KR20190036907A

KR20190036907A - 친환경 추출 기술을 이용한 영지 추출물의 제조 방법과 그에 의해 제조된 영지 추출물 및 이를 함유하는 항노화 화장료 조성물

Info

Publication number: KR20190036907A
Application number: KR1020170126385A
Authority: KR
Inventors: 심진섭; 이은정; 박녹현; 최소웅; 김용진
Original assignee: (주)아모레퍼시픽
Priority date: 2017-09-28
Filing date: 2017-09-28
Publication date: 2019-04-05
Also published as: US11433019B2; CN111417382B; US20200253859A1; CN111417382A; WO2019066381A1; KR102440441B1

Abstract

본 발명은 친환경 추출 기술을 이용한 영지 추출물의 제조 방법과 그에 의해 제조된 영지 추출물 및 이를 함유하는 화장료 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 사이클로덱스트린 수용액을 이용한 추출 기술 또는 사이클로덱스트린 수용액에 초음파 추출을 결합한 추출 기술을 이용하여 효능 성분인 트리테르페노이드가 고농도로 함유된 영지 추출물을 제조함으로써 MMP-1 활성 억제, 콜라겐 분해 억제와 같은 항노화 효과를 높이는 영지 추출물의 제조 방법과, 그에 의해 제조된 영지 추출물, 및 이를 포함하는 화장료 조성물에 관한 것이다.

Description

친환경 추출 기술을 이용한 영지 추출물의 제조 방법과 그에 의해 제조된 영지 추출물 및 이를 함유하는 항노화 화장료 조성물{Method for producing extracts of Ganoderma lucidum, the extracts produced thereby, and the anti-aging cosmetic composition containing the same}

본 발명은 친환경 추출 기술을 이용한 영지 추출물의 제조 방법과 그에 의해 제조된 영지 추출물 및 이를 함유하는 화장료 조성물에 관한 것이다. 보다 상세하게는 사이클로덱스트린 수용액을 이용한 추출 기술 또는 사이클로덱스트린 수용액에 초음파 추출을 결합한 추출 기술을 이용하여 고농도의 트리테르페노이드 성분이 함유된 영지 추출물을 제조함으로써 MMP-1 활성 억제, 콜라겐 분해 억제와 같은 항노화 효과를 높이는 영지 추출물의 제조 방법과, 그에 의해 제조된 영지 추출물, 및 이를 포함하는 화장료 조성물에 관한 것이다.

영지(Ganoderma lucidum)는 담자균류 민주름목 불로초과의 버섯으로, 콩팥, 반원, 또는 부채 모양이고, 지름이 5 내지 20cm이며, 갈색의 갓 표면에는 고리 모양 홈이 나 있고 방사상으로 미세한 주름이 있다. 북반구의 온대 지역에 널리 분포하며, 1년생 버섯으로 초여름부터 가을에 걸쳐 활엽수 뿌리 밑동이나 고사목 그루터기에서 주로 자란다.

불로초 또는 만년버섯으로도 불리는 영지는 심신 안정, 기혈 보충, 기침 진정 등의 효능이 있어 한방의 약재로 사용되어 왔으며, 고혈압, 고콜레스테롤혈증, 간염, 위염, 당뇨병, 기관지염 및 심혈관 질환 등에 효과가 있고, 최근에는 항암 치료와 관련된 연구가 활발히 행해지고 있다. 또한 영지버섯 자실체 추출물이 건강기능식품에 활용되고 있으며, 영지를 항노화 화장품 소재로서 활용하고자 하는 시도도 생겨나고 있다.

영지의 화학성분은 ganoderan A·B·C, ganoderic acid류, ganoderol A·B, lucidenic acid류, ergosterol, mannitol, hemicellulose, β-D-glucan, mannoglucan, peptidoglucan, coumarin, 5'-GMP, 5'-ADP 등이 알려져 있다.

이 중에서 다당류인 β-D-glucan은 영지버섯 자실체 추출물을 함유한 건강기능식품에 필수로 포함되는 주요 생리활성성분이며, ganoderic acid류와 lucidenic acid류의 트리테르페노이드(triterpenoid) 성분 또한 약리 작용 및 면역 기능에 유용한 생리활성성분임이 밝혀졌다. 특히 ganoderic acid는 간암 세포의 세포 독성을 비롯한 광범위한 질환에서 약리학적 활성을 갖는 것으로 알려졌다.

영지 추출물을 제조하기 위한 추출 방법에는 일반적으로 열수를 이용한 방법과 유기용매를 이용한 방법이 있다.

열수를 이용한 추출 방법은 영지로부터 다당류 성분을 용이하게 추출하거나, 일반적인 식품에 영지 추출물을 기능 성분으로 활용하고자 할 때 주로 사용된다. 그러나 현재 행해지고 있는 단순 열수 추출법으로는 트리테르페노이드와 같은 항노화 성분이 고농도로 함유된 영지 추출물을 얻기 힘들다.

유기용매를 이용한 추출법은 영지로부터 약리학적 활성 성분을 얻고자 할 때 더 선호된다. 이는 에탄올, 메탄올, 또는 저급알코올 등의 수성 유기용매를 이용하여 수용성이 아닌 활성 성분을 용이하게 분리하거나 유효성분을 고농도로 추출하기 위함이다. 그러나, 유기용매 자체에 독성이 있어 안전성에 문제가 있고, 이물질이 섞여 추출되므로 이를 제거하기 위한 정제 과정을 더 거쳐야 하는 단점이 있다.

따라서 영지의 항노화 성분을 활용함에 있어서, 유기용매를 사용하지 않아 인체에 안전하면서도 영지에 들어 있는 유효성분을 고농도로 추출할 수 있는 방법의 개발이 필요한 실정이다.

그러한 방법의 하나로, 본 발명에서는 사이클로덱스트린(Cyclodextrin)의 포접능을 이용하여 영지로부터 고농도의 트리테르페노이드 성분을 추출하는 방법을 제시하고자 한다.

사이클로덱스트린은 천연 생물 소재로서 a-1,4-글루코시드 결합에 의해 원형으로 결합된 고리 모양의 말토올리고당이며, D-글루코스의 중합도에 따라 α-사이클로덱스트린(6개), β-사이클로덱스트린(7개), γ-사이클로덱스트린(8개) 등이 있다. 또한 사이클로덱스트린은 도넛 구조의 내측에 소수성 공동을 갖는데, 내측 공동에 각종 화합물을 삽입하여 포접 화합물을 형성하는 독특한 특성이 있으며, 구성단위가 글루코스이므로 독성이 없고 생체에 매우 안전한 물질로 알려져 있다.

사이클로덱스트린을 이용한 추출법은 미국 특허 제5780097호의 표고버섯 분말 추출물 제조, 미국 특허 제5780096호의 클로렐라 추출물 제조, 대한민국 특허 출원 제10-2003-0074765호의 식물체로부터 이소플라본 추출 등에서 사용된 바 있다.

그러나 영지의 트리테르페노이드 성분을 항노화 화장료에 이용하기 위해 영지 추출물을 제조하는 데 있어서 사이클로덱스트린의 포접능을 적용한 사례는 아직 보고되고 있지 않다. 또한 사이클로덱스트린을 이용하여 효능 성분 추출 시 효능 성분의 추출 효율을 더욱 높이기 위한 방법에 대해서도 추가로 제시되고 있지 않은 실정이다.

1. 대한민국 특허출원 제10-2003-0074765호(2005년 04월 29일 공개) 2. 미국 특허 제5780097호(1998년 07월 14일 공개) 3. 미국 특허 제5780096호(1998년 07월 14일 공개)

종래 기술은 영지 추출물을 얻기 위해 단순 열수 추출법을 이용하거나, 에탄올, 메탄올, 에틸아세테이트 등의 유기용매를 사용하여 제조하였다. 그러나, 단순 열수 추출법은 유효성분의 수율이 낮으며, 유기용매 추출법은 열수 추출보다는 수율이 높지만 추출 이후 유기용매를 제거하는 등 공정이 복잡하고, 유기용매 자체의 독성으로 인하여 인체 적용 시 안전성과 친환경적 요소를 만족시키지 못하는 등의 문제가 있다.

본 발명은 유기용매를 사용하지 않아 안전하고 공정이 복잡하지 않으면서도, 항노화 유효성분을 고농도로 함유하는 영지 추출물의 제조 방법을 제공하고자 한다. 또한 그에 의해 제조된 영지 추출물 및 이를 함유하는 항노화 화장료 조성물을 제공하고자 한다.

본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여, 친환경 추출 기술을 이용하여 고농도의 트리테르페노이드 함유 영지 추출물을 제조하는 방법과, 그에 의해 제조된 영지 추출물 및 이를 유효성분으로 함유하는 항노화 화장료 조성물을 제공한다. 구체적으로, 사이클로덱스트린 수용액을 이용한 추출 방법, 또는 사이클로덱스트린 수용액과 초음파 추출을 결합한 방법을 이용하여, 트리테르페노이드가 고농도로 함유된 영지 추출물을 제조하는 방법과, 상기 방법에 의해 제조된 영지 추출물을 함유하는 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명은 영지를 사이클로덱스트린, 사이클로덱스트린 유도체, 또는 사이클로덱스트린 중합체의 수용액에 첨가함으로써, 상기 사이클로덱스트린, 사이클로덱스트린 유도체, 또는 사이클로덱스트린 중합체에 영지의 트리테르페노이드 성분을 결합시켜 추출한다. 또한 상기 사이클로덱스트린 수용액을 구성하는 사이클로덱스트린의 종류와 혼합비를 최적화하여 영지의 트리테르페노이드 성분을 최대한 고농도로 추출할 수 있는 방법을 제공한다. 그리고 상기 사이클로덱스트린 수용액을 이용한 추출 공정에 초음파 처리를 결합하여 트리테르페노이드의 추출 수율을 더욱 높이는 방법도 제공한다.

본 발명에 따른 영지의 트리테르페노이드 추출 방법은 기존의 유기용매 추출법과 비교하여 공정이 간단하여 분리 정제의 비용이 상당히 절감되는 효과가 있으며, 환경 및 인체에 유해할 수 있는 유기용매의 사용을 줄일 수 있어서 안전하고 환경 친화적이라는 장점이 있다.

또한, 사이클로덱스트린 수용액을 이용한 추출 공정에 있어서 가장 적합한 사이클로덱스트린의 종류와 혼합비, 공정 조건들을 설정함으로써 저비용으로도 고효율로 영지의 항노화 성분을 추출할 수 있으며, 이에 초음파 추출을 결합함으로써 더 높은 효율을 제공할 수 있다.

본 발명에 따른 영지 추출물 제조 방법으로 제조된 영지 추출물은 영지의 효능 성분을 고농도로 함유하고, 독성이 없고 인체에 안전하므로 화장품 및 건강기능식품 소재로 쉽게 활용될 수 있다.

또한 상기 영지 추출물을 함유한 항노화 화장료 조성물은 트리테르페노이드를 고농도로 함유함으로써 MMP-1 억제 및 콜라게네이즈 억제 효과가 우수하여 피부 주름 개선 및 탄력 증진을 위한 화장품에 사용될 수 있으며, 그에 따라 소비자들에게 높은 성능을 지니면서도 안전한 제품을 제공할 수 있다.

도 1은 본 발명에 따른 트리테르페노이드 함유 영지 추출물의 제조 방법을 나타낸 것이다.
도 2는 α-CD, β-CD, γ-CD의 다양한 혼합 비율에 따른 사이클로덱스트린 수용액을 이용하여 영지 추출물을 제조한 후, 상기 영지 추출물에 포함된 트리테르페노이드에 대한 흡광도를 측정하여 그래프로 비교해 나타낸 것이다.

본 발명은 친환경 추출 기술을 이용하여 Ganoderic acid류를 비롯한 트리테르페노이드 성분을 함유하는 영지 추출물을 제조하는 방법에 관한 것으로, 추출 용매로 사이클로덱스트린 수용액을 이용한 추출 방법과 사이클로덱스트린 수용액에 초음파 추출 공정을 결합한 추출 방법을 제공한다.

또한 본 발명은 상기 사이클로덱스트린 수용액을 이용한 추출 방법에 따라 제조된 고농도 트리테르페노이드 함유 영지 추출물을 제공한다.

또한 본 발명은 상기 사이클로덱스트린 수용액을 이용한 추출 방법에 따라 제조된 상기 고농도 트리테르페노이드 함유 영지 추출물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명은 사이클로덱스트린 중에서도 α-사이클로덱스트린, β-사이클로덱스트린, γ-사이클로덱스트린 등의 조합과 혼합비에 따라, 영지로부터 고농도의 트리테르페노이드 성분을 추출할 수 있는 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 영지 추출물의 추출 방법은, 트리테르페노이드 성분이 포함된 영지를 사이클로덱스트린 수용액에 첨가하여 상기 사이클로덱스트린과 상기 트리테르페노이드의 결합체를 형성하는 것을 특징으로 한다.

또한 본 발명에 따른 영지 추출물의 추출 방법은, 영지에 사이클로덱스트린 수용액을 첨가한 후 초음파 처리와 함께 추출하여 상기 결합체의 형성 효율을 더욱 높일 수 있다.

본 발명은 영지의 유효성분을 추출함에 있어서, 유기용매 대신 사이클로덱스트린 수용액을 사용하는 것을 특징으로 하며, 바람직하게는 적정 농도의 사이클로덱스트린이 함유된 상온수 또는 열수를 사용한다.

상기 트리테르페노이드 성분이 포함된 영지는 영지(靈芝, Ganoderma lucidum), 자지(紫芝, Ganoderma sinensis), 흑영지(黑靈芝, Ganoderma atrum), 자흑색불로초(Ganoderma neojaponicum) 등을 사용할 수 있으나 이에 국한되지 않으며, 시중 약재상 등에서 판매하는 영지버섯을 원료로 사용할 수 있다.

상기 사이클로덱스트린 수용액에서 사이클로덱스트린은 α-사이클로덱스트린, β-사이클로덱스트린, γ-사이클로덱스트린을 사용할 수 있으며, 사이클로덱스트린의 유도체인 하이드록시프로필 α-사이클로덱스트린((2-Hydroxypropyl)-α-cyclodextrin, 분자량 약 1180, CAS 128446-33-3), 하이드록시프로필 β-사이클로덱스트린((2-Hydroxypropyl)-β-cyclodextrin, 분자량 약 1400, CAS 128446-35-5), 하이드록시프로필 γ-사이클로덱스트린((2-Hydroxypropyl)-γ-cyclodextrin, 분자량 약 1580, CAS 128446-34-4), 메틸 β-사이클로덱스트린(Methyl-β-cyclodextrin, 분자량 약 1310, CAS 128446-36-6) 등을 사용할 수 있다. 또한 상기 사이클로덱스트린의 중합체, 사이클로덱스트린 유도체의 중합체, 또는 상기 사이클로덱스트린 및 사이클로덱스트린 유도체의 중합체로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 사용할 수 있다.

상기 사이클로덱스트린 수용액에서 α-사이클로덱스트린, β-사이클로덱스트린, γ-사이클로덱스트린, 하이드록시프로필 α-사이클로덱스트린, 하이드록시프로필 β-사이클로덱스트린, 하이드록시프로필 γ-사이클로덱스트린, 또는 메틸 β-사이클로덱스트린을 단독 사용 시에는, α-사이클로덱스트린을 단독 사용하는 것은 바람직하지 않으며, β-사이클로덱스트린, γ-사이클로덱스트린, 또는 하이드록시프로필 β-사이클로덱스트린, 하이드록시프로필 γ-사이클로덱스트린, 또는 메틸 β-사이클로덱스트린을 사용하는 것이 바람직하다.

또한 상기 사이클로덱스트린 수용액에서 α-사이클로덱스트린, β-사이클로덱스트린 또는 γ-사이클로덱스트린을 단독 사용하는 것보다, β-사이클로덱스트린 및 γ-사이클로덱스트린의 2종을 중량 기준으로 1:1의 혼합비로 혼합하여 사용하는 것이 바람직하다.

상기 사이클로덱스트린 수용액에서 α-사이클로덱스트린, β-사이클로덱스트린 및 γ-사이클로덱스트린의 3종을 혼합하여 사용 시, α-사이클로덱스트린, β-사이클로덱스트린 및 γ-사이클로덱스트린의 혼합비는 중량 기준으로 1:1 내지 2:0.5 내지 2인 것이 바람직하며, α-사이클로덱스트린, β-사이클로덱스트린 및 γ-사이클로덱스트린을 1:1:1의 혼합비로 혼합하여 사용하는 것이 가장 바람직하다. 그러나 앞서 소개한 모든 종류의 사이클로덱스트린을 사용할 수 있으며, 본 발명의 제조 방법에 사용된 물질을 이로 한정하는 것은 아니다.

상기 사이클로덱스트린과 영지의 트리테르페노이드 결합체 형성 단계에서, 상기 사이클로덱스트린 수용액의 농도는 수용액 총 부피 대비 사이클로덱스트린의 중량이 0.01 내지 30%(중량/부피)인 것이 바람직하고, 0.5 내지 5%(중량/부피)인 것이 더욱 바람직하다. 사이클로덱스트린 수용액의 농도가 0.01%(중량/부피) 미만인 경우에는 결합률이 현저히 떨어져 추출 효율이 낮아지며, 30%(중량/부피)를 넘으면 더 이상 추출 효율이 증가하지 않고 포화된다.

상기 결합체 형성을 위한 추출 시간은 10분 내지 24시간인 것이 바람직하다. 10분 미만인 경우에는 추출 효율이 떨어지며, 24시간 넘게 추출하여도 추출 효율이 시간에 비례하여 증가하지 않고 거의 포화하므로 비용 면에서 24시간을 초과하지 않는 것이 바람직하다. 더욱 바람직한 상기 결합체 형성을 위한 추출 시간은 30분 내지 240분이다. 이때 상기 결합체 형성을 위한 추출 온도는 15℃ 내지 100℃임이 바람직하다.

상기 결합체 형성 과정에서 초음파 추출을 병행하고자 할 경우, 10분 내지 120분 동안 15℃ 내지 35℃의 온도에서 초음파(20㎑ 내지 25㎒) 추출을 하는 것이 바람직하며, 15분 내지 60분 동안 15℃ 내지 35℃의 온도에서 초음파 추출을 하는 것이 가장 바람직하다.

본 발명은 상기 사이클로덱스트린 수용액을 이용한 추출 방법에 의해 제조된 고농도의 트리테르페노이드 함유 영지 추출물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물에 관한 것이다.

본 발명에 따른 화장료 조성물은 상기 트리테르페노이드 함유 영지 추출물을 조성물 총 중량에 대하여 0.0001 내지 30 중량% 함유하며, 바람직하게는 0.001 내지 10 중량% 함유한다. 가장 바람직하게는 0.01 내지 1 중량% 함유한다.

본 발명에 따른 화장료 조성물은 상기 트리테르페노이드 성분을 고농도로 함유함으로써 MMP-1 억제 및 콜라게네이즈 억제 등의 항노화 효과가 뛰어나며, 이에 따라 피부 주름 개선 및 탄력 증진 용도로 사용됨을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 화장료 조성물은 유연화장수, 수렴화장수, 영양화장수, 영양크림, 마사지크림, 에센스, 아이크림, 아이에센스, 클렌징크림, 클렌징폼, 클렌징워터, 팩, 파우더, 보디로션, 샴푸, 린스, 보디세정제, 치약 또는 구강청정액 등의 제형으로 제형화되어 화장품에 사용될 수 있다.

이하, 실시예 및 시험예를 통해 본 발명을 좀 더 상세히 설명한다. 그러나, 하기 실시예 및 시험예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 예시일 뿐, 본 발명의 내용이 이에 한정되는 것은 아니다.

[ 시험예 1: 사이클로덱스트린 이용 시 영지 트리테르페노이드의 추출 효율]

본 시험에서 사이클로덱스트린 수용액을 이용한 추출은 물에 α-사이클로덱스트린(α-CD), β-사이클로덱스트린(β-CD), 하이드록시프로필 베타 사이클로덱스트린(HP-β-CD), 또는 γ-사이클로덱스트린(γ-CD)을 1%(중량/부피) 농도로 용해한 수용액 200ml에, 분쇄한 영지 10g을 첨가한 뒤 95에서 60분 동안 추출하는 공정을 거쳐 진행하였다. 이를 통해 실시예 1 내지 4의 추출액을 얻었으며, 이 추출액을 분석에 사용하였다.

대조군인 물(증류수)을 이용한 추출은 상기 사이클로덱스트린 수용액을 이용한 추출 공정에서 물에 사이클로덱스트린을 용해하는 과정을 제외하고 동일한 순으로 진행하였다. 영지 10g을 200ml의 물에 현탁시킨 후 상기 사이클로덱스트린 수용액을 이용한 추출 공정과 동일한 반응 조건 및 시간에서 추출하여 비교예 1의 추출액을 얻었으며, 이를 분석에 사용하였다.

또한 본 시험에서 사이클로덱스트린 수용액-초음파 추출은 상기 사이클로덱스트린 수용액을 이용한 추출에 초음파 추출 공정을 결합한 것으로, 초음파 추출기(Branson Ultrasonics Sonifier™ S-450D)를 사용하여 상온(20℃)에서 60KHz로 15분간 초음파 추출을 진행하였다.

얻어진 추출액들은 0.45㎛의 필터로 여과한 뒤 HPLC 샘플로 사용하였으며, HPLC - PDA system을 통해 분석하였다. HPLC 분석은 Waters Alliance system, model 2965 및 photodiode array(PDA, model 2996)로 진행하였고, 분석용 컬럼은 Luna® 5㎛ C18(2) 100Å, LC Column 250x4.6mm를 사용하였으며, 이동상으로는 물과 아세토나이트릴을 사용하였다.

그 결과는 표 1에 나타내었다.

		Cyclodextrin 수용액 추출		Cyclodextrin 수용액 * Ultrasonic Assisted extraction
		Area	Control 대비	Area	Control 대비
비교예 1	물(증류수)	318486	100%	281655	100%
실시예 1	1% α-CD 수용액	290482	94%	321539	114%
실시예 2	1% β-CD 수용액	416196	131%	466576	166%
실시예 3	1% HP-β-CD 수용액	425589	134%	410915	146%
실시예 4	1% γ-CD 수용액	438854	138%	456253	162%

상기 표 1에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 사이클로덱스트린 수용액을 이용한 추출 방법을 사용하면 영지의 효능 성분인 트리테르페노이드가 고농도로 함유된 영지 추출물을 얻을 수 있음을 확인하였다. 1% β-CD 수용액, 1% HP-β-CD 수용액, 또는 1% γ-CD 수용액으로 추출한 실시예 2 내지 4의 경우, 영지에서 추출된 트리테르페노이드(ganoderic acid 등)의 농도가 기존 물 추출 방식 대비 약 30 내지 40% 증가했다. 그러나 1% α-CD 수용액으로 추출한 실시예 1의 경우에는 오히려 단순 물 추출의 경우인 비교예 1보다 감소했다.

또한, 본 발명에 따른 사이클로덱스트린 수용액을 이용한 추출 방법에 초음파 추출을 결합하여 추출한 경우에는 1% α-CD 수용액, 1% β-CD 수용액, 1% HP-β-CD 수용액, 또는 1% γ-CD 수용액 모두의 경우(실시예 1 내지 4에 초음파 추출을 결합한 경우)에, 대조군(비교예 1에 초음파 추출을 결합한 경우)에 비해 영지에서 추출된 트리테르페노이드의 농도가 증가했다. 특히 1% β-CD 수용액 또는 1% γ-CD 수용액을 이용한 추출에 초음파 추출을 결합한 경우, 대조군에 비해 트리테르페노이드의 추출 농도가 60% 이상 증가하여 매우 우수한 추출 효율을 나타내었다.

[ 시험예 2: 사이클로덱스트린의 종류 및 혼합 사용에 따른 영지 트리테르페노이드 의 추출 효율]

본 시험은 사이클로덱스트린 수용액을 이용한 추출 방법에 초음파 추출을 병행하여 이루어졌다. 사이클로덱스트린 수용액은 물에 사이클로덱스트린을 1%(중량/부피) 농도로 희석한 수용액을 사용하였고, 이때 사이클로덱스트린은 α-CD, β-CD, 또는 γ-CD로 이루어진 군에서 선택된 1종이거나 2종 이상의 혼합물이다. 이후, 해당 수용액 200ml에 분쇄한 영지 10g을 첨가한 뒤 초음파 추출하여 추출액을 얻었으며, 이를 여과하여 분석에 사용하였다. 초음파 추출은 초음파 추출기(Branson Ultrasonics CPX952838R)를 사용하여 상온(20℃)에서 40KHz로 30분간 진행하였다.

대조군인 물(증류수)을 이용한 추출은 상기 사이클로덱스트린 수용액을 이용한 추출 공정에서 물에 사이클로덱스트린을 용해하는 과정을 제외하고 동일한 순으로 진행하였다. 영지 10g을 200ml의 물에 현탁시킨 후 상기 사이클로덱스트린 수용액을 이용한 추출 공정과 동일한 반응 조건 및 시간에서 추출하여 추출액을 얻었으며, 이를 여과하여 분석에 사용하였다.

얻어진 추출액들은 5% valline-acetic acid와 perchloric acid에 반응 시킨 후 Biotek™ Synergy 2를 이용하여 550nm에서 트리테르페노이드에 대한 흡광도를 측정하여 분석하였다.

그 결과는 표 2 및 도 2에 나타내었다.

조성물 번호		Cyclodextrin 1% 혼합 비율			흡광도
조성물 번호		α-CD	β-CD	γ-CD	흡광도
1	비교예 1	0.0%	0.0%	0.0%	0.0270
2	실시예 1	100.0%	0.0%	0.0%	0.0227
3	실시예 2	0.0%	100.0%	0.0%	0.0383
4	실시예 4	0.0%	0.0%	100.0%	0.0383
5	실시예 5	66.7%	0.0%	33.3%	0.0367
6	실시예 6	50.0%	0.0%	50.0%	0.0273
7	실시예 7	33.3%	0.0%	66.7%	0.0333
8	실시예 8	0.0%	66.7%	33.3%	0.0350
9	실시예 9	0.0%	50.0%	50.0%	0.0397
10	실시예 10	0.0%	33.3%	66.7%	0.0377
11	실시예 11	50.0%	25.0%	25.0%	0.0337
12	실시예 12	40.0%	40.0%	20.0%	0.0387
13	실시예 13	40.0%	20.0%	40.0%	0.0303
14	실시예 14	33.3%	33.3%	33.3%	0.0407
15	실시예 15	25.0%	50.0%	25.0%	0.0393
16	실시예 16	25.0%	25.0%	50.0%	0.0380
17	실시예 17	20.0%	40.0%	40.0%	0.0390

상기 표 2 및 도 2에 나타낸 바와 같이, 사이클로덱스트린 1% 수용액을 이용하여 추출할 때, α-CD를 단독으로 사용한 경우를 제외한 모든 실시예에서, 단순 물 추출 방법을 이용한 비교예 1에 비해 흡광도가 더 높게 나타남을 확인하였다. 즉 실시예 2와 실시예 4 내지 17은 영지로부터 추출된 트리테르페노이드의 농도가 비교예 1에 비해 높았으며, 그에 따라 추출 효율도 높음을 확인하였다.

또한 상기 사이클로덱스트린 1% 수용액에서, α-CD, β-CD, 또는 γ-CD를 단독으로 사용할 때보다 β-CD 및 γ-CD의 2종을 1:1의 혼합비로 혼합하여 사용할 경우, 또는 α-CD, β-CD, 및 γ-CD의 3종을 일정 비율로 혼합하여 사용할 경우에 더 높은 흡광도를 나타내어 영지 트리테르페노이드의 추출 농도가 더욱 높아짐을 알 수 있었다. 특히 α-CD, β-CD, 및 γ-CD의 3종을 혼합하여 사용할 경우에는 α-CD, β-CD, 및 γ-CD를 1:1 내지 2:0.5 내지 2의 혼합비로 혼합하여 사용할 때 흡광도가 단독 사용 시보다 더 높았으며, α-CD, β-CD, 및 γ-CD를 1:1:1의 혼합비로 혼합하여 사용했을 때 흡광도가 가장 높아 영지 트리테르페노이드를 가장 높은 농도로 추출할 수 있음을 확인하였다.

[ 시험예 3: 사이클로덱스트린 수용액으로 추출한 영지 추출물의 MMP -1 억제 효과]

본 발명에 따른 사이클로덱스트린 수용액으로 추출한 영지 추출물의 자외선에 의해 증가되는 매트릭스 메탈로프로테아제-1(Matrix metalloprotease-1; MMP-1) 발현 억제 효과를 확인하기 위하여, 섬유아세포(HS68)를 12웰 플레이트의 각 웰에 0.75*10 5개씩 심고 24시간 동안 기아 상태(starvation)로 한 후에, 인산염 완충 식염수로 세척하고 UV(30mJ)를 조사하였다. 이어서, 양성 대조군으로 레티노익산(Retinoic Acid; RA) 5μM과 사이클로덱스트린 수용액으로 추출한 영지 추출물 1, 10, 50ppm을 48시간 동안 두 번씩 처리하고, 배지 중에 유리된 MMP-1의 양은 키트(Amersham, RPN2610)를 사용하여 측정하였다.

상기 영지 추출물은 1% β-CD 사이클로덱스트린 수용액을 이용하고 초음파 추출을 병행하여 추출한 것이며, 데이터 값은 시험물질을 포함하지 않은 대조군으로 보정하였고, 그 결과를 표 3에 나타내었다.

	농도	Extracellular MMP-1 (% of control)
대조군		0%
양성대조군(Retinoic acid)	5μM	66.2%
물(증류수)을 이용하여 추출한 영지 추출물	50 ppm	37.1%
사이클로덱스트린 수용액으로 추출한 영지 추출물 (1% β-CD 수용액 * Ultrasonic Assisted extraction)	1 ppm	26.5%
	10 ppm	47.1%
	50 ppm	51.3%

표 3에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 사이클로덱스트린 수용액으로 추출한 영지 추출물은 농도가 증가함에 따라 MMP-1의 발현을 억제하였다. 또한 사이클로덱스트린 수용액을 이용하지 않고 물을 이용하여 추출한 영지 추출물에 비해 MMP-1의 발현 억제 효과가 더 우수하였다.

[ 시험예 4: 사이클로덱스트린 수용액으로 추출한 영지 추출물의 콜라게네이즈 억제 효과]

본 발명에 따른 사이클로덱스트린 수용액으로 추출한 영지 추출물의 콜라게네이즈 생성 저해능을 레티노익산과 비교하여 측정하였다. 2.5%의 우태아 혈청이 함유된 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Media) 배지가 들어있는 96공 평판배양기(96-well microtiter plate)에 인간의 섬유아세포를 5,000 세포/공(well)이 되도록 넣고, 70~80% 정도 자랄 때까지 CO₂ 5%, 37 배양기(incubator)에서 배양하였다. 그리고 1% β-CD 사이클로덱스트린 수용액과 초음파 추출을 이용하여 추출한 영지 추출물을 100 ㎍/ml 농도로 24시간 동안 처리한 다음, 세포배양액을 채취하였다.

이후, 채취한 세포배양액을 상업적으로 이용 가능한 콜라게네이즈 측정기구(GE Healthcare Life Sciences)를 이용하여 콜라게네이즈 생성 정도를 측정하였다. 먼저 1차 콜라게네이즈 항체가 균일하게 도포된 96-공 평판(96-well plate)에 채위된 세포 배양액을 넣고 3시간 동안 항원-항체 반응을 항온조에서 실시하였다. 3시간 후 발색단이 결합된 2차 콜라겐 항체를 96-공 평판(96-well plate)에 넣고 다시 15분간 반응시켰다. 15분 후 발색유발물질을 넣어 실온에서 15분간 발색을 유발시키고, 다시 1M 황산을 넣어 반응(발색)을 중지시키면 반응액의 색깔은 노란색을 띄며 반응 진행의 정도에 따라 노란색의 정도가 다르게 나타났다.

노란색을 띠는 96-공 평판(96-well plate)의 흡광도를 흡광계를 이용하여 405nm에서 측정하였고, 하기 수학식 1에 의해 콜라게네이즈의 발현 정도를 계산하였다. 이때 상기 시험물질을 처리하지 않은 군(비처리군)의 채위된 세포배양액의 반응 흡광도를 대조군의 흡광도로 하였다.

콜라게네이즈 발현 정도(%)= A/B × 100

A: 상기 시험물질 처리 세포군의 흡광도

B: 대조군의 흡광도

한편, 상기 인간의 섬유아세포에서 상기 시험물질들의 콜라게네이즈 발현 억제 효능을 측정한 결과를 콜라게네이즈 발현 정도로 하기 표 4에 나타내었으며, 이는 비처리군의 콜라게네이즈 발현 정도를 100으로 하여 대비한 것이다.

	농도	콜라게네이즈 발현 정도 (%)
대조군(비처리군)		100%
양성대조군(Retinoic acid)	5μM	75.0%
물(증류수)을 이용하여 추출한 영지 추출물	50 ppm	83.7%
사이클로덱스트린 수용액과 초음파 추출로 추출한 영지 추출물 (1% β-CD 수용액 * Ultrasonic Assisted extraction)	1 ppm	93.5%
	10 ppm	82.7%
	50 ppm	74.0%

상기 표 4에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 사이클로덱스트린 수용액으로 추출한 영지 추출물은 콜라게네이즈 발현을 효과적으로 억제함을 확인할 수 있었으며, 특히 사이클로덱스트린 수용액을 이용하지 않고 물을 이용하여 추출한 영지 추출물보다 더 높은 콜라게네이즈 발현 억제 효능을 나타냄을 알 수 있었다.

상기 시험예 1 및 2의 결과를 통해, 본 발명에 따른 사이클로덱스트린 수용액을 이용한 추출 방법으로 제조된 영지 추출물은 트리테르페노이드 성분을 고농도로 함유하게 됨을 확인할 수 있었다. 또한, 상기 시험예 3 및 4의 결과에서, 본 발명에 따른 고농도 트리테르페노이드 함유 영지 추출물은 MMP-1 억제 및 콜라게네이즈 억제 효과가 뛰어남을 확인하였다. 이에 따라 본 발명에 따른 제조 방법으로 제조된 고농도 트리테르페노이드 함유 영지 추출물은 항노화 효과를 가지며, 피부 주름 개선 및 탄력 증진 용도로 사용될 수 있음을 알 수 있었다.

Claims

사이클로덱스트린(cyclodextrin) 수용액을 이용한 트리테르페노이드(triterpenoid) 함유 영지(Ganoderma lucidum) 추출물의 제조 방법으로서,
트리테르페노이드 성분이 포함된 영지를 사이클로덱스트린 수용액에 첨가하여 상기 사이클로덱스트린과 상기 영지의 트리테르페노이드 성분의 결합체를 형성시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 트리테르페노이드 함유 영지 추출물의 제조 방법.
제 1항에 있어서, 상기 사이클로덱스트린과 영지의 트리테르페노이드 성분 결합체 형성 단계에서 초음파 처리를 추가하여 상기 결합체를 형성하는 것을 특징으로 하는, 트리테르페노이드 함유 영지 추출물의 제조 방법.
제 1항에 있어서, 상기 사이클로덱스트린은 α-사이클로덱스트린, β-사이클로덱스트린 및 γ-사이클로덱스트린 중에서 선택되는 사이클로덱스트린; 사이클로덱스트린의 유도체로서 하이드록시프로필 α-사이클로덱스트린, 하이드록시프로필 β-사이클로덱스트린, 하이드록시프로필 γ-사이클로덱스트린, 및 메틸 β-사이클로덱스트린 중에서 선택되는 사이클로덱스트린의 유도체; 및 상기 사이클로덱스트린의 중합체, 사이클로덱스트린 유도체의 중합체, 또는 상기 사이클로덱스트린 및 사이클로덱스트린 유도체의 중합체; 로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상임을 특징으로 하는, 트리테르페노이드 함유 영지 추출물의 제조 방법.
제 1항에 있어서, 상기 사이클로덱스트린 수용액은 중량 기준으로 β-사이클로덱스트린 및 γ-사이클로덱스트린을 1:1로 혼합한 혼합물; 또는 α-사이클로덱스트린, β-사이클로덱스트린, 및 γ-사이클로덱스트린을 1:1 내지 2:0.5 내지 2로 혼합한 혼합물임을 특징으로 하는, 트리테르페노이드 함유 영지 추출물의 제조 방법.
제 1항에 있어서, 상기 사이클로덱스트린 수용액의 농도는 수용액 총 부피 대비 사이클로덱스트린의 중량이 0.01 내지 30%(중량/부피)임을 특징으로 하는, 트리테르페노이드 함유 영지 추출물의 제조 방법.
제 1항에 있어서, 상기 추출물 제조 시 추출 온도는 15℃ 내지 100℃임을 특징으로 하는, 트리테르페노이드 함유 영지 추출물의 제조 방법.
제 1항에 있어서, 상기 추출물 제조 시 추출 시간은 10분 내지 24시간임을 특징으로 하는, 트리테르페노이드 함유 영지 추출물의 제조 방법.
제 2항에 있어서, 상기 초음파 처리 시 추출 온도는 15℃ 내지 35℃이며, 추출 시간은 10분 내지 120분임을 특징으로 하는, 트리테르페노이드 함유 영지 추출물의 제조 방법.
제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 따라 제조된 트리테르페노이드 함유 영지 추출물.
제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 따라 제조된 트리테르페노이드 함유 영지 추출물을 함유하는 화장료 조성물.
제 10항에 있어서, 상기 조성물은 피부 주름 개선 및 탄력 증진용인 화장료 조성물.