SSC, 0.1% SDS에서 1회 이상 세척; (2) 높은 엄격성 혼성화 조건: 약 45℃에서 6 X SSC, 이어서 65℃에서 0.2XSSC, 0.1% SDS에서 1회 이상 세척; 및 (3) 매우 높은 엄격성 혼성화 조건: 65℃에서 0.5 M 인산나트륨, 7% SDS, 이어서 65℃에서 0.2XSSC, 1% SDS에서 1회 이상 세척.
본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 부분을 코딩하는 핵산을 적합한 발현 시스템에서 발현될 수 있는 발현 벡터 내로 도입한 후, 발현된 항체 또는 그의 항원-결합 부분을 단리 또는 정제할 수 있다. 임의로, 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 부분을 코딩하는 핵산은 무세포 번역 시스템에서 번역될 수 있다. 미국 특허 번호 4,816,567. 문헌 [Queen et al., Proc Natl Acad Sci USA, 86: 10029-10033 (1989)].
본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 목적하는 항체의 경쇄 및 중쇄 (또는 그의 부분)를 코딩하는 DNA로 형질전환된 숙주 세포에 의해 생산될 수 있다. 항체는 표준 기술을 사용하여 이들 배양물 상청액 및/또는 세포로부터 단리되고, 정제될 수 있다. 예를 들어, 숙주 세포는 항체의 경쇄, 중쇄, 또는 둘 다를 코딩하는 DNA로 형질전환될 수 있다. 재조합 DNA 기술은 또한 결합에 필요하지 않은 경쇄 및 중쇄 중 어느 하나 또는 둘 다를 코딩하는 DNA의 일부 또는 전부, 예를 들어, 불변 영역을 제거하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 핵산은 원핵 세포 및 진핵 세포, 예를 들어, 박테리아 세포 (예를 들어, 이. 콜라이(E. coli)), 효모 세포, 식물 세포, 곤충 세포, 및 포유동물 세포를 포함한 다양한 적합한 세포에서 발현될 수 있다. 다수의 포유동물 세포주는 관련 기술분야에 공지되어 있으며, 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC)으로부터 이용가능한 불멸화 세포주를 포함한다. 세포의 비제한적 예는 원숭이 신장 세포의 모 세포, 유도체 및/또는 조작된 변이체 (COS, 예를 들어, COS-1, COS-7), HEK293, 새끼 햄스터 신장 (BHK, 예를 들어, BHK21), 차이니스 햄스터 난소 (CHO), NSO, PerC6, BSC-1, 인간 간세포성 암종 세포 (예를 들어, Hep G2), SP2/0, HeLa, 마딘-다비(Madin-Darby) 소 신장 (MDBK), 골수종 및 림프종 세포를 포함하나 이에 제한되지는 않는 포유동물 기원 또는 포유동물-유사 특징의 모든 세포주를 포함한다. 조작된 변이체는 예를 들어, 글리칸 프로파일 변형된 및/또는 부위-특이적 통합 부위 유도체를 포함한다.
본 발명은 또한 본원에 기재된 핵산을 포함하는 세포를 제공한다. 세포는 하이브리도마 또는 형질감염체일 수 있다.
대안적으로, 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 관련 기술분야에 널리 공지된 고체 상 절차에 의해 합성될 수 있다. 문헌 [Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach by E. Atherton and R. C. Sheppard, published by IRL at Oxford University Press (1989). Methods in Molecular Biology, Vol. 35: Peptide Synthesis Protocols (ed. M. W.Pennington and B. M. Dunn), chapter 7. Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd Ed., Pierce Chemical Co., Rockford, IL (1984). G. Barany and R. B. Merrifield, The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology, editors E. Gross and J. Meienhofer, Vol. 1 and Vol. 2, Academic Press, New York, (1980), pp. 3-254. M. Bodansky, Principles of Peptide Synthesis, Springer-Verlag, Berlin (1984)].
비-인간 (예를 들어, 뮤린) 항체의 "인간화" 형태는 비-인간 이뮤노글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 함유하는 키메라 항체이다. 한 실시양태에서, 인간화 항체는 수용자의 초가변 영역으로부터의 잔기가 목적하는 특이성, 친화도 및/또는 능력을 갖는 비-인간 종 (공여자 항체), 예컨대 마우스, 래트, 토끼 또는 비인간 영장류의 초가변 영역으로부터의 잔기에 의해 대체된 인간 이뮤노글로불린 (수용자 항체)이다. 일부 경우에, 인간 이뮤노글로불린의 프레임워크 영역 (FR) 잔기는 상응하는 비-인간 잔기에 의해 대체된다. 추가로, 인간화 항체는 수용자 항체 또는 공여자 항체에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이들 변형은 항체 성능을 추가로 정밀화하기 위해 이루어진다. 일반적으로, 인간화 항체는 적어도 1개 및 전형적으로 2개의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함할 것이며, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 초가변 루프는 비-인간 이뮤노글로불린의 것에 상응하고, 모든 또는 실질적으로 모든 FR은 인간 이뮤노글로불린 서열의 것이다. 또한, 인간화 항체는 임의로 이뮤노글로불린 불변 영역 (Fc) 중 적어도 한 부분, 전형적으로 인간 이뮤노글로불린의 것을 포함할 것이다. 추가의 세부사항에 대해서는, 문헌 [Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); and Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)]을 참조한다. 또한 하기 종설 논문 및 인용된 참고문헌: [Vaswani and Hamilton, Ann. Allergy, Asthma & Immunol. 1:105-115 (1998); Harris, Biochem. Soc. Transactions 23:1035-1038 (1995); Hurle and Gross, Curr. Op. Biotech. 5:428-433 (1994)]을 참조한다.
용어 "초가변 영역", "HVR", 또는 "HV"는, 본원에서 사용될 때, 서열이 초가변성이고/이거나 구조적으로 한정된 루프를 형성하는 항체 가변 도메인의 영역을 지칭한다. 일반적으로, 항체는 6개의 초가변 영역을 포함하며; VH에 3개가 있고 (H1, H2, H3), VL에 3개가 있다 (L1, L2, L3). 다수의 초가변 영역 묘사가 사용되고 있으며 본원에 포괄된다. 카바트(Kabat) 상보성 결정 영역 (CDR)은 서열 가변성을 기초로 하며, 가장 통상적으로 사용된다 (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)). 대신, 코티아(Chothia)는 구조적 루프의 위치를 지칭한다 (문헌 [Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)]).
"프레임워크" 또는 "FW" 잔기는 본원에 정의된 바와 같은 초가변 영역 잔기 이외의 가변 도메인 잔기이다.
용어 "카바트에서와 같은 가변 도메인 잔기 넘버링" 또는 "카바트에서와 같은 아미노산 위치 넘버링", 및 그의 변형은 문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)]에서의 항체의 편집의 중쇄 가변 도메인 또는 경쇄 가변 도메인에 대해 사용된 넘버링 시스템을 지칭한다. 이러한 넘버링 시스템을 사용하여, 실제 선형 아미노산 서열은 가변 도메인의 FR 또는 HVR의 단축, 또는 그 내로의 삽입에 상응하게 보다 적은 또는 추가의 아미노산을 함유할 수 있다. 예를 들어, 중쇄 가변 도메인은 H2의 잔기 52 다음에 단일 아미노산 삽입물 (카바트에 따라 잔기 52a), 및 중쇄 FR 잔기 82 다음에 삽입된 잔기 (예를 들어, 카바트에 따라 잔기 82a, 82b, 및 82c 등)를 포함할 수 있다. 잔기의 카바트 넘버링은 항체 서열을 "표준" 카바트 넘버링된 서열과 상동성 영역에서 정렬함으로써 주어진 항체에 대해 결정될 수 있다.
"단일-쇄 Fv" 또는 "scFv" 항체 단편은 항체의 VH 및 VL 도메인을 포함하며, 여기서 이들 도메인은 단일 폴리펩티드 쇄에 존재한다. 일반적으로, scFv 폴리펩티드는 scFv가 항원 결합을 위한 목적하는 구조를 형성할 수 있게 하는, VH 도메인과 VL 도메인 사이의 폴리펩티드 링커를 추가로 포함한다. scFv의 검토에 대해서는 문헌 [Pluckthun, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)]을 참조한다.
용어 "디아바디"는 2개의 항원-결합 부위를 갖는 소형 항체 단편을 지칭하며, 상기 단편은 동일한 폴리펩티드 쇄에 경쇄 가변 도메인 (VL)에 연결된 중쇄 가변 도메인 (VH) (VH-VL)을 포함한다. 동일한 쇄 상의 2개의 도메인 사이의 쌍형성을 허용하기에 너무 짧은 링커를 사용함으로써, 도메인은 또 다른 쇄의 상보적 도메인과 쌍형성하도록 강제되고 2개의 항원-결합 부위를 생성한다. 디아바디는 예를 들어, EP 404,097; WO 93/1161; 및 문헌 [Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993)]에 보다 충분히 기재되어 있다.
"인간 항체"는 인간에 의해 생산된 항체의 것에 상응하는 아미노산 서열을 보유하고/거나 본원에 개시된 바와 같은 인간 항체를 제조하기 위한 임의의 기술을 사용하여 제조된 것이다. 인간 항체의 이러한 정의는 구체적으로 비-인간 항원-결합 잔기를 포함하는 인간화 항체를 배제한다.
"친화도 성숙" 항체는 변경(들)을 갖지 않는 모 항체에 비해 항원에 대한 항체의 친화도를 개선시키는, 그의 하나 이상의 HVR에 하나 이상의 변경을 갖는 항체이다. 한 실시양태에서, 친화도 성숙 항체는 표적 항원에 대해 나노몰 또는 심지어 피코몰의 친화도를 갖는다. 친화도 성숙 항체는 관련 기술분야에 공지된 절차에 의해 생산된다. 문헌 [Marks et al. Bio/Technology 10:779-783 (1992)]은 VH 및 VL 도메인 셔플링(shuffling)에 의한 친화도 성숙을 기재하고 있다. CDR 및/또는 프레임워크 잔기의 무작위 돌연변이유발이 하기 문헌에 기재되어 있다: 문헌 [Barbas et al. Proc Nat. Acad. Sci. USA 91:3809-3813 (1994); Schier et al. Gene 169:147-155 (1995); Yelton et al. J. Immunol. 155:1994-2004 (1995); Jackson et al., J. Immunol. 154(7):3310-9 (1995); 및 Hawkins et al., J. Mol. Biol. 226:889-896 (1992)].
"차단" 항체 또는 "길항제" 항체는 그가 결합하는 항원의 생물학적 활성을 억제하거나 또는 감소시키는 항체이다. 특정 차단 항체 또는 길항제 항체는 항원의 생물학적 활성을 실질적으로 또는 완전히 억제한다.
본원에 사용된 "효능제 항체"는 관심 폴리펩티드의 기능적 활성 중 적어도 하나를 모방하는 항체이다.
"장애"는 본 발명의 항체를 사용한 치료로부터 이익을 얻을 임의의 상태이다. 이는 만성 및 급성 장애 또는 질환 (포유동물이 해당 장애에 걸리기 쉬운 병리학적 상태 포함)을 포함한다. 본원에서 치료될 장애의 비제한적 예는 암을 포함한다.
용어 "세포 증식성 장애" 및 "증식성 장애"는 어느 정도의 비정상 세포 증식과 연관된 장애를 지칭한다. 한 실시양태에서, 세포 증식성 장애는 암이다.
본원에 사용된 "종양"은 악성이든 양성이든 모든 신생물성 세포 성장 및 증식, 및 모든 전암성 및 암성 세포 및 조직을 지칭한다. 용어 "암", "암성", "세포 증식성 장애", "증식성 장애" 및 "종양"은 본원에 언급된 바와 같이 상호 배타적이지 않다.
용어 "암" 및 "암성"은 전형적으로 비조절된 세포 성장/증식을 특징으로 하는 포유동물에서의 생리학적 상태를 지칭하거나 기재한다. 암의 예는 암종, 림프종 (예를 들어, 호지킨 및 비호지킨 림프종), 모세포종, 육종 및 백혈병을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 이러한 암의 보다 특정한 예는 편평 세포암, 소세포 폐암, 비소세포 폐암, 폐의 선암종, 폐의 편평세포 암종, 복막암, 간세포성암, 위장암, 췌장암, 교모세포종, 자궁경부암, 난소암, 간암, 방광암, 간세포암, 유방암, 결장암, 결장직장암, 자궁내막 또는 자궁 암종, 타액선 암종, 신장암, 간암, 전립선암, 외음부암, 갑상선암, 간 암종, 백혈병 및 다른 림프증식성 장애, 및 다양한 유형의 두경부암을 포함한다.
본원에 사용된 "치료"는 치료될 개체 또는 세포의 자연적인 경과를 변경하려는 시도에서의 임상 개입을 지칭하고, 예방을 위해 또는 임상 병리상태의 과정 도중에 수행될 수 있다. 치료의 바람직한 효과는 질환의 발생 또는 재발 방지, 증상의 완화, 질환의 임의의 직접 또는 간접적인 병리학 결과의 축소, 염증 및/또는 조직/장기 손상의 방지 또는 감소, 질환 진행 속도의 감소, 질환 상태의 개선 또는 호전, 및 완화 또는 개선된 예후를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체는 질환 또는 장애의 발병을 지연시키기 위해 사용된다.
"개체" 또는 "대상체"는 척추동물이다. 특정 실시양태에서, 척추동물은 포유동물이다. 포유동물에는 가축 (예컨대 소), 스포츠 동물, 애완동물 (예컨대 고양이, 개 및 말), 영장류, 마우스 및 래트가 포함되지만, 이에 제한되지는 않는다. 특정 실시양태에서, 척추동물은 인간이다.
치료 목적을 위한 "포유동물"은 인간, 가축 및 농장 동물, 및 동물원, 스포츠 또는 애완 동물, 예컨대 개, 말, 고양이, 소 등을 포함하는, 포유동물로 분류되는 임의의 동물을 지칭한다. 특정 실시양태에서, 포유동물은 인간이다.
"유효량"은 목적하는 치료 또는 예방 결과를 달성하기 위해 필요한 투여량에서 및 이러한 기간 동안 유효한 양을 지칭한다.
본 발명의 물질/분자의 "치료 유효량"은 개체의 질환 상태, 연령, 성별, 및 체중, 및 개체에서 목적하는 반응을 유도하는 물질/분자의 능력과 같은 요인에 따라 변할 수 있다. 또한, 치료 유효량은 물질/분자의 임의의 독성 또는 유해한 효과를 치료상 유익한 효과가 능가하는 양이다. "예방 유효량"은 목적하는 예방 결과를 달성하는데 필요한 투여량 및 기간에서 이를 달성하는데 유효한 양을 지칭한다. 반드시는 아니지만 전형적으로, 예방 용량은 질환의 보다 초기 단계에 앞서, 또는 보다 초기 단계에서 대상체에서 사용되기 때문에, 예방 유효량은 치료 유효량 미만일 것이다.
"조합"은 조합 요법을 지칭하며, 이는 치료 주기 동안 동일한 날 또는 상이한 날에 순차적으로 또는 동시에 함께 투여된 경우에 (공-투여 및/또는 공-제제화), 치료상 유효하고 치료상 상가적인 것보다 더 큰 상승작용적 효과를 갖는 항체-약물 접합체의 양 및/또는 다른 생물학적 또는 화학적 약물의 양일 것이다.
용어 "암" 및 "암성"은 전형적으로 비조절된 세포 성장을 특징으로 하는 포유동물에서의 생리학적 상태를 지칭하거나 기재한다. "종양"은 1개 이상의 암성 세포를 포함한다. 암의 예는 암종, 림프종, 모세포종, 육종 및 백혈병 또는 림프성 악성종양을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
본원에 사용된 용어 "세포독성제"는 세포의 기능을 억제하거나 막고/거나 세포의 파괴를 유발하는 물질을 지칭한다. 상기 용어는 방사성 동위원소 (예를 들어, 211At, 131I, 125I, 90Y, 186Re, 188Re, 153Sm, 212Bi, 32P, 60C, 및 루테튬-177, 스트론튬-89 및 사마륨 (153Sm)의 방사성 동위원소), 화학요법제, 및 독소, 예컨대 소분자 독소, 또는 박테리아, 진균, 식물 또는 동물 기원의 효소적 활성 독소, 예컨대 그의 합성 유사체 및 유도체를 포함하는 것으로 의도된다.
때때로 광화학요법으로도 불리는 용어 "광역학 요법 (PDT)"은 세포 사멸 (광독성)을 도출하기 위해 분자 산소와 함께 사용되는, 빛 및 광증감 화학 물질을 수반하는 광선요법의 한 형태이다. 이는 습성 연령-관련 황반 변성, 건선, 아테롬성동맥경화증을 포함한 광범위한 의학적 상태를 치료하기 위해 임상적으로 사용되며, 포진을 포함한 항바이러스 치료에서 일부 효능을 나타내었다. 이는 또한 두경부암, 폐암, 방광암, 피부암 및 전립선암을 포함한 악성 암을 치료한다 (Wang, SS et al. Cancer Journal. 8 (2): 154-63. 2002). "광역학 치료제"는 포토프린, 레이저피린, 아미노레불린산 (ALA), 규소 프탈로시아닌 Pc 4, m-테트라히드록시페닐클로린 (mTHPC), 클로린 e6 (Ce6), 알루메라, 레불란, 포스칸, 메트빅스, 헥스빅스, 포토클로르, 포토센스, 포트렉스, 루마칸, 비소낙, 암피넥스, 베르테포르핀, 퓨를리틴, ATMPn, 아연 프탈로시아닌 (ZnPc), 프로토포르피린 IX (PpIX), 피로페오포르비드 a (PPa) 또는 페오포르비드 a (PhA)로부터 선택된다.
"화학요법제"는 암의 치료에 유용한 화학적 화합물이다. 화학요법제의 예는 모노메틸 아우리스타틴 E (MMAE), 모노메틸 아우리스타틴 F (MMAF), 메르탄신 (또한 DM1로도 불림), 안트라시클린, 피롤로벤조디아제핀, α-아마니틴, 튜부리신, 벤조디아제핀, 에를로티닙 (타르세바(TARCEVA)®), 제넨테크(Genentech)/오에스아이 팜.(OSI Pharm.)), 보르테조밉 (벨케이드(VELCADE)®, 밀레니엄 팜.(Millenium Pharm.)), 풀베스트란트 (파슬로덱스(FASLODEX)®, 아스트라제네카(Astrazeneca)), 수니티닙 (수텐트(SUTENT)®, SU11248, 화이자(Pfizer)), 레트로졸 (페마라(FEMARA)®), 노파르티스(Novartis)), 이마티닙 메실레이트 (글리벡(GLEEVEC)®, 노파르티스), PTK787/ZK 222584 (노파르티스), 옥살리플라틴 (엘록사틴(ELOXATIN)®, 사노피(Sanofi)), 류코보린, 라파마이신 (시롤리무스, 라파뮨(RAPAMUNE)®, 와이어쓰(Wyeth)), 라파티닙 (타이커브(TYKERB)®, GSK572016, 글락소스미스클라인(GlaxoSmithKline)), 로나파르닙 (사라사르(SARASAR)®, SCH 66336), 소라페닙 (넥사바르(NEXAVAR)®, BAY43-9006, 바이엘 랩스.(Bayer Labs.)) 및 게피티닙 (이레사(IRESSA)®, 아스트라제네카), AG1478, AG1571 (SU 5271; 수젠(Sugen)), 알킬화제 예컨대 티오테파 및 시톡산(CYTOXAN)® 시클로포스파미드; 알킬 술포네이트 예컨대 부술판, 임프로술판 및 피포술판; 아지리딘 예컨대 벤조도파, 카르보쿠온, 메투레도파, 및 우레도파; 알트레타민, 트리에틸렌멜라민, 트리에틸렌포스포르아미드, 트리에틸렌티오포스포르아미드 및 트리메틸로멜라민을 포함한 에틸렌이민 및 메틸라멜라민; 아세토게닌 (특히 불라타신 및 불라타시논); 캄프토테신 (합성 유사체 토포테칸 포함); 브리오스타틴; 칼리스타틴; CC-1065 (그의 아도젤레신, 카르젤레신 및 비젤레신 합성 유사체 포함); 크립토피신 (특히 크립토피신 1 및 크립토피신 8); 돌라스타틴; 두오카르마이신 (합성 유사체, KW-2189 및 CB1-TM1 포함); 엘레우테로빈; 판크라티스타틴; 사르코딕티인; 스폰지스타틴; 질소 머스타드 예컨대 클로람부실, 클로르나파진, 콜로포스파미드, 에스트라무스틴, 이포스파미드, 메클로레타민, 메클로레타민 옥시드 히드로클로라이드, 멜팔란, 노벰비킨, 페네스테린, 프레드니무스틴, 트로포스파미드, 우라실 머스타드; 니트로스우레아 예컨대 카르무스틴, 클로로조토신, 포테무스틴, 로무스틴, 니무스틴 및 라니무스틴; 항생제 예컨대 에네디인 항생제 (예를 들어, 칼리케아미신, 특히 칼리케아미신 감마1I 및 칼리케아미신 오메가I1 (Angew Chem. Intl. Ed. Engl. (1994) 33:183-186); 디네미신 A를 포함한 디네미신; 비스포스포네이트, 예컨대 클로드로네이트; 에스페라미신; 뿐만 아니라 네오카르지노스타틴 발색단 및 관련 색소단백질 에네디인 항생제 발색단), 아클라시노마이신, 악티노마이신, 아우트라마이신, 아자세린, 블레오마이신, 칵티노마이신, 카라비신, 카미노마이신, 카르지노필린, 크로모미시니스, 닥티노마이신, 다우노루비신, 데토루비신, 6-디아조-5-옥소-L-노르류신, 아드리아마이신(ADRIAMYCIN)® 독소루비신 (모르폴리노-독소루비신, 시아노모르폴리노-독소루비신, 2-피롤리노-독소루비신 및 데옥시독소루비신 포함), 에피루비신, 에소루비신, 이다루비신, 마르셀로마이신, 미토마이신 예컨대 미토마이신 C, 미코페놀산, 노갈라마이신, 올리보마이신, 페플로마이신, 포트피로마이신, 퓨로마이신, 쿠엘라마이신, 로도루비신, 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 투베르시딘, 우베니멕스, 지노스타틴, 조루비신; 항대사물 예컨대 메토트렉세이트 및 5-플루오로우라실 (5-FU); 폴산 유사체 예컨대 데노프테린, 프테로프테린, 트리메트렉세이트; 퓨린 유사체 예컨대 플루다라빈, 6-메르캅토퓨린, 티아미프린, 티오구아닌; 피리미딘 유사체 예컨대 안시타빈, 아자시티딘, 6-아자우리딘, 카르모푸르, 시타라빈, 디데옥시우리딘, 독시플루리딘, 에노시타빈, 플록수리딘; 안드로겐 예컨대 칼루스테론, 드로모스타놀론 프로피오네이트, 에피티오스타놀, 메피티오스탄, 테스토락톤; 항부신제 예컨대 아미노글루테티미드, 미토탄, 트릴로스탄; 폴산 보충제 예컨대 프롤린산; 아세글라톤; 알도포스파미드 글리코시드; 아미노레불린산; 에닐우라실; 암사크린; 베스트라부실; 비산트렌; 에다트락세이트; 데포파민; 데메콜신; 디아지쿠온; 엘포르미틴; 엘립티늄 아세테이트; 에포틸론; 에토글루시드; 질산갈륨; 히드록시우레아; 렌티난; 로니다이닌; 메이탄시노이드 예컨대 메이탄신 및 안사미토신; 미토구아존; 미톡산트론; 모피단몰; 니트라에린; 펜토스타틴; 페나메트; 피라루비신; 로속산트론; 포도필린산; 2-에틸히드라지드; 프로카르바진; PSK® 폴리사카라이드 복합체 (JHS 내츄럴 프로덕츠, 오레곤주 유진); 라족산; 리족신; 시조피란; 스피로게르마늄; 테누아존산; 트리아지쿠온; 2,2',2"-트리클로로트리에틸아민; 트리코테센 (특히 T-2 독소, 베라큐린 A, 로리딘 A 및 안구이딘); 우레탄; 빈데신; 다카르바진; 만노무스틴; 미토브로니톨; 미토락톨; 피포브로만; 가시토신; 아라비노시드 ("Ara-C"); 시클로포스파미드; 티오테파; 탁소이드, 예를 들어, 탁솔(TAXOL)® 파클리탁셀 (브리스톨-마이어스 스큅 온콜로지(Bristol-Myers Squibb Oncology), 뉴저지주 프린스턴), 아브락산(ABRAXANE)™ 파클리탁셀의 크레모포르-무함유, 알부민-조작된 나노입자 제제 (아메리칸 파마슈티칼 파트너스(American Pharmaceutical Partners), 일리노이주 샴버그) 및 탁소테레(TAXOTERE)® 도세탁셀 (롱-프랑 로러(Rhone-Poulenc Rorer), 프랑스 안토니); 클로란부실; 겜자르(GEMZAR)® 겜시타빈; 6-티오구아닌; 메르캅토퓨린; 메토트렉세이트; 백금 유사체 예컨대 시스플라틴 및 카르보플라틴; 빈블라스틴; 백금; 에토포시드 (VP-16); 이포스파미드; 미톡산트론; 빈크리스틴; 나벨빈(NAVELBINE)® 비노렐빈; 노반트론; 테니포시드; 에다트렉세이트; 다우노마이신; 아미노프테린; 젤로다; 이반드로네이트; CPT-11; 토포이소머라제 억제제 RFS 2000; 디플루오로메틸오르니틴 (DMFO); 레티노이드 예컨대 레티노산; 카페시타빈 (젤로다(XELODA)®, 로슈(Roche)); 및 상기 중 임의의 것의 제약상 허용되는 염, 산 또는 유도체를 포함한다.
또한 "화학요법제"의 이러한 정의에는 (i) 종양에 대한 호르몬 작용을 조절하거나 억제하는 작용을 하는 항호르몬제 예컨대 항에스트로겐 및 선택적 에스트로겐 수용체 조정제 (SERM), 예컨대, 예를 들어, 타목시펜 (놀바덱스(NOLVADEX)® 타목시펜 포함), 랄록시펜, 드롤록시펜, 4-히드록시타목시펜, 트리옥시펜, 케옥시펜, LY117018, 오나프리스톤 및 파레스톤, 토레미펜; (ii) 부신에서의 에스트로겐 생산을 조절하는 효소 아로마타제를 억제하는 아로마타제 억제제, 예컨대, 예를 들어, 4(5)-이미다졸, 아미노글루테티미드, 메가세(MEGASE)® 메게스트롤 아세테이트, 아로마신(AROMASIN)® 엑세메스탄, 포르메스타니, 파드로졸, 리비소르(RIVISOR)® 보로졸, 페마라(FEMARA)® 레트로졸, 및 아리미덱스(ARIMIDEX)® 아나스트로졸; (iii) 항안드로겐 예컨대 플루타미드, 닐루타미드, 비칼루타미드, 류프롤리드 및 고세렐린; 뿐만 아니라 트록사시타빈 (1,3-디옥솔란 뉴클레오시드 시토신 유사체); (iv) 아로마타제 억제제; (v) 단백질 키나제 억제제; (vi) 지질 키나제 억제제; (vii) 안티센스 올리고뉴클레오티드, 특히 이상 세포 증식에 연루된 신호전달 경로, 예컨대, 예를 들어, PKC-알파, Ralf 및 H-Ras에서 유전자의 발현을 억제하는 것; (viii) 리보자임 예컨대 VEGF 발현 억제제 (예를 들어, 안지오자임(ANGIOZYME)® 리보자임) 및 HER2 발현 억제제; (ix) 백신 예컨대 유전자 요법 백신, 예를 들어, 알로벡틴(ALLOVECTIN)® 백신, 류벡틴(LEUVECTIN)® 백신, 및 박시드(VAXID)® 백신; 프로류킨(PROLEUKIN)® rIL-2; 루르토테칸(LURTOTECAN)® 토포이소머라제 1 억제제; 아바렐릭스(ABARELIX)® rmRH; (x) 항혈관신생제 예컨대 베바시주맙 (아바스틴(AVASTIN)®, 제넨테크); 및 (xi) 상기 중 임의의 것의 제약상 허용되는 염, 산 또는 유도체가 포함된다.
단백질 키나제 억제제는 티로신 키나제 예컨대 ErbB 수용체의 티로신 키나제 활성을 어느 정도까지 억제하는 티로신 키나제 억제제를 포함한다. 티로신 키나제 억제제의 예는 EGFR-표적화된 약물 예컨대: (i) EGFR에 결합하는 항체, 예컨대 MAb 579 (ATCC CRL HB 8506), MAb 455 (ATCC CRL HB8507), MAb 225 (ATCC CRL 8508), MAb 528 (ATCC CRL 8509) (미국 특허 번호 4,943,533 (Mendelsohn et al.) 참조) 및 그의 변이체, 예컨대 키메라 225 (C225 또는 세툭시맙; 에르비툭스(ERBITUX)®, 임클론(Imclone)) 및 재형성된 인간 225 (H225) (WO 96/40210, 임클론 시스템즈 인크.(Imclone Systems Inc.)); 유형 II 돌연변이체 EGFR에 결합하는 항체 (미국 특허 번호 5,212,290); EGFR에 결합하는 인간화 및 키메라 항체 (미국 특허 번호 5,891,996); 및 EGFR에 결합하는 인간 항체, 예컨대 ABX-EGF (WO 98/50433); (ii) 세포독성제와 접합된 항-EGFR 항체 (EP 659439A2); 및 EGFR에 결합하는 소분자 예컨대 ZD1839 또는 게피티닙 (이레사™; 아스트라 제네카), 에를로티닙 HCl (CP-358774, 타르세바™; 제넨테크/오에스아이) 및 AG1478, AG1571 (SU 5271; 수젠), 퀴나졸린 예컨대 PD 153035,4-(3-클로로아닐리노) 퀴나졸린, 피리도피리미딘, 피리미도피리미딘, 피롤로피리미딘, 예컨대 CGP 59326, CGP 60261 및 CGP 62706, 및 피라졸로피리미딘, 4-(페닐아미노)-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘, 쿠르쿠민 (디페룰로일 메탄, 4,5-비스(4-플루오로아닐리노)프탈이미드), 니트로티오펜 모이어티를 함유하는 티르포스틴; PD-0183805 (워너-램버트(Warner-Lambert)); 안티센스 분자 (예를 들어, ErbB-코딩 핵산에 결합하는 것); 퀴녹살린 (미국 특허 번호 5,804,396); 트리포스틴 (미국 특허 번호 5,804,396); ZD6474 (아스트라 제네카); PTK-787 (노파르티스/쉐링 아게(Schering AG)); 범-ErbB 억제제 예컨대 CI-1033 (화이자); 아피니탁 (ISIS 3521; 이스이스(Isis)/릴리(Lilly)); 이마티닙 메실레이트 (글리벡; 노파르티스); PKI 166 (노파르티스); GW2016 (글락소 스미스클라인); CI-1033 (화이자); EKB-569 (와이어쓰); 세막사닙 (수젠); ZD6474 (아스트라제네카); PTK-787 (노파르티스/쉐링 아게); INC-1C11 (임클론); 또는 미국 특허 번호 5,804,396; WO 99/09016 (아메리칸 시아나미드(American Cyanamid)); WO 98/43960 (아메리칸 시아나미드); WO 97/38983 (워너 램버트(Warner Lambert)); WO 99/06378 (워너 램버트); WO 99/06396 (워너 램버트); WO 96/30347 (화이자, 인크); WO 96/33978 (제네카); WO 96/3397 (제네카); 및 WO 96/33980 (제네카)에 기재된 바와 같은 것을 포함한다.
"항혈관신생제"는 혈관 발생을 어느 정도로 차단 또는 방해하는 화합물을 지칭한다. 항혈관신생 인자는 예를 들어 혈관신생 촉진에 수반되는 성장 인자 또는 성장 인자 수용체에 결합하는 소분자 또는 항체일 수 있다. 예시적인 항혈관신생제는 혈관 내피 성장 인자 (VEGF)에 결합하는 항체 예컨대 베바시주맙 (아바스틴®, 제넨테크)이다.
용어 "시토카인"은 세포간 매개체로서 또 다른 세포에 대해 작용하는, 한 세포 집단에 의해 방출된 단백질에 대한 일반 용어이다. 이러한 시토카인의 예는 림포카인, 모노카인 및 전통적인 폴리펩티드 호르몬이다. 시토카인에는 성장 호르몬 예컨대 인간 성장 호르몬, N-메티오닐 인간 성장 호르몬 및 소 성장 호르몬; 부갑상선 호르몬; 티록신; 인슐린; 프로인슐린; 렐락신; 프로렐락신; 당단백질 호르몬 예컨대 여포 자극 호르몬 (FSH), 갑상선 자극 호르몬 (TSH), 및 황체형성 호르몬 (LH); 간 성장 인자; 섬유모세포 성장 인자; 프로락틴; 태반 락토겐; 종양 괴사 인자-α 및 -β; 뮐러-억제 물질; 마우스 고나도트로핀-연관 펩티드; 인히빈; 액티빈; 혈관 내피 성장 인자; 인테그린; 트롬보포이에틴 (TPO); 신경 성장 인자 예컨대 NGF-β; 혈소판-성장 인자; 형질전환 성장 인자 (TGF) 예컨대 TGF-α 및 TGF-β; 인슐린-유사 성장 인자-I 및 -II; 에리트로포이에틴 (EPO); 골유도 인자; 인터페론 예컨대 인터페론-α, -β 및 -γ; 콜로니 자극 인자 (CSF) 예컨대 대식세포-CSF (M-CSF); 과립구-대식세포-CSF (GM-CSF); 및 과립구-CSF (G-CSF); 인터류킨 (IL) 예컨대 IL-1, IL-1α, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12; 종양 괴사 인자 예컨대 TNF-α 또는 TNF-β; 및 LIF 및 kit 리간드 (KL)를 포함한 다른 폴리펩티드 인자가 포함된다. 본원에 사용된 용어 시토카인은 천연 공급원으로부터의 또는 재조합 세포 배양물로부터의 단백질 및 천연 서열 시토카인의 생물학적 활성 등가물을 포함한다.
본 출원에 사용된 용어 "전구약물"은 모 약물과 비교하여 종양 세포에 덜 세포독성이고, 보다 활성의 모 형태로 효소적으로 활성화되거나 전환될 수 있는, 제약 활성 물질의 전구체 또는 유도체 형태를 지칭한다. 예를 들어, 문헌 [Wilman, "Prodrugs in Cancer Chemotherapy" Biochemical Society Transactions, 14, pp. 375-382, 615th Meeting Belfast (1986) 및 Stella et al., "Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery," Directed Drug Delivery, Borchardt et al., (ed.), pp. 247-267, Humana Press (1985)]을 참조한다. 본 발명의 전구약물은, 보다 활성의 세포독성 유리 약물로 전환될 수 있는, 포스페이트-함유 전구약물, 티오포스페이트-함유 전구약물, 술페이트-함유 전구약물, 펩티드-함유 전구약물, D-아미노산-변형된 전구약물, 글리코실화 전구약물, β-락탐-함유 전구약물, 임의로 치환된 페녹시아세트아미드-함유 전구약물 또는 임의로 치환된 페닐아세트아미드-함유 전구약물, 5-플루오로시토신 및 다른 5-플루오로우리딘 전구약물을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 본 발명에 사용하기 위한 전구약물 형태로 유도체화될 수 있는 세포독성 약물의 예는 상기 기재된 화학요법제를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
"리포솜"은 약물 (예컨대 본원에 개시된 항-ErbB2 항체 및, 임의로, 화학요법제)을 포유동물에게 전달하는데 유용한 다양한 유형의 지질, 인지질 및/또는 계면활성제로 구성된 작은 소포이다. 통상적으로, 리포솜의 성분은 생물학적 막의 지질 배열과 유사한 이중층 형태로 배열된다.
본원에 사용된 어구 "제약상 허용되는 염"은 ADC의 제약상 허용되는 유기 또는 무기 염을 지칭한다. 예시적인 염은 술페이트, 시트레이트, 아세테이트, 옥살레이트, 클로라이드, 브로마이드, 아이오다이드, 니트레이트, 비술페이트, 포스페이트, 산 포스페이트, 이소니코티네이트, 락테이트, 살리실레이트, 산 시트레이트, 타르트레이트, 올레에이트, 탄네이트, 판토테네이트, 비타르트레이트, 아스코르베이트, 숙시네이트, 말레에이트, 겐티시네이트, 푸마레이트, 글루코네이트, 글루쿠로네이트, 사카레이트, 포르메이트, 벤조에이트, 글루타메이트, 메탄술포네이트, 에탄술포네이트, 벤젠술포네이트, p-톨루엔술포네이트, 및 파모에이트 (즉, 1,1'-메틸렌-비스-(2-히드록시-3-나프토에이트)) 염을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 제약상 허용되는 염은 또 다른 분자 예컨대 아세테이트 이온, 숙시네이트 이온 또는 다른 반대이온의 포함을 수반할 수 있다. 반대이온은 모 화합물 상의 전하를 안정화시키는 임의의 유기 또는 무기 모이어티일 수 있다. 또한, 제약상 허용되는 염은 그의 구조 내에 1개 초과의 하전된 원자를 가질 수 있다. 다중 하전된 원자가 제약상 허용되는 염의 일부인 경우는 다중 반대 이온을 가질 수 있다. 따라서, 제약상 허용되는 염은 1개 이상의 하전된 원자 및/또는 1개 이상의 반대이온을 가질 수 있다.
"제약상 허용되는 용매화물"은 1개 이상의 용매 분자 및 ADC의 회합물을 지칭한다. 제약상 허용되는 용매화물을 형성하는 용매의 예는 물, 이소프로판올, 에탄올, 메탄올, DMSO, 에틸 아세테이트, 아세트산, 및 에탄올아민을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
예시적인 항체-약물 접합체의 일반적 특색
본 발명의 화합물은 항암 활성에 대해 유용성을 갖는 것을 포함한다. 특히, 화합물은 약물 모이어티에 접합된, 즉 링커에 의해 공유 부착된 항체를 포함하며, 여기서 약물은 항체에 접합되지 않은 경우에 세포독성 또는 세포증식억제 효과를 갖는다. 약물 모이어티의 생물학적 활성은 따라서 항체에의 접합에 의해 조정된다. 본 발명의 항체-약물 접합체 (ADC)는 유효 용량의 세포독성제를 종양 조직으로 선택적으로 전달할 수 있고, 그에 의해 보다 큰 선택성, 즉 보다 낮은 효과적인 용량이 달성될 수 있다.
항체-약물 접합체 (ADC)는 화학식 I:
Ab-(L-D)n (I)
또는 그의 제약상 허용되는 염 또는 용매화물에 의해 나타내어질 수 있고, 여기서:
Ab는 글로보 시리즈 항원에 결합하거나 또는 1종 이상의 종양-연관 항원 또는 세포-표면 수용체에 결합하는 항체이고; n은 약물-대-항체 비 (DAR)이며 1 내지 8 범위이다.
항체-약물 접합체 (ADC)는 링커에 의해 1종 이상의 MMAE 모이어티에 공유 부착된 항체를 포함한다. ADC는 화학식 I:
Ab-(L-D)n (I)
에 의해 나타내어질 수 있고, 여기서 1종 이상의 MMAE 약물 모이어티 (D)는 L에 의해 항체 (Ab)에 공유 연결된다. Ab는 글로보 시리즈 항원을 표적화하거나 또는 1종 이상의 종양-연관 항원 또는 세포-표면 수용체에 결합하는 항체이다. 링커 L은 세포 외부, 즉, 세포외에서 안정할 수 있다.
한 실시양태에서, 약물 모이어티의 실질적인 양은 항체-약물 접합체가 항체-약물 접합체의 항체에 특이적인 세포-표면 수용체를 갖는 세포에 진입할 때까지 항체로부터 절단되지 않고, 약물 모이어티는 항체-약물 접합체가 세포에 진입한 경우에 항체로부터 절단된다.
또 다른 실시양태에서, ADC는 글로보 시리즈 항원, 예컨대 글로보 H, SSEA-3 또는 SSEA-4에 특이적으로 결합한다. ADC는 글로보 H, SSEA-4, SSEA-3에 특이적으로 결합할 수 있다. ADC는 글로보 시리즈 항원을 발현하는 종양 세포의 성장을 억제할 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 화학식 I의 항체 (Ab)는 인간, 키메라 또는 인간화 항체이다.
본 발명의 또 다른 측면은 화학식 I의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염 또는 용매화물, 및 제약상 허용되는 희석제, 담체 또는 부형제를 포함하는 제약 조성물이다.
또 다른 측면은 화학식 I의 화합물 및 항암 특성 또는 다른 치료 효과를 갖는 제2 화합물을 포함하는 제약 조합물을 제공한다.
또 다른 측면은 본원에 개시된 화합물 및 조성물에 대한 진단 및 치료 용도를 포함한다.
또 다른 측면은 종양 세포 또는 암 세포를 사멸시키거나 그의 증식을 억제하기에 효과적인 양의 항체-약물 접합체, 또는 그의 제약상 허용되는 염 또는 용매화물로 세포를 처리하는 것을 포함하는, 종양 세포 또는 암 세포를 사멸시키거나 그의 증식을 억제하는 방법이다.
또 다른 측면은 환자에게 화학식 I의 화합물의 제제를 투여하는 것을 포함하는, 암을 치료하는 방법이다. 하나의 방법은 포유동물에서 암을 치료하기 위한 것이며, 여기서 암은 글로보 시리즈 항원의 발현을 특징으로 한다. 포유동물은 임의로 비접합된 항-글로보 시리즈 항원 항체에 의한 치료에 대해 반응하지 않거나, 또는 불량하게 반응한다. 방법은 포유동물에게 치료 유효량의 항체-약물 접합체 화합물을 투여하는 것을 포함한다.
또 다른 측면은 환자에게 성장 인자 수용체에 특이적으로 결합하는 항체-약물 접합체 화합물 및 화학요법제를 투여하는 것을 포함하는, 글로보 H, SSEA-4 및/또는 SSEA-3을 발현하는 종양 세포의 성장을 억제하는 방법이며, 여기서 상기 항체-약물 접합체 및 상기 화학요법제는 각각 환자에서 종양 세포의 성장을 억제하는데 효과적인 양으로 투여된다.
또 다른 측면은 화학식 I의 항체-약물 접합체 화합물 및 화학요법제의 조합물을 투여하는 것을 포함하는, 글로보 시리즈 항원의 발현을 특징으로 하는 장애에 감수성이거나 그러한 장애를 갖는 것으로 진단받은 인간 환자를 치료하는 방법이다.
또 다른 측면은 암 세포를 항체-약물 접합체 화합물에 노출시키는 단계, 및 항체-약물 접합체 화합물이 세포에 결합하는 정도를 결정하는 단계를 포함하는, 암 세포를 검출하기 위한 검정 방법이다.
또 다른 측면은 질환 또는 장애의 치료를 위한 ADC 약물 후보를 스크리닝하는 방법에 관한 것이며, 여기서 질환 또는 장애는 글로보 시리즈 항원의 발현을 특징으로 한다.
또 다른 측면은 항체-약물 접합체, 용기, 및 치료를 표시하는 패키지 삽입물 또는 라벨을 포함하는 제조 물품, 즉, 키트를 포함한다.
또 다른 측면은 항체-약물 접합체 화합물을 사용하여 환자에서 글로보 시리즈 항원의 과다발현을 특징으로 하는 질환 또는 장애를 치료하는 방법을 포함한다.
또 다른 측면은 항체-약물 접합체 화합물을 제작하는 방법, 제조하는 방법, 합성 방법, 접합 방법, 및 정제 방법, 및 항체-약물 접합체 화합물의 제조, 합성, 및 접합을 위한 중간체를 포함한다.
ADC: 항체:
화학식 I의 항체 단위 (Ab-)는, 그의 범주 내에, 주어진 표적-세포 집단과 연관된 수용체, 항원 또는 다른 수용 모이어티와 결합하거나 그와 반응적으로 회합하거나 그와 복합체화하는 항체의 임의의 단위를 포함한다. 항체는 치료적으로 또는 달리 생물학적으로 변형시키고자 세포 집단의 모이어티에 결합하거나 그와 복합체화하거나 그와 반응하는 임의의 단백질 또는 단백질-유사 분자일 수 있다. 한 측면에서, 항체 단위는 메이탄시노이드 약물 모이어티를 항체 단위가 반응하는 특정한 표적 세포 집단으로 전달하는 작용을 한다. 이러한 항체는 대분자량 단백질 예컨대, 전장 항체 및 항체 단편을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 항체-약물 접합체를 포함하는 항체는 바람직하게는 그의 천연, 야생형 대응물의 항원 결합 능력을 보유한다. 따라서, 본 발명의 항체는 항원에, 바람직하게는 특이적으로, 결합할 수 있다.
본원에서 용어 "항체"는 가장 넓은 의미로 사용되고, 구체적으로 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 이량체, 다량체, 다중특이적 항체 (예를 들어, 이중특이적 항체), 및 목적하는 생물학적 활성을 나타내는 한, 항체 단편을 포괄한다 (Miller et al. (2003) Jour. of Immunology 170:4854-4861). 항체는 뮤린, 인간, 인간화, 키메라 항체일 수 있거나, 또는 다른 종으로부터 유래될 수 있다. 항체는 특정 항원을 인식하고 그에 결합할 수 있는, 면역계에 의해 생성된 단백질이다 (Janeway, C., Travers, P., Walport, M., Shlomchik (2001) Immuno Biology, 5th Ed., Garland Publishing, New York). 표적 항원은 일반적으로 다중 항체 상의 CDR에 의해 인식되는, 에피토프로도 불리는 수많은 결합 부위를 갖는다. 상이한 에피토프에 특이적으로 결합하는 각각의 항체는 상이한 구조를 갖는다. 따라서, 1종의 항원은 1종 초과의 상응하는 항체를 가질 수 있다. 항체는 전장 이뮤노글로불린 분자, 또는 전장 이뮤노글로불린 분자의 면역학적 활성 부분, 즉 관심 표적의 항원 또는 그의 일부에 면역특이적으로 결합하는 항원 결합 부위를 함유하는 분자를 포함하며, 이러한 표적은 암 세포, 또는 자가면역 질환과 연관된 자가면역 항체를 생산하는 세포를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 본원에 개시된 이뮤노글로불린은 이뮤노글로불린 분자의 임의의 유형 (예를 들어, IgG, IgE, IgM, IgD, 및 IgA), 부류 (예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2) 또는 하위부류의 것일 수 있다. 이뮤노글로불린은 임의의 종으로부터 유래될 수 있다. 그러나, 한 측면에서, 이뮤노글로불린은 인간, 뮤린 또는 토끼 기원의 것이다.
예를 들어, 항체는 전장일 수 있거나, 또는 Fab, F(ab')2, Fab', F(ab)', Fv, 단일 쇄 Fv (scFv), 2가 scFv (비-scFv), 3가 scFv (트리-scFv), Fd, dAb 단편 (예를 들어, Ward et al., Nature, 341:544-546 (1989)), 단리된 CDR, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디, 선형 항체, 단일-쇄 항체 분자, 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체를 포함하나 이에 제한되지는 않는 항원-결합 부분을 갖는 항체의 단편 (또는 단편들)을 포함할 수 있다. 재조합 방법, 또는 합성 링커를 사용하여 항체 단편을 연결시킴으로써 생산된 단일 쇄 항체가 또한 본 발명에 포괄된다. 문헌 [Bird et al. Science, 1988, 242:423-426. Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1988, 85:5879-5883].
예를 들어, 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 단일특이적, 이중특이적 또는 다중특이적일 수 있다. 다중특이적 또는 이중특이적 항체 또는 그의 단편은 1종의 표적 탄수화물 (예를 들어, 글로보 H)의 상이한 에피토프에 특이적일 수 있거나, 또는 1종 초과의 표적 탄수화물에 특이적인 항원-결합 도메인 (예를 들어, 글로보 H, SSEA-3 및 SSEA-4에 특이적인 항원-결합 도메인)을 함유할 수 있다. 한 실시양태에서, 다중특이적 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 적어도 2개의 상이한 가변 도메인을 포함하며, 여기서 각각의 가변 도메인은 별개의 탄수화물 항원 또는 동일한 탄수화물 항원 상의 상이한 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있다. 문헌 [Tutt et al., 1991, J. Immunol. 147:60-69. Kufer et al., 2004, Trends Biotechnol. 22:238-244]. 본 발명의 항체는 또 다른 기능적 분자, 예를 들어, 또 다른 펩티드 또는 단백질에 연결되거나, 또는 그와 공동-발현될 수 있다. 예를 들어, 항체 또는 그의 단편은 1종 이상의 다른 분자적 실체, 예컨대 또 다른 항체 또는 항체 단편에 기능적으로 연결되어 (예를 들어, 화학적 커플링, 유전자 융합, 비공유 회합에 의해 또는 다른 방식으로) 제2 결합 특이성을 갖는 이중-특이적 또는 다중특이적 항체를 생산할 수 있다.
IgG (예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), IgM, IgA (IgA1, IgA2), IgD 또는 IgE를 포함한 모든 항체 이소형이 본 발명에 포괄된다 (모든 부류 및 하위부류가 본 발명에 포괄됨). 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 포유동물 (예를 들어, 마우스, 인간) 항체 또는 그의 항원-결합 부분일 수 있다. 항체의 경쇄는 카파 또는 람다 유형의 것일 수 있다.
본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 부분의 가변 영역은 비-인간 또는 인간 공급원으로부터의 것일 수 있다. 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 부분의 프레임워크는 인간, 인간화, 비-인간 (예를 들어, 인간에서의 항원성을 감소시키기 위해 변형된 뮤린 프레임워크), 또는 합성 프레임워크 (예를 들어, 컨센서스 서열)일 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 적어도 1개의 중쇄 가변 영역 및/또는 적어도 1개의 경쇄 가변 영역을 포함한다.
본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 글로보 H에 약 10E-7 M 미만, 약 10E-8 M 미만, 약 10E-9 M 미만, 약 10E-10 M 미만, 약 10E-11 M 미만, 또는 약 10E-12 M 미만의 해리 상수 (KD)로 특이적으로 결합한다. 한 실시양태에서, 항체 또는 그의 항체 결합 부분은 1~10x10E-9 이하의 해리 상수 (KD)를 갖는다. 또 다른 실시양태에서, Kd는 표면 플라즈몬 공명에 의해 결정된다.
본 발명의 항체-약물 접합체를 포함하는 항체는 바람직하게는 그의 천연, 야생형 대응물의 항원 결합 능력을 보유한다. 따라서, 본 발명의 항체는 항원에, 바람직하게는 특이적으로, 결합할 수 있다. 이러한 항원은 예를 들어 종양-연관 항원 (TAA), 세포 표면 수용체 단백질 및 다른 세포 표면 분자, 세포 생존 조절 인자, 세포 증식 조절 인자, 조직 발생 또는 분화와 연관된 분자 (예를 들어, 조직 발생 또는 분화에 기능적으로 기여하는 것으로 공지되거나 그렇게 여겨지는 분자), 림포카인, 시토카인, 세포 주기 조절에 수반되는 분자, 혈관생성에 수반되는 분자 및 혈관신생과 연관된 분자 (예를 들어, 혈관신생에 기능적으로 기여하는 것으로 공지되거나 그렇게 여겨지는 분자)를 포함한다. 종양-연관 항원은 클러스터 분화 인자 (즉, CD 단백질)일 수 있다. 본 발명의 항체가 결합할 수 있는 항원은 상기 언급한 카테고리 중 하나의 하위세트의 구성원일 수 있으며, 여기서 상기 카테고리의 다른 하위세트(들)는 (관심 항원에 대해) 별개의 특징을 갖는 다른 분자/항원을 포함한다.
한 실시양태에서, 항체-약물 접합체 (ADC)의 항체는 글로보 시리즈 항원 글로보 H, SSEA-4 및/또는 SSEA-3에 특이적으로 결합한다.
일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 부분은, 예를 들어, 표 1에 제시된 바와 같은 항-글로보 시리즈 항원 항체 (글로보 H : OBI-888, SSEA-4 : OBI-999)의 가변 중쇄 및/또는 가변 경쇄를 포함한다.
관련된 실시양태에서, 예시적인 항체 또는 그의 항원-결합 부분은, 예를 들어, 항-글로보 시리즈 항원 항체 (글로보 H : OBI-888, SSEA-4 : OBI-999)의 가변 중쇄의 CDR 및/또는 가변 경쇄의 CDR을 포함한다. 이들 하이브리도마 클론으로부터의 가변 중쇄 및 가변 경쇄의 예시적인 CDR 및 프레임워크가 표 1에 제시된다.
표 1-1. 항-글로보 H 항체 (OBI-888) 아미노산 서열
[상세내용은 US2017/0101462 (WO2017/062792)에 기재되어 있음]
Figure pct00001
Figure pct00002
표 1-2. 항-SSEA4 항체 (OBI-898) 아미노산 서열
[상세내용은 US 2017/283488 (WO2017/172990)에 기재되어 있음]
Figure pct00003
클론 2C2에 의해 생산된 항체의 가변 중쇄 영역 및 가변 경쇄 영역에 대해 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 81%, 적어도 약 82%, 적어도 약 83%, 적어도 약 84%, 적어도 약 85%, 적어도 약 86%, 적어도 약 87%, 적어도 약 88%, 적어도 약 89%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 약 100% 상동인 가변 중쇄 영역 및 가변 경쇄 영역을 갖는 항체도 또한 탄수화물 항원 (예를 들어 글로보 H)에 결합할 수 있다. 상동성은 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열 수준에서 존재할 수 있다.
글로보 시리즈 항원을 표적화하는 ADC
본 개시내용의 한 측면은 글로보 H에 특이적인 신규 ADC (OBI-999)를 특색으로 한다. ADC의 항-글로보 H 항체는 Fucα1→2 Galβ1→3 GalNAcβ1→3 Galα1→4 Galβ1→4 Glc에 결합한다.
본원에 기재된 임의의 항체는 전장 항체 또는 그의 항원-결합 단편일 수 있다. 일부 예에서, 항원 결합 단편은 Fab 단편, F(ab')2 단편 또는 단일-쇄 Fv 단편이다. 일부 예에서, 항원 결합 단편은 Fab 단편, F(ab')2 단편 또는 단일-쇄 Fv 단편이다. 일부 예에서, 항체는 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체 또는 단일-쇄 항체이다.
본원에 기재된 임의의 항체는 하기 중 하나 이상의 특징을 갖는다: (a) 재조합 항체, 모노클로날 항체, 키메라 항체, 인간화 항체, 인간 항체, 항체 단편, 이중특이적 항체, 단일특이적 항체, 1가 항체, IgG1 항체, IgG2 항체 또는 항체의 유도체임; (b) 인간, 뮤린, 인간화, 또는 키메라 항체, 항원-결합 단편 또는 항체의 유도체임; (c) 단일-쇄 항체 단편, 멀티바디, Fab 단편 및/또는 IgG, IgM, IgA, IgE, IgD 이소형 및/또는 그의 하위부류의 이뮤노글로불린임; (d) 하기 특징 중 하나 이상을 가짐: (i) 암 세포의 ADCC 및/또는 CDC를 매개함; (ii) 암 세포의 아폽토시스를 유도 및/또는 촉진함; (iii) 암 세포의 표적 세포의 증식을 억제함; (iv) 암 세포의 식세포작용을 유도 및/또는 촉진함; 및/또는 (v) 세포독성제의 방출을 유도 및/또는 촉진함; (e) 종양-특이적 탄수화물 항원인 종양-연관 탄수화물 항원에 특이적으로 결합함; (f) 비-암 세포, 비-종양 세포, 양성 암 세포 및/또는 양성 종양 세포 상에 발현되는 항원에 결합하지 않음; 및/또는 (g) 암 줄기 세포 상에 및 정상 암 세포 상에 발현되는 종양-연관 탄수화물 항원에 특이적으로 결합함.
바람직하게는 그의 각각의 항원으로의 항체의 결합은 특이적이다. 용어 "특이적"은 결합 쌍의 하나의 구성원이 그의 특이적 결합 파트너(들) 외에 다른 분자에 대하여 어떠한 유의한 결합을 나타내지 않을 것이고, 예를 들어 본원에 상세화된 것들 외에 임의의 다른 분자와 약 30% 미만, 바람직하게는 20%, 10% 또는 1% 교차-반응성을 갖는 상황을 지칭하는데 일반적으로 사용된다.
항체의 생산
모노클로날 항체 (MAb)를 생산하는데 다양한 방법이 사용되어 왔다. 단일 유형의 항체를 생산하는 클로닝된 세포주를 지칭하는 하이브리도마 기술은 마우스 (뮤린), 햄스터, 래트, 및 인간을 포함한 다양한 종의 세포를 사용한다. 키메라 및 인간화 항체를 포함한 MAb를 제조하기 위한 다른 방법은 유전자 조작, 즉, 재조합 DNA 기술을 사용한다.
폴리클로날 항체는 동물에서 관련 항원 및 아주반트의 다중 피하 (sc) 또는 복강내 (ip) 주사에 의해 생성될 수 있다. 모노클로날 항체는 실질적으로 동종 항체의 집단으로부터 수득되고, 즉 집단을 구성하는 개별 항체는 미량으로 존재할 수 있는 가능한 자연 발생 돌연변이를 제외하고는 동일하다.
인간 골수종 및 마우스-인간 이종골수종 세포주가 또한 인간 모노클로날 항체의 생산에 대해 기재되어 있다 (Kozbor, (1984) J. Immunol., 133:3001, 및 Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)). 하이브리도마 세포가 성장하고 있는 배양 배지를 항원에 대해 지시된 모노클로날 항체의 생산에 대해 검정한다. 하이브리도마 세포에 의해 생산된 모노클로날 항체의 결합 특이성은 면역침전에 의해, 또는 시험관내 결합 검정, 예컨대 방사선면역검정 (RIA) 또는 효소-연결된 면역흡착 검정 (ELISA)에 의해 결정될 수 있다. 모노클로날 항체의 결합 친화도는, 예를 들어 문헌 [Munson et al. (1980) Anal. Biochem. 107:220]의 스캐차드 분석에 의해 결정될 수 있다.
모노클로날 항체를 코딩하는 DNA는 통상적인 절차를 사용하여 (예를 들어, 뮤린 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용함으로써) 용이하게 단리 및 서열분석된다. 하이브리도마 세포는 이러한 DNA의 공급원으로서의 역할을 한다. 일단 단리되면, DNA를 발현 백터 내로 위치시킬 수 있고, 이후에 이를 달리 항체 단백질을 생산하지 않는 숙주 세포, 예컨대 이. 콜라이(E. coli) 세포, 원숭이 COS 세포, 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포 또는 골수종 세포 내로 형질감염시켜, 재조합 숙주 세포에서 모노클로날 항체의 합성을 수득한다 (US 2005/0048572; US 2004/0229310). 항체를 코딩하는 DNA의 박테리아에서의 재조합 발현에 대한 종설 논문은 [Skerra et al (1993) Curr. Opinion in Immunol. 5:256-262 및 Plueckthun (1992) Immunol. Revs. 130:151-188]을 포함한다.
추가 실시양태에서, 모노클로날 항체 또는 항체 단편은 문헌 [McCafferty et al. (1990) Nature 348:552-554; Clackson et al. (1991) Nature 352:624-628; 및 Marks et al. (1991) J. Mol. Biol., 222:581-597]에 기재된 기술을 사용하여 생성된 항체 파지 라이브러리로부터 단리될 수 있고, 상기 문헌은 파지 라이브러리를 사용한 뮤린 및 인간 항체의 단리를 각각 기재한다. 후속 간행물은 쇄 셔플링 (Marks et al. (1992) Bio/Technology 10:779-783), 뿐만 아니라 매우 큰 파지 라이브러리를 구축하기 위한 전략으로서 조합 감염 및 생체내 재조합 (Waterhouse et al. (1993) Nuc. Acids. Res. 21:2265-2266)에 의한 높은 친화도 (nM 범위) 인간 항체의 생산을 기재한다. 따라서, 이들 기술은 모노클로날 항체의 단리를 위한 전통적인 모노클로날 항체 하이브리도마 기술에 대한 실행가능한 대안이다.
DNA는 또한, 예를 들어, 상동 뮤린 서열 대신 인간 중쇄 및 경쇄 불변 도메인에 대한 코딩 서열로 치환하는 것에 의해 (미국 특허 번호 4,816,567; 및 Morrison et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851), 또는 비-이뮤노글로불린 폴리펩티드에 대한 코딩 서열의 모두 또는 일부를 이뮤노글로불린 코딩 서열에 공유 연결시키는 것에 의해 변형될 수 있다.
전형적으로, 이러한 비-이뮤노글로불린 폴리펩티드는 항체의 불변 도메인으로 치환되거나, 또는 항체의 하나의 항원-결합 부위의 가변 도메인으로 치환되어, 항원에 대한 특이성을 갖는 하나의 항원-결합 부위 및 상이한 항원에 대한 특이성을 갖는 또 다른 항원-결합 부위를 포함하는 키메라 2가 항체를 생성한다.
ADC: 링커:
예시적인 ADC 링커
ADC를 위한 적합한 예시적인 링커는 예를 들어 미국 특허 번호 7595292 (WO2005/007197)에 기재되어 있다. 링커에 관한 모든 내용은 본원에 참조로 포함된다. 링커, L은 디술피드 기를 포함하지 않고 공유 결합(들)을 통해 항체를 약물 모이어티에 부착시킨다. 링커는 1개 이상의 약물 모이어티 (D) 및 항체 단위 (Ab)를 연결하여 화학식 I의 항체-약물 접합체 (ADC)를 형성할 수 있는 이관능성 또는 다관능성 모이어티이다. 항체-약물 접합체 (ADC)는 약물 및 항체에 결합하기 위한 반응성 관능기를 갖는 링커를 사용하여 편리하게 제조할 수 있다. 항체 (Ab)의 시스테인 티올, 또는 아민, 예를 들어 N-말단 또는 아미노산 측쇄, 예컨대 리신은 링커 시약, 약물 모이어티 또는 약물-링커 시약의 관능기와 결합을 형성할 수 있다.
링커는 바람직하게는 세포외에서 안정하다. 세포로의 수송 또는 전달 전에 항체-약물 접합체 (ADC)는 바람직하게는 안정하고 무손상인 채로 유지되며, 즉, 항체는 약물 모이어티에 연결된 채로 유지된다. 링커는 표적 세포 외부에서 안정하고, 세포 내부에서 일부 효과적인 비율로 절단될 수 있다. 효과적인 링커는 (i) 항체의 특이적 결합 특성을 유지하고; (ii) 접합체 또는 약물 모이어티의 세포내 전달을 가능하게 하고; (iii) 안정하고 무손상인 채로, 즉 접합체가 그의 표적화된 부위로 전달되거나 수송될 때까지 절단되지 않은 채로 유지되며; (iv) 메이탄시노이드 약물 모이어티의 세포독성, 세포-사멸 효과 또는 세포증식억제 효과를 유지할 것이다. ADC의 안정성은 표준 분석 기술, 예컨대 질량 분광분석법, HPLC, 및 분리/분석 기술 LC/MS에 의해 측정될 수 있다.
항체 및 약물 모이어티의 공유 부착은 링커가 2개의 반응성 관능기, 즉 반응성 면에서 2가성을 갖는 것을 필요로 한다. 2개 이상의 기능적 또는 생물학적 활성 모이어티, 예컨대 펩티드, 핵산, 약물, 독소, 항체, 합텐 및 리포터 기를 부착시키는데 유용한 2가 링커 시약은 공지되어 있고, 방법이 그의 생성된 접합체와 함께 기재되어 있다 (Hermanson, G. T. (1996) Bioconjugate Techniques; Academic Press: New York, p234-242).
예시적인 ADC 링커는 화학식 II의 생물학적 활성 화합물을 포함할 수 있으며, 여기서 X 및 X' 중 하나는 중합체 (특히 독소)를 나타내고, 다른 것은 수소 원자를 나타내고; 각각의 Q는 독립적으로 연결기를 나타내고; W는 전자-끄는 모이어티 또는 전자-끄는 모이어티의 환원에 의해 제조가능한 모이어티를 나타내거나; 또는 X'가 중합체를 나타내는 경우에, X-Q-W-는 함께 전자 끄는 기를 나타낼 수 있고; 또한 X가 중합체를 나타내는 경우에, X' 및 전자 끄는 기 W는 개재 원자와 함께 고리를 형성할 수 있고; 각각의 Z1 및 Z2는 독립적으로 생물학적 분자로부터 유래된 기를 나타내고, 각각은 친핵성 모이어티를 통해 A 및 B에 연결되거나; 또는 Z1 및 Z2는 함께 2개의 친핵성 모이어티를 통해 A 및 B에 연결된 생물학적 분자로부터 유래된 단일 기를 나타내고; A는 C1-5 알킬렌 또는 알케닐렌 쇄이고; B는 결합 또는 C1-4 알킬렌 또는 알케닐렌 쇄이고; 이는 적합한 중합체를 상기 분자 내에서 친핵성 기를 통해, 바람직하게는 디술피드 가교를 통해 적합한 생물학적 활성 분자에 접합시킴으로써 형성된다.
Figure pct00004
특정 실시양태에서, 개시내용은 화학식 III의 단백질-중합체 접합체를 제공하며:
Figure pct00005
여기서 X는 폴리알킬렌 글리콜, 폴리비닐피롤리돈, 폴리아크릴레이트, 폴리메타크릴레이트, 폴리옥사졸린, 폴리비닐알콜, 폴리아크릴아미드, 폴리메타크릴아미드, HPMA 공중합체, 폴리에스테르, 폴리아세탈, 폴리(오르토 에스테르), 폴리카르보네이트, 폴리(이미노 카르보네이트), 폴리아미드, 디비닐에테르-말레산 무수물 및 스티렌-말레산 무수물의 공중합체, 폴리사카라이드 및 폴리글루탐산으로 이루어진 군으로부터 선택된 단독- 또는 공-중합체 (특히 독소)이고; Q는 직접 결합, 알킬렌, 임의로-치환된 아릴, 및 임의로-치환된 헤테로아릴로 이루어진 군으로부터 선택된 연결기이고, 여기서 알킬렌, 아릴 또는 헤테로아릴은 1개 이상의 산소 원자, 황 원자, 케토 기, -O-CO- 기, -CO-O- 기, 또는 R이 알킬 또는 아릴 기인 -NR 기에 의해 종결되거나 개재될 수 있고; W는 케토 기, 에스테르 기, 술폰 기, 환원된 케토 기, 환원된 에스테르 기, 및 환원된 술폰 기로 이루어진 군으로부터 선택되고; X'-Q는 수소이고; A는 C1-5 알킬렌 또는 알케닐렌 쇄이고; B는 결합 또는 C1-4 알킬렌 또는 알케닐렌 쇄이고; Z는 단백질 내의 디술피드 가교의 환원에 의해 생성된 2개의 티올 기를 통해 A 및 B에 연결된 단일 단백질이다.
예시적인 ADC의 효능을 입증하는 활성 검정
본 발명의 ADC (OBI-999)는 관련 기술분야에 공지된 다양한 검정에 의해 그의 물리적/화학적 특성 및 생물학적 기능에 대해 특징화될 수 있다.
본 개시내용의 항체, 또는 그의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체는 또한 항원에 대한 그의 결합 친화도의 관점에서 기재되거나 구체화될 수 있다. 탄수화물 항원에 대한 항체의 친화도는 임의의 적합한 방법을 사용하여 실험적으로 결정될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Berzofsky et al., "Antibody- Antigen Interactions," In Fundamental Immunology, Paul, W. E., Ed., Raven Press: New York, N.Y. (1984); Kuby, Janis Immunology, W. H. Freeman and Company: New York, N.Y. (1992)]; 및 본원에 기재된 방법 참조). 특정한 항체-탄수화물 항원 상호작용의 측정된 친화도는 상이한 조건 (예를 들어, 염 농도, pH) 하에 측정시 달라질 수 있다. 따라서, 친화도 및 다른 항원-결합 파라미터 (예를 들어, KD, Ka, Ka)의 측정은 바람직하게는 항체 및 항원의 표준화된 용액, 및 표준화된 완충제로 수행된다.
본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 시험관내 및 생체내 치료, 예방, 및/또는 진단 유용성을 갖는다. 예를 들어, 이들 항체는 암을 치료, 억제, 재발 방지 및/또는 진단하기 위해 예를 들어 시험관내 또는 생체외에서 배양물 내의 세포에 또는 예를 들어 생체내에서 대상체에게 투여될 수 있다.
정제된 항체는 N-말단 서열분석, 아미노산 분석, 비-변성 크기 배제 고압 액체 크로마토그래피 (HPLC), 질량 분광측정법, 이온 교환 크로마토그래피 및 파파인 소화를 포함하나 이에 제한되지 않는 일련의 검정에 의해 추가로 특징화될 수 있다.
필요에 따라, 항체를 그의 생물학적 활성에 대해 분석한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체를 그의 항원 결합 활성에 대하여 시험한다. 관련 기술분야에 공지되어 있으며 본원에 사용될 수 있는 항원 결합 검정은 웨스턴 블롯, 방사성면역검정, ELISA (효소 연결 면역흡착 검정), "샌드위치" 면역검정, 면역침전 검정, 형광 면역검정, 화학발광 면역검정, 나노입자 면역검정, 압타머 면역검정, 및 단백질 A 면역검정과 같은 기술을 사용하는 임의의 직접적 또는 경쟁적 결합 검정을 비제한적으로 포함한다.
인간화 항체
본 발명은 인간화 항체를 포괄한다. 비-인간 항체를 인간화하기 위한 다양한 방법이 관련 기술분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 인간화 항체는 비-인간인 공급원으로부터 유래된 1개 이상의 아미노산 잔기가 도입되어 있을 수 있다. 이들 비-인간 아미노산 잔기는 종종 "유입" 잔기로 지칭되고, 이는 전형적으로 "유입" 가변 도메인으로부터 취해진다. 인간화는 본질적으로 윈터(Winter) 및 동료들의 방법에 따라, 초가변 영역 서열을 인간 항체의 상응하는 서열로 치환함으로써 수행될 수 있다 (Jones et al. (1986) Nature 321:522-525; Riechmann et al. (1988) Nature 332:323-327; Verhoeyen et al. (1988) Science 239:1534-1536). 따라서, 이러한 "인간화" 항체는 실질적으로 무손상 인간 가변 도메인 이외의 부분이 비-인간 종으로부터의 상응하는 서열에 의해 치환된 키메라 항체이다 (미국 특허 번호 4,816,567). 실제로, 인간화 항체는 전형적으로 일부 초가변 영역 잔기 및 가능하게는 일부 FR 잔기가 설치류 항체의 유사 부위로부터의 잔기에 의해 치환된 인간 항체이다.
인간화 항체의 제조에 사용될 경쇄 및 중쇄 둘 다의 인간 가변 도메인의 선택은 항원성을 감소시키는데 중요할 수 있다. 소위 "최적-피트" 방법에 따르면, 설치류 항체의 가변 도메인의 서열은 공지된 인간 가변-도메인 서열의 전체 라이브러리에 대해 스크리닝된다. 설치류의 것과 가장 근접한 인간 서열은 이어서 인간화 항체를 위한 인간 프레임워크로서 허용된다 (Sims et al. (1993) J. Immunol. 151:2296; Chothia et al. (1987) J. Mol. Biol. 196:901). 또 다른 방법은 경쇄 또는 중쇄의 특정한 하위군의 모든 인간 항체의 컨센서스 서열로부터 유래된 특정한 프레임워크를 사용한다. 동일한 프레임워크가 여러 상이한 인간화 항체에 대해 사용될 수 있다 (Carter et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285; Presta et al. (1993) J. Immunol., 151:2623).
추가로, 항원에 대한 높은 친화도 및 다른 유리한 생물학적 특성을 보유하도록 항체를 인간화하는 것이 일반적으로 바람직하다. 이러한 목적을 달성하기 위해, 하나의 방법에 따라, 인간화 항체는 모 서열 및 인간화 서열의 3차원 모델을 사용하는 모 서열 및 다양한 개념적 인간화 생성물의 분석 공정에 의해 제조된다. 3차원 이뮤노글로불린 모델은 통상적으로 이용가능하고 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 친숙하다. 선택된 후보 이뮤노글로불린 서열의 가능한 3차원 입체형태적 구조를 예시하고 디스플레이하는 컴퓨터 프로그램이 이용가능하다. 이들 디스플레이의 검사로 후보 이뮤노글로불린 서열의 기능화에 있어서 잔기의 가능한 역할의 분석이 가능하며, 즉, 그의 항원에 결합하는 후보 이뮤노글로불린의 능력에 영향을 미치는 잔기의 분석이 가능하다. 이러한 방식으로, 목적하는 항체 특징, 예컨대 표적 항원(들)에 대한 증가된 친화도가 달성되도록 수용자 및 유입 서열로부터 FR 잔기를 선택하고 조합할 수 있다. 일반적으로, 초가변 영역 잔기가 항원 결합에 영향을 미치는데 있어서 직접적이고 가장 실질적으로 수반된다.
용도
본 발명의 ADC (OBI-999)는, 예를 들어, 시험관내, 생체외 및 생체내 치료 방법에서 사용될 수 있다. 본 발명의 ADC (OBI-999)는 시험관내, 생체외 및/또는 생체내에서 특정 항원 활성을 부분적으로 또는 완전하게 차단하는 길항제로서 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 ADC (OBI-999)는, 예를 들어, 항원을 함유하는 세포 배양물에서, 인간 대상체에서, 또는 본 발명의 ADC (OBI-999)가 교차-반응하는 항원을 갖는 다른 포유동물 대상체 (예를 들어 침팬지, 개코원숭이, 마모셋, 시노몰구스 및 레서스, 돼지 또는 마우스)에서, 특정 항원 활성을 억제하는데 사용될 수 있다. 한 실시양태에서, 본 발명의 ADC (OBI-999)는 항원 활성이 억제되도록 ADC (OBI-999)를 항원과 접촉시킴으로써 항원 활성을 억제하기 위해 사용될 수 있다. 한 실시양태에서, 항원은 인간 단백질 분자이다.
한 실시양태에서, 본 발명의 ADC (OBI-999)는 항원 활성이 유해한 장애를 앓고 있는 대상체에게 상기 대상체에서의 항원 활성이 억제되도록 본 발명의 ADC (OBI-999)를 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 항원을 억제하는 방법에 사용될 수 있다. 한 실시양태에서, 항원은 인간 단백질 분자이고 대상체는 인간 대상체이다. 대안적으로, 대상체는 본 발명의 ADC (OBI-999)가 결합하는 항원을 발현하는 포유동물일 수 있다. 또한 추가로, 대상체는 (예를 들어, 항원의 투여에 의해 또는 항원 트랜스진의 발현에 의해) 항원이 도입된 포유동물일 수 있다. 본 발명의 ADC (OBI-999)는 치료 목적을 위해 인간 대상체에게 투여될 수 있다. 더욱이, 본 발명의 ADC (OBI-999)는 수의학적 목적을 위해 또는 인간 질환의 동물 모델로서 ADC (OBI-999)가 교차-반응하는 항원을 발현하는 비-인간 포유동물 (예를 들어, 영장류, 돼지 또는 마우스)에게 투여될 수 있다. 동물 모델과 관련하여, 이러한 동물 모델은 본 발명의 ADC (OBI-999)의 치료 효능을 평가하는데 (예를 들어, 투여량 및 투여의 시간 경과를 시험하는데) 유용할 수 있다. 본 발명의 ADC (OBI-999)는 암, 근육 장애, 유비퀴틴-경로-관련 유전 장애, 면역/염증성 장애, 신경계 장애, 및 다른 유비퀴틴 경로-관련 장애를 포함하나 이에 제한되지는 않는, 글로보 시리즈 항원의 비정상적 발현 및/또는 활성과 연관된 질환, 장애 또는 상태를 치료, 억제, 진행 지연, 재발 예방/지연, 개선, 또는 예방하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 ADC (OBI-999)는 요법에서 단독으로 또는 다른 조성물과 조합되어 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 ADC (OBI-999)는 또 다른 항체, 및/또는 아주반트/치료제 (예를 들어, 스테로이드)와 함께 공-투여될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 ADC (OBI-999)는 치료 계획에서, 예를 들어 암, 근육 장애, 유비퀴틴-경로-관련 유전 장애, 면역/염증 장애, 신경계 장애, 및 다른 유비퀴틴 경로-관련 장애를 포함하는, 본원에 기재된 임의의 질환을 치료함에 있어서 항-염증제 및/또는 방부제와 조합될 수 있다. 상기 언급된 이러한 조합 요법은 조합 투여 (여기서 2종 이상의 작용제가 동일 또는 개별 제제에 포함됨) 및 개별 투여를 포함하고, 이 경우에 본 발명 ADC (OBI-999)의 투여는 보조 요법 또는 요법들의 투여 전 및/또는 후에 이루어질 수 있다.
본 발명의 ADC (OBI-999)는 비경구, 피하, 복강내, 폐내 및 비강내, 및 원한다면 국부 치료용의 병변내 투여를 포함하는 임의의 적합한 수단에 의해 투여될 수 있다. 비경구 주입은 근육내, 정맥내, 동맥내, 복강내 또는 피하 투여를 포함한다. 또한, ADC (OBI-999)는 특히 ADC (OBI-999)의 용량을 감소시킨 펄스 주입에 의해 적합하게 투여된다. 투여는 부분적으로 투여가 단기적인지 아니면 만성적인지에 따라 임의의 적합한 경로, 예를 들어 주사, 예컨대 정맥내 또는 피하 주사에 의해 이루어질 수 있다.
치료 용도
치료 유효량의 본원에 기재된 하나 이상의 ADC (OBI-999)를 포함하는 조성물을 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 치료 방법이 본원에 기재된다.
일부 실시양태에서, 치료를 필요로 하는 대상체 (예를 들어, 인간 환자)는 암으로 진단되거나, 암을 갖는 것으로 의심되거나, 또는 암에 대한 위험이 있다. 암의 예는 육종, 피부암, 백혈병, 림프종, 뇌암, 교모세포종, 폐암, 유방암, 구강암, 두경부암, 비인두암, 식도암, 위암, 간암, 담관암, 담낭암, 방광암, 췌장암, 장암, 결장직장암, 신장암, 자궁경부암, 자궁내막암, 난소암, 고환암, 협부암, 구인두암, 후두암 또는 전립선암을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
바람직한 실시양태에서, ADC (OBI-999)는 글로보 시리즈 항원-발현 암 세포를 표적화할 수 있다. 일부 실시양태에서, ADC (OBI-999)는 암 세포 상의 글로보 시리즈 항원을 표적화할 수 있다. 일부 실시양태에서, ADC (OBI-999)는 암에서 글로보 시리즈 항원을 표적화할 수 있다.
치료는 종양 크기의 감소, 악성 세포의 제거, 전이의 방지, 재발의 방지, 파종성 암의 감소 또는 사멸, 생존의 연장 및/또는 종양 암 진행 시간의 연장을 생성한다.
일부 실시양태에서, 치료는 상기 ADC (OBI-999)의 투여 전에, 그 동안에, 또는 그 후에 상기 대상체에게 추가의 요법을 투여하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 추가의 요법은 화학요법제에 의한 치료다. 일부 실시양태에서, 추가의 요법은 방사선 요법이다.
본 발명의 방법은 조기 종양을 치료 및 예방하는 데에 특히 유리하므로, 보다 진행된 병기로의 진행을 방지하여 진행성 암과 연관된 이환율 및 사망률을 감소시킨다. 본 발명의 방법은 또한 예를 들어 원발성 종양의 제거 후에 지속되는 휴면 종양과 같은 종양의 재발 또는 종양의 재성장을 방지하거나, 또는 종양의 발생을 감소시키거나 방지하는데 유리하다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 방법은 예를 들어 증가된 글로보 H, SSEA-3 및/또는 SSEA-4 발현을 특징으로 하는 암의 치료 또는 예방에 유용하다. 일부 실시양태에서 암은 암 줄기 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 암은 전-암 및/또는 악성 암 및/또는 요법 저항성 암이다. 일부 실시양태에서, 암은 뇌암이다.
본원에 기재된 방법에 의해 치료될 대상체는 포유동물, 보다 바람직하게는 인간일 수 있다. 포유동물은 농장 동물, 스포츠 동물, 애완동물, 영장류, 말, 개, 고양이, 마우스 및 래트를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 치료를 필요로 하는 인간 대상체는 육종, 피부암, 백혈병, 림프종, 뇌암, 폐암, 유방암, 구강암, 식도암, 위암, 간암, 담관암, 췌장암, 결장암, 신장암, 자궁경부암, 난소암 및 전립선암을 포함하나 이에 제한되지는 않는 암을 갖거나, 암에 대한 위험이 있거나, 암을 갖는 것으로 의심되는 환자일 수 있다. 암을 갖는 대상체는 일상적 의료 검진에 의해 확인할 수 있다.
본원에 사용된 "유효량"은 단독으로 또는 하나 이상의 다른 활성 작용제와 조합되어 대상체에 대한 치료 효과를 부여하는데 요구되는 각각의 활성제의 양을 지칭한다. 관련 기술분야의 통상의 기술자가 인식할 바와 같이, 유효량은 치료될 특정 상태, 상태의 중증도, 연령, 신체 상태, 체격, 성별 및 체중을 포함하는 개별적인 환자 파라미터, 치료 지속기간, (존재하는 경우) 공동 요법의 성질, 특정 투여 경로, 및 건강 진료의의 지식 및 전문기술 내에 속하는 기타 인자에 따라 바뀐다. 이들 인자는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있고, 불과 상용 실험으로 다루어질 수 있다. 개별 성분 또는 그의 조합의 최대 용량, 즉 타당한 의학적 판단에 따른 가장 높은 안전한 용량이 사용되는 것이 일반적으로 바람직하다. 그러나, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 환자가 의학적 이유, 심리적 이유 또는 실질적으로 임의의 다른 이유로 보다 낮은 용량 또는 허용가능한 용량을 요구할 수 있음을 이해할 것이다.
본원에 사용된 용어 "치료하는"은 하나 이상의 활성제를 포함하는 조성물을 암, 암의 증상, 또는 암에 대한 소인이 있는 대상체에게 이러한 암, 암의 증상, 또는 암에 대한 소인을 치유하거나, 고치거나, 완화시키거나, 경감시키거나, 변경시키거나, 구제하거나, 호전시키거나, 개선하거나, 이에 영향을 미칠 목적으로 적용 또는 투여하는 것을 지칭한다.
암의 "발병" 또는 "진행"은 암의 초기 징후 및/또는 그 후의 진행을 의미한다. 암의 발병은 관련 기술분야에 널리 공지된 표준 임상 기술을 사용하여 검출되고 평가될 수 있다. 그러나, 발병은 또한 검출불가능할 수 있는 진행을 지칭한다. 본 개시내용의 목적을 위해, 발병 또는 진행은 증상의 생물학적 과정을 지칭한다. "발병"은 발생, 재발, 및 개시를 포함한다. 본원에 사용된 암의 "개시" 또는 "발생"은 초기 개시 및/또는 재발을 포함한다.
치료될 질환의 유형 또는 질환 부위에 따라, 의학 분야의 통상의 기술자에게 공지된 통상적인 방법을 사용하여 제약 조성물을 대상체에게 투여할 수 있다. 이러한 조성물은 다른 통상적인 경로를 통해 또한 투여될 수 있고, 예를 들어, 경구로, 비경구로, 흡입 스프레이에 의해, 국소적으로, 직장으로, 비강으로, 협측으로, 질로, 또는 이식 저장소를 통해 투여될 수 있다. 본원에 사용된 용어 "비경구"는 피하, 피내, 정맥내, 근육내, 관절내, 동맥내, 활막내, 흉골내, 척수강내, 병변내, 및 두개내 주사 또는 주입 기술을 포함한다. 추가적으로, 주사가능한 데포 투여 경로를 통해, 예컨대 1-, 3-, 또는 6-개월 데포 주사가능한 또는 생분해성 물질 및 방법을 사용하여 이를 대상체에게 투여할 수 있다.
주사가능한 조성물은 다양한 담체 예컨대 식물성 오일, 디메틸아세트아미드, 디메틸포름아미드, 에틸 락테이트, 에틸 카르보네이트, 이소프로필 미리스테이트, 에탄올 및 폴리올 (글리세롤, 프로필렌 글리콜, 액체 폴리에틸렌 글리콜 등)을 함유할 수 있다. 정맥내 주사의 경우, 수용성 ADC (OBI-999)가 점적 방법에 의해 투여될 수 있고, 이에 의해 ADC (OBI-999) 및 생리학상 허용되는 부형제를 함유하는 제약 제제가 주입된다. 생리학상 허용되는 부형제는, 예를 들어, 5% 덱스트로스, 0.9% 염수, 링거액 또는 다른 적합한 부형제를 포함할 수 있다.
항체-약물 접합체 제약 제제의 투여
치료 항체-약물 접합체 (ADC)는 치료될 상태에 적절한 임의의 경로에 의해 투여될 수 있다. ADC는 전형적으로 비경구로, 즉, 주입, 피하, 근육내, 정맥내, 피내, 척수강내, 볼루스, 종양내 주사 또는 경막외로 투여될 것이다 (Shire et al. (2004) J. Pharm. Sciences 93(6):1390-1402). 치료 항체-약물 접합체 (ADC)의 제약 제제는 전형적으로 제약상 허용되는 비경구 비히클과 함께 비경구 투여를 위한, 단위 투여량의 주사가능한 형태로 제조된다. 목적하는 순도를 갖는 항체-약물 접합체 (ADC)는 임의로 제약상 허용되는 희석제, 담체, 부형제 또는 안정화제와 동결건조 제제 또는 수용액의 형태로 혼합된다 (Remington's Pharmaceutical Sciences (1980) 16th edition, Osol, A. Ed.).
허용되는 비경구 비히클, 희석제, 담체, 부형제 및 안정화제는 사용되는 투여량 및 농도에서 수용자에게 비독성이고, 이는 완충제 예컨대 포스페이트, 시트레이트, 및 다른 유기 산; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함한 항산화제; 보존제 (예컨대 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드, 벤제토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알콜; 알킬 파라벤 예컨대 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 시클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레졸); 저분자량 (약 10개 미만의 잔기) 폴리펩티드; 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴 또는 이뮤노글로불린; 친수성 중합체 예컨대 폴리비닐피롤리돈; 아미노산 예컨대 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 리신; 모노사카라이드, 디사카라이드, 및 글루코스, 만노스 또는 덱스트린을 포함한 다른 탄수화물; 킬레이트화제 예컨대 EDTA; 당 예컨대 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 염-형성 반대-이온 예컨대 나트륨; 금속 착물 (예를 들어 Zn-단백질 착물); 및/또는 비-이온성 계면활성제 예컨대 트윈(TWEEN)™, 플루로닉스(PLURONICS)™ 또는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)을 포함한다. 예를 들어, 동결건조된 항-ErbB2 항체 제제는 WO 97/04801에 기재되어 있고, 이는 본원에 명백하게 참조로 포함된다. ADC의 예시적인 제제 예컨대 트라스투주맙-SMCC-DM1은 약 100 mg/ml의 트레할로스 (2-(히드록시메틸)-6-[3,4,5-트리히드록시-6-(히드록시메틸)테트라히드로피란-2-일]옥시-테트라히드로피란-3,4,5-트리올; C12H22O11; CAS 번호 99-20-7) 및 약 0.1% 트윈™ 20 (폴리소르베이트 20; 도데칸산 2-[2-[3,4-비스(2-히드록시에톡시)테트라히드로푸란-2-일]-2-(2-히드록시에톡시)에톡시]에틸 에스테르; C26H50O10; CAS 번호 9005-64-5)를 함유하고 대략 pH 6이다.
치료 항체-약물 접합체 (ADC)의 제약 제제는 ADC 제조 공정에서 과량의 시약, 불순물 및 부산물의 불완전한 정제 및 분리의 결과로서; 또는 벌크 ADC 또는 제제화된 ADC 조성물의 시간/온도 가수분해 또는 저장 후 분해의 결과로서 특정량의 미반응 약물 모이어티 (D), 항체-링커 중간체 (Ab-L) 및/또는 약물-링커 중간체 (D-L)를 함유할 수 있다.
활성 제약 성분은 또한, 예를 들어 코아세르베이션 기술에 의해 또는 계면 중합에 의해 제조된 마이크로캡슐, 예를 들어 각각 히드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐에, 콜로이드성 약물 전달 시스템 (예를 들어, 리포솜, 알부민 마이크로구체, 마이크로에멀젼, 나노-입자 및 나노캡슐)에 또는 마크로에멀젼에 포획될 수 있다. 이러한 기술은 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)]에 개시되어 있다.
지속-방출 제제가 제조될 수 있다. 지속-방출 제제의 적합한 예는 ADC를 함유하는 고체 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스를 포함하고, 이러한 매트릭스는 성형품, 예를 들어 필름 또는 마이크로캡슐 형태이다. 지속-방출 매트릭스의 예는 폴리에스테르, 히드로겔 (예를 들어, 폴리(2-히드록시에틸-메타크릴레이트), 또는 폴리(비닐알콜)), 폴리락티드 (미국 특허 번호 3,773,919), L-글루탐산과 감마-에틸-L-글루타메이트의 공중합체, 비-분해성 에틸렌-비닐 아세테이트, 분해성 락트산-글리콜산 공중합체, 예컨대 루프론 데포(LUPRON DEPOT)™ (락트산-글리콜산 공중합체 및 류프롤리드 아세테이트로 구성된 주사가능한 마이크로구체) 및 폴리-D-(-)-3-히드록시부티르산을 포함한다.
생체내 투여에 사용될 제제는 멸균되어야 하고, 이것은 멸균 여과 막을 통한 여과로 용이하게 달성된다.
제제는 상기 투여 경로에 적합한 것을 포함한다. 제제는 편리하게는 단위 투여 형태로 제공될 수 있고 제약 기술분야에 널리 공지된 방법 중 임의의 것에 의해 제조될 수 있다. 기술 및 제제화는 일반적으로 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Co., Easton, Pa.)]에서 확인된다. 이러한 방법은 활성 성분을 1종 이상의 보조 성분을 구성하는 담체와 회합시키는 단계를 포함한다. 일반적으로, 제제는 활성 성분을 액체 담체 또는 미분된 고체 담체 또는 둘 다와 균일하게 및 친밀하게 회합시킨 다음, 필요한 경우, 생성물을 성형함으로써 제조된다.
수성 현탁액은 활성 물질을 수성 현탁액의 제조에 적합한 부형제와 혼합하여 함유한다. 이러한 부형제는 현탁화제, 예컨대 소듐 카르복시메틸셀룰로스, 크로스카르멜로스, 포비돈, 메틸셀룰로스, 히드록시프로필 메틸셀룰로스, 알긴산나트륨, 폴리비닐피롤리돈, 트라가칸트 검 및 아카시아 검, 및 분산제 또는 습윤제 예컨대 자연 발생 포스파티드 (예를 들어, 레시틴), 알킬렌 옥시드와 지방산의 축합 생성물 (예를 들어, 폴리옥시에틸렌 스테아레이트), 에틸렌 옥시드와 장쇄 지방족 알콜의 축합 생성물 (예를 들어, 헵타데카에틸렌옥시세탄올), 에틸렌 옥시드와 지방산 및 헥시톨 무수물로부터 유래된 부분 에스테르의 축합 생성물 (예를 들어, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레에이트)을 포함한다. 수성 현탁액은 또한 1종 이상의 보존제, 예컨대 에틸 또는 n-프로필 p-히드록시-벤조에이트, 1종 이상의 착색제, 1종 이상의 향미제 및 1종 이상의 감미제, 예컨대 수크로스 또는 사카린을 함유할 수 있다.
ADC의 제약 조성물은 멸균 주사가능한 제제, 예컨대 멸균 주사가능한 수성 또는 유질 현탁액의 형태일 수 있다. 이러한 현탁액은 상기 언급된 그러한 적합한 분산제 또는 습윤제 및 현탁화제를 사용하여 공지된 기술에 따라 제제화될 수 있다. 멸균 주사가능한 제제는 또한 비-독성의 비경구로 허용되는 희석제 또는 용매 중의 멸균 주사가능한 용액 또는 현탁액, 예컨대 1,3-부탄-디올 중의 용액일 수 있거나, 또는 동결건조된 분말로서 제조될 수 있다. 사용될 수 있는 허용되는 비히클 및 용매 중에는 물, 링거액 및 등장성 염화나트륨 용액이 있다. 또한, 멸균 고정 오일이 통상적으로 용매 또는 현탁 매질로서 사용될 수 있다. 이러한 목적을 위해, 합성 모노- 또는 디글리세리드를 포함한 임의의 무자극 고정 오일이 사용될 수 있다. 또한, 지방산 예컨대 올레산이 마찬가지로 주사제의 제조에 사용될 수 있다.
단일 투여 형태를 생성하기 위해 담체 물질과 조합될 수 있는 활성 성분의 양은 치료되는 숙주 및 특정한 투여 방식에 따라 달라질 것이다. 예를 들어, 정맥내 주입을 위해 의도되는 수용액은 용액 밀리리터당 활성 성분 약 3 내지 500 μg을 함유하여, 약 30 mL/시간의 속도의 적합한 부피로 주입될 수 있다. 피하 (볼루스) 투여는 총 부피 약 1.5 ml 이하 및 ml당 약 100 mg ADC의 농도로 실시될 수 있다. 빈번하고 만성인 투여가 요구되는 ADC의 경우에는 피하 경로 예컨대 사전-충전된 시린지 또는 자가주사기 장치 기술이 사용될 수 있다.
일반적인 제안으로서, 용량당 투여되는 ADC의 초기 제약 유효량은 1일에 약 0.01-100 mg/kg 환자 체중, 즉 약 0.1 내지 20 mg/kg 환자 체중의 범위일 것이며, 사용되는 화합물의 전형적인 초기 범위는 0.3 내지 15 mg/kg/일이다. 예를 들어, 인간 환자에게 환자 체중 kg당 약 1.5 mg ADC로 초기 투여할 수 있다. 용량은 최대 허용 용량 (MTD)까지 증가될 수 있다. 투여 스케줄은 약 3주마다일 수 있지만, 진단된 상태 또는 반응에 따라 스케줄이 더 빈번하거나 덜 빈번할 수 있다. 용량은 치료 기간 동안 다수 주기, 예컨대 약 4회 이상 안전하게 투여될 수 있는 MTD 이하로 추가로 조정될 수 있다.
비경구 투여에 적합한 제제는 항산화제, 완충제, 정박테리아제, 및 제제를 의도된 수용자의 혈액과 등장성이 되게 하는 용질을 함유할 수 있는 수성 및 비-수성 멸균 주사 용액; 및 현탁화제 및 증점제를 포함할 수 있는 수성 및 비-수성 멸균 현탁액을 포함한다.
단백질 치료제의 경구 투여는 장에서의 제한된 흡수, 가수분해 또는 변성으로 인한 불량한 생체이용률 때문에 일반적으로 선호되지 않지만, 경구 투여에 적합한 ADC 제제는 미리 결정된 양의 ADC를 각각 함유하는 이산 단위, 예컨대 캡슐, 카쉐 또는 정제로 제조될 수 있다.
제제는 단위-용량 또는 다중-용량 용기, 예를 들어 밀봉된 앰플 및 바이알에 포장될 수 있고, 사용 직전에 주사를 위해 단지 멸균 액체 담체, 예를 들어 물의 첨가만을 필요로 하는 냉동-건조 (동결건조) 상태로 저장될 수 있다. 즉석 주사 용액 및 현탁액은 이전에 기재된 종류의 멸균 분말, 과립 및 정제로부터 제조된다. 예시적인 단위 투여 제제는 활성 성분의 1일 용량 또는 단위 1일 하위-용량 또는 그의 적절한 분획을 함유한다.
본 발명은 상기 정의된 바와 같은 적어도 1종의 활성 성분을 그를 위한 수의학적 담체와 함께 포함하는 수의학적 조성물을 추가로 제공한다. 수의학적 담체는 조성물을 투여할 목적에 유용한 물질이고, 달리 불활성이거나 또는 수의학적 기술분야에서 허용되는 고체, 액체 또는 기체상 물질일 수 있고, 활성 성분과 상용성이다. 이들 수의학적 조성물은 비경구로, 경구로 또는 임의의 다른 목적하는 경로에 의해 투여될 수 있다.
질환의 예방 또는 치료를 위한, ADC의 적절한 투여량은 상기 정의된 바와 같은 치료될 질환의 유형, 질환의 중증도 및 경과, 분자가 예방 또는 치료 목적으로 투여되는지, 선행 요법, 환자의 임상 병력 및 항체에 대한 반응, 및 담당 의사의 판단에 좌우될 것이다. 분자는 환자에게 1회 또는 일련의 치료에 걸쳐 적합하게 투여된다. 질환의 유형 및 중증도에 따라, 예를 들어 1회 이상의 개별 투여에 의하는 것 또는 연속 주입에 의하는 것에 상관없이, 약 1 μg/kg 내지 15 mg/kg (예를 들어 0.1-20 mg/kg)의 분자가 환자에게 투여하기 위한 초기 후보 투여량이다. 전형적인 1일 투여량은 상기 언급된 인자에 따라 약 1 μg/kg 내지 100 mg/kg 또는 그 초과의 범위일 수 있다. 환자에게 투여될 ADC의 예시적인 투여량은 약 0.1 내지 약 10 mg/kg 환자 체중 범위이다.
수일 이상에 걸친 반복 투여의 경우에, 상태에 따라, 질환 증상의 목적하는 억제가 일어날 때까지 치료가 지속된다. 예시적인 투여 요법은 항-ErbB2 항체를 약 4 mg/kg의 초기 부하 용량에 이어서 매주 약 2 mg/kg의 유지 용량으로 투여하는 것을 포함한다. 다른 투여 요법이 유용할 수 있다. 이러한 요법의 진행은 통상적인 기술 및 검정에 의해 용이하게 모니터링된다.
조합 요법
항체-약물 접합체 (ADC)는 항암 특성을 갖는 제2 화합물과 제약 조합 제제 중에서 조합되거나, 또는 이것과의 조합 요법으로서의 투여 요법으로 조합될 수 있다. 제약 조합 제제 또는 투여 요법의 제2 화합물은 바람직하게는 조합물의 ADC에 상보적인 활성을 가져서 서로 불리한 영향을 미치지 않는다.
제2 화합물은 화학요법제, 세포독성제, 시토카인, 성장 억제제, 항호르몬제, 아로마타제 억제제, 단백질 키나제 억제제, 지질 키나제 억제제, 항안드로겐, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 리보자임, 유전자 요법 백신, 항혈관신생제 및/또는 심장보호제일 수 있다. 이러한 분자는 의도된 목적에 유효한 양으로 조합되어 적합하게 존재한다. ADC를 함유하는 제약 조성물은 또한 치료 유효량의 화학요법제 예컨대 튜불린-형성 억제제, 토포이소머라제 억제제, 또는 DNA 결합제를 가질 수 있다.
대사 생성물은 방사성표지된 (예를 들어, 14C 또는 3H) ADC를 제조하고, 이를 래트, 마우스, 기니 피그, 원숭이와 같은 동물 또는 인간에게 검출가능한 용량 (예를 들어 약 0.5 mg/kg 초과)으로 비경구로 투여하고, 충분한 시간 동안 대사가 일어나게 하고 (전형적으로 약 30초 내지 30시간), 그의 전환 생성물을 소변, 혈액 또는 다른 생물학적 샘플로부터 단리함으로써 확인될 수 있다. 이들 생성물은 표지되어 있기 때문에 용이하게 단리된다 (다른 것은 대사물 중에 남아있는 에피토프에 결합할 수 있는 항체를 사용하여 단리됨). 대사물 구조는 통상적인 방식, 예를 들어 MS, LC/MS 또는 NMR 분석에 의해 결정된다. 일반적으로, 대사물의 분석은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지된 통상적인 약물 대사 연구와 동일한 방식으로 수행된다. 전환 생성물은, 이들이 생체내에서 달리 발견되지 않는 한, ADC 화합물의 치료적 투여를 위한 진단 검정에 유용하다.
대사물은 약물 모이어티를 항체에 연결하는 임의의 결합의 절단이 일어난, ADC의 생체내 절단 생성물을 포함한다. 따라서, 대사 절단은 네이키드 항체 또는 항체 단편을 발생시킬 수 있다. 항체 대사물은 링커의 일부 또는 전부에 연결될 수 있다. 대사 절단은 또한 약물 모이어티 또는 그의 일부의 생성을 발생시킬 수 있다. 약물 모이어티 대사물은 링커의 일부 또는 전부에 연결될 수 있다.
제조 물품
또 다른 실시양태에서, ADC 및 상기 기재된 장애의 치료에 유용한 물질을 함유하는 제조 물품 또는 "키트"가 제공된다. 제조 물품은 용기 및 용기 상의 또는 용기와 회합된 라벨 또는 패키지 삽입물을 포함한다. 적합한 용기는 예를 들어 병, 바이알, 시린지 또는 블리스터 팩을 포함한다. 용기는 다양한 물질, 예컨대 유리 또는 플라스틱으로 형성될 수 있다. 용기는 상태의 치료에 효과적인 항체-약물 접합체 (ADC) 조성물을 보유하고, 멸균 접근 포트를 가질 수 있다 (예를 들어, 용기는 정맥내 용액 백 또는 피하 주사 바늘로 뚫을 수 있는 마개를 갖는 바이알일 수 있음). 조성물 중의 적어도 1종의 활성제는 ADC이다. 라벨 또는 패키지 삽입물은 조성물이 선택된 상태, 예컨대 암을 치료하는데 사용된다는 것을 나타낸다.
추가의 상술 없이도, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 상기 설명에 기초하여 본 발명을 그의 최대 범위까지 이용할 수 있을 것으로 여겨진다. 따라서, 하기 구체적 실시양태는 단지 예시적이며 어떠한 방식으로도 나머지의 본 개시내용을 제한하지 않는 것으로 해석되어야 한다. 본원에 인용된 모든 간행물은 본원에 언급된 목적 또는 대상을 위하여 참조로 포함된다.
실시예
실시예 1: 항체 약물 접합
폴리테릭스(PolyTherics)는 MMAE 시약을 OBI-888 모노클로날 항체에 접합시켜 항체 약물 접합체 (ADC; OBI-999)를 제조하는 것을 수행하였다. 디술피드 접합 링커는 PCT 공개 번호: 미국 특허 번호 7595292 (WO2005/007197)에 개시된 바와 같고; OBI-888은 US20170101462 (WO2017/062792)에 개시된 바와 같은 항-글로보 H 모노클로날 항체이고; 모노메틸 아우리스타틴 E (MMAE)는 상업적으로 입수가능한 항신생물제이다. 파일럿 규모 반응 및 정제를 수행하여 적절한 조건을 확인하였다. 환원된 항체는 응집하는 경향이 없는 것으로 발견되었다. 환원 및 접합 상태의 후속 스크리닝은 유의하게 개선된 접합 수율을 발생시켰다. OBI-999 (DAR=4)의 전체 화학 구조는 하기와 같이 표시된다:
Figure pct00006
실시예 2: 항체 약물 접합체 (OBI-999)의 분석
2.1 외관
생성물 용액의 외관을 색상 및 투명성에 대해 시각적으로 조사하였다.
2.2 HIC 분석
분석 HIC (소수성 상호작용 크로마토그래피)를 디오넥스 얼티메이트(Dionex Ultimate) 3000RS HPLC 시스템에 연결된 도소(TOSOH), TSK겔 부틸-NPR 칼럼 (3.5 cm x 4.6 mm)을 사용하여 수행하였다. 이동상은 완충제 A (50 mM 인산나트륨 중 1.5 M 황산암모늄, pH 7.0)였다. 구배는 완충제 B (50 mM 인산나트륨 중 20% 이소프로판올 (v/v), pH 7.0)를 20%에서 86% (18.4분에 걸쳐 유량 1.2 mL/분)로 사용하여 적용하였다. 칼럼 온도는 분석 전체에 걸쳐 30℃에서 유지시켰고, UV 검출은 280 nm에서 수행하였다. 각각의 분석을 위해 천연 OBI-888 또는 접합된 생성물 10 μg을 주입하였다.
2.3 SEC 분석
SEC (크기 배제 크로마토그래피)는 애질런트 인피니티 1260 바이오이너트 시스템(Agilent Infinity 1260 Bioinert system)에 연결된 도소 바이오사이언스(TOSOH Bioscience) TSK겔 슈퍼 SW 3000 칼럼 (4.6 mm x 30 cm, 4 μm) 및 가드 칼럼 (4.6 mm x 4 cm)을 사용하여 수행하였다. 이동상은 0.2 M 인산칼륨 완충제, pH 6.8 (0.2 M 염화칼륨, 15% 이소프로판올)이었다. 유량은 0.35 mL/분으로 일정하게 유지시켰다. 칼럼은 분석 전체에 걸쳐 주위 온도에서 유지시켰다. 분석은 20분 등용매 용리로 수행하고, 280 nm에서 UV 검출하였다. 각각의 분석을 위해, 접합된 생성물 10 μg을 주입하였다. 백분율 순도 & 존재하는 백분율 응집은 각각 주요 피크 및 초기 용리 피크의 피크 면적을 총 피크 면적과 비교하여 계산하였다.
2.4 SDS-PAGE 분석
SDS-PAGE 분석은 MES 완충제에 의한 환원 조건 하에 NuPAGE 4-12% 비스-트리스 겔 (인비트로젠(Invitrogen), Cat# NP0321BOX)을 사용하여 수행하였다. 분석을 위해, 레인당 샘플 1 μg (단백질을 기초로 함)을 겔 상에 로딩하였다. 전기영동은 200 V에서 35분 동안 수행하였다. 겔을 단백질 검출을 위해 인스턴트블루(InstantBlue) (엑스페데온(Expedeon), Cat #ISB1LUK)로 염색하고, 이미지콴트(ImageQuant) 영상화 장비 (지이 헬스케어(GE Healthcare))를 사용하여 분석하였다.
2.5 브래드포드 검정 & UV 흡광도에 의한 농도 결정.
접합체의 농도는 천연 OBI-888 표준 곡선 (0-100 μg/mL) 대비 브래드포드 마이크로플레이트 검정에 의해 결정하였다. 검정은 편평 바닥, 96 웰 플레이트에서 각각의 보정 표준 및 샘플 100 μL를 브래드포드 시약 (엑스페데온, BFU1L) 200 μL와 혼합함으로써 삼중으로 수행하였다. 595 nm에서의 광학 밀도를 판독하고, 샘플 농도를 천연 OBI-888 표준 곡선 대비 결정하였다. 접합체의 농도 (단백질을 기초로 함)를 또한 나노드롭 분광광도계를 사용하여 UV 흡광도 (A280)에 의해 결정하였다. 측정을 삼중으로 수행하고, 평균값을 사용하여 항체 농도를 결정하였다:
c=Abs /ε.l
c=농도 (mg/mL); Abs=280 nm에서의 흡광도; ε=흡광 계수 (mL/mg.cm); l=길이 (cm).
보다 큰 규모의 접합으로부터 약물 대 항체 비가 4인 1종의 ADC 샘플 (OBI-999)을 단리하였고, 단리된 ADC (OBI-999)의 총량은 14.5 mg이었다 (브래드포드에 의함). 약물 대 항체 비 분포를 소수성 상호작용 크로마토그래피를 사용하여 수행하였고, 이를 도 1에 제시한다. 도 1(A)는 HIC에 의한 OBI-888의 단일 피크 (100%)를 보여주고, 도 1(B)는 약물 대 항체 비 4를 나타내는 ADC (OBI-999)의 주요 피크 (82.3%)를 보여준다. OBI-888 (도 2A) 및 ADC (OBI-999) (도 2B)의 순도는 크기 배제 크로마토그래피를 사용하여 수행하였다. 순도는 둘 다 96% 초과였다. 마지막으로, OBI-888 및 ADC (OBI-999)의 SDS-PAGE 분석을 도 3에 제시한다. 샘플은 응집이 적은 (<5 %) 균질한 생성물 (>82 % 단일 약물 대 항체 비)인 것으로 제시되었다. 분석 요약을 표 2에 열거한다.
표 2. ADC (OBI-999)의 분석 요약
Figure pct00007
실시예 3: 누드 마우스 (유방암)에서의 예시적인 항체의 항종양 활성의 측정
인간 유방 선암종의 이종이식 종양 모델에서, MCF-7 (ATCC HTB-22) 세포를 암컷 무흉선 (nu/nu) 누드 마우스의 우측 측복부 내로 피하로 (SC) 이식하였다 (1:1 매트리겔/배지 혼합물 중 2.0 x 107개 세포, 0.2 mL/마우스). 에스트라디올 시클로펜틸 프로피오네이트 (100 μg/마우스)의 보충 주사를, 세포 이식 1주 전으로부터 연구 완결 시까지 매주 2회 견갑골 사이로 피하로 투여하였다. 종양-이식된 마우스를 11개의 처리군으로 나누었고, 각각의 군은 6마리의 동물을 함유하였고, 시험 작용제 투여는 세포 이식 1일 후 (제1일로 표시됨)에 개시하였다.
3.1 시험 물질 및 투여 패턴
시험 물질 ADC (OBI-999), OBI-888, 및 MMAE는 원액을 25 mM 시트르산나트륨, 100 mM NaCl 완충제 (pH 6.5)로 매일 희석함으로써 제제화하고, 2 또는 6주 동안 매주 1회 정맥내로 (IV) 투여하였다. 2개의 대조군에는 6주 (군 1) 또는 2주 (군 2) 동안 매주 1회 비히클 (25 mM 시트르산나트륨, pH 6.5 + 100 mM NaCl)의 정맥내 주사를 제공하였다. 시험 물질, ADC (OBI-999)는 10 mg/kg으로 2주 동안 매주 1회, 및 0.3, 1, 및 3 mg/kg으로 6주 동안 매주 1회 투여하였다. 시험 물질, OBI-888은 10 mg/kg으로 2주 동안 매주 1회, 및 0.3, 1 및 3 mg/kg으로 6주 동안 매주 1회 투여하였다. 시험 물질, MMAE는 0.057 mg/kg으로 6주 동안 매주 1회 투여하였다. ADC (OBI-999)를 12.5 mL/kg의 용량 부피로 10 mg/kg으로 투여하는 것을 제외하고, 모든 시험 물질은 10 mL/kg의 용량 부피로 투여하였다.
표 3. 누드 마우스 (유방암)에서의 예시적인 항체의 항종양 활성에 대한 연구 설계
Figure pct00008
3.2 세포주
인간 유방 선암종 종양 세포주, MCF-7 (ATCC HTB-22, 유방 선암종)을 스폰서(Sponsor)에 의해 제공받았다. 종양 세포는 스폰서에 의해 제조 및 배양되었으며 (1 x 108개 세포/mL), 2 x 107개 세포를 함유하는 0.2 mL MCF-7 종양 세포 접종물 (매트리겔 및 배지의 혼합물; 1:1)을 각각의 마우스의 우측 측복부에 피하로 이식하였다.
3.3 동물
바이오라스코 타이완(BioLasco Taiwan)으로부터 (찰스 리버 래보러토리즈(Charles River Laboratories) 사용권 하에) 수득한 6-7주령의 암컷 (nu/nu) 누드 마우스를 사용하였다. 동물을 개별 환기 케이지 (IVC, 36 미니 아이솔레이터 시스템) 안에 수용하였다. 3-5마리의 동물을 위한 할당은 27 x 20 x 14 (cm)였다. 모든 동물을 위생적인 환경에서 제어되는 온도 (20-24℃) 및 습도 (30-70%) 하에 12-시간 낮/밤 주기로 유지시켰다. 표준 실험실 식이 (오리엔탈 이스트 캄파니 리미티드(Oriental Yeast Co., Ltd.), 일본) 및 오토클레이빙된 수돗물에의 자유로운 접근이 허용되었다. 수용, 실험, 및 동물 처분을 포함한 이러한 작업의 모든 측면은 일반적으로 문헌 ["Guide for the Care and Use of Laboratory Animals: Eighth Edition" (National Academies Press, Washington, D.C., 2011)]에 따라 본 발명자들의 AAALAC-인증 실험 동물 시설에서 수행하였다. 또한, 동물 관리 및 사용 프로토콜은 유로핀스 판랩스 타이완, 리미티드(Eurofins Panlabs Taiwan, Ltd)에서 IACUC에 의해 검토 및 승인받았다.
3.4 화학물질
에스톨-데포(Estol-Depot) Inj. (에스트라디올 시클로펜틸 프로피오네이트) (아스타르(Astar), 대만) 및 BD 매트리겔 매트릭스 (비디 바이오사이언시스(BD Biosciences), 미국)를 본 실험에 사용하였다.
3.5 장비
캘리퍼 (미투토요(Mitutoyo), 일본), 원심분리 5810R (에펜도르프(Eppendorf), 독일), CO2 인큐베이터 (포르마 사이언티픽 인크.(Forma Scientific Inc.), 미국), 혈구계수기 (하우써 사이언티픽 호르샴(Hausser Scientific Horsham), 미국), 개별 환기 케이지 (36 미니 아이솔레이터 시스템, 테크니플라스트(Tecniplast), 이탈리아), 도립 현미경 CK-40 (올림푸스(Olympus), 일본), 시스템 현미경 E-400 (니콘(Nikon), 일본) 및 수직 층류 (차오-흐신(Tsao-Hsin), 대만).
3.6 방법
77일 동안 매주 2회 종양 부피, 체중, 사망률, 및 명백한 독성 징후를 모니터링하고 기록하였다. 종양 부피 (mm3)는 장구형 타원체에 대한 공식에 따라 계산하였다: 길이 (mm) × [폭 (mm)]2 × 0.5. 종양 성장 억제는 T/C (처리군/대조군) x 100%로 계산하였다. T/C 값 ≤ 42%를 유의한 항종양 활성으로 간주하였다. 이원 ANOVA에 이어 본페로니 검정을 사용하여 각각의 비히클 대조군과 비교하여 군의 통계적 유의성을 확인하였다 (*p< 0.05).
3.7 결과
표 4-1 누드 마우스에서의 종양 부피, 이종이식편, 유방, MCF-7 (제1일-제26일)
Figure pct00009
Figure pct00010
표 4-2 누드 마우스에서의 종양 부피, 이종이식편, 유방, MCF-7 (제29일-제49일)
Figure pct00011
Figure pct00012
표 4-3 누드 마우스에서의 종양 부피, 이종이식편, 유방, MCF-7 (제53일-제77일)
Figure pct00013
Figure pct00014
표 5-1 누드 마우스에서의 체중, 이종이식편, 유방, MCF-7 (제1일-제26일)
Figure pct00016
표 5-2 누드 마우스에서의 체중, 이종이식편, 유방, MCF-7 (제29일-제49일)
Figure pct00017
Figure pct00018
표 5-3 누드 마우스에서의 체중, 이종이식편, 유방, MCF-7 (제53일-제77일)
Figure pct00019
Figure pct00020
도 4는 MCF-7 이식된 암컷 누드 (nu/nu) 마우스에서의 종양 성장 곡선을 보여준다. 2주 동안 매주 1회 10 mg/kg으로의 ADC (OBI-999)의 정맥내 투여는 제19일부터 제77일까지 상응하는 비히클 대조군과 비교하여 유의한 (T/C 값 ≤ 42%) 항종양 활성과 연관되었다 (도 4A). 또한, 6주 동안 매주 1회 투여를 제공받은 ADC (OBI-999) 처리군에서 용량-의존성 효과의 증거가 관찰되었다. 6주 동안 매주 1회 0.3 mg/kg으로의 ADC (OBI-999)의 정맥내 투여는 연구 과정에 걸쳐 항종양 활성과 연관되지 않았다. 그러나, 6주 동안 매주 1회 1 mg/kg 및 3 mg/kg으로의 ADC (OBI-999)의 정맥내 투여는 각각 제26일부터 제77일까지 및 제19일부터 제77일까지 상응하는 비히클 대조군과 비교하여 유의한 (T/C 값 ≤ 42%) 항종양 활성과 연관되었다 (도 4B).
2주 동안 매주 1회 10 mg/kg으로의 OBI-888의 정맥내 투여는 연구의 투여기 및 그 후 짧은 시간 둘 다 동안 상응하는 비히클 대조군과 비교하여 보통-내지-중간 정도의 항종양 활성과 연관되었다 (도 4A). 또한, 6주 동안 매주 1회 투여를 제공받은 OBI-888 처리군에서 용량-의존성 효과의 증거가 관찰되었다. 6주 동안 매주 1회 0.3 mg/kg으로의 OBI-888의 정맥내 투여는 연구 과정에 걸쳐 보통의 항종양 활성과 연관되었다. 6주 동안 매주 1회 1 mg/kg으로의 OBI-888의 정맥내 투여는 연구 과정에 걸쳐 중간 정도의 항종양 활성과 연관되었다. 6주 동안 매주 1회 3 mg/kg으로의 OBI-888의 정맥내 투여로 제67일 및 제70일에 유의한 (T/C 값 ≤ 42%) 항종양 활성에 도달하였지만, 항종양 활성은 상응하는 비히클 대조군과 비교하여 제26일만큼 초기에 유의한 (T/C 값 ≤ 42%) 항종양 활성 가까이에서 유지되었다 (도 4B).
6주 동안 매주 1회 0.057 mg/kg으로의 MMAE의 정맥내 투여는 연구의 투여기 및 그 후 짧은 시간 둘 다 동안 상응하는 비히클 대조군과 비교하여 보통-내지-중간 정도의 항종양 활성과 연관되었다 (도 4B).
도 5는 MCF-7 이식된 암컷 누드 (nu/nu) 마우스에서의 체중 변화를 보여준다. 모든 시험 물질은 모든 용량 수준에서 동물에게 잘-허용되었고, 연구의 과정에 걸쳐 유의한 체중 감소와 연관되지 않았다. 연구 기간 동안 어떠한 명백한 독성도 관찰되지 않았다. 또한 상응하는 비히클 대조군과 비교하여 ADC (OBI-999), OBI-888 및 MMAE의 안전성이 입증되었다.
실시예 4: 누드 마우스 (위암)에서의 예시적인 항체의 항종양 활성의 측정
인간 위 암종의 이종이식 종양 모델에서, 생존 NCI-N87 (ATCC CRL-5822) 세포를 암컷 nu/nu 마우스의 우측 측복부 내로 피하로 (SC) 이식하였다 (2.5 x 106개 세포/mL 매트리겔 함유 (1:1), 0.2 mL/마우스). 종양 이식된 마우스를 7개의 처리군으로 나누었고, 각각의 군은 8마리의 동물을 함유하였고, 하나의 군은 5마리의 동물을 함유하였고, 용량 투여는 세포 이식 1일 후 (제1일로 표시됨)에 개시하였다.
4.1 시험 물질 및 투여 패턴
시험 물질 ADC (OBI-999), OBI-888, 및 상응하는 비히클은 원액을 25 mM 시트르산나트륨, 100 mM NaCl 완충제 (pH 6.5)로 희석함으로써 제제화하고, 4주 동안 매주 1회 정맥내로 (IV) 투여하였다. 표준 작용제, MMAE 항체 0.191 mg/kg, 및 상응하는 비히클 (PBS pH 7.4)을 4주 동안 매주 1회 복강내로 (IP) 투여하였다. 하나의 처리군에는 시험 물질, OBI-888 10 mg/kg과 MMAE 0.191 mg/kg의 조합 요법을 제공하였다.
표 6. 누드 마우스 (위암)에서의 예시적인 항체의 항종양 활성에 대한 연구 설계
Figure pct00021
4.2 세포주
생존 인간 위 암종 NCI-N87 (ATCC CRL-5822) 세포주를 유로핀스 판랩스 타이완, 리미티드에서 구입하여 배양하였다. 세포를 10% 태아 소 혈청 (FBS)을 함유하는 RPMI-1640 배지에서 5% CO2 인큐베이터 내에서 37℃에서 배양하고, 각각의 마우스의 우측 측복부에 피하로 이식하였다.
4.3 동물
바이오라스코 타이완으로부터 (찰스 리버 래보러토리즈 사용권 하에) 수득한 5-6주령의 암컷 누드 (nu/nu) 마우스를 사용하였다. 동물을 개별 환기 케이지 (IVC, 36 미니 아이솔레이터 시스템) 안에 수용하였다. 3마리의 동물을 위한 할당은 27 x 20 x 14 (cm)였다. 모든 동물을 위생적인 환경에서 제어되는 온도 (20-24℃) 및 습도 (30-70%) 하에 12-시간 낮/밤 주기로 유지시켰다. 표준 실험실 식이 [MFG (오리엔탈 이스트 캄파니 리미티드, 일본)] 및 병에 든 오토클레이빙된 수돗물에의 자유로운 접근이 허용되었다. 수용, 실험, 및 동물 처분을 포함한 이러한 작업의 모든 측면은 일반적으로 문헌 ["Guide for the Care and Use of Laboratory Animals: Eighth Edition" (National Academies Press, Washington, D.C., 2011)]에 따라 본 발명자들의 AAALAC-인증 실험 동물 시설에서 수행하였다. 또한, 동물 관리 및 사용 프로토콜은 유로핀스 판랩스 타이완, 리미티드에서 IACUC에 의해 검토 및 승인받았다.
4.4 화학물질
0.9% NaCl (신-통(Sin-Tong), 대만), 태아 소 혈청 (하이클론(HyClone), 미국), 매트리겔 (BD, USA) 및 RPMI-1640 (하이클론, 미국).
4.5 장비
동물 케이지 (테크니플라스트, 이탈리아), 비커 1000 mL (키맥스(Kimax), 미국), 캘리퍼 (미투토요, 일본), 클래스 II 생물학적 안전 캐비넷 (누아이레(NuAire), 미국), 개별 환기 케이지 (IVC, 36 미니 아이솔레이터 시스템) (테크니플라스트, 이탈리아), 마우스 스케일 #Z-40 (타코닉(Taconic), 미국), 스테인레스 겸자 (클라페넥케르(Klappenecker), 독일) 및 수직 층류 (차오-흐신, 대만).
4.6 방법
100일 동안 매주 2회 종양 부피, 체중, 사망률, 및 명백한 독성 징후를 모니터링하고 기록하였다. 종양 성장 억제는 T/C (처리군/대조군) × 100%로 계산하였다. 비히클 대조군의 것과 비교하여 T/C 값 ≤ 42%를 유의한 항종양 활성으로 간주하였다. 이원 ANOVA에 이어 본페로니 검정을 사용하여 각각의 비히클 대조군과 비교하여 군의 통계적으로 유의한 유의성을 확인하였다 (*p< 0.05).
4.7 결과
표 7-1 암컷 nu/nu 마우스에서의 종양 부피, 이종이식편, 위, NCI-N87 (제1일-제25일)
Figure pct00022
Figure pct00023
표 7-2 암컷 nu/nu 마우스에서의 종양 부피, 이종이식편, 위, NCI-N87 (제29일-제53일)
Figure pct00024
Figure pct00025
표 7-3 암컷 nu/nu 마우스에서의 종양 부피, 이종이식편, 위, NCI-N87 (제57일-제85일)
Figure pct00026
Figure pct00027
표 7-4 암컷 nu/nu 마우스에서의 종양 부피, 이종이식편, 위, NCI-N87 (제88일-제100일)
Figure pct00028
Figure pct00029
표 8-1 암컷 nu/nu 마우스에서의 체중, 이종이식편, 위, NCI-N87 (제1일-제25일)
Figure pct00030
Figure pct00031
표 8-2 암컷 nu/nu 마우스에서의 체중, 이종이식편, 위, NCI-N87 (제29일-제53일)
Figure pct00032
Figure pct00033
표 8-3 암컷 nu/nu 마우스에서의 체중, 이종이식편, 위, NCI-N87 (제57일-제85일)
Figure pct00034
Figure pct00035
표 8-4 암컷 nu/nu 마우스에서의 체중, 이종이식편, 위, NCI-N87 (제88일-제100일)
Figure pct00036
Figure pct00037
도 17은 NCI-H526 이식된 암컷 누드 (nu/nu) 마우스에서의 종양 성장 곡선을 보여준다. ADC (OBI-999)의 1 mg/kg으로의 정맥내 투여는 연구 과정에 걸쳐 비히클 대조군과 비교하여 강건한 항종양 활성을 나타내었다. 유의한 항종양 활성 (T/C 값 ≤ 42%)은 제15일에 달성되어 그로부터 제53일까지 계속되었고, 최대 퍼센트 TGI는 제53일에 83%였다. ADC (OBI-999)의 3 mg/kg으로의 정맥내 투여는 연구 과정에 걸쳐 비히클 대조군과 비교하여 강건한 항종양 활성을 나타내었다. 유의한 항종양 활성 (T/C 값 ≤ 42%)은 제11일에 달성되어 그로부터 제53일까지 계속되었고, 최대 퍼센트 TGI는 제53일에 97%였다. ADC (OBI-999)의 10 mg/kg으로의 정맥내 투여는 연구 과정에 걸쳐 비히클 대조군과 비교하여 강건한 항종양 활성을 나타내었다. 유의한 항종양 활성 (T/C 값 ≤ 42%)은 제11일에 달성되어 그로부터 제53일까지 계속되었고, 최대 퍼센트 TGI는 제53일에 97%였다.
OBI-888의 10 mg/kg으로의 매주 정맥내 (IV) 투여는 연구 과정에 걸쳐 비히클 대조군과 비교하여 보통의 항종양 활성을 나타내었다 (도 17).
시험 물질, 항-CD30 ADC (OBI-910)의 10 mg/kg으로의 매주 정맥내 (IV) 투여는 연구 과정에 걸쳐 비히클 대조군과 비교하여 강건한 항종양 활성을 나타내었다. 유의한 항종양 활성 (T/C 값 ≤ 42%)은 제11일에 달성되어 그로부터 제53일까지 계속되었고, 최대 퍼센트 TGI는 제53일에 75%였다 (도 17).
표준 작용제, MMAE의 0.191 mg/kg으로의 매주 복강내 (IP) 투여는 연구 과정에 걸쳐 비히클 대조군과 비교하여 중간 정도의 항종양 활성을 나타내었고, 최대 퍼센트 TGI는 제53일에 53%였다 (도 17).
시험 물질 OBI-888 10 mg/kg과 표준 작용제 MMAE 0.191 mg/kg의 조합 요법은 연구 과정에 걸쳐 비히클 대조군과 비교하여 종양 성장의 유의한 억제와 연관되었다. 유의한 항종양 활성 (T/C 값 ≤ 42%)은 제11일에 달성되어 그로부터 제53일까지 계속되었고, 최대 퍼센트 TGI는 제53일에 62%였다 (도 17).
도 18은 NCI-H526 이식된 암컷 누드 (nu/nu) 마우스에서의 체중 변화를 보여준다. 모든 시험 물질은 잘-허용되었고, 연구의 과정에 걸쳐 어떠한 유의한 체중 감소와도 연관되지 않았다.
실시예 5: 누드 마우스 (폐암)에서의 예시적인 항체의 항종양 활성의 측정
인간 소세포 폐암의 이종이식 종양 모델에서, 생존 NCI-H526 병기 E 암종; 변이체 소세포 폐암 세포 (ATCC CRL-5811)를 암컷 nu/nu 마우스의 우측 측복부 내로 피하로 (SC) 이식하였다 (1 x 106개 세포, 매트리겔 함유 (1:0.8), 0.2 mL/마우스). 종양 이식된 마우스를 5개의 처리군으로 나누었고, 각각의 군은 8마리의 동물을 함유하였고, 시험 작용제 투여는 세포 이식 1일 후 (제1일로 표시됨)에 개시하였다.
5.1 시험 물질 및 투여 패턴
시험 물질 ADC (OBI-999), OBI-888, 및 상응하는 비히클은 원액을 25 mM 시트르산나트륨, 100 mM NaCl 완충제 (pH 6.5)로 희석함으로써 제제화하고, 4주 동안 매주 1회 정맥내로 (IV) 투여하였다. 표준 작용제, MMAE 항체 0.191 mg/kg, 및 상응하는 비히클 (PBS pH 7.4)을 4주 동안 매주 1회 복강내로 (IP) 투여하였다. 하나의 처리군에는 시험 물질, OBI-888 10 mg/kg과 MMAE 0.191 mg/kg의 조합 요법을 제공하였다.
표 9. 누드 마우스 (폐암)에서의 예시적인 항체의 항종양 활성에 대한 연구 설계
Figure pct00038
5.2 세포주
NCI-H526 종양 세포주를 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection)으로부터 구입하고 (ATCC CRL-5811, 변이체 소세포 폐 암종), 유로핀스 판랩스 타이완, 리미티드에서 배양하였다. 세포를 10% 태아 소 혈청 (FBS)을 함유하는 RPMI-1640 배지에서 5% CO2 인큐베이터 내에서 37℃에서 배양하고, 각각의 마우스의 우측 측복부에 피하로 이식하였다.
5.3 동물
6-7주령의 암컷 nu/nu 누드를 바이오라스코 타이완으로부터 (찰스 리버 래보러토리즈 사용권 하에) 수득하여 사용하였다. 동물을 개별 환기 케이지 (IVC, 36 미니 아이솔레이터 시스템) 안에 수용하였다. 5마리의 동물을 위한 할당은 27 x 20 x 14 (cm)였다. 모든 동물을 위생적인 환경에서 제어되는 온도 (20-24℃) 및 습도 (30-70%) 하에 12-시간 낮/밤 주기로 유지시켰다. 표준 실험실 식이 [MFG (오리엔탈 이스트 캄파니 리미티드, 일본)] 및 오토클레이빙된 수돗물에의 자유로운 접근이 허용되었다. 수용, 실험, 및 동물 처분을 포함한 이러한 작업의 모든 측면은 일반적으로 문헌 ["Guide for the Care and Use of Laboratory Animals: Eighth Edition" (National Academies Press, Washington, D.C., 2011)]에 따라 본 발명자들의 AAALAC-인증 실험 동물 시설에서 수행하였다. 또한, 동물 관리 및 사용 프로토콜은 유로핀스 판랩스 타이완, 리미티드에서 IACUC에 의해 검토 및 승인받았다.
5.4 화학물질
태아 소 혈청 (하이클론, 미국), RPMI-1640 배지 (써모피셔(ThermoFisher), 미국) 및 매트리겔 (코닝, 미국)을 본 실험에서 사용하였다.
5.5 장비
캘리퍼 (미투토요, 일본), 원심분리 5810R (에펜도르프, 독일), CO2 인큐베이터 (포르마 사이언티픽 인크., 미국), 혈구계수기 (하우써 사이언티픽 호르샴, 미국), 개별 환기 케이지 랙 (36 미니 아이솔레이터 시스템, 테크니플라스트, 이탈리아), 도립 현미경 CK-40 (올림푸스, 일본), 시스템 현미경 E-400 (니콘, 일본) 및 수직 층류 (차오-흐신, 대만).
5.6 방법
45일 동안 매주 2회 종양 부피, 체중, 사망률, 및 명백한 독성 징후를 모니터링하고 기록하였다. 종양 성장 억제는 T/C (처리군/대조군) × 100%로 계산하였다. 비히클 대조군의 것과 비교하여 T/C 값 ≤ 42%를 유의한 항종양 활성으로 간주하였다. 이원 ANOVA에 이어 본페로니 검정을 사용하여 각각의 비히클 대조군과 비교하여 군의 통계적으로 유의한 유의성을 확인하였다 (*p< 0.05).
5.7 결과
표 10-1 암컷 nu/nu 마우스에서의 종양 부피, 이종이식편, 폐, NCI-H526 (제1일-제25일)
Figure pct00039
표 10-2 암컷 nu/nu 마우스에서의 종양 부피, 이종이식편, 폐, NCI-H526 (제29일-제45일)
Figure pct00040
Figure pct00041
표 11-1 암컷 nu/nu 마우스에서의 체중, 이종이식편, 폐, NCI-H526 (제1일-제25일)
Figure pct00042
표 11-2 암컷 nu/nu 마우스에서의 체중, 이종이식편, 폐, NCI-H526 (제29일-제45일)
Figure pct00043
도 27은 NCI-H526 이식된 암컷 누드 (nu/nu) 마우스에서의 종양 성장 곡선을 보여준다. 4주 동안 매주 1회 ADC (OBI-999)의 10 mg/kg으로의 정맥내 투여는 유의한 항종양 활성 (T/C 값 ≤ 42%)과 연관되었고, 이는 제15일에 개시되어 제31일까지 계속되었고, 최대 퍼센트 TGI는 제25일에 85%였다.
시험 물질, OBI-888의 10 mg/kg으로의 매주 정맥내 (IV) 투여는 연구 과정에 걸쳐 비히클 대조군과 비교하여 중간 정도의 항종양 활성을 나타내었지만; 그러나, 유의한 항종양 활성 (T/C 값 ≤ 42%)이 연구 제18일에 달성되었고, 최대 퍼센트 TGI는 제18일에 61%였다.
표준 작용제, MMAE의 0.191 mg/kg으로의 매주 복강내 (IP) 투여는 연구 과정에 걸쳐 비히클 대조군과 비교하여 중간 정도의 항종양 활성을 나타내었고, 최대 퍼센트 TGI는 제18일에 55%였다.
시험 물질 OBI-888 10 mg/kg과 표준 작용제 MMAE 0.191 mg/kg의 조합 요법은 연구 과정에 걸쳐 비히클 대조군과 비교하여 종양 성장의 중간 정도의 억제와 연관되었지만; 그러나, 유의한 항종양 활성 (T/C 값 ≤ 42%)이 연구 제18일, 제22일, 및 제25일에 달성되었고, 최대 퍼센트 TGI는 제18일에 69%였다.
도 28은 NCI-H526 이식된 암컷 누드 (nu/nu) 마우스에서의 체중 변화를 보여준다. 모든 시험 물질은 잘-허용되었고, 연구의 과정에 걸쳐 어떠한 유의한 체중 감소와도 연관되지 않았다.
실시예 6: 누드 마우스 (췌장암)에서의 예시적인 항체의 항종양 활성의 측정
본 연구의 목적은 수컷 BALB/c 누드 마우스의 HPAC 인간 췌장암 이종이식편 모델에서 OBI-888, ADC (OBI-999), MMAE 및 MMAE와 조합된 OBI-888의 생체내 항종양 효능을 평가하기 위한 것이다.
6.1 시험 물질 및 투여 패턴
시험 물질 ADC (OBI-999), OBI-888, 및 상응하는 비히클은 원액을 25 mM 시트르산나트륨, 100 mM NaCl 완충제 (pH 6.5)로 희석함으로써 제제화하고, 4주 동안 매주 1회 정맥내로 (IV) 투여하였다. 표준 작용제, MMAE 항체 0.191 mg/kg, 및 상응하는 비히클 (PBS pH 7.4)을 4주 동안 매주 1회 복강내로 (IP) 투여하였다. 하나의 처리군에는 시험 물질, OBI-888 10 mg/kg과 MMAE 0.191 mg/kg의 조합 요법을 제공하였다.
표 12. 누드 마우스 (췌장암)에서의 예시적인 항체의 항종양 활성에 대한 연구 설계
Figure pct00044
6.2 세포주
HPAC 종양 세포 (ATCC CRL-2119)를 0.002 mg/mL 인슐린, 0.005 mg/mL 트랜스페린, 40 ng/mL 히드로코르티손, 10 ng/mL 표피 성장 인자 및 5% 태아 소 혈청, 100 U/mL 페니실린 및 100 μg/mL 스트렙토마이신이 보충된 1.2 g/L 중탄산나트륨, 2.5 mM L-글루타민, 15 mM HEPES 및 0.5 mM 피루브산나트륨을 함유하는 둘베코 변형 이글 배지 및 햄 F12 배지의 1:1 혼합물 중에 단층 배양물로서, 공기 중 5% CO2 분위기 하에 37℃에서 시험관내 유지시켰다. 종양 세포를 트립신-EDTA 처리에 의해 매주 2회 통상적으로 계대배양하였다. 지수 성장기에서 성장 중인 세포를 수거하여 종양 접종을 위해 카운팅하였다.
6.3 동물
6-8주령의 수컷 nu/nu 누드를 상하이 링창(Shanghai Lingchang)으로부터 수득하여 사용하였다. 마우스를 각각의 케이지에 4마리의 동물로, 일정한 온도 및 습도의 개별 환기 케이지 안에 유지시켰다 (온도: 20-26℃ 및 습도: 40-70%). 케이지는 폴리카르보네이트로 만들어졌고, 크기는 300 mm x 200 mm x 180 mm였다. 베딩 재료는 옥수수 속대였고, 이는 1주에 2회 바꾸었다. 동물은 조사 멸균된 건조 과립 사료 및 음용수에 전체 연구 기간 동안 자유롭게 접근하였다. 각각의 케이지에 대한 확인 라벨에는 하기 정보가 담겼다: 동물의 수, 성별, 계통, 수용일, 처리, 연구 번호, 군 번호 및 처리 개시일.
6.4 방법
종점은 시험 중인 화합물의 항종양 효과를 결정하는 것이다. 종양 크기는 캘리퍼를 사용하여 2차원적으로 매주 2회 측정하였고, 부피는 식: V = 0.5 a x b2를 사용하여 mm3 단위로 표현하였고, 여기서 a 및 b는 각각 종양의 긴 쪽 직경 및 짧은 쪽 직경이다. 이어서 T/C 값의 계산을 위해 종양 크기를 사용하였다. T/C 값 (퍼센트 단위)은 항종양 유효성의 지표이며; T 및 C는 각각 주어진 날의 처리군 및 대조군의 평균 부피이다. TGI를 각각의 군에 대해 식: TGI (%) = [1-(Ti-T0)/ (Vi-V0)] x100을 사용하여 계산하였고; Ti는 주어진 날의 처리군의 평균 종양 부피이고, T0은 제0일의 처리군의 평균 종양 부피이고, Vi는 Ti와 동일한 날의 비히클 대조군의 평균 종양 부피이고, V0은 제0일의 비히클 군의 평균 종양 부피이다.
평균 및 평균의 표준 오차 (SEM)를 포함한 요약 통계를 각각의 시점에 각각의 군의 종양 부피에 대해 제공한다. 마지막 용량 (군생성 후 제37일째 날) 후 최상의 치료 시점에 수득한 데이터에 대해 군들 사이의 종양 부피에서의 차이의 통계적 분석을 수행하였다. 일원 ANOVA를 수행하여 군들 사이의 종양 부피를 비교하였고, 유의한 F-통계 (처리 분산 대 오차 분산의 비)가 수득된 경우에, 군들 사이의 비교는 게임스-호웰 검정으로 수행하였고, 그렇지 않은 경우에는 던넷 (양측) 검정으로 수행하였다. OBI-888 및 MMAE 사이의 잠재적 상승작용적 효과를 이원 ANOVA에 의해 분석하였다. 모든 데이터는 SPSS 17.0을 사용하여 분석하였다. p < 0.05가 통계적으로 유의한 것으로 간주되었다.
6.5 결과
표 13. nu/nu 마우스에서의 종양 부피, 췌장, HPAC
Figure pct00045
Figure pct00046
표 14. nu/nu 마우스에서의 체중, 췌장, HPAC
Figure pct00047
Figure pct00048
도 34는 HPAC 이식된 누드 (nu/nu) 마우스에서의 종양 성장 곡선을 보여준다. 시험 물품 ADC (OBI-999)의 10 mg/kg으로의 처리는 유의한 항종양 활성을 생성하였고, 이는 제14일에 시작되어 제37일까지 계속되었다. 그의 평균 종양 크기는 1 mm3 (T/C = 0.1%, TGI = 104.0%, p< 0.001)였다. 단일 작용제로서 OBI-888 10 mg/kg은 유의한 항종양 활성을 생성하지 않았다. 그의 평균 종양 크기는 2,044 mm3 (T/C = 94.2%, TGI = 6.0%, p= 0.967)였다. 단일 작용제로서 MMAE 0.191 mg/kg 또는 OBI-888 10 mg/kg과 조합된 것은 약한 항종양 활성을 생성하였고, 평균 종양 크기는 각각 1,644 mm3 (T/C = 75.8%, TGI = 25.2%, p= 0.231) 및 1,680 mm3 (T/C = 77.4%, TGI = 23.5%, p= 0.213)였다.
도 35는 HPAC 이식된 누드 (nu/nu) 마우스에서의 체중 변화를 보여준다. 모든 시험 물질은 잘-허용되었고, 연구의 과정에 걸쳐 어떠한 유의한 체중 감소와도 연관되지 않았다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 과학 용어 및 임의의 두문자어는 본 발명의 분야에서 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기재된 것과 유사하거나 동등한 정보를 전달하는 임의의 조성물, 방법, 키트 및 수단을 사용하여 본 발명을 실시할 수 있지만, 정보 전달을 위한 바람직한 조성물, 방법, 키트 및 수단이 본원에 기재되어 있다.
본원에 인용된 모든 참고문헌은 법이 허용하는 전체 범위까지 본원에 참조로 포함된다. 그러한 참고문헌의 논의는 단지 그 저자들에 의해 이루어진 주장을 요약하기 위한 것으로 의도된다. 임의의 참고문헌 (또는 임의의 참고문헌의 일부)이 관련된 선행 기술임을 인정하는 것은 아니다. 출원인은 임의의 인용된 참고문헌의 정확도 및 적절성에 대해 이의를 제기할 권리를 보유한다.
SEQUENCE LISTING <110> OBI PHARMA, INC. <120> CONJUGATED BIOLOGICAL MOLECULES, PHARMACEUTICAL COMPOSITIONS AND METHODS <130> G3004-00901 <140> PCT/US2017/062886 <141> 2017-11-21 <150> 62/424,851 <151> 2016-11-21 <160> 34 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1 Gly Phe Ser Leu Tyr Thr Phe Asp Met Gly Val Gly 1 5 10 <210> 2 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 2 His Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys Tyr Tyr Asn Pro Ala Leu Lys Ser 1 5 10 15 <210> 3 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 3 Val Arg Gly Leu His Asp Tyr Tyr Tyr Trp Phe Ala Tyr 1 5 10 <210> 4 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 4 Gln Ile Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Thr Leu Val Lys Pro 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Claims (47)

  1. 암 세포를 고유하게 표적화하는 1개 이상의 항원을 포함하는 탄수화물 분자.
  2. 제1항에 있어서, 항원이 상기 항원-특이적 항체가 치료제를 표적화된 암 세포로 효과적으로 인도하게 할 수 있는 것인 탄수화물 분자.
  3. 제1항에 있어서, 항원이 글로보 시리즈 항원인 탄수화물 분자.
  4. 제3항에 있어서, 글로보 시리즈 항원이 스테이지-특이적 배아 항원-4 (SSEA-4; Neu5Acα2→ 3Galβ1→ 3GalNAcβ1→ 3Galα1→ 4Galβ1→ 4Glcβ1), 스테이지-특이적 배아 항원-3 (SSEA-3; Galβ1→ 3GalNAcβ1→ 3Galα1→ 4Galβ1→ 4Glcβ1) 또는 글로보 H (Fucα1→2 Galβ1→3 GalNAcβ1→3 Galα1→4 Galβ1→4 Glc)인 탄수화물 분자.
  5. 제2항에 있어서, 치료제가 항암 독소, 화학요법제, 광역학 치료제 또는 생물학적 작용제인 탄수화물 분자.
  6. 제1항에 있어서, 암이 글로보 시리즈 항원 발현 암인 탄수화물 분자.
  7. 치료제 및 글로보 시리즈 항원에 결합하는 항체 또는 항원-결합 단편을 포함하는 항체-약물 접합체 (ADC)이며;
    여기서 치료제는 링커에 의해 항체 또는 항원-결합 단편에 공유 접합된 것인 항체-약물 접합체 (ADC).
  8. 하기 화학식을 갖는 제7항의 ADC 화합물의 혼합물을 포함하는 조성물:
    Ab-(L-D)n (I)
    여기서 1종 이상의 치료 약물 모이어티 (D)는 링커 L에 의해 글로보 시리즈 항원을 표적화하는 항체인 항체 (Ab)에 공유 연결되고; n은 1 내지 8의 정수이다.
  9. 제7항에 있어서, 항체가 모노클로날 항체, 항원-결합 단편, 키메라 항체, 및 인간화 항체로부터 선택된 것인 ADC.
  10. 제9항에 있어서, 항원-결합 단편이 Fab, F(ab')2, Fv 또는 scFv 단편인 ADC.
  11. 제7항에 있어서, 항체가 암 세포 상에 발현된 글로보 시리즈 항원 SSEA-4 (Neu5Acα2→ 3Galβ1→ 3GalNAcβ1→ 3Galα1→ 4Galβ1→ 4Glcβ1), SSEA-3 (Galβ1→ 3GalNAcβ1→ 3Galα1→ 4Galβ1→ 4Glcβ1) 및/또는 글로보 H (Fucα1→2 Galβ1→3 GalNAcβ1→3 Galα1→4 Galβ1→4 Glc) 중 1종 이상을 표적화하는 것인 ADC.
  12. 제7항에 있어서, 항체가 항-글로보 H, 항-SSEA3 또는 항-SSEA4 항체인 ADC.
  13. 제12항에 있어서, 항-글로보 H 항체가 OBI-888인 ADC.
  14. 제12항에 있어서, 항-SSEA4 항체가 OBI-898인 ADC.
  15. 제7항에 있어서, 치료제가 모노메틸 아우리스타틴 E (MMAE)인 ADC.
  16. 제7항의 ADC 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염; 및 제약상 허용되는 희석제, 담체 또는 부형제를 포함하는 제약 조성물.
  17. 제16항에 있어서, 글로보 시리즈 항원을 표적화하는 다른 ADC의 조합물을 포함하는 제약 조성물.
  18. Ab와 화학식 I의 링커 시약을 반응시켜 항체-링커 중간체 Ab-L을 형성한 다음, Ab-L과 약물 모이어티를 반응시켜 항체-약물 접합체 화합물의 혼합물을 형성하거나; 또는
    약물 모이어티 D를 링커 시약과 반응시켜 약물-링커 중간체 D-L을 형성한 다음, D-L을 Ab와 반응시켜 항체-약물 접합체 화합물의 혼합물을 형성하는 것
    을 포함하는, 제8항의 조성물을 제조하는 방법.
  19. 제8항에 있어서, 링커 L이 티오 기를 포함하는 것인 조성물.
  20. 제19항에 있어서, 티오 기가 디술피드 가교의 환원에 의해 생성된 것인 조성물.
  21. 제8항에 있어서, 약물 모이어티 D가 화학요법제, 광역학 치료제 또는 생물학적 작용제인 조성물.
  22. 제21항에 있어서, 광역학 치료제가 포토프린, 레이저피린, 아미노레불린산 (ALA), 규소 프탈로시아닌 Pc 4, m-테트라히드록시페닐클로린 (mTHPC), 클로린 e6 (Ce6), 알루메라, 레불란, 포스칸, 메트빅스, 헥스빅스, 포토클로르, 포토센스, 포트렉스, 루마칸, 비소낙, 암피넥스, 베르테포르핀, 퓨를리틴, ATMPn, 아연 프탈로시아닌 (ZnPc), 프로토포르피린 IX (PpIX), 피로페오포르비드 a (PPa) 또는 페오포르비드 a (PhA)로부터 선택된 것인 조성물.
  23. 제8항에 있어서, 약물 모이어티 D가 항증식제인 조성물.
  24. 제23항에 있어서, 항증식제가 모노메틸 아우리스타틴 E (MMAE), 모노메틸 아우리스타틴 F (MMAF), 메르탄신 (DM1), 안트라시클린, 피롤로벤조디아제핀, α-아마니틴, 튜부리신, 벤조디아제핀, 에를로티닙, 보르테조밉, 풀베스트란트, 수니티닙, 레트로졸, 이마티닙 메실레이트, PTK787/ZK 222584, 옥살리플라틴, 류코보린, 라파마이신, 라파티닙, 로나파르닙 (사라사르®, SCH 66336), 소라페닙, 게피티닙, AG1478, AG1571, 알킬화제; 알킬 술포네이트; 아지리딘; 에틸렌이민; 메틸라멜라민; 아세토게닌; 캄프토테신; 브리오스타틴; 칼리스타틴; CC-1065; 크립토피신; 돌라스타틴; 두오카르마이신; 엘레우테로빈; 판크라티스타틴; 사르코딕티인; 스폰지스타틴; 클로람부실; 클로르나파진; 콜로포스파미드; 에스트라무스틴; 이포스파미드; 메클로레타민; 메클로레타민 옥시드 히드로클로라이드; 멜팔란; 노벰비킨; 페네스테린; 프레드니무스틴; 트로포스파미드; 우라실 머스타드; 카르무스틴; 클로로조토신; 포테무스틴; 로무스틴; 니무스틴; 라니무스틴; 칼리케아미신; 디네미신; 클로드로네이트; 에스페라미신; 네오카르지노스타틴 발색단; 아클라시노마이신; 악티노마이신; 아우트라마이신; 아자세린; 블레오마이신; 칵티노마이신; 카라비신; 카미노마이신; 카르지노필린; 크로모미시니스; 닥티노마이신; 다우노루비신; 데토루비신; 6-디아조-5-옥소-L-노르류신; 독소루비신; 에피루비신; 에소루비신; 이다루비신; 마르셀로마이신; 미토마이신; 미코페놀산; 노갈라마이신; 올리보마이신; 페플로마이신; 포트피로마이신; 퓨로마이신; 쿠엘라마이신; 로도루비신; 스트렙토니그린; 스트렙토조신, 투베르시딘, 우베니멕스, 지노스타틴, 조루비신; 메토트렉세이트; 5-플루오로우라실 (5-FU); 데노프테린; 프테로프테린; 트리메트렉세이트; 플루다라빈; 6-메르캅토퓨린; 티아미프린; 티오구아닌; 안시타빈; 아자시티딘; 6-아자우리딘; 카르모푸르; 시타라빈; 디데옥시우리딘; 독시플루리딘; 에노시타빈; 플록수리딘; 칼루스테론; 드로모스타놀론 프로피오네이트; 에피티오스타놀; 메피티오스탄; 테스토락톤; 아미노글루테티미드; 미토탄; 트릴로스탄; 프롤린산; 아세글라톤; 알도포스파미드 글리코시드; 아미노레불린산; 에닐우라실; 암사크린; 베스트라부실; 비산트렌; 에다트락세이트; 데포파민; 데메콜신; 디아지쿠온; 엘포르미틴; 엘립티늄 아세테이트; 에포틸론; 에토글루시드; 질산갈륨; 히드록시우레아; 렌티난; 로니다이닌; 메이탄신; 안사미토신; 미토구아존; 미톡산트론; 모피단몰; 니트라에린; 펜토스타틴; 페나메트; 피라루비신; 로속산트론; 포도필린산; 2-에틸히드라지드; 프로카르바진; 라족산; 리족신; 시조피란; 스피로게르마늄; 테누아존산; 트리아지쿠온; 2,2',2"-트리클로로트리에틸아민; 트리코테센; 우레탄; 빈데신; 다카르바진; 만노무스틴; 미토브로니톨; 미토락톨; 피포브로만; 가시토신; 아라비노시드; 시클로포스파미드; 티오테파; 탁소이드; 파클리탁셀; 도세탁셀; 클로란부실; 겜시타빈; 6-티오구아닌; 메르캅토퓨린; 메토트렉세이트; 시스플라틴; 카르보플라틴; 빈블라스틴; 백금; 에토포시드; 이포스파미드; 미톡산트론; 빈크리스틴; 비노렐빈; 노반트론; 테니포시드; 에다트렉세이트; 다우노마이신; 아미노프테린; 젤로다; 이반드로네이트; 토포이소머라제 억제제; 디플루오로메틸오르니틴 (DMFO); 레티노이드 또는 카페시타빈으로부터 선택된 것인 조성물.
  25. 암의 치료를 필요로 하는 대상체에게 유효량의 제7항의 ADC를 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 암을 치료하는 방법.
  26. 제25항에 있어서, 암이 글로보 시리즈 항원 발현 암인 방법.
  27. 제26항에 있어서, 글로보 시리즈 항원 발현 암이 육종, 피부암, 백혈병, 림프종, 뇌암, 교모세포종, 폐암, 유방암, 구강암, 두경부암, 비인두암, 식도암, 위암, 간암, 담관암, 담낭암, 방광암, 췌장암, 장암, 결장직장암, 신장암, 자궁경부암, 자궁내막암, 난소암, 고환암, 협부암, 구인두암, 후두암 및 전립선암으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
  28. 제25항에 있어서, 그를 필요로 하는 대상체에게 글로보 시리즈 항원을 표적화하는 다른 ADC의 조합물의 유효량을 투여하는 것을 포함하는 방법.
  29. 제28항에 있어서, 조합물이 암 치료에서 상승작용적 효과 및 증진된 치료 효능을 제공하는 것인 방법.
  30. 제20항의 제약 조성물의 면역 유효량을 투여하는 것 및 하기로부터 선택된 절차 중 하나 이상:
    제7항의 ADC를 2회 이상 투여하는 것;
    2회의 연속 투여 사이의 시간 간격 및/또는 투여량 요법을 조정하는 것;
    투여 경로를 조정하는 것 및/또는 투여의 주사 부위를 변경하는 것; 또는
    글로보 시리즈 항원을 포함하는 다른 ADC를 조합하는 것
    을 포함하는, 면역 반응의 유도 또는 증진을 필요로 하는 대상체에서 면역 반응을 유도하거나 증진시키는 방법.
  31. 제30항에 있어서, 주사가 면역 반응 부스터 작용제의 첨가에 의해 변경 및/또는 보충될 수 있는 것인 방법.
  32. 제25항, 제28항 및 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 인간인 방법.
  33. 제25항, 제28항 및 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 유효량이 0.01 μg 내지 250 mg인 방법.
  34. 제25항, 제28항 및 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 유효량이 0.001 μg/kg 내지 250 mg/kg인 방법.
  35. 제25항, 제28항 및 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 유효량이 공동-제제 또는 개별 제제 내에 존재하는 것인 방법.
  36. 제30항에 있어서, 조합물이 면역 반응을 유도하거나 증진시키는데 상승작용적 효과를 제공하는 것인 방법.
  37. 제7항에 있어서, 육종, 피부암, 백혈병, 림프종, 뇌암, 교모세포종, 폐암, 유방암, 구강암, 두경부암, 비인두암, 식도암, 위암, 간암, 담관암, 담낭암, 방광암, 췌장암, 장암, 결장직장암, 신장암, 자궁경부암, 자궁내막암, 난소암, 고환암, 협부암, 구인두암, 후두암 및 전립선암으로 이루어진 군으로부터 선택된 암의 치료에 사용하기 위한, 항암제, 면역억제제, 및 항감염제로 이루어진 군으로부터 선택된 추가의 작용제의 유효량과 조합하여 사용하기 위한 항체-약물 접합체 화합물.
  38. 육종, 피부암, 백혈병, 림프종, 뇌암, 교모세포종, 폐암, 유방암, 구강암, 두경부암, 비인두암, 식도암, 위암, 간암, 담관암, 담낭암, 방광암, 췌장암, 장암, 결장직장암, 신장암, 자궁경부암, 자궁내막암, 난소암, 고환암, 협부암, 구인두암, 후두암 또는 전립선암의 치료를 위한 의약의 제조에서의 제7항의 항체-약물 접합체 화합물의 용도.
  39. 육종, 피부암, 백혈병, 림프종, 뇌암, 교모세포종, 폐암, 유방암, 구강암, 두경부암, 비인두암, 식도암, 위암, 간암, 담관암, 담낭암, 방광암, 췌장암, 장암, 결장직장암, 신장암, 자궁경부암, 자궁내막암, 난소암, 고환암, 협부암, 구인두암, 후두암 또는 전립선암의 치료를 위한, 항암제, 면역억제제, 및 항감염제로 이루어진 군으로부터 선택된 추가의 작용제의 유효량과 조합하여 사용하기 위한 의약의 제조에서의 제7항의 항체-약물 접합체 화합물의 용도.
  40. 암 세포를 제7항의 ADC에 접촉시키는 단계;
    상기 결합된 ADC의 양에 기초하여 ADC가 암 세포에 결합하는 정도를 측정하는 단계; 및
    ADC에 대해 암 세포의 결합 효능을 결정하는 단계
    를 포함하는, ADC에 대해 암 세포의 치료 효능을 결정하는 방법.
  41. 영상화제, 및 글로보 시리즈 항원에 결합하는 항체 또는 항원-결합 단편을 포함하는 항체-약물 접합체 (ADC)의 유효량을 투여하는 단계이며;
    여기서 영상화제는 링커에 의해 항체 또는 항원-결합 단편에 공유 접합된 것인 단계; 및
    대상체에서 영상화제를 검출하는 단계
    를 포함하는, 대상체를 영상화하는 방법.
  42. 제41항에 있어서, 영상화제가 형광단, 염료, MRI 조영제 또는 방사성핵종인 방법.
  43. 제41항에 있어서, 대상체가 암을 갖는 방법이며, 암 전이를 검출하는 방법으로서 추가로 정의되는 방법.
  44. 제41항에 있어서, 대상체가 인간인 방법.
  45. 제41항에 있어서, ADC가 글로보 시리즈 항원 SSEA-4 (Neu5Acα2→ 3Galβ1→ 3GalNAcβ1→ 3Galα1→ 4Galβ1→ 4Glcβ1), SSEA-3 (Galβ1→ 3GalNAcβ1→ 3Galα1→ 4Galβ1→ 4Glcβ1) 및/또는 글로보 H (Fucα1→2 Galβ1→3 GalNAcβ1→3 Galα1→4 Galβ1→4 Glc)를 표적화하는 것인 방법.
  46. 중쇄 가변 도메인이
    서열식별번호(SEQ ID NO): 1의 아미노산 서열을 갖는 제1 중쇄 상보성 결정 영역 (HCDR1);
    서열식별번호: 2의 아미노산 서열을 갖는 제2 중쇄 상보성 결정 영역 (HCDR2);
    서열식별번호: 3의 아미노산 서열을 갖는 제3 중쇄 상보성 결정 영역 (HCDR3)
    을 포함하고;
    경쇄 가변 도메인이
    서열식별번호: 7의 아미노산 서열을 갖는 제1 경쇄 상보성 결정 영역 (LCDR1);
    서열식별번호: 8의 아미노산 서열을 갖는 제2 경쇄 상보성 결정 영역 (LCDR2);
    서열식별번호: 9의 아미노산 서열을 갖는 제3 경쇄 상보성 결정 영역 (LCDR3)
    을 포함하는 항체를 포함하는, 글로보 H에 결합하는 항체-약물 접합체 (ADC).
  47. 중쇄 가변 도메인이
    서열식별번호: 29의 아미노산 서열을 갖는 제1 중쇄 상보성 결정 영역 (HCDR1);
    서열식별번호: 31의 아미노산 서열을 갖는 제2 중쇄 상보성 결정 영역 (HCDR2);
    서열식별번호: 33의 아미노산 서열을 갖는 제3 중쇄 상보성 결정 영역 (HCDR3)
    을 포함하고;
    경쇄 가변 도메인이
    서열식별번호: 22의 아미노산 서열을 갖는 제1 경쇄 상보성 결정 영역 (LCDR1);
    서열식별번호: 24의 아미노산 서열을 갖는 제2 경쇄 상보성 결정 영역 (LCDR2);
    서열식별번호: 26의 아미노산 서열을 갖는 제3 경쇄 상보성 결정 영역 (LCDR3)
    을 포함하는 항체를 포함하는, SSEA-4에 결합하는 항체-약물 접합체 (ADC).
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