KR20190015757A - 인터루킨 4 수용체에 결합하는 항체 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 인터루킨 4 (interleukin 4, IL-4) 수용체 (IL-4 receptor, IL-4R)에 결합할 수 있는 항체를 제공한다. 본 발명은 또한 상기 항체를 코딩하는 핵산 서열, 상기 핵산 서열을 포함하는 벡터, 및 상기 벡터로 형질전환되거나 형질도입된 숙주 세포를 제공한다. 본 발명은 또한 상기 항체의 제조 방법, 의학적 용도 및 상기 항체를 포함하는 키트를 제공한다.

Description

인터루킨 4 수용체에 결합하는 항체
본 발명은 생물 약제학 분야에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 인터루킨 4 (interleukin 4, IL-4) 수용체 (IL-4 receptor, IL-4R)에 결합할 수 있는 항체 및 그 용도에 관한 것이다.
인터루킨-4 (IL-4)는 주로 활성화된 T 세포, 단핵구, 호염구, 비만세포 및 호산구에 의해 생성되는 사이토카인이다. IL-4는 다양한 생물학적 과정에 관여하며, 당 업계에 공지된 이의 생물학적 효과는 활성화된 B 세포 및 T 세포의 증식 및 CD4+ T 세포의 II 형 헬퍼 T 세포로의 분화를 자극하는 것을 포함한다. 더우기, IL-4는 알레르기 질환, 자가면역 질환, 전염성 질환 및 종양과 같은 질병에 대한 면역반응을 매개하는데 다수의 효과를 가지며, 종양, 자가면역 질환 및 전염성 질환 등에 대한 치료 효과를 갖는다는 연구 결과가 있다. 한편, IL-4는 또한 백신에 대한 면역 반응을 조절할 수 있다. 따라서 IL-4는 항상 광범위한 관심을 야기하는 연구 분야 이다.
IL-13은 또한 활성화된 T 세포에 의해 생성되는 사이토카인이며, 이는 단핵구, B 세포, 비만세포 및 각질형성세포와 같은 상이한 유형의 세포에서 상이한 기능을 갖는다. IL-13은 단핵구로부터의 염증성 사이토카인 및 케모카인의 방출을 억제하고, B 세포의 증식 및 분화를 유도하며, IgE의 합성을 촉진시킨다. IL-13 및 IL-4는 단핵구로부터의 염증 매개체의 방출 억제, 대식세포의 수지상 발달 유도, 단핵구 표면에서의 CD23 발현 촉진 및 B 세포에 의한 면역글로블린 합성 촉진 등을 포함하는 많은 공통적인 특성을 공유한다. 동시에, IL-13은 또한 인간의 단핵구의 분화를 촉진하고 세포 표면의 항원 변화를 촉진하며; B 세포의 증식 및 분화를 유도하고 B 세포로부터의 항체 분비를 촉진하며; IgE의 합성을 조절함으로써 신체의 알레르기 반응과 관련되어 있고; 종양 세포의 성장을 억제하며; HIV의 복제를 억제하는 등의 고유한 생물학적 특성을 가지고 있다.
IL-4의 생물학적 활성은 세포 표면의 특정 IL-4 수용체 (인간에서 "hIL-4R"로 불리는 IL-4R)에 의해 매개된다. 인간 IL-4R은 알파 사슬 (hIL-4Rα, UniProtKB: P24394) 이 IL-4에 대해 높은 친화성을 갖는 2 개의 폴리펩티드 사슬에 의해 형성된 이종이량체이다. 연구에 따르면 IL-13 의 세포 표면 수용체 알파 사슬 (IL-13Rα chain)은 IL-4Rα 사슬과 다른 형태의 IL-4R 복합체를 형성한다는 사실이 밝혀졌다. 상기 IL-4R 복합체의 IL-4Rα 사슬은 IL-4및 관련된 다른 사이토카인에 결합하는데 선도적인 역할을 하기에, IL-4Rα 사슬은 현재 주요 표적으로 연구되고 있다. 또한, 상기 IL-4Rα 사슬에 대한 인간 단클론항체가 천식, 습진, 아토피성 피부염 등의 증상을 완화하고 치료하는데 임상적으로 효과가 있음이 입증되었다.
인간 인터루킨-4 수용체는 T 세포에 의해 매개되는 IL-4 및 IL-5 상향 조절에 의해 매개되는 세포증식을 억제하는 가용성(soluble) 단백질 (shIL-4Rα, 서열번호 94)을 생산하는 것으로 알려져 있다. 상기 수용체의 두 가지 형태는 알레르기성 비염, 부비동염, 천식, 습진 등의 알레르기 반응과 관련이 있다. 따라서, 상기 단백질을 표적으로 하는 항체를 차단하면 상기 질병을 치료하고 완화시키는데 도움을 줄 수 있다.
천식은 만성 기도 염증성 질환으로 호산구, 비만세포 및 림프구와 같은 많은 염증세포가 관여되며 그 구체적인 원인은 여전히 불분명하다. IL-4와 같은 사이토카인은 기관지 천식의 발생 및 발병에 중요한 역할을하기 때문에 IL-4에 특이적인 항체의 개발은 천식 치료에 효과적인 방법 중 하나이다. IL-4/IL-4Rα의 억제는 천식에 효과적인 면역조절 효과를 가질 수 있다.
알레르기성 비염 (AR)은 천식과 매우 유사한 병인을 가지며, 알레르기성 비염과 천식은 모두 제 1 형 알레르기에 속한다. 한편, IL-4, IL-17 및 IgE가 알레르기성 비염의 병인에 중요한 역할을 한다는 연구 결과가 있다. 지금까지 AR 치료로 비강내 코르티코 스테로이드 및 항히스타민 제제 투여가 약물치료로 사용되어 왔다.
이소성 피부염 또는 유전성 알레르기성 피부염으로도 알려진 아토피성 피부염 (AD)은 어린이 및 청소년에게 주로 나타나는 일반적인 피부질환이며 종종 알레르기성 비염, 천식 등과 같은 유전성 알레르기 질환과 함께 나타난다. IL-4 및 IL-13과 같은 면역학적 인자의 관련은 주요 발병 기전 중 하나이다.
호산구성 식도염 (EoE)은 식도의 모든 층에서 호산구 (EOS)의 침윤을 특징으로하는 만성 면역 염증 질환이다. EoE 발병은 Th2 세포의 기능 장애와 관련이 있다. 현재, 새로운 생물학적 제제인 항-IL-5 (메폴리주맙)와 같은 높은 특이성을 갖는 프로토콜이 집중적으로 연구되고 있다. 면역 조절 요법이 동물 모델에서 어느 정도 결과를 얻긴 했지만, 인간에 있어서는 여전히 임상시험이 필요하다. 현재 PGD2 억제제, 항-TNF-α 및 항-IL-13과 같은 약제가 연구중이다.
현재, hIL-4R을 표적으로 하는 두필루맙과 같은 단클론항체 약제는 임상 시험에 진입했으며, 아토피성 피부염의 2 상 임상시험에서 좋은 효능을 보였다. 두필루맙 외에 hIL-4R에 대한 다른 단클론항체가 특허 출원, 예를 들어 US 7,186,809 및 US 7,638,606, 된 바 있다.
발명의 요약
본 발명은 항체 스크리닝 및 최적화를 통해 IL-4R에 특이적인 항체를 제공하며, 상기 항체는 IL-4와 IL-4R의 결합을 차단하는 역할을 할 수 있고, IL-4R에 결합함으로써 염증 또는 알레르기 질환의 치료에 사용될 수 있다.
서열번호 58로 기재되는 서열의 아미노산 잔기의 번호를 참조하면 본 발명의 항체는 그 안에 포함된 경쇄 가변영역의 31 번 위치에 세린 (31Ser)을 가지고, 서열번호 93에 기재되는 서열의 아미노산 잔기의 번호를 참조하면 상기 항체는 그 안에 포함된 중쇄 가변영역의 103 번 위치에 아스파르트산 (103Asp) 및 104 번 위치에 티로신 (104Tyr)을 갖는다. 여기서, 상기 31Ser은 상응하는 본 발명의 항체의 경쇄 가변 영역의 CDR1에 위치하고, 상기 103Asp 및 104Tyr은 상응하는 본 발명의 항체의 중쇄 가변 영역의 CDR3에 위치한다.
바람직하게는, 본 발명의 항체의 경쇄 가변 영역은 서열번호 2로 기재되는 CDR1을 포함하고, 상기 항체의 중쇄 가변 영역은 서열번호 19로 기재되는 CDR3을 포함한다.
바람직하게는, 본 발명의 항체의 경쇄 가변 영역은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 CDR1, CDR2 및 CDR3의 조합을 포함한다:
(1) 서열번호 2로 기재되는 CDR1, 서열번호 3으로 기재되는 CDR2 및 서열번호 5로 기재되는 CDR3;
(2) 서열번호 2로 기재되는 CDR1, 서열번호 4로 기재되는 CDR2 및 서열번호 5로 기재되는 CDR3;
(3) 서열번호 2로 기재되는 CDR1, 서열번호 3으로 기재되는 CDR2 및 서열번호 6으로 기재되는 CDR3;
(4) 서열번호 2로 기재되는 CDR1, 서열번호 3으로 기재되는 CDR2 및 서열번호 7로 기재되는 CDR3;
(5) 서열번호 2로 기재되는 CDR1, 서열번호 3으로 기재되는 CDR2 및 서열번호 8로 기재되는 CDR3;
(6) 서열번호 2로 기재되는 CDR1, 서열번호 4로 기재되는 CDR2 및 서열번호 6으로 기재되는 CDR3
(7) 서열번호 2로 기재되는 CDR1, 서열번호 4로 기재되는 CDR2 및 서열번호 7로 기재되는 CDR3; 및
(8) 서열번호 2로 기재되는 CDR1, 서열번호 4로 기재되는 CDR2 및 서열번호 8로 기재되는 CDR3.
본 발명의 항체의 중쇄 가변 영역은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 CDR1, CDR2 및 CDR3의 조합을 포함한다:
(1) 서열번호 14로 기재되는 CDR1, 서열번호 17로 기재되는 CDR2 및 서열번호 19로 기재되는 CDR3;
(2) 서열번호 14로 기재되는 CDR1, 서열번호 18로 기재되는 CDR2 및 서열번호 19로 기재되는 CDR3;
(3) 서열번호 15로 기재되는 CDR1, 서열번호 17로 기재되는 CDR2 및 서열번호 19로 기재되는 CDR3;
(4) 서열번호 15로 기재되는 CDR1, 서열번호 18로 기재되는 CDR2 및 서열번호 19로 기재되는 CDR3;
(5) 서열번호 16으로 기재되는 CDR1, 서열번호 18로 기재되는 CDR2 및 서열번호 19로 기재되는 CDR3; 및
(6) 서열번호 16으로 기재되는 CDR1, 서열번호 17로 기재되는 CDR2 및 서열번호 19로 기재되는 CDR3.
보다 바람직하게는, 본 발명의 항체는 하기 서열로 표시되는 아미노산 서열로부터 선택되는 경쇄 가변 영역을 포함한다: 서열번호 40, 서열번호 41, 서열번호 44, 서열번호 45, 서열번호 46, 서열번호 47, 서열번호 49, 서열번호 50, 서열번호 51, 서열번호 54, 서열번호 55 및 서열번호 57. 본 발명의 항체는 또한 하기 서열로 표시되는 아미노산 서열로부터 선택되는 중쇄 가변 영역을 포함한다: 서열번호 59, 서열번호 60, 서열번호 61, 서열번호 62, 서열번호 63, 서열번호 64, 서열번호 65, 서열번호 66, 서열번호 67, 서열번호 74, 서열번호 75, 서열번호 76, 서열번호 77, 서열번호 78, 서열번호 79, 서열번호 80, 서열번호 91 및 서열번호 92.
더욱 바람직하게는, 본 발명의 항체는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 경쇄 가변 영역과 중쇄 가변 영역의 조합을 포함한다:
(1) 서열번호 57로 기재되는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 62로 기재되는 중쇄 가변 영역;
(2) 서열번호 57로 기재되는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 63으로 기재되는 중쇄 가변 영역;
(3) 서열번호 57로 기재되는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 59로 기재되는 중쇄 가변 영역;
(4) 서열번호 57로 기재되는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 60으로 기재되는 중쇄 가변 영역;
(5) 서열번호 57로 기재되는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 61로 기재되는 중쇄 가변 영역;
(6) 서열번호 57로 기재되는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 67로 기재되는 중쇄 가변 영역;
(7) 서열번호 57로 기재되는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 65로 기재되는 중쇄 가변 영역;
(8) 서열번호 57로 기재되는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 66으로 기재되는 중쇄 가변 영역;
(9) 서열번호 57로 기재되는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 64로 기재되는 중쇄 가변 영역;
(10) 서열번호 57로 기재되는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 91로 기재되는 중쇄 가변 영역;
(11) 서열번호 57로 기재되는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 74로 기재되는 중쇄 가변 영역;
(12) 서열번호 57로 기재되는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 75로 기재되는 중쇄 가변 영역;
(13) 서열번호 57로 기재되는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 76으로 기재되는 중쇄 가변 영역;
(14) 서열번호 57로 기재되는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 77로 기재되는 중쇄 가변 영역;
(15) 서열번호 57로 기재되는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 78로 기재되는 중쇄 가변 영역;
(16) 서열번호 57로 기재되는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 80으로 기재되는 중쇄 가변 영역;
(17) 서열번호 40으로 기재되는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 92로 기재되는 중쇄 가변 영역;
(18) 서열번호 41로 기재되는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 92로 기재되는 중쇄 가변 영역;
(19) 서열번호 44로 기재되는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 92로 기재되는 중쇄 가변 영역;
(20) 서열번호 44로 기재되는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 62로 기재되는 중쇄 가변 영역;
(21) 서열번호 44로 기재되는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 91로 기재되는 중쇄 가변 영역;
(22) 서열번호 49로 기재되는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 92로 기재되는 중쇄 가변 영역;
(23) 서열번호 50으로 기재되는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 92로 기재되는 중쇄 가변 영역;
(24) 서열번호 45로 기재되는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 92로 기재되는 중쇄 가변 영역;
(25) 서열번호 46으로 기재되는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 92로 기재되는 중쇄 가변 영역;
(26) 서열번호 47로 기재되는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 92로 기재되는 중쇄 가변 영역;
(27) 서열번호 55로 기재되는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 92로 기재되는 중쇄 가변 영역;
(28) 서열번호 55로 기재되는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 62로 기재되는 중쇄 가변 영역;
(29) 서열번호 55로 기재되는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 91로 기재되는 중쇄 가변 영역;
(30) 서열번호 54로 기재되는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 92로 기재되는 중쇄 가변 영역;
(31) 서열번호 54로 기재되는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 62로 기재되는 중쇄 가변 영역;
(32) 서열번호 54로 기재되는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 91로 기재되는 중쇄 가변 영역; 및
(33) 서열번호 51로 기재되는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 92로 기재되는 중쇄 가변 영역.
다른 측면에서, 본 발명은 인터류킨 4 (IL-4) 수용체 (IL-4R)에 결합할 수 있는 항체를 제공한다. 상기 항체는 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함하며, 상기 경쇄 가변 영역은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 CDR1, CDR2 및 CDR3의 조합을 포함한다:
(1) 서열번호 1로 기재되는 CDR1, 서열번호 3으로 기재되는 CDR2 및 서열번호 5로 기재되는 CDR3;
(2) 서열번호 2로 기재되는 CDR1, 서열번호 3으로 기재되는 CDR2 및 서열번호 5로 기재되는 CDR3;
(3) 서열번호 2로 기재되는 CDR1, 서열번호 4로 기재되는 CDR2 및 서열번호 5로 기재되는 CDR3;
(4) 서열번호 1로 기재되는 CDR1, 서열번호 4로 기재되는 CDR2 및 서열번호 5로 기재되는 CDR3;
(5) 서열번호 2로 기재되는 CDR1, 서열번호 3으로 기재되는 CDR2 및 서열번호 6으로 기재되는 CDR3;
(6) 서열번호 2로 기재되는 CDR1, 서열번호 3으로 기재되는 CDR2 및 서열번호 7로 기재되는 CDR3;
(7) 서열번호 2로 기재되는 CDR1, 서열번호 3으로 기재되는 CDR2 및 서열번호 8로 기재되는 CDR3;
(8) 서열번호 1로 기재되는 CDR1, 서열번호 3으로 기재되는 CDR2 및 서열번호 6으로 기재되는 CDR3;
(9) 서열번호 2로 기재되는 CDR1, 서열번호 4로 기재되는 CDR2 및 서열번호 6으로 기재되는 CDR3;
(10) 서열번호 2로 기재되는 CDR1, 서열번호 4로 기재되는 CDR2 및 서열번호 8로 기재되는 CDR3;
(11) 서열번호 1로 기재되는 CDR1, 서열번호 4로 기재되는 CDR2 및 서열번호 8로 기재되는 CDR3; 및
(12) 서열번호 1로 기재되는 CDR1, 서열번호 3으로 기재되는 CDR2 및 서열번호 8로 기재되는 CDR3;
및/또는
상기 항체는 중쇄 가변 영역 (VH)을 포함하며, 상기 중쇄 가변 영역은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 CDR1, CDR2 및 CDR3의 조합을 포함한다:
(1) 서열번호 14로 기재되는 CDR1, 서열번호 17로 기재되는 CDR2 및 서열번호 19로 기재되는 CDR3;
(2) 서열번호 14로 기재되는 CDR1, 서열번호 18로 기재되는 CDR2 및 서열번호 19로 기재되는 CDR3;
(3) 서열번호 14로 기재되는 CDR1, 서열번호 17로 기재되는 CDR2 및 서열번호 20으로 기재되는 CDR3;
(4) 서열번호 14로 기재되는 CDR1, 서열번호 18로 기재되는 CDR2 및 서열번호 20으로 기재되는 CDR3;
(5) 서열번호 15로 기재되는 CDR1, 서열번호 17로 기재되는 CDR2 및 서열번호 19로 기재되는 CDR3;
(6) 서열번호 16으로 기재되는 CDR1, 서열번호 17로 기재되는 CDR2 및 서열번호 19로 기재되는 CDR3; 및
(7) 서열번호 14로 기재되는 CDR1, 서열번호 18로 기재되는 CDR2 및 서열번호 19로 기재되는 CDR3.
또한, 본 발명의 항체의 골격 영역에서, 상기 항체의 경쇄 가변 영역은 바람직하게는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 FR1, FR2, FR3 및 FR4의 조합을 포함한다:
(1) 서열번호 9로 기재되는 FR1, 서열번호 10으로 기재되는 FR2, 서열번호 12로 기재되는 FR3 및 서열번호 13으로 기재되는 FR4; 및
(2) 서열번호 9로 기재되는 FR1, 서열번호 11로 기재되는 FR2, 서열번호 12로 기재되는 FR3 및 서열번호 13으로 기재되는 FR4.
바람직하게는, 상기 항체의 중쇄 가변 영역은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 FR1, FR2, FR3 및 FR4의 조합을 포함한다:
(1) 서열번호 21로 기재되는 FR1, 서열번호 32로 기재되는 FR2, 서열번호 34로 기재되는 FR3 및 서열번호 38로 기재되는 FR4;
(2) 서열번호 22로 기재되는 FR1, 서열번호 32로 기재되는 FR2, 서열번호 34로 기재되는 FR3 및 서열번호 38로 기재되는 FR4;
(3) 서열번호 23으로 기재되는 FR1, 서열번호 32로 기재되는 FR2, 서열번호 34로 기재되는 FR3 및 서열번호 38로 기재되는 FR4;
(4) 서열번호 24로 기재되는 FR1, 서열번호 32로 기재되는 FR2, 서열번호 34로 기재되는 FR3 및 서열번호 38로 기재되는 FR4;
(5) 서열번호 24로 기재되는 FR1, 서열번호 32로 기재되는 FR2, 서열번호 35로 기재되는 FR3 및 서열번호 38로 기재되는 FR4;
(6) 서열번호 25로 기재되는 FR1, 서열번호 32로 기재되는 FR2, 서열번호 34로 기재되는 FR3 및 서열번호 38로 기재되는 FR4;
(7) 서열번호 26으로 기재되는 FR1, 서열번호 32로 기재되는 FR2, 서열번호 34로 기재되는 FR3 및 서열번호 38로 기재되는 FR4;
(8) 서열번호 27로 기재되는 FR1, 서열번호 32로 기재되는 FR2, 서열번호 34로 기재되는 FR3 및 서열번호 38로 기재되는 FR4;
(9) 서열번호 29로 기재되는 FR1, 서열번호 32로 기재되는 FR2, 서열번호 34로 기재되는 FR3 및 서열번호 38로 기재되는 FR4;
(10) 서열번호 30으로 기재되는 FR1, 서열번호 32로 기재되는 FR2, 서열번호 34로 기재되는 FR3 및 서열번호 38로 기재되는 FR4;
(11) 서열번호 24로 기재되는 FR1, 서열번호 33으로 기재되는 FR2, 서열번호 34로 기재되는 FR3 및 서열번호 38로 기재되는 FR4;
(12) 서열번호 24로 기재되는 FR1, 서열번호 32로 기재되는 FR2, 서열번호 36로 기재되는 FR3 및 서열번호 38로 기재되는 FR4;
(13) 서열번호 24로 기재되는 FR1, 서열번호 32로 기재되는 FR2, 서열번호 37로 기재되는 FR3 및 서열번호 38로 기재되는 FR4;
(14) 서열번호 31로 기재되는 FR1, 서열번호 32로 기재되는 FR2, 서열번호 34로 기재되는 FR3 및 서열번호 38로 기재되는 FR4;
(15) 서열번호 27로 기재되는 FR1, 서열번호 32로 기재되는 FR2, 서열번호 35로 기재되는 FR3 및 서열번호 38로 기재되는 FR4;
(16) 서열번호 26으로 기재되는 FR1, 서열번호 32로 기재되는 FR2, 서열번호 35로 기재되는 FR3 및 서열번호 38로 기재되는 FR4;
(17) 서열번호 25로 기재되는 FR1, 서열번호 32로 기재되는 FR2, 서열번호 35로 기재되는 FR3 및 서열번호 38로 기재되는 FR4;
(18) 서열번호 28로 기재되는 FR1, 서열번호 32로 기재되는 FR2, 서열번호 35로 기재되는 FR3 및 서열번호 38로 기재되는 FR4;
(19) 서열번호 28로 기재되는 FR1, 서열번호 32로 기재되는 FR2, 서열번호 34로 기재되는 FR3 및 서열번호 38로 기재되는 FR4;
(20) 서열번호 23으로 기재되는 FR1, 서열번호 32로 기재되는 FR2, 서열번호 35로 기재되는 FR3 및 서열번호 38로 기재되는 FR4;
(21) 서열번호 22로 기재되는 FR1, 서열번호 32로 기재되는 FR2, 서열번호 35로 기재되는 FR3 및 서열번호 38로 기재되는 FR4; 및
(22) 서열번호 21로 기재되는 FR1, 서열번호 32로 기재되는 FR2, 서열번호 35로 기재되는 FR3 및 서열번호 38로 기재되는 FR4.
당업계에 공지된 항체의 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역의 도메인 조성에 따르면, 본 발명의 항체의 경쇄 가변 영역 또는 중쇄 가변 영역은 FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4또는 (X)n-FR1-(X)n-CDR1-(X)n-FR2-(X)n-CDR2-(X)n-FR3-(X)n-CDR3-(X)n-FR4-(X)n 의 순서로 상기 도메인 구성 요소를 포함한다. 여기서, X는 임의의 아미노산 잔기이고, n은 0 또는 0보다 큰 정수이다.
바람직하게는, 본 발명의 항체는 하기 서열로 표시되는 아미노산 서열로부터 선택되는 경쇄 가변 영역을 포함한다:
서열번호 39, 서열번호 40, 서열번호 41, 서열번호 42, 서열번호 43, 서열번호 44, 서열번호 45, 서열번호 46, 서열번호 47, 서열번호 48, 서열번호 49, 서열번호 50, 서열번호 51, 서열번호 52, 서열번호 53, 서열번호 54, 서열번호 55, 서열번호 56, 서열번호 57 및 서열번호 58.
및/또는
본 발명의 항체는 하기 서열로 표시되는 아미노산 서열로부터 선택되는 중쇄 가변 영역을 포함한다:
서열번호 59, 서열번호 60, 서열번호 61, 서열번호 62, 서열번호 63, 서열번호 64, 서열번호 65, 서열번호 66, 서열번호 67, 서열번호 68, 서열번호 69, 서열번호 70, 서열번호 71, 서열번호 72, 서열번호 73, 서열번호 74, 서열번호 75, 서열번호 76, 서열번호 77, 서열번호 78, 서열번호 79, 서열번호 80, 서열번호 81, 서열번호 82, 서열번호 83, 서열번호 84, 서열번호 85, 서열번호 86, 서열번호 87, 서열번호 88, 서열번호 89, 서열번호 90, 서열번호 91, 서열번호 92 및 서열번호 93.
본 발명의 특정 구현예에 따르면, 본 발명의 항체는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역의 조합을 포함한다:
(1) 서열번호 57로 기재되는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 62로 기재되는 중쇄 가변 영역;
(2) 서열번호 57로 기재되는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 63으로 기재되는 중쇄 가변 영역;
(3) 서열번호 57로 기재되는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 59로 기재되는 중쇄 가변 영역;
(4) 서열번호 57로 기재되는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 60으로 기재되는 중쇄 가변 영역;
(5) 서열번호 57로 기재되는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 61로 기재되는 중쇄 가변 영역;
(6) 서열번호 57로 기재되는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 67로 기재되는 중쇄 가변 영역;
(7) 서열번호 57로 기재되는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 65로 기재되는 중쇄 가변 영역;
(8) 서열번호 57로 기재되는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 66으로 기재되는 중쇄 가변 영역;
(9) 서열번호 57로 기재되는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 64로 기재되는 중쇄 가변 영역;
(10) 서열번호 57로 기재되는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 68로 기재되는 중쇄 가변 영역;
(11) 서열번호 57로 기재되는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 69로 기재되는 중쇄 가변 영역;
(12) 서열번호 57로 기재되는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 70으로 기재되는 중쇄 가변 영역;
(13) 서열번호 57로 기재되는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 71로 기재되는 중쇄 가변 영역;
(14) 서열번호 57로 기재되는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 72로 기재되는 중쇄 가변 영역;
(15) 서열번호 57로 기재되는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 73으로 기재되는 중쇄 가변 영역;
(16) 서열번호 57로 기재되는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 89로 기재되는 중쇄 가변 영역;
(17) 서열번호 57로 기재되는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 88로 기재되는 중쇄 가변 영역;
(18) 서열번호 57로 기재되는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 87로 기재되는 중쇄 가변 영역;
(19) 서열번호 57로 기재되는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 86으로 기재되는 중쇄 가변 영역;
(20) 서열번호 57로 기재되는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 83으로 기재되는 중쇄 가변 영역;
(21) 서열번호 57로 기재되는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 82로 기재되는 중쇄 가변 영역;
(22) 서열번호 57로 기재되는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 81로 기재되는 중쇄 가변 영역;
(23) 서열번호 57로 기재되는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 85로 기재되는 중쇄 가변 영역;
(24) 서열번호 57로 기재되는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 84로 기재되는 중쇄 가변 영역;
(25) 서열번호 57로 기재되는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 91로 기재되는 중쇄 가변 영역;
(26) 서열번호 57로 기재되는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 90으로 기재되는 중쇄 가변 영역;
(27) 서열번호 57로 기재되는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 74로 기재되는 중쇄 가변 영역;
(28) 서열번호 57로 기재되는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 75로 기재되는 중쇄 가변 영역;
(29) 서열번호 57로 기재되는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 76으로 기재되는 중쇄 가변 영역;
(30) 서열번호 57로 기재되는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 77로 기재되는 중쇄 가변 영역;
(31) 서열번호 57로 기재되는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 78로 기재되는 중쇄 가변 영역;
(32) 서열번호 57로 기재되는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 80으로 기재되는 중쇄 가변 영역;
(33) 서열번호 39로 기재되는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 92로 기재되는 중쇄 가변 영역;
(34) 서열번호 40으로 기재되는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 92로 기재되는 중쇄 가변 영역;
(35) 서열번호 41로 기재되는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 92로 기재되는 중쇄 가변 영역;
(36) 서열번호 42로 기재되는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 92로 기재되는 중쇄 가변 영역;
(37) 서열번호 43으로 기재되는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 92로 기재되는 중쇄 가변 영역;
(38) 서열번호 44로 기재되는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 92로 기재되는 중쇄 가변 영역;
(39) 서열번호 44로 기재되는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 62로 기재되는 중쇄 가변 영역;
(40) 서열번호 44로 기재되는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 68로 기재되는 중쇄 가변 영역;
(41) 서열번호 44로 기재되는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 72로 기재되는 중쇄 가변 영역;
(42) 서열번호 44로 기재되는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 82로 기재되는 중쇄 가변 영역;
(43) 서열번호 44로 기재되는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 85로 기재되는 중쇄 가변 영역;
(44) 서열번호 44로 기재되는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 91로 기재되는 중쇄 가변 영역;
(45) 서열번호 48로 기재되는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 92로 기재되는 중쇄 가변 영역;
(46) 서열번호 49로 기재되는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 92로 기재되는 중쇄 가변 영역;
(47) 서열번호 50으로 기재되는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 92로 기재되는 중쇄 가변 영역;
(48) 서열번호 45로 기재되는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 92로 기재되는 중쇄 가변 영역;
(49) 서열번호 46으로 기재되는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 92로 기재되는 중쇄 가변 영역;
(50) 서열번호 47로 기재되는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 92로 기재되는 중쇄 가변 영역;
(51) 서열번호 56으로 기재되는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 92로 기재되는 중쇄 가변 영역;
(52) 서열번호 55로 기재되는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 92로 기재되는 중쇄 가변 영역;
(53) 서열번호 55로 기재되는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 62로 기재되는 중쇄 가변 영역;
(54) 서열번호 55로 기재되는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 68로 기재되는 중쇄 가변 영역;
(55) 서열번호 55로 기재되는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 72로 기재되는 중쇄 가변 영역;
(56) 서열번호 55로 기재되는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 82로 기재되는 중쇄 가변 영역;
(57) 서열번호 55로 기재되는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 85로 기재되는 중쇄 가변 영역;
(58) 서열번호 55로 기재되는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 91로 기재되는 중쇄 가변 영역;
(59) 서열번호 54로 기재되는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 92로 기재되는 중쇄 가변 영역;
(60) 서열번호 54로 기재되는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 62로 기재되는 중쇄 가변 영역;
(61) 서열번호 54로 기재되는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 68로 기재되는 중쇄 가변 영역;
(62) 서열번호 54로 기재되는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 72로 기재되는 중쇄 가변 영역;
(63) 서열번호 54로 기재되는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 82로 기재되는 중쇄 가변 영역;
(64) 서열번호 54로 기재되는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 85로 기재되는 중쇄 가변 영역;
(65) 서열번호 54로 기재되는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 91로 기재되는 중쇄 가변 영역;
(66) 서열번호 53으로 기재되는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 92로 기재되는 중쇄 가변 영역;
(67) 서열번호 51로 기재되는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 92로 기재되는 중쇄 가변 영역;
(68) 서열번호 52로 기재되는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 92로 기재되는 중쇄 가변 영역;
(69) 서열번호 52로 기재되는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 62로 기재되는 중쇄 가변 영역;
(70) 서열번호 52로 기재되는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 91로 기재되는 중쇄 가변 영역;
(71) 서열번호 58로 기재되는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 92로 기재되는 중쇄 가변 영역;
(72) 서열번호 57로 기재되는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 93으로 기재되는 중쇄 가변 영역;
(73) 서열번호 44로 기재되는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 93으로 기재되는 중쇄 가변 영역;
(74) 서열번호 58로 기재되는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 91로 기재되는 중쇄 가변 영역;
(75) 서열번호 55로 기재되는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 93으로 기재되는 중쇄 가변 영역; 및
(76) 서열번호 51로 기재되는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 93으로 기재되는 중쇄 가변 영역.
본 발명의 항체는 IL-4R에 결합할 수 있으며, IL-4R의 길항제로서 작용한다. 바람직하게는, 상기 항체는 IL-4Rα에 결합할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 포유동물 IL-4Rα, 보다 바람직하게는 인간 IL-4Rα, 더욱 바람직하게는 인간 가용성(soluble) IL-4Rα에 결합할 수 있다.
본 발명의 항체의 IL-4Rα에 대한 결합 친화도는 바이아코아(Biacore) 또는 ELISA 방법에 의해 결정될 수 있다. 상기 항체는 100 nM 미만, 10 nM 미만, 1 nM 미만, 0.5 nM 미만 및 심지어 0.1 nM 미만의 친화도로 IL-4Rα에 결합한다.
동일한 조건 하에서, 본 발명의 항체의 기준 항체에 대한 발현 수준의 비는 0.1-3:1, 바람직하게는 0.3-3:1, 더욱 바람직하게는 0.4-3:1, 더욱 바람직하게는 0.5-3:1, 더욱 바람직하게는 0.6-3:1, 더욱 바람직하게는 0.7-3:1, 더욱 바람직하게는 1-3:1 이다.
항체 유형의 관점에서, 본 발명에서 제공되는 항체는 단클론항체, 완전히 또는 부분적으로 인간화된 항체 또는 키메라 항체 일 수 있다.
또는, 상기 항체는 면역글로불린, 바람직하게는 IgA, IgD, IgE, IgG 또는 IgM, 보다 바람직하게는 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 서브타입, 더욱 바람직하게는 IgG2 또는 IgG4 서브타입이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 항체를 포함하는 융합 단백질 또는 접합체를 제공한다. 상기 융합 단백질 또는 접합체는 세포 표면 수용체, 활성 단백질 또는 활성 폴리펩타이드, 아미노산 및 사카라이드와 같은 소분자 화합물, 소분자 중합체 또는 화학적 또는 물리적 방법으로 본 항체에 결합된 항체 등을 화학적으로 변형시키는 기타 부분을 추가로 포함할 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명에서 제공되는 항체의 중쇄 가변 영역 및/또는 경쇄 가변 영역을 코딩할 수 있는 핵산 서열을 제공한다.
바람직하게는, 상기 핵산 서열은 본 발명에서 제공되는 항체의 중쇄 및/또는 경쇄를 코딩할 수 있다
또 다른 측면에서, 본 발명은 또한 본 발명에서 제공되는 핵산 서열을 포함하는 벡터를 제공한다. 상기 벡터는 진핵 발현 벡터, 원핵 발현 벡터, 인공 염색체, 파지 벡터 등일 수 있다.
상기 벡터 또는 핵산 서열은 보존 또는 항체 발현 등의 목적으로 숙주 세포를 형질전환 또는 형질감염 시키는데 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한 상기 벡터 또는 핵산 서열로 형질전환되거나 형질감염된 숙주 세포를 제공한다. 상기 숙주 세포는 박테리아 또는 곤충, 곰팡이, 식물 또는 동물 세포와 같은 임의의 원핵 또는 진핵 세포일 수 있다.
본 발명의 항체는 당 업계에 공지된 임의의 방법을 통해 수득할 수 있다.
예를 들어, 상기 항체의 중쇄 가변 영역 및/또는 경쇄 가변 영역, 또는 중쇄 및/또는 경쇄는 본 발명에서 제공되는 핵산 서열로부터 먼저 수득 된 후, 상기 항체의 임의의 다른 도메인을 갖는 항체와 조립된다. 또는, 본 발명에서 제공되는 숙주 세포는 상기 숙주 세포가 본 발명의 항체의 중쇄 가변 영역 및/또는 경쇄 가변 영역 또는 중쇄 및/또는 경쇄를 발현하도록 허용하는 조건하에서 배양된다.
선택적으로, 상기 방법은 생성된 항체를 회수하는 단계를 추가로 포함한다.
본 발명에서 제공되는 항체, 융합 단백질 또는 접합체, 핵산 서열, 벡터 또는 숙주 세포 또는 상기 방법으로 제조된 항체는 약학적 조성물, 보다 구체적으로는 실제로 필요한 다양한 목적을 위한 약학적 제제에 포함될 수 있다. 따라서, 또 다른 측면에서, 본 발명은 또한 본 발명의 항체, 융합 단백질 또는 접합체, 핵산 서열, 벡터, 숙주 세포 및/또는 상기 방법에 의해 제조 된 항체를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.
선택적으로, 상기 약학적 조성물은 약학적 제제일 수 있다. 상기 약학적 제제는 예를 들어 주사제이다.
상기 약학적 조성물 또는 약학적 제제는 특정 투여 형태에 따라 약학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 추가로 포함할 수 있다.
상기 약학적 조성물 또는 약학적 제제는 하기에 기술된 약제 중 하나 이상을 포함할 수 있다: 알부테롤 등의 항천식제, 로라타딘 등의 항히스타민제, 타 크롤리 무스, 피메크로리무스 등의 면역억제제, 이프 라트로피움 브로마이드 등의 M 수용체 차단제, 몬테루카스트 등의 류코트리엔 수용체 차단제, 테오필린 등의 포스포디 에스테라아제 저해제, 5-아미노살리실산 등의 비스테로이드계 항염증제, 베클로메타존 및 부데소니드 등의 호르몬. 즉, 본 발명에서 제공되는 항체, 융합 단백질 또는 접합체, 핵산 서열, 벡터, 숙주 세포 또는 상기 방법으로 제조된 항체는 필요에 따라 다른 약제와 조합하여 사용될 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 또한 염증 또는 알레르기 질환의 예방, 치료 또는 개선을 위한 약제의 제조 방법에 의해 제조된 항체, 융합 단백질 또는 접합체, 핵산 서열, 벡터, 숙주 세포 또는 항체의 용도를 제공한다.
상기 염증 또는 알레르기 질환은 바람직하게는 알레르기성 피부염, 천식, 호산구성 식도염, 습진, 알레르기성 비염, 비용종, 류마티스성 관절염 등과 같은 자가면역 질환을 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명에서 제공되는 항체, 융합 단백질 또는 접합체, 핵산 서열, 벡터, 숙주 세포 및/또는 상기 방법으로 제조된 항체를 필요로하는 대상에게 투여하는 단계를 포함하는, 염증 또는 알레르기성 질환을 예방, 치료 또는 개선하는 방법을 제공한다.
바람직하게는, 상기 대상은 포유동물이고, 보다 바람직하게는 사람이다.
바람직하게는, 상기 염증 또는 알레르기 질환은 레르기성 피부염, 천식, 호산구성 식도염, 습진, 알레르기성 비염, 비용종, 류마티스성 관절염 등과 같은 자가면역 질환을 포함한다.
다른 약제들도 상기 염증 또는 알레르기성 질환을 예방, 치료 또는 개선하기 위해 조합하여 사용될 수 있으며, 예를 들어, 상기 방법은 하기에 기술된 약제들로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 약제를 필요로하는 대상에게 투여하는 단계를 추가로 포함한다: 알부테롤 등의 항천식제, 로라타딘 등의 항히스타민제, 타 크롤리 무스, 피메크로리무스 등의 면역억제제, 이프 라트로피움 브로마이드 등의 M 수용체 차단제, 몬테루카스트 등의 류코트리엔 수용체 차단제, 테오필린 등의 포스포디 에스테라아제 저해제, 5-아미노살리실산 등의 비스테로이드계 항염증제, 베클로메타존 및 부데소니드 등의 호르몬.
바람직하게는, 상기 약제는 본 발명에서 제공되는 항체, 융합 단백질 또는 접합체, 핵산 서열, 벡터, 숙주 세포 및/또는 상기 방법으로 제조된 항체와 동시에 또는 순차적으로 투여된다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 또한 본 발명에서 제공되는 항체, 융합 단백질 또는 접합체, 핵산 서열, 벡터, 숙주 세포 및/또는 상기 방법으로 제조된 항체를 포함하는 키트를 제공한다.
본 발명은 본 발명의 비제한적인 구현예 및 첨부된 도면과의 조합에 의해 더 잘 이해될 수 있다:
도 1은 본 발명의 항체의 마우스에서의 약물동력학 곡선을 나타낸다.
도 2는 본 발명의 항체의 필리핀 원숭이 (Macaca fascicularis) 신경근에서의 약물동력학 곡선을 나타낸다.
도 3은 FACS에 의해 측정된, 본 발명의 항체와 IL-4Rα를 발현하는 TF-1 세포와의 특이적 결합을 나타내는 패널 3A 내지 3C를 포함한다. 여기서, 패널 3A는 본 발명의 항체 L1012H1031을 첨가하지 않은 경우의 형광 신호를 나타내며; 패널 3B는 본 발명의 항체 L1012H1031을 첨가한 경우의 형광 신호를 나타내고; 패널 3C는 비교를 위한 패널 3A 및 3B의 신호 중첩을 나타낸다.
도 4는 본 발명의 항체와 IL-4Rα 를 발현하는 TF-1 세포와의 특이적인 결합이 FACS에 의해 측정된 바와 같이 시스템에 존재하는 sIL-4Rα 에 의해 차단된다는 것을 보여주는 패널 4A-4D를 포함한다. 여기서, 패널 4A는 본 발명의 항체 L1012H1031을 첨가하지 않은 경우의 형광 신호를 나타내고; 패널 4B는 본 발명의 항체 L1012H1031을 첨가한 경우의 형광 신호를 나타내며; 패널 4C는 본 발명의 항체 L1012H1031 및 sIL-4Rα를 첨가한 경우의 형광 신호를 나타내고; 패널 4D는 비교를 위한 패널 4A-4C의 신호 중첩을 나타낸다.
도 5는 ELISA에 의해 측정된 TARC 및 MDC 방출의 저해에 대한 본 발명의 항체의 효과를 나타내는 패널 5A-5B를 포함한다. 여기서, 패널 5A는 본 발명의 항체 L1020H1031이 TARC 방출을 억제한다는 결과를 나타내며; 패널 5B는 본 발명의 항체 L1020H1031이 MDC 방출을 억제한다는 결과를 나타낸다.
이하, 본 발명은 특정 구현예와 함께 상세히 설명된다. 단, 하기 구현예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 내용이 하기 구현예에 의해 한정되는 것은 아니다.
하기 실시예에서의 실험 방법은 특별히 언급되지 않는한 모두 통상적인 방법이다. 하기 실시예에서 사용된 원료 물질은 특별히 언급되지 않는한, 통상의 생화학 시약 스토어로부터 상업적으로 입수가 가능하다.
하기 실시예에서, 표 1에 나타낸 항체 및 그 효과를 예시적으로 제공하고 검증하였다.
표 1. 본 발명에서 제공되는 예시적인 항체
Figure pct00001
Figure pct00002
실시예 1: 본 발명의 항체의 제조 및 비환원성 SDS-PAGE 겔 전기영동에 의한 발현 수준 측정
상기 항체의 경쇄 가변 영역을 코딩하는 서열을 EcoRI 및 BsiWI 제한효소 부위를 사용하여 벡터 pFUSE2ss-CLIg-hK (Invivogen, 카탈로그 번호: pfuse2ss-hclk)에 삽입하여 경쇄 발현 벡터를 제작하였다. 상기 항체의 중쇄 가변 영역을 코딩하는 서열을 EcoRI 및 NheI 제한효소 부위를 사용하여 벡터 pFUSEss-CHIg-hG2 (Invivogen, 카탈로그 번호: pfusess-hchg2) 또는 벡터vector pFUSEss-CHIg-hG4 (Invivogen, 카탈로그 번호: pfusess-hchg4)에 삽입하여 중쇄 발현 벡터를 제작하였다.
Expi293 세포의 배양 및 형질도입은 Invitrogen 사의 Expi293? Expression System Kit (카탈로그 번호: A14635)의 핸드북에 따라 수행하였다. 세포의 밀도는 형질 감염을 위해 2 × 106 세포/㎖ 로 조정하였고, 세포 배양액 1 ㎖ 당 전술한 중쇄 발현벡터 0.6 ㎍ 및 중쇄 발현벡터 0.4 ㎍을 가하고, 4 일 후에 배양물의 상등액을 수득하였다.
상기 수득한 배양 상등액을 가지고 부록 8, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual"의 제 3 판에 기술된 프로토콜에 따라 비환원성 SDS-PAGE 겔 전기영동을 실시하였다.
BEIJING JUNYI Electrophoresis 사의 겔 스캐닝 이미징 시스템으로 사진을 촬영하고, 일시적 형질감염 후 항체의 발현 수준을 결정하기 위해 Gel-PRO ANALYZER 소프트웨어를 사용하여 정량분석 하였다. 그 결과를 대조군 항체 1의 발현 수준에 대한 상대적 수준으로 나타내었다 (대조군 항체 1은 미국 특허 제 7,186,809 호의 서열번호 10에 기재된 경쇄 가변 영역 및 미국 특허 제 7,186,809 호의 서열번호 12에 기재된 중쇄 가변 영역을 포함하는 미국 특허 제 7,186,809에 따라 구성된다.) (대조군 항체 2는 미국 특허 제 7,638,606 호의 서열번호 6에 기재된 경쇄 가변 영역 및 미국 특허 제 7,638,606 호의 서열번호 42에 기재된 중쇄 가변 영역을 포함하는 미국 특허 제 7,638,606에 따라 구성된다.). 하기 표 2a-2c에 그 결과를 나타내었다.
표 2a. 일시적 형질감염 후 본 발명의 항체의 발현 수준 (발현 수준이 대조군 항체 1 보다 유의하게 높은 항체):
Figure pct00003
표 2b. 일시적 형질감염 후 본 발명의 항체의 발현 수준 (발현 수준이 대조군 항체 1 보다 약간 낮은 항체):
Figure pct00004
표 2c. 일시적 형질감염 후 본 발명의 항체의 발현 수준 (발현 수준이 대조군 항체 1 보다 유의하게 낮은 항체):
Figure pct00005
실시예 2: hIL-4 또는 hIL-13에 의한 TF-1 세포의 증식에 대한 본 발명의 항체의 억제 효과
1. 시약의 준비
hIL-4 (Invivogen, 카탈로그 번호: rhil-4) 용액: hIL-4를 0.1% BSA (Beyotime, 카탈로그 번호: ST023)를 함유하는 PBS 100 ㎕에 용해시켜 100 ㎍/㎖ 농도의 용액을 준비하고, 상기 용해된 hIL-4를 1.5 ㎖ (Nunc) 원심분리 튜브에 튜브당 5 ㎕의 양으로 채운 다음, 상기 튜브를 -20℃의 냉장고에 보관하였다.
WST-1 (Beyotime, 카탈로그 번호: C0036) 용액: WST-1 분말 (C0036-1)에 전자 커플링제 (C0036-2) 5 ㎖를 첨가하고, 상기 WST-1 분말을 완전히 용해시켜 WST-1 용액을 준비하고, 상기 용액을 1.5 ㎖ (Nunc) 원심분리 튜브에 튜브당 620 μl 의 양으로 채운 다음, 상기 튜브를 -20℃의 냉장고에 보관하였다.
2. TF-1 세포의 배양
액체 질소로 동결된 TF-1 세포 (ATCC：CRL-2003TM)를 취하여 37°C의 수조에서 흔들어 신속히 용해시켰다. 용해된 세포 현탁액을 15 ㎖ 원심분리 튜브에 옮기고, 1640 배지를 10 ㎖가 되도록 첨가하였다. 상기 튜브를 800 rpm에서 5 분 동안 원심분리한 후, 그 상등액을 흡인하여 세포 펠릿을 얻어 다시 한번 세척하였다. 10% FBS 및 2 ng/㎖의 GM-CSF (Sino Biological, 카탈로그 번호: 10015-H01H)를 함유하는 1640 배지 10 ㎖를 상기 튜브에 첨가하여 1 Х 105 - 1 Х 106 세포/㎖의 세포 밀도를 얻었다. 상기 현탁액을 T75 세포 배양 플라스크 (Nunc)에 옮기고, 37°C, 5% CO2 배양기 (Thermo)에서 정적 배양 하였다. 2 ~ 3 일마다 세포 현탁액을 꺼내서 800 rpm에서 5 분간 원심분리하고, 세포를 10 ㎖의 배지에 재현탁시켰다. 이어서, 1Х106 개의 세포를 계수하여 새로운 T75 세포 배양 플라스크에 옮기고, 배지를 10 ㎖가 되도록 보충하였다. 상기 세포는 증식 차단 실험을 위해 양호한 상태 (세포는 개별적으로 현탁시켰을 때 밝았으며 약간 불규칙한 모양을 보였다.)에 도달시키기 위해 2-3 회 연속적으로 계대배양 하였다.
3. 항체의 준비와 정제
a) 본 발명의 항체의 세포 배양 상등액 시료: Expi293 세포를 항체의 다른 유전자 그룹을 갖는 플라스미드로 형질감염시키고, 형질감염 4 일 후에 200 ㎕의 세포 배양 상등액을 취하여 800 rpm에서 5 분간 원심분리 하였다. 상등액을 0.22 ㎛의 구멍 크기의 필터를 통해 여과하고 증식 차단 실험에 사용하였다.
b) 본 발명의 정제된 항체 샘플: 본 발명의 각각의 항체에 대해, 상기 항체를 발현하는 세포의 배양 상등액을 0.22 ㎛ 필터에 통과시킨 후, 정화 시스템 GE AKTA 정제기 10에서 GE MabSelect Sure (카탈로그 번호: 11003494) 단백질 A 친화 크로마토 그래피 컬럼으로 정제하였다. 상기 정제된 항체를 수득하고 Amicon 한외여과 농축기 (카탈로그 번호: UFC903096)를 사용하여 농축한 다음 정량하였다. 상기 항체를 PBS를 사용하여 0 내지 1 ㎍/㎖ 로 희석하여 증식 차단 실험에 사용하였다.
4. 증식 차단 실험
잘 자란 T75 세포 플라스크의 세포를 취하여 15 ㎖ 원심분리 튜브로 옮긴 다음 800 rpm에서 5 분간 원심분리 하였다. 상등액은 버리고 세포 펠렛을 10 ㎖의 PBS로 재현탁시킨 후, 800 rpm에서 5 분간 원심분리 하였다. 상등액은 버리고 세포 펠렛을 10% FBS를 함유하는 1640 배지 (GM-CSF가 없는) 10 ㎖에 재현탁시킨 후, 800 rpm에서 5 분간 원심분리 하였다. 상등액은 버리고 세포 펠렛을 10% FBS를 함유하는 1640 배지 (GM-CSF가 없는) 5 ㎖에 재현탁시켰다. 세포를 계수하고 배지를 보충하여 5 Х 105 세포/㎖의 세포 밀도로 조정하였다. 상기 세포 현탁액을 웰 당 80㎕의 부피로 96-웰 플레이트에 첨가하였다 (바깥쪽 웰은 증발을 방지하기 위해 세포를 넣지 않았다.). 본 발명의 각각의 항체에 대해, 상이한 농도를 갖는 정제된 항체 10 ㎕ 또는 상응하는 세포 배양 상등액 10 ㎕를 96-웰 플레이트 (3 개의 동일한 웰)의 세포에 첨가하였다. 이어서, hIL-4를 10% FBS를 함유하는 1640 배지를 이용하여 50 ng/㎖로 희석하고 96-웰 플레이트 내의 상응하는 각 웰에 10 ㎕의 부피로 첨가하여, 최종 세포밀도가 4Х105 세포/㎖, hIL-4의 농도는 5 ng/㎖, 96-웰 플레이트의 각 웰의 부피는 100 μl가 되도록 하였다. hIL-4 또는 항체가 첨가되지 않은 음성 대조군 (3 개의 동일한 웰)을 설정하고 동일한 수의 세포 및 동일한 부피의 배양 배지를 첨가하였다. 한편, 동일한 농도의 hIL-4 및 동일한 부피의 배지를 첨가한 양성 대조군 (3 개의 동일한 웰)을 설정하고, 이 군에는 항체를 첨가하지 않았다. 상기 96-웰 세포 플레이트의 외측 링 내의 각 웰에 200㎕의 PBS를 첨가하여 내측 링 내 액체의 증발을 방지 하였다. 상기 96-웰 세포 플레이트를 5% CO2 배양기에 넣어 37°C 에서 정적 배양 하였다.
상기 실험을 500 ng/㎖의 hIL-13 (세포에 첨가된 후 최종 농도는 50 ng/㎖)을 사용하여 동일한 과정으로 반복 하였다
5. 데이터 통계
상기 96-웰 세포 플레이트를 5% CO2 배양기에서 72 시간 동안 정적 배양한 후, 10㎕의 WST-1 용액을 각 웰의 세포에 첨가하였다. 상기 96-웰 세포 플레이트를 5% CO2 배양기에 넣어 37°C 에서 추가로 정적 배양 하였다. 24 시간 후, 상기 96-웰 플레이트를 플렉스스테이션 3 (Molecular Devices)에 넣고 OD450-OD650 값을 판독하였다.
본 발명의 항체의 배양 상등액에서, OD450-OD650 값 (OD 값)과 양성 대조군 및 음성 대조군의 값을 사용하여 억제율을 다음과 같이 계산 하였다: 억제율 = (형질감염된 세포 상등액의 OD 값 - 양성 대조군의 OD 값) / (음성 대조군의 OD 값 - 양성 대조군의 OD 값) Х 100%. 본 발명의 항체의 hIL-4 또는 hIL-13에 의한 TF-1 세포의 증식에 대한 차단 효과를 하기 표 3a 내지 표 3b에 나타내었다.
상이한 농도를 갖는 본 발명의 정제된 항체에 대해, 측정된 OD450-OD650 데이터를 음성 대조군의 값을 가장 낮은 것으로 양성 대조군의 값을 가장 높은 것으로 설정된 prism5 소프트웨어에 입력하고, 항체 농도의 로그(logarithm)를 취하였다. OD450-OD650 값에 대한 항체 농도의 곡선을 prism5 소프트웨어로 맞추었다. 계산된 IC50값을 하기 표 4에 나타내었다.
표 3a. TF-1 세포의 증식 활성에 대한 본 발명의 항체의 억제 효과의 스크리닝 결과 (대조군 항체 1과 비교하여 증가된 저해율을 갖는 항체)
Figure pct00006
표 3b. TF-1 세포의 증식 활성에 대한 본 발명의 항체의 억제 효과의 스크리닝 결과 (대조군 항체 1과 비교하여 감소된 저해율을 갖는 항체)
Figure pct00007
표 4. 일시적 형질감염 후 정제된 항체 (600-900 ㎖)의 활성 데이터
Figure pct00008
실시예 3 ELISA에 의한 sIL-4Rα 에 대한 본 발명의 항체의 결합 능력의 검출
1. 시약의 준비
sIL-4Rα (PEPRO TECH, 카탈로그 번호: 200-04R) 용액: sIL-4Rα 를 취하여 거기에 1 ㎖의 ddH2O를 첨가하고 상하로 혼합하여 100 ㎍/㎖의 용액을 준비하였다. 상기 용액은 포장 후 -20℃의 냉장고에 보관하였다.
테스트할 샘플: 본 발명의 각 항체에 대하여, 일시적 형질감염 후 상기 항체를 발현하는 Expi293 세포의 배양 상등액 (배지는 Expi293 발현 배지 (Invitrogen, 카탈로그 번호: A1435102)를 사용하였고, 배양은 8% CO2 incubator 에서 100 rpm으로 4 일 동안 현탁배양 하였다.) 10 ㎕ 및 2 ㎕를 각각 990 ㎕ 및 998 ㎕의 PBS에 첨가하여 1:100 및 1:500 의 항체 샘플을 준비하였다.
대조군 샘플: 음성 대조군 샘플로서, 정상 세포의 배양 상등액 (형질감염 시키지 않은 Expi293 세포; 배지는 Expi293 발현 배지 (Invitrogen, 카탈로그 번호: A1435102)를 사용하였고, 배양은 8% CO2 incubator 에서 100 rpm으로 4 일 동안 현탁배양 하였다.)도 또한 1:100 및 1:500으로 희석하여 준비하였다.
2. ELISA에 의한 검출
9.90 ㎖의 PBS에 100 ㎍/㎖의 sIL-4Rα 용액 100 ㎕를 첨가하고 상하로 혼합하여 1.0 ㎍/㎖의 항원 코팅 완충액을 얻었다. 제조된 항원 코팅 완충액을 96-웰 ELISA 플레이트 (Corning)에 웰 당 100㎕의 부피로 첨가 하였다. 상기 96-웰 ELISA 플레이트를 4°C의 냉장고에서 밤새 배양하였다. 다음 날, 상기 용액을 버리고, 2% BSA를 함유하는 PBS를 상기 96-웰 ELISA 플레이트에 웰 당 300㎕의 부피로 첨가하였다. 상기 96-웰 ELISA 플레이트를 4°C의 냉장고에서 2 시간 동안 배양하였다. 이어서, 2% BSA를 함유하는 PBS를 버리고 상기 플레이트를 PBST로 3 회 세척하였다. 테스트할 희석된 항체를 순차적으로 상응하는 웰에 첨가하는 한편, 음성 대조군 샘플로서 정상 세포 배양 상등액을 첨가하였다. 각 샘플 당 3 개의 동일한 웰에 웰당 100㎕의 부피로 샘플을 첨가하였다. 상기 ELISA 플레이트를 보존 필름으로 감싸고 (또는 덮음) 10°C 항온 배양기에서 1 시간 동안 배양하였다. 이어서, 상기 96-웰 ELISA 플레이트를 꺼내고, 그 용액을 버렸다. PBST로 3 회 세척한 후, TMB 용액 (Solarbio, 카탈로그 번호: PR1200)을 상기 96-웰 ELISA 플레이트에 웰당 100 ㎕의 부피로 첨가하였다. 상기 96-웰 ELISA 플레이트를 실온에서 5 분간 방치하고 즉시 2 M H2SO4 용액을 첨가하여 반응을 종결시켰다. 상기 96-웰 ELISA 플레이트를 플렉스스테이션 3 (Molecular Devices)에 넣어 OD450 값을 판독하고 데이터를 수집, 계산 및 분석하였다. 그 결과는 대조군 항체 1의 친화도에 대한 상대적 값으로 나타내었다. 결과는 하기 표 5a-5c 에 나타내었다.
표 5a. sIL-4Rα에 대한 본 발명의 항체의 친화도 (대조군 항체 1보다 유의하게 큰 친화도를 보이는 항체)
Figure pct00009
표 5b. sIL-4Rα에 대한 본 발명의 항체의 친화도 (대조군 항체 1보다 같거나 약간 낮은 친화도를 보이는 항체)
Figure pct00010
표 5c. sIL-4Rα에 대한 본 발명의 항체의 친화도 (대조군 항체 1보다 유의하게 낮은 친화도를 보이는 항체)
Figure pct00011
Figure pct00012
실시예 4: 마우스에서의 본 발명의 항체의 약동학
항체를 더 스크리닝하기 위해 일련의 약동학 실험을 마우스에서 수행하였다.
6-8 주령의 SPF Balb/c 마우스를 선별하여 항체 (본 발명의 항체 또는 대조군 항체 2)를 5 mg/kg (마우스 중량)의 용량으로 피하주사로 주입 하였다. 투여 전 (0 시간) 및 투여 후 2, 8, 24, 48, 72, 120, 168, 216, 264, 336 시간에 혈액 샘플을 채취하였다. 혈액 샘플링을 위해, 동물을 이소플루란 (isoflurane)을 흡입시켜 마취시키고, 각 동물당 0.1 ㎖ 의 혈액 샘플을 안와 정맥총으로부터 채취하였다; 투여 336 시간 후, 이소플루란을 흡입시켜 동물을 마취시킨 다음 하대정맥에서 혈액을 채취한 후 안락사시켰다.
혈액 샘플에 항응고제는 첨가하지 않았고, 혈액 샘플링 후 2 시간 이내에 실온에서 1500 g로 10 분간 원심분리하여 각 샘플로부터 혈청을 분리 하였다. 수득한 상등액을 즉시 새로운 원심분리 튜브로 옮긴 다음 -70°C에서 임시 보관하였다. 마우스의 항체 농도를 ELISA로 측정하였다:
1. 시약의 준비
sIL-4Rα (PEPRO TECH, 카탈로그 번호: 200-04R) 용액: sIL-4Rα 를 취하여 거기에 1 ㎖의 ddH2O를 첨가하고 상하로 혼합하여 100 ㎍/㎖의 용액을 준비하였다. 상기 용액은 포장 후 -20℃의 냉장고에 보관하였다.
테스트할 샘플: 상이한 시점에서 수집된 혈청 1 ㎕를 1% BSA를 함유하는 999 ㎕의 PBS에 첨가하여 1:1000 희석의 혈청 샘플을 준비하였다.
표준 샘플: 시험하고자 하는 항체를 1% BSA 및 0.1% 정상 동물 혈청 (Beyotime, 카탈로그 번호: ST023)을 함유하는 PBS로 희석하여 0.1㎍/㎖ 농도로 준비하였다. 그 후, 1% BSA 및 0.1% 정상 동물 혈청을 포함하는 200, 400, 600, 800, 900, 950, 990 및 1000㎕의 PBS를 각각 800, 600, 400, 200, 100, 50, 10 및 0㎕ 의 시험하고자하는 0.1 ㎍/㎖의 항체에 첨가하여, 본 발명의 항체의 표준 샘플을 각각 80, 60, 40, 20, 10, 5, 1 또는 0 ng/㎖의 최종 농도로 제조 하였다.
2. ELISA에 의한 검출
9.75 ㎖의 PBS에 250 μl의 100 μg/㎖ sIL-4Rα 용액을 첨가하고 상하로 혼합하여 2.5 ㎍/㎖의 항원 코팅 완충액을 얻었다. 제조된 항원 코팅 완충액을 96-웰 ELISA 플레이트 (Corning)에 웰 당 100㎕의 부피로 첨가 하였다. 상기 96-웰 ELISA 플레이트를 보존 필름으로 감싸고 (또는 덮음) 4°C의 냉장고에서 밤새 배양하였다. 다음날, 상기96-웰 ELISA 플레이트를 꺼내고, 그 용액을 버리고 2% BSA를 함유하는 PBS를 웰당 300 ㎕의 부피로 첨가하였다. 상기 96-웰 ELISA 플레이트를 보존 필름으로 감싸고 (또는 덮음) 4°C의 냉장고에서 2 시간 동안 배양하였다. 그 후, 상기 96-웰 ELISA 플레이트를 꺼내어 그 용액을 버리고 PBST로 3 회 세척하였다.
희석된 표준 항체 및 검출하고자 하는 혈청을 대응하는 웰에 순차적으로 첨가하고, 각 샘플 당 3 개의 동일한 웰에 웰당 100㎕의 부피로 샘플을 첨가하였다. 상기 ELISA 플레이트를 보존 필름으로 감싸고 (또는 덮음) 실온에서 1 시간 동안 배양하였다. 이어서, 상기 96-웰 ELISA 플레이트의 용액을 버리고 PBST로 3 회 세척하였다. 그 후, TMB 용액 (Solarbio, 카탈로그 번호: PR1200)을 상기 96-웰 ELISA 플레이트에 웰당 100 ㎕의 부피로 첨가하였다. 상기 96-웰 ELISA 플레이트를 실온에서 5 분간 방치하고 즉시 2 M H2SO4 용액을 첨가하여 반응을 종결시켰다. 상기 96-웰 ELISA 플레이트를 플렉스스테이션 3 (Molecular Devices)에 넣어 OD450 값을 판독하고 데이터를 수집하고 그 결과를 Winnonlin 소프트웨어를 사용하여 계산하였다. 약동학 결과는 도 1 및 하기 표 6에 나타내었다.
표 6. 본 발명의 항체의 마우스에서의 약동학 결과
Figure pct00013
실시예 5: 필리핀원숭이 (Macaca fascicularis)에서의 본 발명의 항체의 약동학
항체를 더 스크리닝하기 위해 일련의 약동학 실험을 필리핀원숭이 (Macaca fascicularis)에서 수행하였다.
2-5 Kg의 몸무게를 가진 3-5 세의 필리핀원숭이 (Macaca fascicularis)를 선별하여 항체 (본 발명의 항체 또는 대조군 항체 2)를 5 mg/kg (필리핀원숭이 중량)의 용량으로 피하주사로 주입 하였다. 상기 항체 또는 대조군 항체 2를 일회용 무균 주사기로 정확하게 추출하고, 동물의 대퇴부의 내측의 다지점에 지점 당 주사 용량을 2㎖ 이하의 용량으로 피하주사를 실시하였다. 투여 전 (0 시간) 및 투여 후 0.5, 2, 4, 8, 24, 48, 72, 120, 168, 240, 336, 432, 504, 600, 및 672 시간에서 동물의 뒷다리 피하 정맥으로부터 전혈 샘플을 채취 하였다. 각 동물에게서 채취한 혈액량은 매회 약 0.1 ㎖ 이었다.
혈액 샘플에 항응고제는 첨가하지 않았고, 혈액 샘플링 후 2 시간 이내에 실온에서 1500 g로 10 분간 원심분리하여 각 샘플로부터 혈청을 분리 하였다. 수득한 상등액을 즉시 새로운 원심분리 튜브로 옮긴 다음 -70°C에서 임시 보관하였다. 필리핀원숭이 (Macaca fascicularis)에서의 항체 농도를 실시예 4에 기재된 방법에 따라 측정하였다. 약동학 결과는 도 2와 하기 표 7에 나타내었다.
표 7. 본 발명의 항체의 필리핀원숭이에서의 약동학 결과
Figure pct00014
실시예 6: FACS에 의한 TF-1 세포에 대한 본 발명의 항체의 결합 검출
1. 세포 배양
액체 질소로 동결된 TF-1 세포 (ATCC: CRL-2003TM)를 취하여 37℃ 수조에서 부드럽게 흔들어 용해시켰다. 용해시킨 세포 현탁액을 15 ㎖ 원심분리 튜브에 옮기고 1640 배지 (Hyclone, 카탈로그 번호: SH30809.01B)를 10 ㎖ 첨가하였다. 상기 튜브를 800 rpm에서 5 분간 원심분리하고, 그 상등액을 흡인 제거한 후 얻은 세포 펠렛을 다시 한번 세척하였다. 세포 밀도는 10% FBS (Hyclone, 카탈로그 번호: SV30184.02) 및 2 ng/㎖의 GM-CSF (Sino Biological, 카탈로그 번호: 10015-H01H)를 포함하는 1640 배지를 이용하여 1 Х 105 - 1 Х 106 세포/㎖가 되도록 하였다. 상기 현탁액을 T75 세포 배양 플라스크 (Nunc)에 옮기고, 37°C, 5% CO2 배양기 (Thermo)에서 정적 배양 하였다. 2 ~ 3 일마다 세포 현탁액을 꺼내서 800 rpm에서 5 분간 원심분리하고, 세포를 10 ㎖의 배지에 재현탁시켰다. 이어서, 1Х106 개의 세포를 계수하여 새로운 T75 세포 배양 플라스크에 옮기고, 배지를 10 ㎖가 되도록 보충하였다. 상기 세포는 실험을 위해 양호한 상태 (세포는 개별적으로 현탁시켰을 때 밝았으며 약간 불규칙한 모양을 보였다.)에 도달시키기 위해 2-3 회 연속적으로 계대배양 하였다.
2. 세포 처리
Tf-1 세포를 취하여 현미경 하에서 계수하였다. 상기 세포를 3 개의 그룹으로 나누어 각각 3 개의 1.5 ㎖ 원심 분리 튜브에 넣었다. 각 그룹의 세포 수는 1 x 106 이었다. 상기 세포를 800 rpm에서 5 분간 원심분리 한 후, 1% BSA를 함유하는 차가운 PBS 1 ㎖에 재현탁시켜 다시 한번 세척하였다. 이어서, 상기 세포를 800 rpm에서 5 분간 원심분리하고, 1% BSA를 함유하는 차가운 PBS 45㎕를 각 원심분리 튜브에 첨가하여 세포를 재현탁시킨 후, 5㎕ (500㎍/㎖)의 본 발명의 항체 L1021H1031, L1020H1031 또는 L1012H1031을 첫번째 원심분리 튜브에 첨가하고, 5 ㎕의 PBS를 음성 대조군으로서 두 번째 원심분리 튜브에 첨가하였다. 상기 세포를 얼음 위에서 45 분 동안 방치한 다음 800 rpm으로 5 분간 원심분리 하였다. 그 후, 1% BSA를 함유하는 차가운 PBS 1 ㎖에 재현탁하여 다시 한번 세척하고, 800 rpm에서 5 분간 원심분리 하였다. 각 원심분리 튜브에 1% BSA를 포함하는 차가운 PBS 499 μl를 가하여 세포를 재현탁시킨 후 FITC 표지된 염소 항-인간 IgG (H+L) (Beyotime, 카탈로그 번호: A0556) 를 1 ㎕ 첨가하였다. 상기 튜브를 얼음 위에서 45 분 동안 방치한 후, 세포를 800 rpm에서 5 분간 원심분리하고 1% BSA를 함유하는 차가운 PBS 1 ㎖에 재현탁시켜 다시 한번 세척하여 검출을 위한 세포를 수득하였다.
3. FACS에 의한 검출
FACS 장비 및 운영 체제는 적절한 프로토콜에 따라 실행되었다. 적절한 매개 변수를 설정한 후, 상기 세포를 검출 튜브에 첨가하여 FL1 채널의 형광신호를 검출하였다. 결과는 FlowJo 7.6 소프트웨어를 사용하여 분석하였으며 그 결과는 도 3의 패널 3A-3C에 나타내었다. 본 발명의 항체는 IL-4Rα 를 발현하는 TF-1 세포에 특이적으로 결합할 수 있음을 알 수 있다.
실시예 7: FACS에 의한 TF-1 세포에 대한 항체의 결합에 대한 가용성 hIL-4Rα (sIL-4Rα) 의 차단 효과 검출
1. 시약의 준비
hIL-4 (Invivogen, 카탈로그 번호: rhil-4) 용액을 실시예 2에 기술된 바와 같이 제조하였다.
2. 세포 배양
TF-1 세포 (ATCC: CRL-2003TM)를 실시예 6에 기술된 바와 같이 배양하였다.
3. 본 발명의 항체와 sIL-4Rα의 혼합
5 ㎕ (100 ㎍/㎖)의 본 발명의 항체 L1021H1031, L1020H1031 또는 L1012H1031 을 10 ㎕ (100 ㎍/㎖)의 sIL-4Rα 와 1.5 ㎖ 원심분리 튜브에서 2 : 1의 몰비로 균일하게 혼합하였다. 10 ㎕의 PBS와 5 ㎕의 본 발명의 항체 L1021H1031, L1020H1031 또는 L1012H1031의 혼합물을 양성 대조군으로 사용하였고 15 ㎕의 PBS를 음성 대조군으로 사용하였다. 상기 원심분리 튜브를 1 시간 동안 37℃ 배양기에 두었다.
4. 세포 처리
TF-1 세포를 취하여 현미경으로 계수하였다. 상기 세포를 4 그룹으로 나누어 각각 1.5 ㎖ 원심분리 튜브 4 개에 넣었다. 각 그룹의 세포수는 1 x 106이었다. 상기 세포를 800 rpm에서 5 분간 원심분리 한 후 1 % BSA가 함유된 1 ㎖의 차가운 PBS에 재현탁하여 다시 한번 세척하였다. 이어서, 상기 세포를 800 rpm에서 5 분간 원심분리하고, 1% BSA를 포함하는 차가운 PBS를 각각의 원심분리 튜브에 35㎕ 씩 첨가하여 세포를 재현탁시킨 다음, 단계 3 에서 준비한 각 항체 혼합물 및 대조군을 각각의 튜브에 15㎕ 씩 첨가하였다. 상기 튜브를 얼음에서 45 분간 방치한 후 세포를 800 rpm에서 5 분간 원심분리하고 1% BSA를 포함하는 1 ㎖의 PBS에 재현탁시킨 후 다시 한번 세척하고 800 rpm에서 5 분간 원심분리 하였다. 각 원심분리 튜브에 1% BSA를 포함하는 차가운 PBS 499 ㎕를 가하고 세포를 재현탁시킨 후 FITC 표지된 염소 항-인간 IgG (H+L) (Beyotime, 카탈로그 번호: A0556)를 1 ㎕ 씩 첨가하였다. 상기 튜브를 얼음에서 45 분간 방치한 후, 세포를 800 rpm에서 5 분간 원심분리하고 1% BSA를 포함하는 1 ㎖의 차가운 PBS에 재현탁시켜 다시 한번 세척하였다. 그 결과, 검출을 위한 세포를 수득하였다.
5. FACS에 의한 검출
FACS 장비 및 운영 체제는 적절한 프로토콜에 따라 실행되었다. 적절한 매개 변수를 설정한 후, 상기 세포를 검출 튜브에 첨가하여 FL1 채널의 형광신호를 검출하였다. 결과는 FlowJo 7.6 소프트웨어를 사용하여 분석하였으며 그 결과는 도 4의 패널 4A-4D에 나타내었다. TF-1 세포에 대한 본 발명의 항체의 특이적 결합을 sIL-4Rα가 특이 적으로 및 효과적으로 차단할 수 있음을 알 수 있었다.
실시예 8: 바이아코아에 의한 항체의 친화도 측정
CM5 칩에 항-인간 Fc (AHC) 항체 (GE Healthcare)를 결합시킨 후, 본 발명의 항체를 AHC에 의해 각각 포획하였다. 이어서, 본 발명의 항체가 포획된 칩의 표면에 상이한 농도의 인간 sIL-4Rα를 흘려 넣었다. 포획 및 결합을 위해, 본 발명의 항체를 2㎍/㎖로 희석하고 항원 sIL-4Rα는 0.39, 0.78, 1.56, 3.13, 6.25, 12.5, 25.0, 50.0 및 100.0 nM로 희석하였다. 실험 방법은 바이아코아 T200 제어 소프트웨어에서 확립되었고, 그 후 검출을 위한 실험 프로그램을 실행하였다. 그 결과를 하기 표 8에 나타내었다.
표 8. 항체 친화도의 검출 결과
Figure pct00015
실시예 9: ELISA로 조사한 TARC 및 MDC 방출에 대한 본 발명의 항체의 억제 효과
헤파린으로 응고를 방지한 혈액 10 ㎖ 를 상온에서 PBS와 1 : 1의 비율로 혼합한 후 상기 혼합물을 미리 준비한 인간 림프구 분리액 (Solarbio, 카탈로그 번호: P8610) 20㎖ 에 조심스럽게 첨가하였다. 상기 혼합액을 실온에서 1500 rpm으로 30 분 동안 원심분리 한 후, PBMC 층을 조심스럽게 흡인하고 PBS로 2 회 세척하였다. 상기 세포를 최종적으로 10% FBS 및 200 IU/㎖의 IL-2를 포함하는 1640 배지로 희석한 다음 웰당 1 x 106 세포로 24-웰 플레이트에 첨가하였다. 그 후, 상기 플레이트에 항체 L1020H1031을 최종 농도 1000, 300, 100, 30 또는 10 ng/㎖로 첨가하였고, 이어서 최종 농도 10 ng/㎖ 로 IL-4 (또는 최종 농도 100 ng/㎖ 인 IL-13)를 첨가하였다. 검출은 72 시간 배양 후 인간 TARC ELISA 키트 (Abcam, 카탈로그 번호: ab183366) 또는 인간 MDC ELISA 키트 (Abcam, 카탈로그 번호: ab179885)를 사용하여 제공된 방법에 따라 수행하였다.
그 결과를 도 5의 패널 5A 내지 5B에 나타내었으며, 이는 본 발명의 항체가 TARC 및 MDC 방출을 효과적으로 억제할 수 있고 항체 농도의 증가에 따라 방출에 대한 억제 효과 역시 증가함을 보여준다.
실시예 10: 본 발명의 항체의 약동학 및 발현 수준에 대한 특정 아미노산의 효과
본 발명의 항체의 생체내 약동학은 동물에서의 항체의 약동학상의 특정 위치에서 특정 아미노산의 가능한 영향을 조사하기 위해서 이 실시예에서 추가로 검출되고 비교되었다. 구체적인 실험 방법은 실시예 4에 기재된 방법과 동일하였으며, 그 결과를 하기 표 9에 나타내었다.
표 9. 본 발명의 항체의 생체내 약동학 검출 결과
Figure pct00016
특정 서열에서, 상기 항체의 (CDR3에서) 중쇄 H1031 (서열번호 91)의 서열중 103 번 위치의 아미노산은 Asp (103Asp)이고, 104 번 위치의 아미노산은 Tyr (104Tyr) 이었다. 중쇄에서 103Asp 및 104Tyr을 갖지 않는 항체와 비교할 때, 103Asp 및 104Tyr을 갖는 본 발명의 항체는 약물-시간 곡선 하에서 2 내지 4 배 더 높은 영역 및 약 70% 감소된 제거율을 보인다.
본 발명의 항체의 발현 수준은 또한 상기 항체의 발현에 대한 특정 위치에서의 특정 아미노산의 가능한 효과를 조사하기 위해 검출 및 비교된다. 실시예 1에 따라 Expi293 세포의 배양 및 형질감염을 수행한 후, 배양 상등액을 수득하여 0.22 ㎛ 필터에 통과시킨 후 정제 시스템 (GE AKTA purifier 10) 에서 GE MabSelect Sure (카탈로그 번호: 11003494) 단백질 A 친화성 크로마토그래피 칼럼으로 정제하였다. 정제된 항체를 수득하고 Amicon 한외여과 농축 튜브 (카탈로그 번호: UFC903096)를 사용하여 농축한 다음 정량하였다. 정량 결과를 하기 표 10에 나타내었다.
표 10. 본 발명의 항체의 발현량의 검출 결과
Figure pct00017
특정 서열에서, 상기 항체의 (CDR1에서) L1012 (서열번호 44), L1020 (서열번호 55) 또는 L1023 (서열번호 51)의 서열중 31 번 위치의 아미노산은 Ser (31Ser) 이었다. 경쇄에 31Ser를 갖지 않는 항체와 비교하여, 31Ser를 갖는 본 발명의 항체는 2 내지 5 배 더 높은 발현 수준을 보였다.
본 발명의 구현예들에 대한 상기 설명은 본 발명을 한정하기 위한것이 아니며, 당 업자는 본 발명의 청구 범위의 보호 범위 내에서 본 발명에 따른 다양한 변경 및 변형을 할 수 있다.
<110> SUZHOU CONNECT BIOPHARMACEUTICALS LTD <120> ANTIBODY FOR BINDING TO INTERLEUKIN 4 RECEPTOR <130> 2018FPI-08-004/CN <150> CN 201610399254.4 <151> 2016-06-08 <160> 94 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LCDR1-1 <400> 1 Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Ser Tyr Leu Ala 1 5 10 <210> 2 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LCDR1-2 <400> 2 Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala 1 5 10 <210> 3 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LCDR2-1 <400> 3 Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr 1 5 <210> 4 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LCDR2-2 <400> 4 Gly Ala Ser Ser Arg Ala Pro 1 5 <210> 5 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LCDR3-1 <400> 5 Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Pro Trp Thr 1 5 10 <210> 6 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LCDR3-2 <400> 6 Gln Gln Tyr Asp His Ser Pro Pro Trp Thr 1 5 10 <210> 7 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial 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110 Val Ser Ser 115 <210> 89 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH H1022 <400> 89 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val His Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Gly Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Asn 20 25 30 Ala Met Phe Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Gly Ile Gly Thr Gly Gly Ala Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Gly Arg Tyr Tyr Phe Pro Trp Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser 115 <210> 90 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH H1032 <400> 90 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Asn 20 25 30 Ala Met Phe Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Gly Ile Gly Thr Gly Gly Ala Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Met Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Gly Arg Tyr Tyr Phe Pro Trp Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser 115 <210> 91 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH H1031 <400> 91 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Asn 20 25 30 Ala Met Phe Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Gly Ile Gly Thr Gly Gly Ala Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Gly Arg Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser 115 <210> 92 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH H1000 <400> 92 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val His Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Gly Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Asn 20 25 30 Ala Met Phe Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Gly Ile Gly Thr Gly Gly Ala Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Met Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Gly Arg Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser 115 <210> 93 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH H1001 <400> 93 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Asn 20 25 30 Ala Met Phe Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Gly Ile Gly Thr Gly Gly Ala Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Gly Arg Tyr Tyr Phe Pro Trp Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser 115 <210> 94 <211> 209 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 94 Gly Asn Met Lys Val Leu Gln Glu Pro Thr Cys Val Ser Asp Tyr Met 1 5 10 15 Ser Ile Ser Thr Cys Glu Trp Lys Met Asn Gly Pro Thr Asn Cys Ser 20 25 30 Thr Glu Leu Arg Leu Leu Tyr Gln Leu Val Phe Leu Leu Ser Glu Ala 35 40 45 His Thr Cys Ile Pro Glu Asn Asn Gly Gly Ala Gly Cys Val Cys His 50 55 60 Leu Leu Met Asp Asp Val Val Ser Ala Asp Asn Tyr Thr Leu Asp Leu 65 70 75 80 Trp Ala Gly Gln Gln Leu Leu Trp Lys Gly Ser Phe Lys Pro Ser Glu 85 90 95 His Val Lys Pro Arg Ala Pro Gly Asn Leu Thr Val His Thr Asn Val 100 105 110 Ser Asp Thr Leu Leu Leu Thr Trp Ser Asn Pro Tyr Pro Pro Asp Asn 115 120 125 Tyr Leu Tyr Asn His Leu Thr Tyr Ala Val Asn Ile Trp Ser Glu Asn 130 135 140 Asp Pro Ala Asp Phe Arg Ile Tyr Asn Val Thr Tyr Leu Glu Pro Ser 145 150 155 160 Leu Arg Ile Ala Ala Ser Thr Leu Lys Ser Gly Ile Ser Tyr Arg Ala 165 170 175 Arg Val Arg Ala Trp Ala Gln Cys Tyr Asn Thr Thr Trp Ser Glu Trp 180 185 190 Ser Pro Ser Thr Lys Trp His Asn Ser Tyr Arg Glu Pro Phe Glu Gln 195 200 205 His

Claims (16)

  1. 서열번호 58로 기재되는 서열의 아미노산 잔기 번호를 참조하여, 그 안에 포함된 경쇄 가변 영역(light chain variable region)의 31번 위치에 세린(serine)(31Ser)을 가지고, 서열번호 93으로 기재되는 서열의 아미노산 잔기 번호를 참조하여, 그 안에 포함된 중쇄 가변 영역(heavy chain variable region)의 103번 위치에 아스파르트산(aspartic acid)(103Asp) 및 104번 위치에 티로신(tyrosine)(104Tyr)을 갖는, 인터루킨 4(interleukin 4, IL-4) 수용체(IL-4R)에 결합할 수 있는 항체.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 항체의 경쇄 가변 영역은 서열번호 2로 기재되는 CDR1을 포함하고, 상기 항체의 중쇄 가변 영역은 서열번호 19로 기재되는 CDR3을 포함하며;
    바람직하게는, 상기 항체의 경쇄 가변 영역은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 CDR1, CDR2 및 CDR3의 조합을 포함하고:
    (1) 서열번호 2로 기재되는 CDR1, 서열번호 3으로 기재되는 CDR2 및 서열번호 5로 기재되는 CDR3;
    (2) 서열번호 2로 기재되는 CDR1, 서열번호 4로 기재되는 CDR2 및 서열번호 5로 기재되는 CDR3;
    (3) 서열번호 2로 기재되는 CDR1, 서열번호 3으로 기재되는 CDR2 및 서열번호 6으로 기재되는 CDR3;
    (4) 서열번호 2로 기재되는 CDR1, 서열번호 3으로 기재되는 CDR2 및 서열번호 7로 기재되는 CDR3;
    (5) 서열번호 2로 기재되는 CDR1, 서열번호 3으로 기재되는 CDR2 및 서열번호 8로 기재되는 CDR3;
    (6) 서열번호 2로 기재되는 CDR1, 서열번호 4로 기재되는 CDR2 및 서열번호 6으로 기재되는 CDR3;
    (7) 서열번호 2로 기재되는 CDR1, 서열번호 4로 기재되는 CDR2 및 서열번호 7로 기재되는 CDR3; 및
    (8) 서열번호 2로 기재되는 CDR1, 서열번호 4로 기재되는 CDR2 및 서열번호 8로 기재되는 CDR3;
    상기 항체의 중쇄 가변 영역은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 CDR1, CDR2 및 CDR3의 조합을 포함하며:
    (1) 서열번호 14로 기재되는 CDR1, 서열번호 17로 기재되는 CDR2 및 서열번호 19로 기재되는 CDR3;
    (2) 서열번호 14로 기재되는 CDR1, 서열번호 18로 기재되는 CDR2 및 서열번호 19로 기재되는 CDR3;
    (3) 서열번호 15로 기재되는 CDR1, 서열번호 17로 기재되는 CDR2 및 서열번호 19로 기재되는 CDR3;
    (4) 서열번호 15로 기재되는 CDR1, 서열번호 18로 기재되는 CDR2 및 서열번호 19로 기재되는 CDR3;
    (5) 서열번호 16으로 기재되는 CDR1, 서열번호 18로 기재되는 CDR2 및 서열번호 19로 기재되는 CDR3; 및
    (6) 서열번호 16으로 기재되는 CDR1, 서열번호 17로 기재되는 CDR2 및 서열번호 19로 기재되는 CDR3;
    더욱 바람직하게는, 상기 항체는 하기 서열로 표시되는 아미노산 서열로부터 선택되는 경쇄 가변 영역을 포함하고: 서열번호 40, 서열번호 41, 서열번호 44, 서열번호 45, 서열번호 46, 서열번호 47, 서열번호 49, 서열번호 50, 서열번호 51, 서열번호 54, 서열번호 55 및 서열번호 57, 상기 항체는 하기 서열로 표시되는 아미노산 서열로부터 선택되는 중쇄 가변 영역을 포함하며: 서열번호 59, 서열번호 60, 서열번호 61, 서열번호 62, 서열번호 63, 서열번호 64, 서열번호 65, 서열번호 66, 서열번호 67, 서열번호 74, 서열번호 75, 서열번호 76, 서열번호 77, 서열번호 78, 서열번호 79, 서열번호 80, 서열번호 91 및 서열번호 92;
    더욱 바람직하게는, 상기 항체는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역의 조합을 포함하는 항체:
    (1) 서열번호 57로 기재되는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 62로 기재되는 중쇄 가변 영역;
    (2) 서열번호 57로 기재되는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 63으로 기재되는 중쇄 가변 영역;
    (3) 서열번호 57로 기재되는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 59로 기재되는 중쇄 가변 영역;
    (4) 서열번호 57로 기재되는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 60으로 기재되는 중쇄 가변 영역;
    (5) 서열번호 57로 기재되는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 61로 기재되는 중쇄 가변 영역;
    (6) 서열번호 57로 기재되는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 67로 기재되는 중쇄 가변 영역;
    (7) 서열번호 57로 기재되는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 65로 기재되는 중쇄 가변 영역;
    (8) 서열번호 57로 기재되는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 66으로 기재되는 중쇄 가변 영역;
    (9) 서열번호 57로 기재되는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 64로 기재되는 중쇄 가변 영역;
    (10) 서열번호 57로 기재되는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 91로 기재되는 중쇄 가변 영역;
    (11) 서열번호 57로 기재되는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 74로 기재되는 중쇄 가변 영역;
    (12) 서열번호 57로 기재되는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 75로 기재되는 중쇄 가변 영역;
    (13) 서열번호 57로 기재되는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 76으로 기재되는 중쇄 가변 영역;
    (14) 서열번호 57로 기재되는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 77로 기재되는 중쇄 가변 영역;
    (15) 서열번호 57로 기재되는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 78로 기재되는 중쇄 가변 영역;
    (16) 서열번호 57로 기재되는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 80으로 기재되는 중쇄 가변 영역;
    (17) 서열번호 40으로 기재되는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 92로 기재되는 중쇄 가변 영역;
    (18) 서열번호 41로 기재되는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 92로 기재되는 중쇄 가변 영역;
    (19) 서열번호 44로 기재되는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 92로 기재되는 중쇄 가변 영역;
    (20) 서열번호 44로 기재되는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 62로 기재되는 중쇄 가변 영역;
    (21) 서열번호 44로 기재되는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 91로 기재되는 중쇄 가변 영역;
    (22) 서열번호 49로 기재되는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 92로 기재되는 중쇄 가변 영역;
    (23) 서열번호 50으로 기재되는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 92로 기재되는 중쇄 가변 영역;
    (24) 서열번호 45로 기재되는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 92로 기재되는 중쇄 가변 영역;
    (25) 서열번호 46으로 기재되는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 92로 기재되는 중쇄 가변 영역;
    (26) 서열번호 47로 기재되는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 92로 기재되는 중쇄 가변 영역;
    (27) 서열번호 55로 기재되는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 92로 기재되는 중쇄 가변 영역;
    (28) 서열번호 55로 기재되는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 62로 기재되는 중쇄 가변 영역;
    (29) 서열번호 55로 기재되는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 91로 기재되는 중쇄 가변 영역;
    (30) 서열번호 54로 기재되는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 92로 기재되는 중쇄 가변 영역;
    (31) 서열번호 54로 기재되는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 62로 기재되는 중쇄 가변 영역;
    (32) 서열번호 54로 기재되는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 91로 기재되는 중쇄 가변 영역; 및
    (33) 서열번호 51로 기재되는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 92로 기재되는 중쇄 가변 영역.
  3. 인터루킨 4(IL-4) 수용체(IL-4R)에 결합할 수 있는 항체로서, 상기 항체는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하고, 상기 경쇄 가변 영역은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 CDR1, CDR2 및 CDR3의 조합을 포함하며:
    (1) 서열번호 1로 기재되는 CDR1, 서열번호 3으로 기재되는 CDR2 및 서열번호 5로 기재되는 CDR3;
    (2) 서열번호 2로 기재되는 CDR1, 서열번호 3으로 기재되는 CDR2 및 서열번호 5로 기재되는 CDR3;
    (3) 서열번호 2로 기재되는 CDR1, 서열번호 4로 기재되는 CDR2 및 서열번호 5로 기재되는 CDR3;
    (4) 서열번호 1로 기재되는 CDR1, 서열번호 4로 기재되는 CDR2 및 서열번호 5로 기재되는 CDR3;
    (5) 서열번호 2로 기재되는 CDR1, 서열번호 3로 기재되는 CDR2 및 서열번호 6으로 기재되는 CDR3;
    (6) 서열번호 2로 기재되는 CDR1, 서열번호 3으로 기재되는 CDR2 및 서열번호 7로 기재되는 CDR3;
    (7) 서열번호 2로 기재되는 CDR1, 서열번호 3으로 기재되는 CDR2 및 서열번호 8로 기재되는 CDR3;
    (8) 서열번호 1로 기재되는 CDR1, 서열번호 3으로 기재되는 CDR2 및 서열번호 6으로 기재되는 CDR3;
    (9) 서열번호 2로 기재되는 CDR1, 서열번호 4로 기재되는 CDR2 및 서열번호 6으로 기재되는 CDR3;
    (10) 서열번호 2로 기재되는 CDR1, 서열번호 4로 기재되는 CDR2 및 서열번호 8로 기재되는 CDR3;
    (11) 서열번호 1로 기재되는 CDR1, 서열번호 4로 기재되는 CDR2 및 서열번호 8로 기재되는 CDR3; 및
    (12) 서열번호 1로 기재되는 CDR1, 서열번호 3으로 기재되는 CDR2 및 서열번호 8로 기재되는 CDR3;
    및/또는
    상기 항체는 중쇄 가변 영역(VH)을 포함하고, 상기 중쇄 가변 영역은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 CDR1, CDR2 및 CDR3의 조합을 포함하는 항체:
    (1) 서열번호 14로 기재되는 CDR1, 서열번호 17로 기재되는 CDR2 및 서열번호 19로 기재되는 CDR3;
    (2) 서열번호 14로 기재되는 CDR1, 서열번호 18로 기재되는 CDR2 및 서열번호 19로 기재되는 CDR3;
    (3) 서열번호 14로 기재되는 CDR1, 서열번호 17로 기재되는 CDR2 및 서열번호 20으로 기재되는 CDR3;
    (4) 서열번호 14로 기재되는 CDR1, 서열번호 18로 기재되는 CDR2 및 서열번호 20으로 기재되는 CDR3;
    (5) 서열번호 15로 기재되는 CDR1, 서열번호 17로 기재되는 CDR2 및 서열번호 19로 기재되는 CDR3;
    (6) 서열번호 16으로 기재되는 CDR1, 서열번호 17로 기재되는 CDR2 및 서열번호 19로 기재되는 CDR3; 및
    (7) 서열번호 14로 기재되는 CDR1, 서열번호 18로 기재되는 CDR2 및 서열번호 19로 기재되는 CDR3.
  4. 제 1항 내지 제 3항의 어느 한 항에 있어서, 상기 항체의 경쇄 가변 영역은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 FR1, FR2, FR3 및 FR4의 조합을 포함하고:
    (1) 서열번호 9로 기재되는 FR1, 서열번호 10으로 기재되는 FR2, 서열번호 12로 기재되는 FR3 및 서열번호 13으로 기재되는 FR4; 및
    (2) 서열번호 9로 기재되는 FR1, 서열번호 11로 기재되는 FR2, 서열번호 12로 기재되는 FR3 및 서열번호 13으로 기재되는 FR4;
    및/또는
    상기 항체의 중쇄 가변 영역은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 FR1, FR2, FR3 및 FR4의 조합을 포함하며:
    (1) 서열번호 21로 기재되는 FR1, 서열번호 32로 기재되는 FR2, 서열번호 34로 기재되는 FR3 및 서열번호 38로 기재되는 FR4;
    (2) 서열번호 22로 기재되는 FR1, 서열번호 32로 기재되는 FR2, 서열번호 34로 기재되는 FR3 및 서열번호 38로 기재되는 FR4;
    (3) 서열번호 23으로 기재되는 FR1, 서열번호 32로 기재되는 FR2, 서열번호 34로 기재되는 FR3 및 서열번호 38로 기재되는 FR4;
    (4) 서열번호 24로 기재되는 FR1, 서열번호 32로 기재되는 FR2, 서열번호 34로 기재되는 FR3 및 서열번호 38로 기재되는 FR4;
    (5) 서열번호 24로 기재되는 FR1, 서열번호 32로 기재되는 FR2, 서열번호 35로 기재되는 FR3 및 서열번호 38로 기재되는 FR4;
    (6) 서열번호 25로 기재되는 FR1, 서열번호 32로 기재되는 FR2, 서열번호 34로 기재되는 FR3 및 서열번호 38로 기재되는 FR4;
    (7) 서열번호 26으로 기재되는 FR1, 서열번호 32로 기재되는 FR2, 서열번호 34로 기재되는 FR3 및 서열번호 38로 기재되는 FR4;
    (8) 서열번호 27로 기재되는 FR1, 서열번호 32로 기재되는 FR2, 서열번호 34로 기재되는 FR3 및 서열번호 38로 기재되는 FR4;
    (9) 서열번호 29로 기재되는 FR1, 서열번호 32로 기재되는 FR2, 서열번호 34로 기재되는 FR3 및 서열번호 38로 기재되는 FR4;
    (10) 서열번호 30으로 기재되는 FR1, 서열번호 32로 기재되는 FR2, 서열번호 34로 기재되는 FR3 및 서열번호 38로 기재되는 FR4;
    (11) 서열번호 24로 기재되는 FR1, 서열번호 33으로 기재되는 FR2, 서열번호 34로 기재되는 FR3 및 서열번호 38로 기재되는 FR4;
    (12) 서열번호 24로 기재되는 FR1, 서열번호 32로 기재되는 FR2, 서열번호 36으로 기재되는 FR3 및 서열번호 38로 기재되는 FR4;
    (13) 서열번호 24로 기재되는 FR1, 서열번호 32로 기재되는 FR2, 서열번호 37로 기재되는 FR3 및 서열번호 38로 기재되는 FR4;
    (14) 서열번호 31로 기재되는 FR1, 서열번호 32로 기재되는 FR2, 서열번호 34로 기재되는 FR3 및 서열번호 38로 기재되는 FR4;
    (15) 서열번호 27로 기재되는 FR1, 서열번호 32로 기재되는 FR2, 서열번호 35로 기재되는 FR3 및 서열번호 38로 기재되는 FR4;
    (16) 서열번호 26으로 기재되는 FR1, 서열번호 32로 기재되는 FR2, 서열번호 35로 기재되는 FR3 및 서열번호 38로 기재되는 FR4;
    (17) 서열번호 25로 기재되는 FR1, 서열번호 32로 기재되는 FR2, 서열번호 35로 기재되는 FR3 및 서열번호 38로 기재되는 FR4;
    (18) 서열번호 28로 기재되는 FR1, 서열번호 32로 기재되는 FR2, 서열번호 35로 기재되는 FR3 및 서열번호 38로 기재되는 FR4;
    (19) 서열번호 28로 기재되는 FR1, 서열번호 32로 기재되는 FR2, 서열번호 34로 기재되는 FR3 및 서열번호 38로 기재되는 FR4;
    (20) 서열번호 23으로 기재되는 FR1, 서열번호 32로 기재되는 FR2, 서열번호 35로 기재되는 FR3 및 서열번호 38로 기재되는 FR4;
    (21) 서열번호 22로 기재되는 FR1, 서열번호 32로 기재되는 FR2, 서열번호 35로 기재되는 FR3 및 서열번호 38로 기재되는 FR4; 및
    (22) 서열번호 21로 기재되는 FR1, 서열번호 32로 기재되는 FR2, 서열번호 35로 기재되는 FR3 및 서열번호 38로 기재되는 FR4;
    바람직하게는, 상기 항체는 하기 서열로 표시되는 아미노산 서열로부터 선택되는 경쇄 가변 영역을 포함하고:
    서열번호 39, 서열번호 40, 서열번호 41, 서열번호 42, 서열번호 43, 서열번호 44, 서열번호 45, 서열번호 46, 서열번호 47, 서열번호 48, 서열번호 49, 서열번호 50, 서열번호 51, 서열번호 52, 서열번호 53, 서열번호 54, 서열번호 55, 서열번호 56, 서열번호 57 및 서열번호 58;
    및/또는
    상기 항체는 하기 서열로 표시되는 아미노산 서열로부터 선택되는 중쇄 가변 영역을 포함하며:
    서열번호 59, 서열번호 60, 서열번호 61, 서열번호 62, 서열번호 63, 서열번호 64, 서열번호 65, 서열번호 66, 서열번호 67, 서열번호 68, 서열번호 69, 서열번호 70, 서열번호 71, 서열번호 72, 서열번호 73, 서열번호 74, 서열번호 75, 서열번호 76, 서열번호 77, 서열번호 78, 서열번호 79, 서열번호 80, 서열번호 81, 서열번호 82, 서열번호 83, 서열번호 84, 서열번호 85, 서열번호 86, 서열번호 87, 서열번호 88, 서열번호 89, 서열번호 90, 서열번호 91, 서열번호 92 및 서열번호 93;
    더욱 바람직하게는 상기 항체는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역의 조합을 포함하는 항체:
    (1) 서열번호 57로 기재되는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 62로 기재되는 중쇄 가변 영역;
    (2) 서열번호 57로 기재되는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 63으로 기재되는 중쇄 가변 영역;
    (3) 서열번호 57로 기재되는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 59로 기재되는 중쇄 가변 영역;
    (4) 서열번호 57로 기재되는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 60으로 기재되는 중쇄 가변 영역;
    (5) 서열번호 57로 기재되는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 61로 기재되는 중쇄 가변 영역;
    (6) 서열번호 57로 기재되는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 67로 기재되는 중쇄 가변 영역;
    (7) 서열번호 57로 기재되는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 65로 기재되는 중쇄 가변 영역;
    (8) 서열번호 57로 기재되는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 66으로 기재되는 중쇄 가변 영역;
    (9) 서열번호 57로 기재되는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 64로 기재되는 중쇄 가변 영역;
    (10) 서열번호 57로 기재되는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 68로 기재되는 중쇄 가변 영역;
    (11) 서열번호 57로 기재되는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 69로 기재되는 중쇄 가변 영역;
    (12) 서열번호 57로 기재되는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 70으로 기재되는 중쇄 가변 영역;
    (13) 서열번호 57로 기재되는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 71로 기재되는 중쇄 가변 영역;
    (14) 서열번호 57로 기재되는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 72로 기재되는 중쇄 가변 영역;
    (15) 서열번호 57로 기재되는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 73으로 기재되는 중쇄 가변 영역;
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    (63) 서열번호 54로 기재되는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 82로 기재되는 중쇄 가변 영역;
    (64) 서열번호 54로 기재되는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 85로 기재되는 중쇄 가변 영역;
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    (66) 서열번호 53으로 기재되는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 92로 기재되는 중쇄 가변 영역;
    (67) 서열번호 51로 기재되는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 92로 기재되는 중쇄 가변 영역;
    (68) 서열번호 52로 기재되는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 92로 기재되는 중쇄 가변 영역;
    (69) 서열번호 52로 기재되는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 62로 기재되는 중쇄 가변 영역;
    (70) 서열번호 52로 기재되는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 91로 기재되는 중쇄 가변 영역;
    (71) 서열번호 58로 기재되는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 92로 기재되는 중쇄 가변 영역;
    (72) 서열번호 57로 기재되는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 93으로 기재되는 중쇄 가변 영역;
    (73) 서열번호 44로 기재되는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 93으로 기재되는 중쇄 가변 영역;
    (74) 서열번호 58로 기재되는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 91로 기재되는 중쇄 가변 영역;
    (75) 서열번호 55로 기재되는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 93으로 기재되는 중쇄 가변 영역; 및
    (76) 서열번호 51로 기재되는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 93으로 기재되는 중쇄 가변 영역.
  5. 제 1항 내지 제 4항의 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 인터루킨 4(IL-4) 수용체(IL-4R)에 결합할 수 있고;
    바람직하게는 IL-4Rα에 결합할 수 있으며,
    바람직하게는 포유동물의 IL-4Rα에, 보다 바람직하게는 인간의 IL-4Rα에, 보다 더 바람직하게는 인간 가용성(soluble) IL-4Rα에 결합할 수 있고;
    보다 바람직하게는 100 nM 미만, 10 nM 미만, 1 nM 미만, 0.5 nM 미만 및 심지어 0.1 nM 미만의 친화도로 IL-4Rα에 결합할 수 있는 항체.
  6. 제 1항 내지 제 5항의 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 단클론(monoclonal) 항체, 완전히 또는 부분적으로 인간화된(humanized) 항체, 또는 키메라(chimeric) 항체이고;
    바람직하게는, 상기 항체는 면역글로불린(immunoglobulin)이고, 더욱 바람직하게는 IgA, IgD, IgE, IgG 또는 IgM이며, 보다 바람직하게는 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 서브타입인 항체.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항의 항체를 포함하는 융합 단백질(fusion protein) 또는 접합체(conjugate).
  8. 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항의 항체의 중쇄 가변 영역 및/또는 경쇄 가변 영역을 코딩하는 핵산 서열;
    바람직하게는 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항의 항체의 중쇄 및/또는 경쇄를 코딩하는 핵산 서열.
  9. 제 8 항의 핵산 서열을 포함하는 벡터.
  10. 제 8 항의 핵산 서열 또는 제 9 항의 벡터로 형질전환되거나(transformed) 형질도입된(transfected) 숙주 세포.
  11. 항체의 중쇄 가변 영역 및/또는 경쇄 가변 영역, 또는 항체의 중쇄 및/또는 경쇄를 제 10항의 핵산 서열로부터 수득하는 단계; 및 상기 수득한 것들을 상기 항체의 다른 도메인과 함께 항체로 조립하는(assembling) 단계를 포함하거나; 또는
    항체의 조립을 위해 제 12항의 숙주 세포를 항체의 중쇄 가변 영역 및/또는 경쇄 가변 영역, 또는 항체의 중쇄 및/또는 경쇄를 발현하도록 하는 조건 하에서 배양하는 단계를 포함하고;
    선택적으로, 생성된 항체를 회수하는 단계를 더 포함하는, 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항의 항체를 생산하는 방법.
  12. 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항의 항체, 제 7항의 융합 단백질 또는 접합체, 제 8 항의 핵산 서열, 제 9 항의 벡터, 제 10 항의 숙주 세포 및/또는 제 11 항의 방법에 의해 생산된 항체를 포함하는 약학적 조성물로;
    바람직하게는, 상기 약학적 조성물은 주사제인 약학적 제제(pharmaceutical preparation)이고;
    바람직하게는, 상기 약학적 조성물 또는 약학적 제제는 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제를 더 포함하며;
    바람직하게는, 상기 약학적 조성물 또는 약학적 제제는 하기의 약제 중 하나 이상을 더 포함하는 약학적 조성물:
    알부테롤(albuterol) 등의 항천식제, 로라타딘(loratadine) 등의 항히스타민제, 타크롤리무스(tacrolimus), 피메크롤리무스(pimecrolimus) 등의 면역억제제, 이프라트로피움 브로마이드(ipratropium bromide) 등의 M 수용체 차단제(M receptor blockers), 몬테루카스트(montelukast) 등의 류코트리엔 수용체 차단제(leukotriene receptor blockers), 테오필린(theophylline) 등의 포스포디에스테라아제 저해제(phosphodiesterase inhibitors), 5-아미노살리실산(5-aminosalicylic acid) 등의 비스테로이드계 항염증제(non-steroidal anti-inflammatory drugs), 베클로메타존(beclomethasone) 및 부데소니드(budesonide) 등의 호르몬.
  13. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항의 항체, 제 7 항의 융합 단백질 또는 접합체, 제 8 항의 핵산 서열, 제 9 항의 벡터, 제 10 항의 숙주 세포 및/또는 제 11 항의 방법에 의해 생산된 항체의 염증 또는 알레르기 질환 예방, 치료 또는 개선용 약제의 제조를 위한 용도로;
    바람직하게는, 상기 염증 또는 알레르기 질환은 알레르기성 피부염(allergic dermatitis), 천식, 호산구성 식도염(eosinophilic esophagitis), 습진(eczema), 알레르기성 비염(allergic rhinitis), 비용종(nasal polyp), 류마티스성 관절염(rheumatoid arthritis) 등과 같은 자가면역 질환을 포함하는, 용도.
  14. 염증 또는 알레르기 질환의 예방, 치료 또는 개선 방법으로, 상기 방법은 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항의 항체, 제 7 항의 융합 단백질 또는 접합체, 제 8 항의 핵산 서열, 제 9 항의 벡터, 제 10 항의 숙주 세포 및/또는 제 11 항의 방법에 의해 제조된 항체를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하고;
    바람직하게는, 상기 개체는 포유동물이고;
    보다 바람직하게는, 상기 개체는 사람이며;
    바람직하게는, 상기 염증 또는 알레르기 질환은 알레르기성 피부염, 천식, 호산구성 식도염, 습진, 알레르기성 비염, 비용종, 류마티스성 관절염 등과 같은 자가면역 질환인, 방법.
  15. 제 14 항의 방법에 있어서, 상기 방법은 하기의 약제들로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 약제를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 더 포함하고: 알부테롤 등의 항천식제, 로라타딘 등의 항히스타민제, 타크롤리무스, 피메크롤리무스 등의 면역억제제, 이프라트로피움 브로마이드 등의 M 수용체 차단제, 몬테루카스트 등의 류코트리엔 수용체 차단제, 테오필린 등의 포스포디에스테라아제 저해제, 5-아미노살리실산 등의 비스테로이드계 항염증제, 베클로메타존 및 부데소니드 등의 호르몬;
    바람직하게는, 상기 약제는 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항의 항체, 제 7 항의 융합 단백질 또는 접합체, 제 8 항의 핵산 서열, 제 9 항의 벡터, 제 10 항의 숙주 세포 및/또는 제 11 항의 방법에 의해 생산된 항체와 동시에 또는 순차적으로 투여되는, 방법.
  16. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항의 항체, 제 7 항의 융합 단백질 또는 접합체, 제 8 항의 핵산 서열, 제 9 항의 벡터, 제 10 항의 숙주 세포 및/또는 제 11 항의 방법에 의해 생산된 항체를 포함하는 키트.
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