KR20190042629A - 고글리코실화 인간 혈액응고인자 viii 융합 단백질 및 그 제조방법과 용도 - Google Patents

고글리코실화 인간 혈액응고인자 viii 융합 단백질 및 그 제조방법과 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 고글리코실화 재조합 인간 혈액응고인자 VIII (FVIII) 융합 단백질 및 그 제조방법과 용도를 개시하였다. 상기 융합 단백질은 N-말단에서 C-말단까지 인간 FVIII, 가요성 펩티드 링커, 적어도 하나의 인간 융모성 생식선 자극호르몬 β 서브 유닛 카르복시말단 펩티드 강성 유닛 및 반감기 연장 부분(바람직하게는 IgG Fc 변이체)을 포함한다. 상기 융합 단백질은 재조합 FVIII과 유사한 생물학적 활성 및 연장된 체내 활성 반감기를 가지므로, 약동학적 성능 및 약효를 향상한다.

Description

고글리코실화 인간 혈액응고인자 VIII 융합 단백질 및 그 제조방법과 용도
본 발명은 융합 단백질 분야에 속한 것이며, 구체적으로는 인간 혈액응고인자 VIII (FVIII)의 융합 단백질 및 그 제조방법과 용도에 관한 것이며, 특히 다양한 혈액응고 관련 질환의 치료 용도에 관한 것이다.
혈액응고인자 VIII (FVIII)는 항혈우병인자(antihemophilic factor)로도 불리우며, 내원성 응고 시스템에서 중요한 역할을 한다. FVIII의 분자 유전학에 관한 많은 연구에 따르면, 성 염색체인 X-연관 유전자(X-linked gene)에서 FVIII의 결핍은 A형 혈우병을 유발한다는 것이 밝혀졌다. 통계에 따르면, 남성 인구에서 A형 혈우병의 유병률(prevalence)은 5,000 명 중 1 명으로 혈우병 총 수의 80% 이상을 차지한다. 현재 A형 혈우병 치료는 혈우병 환자에서 부족한 혈액응고인자 VIII를 보충하는 보충요법이다.
FVIII는 3 개의 A 도메인 (A1, A2, A3), 하나의 탄수화물이 풍부하고 필수가 아닌 중심 도메인 (B-도메인) 및 2 개의 C 도메인 (C1, C2)인 6개의 도메인으로 나뉘어진 다중 구조의 고분자 당 단백질이다. 성숙한 단백질은 약 280kDa의 경쇄와 중쇄로 구성된다. 경쇄는 약 80kDa의 분자량을 가지며, 구조는 A3, C1 및 C2를 포함하며, 연결 방식은 A3-C1-C2이다. 중쇄는 약 90 내지 200kDa의 분자량을 가지며, 구조는 A1, A2 및 B를 포함하며, 연결 방식은 A1-A2-B이다. 중쇄 및 경쇄의 결합은 금속 이온에 의존한다. 혈장에서 중쇄 및 경쇄의 이량체는 폰 빌레브란트 인자(von Willebrand, vWF)와 높은 친화력으로 결합되는데, 이로하여 이들이 성숙 전 분해되는 것을 보호한다. 혈장에서 vWF에 결합되는 비활성화된 FVIII의 반감기는 약 12 시간이다. FVIII는 중쇄 내의 아미노산 Arg372 및 Arg740, 경쇄 내의 Arg1689에서 활성화 혈액응고인자 FX (FXa) 및 트롬빈(thrombin) 단백질에 의해 분해 절단되어 활성화되며, 따라서 vWF 인자가 방출됨으로써 활성화된 FVIII 이량체(FVIIIa)를 생성하며, Ca2+의 존재하에 인지질 표면에서 활성화 혈액응고인자 FIX (FIXa) 및 FX와 견고한 복합체를 형성하고, 이어서 FX는 FIXa에 의해 활성화되며, 활성화된 FX는 복합체에서 해리되어 프로트롬빈을 트롬빈으로 변환시키며 트롬빈은 피브리노겐을 피브린으로 직접 변환시킨다. 응고 시스템의 보조인자로서, FVIII는 FX에 대한 FIXa의 활성화 촉매 효율을 몇개 크기 정도(order of magnitude)로 증가시킨다.
FVIII 분자는 지금까지 복제된 가장 긴 유전자 단편 중 하나이며, 임상에 응용되는 분자량이 가장 큰 단백질 약물이다. 포유 동물 세포는 분자량이 크고 글리코실화도가 높은 재조합 단백질의 최적 발현 시스템이다. 그러나 생체외(in vitro)에서 FVIII의 재조합 발현양은 기타 성질이 비슷한 유전자의 재조합 발현량보다 현저히 낮다(예컨대 FVIII 발현 수준은 FIX의 1%임). 이는 FVIII에 대한 신체의 수요를 반영할 수 있으나, FVIII의 생체외 재조합 발현에 대해서는 가장 큰 장애이다. 또한 FVIII는 혈중 반감기가 짧기(단지 8-12시간) 때문에 심각한 혈우병 A 환자에 대해 예방적 치료를 진행하려면 매주 약 3회 정맥(i.v.) 주사를 해야 한다.
FVIII의 생체내 기능적 반감기를 연장시키기 위해, 선행 기술은 FVIII를 PEG, 인간혈청알부민(HSA), 트랜스페린(Transferrin) 또는 IgG Fc 등과 반감기를 연장하는 부분에 연결시킨다. 예를 들어, Novo Nordisk (N8-GP), Bayer (BAY94-9027) 및 Baxter (BAX 855) 회사는 지속 작용가능한 PEG화 FVIII 제품을 개발하였고, 이미 임상 연구를 시작했으나, 이는 단백질 제조 공정에서 PEG와 FVIII 화학적 결합의 추가 단계를 증가함으로써 최종 수율을 감소시키고 제조 비용을 증가시킨다. 또한, 약동학 연구데이터에 따르면, PEG화 FVIII는 현저히 연장된 반감기를 얻지 못함을 나타냈으며, 예컨대 N8-혜의 A형 혈우병 환자 체내에서의 순환반감기는 약 18시간이였다(Tiede A 등, J Thromb Haemost, 2013, 11: 670-678). BAY94-9027의 임상 I단계 연구에 따르면, 이의 건강한 인체 내에서의 반감기는 약 18.2시간이며 야생형 FVIII보다 약 1.4배 연장하였다(Coyle T 등, Haemophilia, 2012, 18(Suppl 3): 22). Bax 855의 반감기는 약 18시간이다(Turecek PL 등, Hamostaseologie, 2012, 32 Suppl 1: 29-38).
미국의 Biogen Idec 회사에서 개발한 단량체-이량체 하이브리드형(monomer-dimer hybrid) 재조합 FVIIIFc 융합 단백질(Monomer-dimer hybrid FVIII-Fc)인 Eloctate®는 2014 년 6 월 미국 FDA의 승인을 받고 출시되었다. 임상 데이터에 의하면, 인체 내에서 Eloctate®의 반감기는 1.5~1.7배로만 연장되어(Dumont J A 등, Blood, 2012, 119: 3024-3030; Powell JS 등, Blood, 2 012, 119:3031-3037), 3~5일에 한번씩 주사해야 된다고 나타났다. Biogen회사에서 구축한 rFVIIIFc 및 Fc의 이중 발현 벡터(dual expression vector)로 감염한 HEK-293 세포에 있어서, 이로 발현한 산물에서 rFVIIIFc 호모다이머 형태의 융합체가 검출되지 않았고, 오직 단량체-이량체 하이브리드형 rFVIIIFc 융합 단백질과 Fc 이량체만 발현되었다. 해당 회사의 연구원들은 사용된 발현 시스템에서 호모다이머형의 분자량이 너무 커, 숙주세포가 약 400KDa의 분자량을 갖는 rFVIIIFc 호모다이머를 성공적으로 분비하지 못하거나, rFVIIIFc 단량체 간의 입체 장애 효과(Steric effects)로 인해 중합이 실패했다고 추측한다(Peters RT 등, J Thromb Haemost, 2013,11(1): 132-41). 이로 부터, 호모다이머형 FVIII 융합 단백질의 발현은 아주 어렵다는 것을 알 수 있다.
인간 융모성 생식선 자극호르몬(hCG) β쇄의 카르복시말단 펩티드(Carboxy terminal peptide)(이하, CTP라 함) 또한 특정 단백질의 생체내 반감기를 연장시키는 효과를 가지므로 일부 특허 문헌에 개시된 융합 단백질에 함유된 반감기를 연장하는 부분은 면역 글로불린 Fc 단편, HSA, CTP 또는 반감기를 연장할 수 있는 기타 융합 리간드(Fusion ligand)를 선택 사용하였다. 또한 CTP는 동일한 단백질의 서브유닛을 연결하는 링커로 사용될 수 있다. 예를 들어, 중국특허번호 CN103539860A, CN103539861A, CN103539868A 및 CN103539869A에 개시된 융합 단백질 중 CTP는 난포자극호르몬의 β 서브 유닛과 α 서브 유닛 사이에 위치하여 링커로서 작용하며, WO2005058953A2에 개시된 융합 단백질 중 CTP는 당단백 호르몬의 β 서브 유닛과 α 서브 유닛을 연결하기 위한 링커로서 작용한다.
본 발명자는 선행 기술에 따라 CTP를 링커 또는 반감기를 연장하는 부분으로 사용하지 않고, 이를 가요성 펩티드 링커(flexible peptide linker) (예를 들어, (GGGGS)n)에 연결하여 새로운 링커 서열을 형성하여, FVIII와 반감기를 연장하는 부분 사이(예를 들어, 선행 기술에서 제안된 CTP를 포함하지 않는 면역 글로불린 Fc 단편)에 배치하여 신규 FVIII 융합 단백질을 구성하고, 이에 의해 반감기를 연장시키고 우수한 생물학적 활성 및 기능을 유지하였다.
본 발명은 연장된 생체내 활성 반감기 및 재조합 FVIII와 비슷한 생물학적 활성을 가지는 고글리코실화 인간 혈액응고인자 VIII 융합 단백질을 제공한다. 또한, 본 발명은 상기 융합 단백질을 효율적이고 안정하게 발현시키는 방법을 제공하며, 해당 방법으로 발현한 융합 단백질은 고수율적이고 제조 및 저장 과정에서의 안정성이 좋으며 생물학적 활성이 시판되는 재조합 FVIII 인자와 비슷한 장점을 갖는다.
본 발명의 제 1 측면에 따르면, 고글리코실화 FVIII 융합 단백질(이하 융합 단백질이라고 약칭함)을 제공하며, 상기 융합 단백질은 N-말단에서 C-말단까지 인간 혈액응고인자 VIII (hFVIII), 가요성 펩티드 링커(Linker, L), 적어도 하나의 인간 융모성 생식선 자극호르몬 β 서브 유닛의 카르복시말단 펩티드 강성 유닛(Rigid unit)(이하, CTP 강성 유닛으로 약칭하며 (CTP)n으로 표시함, 바람직하게는 n은 1,2,3,4 또는 5 임) 및 반감기 연장 부분 (예: 면역 글로불린 Fc 단편, 알부민(albumin), 트랜스페린 또는 PEG, 바람직하게는 인간 IgG Fc 변이체 (vFc로 표시))를 순차적으로 함유한다. 본 발명의 일부 바람직한 실시예에서 상기 융합 단백질은 hFVIII-L-CTPn-vFc로 나타낸다.
여기서, 상기 hFVIII는 야생형 또는 돌연변이형이며; 바람직하게 상기 야생형 hFVIII는 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열을 가지며; 바람직하게 상기 돌연변이형 hFVIII는 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열과 적어도 85% 상동하며; 더 바람직하게 돌연변이형 hFVIII는 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열과 적어도 90% 상동하다. 가장 바람직하게 상기 돌연변이형 hFVIII 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열과 적어도 95% 상동하다.
여기서, 가요성 펩티드 링커는 바람직하게는 비면역원성이며 서로 간의 입체 장애 효과(Steric effect)를 최소화하기 위해 hFVIII와 Fc 사이에 충분한 공간 거리를 생성한다. 바람직하게는, 2 개 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 가요성 펩티드 링커가 사용되되, Gly (G), Ser (S), Ala (A) 및 Thr (T)로 이루어진 군으로부터 선택된다.
더욱 바람직하게는, 가요성 펩티드 링커는 G 잔기 및 S 잔기를 포함한다. 링커 펩티드의 길이는 융합 단백질의 활성에 매우 중요하다. 본 발명에서, 상기 펩티드 링커는 바람직하게는 (GS)a(GGS)b(GGGS)c(GGGGS)d 반복단위로 조합되어 형성된 아미노산 서열 화학식을 포함할 수 있으며, 여기서 a, b, c 및 d는 0보다 크거나 같은 정수이며, a + b + c + d≥1이다.
구체적으로 본 발명의 실시예에서, 상기 펩티드 링커는 바람직하게 아래와 같은 서열을 포함할 수 있다:
(i) L1: GSGGGSGGGGSGGGGS(예컨대 서열번호 2);
(ii) L2: GSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(예컨대 서열번호 3);
(iii) L3: GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(예컨대 서열번호 4);
(iv)L4: GSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (예컨대 서열번호 5);
(v) L5: GGGSGGGSGGGSGGGSGGGS (예컨대 서열번호 6).
여기서, 상기 CTP 강성 유닛은 인간 융모성 생식선 자극호르몬 β 서브 유닛의 카르복시말단의 아미노산 113 내지 145로 이루어진 전장 서열 또는 그의 단편에서 선택되며, 구체적으로 CTP 강성 유닛은 서열번호 7에 표시된 아미노산 서열 또는 절단된 서열을 포함한다. 우선, 인체내에 천연적으로 존재하는 복수 개의 글리코실화 사이트(Glycosylation site)를 함유하는 CTP 폴리펩티드는 비면역원성이다. 다음, 복수 개의 클리코실화 사이트를 함유하는 CTP 강성 링커 펩티드는 가요성 링커 펩티드의 불규칙 코일에 비해 안정한 입체 구조를 형성할 수 있어, FVIII와 Fc 단편이 독립적으로 접혀 서로의 생물학적 활성에 영향을 주지 않으면서 정확한 3 차원 구조를 형성하도록 한다. 또한, CTP 글리코실 측쇄의 보호 작용은 프로테아제(Protease)에 대한 링커 펩티드의 민감성을 감소시킬 수 있다.
바람직하게, 상기 CTP 강성 유닛은 적어도 2개의 글리코실화 사이트를 포함하며; 예컨대 본 발명의 바람직한 실시예에서 상기 CTP 강성 유닛은 2개의 글리코실화 사이트를 포함하며, 예시적으로 상기 CTP 강성 유닛은 서열번호 7의 N 말단의 10개 아미노산, 즉 SSSS*KAPPPS*을 포함하거나, 상기 CTP 강성 유닛은 서열번호 7의 C 말단의 14개 아미노산, 즉 S*RLPGPS*DTPILPQ을 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 CTP 강성 유닛은 3개의 글리코실화 사이트를 포함하며, 예시적으로 상기 CTP 강성 유닛은 서열번호 7의 N 말단의 16개 아미노산, 즉 SSSS*KAPPPS*LPSPS*R을 포함한다. 또한 일부 실시예에서 강성 유닛은 4개의 글리코실화 사이트를 포함하며, 예시적으로 상기 CTP 강성 유닛은 28, 29, 30, 31, 32 또는 33개의 아미노산을 포함하고, 인간 융모성 생식선 자극호르몬 β 서브 유닛의 113 번, 114 번, 115 번, 116 번, 117 번 또는 118 번 위치에서 시작하여 145 번 위치에서 끝난다. 구체적으로, 상기 CTP 강성 유닛은 서열번호 7의 N 말단의 28 개 아미노산, 즉 SSSS*KAPPPS*LPSPS*RLPGPS*DTPILPQ을 포함한다. 여기서, *는 글리코실화 사이트를 나타낸다. 각 가능성은 독립적으로 본 발명의 실시형태를 나타낸다.
일부 실시예에서, 본 발명에서 제공되는 CTP 강성 유닛은 천연 CTP 아미노산 서열과 적어도 70% 상동하고, 일부 실시예에서, 본 발명에서 제공되는 CTP 강성 유닛은 천연 CTP 아미노산 서열과 적어도 80% 상동하고; 일부 실시예에서, 본 발명에서 제공되는 CTP 강성 유닛은 천연 CTP 아미노산 서열과 적어도 90% 상동하며, 일부 실시예에서, 본 발명에서 제공되는 CTP 강성 유닛은 천연 CTP 아미노산 서열과 적어도 95% 상동하다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 상기 CTP 강성 유닛은 아래와 같은 서열을 포함할 수 있다:
(i) CTP1: PRFQDSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ(예컨대 서열번호 7);
(ii) CTP2: SSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ(예컨대 서열번호 8);
(iii) CTP3: SSSSKAPPPS(예컨대 서열번호 9);
(iv) CTP4: SRLPGPSDTPILPQ(예컨대 서열번호 10).
본 발명의 일부 실시예에서 상기 융합 단백질은 하나의 상기 CTP 강성 유닛을 포함한다.
본 발명의 일부 실시예에서 상기 융합 단백질은 하나 이상의 상기 CTP 강성 유닛을 포함하며, 바람직하게 2, 3, 4 또는 5 개의 상기 CTP 강성 유닛을 포함하며, 예컨대 본 발명의 일 실시예에서 상기 융합 단백질은 2 개의 CTP3 강성 유닛을 포함하는 SSSSKAPPPSSSSSKAPPPS(CTP3-CTP3, (CTP3)2라고 나타내기도 함) 이다.
여기서, 반감기 연장 부분은 바람직하게 면역 글로불린 IgG, IgM, IgA Fc 단편에서 선택되며, 보다 바람직하게는 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 및 이들의 변이체의 Fc 단편에서 선택되며, 또한 상기 인간 IgG Fc 변이체는 야생형 인간 IgG Fc에 있는 적어도 하나의 아미노산 변형(Amino acid modification)을 포함하며, 변이체는 감소된 효과기 기능(Effector function) (ADCC 및/또는 CDC효과) 및/또는 신생아 수용체 FcRn에 대한 향상된 결합 친화도를 갖는다. 또한, 인간 IgG Fc 변이체는 다음으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
(i) vFcγ1: Leu234Val, Leu235Ala 및 Pro331Ser 돌연변이를 포함하는 인간 IgG1 힌지 영역, CH2 및 CH3 영역(예를 들어, 서열번호11에 기재된 아미노산 서열);
(ii) vFcγ2-1: Pro331Ser 돌연변이를 포함하는 인간 IgG2 힌지 영역, CH2 및 CH3 영역 (예를 들어, 서열 번호 12에 기재된 아미노산 서열);
(iii) vFcγ2-2: Thr250Gln 및 Met428Leu 돌연변이를 포함하는 인간 IgG2 힌지 영역, CH2 및 CH3 영역(예를 들어, 서열번호13에 기재된 아미노산 서열);
(iv) vFcγ2-3: Pro331Ser, Thr250Gln 및 Met428Leu 돌연변이를 포함하는 인간 IgG2 힌지 영역, CH2 및 CH3 영역(예를 들어, 서열번호14에 기재된 아미노산 서열);
(v) vFcγ4: Ser228Pro 및 Leu235Ala 돌연변이를 포함하는 인간 IgG4 힌지 영역, CH2 및 CH3 영역(예를 들어, 서열번호 15에 기재된 아미노산 서열).
본 발명에 의해 제공되는 IgG Fc 변이체는 (i) 내지 (v)에 기재된 5 가지 변이체를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니며, 또한 IgG 이소타입 아형(subtype) 간의 2 가지 유형의 기능적 변이체 돌연변이 사이트의 조합 또는 중첩일 수 있다. 예컨대 상기 (iv)에서 기술된 변이체는 (ii) 및 (iii)에서의 돌연변이 사이트가 중첩되어 수득된 신규 IgG2 Fc의 결합 변이체(combined variant)이다.
본 발명의 상기 융합 단백질의 Fc 변이체(vFc)는 인간 IgG를 함유하되, 예컨대 인간 IgG1, IgG2 및 IgG4의 힌지 영역, CH2 및 CH3 영역을 포함한다. 이러한 CH2 영역은 228, 234, 235 및 331 번 위치(EU 카운팅 시스템에 의해 결정됨)에 아미노산 돌연변이를 포함한다. 이러한 아미노산 돌연변이는 Fc의 효과기 기능을 감소시키는 것으로 예상된다. 인간 IgG2는 FcγR에 결합하지 않지만 매우 약한 보체 활성을 나타낸다. Pro331Ser 돌연변이를 갖는 Fcγ2 변이체는 천연 Fcγ2보다 더 낮은 보체 활성을 가질 것이고, 여전히 FcγR 비결합자이다. IgG4 Fc는 보체 캐스케이드(complement cascade)의 활성화에 결함이 있으며, FcγR에 대한 이의 결합 친화력은 IgG1보다 약 하나의 크기 정도로 낮다. 천연 Fcγ4에 비해, Leu235Ala 돌연변이를 갖는 Fcγ4 변이체는 제일 작은 효과기 기능을 나타낼 수 있다. Leu234Val, Leu235Ala 및 Pro331Ser 돌연변이를 갖는 Fcγ1도 또한 천연 Fcγ1에 비해 감소된 효과기 기능을 나타냈다. 이러한 Fc 변이체는 모두 천연 인간 IgG Fc보다 FVIII 융합 단백질의 제조에 적합하다. 250 및 428 번 위치(EU 넘버링 시스템에 의해 확정된 위치)에는 아미노산 돌연변이를 포함하여, Fc 영역과 신생아 수용체 FcRn의 결합 친화력을 증가시키고, 반감기를 추가로 연장한다(Paul R 등, J BIOL Chem, 2004, 279:6213-6216), 상기 2 가지 유형의 기능적 변이체를 조합하거나 겹쳐 새로운 변이체를 수득함으로써, 효과기 기능을 감소시키고 이의 반감기를 연장시킨다. 본 발명의 Fc 변이체는 상기와 같은 몇개 사이트의 돌연변이를 포함하나 이에 한정되지 않고, 다른 사이트의 치환을 도입하여 Fc가 감소된 효과기 기능 및/또는 FcRn 수용체에 대한 증가된 결합력을 갖도록 할 수 있고, Fc 변이체의 기능/활성이 감소되거나 바람직하지 않은 구조변화를 일으키지 않는다. 일반적인 돌연변이 사이트는 Shields RL 등, J Biol Chem, 2001, 276(9): 6591-604을 참조할 수 있다.
본 발명의 하나의 바람직한 실시예에서 상기 융합 단백질의 아미노산 서열은 서열번호 16과 같다.
본 발명의 다른 한 측면에서는 상기 융합 단백질을 코딩하는 DNA를 제공한다.
본 발명의 하나의 바람직한 실시예에서 상기 융합 단백질의 DNA 서열은 서열번호 17과 같다.
본 발명의 다른 한 측면은 상기 DNA를 포함하는 벡터(vector)를 제공한다.
본 발명의 다른 한 측면은 상기 벡터를 포함하거나 상기 벡터로 형질감염된 숙주세포를 제공한다.
본 발명의 구체적인 실시형태에서 숙주세포는 CHO 유래 세포주 DG44이다.
본 발명의 제 5 측면에 따르면, 약학 조성물이 제공된다. 상기 약학 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체(carrier), 부형제 또는 희석제, 및 유효량의 상기 융합 단백질을 포함한다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, CHO 유래 세포주와 같은 포유동물 세포주로 융합 단백질을 제조 또는 생산하는 방법이 제공되며, 이 방법은 다음과 같은 단계를 포함한다: 즉,
(a) 융합 단백질을 코딩하는 DNA를 CHO 세포에 도입하여 CHO 유래 세포주를 생성시키는 단계;
(b) 단계 (a)에서 성장 배지(Growth medium)에서 매 24 시간내로 1IU/106 이상의 세포를 발현하는 고수율 세포주를 선별하는 단계;
(c) 단계 (b)에서 선별한 세포주를 배양하여 융합 단백질을 발현하는 단계;
(d) 단계 (c)에서 얻은 발효액을 수확하고 융합 단백질을 분리 및 정제하는 단계; 를 포함한다.
더 바람직하게, 상기 단계 (a)에서 CHO 유래 세포주는 DG44이다.
더 바람직하게, 상기 단계 (c)에서 세포 배양은 회분식 배양, 관류 배양 또는 유가 배양 방법을 선택할 수 있다.
또한, 상기 단계(d)에서 상기 융합 단백질은 4 단계 크로마토그래피로 정제하되, 각각 친화성 크로마토그래피, 소수성 크로마토그래피, 음이온교환 크로마토그래피 및 분자체 크로마토그래피 이다. 본 발명은 실시예 5와 조합하여 바람직한 조건을 추가로 제공한다.
본 발명의 바람직한 실시예에서, 상기 방법으로 제조된 융합 단백질의 활성은 >6000IU/mg이다.
본 발명의 제 6 측면에 따르면, FVIII의 결핍 또는 기능 상실에 의해 유발된 출혈성 질환 또는 사건을 예방 또는 치료하기 위한 약물 제조에서의 상기 융합 단백질의 용도가 제공된다.
더 나아가, 상기 질환은 갑형(또는 A형) 혈우병이 포함한다. 본 발명의 융합 단백질은 갑형 혈우병 환자의 자발성 출혈 사건, 수술 예방, 수술 전후 관리(Perioperative management) 또는 수술 치료에서 출혈의 발생을 억제 또는 예방하는 기능을 한다.
본 발명자는 본 발명에서 개시 및/또는 기재한 융합 단백질 및 그 제조방법의 다음과 같은 장점을 개괄하였다.
1. 본 발명에서 구축한 FVIII 융합 단백질은 Fc 단편이 비절단성(non-cleavable)이다. 즉 Fc 단편의 보체 및 수용체 결합 도메인을 돌연변이시켜, Fc와 해당 수용체의 결합 친화력을 조절하여 ADCC 및 CDC 효과를 감소시키거나 제거하며, Fc 부분의 생체내에서 활성 단백질의 반감기를 연장시키는 기능만 보류하며, 세포 독성을 생성하지 않는다. Biogen 회사에서 개발한 FVIII 융합 단백질의 Fc단편은 천연 유래된 것으로, Fc에 의해 매개되는 나쁜 효과기 기능(effector function)이 환자의 치료 위험을 증가시킬 수 있음을 예측할 수 있다.
2. 본 발명은 CHO 세포를 이용하여 융합 단백질을 발현하고 발현 산물에는 호모다이머형 FVIII Fc 융합 단밸질만 함유되어 있으며, 그 정제 단계가 간단하고 효율적이다. Biogen회사는 단량체-이량체 이형접합체(Monomeric) FVIII융합 단백질을 발현하기 위해 rFVIIIFc와 Fc을 발현하는 이중 발현 벡터를 구축하고 HEK-293 세포를 형질감염시켰다(미극특허, 공개번호: US20130274194A1). 발현되는 융합 단백질 발효액에는 FVIII-Fc:FVIII-Fc 호모다이머형(Dimeric) 융합 단백질, FVIII-Fc:Fc 단량체-이량체 이형접합체(Monomeric) 융합 단백질 및 Fc:Fc 이량체의 3가지 형태의 생성물이 함유될 것으로 예측되었다. 융합 단백질 발현 과정에서 숙주세포는 동시에 FVIII-Fc와 Fc의 2 개의 단일 사슬 분자를 발현시킨 후, 둘씩 각각 중합하여 상기 3 가지의 생성물을 형성시키므로 최종 표적 생성물의 발현 효율이 크게 저하될 수 있다. 아울러, 정제과정에서 기타 두가지 형태의 불순물을 반드시 제거하여야 하기에 정제과정이 더욱 복잡하고 생산효율이 낮아지며 생산 비용도 크게 증가한다. 따라서, 본 발명의 제조방법은 Biogen회사에서 개발한 Monomeric rFVIIIFc 융합 단백질보다 일정한 기술적 장점 및 가격상의 장점을 구비하는바, 발현, 정제공정은 모두 더욱 간단하고 효율적이며, 생산 비용도 더 낮다.
3. 30 IU/kg, 90 IU/kg 및 270 IU/kg의 투여량에 따라 FVIII 융합 단백질 FP-B를 HemA 마우스에 투여한 결과, 중투여량 및 고투여량 그룹은 HemA 마우스의 급성 출혈 상황을 효과적으로 제어할 수 있고, FP-B 각 투여량 그룹의 마우스의 생존율은 각 재조합 FVIII(Xyntha, Pfizer) 약물 투여 그룹보다 모두 향상되었으므로, 융합 단백질 FP-B은 Xyntha보다 지속적인 약효과 작용을 가진다는 것을 반영한다. 아울러, FP-B고투여량과 저투여량 그룹은 출혈시간과 출혈량 등 결과에서 모두 투여량 관련성을 나타냈다.
4. 재조합 FVIII와 비교할 때, 본 발명의 융합 단백질은 하강된 면역 원성을 가지며, 환자 체내에서 중화항체의 산생을 감소시킬 수 있는 효과를 기대할 수 있다.
5. 본 발명에서 제조된 융합 단백질은 높은 생물학적 활성을 유지하며, 정제된 각 배치(Batch)의 융합 단백질의 활성은 약 6000-10000IU/mg의 범위이며, 몰비 활성으로 환산하면 약 2340-3900IU/nM (각 융합 단백질은 2 개의 FVIII를 포함하되, 1170-1950IU/nM FVIII에 상당함)이다. 일부 배치의 정제된 융합 단백질의 활성은 심지어 12000IU/mg이상(몰비 활성으로 환산하면 약 4680IU/nM이며, 2340IU/nM FVIII 에 상당함)이다. 따라서, 본 발명에서 제조한 융합 단백질은 Biogen회사에서 개발한 단량체-이량체 이형접합체 rFVIIIFc 융합 단백질(활성은 1660-1770IU/nM) (J. McCue 등, Biologicals, 2015,43: 213-219) 및 출시된 재조합 FVIII ReFacto(활성은 1521-2287IU/nM) (미국특허, 공개번호: US20130274194A1)의 활성과 대등하거나 더 높다. 이는 본 발명에서 제공한 융합 단백질의 C말단에 융합된 Fc는 FVIII의 활성에 거의 영향 주지 않음을 말한다.
6. 본 발명에서 제공한 융합 단백질은 복수 개의 글리코실 측쇄를 갖는 강성 CTP 폴리펩티드를 포함하며, (GGGGS)n와 같은 가요성 링커 펩티드의 불규칙 코일에 비해, 안정한 입체 구조를 형성할 수 있으며, 이러한 “격리”작용은 FVIII와 Fc 단편이 각각의 생물학적 활성에 영향을 주지 않으면서 독립적으로 폴딩하여 정확한 3차원 구조를 형성하게 한다. CTP는 글리코실기를 함유하고, 음전하를 가지고 고도로 시알산화된 CTP는 이에 대한 신장의 제거 작용에 저항할 수 있고, 융합 단백질의 반감기를 추가로 연장시킬 수 있다. 또한, CTP 글리코실 측쇄의 보호 작용은 프로테아제에 대한 링커 펩티드의 민감성을 감소시켜, 융합 단백질이 연결 영역에서 쉽게 분해되지 않게 할 수 있다.
7. 본 발명의 융합 단백질은 발효, 정제 과정 및 저장 과정에서 우수한 안정성을 갖는다.
8. 본 발명에 의해 제공되는 융합 단백질의 제조방법은 수율이 높고, 300ml의 진탕 플라스크(shake flask)에서 14 일간 배양하면, 누적 수율은 적어도 150mg/L일 수 있어, 대규모 산업화 생산을 실현하기 위한 공정 확대를 진행할 수 있다.
본 발명의 범위 내에서, 본 발명의 상술한 다양한 기술적 특징 및 이하(예컨대 실시예)에 구체적으로 기술되는 각 기술적 특징이 서로 조합되어 새로운 또는 바람직한 기술 방안을 형성할 수 있음을 이해해야 한다.
도 1은 본 발명의 실시예에 따른 pcDNA3 발현 벡터에서 SpeI-EcoRI(효소 절단 부위는 표시됨) 단편의 FP-B의 뉴클레오티드 서열 및 유추된 아미노산 서열을 나타낸다. 인간 FVIII는 신호 펩티드(1-19, 밑줄......로 표시)와 성숙한 FVIII 단백질 (20-1457)로 구성된다. 성숙한 융합 단백질은 hFVIII (20-1457), 가요성 펩티드 링커(1458-1484, 밑줄 로 표시), CTP 강성 유닛 (1485-1512, 밑줄
Figure pct00001
로 표시) 및 vFcγ2-3 변이체(1513-1735)를 포함한다.
도 2는 정제 후의 FP-B 단백질의 SEC-HPLC 피크 스펙트럼도이다.
도 3은 정제 후의 FP-B 단백질의 SDS - PAGE 전기영동도이다.
도 4는 꼬리 절단 후 각 마우스의 출혈량 (μl)을 나타낸다. 참고: *p<0.05, **p<0.01.
도 5는 꼬리 절단 후 각 마우스의 출혈 시간(s)을 나타낸다. 참고: *p<0.05, **p<0.01.
hCG-β 카르복시말단 펩티드(CTP)
CTP는 인간 융모성 생식선 자극호르몬(hCG)의 β-서브 유닛의 카르복시말단에서 유래된 짧은 펩티드이다. 생식 관련 4가지 폴리펩티드계 호르몬인 난포자극호르몬 (FSH), 황체형성호르몬 (LH), 갑상선자극호르몬 (TSH) 및 융모성 생식선 자극 호르몬 (hCG)은 동일한 α-서브 유닛과 각각 특이한 β-서브 유닛을 포함한다. 기타 세가지 호르몬에 비해, hCG 체내 반감기는 선명하게 연장된다. 이는 β-서브 유닛의 특유의 카르복시말단 펩티드(CTP) 때문이다(Fares FA 등, Proc Natl Acad Sci USA, 1992, 89 (10): 4304-4308). 천연 CTP는 37개의 아미노산 잔기를 함유하고, 4 개의 O-글리코실화 사이트를 가지며, 말단이 시알산 잔기 이다. 음전하를 가지고 고도로 시알산화된 CTP는 이에 대한 신장의 제거 작용에 저항하여 단백질의 체내에서의 반감기를 연장한다(Fares F A 등, Proc Natl Acad Sci USA, 1992, 89(10): 4304-4308). 그러나, 발명자는 FVIII와 반감기 연장 부분 (예: 면역 글로불린 Fc 단편)의 연결을 위한 링커 펩티드로서, 창조적으로 적절한 길이의 가요성 링커에 적어도 하나의 CTP 폴리펩티드를 연결시켰다.
본 발명자는 FVIII와 Fc 변이체 사이에 CTP 펩티드를 추가함으로써 강성 링커 펩티드를 첨가하는 것에 상당함을 발견했다. 이는 N-말단 융합된 FVIII가 Fc 변이체와 FcRn의 결합 사이트에 영향을 미치지 않는 방식으로 반감기에 좋은 영향을 주도록 확보하였다. 또한, Fc의 Protein A 결합 사이트는 제조 과정에서 정제 단계에 아주 중요한데, CTP를 연결하면 N-말단 융합된 FVIII가 protein A와의 결합 사이트를 "덮지" 않도록 확보하여, 더욱 저렴하고 적절한 필러로 융합 단백질을 정제할 수 있어 정제 비용을 줄일 수 있다. 한편, CTP를 첨가함으로써, 약 25 kDa 크기의 Fc 단편이 N-말단 융합된 FVIII의 정확한 폴딩을 방해하여 그의 생물학적 활성/기능의 감소 또는 상실을 초래하는 것을 방지할 수 있다. 복수 개의 글리코실 측쇄를 갖는 강성 CTP 폴리펩티드는 (GGGGS)n와 같은 가요성 링커 펩티드의 불규칙 코일에 비해, 안정한 입체 구조를 형성할 수 있으며, 이러한 “격리”작용은 FVIII와 Fc 단편이 각각의 생물학적 활성에 영향을 주지 않으면서 독립적으로 폴딩하여 정확한 3차원 구조를 형성하게 한다. 한편, CTP 글리코실 측쇄의 보호 작용은 융합 단백질이 연결 영역에서 쉽게 분해되지 않도록 프로테아제에 대한 링커 펩티드의 민감성을 감소시킬 수 있다.
IgG Fc 변이체
비절단성 Fc 변이체
Fc 요소는 면역 글로불린 IgG의 불변 영역 Fc 단편으로부터 유래되며, 이는 병원체의 면역 방어를 제거하는데 중요한 역할을 한다. Fc에 의해 매개된 IgG의 효과기 기능은 두 가지 메커니즘을 통해 수행된다: (1) 세포 표면 Fc 수용체 (FcγR)에 결합하여, 탐식 작용 또는 용해(lysis) 작용 또는 킬러 세포가 항체 의존성 세포 독성 (ADCC) 경로를 통해 병원체를 소화하거나, (2) 제1 보체 성분 C1의 C1q에 결합하여 보체 의존성 세포 독성(CDC) 경로를 유발하여 병원체를 용해시킨다. 네가지 인간 IgG 아형에서, IgG1과 IgG3는 FcγR에 효율적으로 결합하나, IgG4와 FcγRs의 결합 친화력은 낮으며, IgG2와 FcγR의 결합은 측정할 수 없을 정도로 너무 낮아 인간 IgG2는 거의 ADCC 효과가 없다. 또한, 인간 IgG1 및 IgG3는 C1q에 효율적으로 결합하여 보체 캐스케이드 반응을 활성화시킬 수 있다. 또한 인간 IgG2와 C1q의 결합은 비교적 약하고, IgG4는 C1q에 결합하지 않으며(Jefferis R 등, Immunol Rev, 1998, 163: 59-76), 즉 상기 인간 IgG2는 CDC 효과도 비교적 약하다. 천연 IgG 아형 중 FVIII-Fc 융합 단백질의 제조에 적합한 것은 아무것도 없음이 분명하다. 효과기 기능이 없는 비절단성 Fc를 얻기 위한 가장 효과적인 방법으로는 Fc 단편의 보체와 수용체 결합 도메인을 돌연변이 변형시켜 ADCC 및 CDC효과를 감소하거나 제거하고, 기능성 단백질의 생물학적 활성 및 Fc 단편의 장기간 지속되는 생체내 반감기만 유지하여, 세포 독성을 일으키지 않는 것이다. 더 많은 비절단성 Fc 변이체에 포함된 돌연변이 사이트에 관한 내용은 아래 문헌을 참조할 수 있다: 즉, Shields RL 등, J Biol Chem, 2001,276(9):6591-604; 또는 중국발명특허 CN201280031137.2를 참조할 수 있다.
신생아 수용체(FcRn)에 대한 결합 친화력이 향상된 Fc 변이체
IgG의 혈장 반감기는 이와 FcRn의 결합에 의해 결정되는데, 일반적으로 pH 6.0에서 결합하고 pH 7.4 (혈장 pH)에서 해리한다. 이들 2 개의 결합 부위에 대한 연구를 통해, IgG에서 FcRn에 결합하는 부위에 대해 조작하여, pH 6.0에서의 결합능력을 증가시켰다. FcRn에 결합하는데 중요한 인간 Fcγ 도메인의 일부 잔기에서의 돌연변이를 통해 혈청 반감기를 증가시킬 수 있음은 이미 입증되었다. 보도에 따르면 T250, M252, S254, T256, V308, E380, M428 및 N434의 돌연변이는 FcRn 결합 친화력을 증가 또는 감소시킬 수 있다(Roopenian 등, Nat. Rview Immunology7: 715-725, 2007). 한국 특허번호 KR 10-1027427에서는 FcRn에 대하여 증가된 결합 친화력을 나타내는 트라스투주마브(trastuzumab) (Herceptin®, Genentech) 변이체를 개시하였으며, 이러한 변이체는 257C, 257M, 257L, 257N, 257Y, 279Q, 279Y, 308F 및 308Y 중의 하나 또는 다수 개의 아미노산 변형을 포함한다. 한국 특허공개번호 KR 2010-0099179에서는 벡시주맙 (beacizumab)(Avastin, Genentech) 변이체를 제공하며, 이러한 변이체는 N434S, M252Y/M428L, M252Y/N434S 및 M428L/N434S의 아미노산 변형을 포함하여 증가된 생체내 반감기를 나타낸다. 또한, Hinton 등도 2개 돌연변이체 T250Q와 M428L는 FcRn에 대한 결합을 각각 3배, 7배 증가시킴을 발견하였다. 또한, 동시에 2개의 사이트를 돌연변이시키면 결합력이 28배 증가한다. 붉은털 원숭이 체내에서, M428L 또는 T250QM/428L 돌연변이체는 혈장 반감기가 2배 증가되는 것으로 나타났다(Paul R. Hinton 등, J Immunol, 2006, 176: 346-356). 신생아 수용체(FcRn)에 대한 결합 친화력이 향상되는 Fc 변이체가 포함하는 돌연변이 사이트에 관한 더 많은 내용은 중국발명특허 CN201280066663.2를 참조할 수 있다. 또한, 5 가지의 인화 항체의 Fc 단편에서의 T250Q/M428 돌연변이에 대한 연구는 Fc와 FcRn의 상호 작용을 향상 시켰을 뿐만 아니라, 추후의 생체내 약물동력학적 시험에서 피하주사할 경우, Fc 돌연변이 항체는 야생형 항체에 비해 향상된 약물동력학적 파라미터를 나태냈는데, 예컨대 향상된 생체내 노출량, 감소된 제거율 및 개선된 피하 생체 이용율을 나타냈다(Datta-Mannan A 등, MAbs. Taylor & Francis, 2012, 4(2): 267-273.).
융합 단백질 및 그 제조방법
본 발명의 융합 단백질 유전자는 코돈 최적화(Codon optimization) 되고, 인공 합성 방법에 의해 제조된다. 본 발명의 뉴클레오티드 서열(nucleotide sequence)에 따르면, 당업자라면 다양한 공지된 방법으로 편리하게 본 발명의 코딩 핵산을 제조할 수 있다. 이러한 방법은 인공 합성 또는 전통적인 서브 클로닝에 한정되지 않으며, 구체적인 방법은 “J. Sambrook, Molecular Cloning Experimental Guide”에서 찾을 수 있다. 본 발명의 하나의 실시형태로서, 본 발명의 코딩 핵산 서열은 뉴클레오티드 서열을 분할 합성(Segmented synthesis)한 후 서브 클로닝하는 방법으로 구축될 수 있다.
또한, 본 발명은, 본 발명 융합 단백질을 코딩하는 서열 및 그에 작동가능하게 연결된 발현 조절 서열을 포함하는 포유 동물 세포의 발현 벡터를 제공한다. "작동 연결됨" 또는 "작동 가능하게 연결됨"은 선형 DNA 서열의 일부가 동일한 선형 DNA 서열의 다른 부분의 활성을 조절하거나 제어할 수 있는 상황을 의미한다. 예를 들어, 프로모터가 서열의 전사를 제어하면, 이는 코딩 서열에 작동 가능하게 연결되는 것이다.
포유동물 세포 발현 벡터로는 예를 들어, 진핵 세포 시스템에서의 발현에 사용될 수 있는 pcDNA3, pIRES, pDR, pBK, pSPORT 등과 같은 시중 판매하고 있는 것을 이용할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 당업자는 또한 숙주세포에 기반하여 적합한 발현 벡터를 선택할 수 있다.
공지된 엠프티 발현 벡터(empty expression vector)의 제한효소 지도에 따라, 당업자는 통상적인 방법에 따라 제한 효소를 이용해 절단 및 접합하여, 본 발명의 융합 단백질의 코딩 서열을 적절한 제한 사이트(Restriction site)에 삽입함으로써 본 발명의 재조합 발현 벡터를 제조한다.
또한 본 발명은, 본 발명의 융합 단백질을 발현하는 숙주세포를 제공하되, 상기 숙주세포는 본 발명의 융합 단백질의 코딩 서열을 포함한다. 상기 숙주세포는 바람직하게 CHO 세포, COS 세포, 293 세포, RSF 세포 등과 같은 진핵 세포일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 바람직한 실시형태에서, 상기 세포는 본 발명의 융합 단백질을 잘 발현할 수 있는 CHO 세포이며, 이로써 활성이 좋고 안정성이 우수한 융합 단백질을 얻을 수 있다.
또한 본 발명은, 재조합 DNA 기술에 의해 본 발명의 융합 단백질을 제조하는 방법을 제공하며, 이 방법은 다음과 같은 단계를 포함한다: 즉,
1) 융합 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 제공하는 단계;
2) 단계 1)의 핵산 서열을 적절한 발현 벡터에 삽입하여, 재조합 발현 벡터를 얻는 단계;
3) 적절한 숙주세포에 단계 2)의 재조합 발현 벡터를 도입하는 단계;
4) 발현에 적합한 조건에서 형질감염된 숙주세포를 배양하는 단계;
5) 상청액을 수집하고, 융합 단백질 생성물을 정제하는 단계; 를 포함한다.
상기 코딩 서열의 숙주세포로의 도입은 칼슘 포스페이트 침전법, 리포좀 형질감염법, 전기천공법(electroporation), 미세주사법(Microinjection), 바이러스 감염, 알칼리 금속이온법과 같은 당업계에 공지된 다양한 기술을 이용할 수 있다.
숙주세포의 배양 및 발현에 관련된 내용은 기존의 서류(Olander RM 등, Dev Biol Stand 1996, 86: 338)를 참조할 수 있다. 원심 분리에 의해 현탁액 중의 세포 및 잔여물을 제거하고 상청액을 수집한다.
상기와 같이 수득된 융합 단백질은 거의 균일한 성질로 정제될 수 있는데, SDS-PAGE 전기영동에서 단일 밴드 또는 특정 밴드를 나타낸다. 상청액을 먼저 농축시키되, 농축액은 겔 크로마토그래피(Gel chromatography)방법으로 정제하거나, 또는 이온 교환 크로마토그래피로 정제할 수 있다. 예를 들어, 음이온 교환 크로마토그래피 또는 양이온 교환 크로마토그래피를 이용할 수 있다. 겔 매트릭스는 아가로스(Agarose), 덱스트란(Dextran), 폴리아미드 등과 같은 단백질 정제에 통상적으로 사용되는 배지일 수 있다. Q-그룹 또는 SP-그룹은 바람직한 이온 교환기이다. 최종적으로, 정제된 생성물은 하이드록시아파타이트 흡착 크로마토그래피(Hydroxyapatite adsorption chromatography), 금속 킬레이트 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피 및 역상 고속 액체 크로마토그래피에 의해 추가로 정제될 수 있다. 상기 모든 정제 단계는 상이한 조합을 이용하여 최종적으로 단백질이 거의 균일한 순도를 가지게 할 수 있다. 발현된 융합 단백질은 또한 상기 융합 단백질의 특정 항체, 수용체 또는 리간드를 함유하는 친화성 크로마토그래피 칼럼을 이용하여 정제할 수 있다. 사용된 친화성 칼럼의 성질에 따라, 친화성 컬럼에 결합된 융합 폴리펩티드는 고염 완충액 방법, pH를 변화시키는 등과 같은 통상적인 방법을 통해 용출될 수 있다.
약학 조성물
또한 본 발명은, 유효량 (바람직하게는 약 2~10㎍/㎏)의 본 발명의 융합 단백질 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 일반적으로, 유효량의 본 발명의 융합 단백질은 비독성, 불활성 및 약학적으로 허용 가능한 수성 담체(aqueous vehicle) 매질에서 제조될 수 있으며, pH는 일반적으로 약 5~8이고, 바람직하게는 약 6~8이다. "유효량" 또는 "유효 투여량"이란 용어는 인간 및/또는 동물에 대해 기능 또는 활성을 발휘할 수 있으며, 인간 및/또는 동물이 수용할 수 있는 양을 의미한다. "약학적으로 허용 가능한" 성분은 인간 및/또는 포유동물에서 사용할 때 과도한 부작용(예: 독성, 자극 및 알레르기반응)이 없는 성분, 즉 합리적인 이득/위험 비율을 갖는 성분이다. 용어 "약학적으로 허용 가능한 담체"는 치료제의 투여용 담체를 의미하되, 다양한 보조제 및 희석제를 포함한다.
약학적으로 허용 가능한 담체는 식염수, 완충액, 포도당, 물, 글리세롤, 에탄올 및 이들의 조합을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 통상적으로, 약학 제제 방식은 투여 방식과 일치해야 하는데, 본 발명의 약학 조성물은 주사약 형태로 제조될 수 있으며, 예를 들어 생리 식염수 또는 포도당과 기타 보조제를 함유하는 수용액을 사용하여 통상적인 방법에 따라 제조된다. 상기 약학 조성물은 바람직하게는 무균 조건하에서 제조된다. 활성 성분의 투여량은 치료 유효량이다. 본 발명의 약물 제제는 또한 서방성 제제(Sustained release preparation)로 제조될 수도 있다.
본 발명의 융합 단백질의 유효량은 투여 방식 및 치료될 질환의 중증도 등에 따라 달라질 수 있다. 바람직한 유효량의 선택은 다양한 요소(예를 들어, 임상 시험)에 기초하여 당업자에 의해 결정될 수 있다. 상기 요소는 생체 이용률, 대사(metabolism), 반감기 등과 같은 상기 융합 단백질의 약물동력학 파라미터, 치료할 환자의 질환 중증도, 환자 체중, 환자의 면역 상태, 투여경로 등을 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다.
실시예 1. FVIII 융합 단백질을 코딩하는 발현 플라스미드의 구축
FVIII 선도펩티드(Leader Peptide), 성숙 단백질, 가요성 펩티드 링커, CTP 강성 유닛 및 인간 IgG vFc 변이체를 코딩하는 유전자 서열은 모두 인위적으로 최적화된 CHO 세포 선호 코돈이며, 인공 합성에 의해 수득된다. 합성된 융합 단백질의 전장 DNA 단편의 5' 말단 및 3' 말단에는 각각 하나의 제한 효소 절단 부위를 구비하고, 각각 SpeI 및 BamHI이며, 전장 DNA 단편은 pUC57 전달 벡터의 대응되는 효소 절단 부위에 삽입되고, DNA 시퀀싱(DNA sequencing)에 의해 서열 확인을 진행한다.
다음 상기 수득한 융합 단백질 전장 유전자 단편을, 중간 벡터로부터 pcDNA3.1를 주형으로 하여 변형시킨 발현 플라스미드의 대응되는 효소 절단 부위 사이로 전이하여 융합 단백질 고발현 플라스미드를 얻었다. PTY1A1 플라스미드는 다음과 같은 중요한 발현 요소를 구비할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다: 즉, 1) 인간 사이토메갈로바이러스 초기 프로모터와 포유동물 세포의 외인성 고발현에 필요한 증폭자; 2) 세균에서 카나마이신 저항성(Kanamycin resistance)을 가지고 포유 동물 세포에서 G418 저항성을 갖는 이중 선발 마커; 3) 마우스 디하이드로폴레이트 환원 효소 (Dihydrofolate reductase, DHFR) 유전자 발현 카세트(숙주세포가 DHFR 유전자 결핍형일 경우, 메토트렉세이트(methotrexate, MTX)는 융합 유전자와 DHFR 유전자를 공동 증폭할 수 있음)(미국 특허 US 4,399,216를 참조); 이다. 다음 융합 단백질 발현 플라스미드를 포유동물 숙주세포주에 형질감염시키되, 안정적이고 높은 정도의 발현을 얻기 위해 바람직한 숙주세포주는 DHFR효소 결핍형 CHO-세포 이다(미국 특허 US4,818,679를 참조). 형질감염 2일 후, 배지를 0.6 mg/mL G418를 함유하는 선별배지로 대체하고, 세포를 일정한 농도(5000-10000 생세포/웰)로 96-웰 플레이트에 분주하고, 큰 이산 세포 클론이 나타날 때까지 10-14일 배양한다. ELISA 분석법으로, 선택된 약물에 내성을 지닌 형질감염체(transfectant)를 선별한다. 96-웰 플레이트에 대해 한계희석을 진행하고, 서브 클로닝을 진행하여 높은 수준의 융합 단백질을 생성하였다.
하기 표에 나타낸 바와 같이, 본 발명은 일련의 hFVIII 융합 단백질을 구성하였는데, 이는 상이한 길이의 펩티드 링커(Linker), 상이한 구성의 CTP 강성 유닛, 및 여러 상이한 아형의 IgG Fc 변이체(vFc)를 포함하여 구성되었다. 적어도 하나의 부동한 길이의 CTP 강성 유닛을 함유할 경우, 융합 단백질의 활성은 모두 증가될 수 있음을 검증하기 위해, 융합 단백질 FP-A, FP-B, FP-C, FP-D 및 FP-E를 구축하였다. 여기서 FP-B의 아미노산 및 코딩 뉴클레오타이드는 도 1에서 나타낸 바와 같다. 융합 단백질 활성에 대한 CTP 강성 유닛의 중요성을 검증하기 위해, CTP 강성 유닛을 함유하지 않는 Fc 융합 단백질 FP-G와 FP-H을 구축하였으며, 발현 플라스미드의 구축 방법은 상술한 바와 같다. 또한, CTP가 Fc의 C말단에 위치한 FP-F를 구축하여 CTP 강성 유닛의 위치의 중요성을 검증하였다. 상세한 내용은 표1을 참조하면 된다. 각 구성요성의 아미노산 서열은 서열표를 참조하면 된다.
Figure pct00002
각종 FVIII 융합 단백질의 구성
실시예 2. 각 융합 단백질의 일과성 발현 및 활성 측청
30 ml 진탕 플라스크에서, 실시예 1에서 얻은 8 개의 발현 플라스미드를 DNAFect LT 시약 TM (ATGCell 회사)을 사용하여 3×107 CHO-K1 세포에 형질감염시키고, 형질감염된 세포를 1000ng/ml의 비타민 K1을 함유하는 무혈청 성장 배지에서 5 일 동안 성장시킨다. 다음 상청액 중의 융합 단백질의 농도를 측정하고, 그의 활성을 실시예 6 또는 실시예 7에 기재된 방법으로 측정하였다. ELISA 결과는 이러한 조건하에서 8 개의 플라스미드의 일과성 발현(transient expression) 수준이 유사함을 나타냈지만, 이들의 혈액응고 활성은 큰 차이를 보였다.
그 중 FP-A의 몰비 활성을 100%로 정의하였다. FP-G 세포 배양 상청액 중의 융합 단백질은 대부분 비활성 형태의 중합체 형태로 분비되었다. FP-F 및 FP-H 플라스미드에 의해 발현된 융합 단백질은 활성이 낮으며 각각 FP-A의 약 20.5% 및 15.2%이며, 마찬가지로 대다수는 중합체 형태로 발현된다. 또한, 융합 단백질 FP-F, FP-G 및 FP-H는 안정성이 못하여 분해되기 쉽다. 보도에 따르면, FVIII 2303-2332 영역의 지질 결합 영역(Lipid binding region)은 그 기능에 아주 중요하며, 해당 영역에서의 아주 작은 구조 변화라도 단백질의 중합을 일으켜 활성이 상실된다(Gilbert GE 등, Biochemistry, 1993, 32(37): 9577-9585). 이에 따라, FvIII 융합 단백질인 FP-F, FP-G 및 FP-H는 지질 결합 영역이 C-말단 Fc 리간드의 영향을 받아 변형되어 단백질 응집이 발생하였고, 그 활성이 크게 감소된 것으로 추측된다. 반면에 CTP를 함유한 FP-B, FP-C, FP-D 및 FP-E의 활성은 각각 FP-A의 113.4%, 96.0%, 87.4% 및 93.7%이다.
FP-B, FP-F 및 FP-H 간의 활성 차이로부터, 펩티드 링커의 연장만으로 융합 단백질의 활성을 효과적으로 향상시키지 못하고, 융합 단백질이 쉽게 중합 및 분해되는 문제점을 해결할 수 없음을 알 수 있다. CTP의 첨가는 융합 단백질 FP-B의 활성을 현저히 증가시켰다. 그 원인을 추측하면 다음과 같다: 과도한 길이의 가요성 펩티드 링커는 FVIII에 높은 가요성을 부여하여 Fc에 대해 자유롭게 회전할 수 있게 하는데 이는 FVIII의 3 차원 구조가 Fc 영역에 더 가깝게 할 수 있고; 양자 간에 CTP 강성 유닛을 추가하면 한편으로는 강성 펩티드 링커가 추가되어 서로 멀리하도록 하며, 더 중요한 것은 CTP 강성 유닛에는 여러 개의 글리코실 측쇄가 함유되는데, 가요성 펩티드 링커의 불규칙 코일 형태에 비해, 이러한 CTP 강성 유닛은 고정된 공간구조를 형성하여 융합 단백질의 부동한 기능 영역을 효과적으로 분리할 수 있으며, 이로써 두 부분이 독립적으로 폴딩하여 정확한 3차원 구조를 형성하는데 도움이 되고, 따라서 비교적 높은 활성을 유지할 수 있다. FP-B와 FP-F의 활성의 비교를 통해 이러한 추측의 정확성을 확인하였다. 즉 CTP 강성 유닛이 Fc의 C-말단에 놓인 FP-F의 활성은 CTP 강성 유닛이 Fc의 N말단에 놓인 FP-B의 활성의 20%보다 낮다. 상기 결과는 CTP 강성 유닛은 융합 단백질의 활성에 아주 중요하고, CTP 강성 유닛은 Fc의 N 말단에 위치하여 융합 단백질의 활성을 효과적으로 증가시키는 것으로 확인되었다.
실시예 3. 고발현 융합 단백질의 안정적 형질감염 세포주의 선별
상기 FP-A, FP-B, FP-C, FP-D 및 FP-E의 발현 플라스미드를 포유동물 숙주세포주에 형질감염시켜 FVIII 융합 단백질을 발현시켰다. 안정하고 고수준의 발현을 유지하기 위해, 바람직한 숙주세포는 DHFR 결핍 CHO 세포이다(미국 특허 NO. 4818679). 바람직한 형질감염방법으로는 전기천공법이며, 칼슘 포스페이트 공침법(calcium phosphate co-precipitation), 리포좀 형질감염 및 미세주사법 등을 포함하는 기타 방법을 이용할 수도 있다. 전기천공법은 300V의 전압 및 1050μFd의 정전용량으로 설정된 Gene Pulser Electroporator(Bio-Rad Laboratories 회사)를 이용하고, 큐벳(cuvette)에 넣은 2~3×107 세포에 PvuI 선형화 발현 플라스미드 50 μg을 첨가하며, 전기천공 후의 세포를 30 ml의 성장 배지를 함유하는 진탕 플라스크에 옮긴다. 형질감염 2일 후, 배지를 0.6 mg/mL G418를 함유하는 성장 배지로 교체하고 세포를 일정한 농도로 96-웰 플레이트에 분주하고, 큰 이산 세포 클론이 나타날 때까지 10-12일 배양한다. 항-인간 IgG Fc ELISA 방법으로, 선택된 약물에 내성을 가지는 형질감염체를 선별하며, 또한 항-FVIII ELISA 방법으로 융합 단백질 발현의 정량분석 측정을 할 수 있으며, 한계희석법에 의한 서브 클로닝을 통해 융합 단백질을 고수준으로 발현하는 웰을 생성할 수 있다.
더 높은 수준의 융합 단백질 발현을 달성하기 위해, MTX 약물의 억제를 받는 DHFR 유전자로 공동 증폭(Co-amplification)하는 것이 바람직하다. 점진 증가하는 농도의 MTX를 함유하는 성장 배지에서, DHFR 유전자로 형질감염된 융합 단백질 유전자를 공동 증폭된다. DHFR 발현 양성인 서브 클론을 한계희석하고, 점차적으로 가압하고, 6 μM의 MTX 배지에서 성장할 수 있는 형질감염체를 선별하고, 분비율을 측정하여 높은 수준으로 외인성 단백질을 발현하는 세포주를 선별한다. 24 시간내로 약 1 (바람직하게는 약 3) IU/106 (즉, 백만) 세포의 분비율을 갖는 세포주를 무혈청 배지를 사용하여 현탁 배양하고, 이어서 조건화 배지를 사용하여 융합 단백질을 정제한다.
하기 실시예에서, FP-B를 예로 하여, 상기 실시예에서 선별된 여러 가지 융합 단백질의 발효, 정제 단계 및 방법을 구체적으로 서술한다. 또한, FP-A, FP-C, FP-D 및 FP-E 도 동일한 방법을 이용하므로, 실시예에서 반복하여 서술하지 않는다.
실시예 4. 융합 단백질의 생산
먼저, 실시예 3에서 얻은 바람직한 고수율 세포주를 배양접시에서 무혈청 순화 배양한 후, 진탕 플라스크로 옮겨 현탁 순화 배양한다. 세포가 이러한 배양 조건에 적응된 후, 300ml의 진탕 플라스크에서 유가배양하거나 배지를 매일 교체하는 방법으로 관류배양을 시뮬레이션한다. 실시예 3의 선별에 의해 수득된 융합 단백질 FP-B를 생산하는 CHO 유래 세포주를 300ml 부피의 진탕 플라스크에서 14 일 동안 유가배양하였는데, 발현된 재조합 융합 단백질의 누적 수율은 200 mg/L에 달하였으며, 생존 세포 밀도는 최고로 15×106/mL에 달할 수 있다. 더 많은 융합 단백질을 얻기 위해 1000 ml의 진탕 플라스크에서 배양할 수도 있다. 또 다른 배양 방법으로는, 상기 CHO 유래 세포 균주를 100ml 부피의 진탕 플라스크에서 배지를 매일 교체하는 것이며, 발현된 재조합 융합 단백질의 누적 수율은 하루에 약 20mg/L이며, 진탕 플라스크에서 생존 세포 밀도는 최고로 30×106/mL에 도달할 수 있다. 상기 2가지 방법에 의해 제조된 재조합 융합 단백질에 대해 측정한 생물학적 활성은 비슷하다.
실시예 5. 융합 단백질의 정제 및 정성
본 발명은 주로 4 단계 크로마토그래피 방법을 이용하여 융합 단백질 FP-B를 정제한다. 각각 친화성 크로마토그래피, 소수성 크로마토그래피, 음이온교환 크로마토그래피 및 분자체 크로마토그래피(본 실시예에서 사용된 단백질 정제기구는 미국 GE사의 AKTA pure 25M이다. 본 실시예에서 사용된 시약은 모두 Sinopharm Chemical ReagentCo. , Ltd로부터 구입했으며, 순도는 분석급이다)를 이용한다.
첫번째 단계, 친화성 크로마토그래피: Bestchrom회사의 내알칼리성 Protein A Diamond 또는 시중 판매하는 재조합 Protein A 친화성 크로마토그래피 매질(예컨대 GE의 Mabselect, Mabselect Sure, TOSOH의 Toyopearl AF-rProteinA-650F, smart-lifesciences의 rProtein A Bead, sepax-tech의 MabPurix, Pall의 Protein A Ceramic HyperD)을 사용하여 샘플 포획, 농축 및 일부 오염물 제거를 진행한다. 먼저 평형 완충액(20 mM His-HCl, 150 mM NaCl, 5 mM CaCl2, 0.02% Tween-80, pH 6.8-7.2)을 이용하여, 50-100cm/h의 선형 유속으로 크로마토그래피 칼럼의 칼럼 부피(CV) 3-5개만큼 평형화한다. 청정화(clarified)된 발효액은 50-100 cm/h의 선형 유속으로 샘플 로딩하며, 로딩량은 50000 IU/ml 이하이다. 샘플 로딩 완료 후, 평형 완충액(20mM His-HCl, 150mM NaCl, 5mM CaCl2, 0.02% Tween 80, pH 6.8-7.2)을 이용하여, 50-100cm/h의 선형 유속으로 크로마토그래피 칼럼의 칼럼 부피(CV) 3-5개만큼 평형화하며 미결합된 성분을 세척해낸다. 오염제거 완충액1(20mM His-HCl, 2M NaCl, 4M urea, 5mM CaCl2, 0.02% Tween 80, pH 6.8-7.2)을 이용하여, 50-100cm/h의 선형 유속으로 크로마토그래피 칼럼의 칼럼 부피 3-5개만큼 세척하여 일부 오염물질을 제거한다. 평형 완충액(20mM His-HCl, 150mM NaCl, 5mM CaCl2,0.02% Tween 80, pH 6.8-7.2)을 이용하여, 50-100cm/h의 선형 유속으로 크로마토그래피 칼럼의 칼럼 부피(CV) 3-5개만큼 평형화한 후, 오염제거 완충액 2(20 mM His-HCl, 5 mM EDTA, 150 mM NaCl, 30% 에틸렌 글리콜, 5 mM CaCl2, 0.02% Tween 80, pH 6.8-7.2)을 이용하여 50-100cm/h의 선형 유속으로 크로마토그래피 칼럼의 칼럼 부피(CV) 3-5개만큼 세척하여 일부 오염물질을 제거한다. 평형 완충액(20 mM His-HCl, 150 mM NaCl, 5 mM CaCl2, 0.02% Tween 80, pH 6.8-7.2)를 이용하여 선형 유속 50-100 cm/h에서 크로마토그래피 칼럼의 컬럼 부피(CV) 3-5개만큼 평형화한 후, 용출 완충액(elution buffer)(20 mM His-HCl, 5 mM CaCl2, 0.02% Tween 80, 50% 에틸렌 글리콜, pH 5.0)를 이용하여 50cm/h보다 낮은 선형 유속으로 목표 생성물을 용출하여 목표 피크를 수집하며, 2M Tris, pH 9.0인 시약으로 pH값이 중성(7.0-8.0)으로 되도록 중화시킨다.
제 2 단계, 소수성 크로마토그래피: Bestchrom회사의 Butyl HP 또는 시중 판매되고 있는 기타 소수성 크로마토그래피 매질(예컨대 GE의 Butyl HP, TOSOH의 Toyopearl Butyl-650, smart-lifesciences의 Butyl Beads 4FF, sepax-tech의 Generik MC30-HIC Butyl, Merck의 Fractogel EMD Propyl)을 이용하여 중간정제를 진행하여 중합체 함량을 감소한다. 제 1 단계의 친화성 용출액 중에는 여전히 일정 비례의 중합체가 함유되는데, 중합체의 형성은 원인이 다양하므로(구조가 변화하지 않은 중합과 구조가 변화하는 중합을 포함), 이들의 생물학적 활성은 차이가 비교적 크고, 따라서 생물확적 활성의 분석에 큰 간섭을 가져다 준다. 따라서, 포획 완료 후, 먼저 중합체를 제거한다. 목표 단백질이 중합된 후, 중합체와 단량체 사이에는 전하 특성 및 소수성을 포함하는 특성상의 차이가 있는데, 여기서는 소수성의 차이를 이용하여 양자를 분리한다. 정제의 마지막 단계가 분자체 크로마토그래피이기때문에, Butyl HP를 사용하여 제 1 단계에서 친화성 크로마토그래피에 의해 포획된 융합 단백질에 대해 제 2 단계의 정제를 진행하는데, 그 목적은 중합체 함량이 10%이하로 되도록 중합체를 일부 제거하기 위한 것이다. 먼저, 평형 완충액(20mM His-HCl, 1.5M NaCl, 5mM CaCl2, 0.02% Tween 80, pH6.8-7.2)을 이용하여 50-100cm/h의 선형 유속으로 크로마토그래피 칼럼의 칼럼 부피(CV) 3-5개만큼 평형화하고; 평형 완충액을 사용하여 친화방식으로 포획한 샘플을 2배 희석하여 유기 용매 함량을 낮춘 다음, 농축 완충액(20mM His-HCl, 3M NaCl, 5mM CaCl2, 0.02% Tween 80, pH 6.8-7.2)을 같은 부피로 첨가한 후 샘플 로딩하되, 로딩량은 <20000IU/ml으로 제어한다. 샘플 로딩 완료 후, 평형 완충액(20mM His-HCl, 1.5M NaCl, 5mM CaCl2, 0.02% Tween 80, pH6.8-7.2)을 이용하여 50-100cm/h의 선형 유속으로 크로마토그래피 칼럼의 칼럼 부피(CV) 3-5개만큼 세척한다. 다음 세척 완충액(wash buffer)(20 mM His-HCl, 1.5 M NaCl, 5 mM CaCl2, 0.02% Tween 80, 20% 에틸렌 글리콜, pH 6.8-7.2)을 이용하여, 50-100cm/h의 선형 유속으로 크로마토그래피 칼럼의 칼럼 부피(CV) 3-5개만큼 세척하여 일부 중합체를 제거한다. 마지막으로 목표 단백질을 용출하되, 용출 완충액(20 mM His-HCl, 5 mM CaCl2, 0.02% Tween 80, 50% 에틸렌 글리콜, pH 6.8-7.2)을 이용하여 60cm/h보다 낮은 선형 유속으로 용출하여 용출 성분을 분할 수집하며 각각 SEC-HPLC 검사를 진행하였다. 모노머 백분율이 90%이상인 목표 조성물을 합병하여 다음 단계의 크로마토그래피를 진행한다.
제 3 단계, 음이온교환 크로마토그래피: Bestchrom회사의 Q-HP 또는 시중 판매하는 음이온교환 크로마토그래피 매질(예컨대 GE의 Q HP, TOSOH의Toyopearl GigaCap Q-650, smart-lifesciences의 DEAE Beads 6FF, sepax-tech의 Generik MC-Q, Merck의 Fractogel EMD TMAE, Pall의 Q Ceramic HyperD F)을 이용하여 중간정제를 진행하여 구조 변이체를 분리하고, 더 나아가 HCP, DNA 등 오염물질을 제거한다. 먼저, 평형 완충액(20mM His-HCl, 200mM NaCl, 5mM CaCl2, 0.02% Tween 80, pH6.8-7.2)을 이용하여 50-100cm/h의 선형 유속으로 크로마토그래피 칼럼의 칼럼 부피(CV) 3-5개만큼 세척한다. 제 2 단계에서 소수성 크로마토그래피를 거쳐 분리된 목표 단백질을 2배 희석하여 유기물 농도를 낮춘 후, 샘플 로딩하되 로딩량은 5000-10000IU/ml로 제어한다. 샘플 로딩 완료 후, 평형 완충액(20mM His-HCl, 200mM NaCl, 5mM CaCl2, 0.02% Tween 80, pH 6.8-7.2)을 이용하여, 50-100cm/h의 선형 유속으로 크로마토그래피 칼럼의 칼럼 부피(CV) 3-5개만큼 세척해낸다. 다음 선형 기울기(Linear Gradient)의 염농도로 용출하되, 용출 완충액은(20mM His-HCl, 1M NaCl, 5mM CaCl2, 0.02% Tween 80, pH 6.8-7.2)이며, 조건은 용출 완충액 0-100%가 2 시간 동안 지속하되 선형 유속을 50cm/h 이하로 제어하고, 용출된 성분을 분할 수집하여, 샘플의 단백질 함량, SEC-HPLC, 활성 및 HCP 함량 검측을 진행하였다. 단백질 농도 및 단백질 활성 측정결과에 따라 계산한 단백질의 비활성(specific activity)은 약 10000 IU/mg이였다.
제 4 단계, 분자체 크로마토그래피: Bestchrom회사의 Chromdex 200 prep grade 또는 시중 판매하는 기타 분자체 매질(예컨대 GE의 superdex 200)을 이용하여 분리하는데, 그 목적은 중합체의 함량을 <5%로 하고 관건적인 오염물질의 함량을 더 낮추기 위한 것이다. 평형 완충액(20 mM His-HCl, 200 mM NaCl, 5 mM CaCl2, 0.02 % Tween 80, pH 6.8-7.2)을 이용하여, 20-40cm/h의 선형 유속으로 크로마토그래피 칼럼의 칼럼 부피(CV) 2개 만큼으로 세척한다. 샘플 로딩량은 칼럼 부피의 3%이하며 20cm/h의 선형 유속으로 세척하며 세척 성분을 차례로 수집하여 SEC 검측 및 합병한다.
샘플의 SEC-HPLC 순도 결과 및 SDS-PAGE 전기영동의 결과는 도 2 및 도 3에 나타냈다. SEC-HPLC 결과에 따르면 정제 후의 융합 단백질 FP-B의 메인 피크 순도는 97% 이상에 달하였고, SDS-PAGE 전기영동 밴드는 예상한 것과 일치하였다. 비환원 전기영동은 미가공 융합 단백질(390KDa), 전기영동시 FVIII의 하나의 중쇄가 탈리된 단편 HC-LC-L-CTP-Fc:LC-L-CTP-Fc(300KDa), 2개의 중쇄가 탈리된 (LC-L-CTP-Fc)2 이량체단편(210KDa)과 HC(90 KDa)를 포함하며; 환원 후에는 선명한 HC-LC-L-CTP-Fc (190 kDa), LC-L-CTP-Fc (105 KDa) 및 HC (90 KDa) 단일쇄 밴드를 얻을 수 있다.
실시예 6. 발색 기질법에 의한 융합 단백질의 생체외 활성의 간접적인 측정
FVIII 융합 단백질의 활성은 발색 기질 방법을 이용하여 측정될 수 있다. 본 실시예는 Chromogenix Coatest SP FVIII 키트(Chromogenix，Ref. K824086)를 사용하여 측정하며 그 검측 원리는 다음과 같다: 트롬빈에 의해 활성화될 경우, FVIIIa는 인지질과 칼슘이온의 존재하에 FIXa에 결합하여 효소 복합체를 형성하고, 인자 X를 활성 형태 Xa로 활성화시킨다. 활성화되어 형성된 인자 Xa는 특정 발색 기질 (S-2765)을 절단(cleaving)하여 발색단(chromophore) pNA를 방출할 수 있다. 405nm에서 생성된 pNA의 양을 측정함으로써, 그 양에 직접 비례하는 FXa의 활성을 알 수 있다. 여기서, 시스템 중 인자 IXa 및 인자 X의 함량은 일정하고 과량이며, FXa의 활성은 FVIIIa의 함량에만 직접 관련된다. 이 방법에 의해 측정된 FVIII 융합 단백질의 비활성은 약 6000-10000 IU/mg이다.
실시예 7. 혈액응고법에 의한 융합 단백질의 생물학적 활성의 직접적인 측정
응고법을 통해 측정되는 FVIII의 생물학적 활성은 FVIII 인자 결핍 혈장에 의한 응고시간의 연장을 수정하는 능력을 통해 얻는다. 독일 Siemens사의 Coagulation Factor VIII Deficient Plasma (Cat. No. OTXW17) 키트를 이용하여 FVIII 활성을 검측하는 방법은 다음과 같다: 역가(Potency)가 알려진 중국식품의약품검측연구소(National Institutes for Food and Drug Control)의 FVIII활성 표준품을 5% FVIII 결핍 혈장으로 10 IU/ml까지 희석한 후, 이어 각각 10배, 20배, 40배 및 80배 희석하였다. 활성화 부분 트롬보플라스틴시간(activated partial thromboplastin time, APTT)을 전자동 혈액응고 분석기(CA500, SYSMEX)로 측정하였다. FVIII 활성 표준품 용액 역가(IU/ml)의 대수(logarithm)를 상응한 응고시간(s)의 대수에 대응하여 선형회귀분석을 하여, FVIII 표준품을 사용하여 표준 곡선을 작성하였다. 다음, 테스트할 샘플을 적당히 희석하고 FVIII 결핍 기질 혈장과 혼합하여 APTT 분석을 진행하였다. 표준 곡선 방정식에 대입하면 테스트할 샘플 FVIII의 역가를 얻을 수 있으며, 이에 기반하여 테스트할 샘플 FVIII의 비활성 크기(단위는 IU/mg)를 계산해낼 수 있다. 본 방법으로 측정한 FVIII 융합 단백질의 비활성은 약 6000-10000 IU/mg이다.
실시예 8. 혈우병 A 마우스의 급성 출혈에 대한 융합 단백질의 지혈 효과
VIII 인자 유전자 녹아웃(knockout) 동형접합자 HemA 마우스의 꼬리 절단 출혈 모델(tail clip bleeding model)로 실시예 5에서 제조한 융합 단백질 FP-B의 HemA 마우스 체내에서의 지혈 활성을 평가하였다. 생후 8-12주령의 수컷 HemA 마우스 (Shanghai Model Organisms로부터 구입)를 선택하여 1주일 동안 적응적 피딩(adjustable feeding)을 진행한 후 마우스들을 체중에 따라 랜덤으로 6 그룹으로 나누었다. 또한 HemA 마우스 음성 대조군 한 그룹과 정상 C57 마우스 대조군 한 그룹을 따로 설정하고, 부동한 유효선량의 융합 단백질 FP-B 또는 대조약물인 Xyntha(주사용 재조합 인간 응고인자 VIII, Pfizer)을 각각 미정맥(caudal vein)주사를 통해 단회 투약한다. 동물 그룹 상황은 표 2를 참조하면 된다.
Figure pct00003
HemA마우스에 대한 융합 단백질의 지혈 효과 실험의 동물그룹 상황
약물 투여하기 전에, 마우스를 먼저 1.0 % 펜토바르비탈 나트륨(Pentobarbital sodium)(Sigma 회사)으로 0.1ml/10g의 용량으로 복강내 주사하여 마취시킨 다음, 마우스의 체온을 유지하기 위해 37℃의 가열 패드에 놓았다. 마우스의 꼬리를 37℃의 온수에 10분간 담가 꼬리 정맥을 팽창시키고, 표 2에 나타낸 투여량으로 투여하였다. 10분간 투여한 후, 마우스의 꼬리 말단으로부터 1.5cm의 거리에서 절단하고, 약 13ml의 예열된 생리 식염수를 함유하는 원심분리관에 꼬리 말단을 신속하게 담그고 타이밍을 시작하였다. 출혈이 30 분이내에 멈추면 출혈 시간과 출혈량을 기록한다. 출혈 시간이 30분을 초과하면 30분으로 기록한다. 출혈량(ml)= (채혈 후 원심분리관의 중량(g) - 채혈 전 원심분리관의 중량(g))/1.05이다. 30분 후 마우스의 꼬리 말단을 식염수 관에서 꺼냈다. 24 시간내로 매 10 분마다 재출혈 상황을 기록하고, 생존한 마우스의 수를 기록하였다. 모든 데이터는 평균수±표준오차( ±SEM)로 나타냈다. 실험 그룹 간의 비교는 t-test 검정분석을 이용하였으며, 분석 소프트웨어로는 Graphpad Prism 5.0을 사용하였고, p<0.05를 통계적 유의성을 가진다고 간주한다.
도 4 및 도 5 중 각 그룹 동물의 출혈 시간 및 출혈량의 통계 분석 결과, HemA 마우스에게 FP-B 270IU/kg을 투여해서 부터 10분 후, 출혈 시간 및 출혈량은 C57 대조군과 거의 유사하였는바, 혈액응고 촉진효과가 선명하였다. 이는 FP-B가 혈우병과 같은 혈액응고 인자 결핍증으로 인한 급성 출혈 상황에서 효과적인 응고제로 사용될 수 있음을 나타낸다. 마우스에 FP-B 90IU/kg을 투여 후, 출혈 시간 및 출혈량은 마찬가지로 C57 대조군과 유사하였다. 같은 유효선량의 FP-B와 Xyntha를 각각 투여한 후 HemA 마우스의 출혈량은 현저한 차이가 없었지만, 각 투여량에서 FP-B 그룹의 출혈 시간은 Xyntha 그룹의 출혈 시간보다 모두 약간 적었다. 이는 FP-B가 Xyntha보다 일정한 약효학적 우세를 가질 수 있음을 나타낸다. FP-B 30IU/kg 투여군과 비교할 때, FP-B 90IU/kg 그룹의 출혈 시간은 현저히 짧았고(p<0.05), FP-B 270IU/kg 그룹의 출혈 시간도 현저히 짧았으며(p<0.05) 출혈량도 현저히 감소하였다(p<0.05). 이는 융합 단백질 FP-B가 HemA 마우스의 급성 출혈에 대한 지혈 효과가 일정한 투여량-효과 관계를 가진다는 것을 나타낸다(상세한 결과는 표 3 참조).
수술 후 회복하는 정황으로 보면, 동일한 유효선량을 투여한 FP-B와 Xyntha에 있어서, FP-B 각 투여량 그룹의 마우스 생존율은 동일한 유효선량의 Xyntha 그룹보다 모두 우수하다. 이는 융합 단백질 FP-B가 Xyntha보다 더욱 지속적인 약효과가 있음을 반영한다(표 3을 참조).
Figure pct00004
각 그룹 HemA마우스 꼬리절단시험의 출혈 시간, 출혈량, 재출혈 횟수 및 생존율 통계
참고: a, 24-48h내에도 마우스의 사망이 존재하므로, 48h 사망률을 통계함;
b, 출혈 시간이 30min을 초과하면 1800초로 기록함.
본 출원에 언급된 모든 문헌은 각각 참고 문헌으로 인용되는 것처럼 모두 본 출원에 참고로 인용된다. 또한, 당업자는 본 발명의 기재로부터 본 발명에 대해 다양한 변형 및 변경을 수행할 수 있으며, 이러한 등가 형태는 마찬가지로 본 출원의 청구범위에 속함을 이해해야 한다.
<110> Ampsource Biopharma Inc. Furen Medicines Group Co., LTD PharMab, lnc. Kaifeng Pharmaceutical (Group) Co., LTD. <120> HYPERGLYCOSYLATED HUMAN COAGULATION FACTOR VIII FUSION PROTEIN, PREPARATION METHOD AND APPLICATION THEREOF <130> 2016 <160> 17 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 1438 <212> PRT <213> FVIII Mature protein amino acid sequence <400> 1 Ala Thr Arg Arg Tyr Tyr Leu Gly Ala Val Glu Leu Ser Trp Asp Tyr 1 5 10 15 Met Gln Ser Asp Leu Gly Glu Leu Pro Val Asp Ala Arg Phe Pro Pro 20 25 30 Arg Val Pro Lys Ser Phe Pro Phe Asn Thr Ser Val Val Tyr Lys Lys 35 40 45 Thr Leu Phe Val Glu Phe Thr Asp His Leu Phe Asn Ile Ala Lys Pro 50 55 60 Arg Pro Pro Trp Met Gly Leu Leu Gly Pro Thr Ile Gln Ala Glu Val 65 70 75 80 Tyr Asp Thr Val Val Ile Thr Leu Lys Asn Met Ala Ser His Pro Val 85 90 95 Ser Leu His Ala Val Gly Val Ser Tyr Trp Lys Ala Ser Glu Gly Ala 100 105 110 Glu Tyr Asp Asp Gln Thr Ser Gln Arg Glu Lys Glu Asp Asp Lys Val 115 120 125 Phe Pro Gly Gly Ser His Thr Tyr Val Trp Gln Val Leu Lys Glu Asn 130 135 140 Gly Pro Met Ala Ser Asp Pro Leu Cys Leu Thr Tyr Ser Tyr Leu Ser 145 150 155 160 His Val Asp Leu Val Lys Asp Leu Asn Ser Gly Leu Ile Gly Ala Leu 165 170 175 Leu Val Cys Arg Glu Gly Ser Leu Ala Lys Glu Lys Thr Gln Thr Leu 180 185 190 His Lys Phe Ile Leu Leu Phe Ala Val Phe Asp Glu Gly Lys Ser Trp 195 200 205 His Ser Glu Thr Lys Asn Ser Leu Met Gln Asp Arg Asp Ala Ala Ser 210 215 220 Ala Arg Ala Trp Pro Lys Met His Thr Val Asn Gly Tyr Val Asn Arg 225 230 235 240 Ser Leu Pro Gly Leu Ile Gly Cys His Arg Lys Ser Val Tyr Trp His 245 250 255 Val Ile Gly Met Gly Thr Thr Pro Glu Val His Ser Ile Phe Leu Glu 260 265 270 Gly His Thr Phe Leu Val Arg Asn His Arg Gln Ala Ser Leu Glu Ile 275 280 285 Ser Pro Ile Thr Phe Leu Thr Ala Gln Thr Leu Leu Met Asp Leu Gly 290 295 300 Gln Phe Leu Leu Phe Cys His Ile Ser Ser His Gln His Asp Gly Met 305 310 315 320 Glu Ala Tyr Val Lys Val Asp Ser Cys Pro Glu Glu Pro Gln Leu Arg 325 330 335 Met Lys Asn Asn Glu Glu Ala Glu Asp Tyr Asp Asp Asp Leu Thr Asp 340 345 350 Ser Glu Met Asp Val Val Arg Phe Asp Asp Asp Asn Ser Pro Ser Phe 355 360 365 Ile Gln Ile Arg Ser Val Ala Lys Lys His Pro Lys Thr Trp Val His 370 375 380 Tyr Ile Ala Ala Glu Glu Glu Asp Trp Asp Tyr Ala Pro Leu Val Leu 385 390 395 400 Ala Pro Asp Asp Arg Ser Tyr Lys Ser Gln Tyr Leu Asn Asn Gly Pro 405 410 415 Gln Arg Ile Gly Arg Lys Tyr Lys Lys Val Arg Phe Met Ala Tyr Thr 420 425 430 Asp Glu Thr Phe Lys Thr Arg Glu Ala Ile Gln His Glu Ser Gly Ile 435 440 445 Leu Gly Pro Leu Leu Tyr Gly Glu Val Gly Asp Thr Leu Leu Ile Ile 450 455 460 Phe Lys Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Asn Ile Tyr Pro His Gly Ile 465 470 475 480 Thr Asp Val Arg Pro Leu Tyr Ser Arg Arg Leu Pro Lys Gly Val Lys 485 490 495 His Leu Lys Asp Phe Pro Ile Leu Pro Gly Glu Ile Phe Lys Tyr Lys 500 505 510 Trp Thr Val Thr Val Glu Asp Gly Pro Thr Lys Ser Asp Pro Arg Cys 515 520 525 Leu Thr Arg Tyr Tyr Ser Ser Phe Val Asn Met Glu Arg Asp Leu Ala 530 535 540 Ser Gly Leu Ile Gly Pro Leu Leu Ile Cys Tyr Lys Glu Ser Val Asp 545 550 555 560 Gln Arg Gly Asn Gln Ile Met Ser Asp Lys Arg Asn Val Ile Leu Phe 565 570 575 Ser Val Phe Asp Glu Asn Arg Ser Trp Tyr Leu Thr Glu Asn Ile Gln 580 585 590 Arg Phe Leu Pro Asn Pro Ala Gly Val Gln Leu Glu Asp Pro Glu Phe 595 600 605 Gln Ala Ser Asn Ile Met His Ser Ile Asn Gly Tyr Val Phe Asp Ser 610 615 620 Leu Gln Leu Ser Val Cys Leu His Glu Val Ala Tyr Trp Tyr Ile Leu 625 630 635 640 Ser Ile Gly Ala Gln Thr Asp Phe Leu Ser Val Phe Phe Ser Gly Tyr 645 650 655 Thr Phe Lys His Lys Met Val Tyr Glu Asp Thr Leu Thr Leu Phe Pro 660 665 670 Phe Ser Gly Glu Thr Val Phe Met Ser Met Glu Asn Pro Gly Leu Trp 675 680 685 Ile Leu Gly Cys His Asn Ser Asp Phe Arg Asn Arg Gly Met Thr Ala 690 695 700 Leu Leu Lys Val Ser Ser Cys Asp Lys Asn Thr Gly Asp Tyr Tyr Glu 705 710 715 720 Asp Ser Tyr Glu Asp Ile Ser Ala Tyr Leu Leu Ser Lys Asn Asn Ala 725 730 735 Ile Glu Pro Arg Ser Phe Ser Gln Asn Pro Pro Val Leu Lys Arg His 740 745 750 Gln Arg Glu Ile Thr Arg Thr Thr Leu Gln Ser Asp Gln Glu Glu Ile 755 760 765 Asp Tyr Asp Asp Thr Ile Ser Val Glu Met Lys Lys 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1535 His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu 1540 1545 1550 Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr 1555 1560 1565 Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn 1570 1575 1580 Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Ser 1585 1590 1595 1600 Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln 1605 1610 1615 Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val 1620 1625 1630 Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val 1635 1640 1645 Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro 1650 1655 1660 Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr 1665 1670 1675 1680 Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val 1685 1690 1695 Leu His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu 1700 1705 1710 Ser Pro Gly Lys 1715 <210> 17 <211> 5208 <212> DNA <213> FP-B Nucleotide sequence <400> 17 atgcagatcg aactgtcaac ttgtttcttc ctgtgcctgc tgagattttg cttttccgcc 60 actcgtcgtt actacctagg agccgtggaa ctgagctggg attacatgca gtctgacctg 120 ggagagctgc cagtggacgc tagatttccc cctcgcgtgc ctaagagttt ccccttcaac 180 acctcagtgg tctataagaa aacactgttc gtggagttta ctgatcacct gttcaacatc 240 gccaagccaa gaccaccctg gatgggactg ctgggaccta caatccaggc tgaggtgtac 300 gacactgtgg tcattaccct gaaaaacatg gcaagtcacc cagtgtcact gcatgccgtc 360 ggggtgtcat actggaaggc ttccgaaggt gcagagtatg acgatcagac ctctcagcgc 420 gaaaaagagg acgataaggt gtttcccggc ggaagccata catacgtctg gcaggtgctg 480 aaggagaatg gccccatggc cagcgaccct ctgtgcctga cctactcata tctgtcccac 540 gtggacctgg tgaaggatct gaacagcggg ctgatcggtg cactgctggt gtgtagagaa 600 ggctctctgg ccaaggagaa aactcagacc ctgcataagt tcattctgct gttcgccgtg 660 tttgacgaag gaaaaagctg gcactctgag actaagaact ccctgatgca ggacagggat 720 gcagcaagcg cacgagcttg gcccaaaatg cataccgtca acggctacgt gaatcgaagt 780 ctgcctggcc tgatcggatg ccaccgtaag tccgtctatt ggcatgtgat cgggatgggc 840 accacacccg aagtccacag cattttcctg gagggtcata cctttctggt gagaaaccac 900 cgccaggcat ccctggagat cagccctatt actttcctga ccgcccagac actgctgatg 960 gatctgggcc agttcctgct gttttgccac atctccagcc accagcatga tggaatggag 1020 gcatacgtca aagtggactc ttgtcctgag gaaccacaac tgaggatgaa gaacaatgag 1080 gaagccgaag actatgacga tgacctgaca gactccgaga tggatgtggt ccgcttcgat 1140 gacgataact cccctagctt tatccagatt cgaagcgtcg ccaagaaaca cccaaagact 1200 tgggtgcatt acatcgcagc cgaggaagag gactgggatt atgctccact ggtgctggca 1260 cccgatgatc ggagttacaa atcacagtat ctgaacaatg ggcctcagcg aattggtcgt 1320 aagtacaaga aagtgcgatt catggcctat actgatgaaa cctttaagac acgtgaagct 1380 atccagcacg agtctgggat tctgggtcca ctgctgtacg gcgaagtggg agacacactg 1440 ctgatcattt ttaagaacca ggcaagcaga ccttacaata tctatccaca tggaattact 1500 gatgtccggc ctctgtactc taggcggctg ccaaaggggg tgaaacacct gaaggacttc 1560 cccatcctgc ctggtgaaat ttttaagtac aagtggacag tcactgtgga ggatgggcca 1620 acaaagtctg accctcgatg cctgactcgt tactattcta gtttcgtgaa tatggaaaga 1680 gacctggcct ccgggctgat cggtcctctg ctgatttgtt acaaagagtc tgtggatcag 1740 aggggcaacc agatcatgag tgacaagcgg aatgtcattc tgttcagcgt gtttgacgaa 1800 aacaggtctt ggtatctgac cgagaacatc cagcggttcc tgccaaatcc cgcaggcgtg 1860 cagcttgaag atccagagtt tcaggccagc aacatcatgc attctattaa tggatacgtg 1920 ttcgactctc tgcagttgag tgtctgtctg cacgaggtgg cctactggta tatcctgtct 1980 attggcgctc agactgattt cctgtcagtg ttcttttccg gatacacctt taagcataaa 2040 atggtgtatg aggacaccct gacactgttc ccctttagtg gcgaaaccgt gtttatgtca 2100 atggagaatc ctggcctgtg gattctggga tgccacaact ccgatttcag aaatcgcggg 2160 atgaccgctc tgctgaaagt gtcatcctgt gacaagaaca ctggtgacta ctatgaagat 2220 agttacgagg acatctcagc ttatctgctg tccaaaaaca atgcaattga accacgatct 2280 tttagtcaga atcctccagt gctgaagagg caccagcggg agatcacaag gactaccctg 2340 cagagtgatc aggaagagat cgactacgac gatactattt ccgtggaaat gaagaaagag 2400 gacttcgaca tctatgacga agatgagaac cagtccccca ggagcttcca gaagaaaacc 2460 cgtcattact ttattgctgc agtggagcgc ctgtgggatt atggcatgag ctctagtcca 2520 cacgtcctgc gaaatcgtgc ccagtcaggc tccgtgcccc agttcaagaa agtggtcttc 2580 caggagttta cagacggctc ctttactcag ccactgtaca gaggagaact gaacgagcat 2640 ctgggcctgc tgggacccta tatccgcgcc gaagtcgagg ataacattat ggtgaccttc 2700 agaaatcagg ccagccgccc ctactctttt tattcatccc tgatcagcta cgaagaggac 2760 cagagacagg gcgctgaacc ccgcaaaaac ttcgtgaagc ctaatgagac taaaacctac 2820 ttttggaagg tgcagcacca catggcacct acaaaagacg agttcgattg caaggcatgg 2880 gcctattttt cagacgtcga tctggagaag gacgtgcatt ctgggctgat cggtcccctg 2940 ctggtgtgtc atacaaacac tctgaatcct gctcacggca ggcaggtcac cgtgcaggaa 3000 tttgcactgt tctttaccat ctttgatgag acaaagtctt ggtactttac agaaaacatg 3060 gagagaaatt gccgcgctcc ttgtaatatt cagatggaag acccaacttt caaggagaac 3120 tatcggtttc atgcaatcaa tggctatatt atggataccc tgcctggact ggtcatggcc 3180 caggaccaga ggattcggtg gtatctgctg tctatgggga gtaacgagaa tatccacagt 3240 attcatttct caggtcacgt ctttaccgtg aggaagaaag aagagtataa aatggccctg 3300 tacaacctgt atccaggcgt cttcgaaaca gtggagatgc tgccctccaa ggctggaatc 3360 tggcgggtgg aatgcctgat tggggagcac ctgcatgcag gcatgtccac actgtttctg 3420 gtgtacagca ataagtgtca gactccactg gggatggcca gcggtcatat ccgggatttc 3480 cagattaccg cttctggcca gtacggacag tgggctccca agctggctag actgcactat 3540 agcggctcta tcaacgcctg gtccactaaa gagcccttct cctggattaa ggtggacctg 3600 ctggctccca tgatcattca tgggatcaaa acccagggtg cacgccagaa gttcagctct 3660 ctgtacatct ctcagtttat catcatgtac agtctggatg gaaagaaatg gcagacctac 3720 cgaggcaatt ccaccggaac actgatggtc ttctttggca acgtggacag ttcaggaatc 3780 aagcacaaca ttttcaatcc ccctatcatt gctcgataca tccgtctgca ccctacccat 3840 tattcaatta ggtccacact gcggatggaa ctgatggggt gcgatctgaa cagttgttca 3900 atgccactgg gtatggagtc caaggcaatc agcgacgccc agattaccgc ttccagctac 3960 ttcactaata tgtttgccac ctggtccccc agcaaagcta ggctgcatct gcagggccga 4020 agcaacgcct ggcgtccaca ggtcaacaat cccaaggagt ggctgcaggt ggattttcag 4080 aaaacaatga aggtcactgg cgtgacaact cagggagtca aatctctgct gacaagtatg 4140 tacgtgaagg agttcctgat ctctagttca caggacggac accagtggac tctgttcttt 4200 cagaacggga aggtcaaagt gttccagggt aatcaggatt ccttcacccc tgtggtcaac 4260 tctctagacc cacccctgct gaccaggtat ctgcgaatcc acccacagag ctgggtccat 4320 cagattgctc tgagaatgga agtgctgggg tgcgaggcac aggatctgta tggatccggt 4380 ggcggtggct ccggtggagg cggaagcggc ggtggaggat caggcggtgg aggtagcggc 4440 ggaggcggta gctccagctc tagtaaagct ccccctcctt ccctgccctc accctcaaga 4500 ctgcctggac cttccgacac tcccatcctg ccacaggtgg agtgccctcc atgtccagca 4560 ccccctgtcg caggtccatc tgtgttcctg tttccaccca agcctaaaga ccagctgatg 4620 atctcccgca ccccagaagt cacctgtgtg gtcgtggatg tgagccatga agaccccgag 4680 gtccagttca attggtacgt ggatggcgtc gaggtgcaca acgctaagac aaaacctaga 4740 gaagagcagt tcaactctac ctttcgcgtc gtgagtgtgc tgacagtcgt gcaccaggac 4800 tggctgaatg gcaaggagta taagtgcaaa gtgagcaaca aaggactgcc tgcctcaatc 4860 gaaaagacta tttccaagac caaaggacag ccaagagagc cccaggtgta caccctgcct 4920 ccaagccgcg aagagatgac taaaaatcag gtctctctga cctgtctggt gaaggggttt 4980 tatcctagtg atatcgccgt ggaatgggag tcaaacggtc agccagagaa caattacaag 5040 accacacccc ctatgctgga cagcgatggg tctttctttc tgtatagcaa actgacagtg 5100 gacaagtctc ggtggcagca gggtaacgtc ttctcttgca gtgtgctgca cgaagcactg 5160 cacaatcatt acacccagaa gtcactgtca ctgagcccag gaaaatga 5208

Claims (26)

  1. 인간 혈액응고인자 VIII의 융합 단백질에 있어서,
    상기 융합 단백질은 N-말단에서 C-말단까지 인간 혈액응고인자 VIII, 가요성 펩티드 링커, 적어도 하나의 인간 융모성 생식선 자극호르몬 β 서브 유닛 카르복시말단 펩티드 강성 유닛, 및 반감기 연장 부분을 포함하며,
    여기서, 반감기 연장 부분은 인간 면역 글로불린 Fc 단편, 알부민, 트랜스페린 또는 PEG에서 선택되는 것을 특징으로 하는 인간 혈액응고인자 VIII의 융합 단백질.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 융합 단백질은 글리코실화된 것을 특징으로 하는 인간 혈액응고인자 VIII의 융합 단백질.
  3. 제 2 항에 있어서,
    상기 융합 단백질은 포유동물 세포에서 발현되어 글리코실화된 것을 특징으로 하는 인간 혈액응고인자 VIII의 융합 단백질.
  4. 제 3 항에 있어서,
    상기 융합 단백질은 중국 햄스터 난소 세포에서 발현되어 글리코실화된 것을 특징으로 하는 인간 혈액응고인자 VIII의 융합 단백질.
  5. 제 1 항에 있어서,
    상기 인간 혈액응고인자 VIII는 서열번호 1에서 기재된 아미노산 서열을 가지거나, 또는 상기 인간 혈액응고인자 VIII의 아미노산 서열은 서열번호 1에서 기재된 아미노산 서열과 적어도 90% 상동한 것을 특징으로 하는 인간 혈액응고인자 VIII의 융합 단백질.
  6. 제 1 항에 있어서,
    상기 가요성 펩티드 링커는 G, S, A 및 T 잔기로 이루어진 군으로부터 선택된 2 개 이상의 아미노산을 함유하는 것을 특징으로 하는 인간 혈액응고인자 VIII의 융합 단백질.
  7. 제 6 항에 있어서,
    상기 가요성 펩티드 링커는 (GS)a(GGS)b(GGGS)c(GGGGS)d 반복단위를 조합하여 형성된 아미노산 서열 화학식을 가지며,
    여기서 a, b, c 및 d는 0보다 크거나 같은 정수이며, a+b+c+d≥1인 것을 특징으로 하는 인간 혈액응고인자 VIII의 융합 단백질.
  8. 제 7 항에 있어서,
    상기 가요성 펩티드 링커는 바람직하게 아래와 같은 서열:
    (i) GSGGGSGGGGSGGGGS;
    (ii) GSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS;
    (iii) GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS;
    (iv) GSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS;
    (v) GGGSGGGSGGGSGGGSGGGS; 에서 선택되는 것을 특징으로 하는 인간 혈액응고인자 VIII의 융합 단백질.
  9. 제 1 항에 있어서,
    상기 인간 융모성 생식선 자극호르몬 β 서브 유닛 카르복시말단 펩티드 강성 유닛은 서열번호 7에 표시된 아미노산 서열 또는 그의 절단된 서열을 포함하며, 상기 절단된 서열은 적어도 2개의 클리코실화 사이트를 포함하는 것을 특징으로 하는 인간 혈액응고인자 VIII의 융합 단백질.
  10. 제 9 항에 있어서,
    상기 인간 융모성 생식선 자극호르몬 β 서브 유닛 카르복시말단 펩티드 강성 유닛은 다음과 같은 아미노산 서열:
    (i) PRFQDSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ;
    (ii) SSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ;
    (iii) SSSSKAPPPS;
    (iv) SRLPGPSDTPILPQ; 을 포함하는 것을 특징으로 하는 인간 혈액응고인자 VIII의 융합 단백질.
  11. 제 1 항에 있어서,
    상기 인간 융모성 생식선 자극호르몬 β 서브 유닛 카르복시말단 펩티드 강성 유닛은 청구항 9 또는 청구항 10의 상기 강성 유닛의 아미노산 서열과 적어도 70%, 80%, 90% 또는 95% 상동한 것을 특징으로 하는 인간 혈액응고인자 VIII의 융합 단백질.
  12. 제 1 항에 있어서,
    상기 융합 단백질은 1, 2, 3, 4 또는 5개의 인간 융모성 생식선 자극호르몬 β 서브 유닛 카르복시말단 펩티드 강성 유닛을 포함하는 것을 특징으로 하는 인간 혈액응고인자 VIII의 융합 단백질.
  13. 제 1 항에 있어서,
    상기 융합 단백질의 반감기 연장 부분은 인간 면역글로불린 Fc 변이체인 것을 특징으로 하는 인간 혈액응고인자 VIII의 융합 단백질.
  14. 제 1 항에 있어서,
    상기 인간 면역 글로불린 Fc 변이체는, 감소된 ADCC 효과, 및/또는 감소된 CDC효과, 및/또는 향상된 FcRn 수용체에 대한 결합 친화도를 갖는 것을 특징으로 하는 인간 혈액응고인자 VIII의 융합 단백질.
  15. 제 14 항에 있어서,
    상기 Fc 변이체는:
    (i) Leu234Val, Leu235Ala 및 Pro331Ser 돌연변이를 포함하는 인간 IgG1 힌지 영역, CH2 및 CH3 영역;
    (ii) Pro331Ser 돌연변이를 포함하는 인간 IgG2 힌지 영역, CH2 및 CH3 영역;
    (iii) Thr250Gln 및 Met428Leu 돌연변이를 포함하는 인간 IgG2 힌지 영역, CH2 및 CH3 영역;
    (iv) Pro331Ser, Thr250Gln 및 Met428Leu 돌연변이를 포함하는 인간 IgG2 힌지 영역, CH2 및 CH3 영역;
    (v) Ser228Pro 및 Leu235Ala 돌연변이를 포함하는 인간 IgG4 힌지 영역, CH2 및 CH3 영역; 에서 선택되는 것을 특징으로 하는 인간 혈액응고인자 VIII의 융합 단백질.
  16. 제 1 항에 있어서,
    상기 융합 단백질의 아미노산 서열은 서열번호 16에 기재된 것과 같은 것을 특징으로 하는 인간 혈액응고인자 VIII의 융합 단백질.
  17. 제 1 항 내지 제 16 항 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 융합 단백질의 활성은 >6000IU/mg인 것을 특징으로 하는 인간 혈액응고인자 VIII의 융합 단백질.
  18. 제 1 항 내지 제 16 항 중의 어느 한 항에 따른 융합 단백질을 코딩하는 DNA분자.
  19. 제 18 항에 있어서,
    서열번호 17와 같은 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 DNA분자.
  20. 제 18 항 또는 제 19 항에 따른 DNA분자를 포함하는 것을 특징으로 하는 벡터.
  21. 제 20 항에 따른 벡터를 포함하거나 제 20 항에 따른 벡터로 형질감염된 숙주세포.
  22. 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제 및 유효량의 제 1 항 내지 제 17 항의 어느 한 항에 따른 융합 단백질을 포함하는 것을 특징으로 하는 약물 조성물.
  23. (a) 융합 단백질을 코딩하는 제 18 항 또는 제 19 항에 따른 DNA를 CHO 세포에 도입하여 CHO 유래 세포주를 생성시키는 단계;
    (b) 단계 (a)에서 성장 배지에서 매 24 시간내로 1IU/106 이상의 세포를 발현하는 고수율 세포주를 선별하는 단계;
    (c) 단계 (b)에서 선별한 세포주를 배양하여 융합 단백질을 발현하는 단계;
    (d) 단계 (c)에서 얻은 발효액을 수확하고 융합 단백질을 분리 및 정제하는 단계; 를 포함하는 것을 특징으로 하는 제 1 항 내지 제 17 항의 어느 한 항에 따른 융합 단백질의 제조방법.
  24. 제 23 항에 있어서,
    상기 단계(d)에서 상기 융합 단백질의 정제 과정은 친화성 크로마토그래피, 소수성 크로마토그래피, 음이온교환 크로마토그래피 및 분자체 크로마토그래피를 포함하는 것을 특징으로 하는 융합 단백질의 제조방법.
  25. 제 1 항 내지 제 17 항의 어느 한 항에 따른 융합 단백질의 출혈성 질환의 예방 또는 치료용 약물에서의 응용.
  26. 재 25 항에 있어서,
    상기 응용은 선천성 또는 후천성 FVIII결핍증 환자의 출혈성 질환의 예방 또는 치료, 혈유병 A환자의 자발성 출혈 또는 수술성 출혈의 예방 또는 치료를 위한 약물 제조에서의 응용을 포함하는 융합 단백질의 출혈성 질환의 예방 또는 치료용 약물에서의 응용.
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