JP7025356B2 - インターロイキン‐４受容体への結合のための抗体 - Google Patents

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Description

本発明は生物薬剤学の分野に関する。特に本発明は、インターロイキン‐４（ＩＬ‐４）受容体（ＩＬ‐４Ｒ）に結合できる抗体、及びその使用に関する。
インターロイキン‐４（ＩＬ‐４）は、主に活性化Ｔ細胞、単球、好塩基球、肥満細胞及び好酸球が産生するサイトカインである。ＩＬ‐４は、多様な生体プロセスに関与し、当該技術分野において公知であるその生物学的効果としては、活性化Ｂ細胞及びＴ細胞の増殖並びにＩＩ型ヘルパーＴ細胞へのＣＤ４＋Ｔ細胞の分化の刺激が挙げられる。更にＩＬ‐４は、アレルギー疾患、自己免疫疾患、感染性疾患及び腫瘍といった疾患に対する免疫応答の仲介において複数の効果を有し、また腫瘍、自己免疫疾患及び感染性疾患等に対する治療効果を有することが、研究によって分かっている。一方、ＩＬ‐４はワクチンに対する免疫応答を調節することもできる。従ってＩＬ‐４は常に、大きな注目を集める研究領域であり続けている。
ＩＬ‐１３もまた、活性化Ｔ細胞が産生するサイトカインであり、これは単球、Ｂ細胞、肥満細胞及びケラチノサイトといった異なるタイプの細胞において異なる機能を有する。ＩＬ‐１３は、単球からの炎症性サイトカイン及びケモカインの放出を阻害でき、Ｂ細胞の増殖及び分化を誘発でき、またＩｇＥの合成を促進できる。ＩＬ‐１３及びＩＬ‐４は、単球からの炎症仲介因子の放出の阻害、マクロファージの樹状細胞様進行の誘発、単球の表面上でのＣＤ２３の発現の促進、及びＢ細胞による免疫グロブリンの合成の刺激を含む生物学的機能に関して多くの共通の特性を共有している。同時にＩＬ‐１３はまた、固有の生物学的特徴を有しており、これは主に：ヒト単球の分化及び細胞表面の抗原の変化の促進；Ｂ細胞の増殖及び分化の誘発、並びにＢ細胞からの抗体の分泌の促進；ＩｇＥの合成の調節（これによって体内のアレルギー反応に関連する）；腫瘍細胞の成長の阻害；ＨＩＶの複製の阻害等を含む。
ＩＬ‐４の生物活性は、細胞表面上の特異的ＩＬ‐４受容体（ＩＬ‐４Ｒ、ヒトにおいては「ｈＩＬ‐４Ｒ」と呼ばれる）によって仲介される。ヒトＩＬ‐４Ｒは、２つのポリペプチド鎖によって形成されたヘテロ二量体であり、そのうちα鎖（ｈＩＬ‐４Ｒα、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ２４３９４）がＩＬ‐４に対して高い親和性を有する。また、ＩＬ‐１３の細胞表面受容体α鎖（ＩＬ‐１３Ｒα鎖）もまた、ＩＬ‐４Ｒα鎖を有するＩＬ‐４Ｒ複合体の別の形態を形成することが、研究によって分かっている。ＩＬ‐４Ｒ複合体中のＩＬ‐４Ｒα鎖は、ＩＬ‐４への結合において主要な役割を果たし、また他のサイトカインが関与するため、ＩＬ‐４Ｒα鎖は現在、主たる標的として研究されている。更に、ＩＬ‐４Ｒα鎖に対するヒトモノクローナル抗体は、喘息、湿疹、アトピー性皮膚炎といった状態の緩和及び治療に効果的であることが、臨床的に証明されている。
ヒトインターロイキン‐４受容体は、Ｔ細胞によって仲介されるＩＬ‐４及びＩＬ‐５上方制御によって仲介される細胞増殖を阻害する、タンパク質の可溶形態（ｓｈＩＬ‐４Ｒα、配列番号９４）を産生することが知られている。上記受容体の２つの形態は、アレルギー性鼻炎、副鼻腔炎、喘息、湿疹等のような疾患として現れるアレルギー反応に関連する。従って上記タンパク質を標的とするブロッキング抗体は、上記疾患の治療及び緩和を支援できる。
喘息は慢性気道炎症性疾患であり、好酸球、肥満細胞及びリンパ球等の多くの炎症細胞が関与し、その特定の病因は依然として不明である。ＩＬ‐４等のサイトカインが、気管支喘息の発生及び進行に重要な役割を果たすことから、ＩＬ‐４に対して特異的な抗体の開発は、喘息の治療のための効果的な方法の１つである。ＩＬ‐４／ＩＬ‐４Ｒαの阻害は、喘息に対して有効な免疫調節効果を有することができる。
アレルギー性鼻炎（ＡＲ）は、喘息の病因とかなり共通した病因を有し、またＡＲ及び喘息はいずれもＩ型アレルギーに属する。一方、ＩＬ‐４、ＩＬ‐１７及びＩｇＥがアレルギー性鼻炎の発病において重要な役割を果たすことが、研究によって分かっている。現在のところ、薬物療法がＡＲの治療の焦点であり、鼻腔内コルチコステロイド及び抗ヒスタミン剤がその核となっている。
異所性皮膚炎又は遺伝性アレルギー性皮膚炎としても知られるアトピー性皮膚炎（ＡＤ）は、主に小児及び青年に見られる一般的な皮膚病であり、多くの場合、アレルギー性鼻炎、喘息等の特定の遺伝性アレルギー性疾患を併発する。ＩＬ‐４及びＩＬ‐１３といった免疫因子の関与が、主要な病因の１つである。
好酸球性食道炎（ＥｏＥ）は、食道の全ての層における好酸球（ＥＯＳ）の浸出を特徴とする、慢性免疫炎症性疾患である。ＥｏＥの発症は、Ｔｈ２細胞の機能不全に関連する。現在、新規の生物学的薬剤である抗ＩＬ‐５（メポリズマブ等）といった、高い特異性を有するプロトコルが、熱心な研究対象となっている。動物モデルでは免疫変調療法によって結果が得られたが、ヒトの臨床試験における探求が依然として必要である。ＰＧＤ２阻害剤、抗ＴＮＦ‐α及び抗ＩＬ‐１３といった薬剤が、現在調査中である。
デュピルマブ等の、ｈＩＬ‐４Ｒを標的としたモノクローナル抗体薬剤は、臨床試験段階に入ったところであり、これはアトピー性皮膚炎の第ＩＩ相臨床試験で良好な結果を示した。デュピルマブに加えて、ｈＩＬ‐４Ｒに対する他のモノクローナル抗体も、例えば特許文献１、２といった企業による特許出願の請求対象となっている。
米国特許第７，１８６，８０９号 米国特許第７，６３８，６０６号
本発明は、ＩＬ‐４Ｒに対して特異的な抗体を、抗体スクリーニング及び最適化によって提供し、上記抗体は、ＩＬ‐４のＩＬ‐４Ｒへの結合に対するブロッキング剤として機能でき、またＩＬ‐４Ｒへの結合による炎症又はアレルギー性疾患の治療に使用できる。
配列番号５８に記載の配列のアミノ酸残基の番号付与を参照すると、本発明の抗体は、上記抗体に含まれる軽鎖可変領域の３１位のセリン（３１Ｓｅｒ）を有し、また配列番号９３に記載の配列のアミノ酸残基の番号付与を参照すると、上記抗体は、上記抗体に含まれる重鎖可変領域の１０３位のアスパラギン酸（１０３Ａｓｐ）、及び１０４位のチロシン（１０４Ｔｙｒ）を有する。これに対応して、３１Ｓｅｒは、本発明の抗体の軽鎖可変領域のＣＤＲ１中にあり、また１０３Ａｓｐ及び１０４Ｔｙｒは、本発明の抗体の重鎖可変領域のＣＤＲ３中にある。
好ましくは、本発明の抗体の軽鎖可変領域は、配列番号２に記載のＣＤＲ１を含み、上記抗体の重鎖可変領域は、配列番号１９に記載のＣＤＲ３を含む。
好ましくは、本発明の抗体の軽鎖可変領域は：
（１）配列番号２に記載のＣＤＲ１、配列番号３に記載のＣＤＲ２、及び配列番号５に記載のＣＤＲ３；
（２）配列番号２に記載のＣＤＲ１、配列番号４に記載のＣＤＲ２、及び配列番号５に記載のＣＤＲ３；
（３）配列番号２に記載のＣＤＲ１、配列番号３に記載のＣＤＲ２、及び配列番号６に記載のＣＤＲ３；
（４）配列番号２に記載のＣＤＲ１、配列番号３に記載のＣＤＲ２、及び配列番号７に記載のＣＤＲ３；
（５）配列番号２に記載のＣＤＲ１、配列番号３に記載のＣＤＲ２、及び配列番号８に記載のＣＤＲ３；
（６）配列番号２に記載のＣＤＲ１、配列番号４に記載のＣＤＲ２、及び配列番号６に記載のＣＤＲ３；
（７）配列番号２に記載のＣＤＲ１、配列番号４に記載のＣＤＲ２、及び配列番号７に記載のＣＤＲ３；並びに
（８）配列番号２に記載のＣＤＲ１、配列番号４に記載のＣＤＲ２、及び配列番号８に記載のＣＤＲ３
からなる群から選択されたＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３の組み合わせを含み、上記抗体の重鎖可変領域は：
（１）配列番号１４に記載のＣＤＲ１、配列番号１７に記載のＣＤＲ２、及び配列番号１９に記載のＣＤＲ３；
（２）配列番号１４に記載のＣＤＲ１、配列番号１８に記載のＣＤＲ２、及び配列番号１９に記載のＣＤＲ３；
（３）配列番号１５に記載のＣＤＲ１、配列番号１７に記載のＣＤＲ２、及び配列番号１９に記載のＣＤＲ３；
（４）配列番号１５に記載のＣＤＲ１、配列番号１８に記載のＣＤＲ２、及び配列番号１９に記載のＣＤＲ３；
（５）配列番号１６に記載のＣＤＲ１、配列番号１８に記載のＣＤＲ２、及び配列番号１９に記載のＣＤＲ３；並びに
（６）配列番号１６に記載のＣＤＲ１、配列番号１７に記載のＣＤＲ２、及び配列番号１９に記載のＣＤＲ３
からなる群から選択されたＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３の組み合わせを含む。
より好ましくは、本発明の抗体は、以下の配列：配列番号４０、配列番号４１、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５４、配列番号５５及び配列番号５７に示されるアミノ酸配列から選択された軽鎖可変領域を含み、また上記抗体は、以下の配列：配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号９１及び配列番号９２に示されるアミノ酸配列から選択された重鎖可変領域を含む。
更に好ましくは、本発明の抗体は：
（１）配列番号５７に記載の軽鎖可変領域、及び配列番号６２に記載の重鎖可変領域；
（２）配列番号５７に記載の軽鎖可変領域、及び配列番号６３に記載の重鎖可変領域；
（３）配列番号５７に記載の軽鎖可変領域、及び配列番号５９に記載の重鎖可変領域；
（４）配列番号５７に記載の軽鎖可変領域、及び配列番号６０に記載の重鎖可変領域；
（５）配列番号５７に記載の軽鎖可変領域、及び配列番号６１に記載の重鎖可変領域；
（６）配列番号５７に記載の軽鎖可変領域、及び配列番号６７に記載の重鎖可変領域；
（７）配列番号５７に記載の軽鎖可変領域、及び配列番号６５に記載の重鎖可変領域；
（８）配列番号５７に記載の軽鎖可変領域、及び配列番号６６に記載の重鎖可変領域；
（９）配列番号５７に記載の軽鎖可変領域、及び配列番号６４に記載の重鎖可変領域；
（１０）配列番号５７に記載の軽鎖可変領域、及び配列番号９１に記載の重鎖可変領域；
（１１）配列番号５７に記載の軽鎖可変領域、及び配列番号７４に記載の重鎖可変領域；
（１２）配列番号５７に記載の軽鎖可変領域、及び配列番号７５に記載の重鎖可変領域；
（１３）配列番号５７に記載の軽鎖可変領域、及び配列番号７６に記載の重鎖可変領域；
（１４）配列番号５７に記載の軽鎖可変領域、及び配列番号７７に記載の重鎖可変領域；
（１５）配列番号５７に記載の軽鎖可変領域、及び配列番号７８に記載の重鎖可変領域；
（１６）配列番号５７に記載の軽鎖可変領域、及び配列番号８０に記載の重鎖可変領域；
（１７）配列番号４０に記載の軽鎖可変領域、及び配列番号９２に記載の重鎖可変領域；
（１８）配列番号４１に記載の軽鎖可変領域、及び配列番号９２に記載の重鎖可変領域；
（１９）配列番号４４に記載の軽鎖可変領域、及び配列番号９２に記載の重鎖可変領域；
（２０）配列番号４４に記載の軽鎖可変領域、及び配列番号６２に記載の重鎖可変領域；
（２１）配列番号４４に記載の軽鎖可変領域、及び配列番号９１に記載の重鎖可変領域；
（２２）配列番号４９に記載の軽鎖可変領域、及び配列番号９２に記載の重鎖可変領域；
（２３）配列番号５０に記載の軽鎖可変領域、及び配列番号９２に記載の重鎖可変領域；
（２４）配列番号４５に記載の軽鎖可変領域、及び配列番号９２に記載の重鎖可変領域；
（２５）配列番号４６に記載の軽鎖可変領域、及び配列番号９２に記載の重鎖可変領域；
（２６）配列番号４７に記載の軽鎖可変領域、及び配列番号９２に記載の重鎖可変領域；
（２７）配列番号５５に記載の軽鎖可変領域、及び配列番号９２に記載の重鎖可変領域；
（２８）配列番号５５に記載の軽鎖可変領域、及び配列番号６２に記載の重鎖可変領域；
（２９）配列番号５５に記載の軽鎖可変領域、及び配列番号９１に記載の重鎖可変領域；
（３０）配列番号５４に記載の軽鎖可変領域、及び配列番号９２に記載の重鎖可変領域；
（３１）配列番号５４に記載の軽鎖可変領域、及び配列番号６２に記載の重鎖可変領域；
（３２）配列番号５４に記載の軽鎖可変領域、及び配列番号９１に記載の重鎖可変領域；並びに
（３３）配列番号５１に記載の軽鎖可変領域、及び配列番号９２に記載の重鎖可変領域
からなる群から選択された軽鎖可変領域及び重鎖可変領域の組み合わせを含む。
別の態様では、本発明は、インターロイキン‐４（ＩＬ‐４）受容体（ＩＬ‐４Ｒ）に結合できる抗体を提供する。上記抗体は軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、上記軽鎖可変領域は：
（１）配列番号１に記載のＣＤＲ１、配列番号３に記載のＣＤＲ２、及び配列番号５に記載のＣＤＲ３；
（２）配列番号２に記載のＣＤＲ１、配列番号３に記載のＣＤＲ２、及び配列番号５に記載のＣＤＲ３；
（３）配列番号２に記載のＣＤＲ１、配列番号４に記載のＣＤＲ２、及び配列番号５に記載のＣＤＲ３；
（４）配列番号１に記載のＣＤＲ１、配列番号４に記載のＣＤＲ２、及び配列番号５に記載のＣＤＲ３；
（５）配列番号２に記載のＣＤＲ１、配列番号３に記載のＣＤＲ２、及び配列番号６に記載のＣＤＲ３；
（６）配列番号２に記載のＣＤＲ１、配列番号３に記載のＣＤＲ２、及び配列番号７に記載のＣＤＲ３；
（７）配列番号２に記載のＣＤＲ１、配列番号３に記載のＣＤＲ２、及び配列番号８に記載のＣＤＲ３；
（８）配列番号１に記載のＣＤＲ１、配列番号３に記載のＣＤＲ２、及び配列番号６に記載のＣＤＲ３；
（９）配列番号２に記載のＣＤＲ１、配列番号４に記載のＣＤＲ２、及び配列番号６に記載のＣＤＲ３；
（１０）配列番号２に記載のＣＤＲ１、配列番号４に記載のＣＤＲ２、及び配列番号８に記載のＣＤＲ３；
（１１）配列番号１に記載のＣＤＲ１、配列番号４に記載のＣＤＲ２、及び配列番号８に記載のＣＤＲ３並びに
（１２）配列番号１に記載のＣＤＲ１、配列番号３に記載のＣＤＲ２、及び配列番号８に記載のＣＤＲ３
からなる群から選択されたＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の組み合わせを含み、並びに／又は上記抗体は重鎖可変領域（ＶＨ）を含み、上記重鎖可変領域は：
（１）配列番号１４に記載のＣＤＲ１、配列番号１７に記載のＣＤＲ２、及び配列番号１９に記載のＣＤＲ３；
（２）配列番号１４に記載のＣＤＲ１、配列番号１８に記載のＣＤＲ２、及び配列番号１９に記載のＣＤＲ３；
（３）配列番号１４に記載のＣＤＲ１、配列番号１７に記載のＣＤＲ２、及び配列番号２０に記載のＣＤＲ３；
（４）配列番号１４に記載のＣＤＲ１、配列番号１８に記載のＣＤＲ２、及び配列番号２０に記載のＣＤＲ３；
（５）配列番号１５に記載のＣＤＲ１、配列番号１７に記載のＣＤＲ２、及び配列番号１９に記載のＣＤＲ３；
（６）配列番号１６に記載のＣＤＲ１、配列番号１７に記載のＣＤＲ２、及び配列番号１９に記載のＣＤＲ３；並びに
（７）配列番号１４に記載のＣＤＲ１、配列番号１８に記載のＣＤＲ２、及び配列番号１９に記載のＣＤＲ３
からなる群から選択されたＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の組み合わせを含む。
更に、上述の本発明の抗体のフレームワーク領域に関して、本発明の抗体の軽鎖可変領域は好ましくは：
（１）配列番号９に記載のＦＲ１、配列番号１０に記載のＦＲ２、配列番号１２に記載のＦＲ３、及び配列番号１３に記載のＦＲ４；並びに
（２）配列番号９に記載のＦＲ１、配列番号１１に記載のＦＲ２、配列番号１２に記載のＦＲ３、及び配列番号１３に記載のＦＲ４
からなる群から選択されたＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４の組み合わせを含む。
好ましくは、上記抗体の重鎖可変領域は：
（１）配列番号２１に記載のＦＲ１、配列番号３２に記載のＦＲ２、配列番号３４に記載のＦＲ３、及び配列番号３８に記載のＦＲ４；
（２）配列番号２２に記載のＦＲ１、配列番号３２に記載のＦＲ２、配列番号３４に記載のＦＲ３、及び配列番号３８に記載のＦＲ４；
（３）配列番号２３に記載のＦＲ１、配列番号３２に記載のＦＲ２、配列番号３４に記載のＦＲ３、及び配列番号３８に記載のＦＲ４；
（４）配列番号２４に記載のＦＲ１、配列番号３２に記載のＦＲ２、配列番号３４に記載のＦＲ３、及び配列番号３８に記載のＦＲ４；
（５）配列番号２４に記載のＦＲ１、配列番号３２に記載のＦＲ２、配列番号３５に記載のＦＲ３、及び配列番号３８に記載のＦＲ４；
（６）配列番号２５に記載のＦＲ１、配列番号３２に記載のＦＲ２、配列番号３４に記載のＦＲ３、及び配列番号３８に記載のＦＲ４；
（７）配列番号２６に記載のＦＲ１、配列番号３２に記載のＦＲ２、配列番号３４に記載のＦＲ３、及び配列番号３８に記載のＦＲ４；
（８）配列番号２７に記載のＦＲ１、配列番号３２に記載のＦＲ２、配列番号３４に記載のＦＲ３、及び配列番号３８に記載のＦＲ４；
（９）配列番号２９に記載のＦＲ１、配列番号３２に記載のＦＲ２、配列番号３４に記載のＦＲ３、及び配列番号３８に記載のＦＲ４；
（１０）配列番号３０に記載のＦＲ１、配列番号３２に記載のＦＲ２、配列番号３４に記載のＦＲ３、及び配列番号３８に記載のＦＲ４；
（１１）配列番号２４に記載のＦＲ１、配列番号３３に記載のＦＲ２、配列番号３４に記載のＦＲ３、及び配列番号３８に記載のＦＲ４；
（１２）配列番号２４に記載のＦＲ１、配列番号３２に記載のＦＲ２、配列番号３６に記載のＦＲ３、及び配列番号３８に記載のＦＲ４；
（１３）配列番号２４に記載のＦＲ１、配列番号３２に記載のＦＲ２、配列番号３７に記載のＦＲ３、及び配列番号３８に記載のＦＲ４；
（１４）配列番号３１に記載のＦＲ１、配列番号３２に記載のＦＲ２、配列番号３４に記載のＦＲ３、及び配列番号３８に記載のＦＲ４；
（１５）配列番号２７に記載のＦＲ１、配列番号３２に記載のＦＲ２、配列番号３５に記載のＦＲ３、及び配列番号３８に記載のＦＲ４；
（１６）配列番号２６に記載のＦＲ１、配列番号３２に記載のＦＲ２、配列番号３５に記載のＦＲ３、及び配列番号３８に記載のＦＲ４；
（１７）配列番号２５に記載のＦＲ１、配列番号３２に記載のＦＲ２、配列番号３５に記載のＦＲ３、及び配列番号３８に記載のＦＲ４；
（１８）配列番号２８に記載のＦＲ１、配列番号３２に記載のＦＲ２、配列番号３５に記載のＦＲ３、及び配列番号３８に記載のＦＲ４；
（１９）配列番号２８に記載のＦＲ１、配列番号３２に記載のＦＲ２、配列番号３４に記載のＦＲ３、及び配列番号３８に記載のＦＲ４；
（２０）配列番号２３に記載のＦＲ１、配列番号３２に記載のＦＲ２、配列番号３５に記載のＦＲ３、及び配列番号３８に記載のＦＲ４；
（２１）配列番号２２に記載のＦＲ１、配列番号３２に記載のＦＲ２、配列番号３５に記載のＦＲ３、及び配列番号３８に記載のＦＲ４；並びに
（２２）配列番号２１に記載のＦＲ１、配列番号３２に記載のＦＲ２、配列番号３５に記載のＦＲ３、及び配列番号３８に記載のＦＲ４
からなる群から選択されたＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４の組み合わせを含む。
当該技術分野で公知の抗体の軽鎖可変領域及び重鎖可変領域のドメインの組成によると、本発明の抗体の軽鎖可変領域又は重鎖可変領域は、上述のドメイン構成要素を、ＦＲ１‐ＣＤＲ１‐ＦＲ２‐ＣＤＲ２‐ＦＲ３‐ＣＤＲ３‐ＦＲ４の順序で含み、又は上述のドメイン構成要素を、（Ｘ）ｎ‐ＦＲ１‐（Ｘ）ｎ‐ＣＤＲ１‐（Ｘ）ｎ‐ＦＲ２‐（Ｘ）ｎ‐ＣＤＲ２‐（Ｘ）ｎ‐ＦＲ３‐（Ｘ）ｎ‐ＣＤＲ３‐（Ｘ）ｎ‐ＦＲ４‐（Ｘ）ｎの順序で含み、ここでＸはいずれのアミノ酸残基であり、ｎは０又は０より大きい整数である。
好ましくは、本発明が提供する抗体は、以下の配列：
配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７及び配列番号５８
に示されるアミノ酸配列から選択された軽鎖可変領域を含み、並びに／又は本発明が提供する抗体は、以下の配列：
配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２及び配列番号９３
に示されるアミノ酸配列から選択された重鎖可変領域を含む。
本発明の特定の実施形態によると、本発明が提供する抗体は：
（１）配列番号５７に記載の軽鎖可変領域、及び配列番号６２に記載の重鎖可変領域；
（２）配列番号５７に記載の軽鎖可変領域、及び配列番号６３に記載の重鎖可変領域；
（３）配列番号５７に記載の軽鎖可変領域、及び配列番号５９に記載の重鎖可変領域；
（４）配列番号５７に記載の軽鎖可変領域、及び配列番号６０に記載の重鎖可変領域；
（５）配列番号５７に記載の軽鎖可変領域、及び配列番号６１に記載の重鎖可変領域；
（６）配列番号５７に記載の軽鎖可変領域、及び配列番号６７に記載の重鎖可変領域；
（７）配列番号５７に記載の軽鎖可変領域、及び配列番号６５に記載の重鎖可変領域；
（８）配列番号５７に記載の軽鎖可変領域、及び配列番号６６に記載の重鎖可変領域；
（９）配列番号５７に記載の軽鎖可変領域、及び配列番号６４に記載の重鎖可変領域；
（１０）配列番号５７に記載の軽鎖可変領域、及び配列番号６８に記載の重鎖可変領域；
（１１）配列番号５７に記載の軽鎖可変領域、及び配列番号６９に記載の重鎖可変領域；
（１２）配列番号５７に記載の軽鎖可変領域、及び配列番号７０に記載の重鎖可変領域；
（１３）配列番号５７に記載の軽鎖可変領域、及び配列番号７１に記載の重鎖可変領域；
（１４）配列番号５７に記載の軽鎖可変領域、及び配列番号７２に記載の重鎖可変領域；
（１５）配列番号５７に記載の軽鎖可変領域、及び配列番号７３に記載の重鎖可変領域；
（１６）配列番号５７に記載の軽鎖可変領域、及び配列番号８９に記載の重鎖可変領域；
（１７）配列番号５７に記載の軽鎖可変領域、及び配列番号８８に記載の重鎖可変領域；
（１８）配列番号５７に記載の軽鎖可変領域、及び配列番号８７に記載の重鎖可変領域；
（１９）配列番号５７に記載の軽鎖可変領域、及び配列番号８６に記載の重鎖可変領域；
（２０）配列番号５７に記載の軽鎖可変領域、及び配列番号８３に記載の重鎖可変領域；
（２１）配列番号５７に記載の軽鎖可変領域、及び配列番号８２に記載の重鎖可変領域；
（２２）配列番号５７に記載の軽鎖可変領域、及び配列番号８１に記載の重鎖可変領域；
（２３）配列番号５７に記載の軽鎖可変領域、及び配列番号８５に記載の重鎖可変領域；
（２４）配列番号５７に記載の軽鎖可変領域、及び配列番号８４に記載の重鎖可変領域；
（２５）配列番号５７に記載の軽鎖可変領域、及び配列番号９１に記載の重鎖可変領域；
（２６）配列番号５７に記載の軽鎖可変領域、及び配列番号９０に記載の重鎖可変領域；
（２７）配列番号５７に記載の軽鎖可変領域、及び配列番号７４に記載の重鎖可変領域；
（２８）配列番号５７に記載の軽鎖可変領域、及び配列番号７５に記載の重鎖可変領域；
（２９）配列番号５７に記載の軽鎖可変領域、及び配列番号７６に記載の重鎖可変領域；
（３０）配列番号５７に記載の軽鎖可変領域、及び配列番号７７に記載の重鎖可変領域；
（３１）配列番号５７に記載の軽鎖可変領域、及び配列番号７８に記載の重鎖可変領域；
（３２）配列番号５７に記載の軽鎖可変領域、及び配列番号８０に記載の重鎖可変領域；
（３３）配列番号３９に記載の軽鎖可変領域、及び配列番号９２に記載の重鎖可変領域；
（３４）配列番号４０に記載の軽鎖可変領域、及び配列番号９２に記載の重鎖可変領域；
（３５）配列番号４１に記載の軽鎖可変領域、及び配列番号９２に記載の重鎖可変領域；
（３６）配列番号４２に記載の軽鎖可変領域、及び配列番号９２に記載の重鎖可変領域；
（３７）配列番号４３に記載の軽鎖可変領域、及び配列番号９２に記載の重鎖可変領域；
（３８）配列番号４４に記載の軽鎖可変領域、及び配列番号９２に記載の重鎖可変領域；
（３９）配列番号４４に記載の軽鎖可変領域、及び配列番号６２に記載の重鎖可変領域；
（４０）配列番号４４に記載の軽鎖可変領域、及び配列番号６８に記載の重鎖可変領域；
（４１）配列番号４４に記載の軽鎖可変領域、及び配列番号７２に記載の重鎖可変領域；
（４２）配列番号４４に記載の軽鎖可変領域、及び配列番号８２に記載の重鎖可変領域；
（４３）配列番号４４に記載の軽鎖可変領域、及び配列番号８５に記載の重鎖可変領域；
（４４）配列番号４４に記載の軽鎖可変領域、及び配列番号９１に記載の重鎖可変領域；
（４５）配列番号４８に記載の軽鎖可変領域、及び配列番号９２に記載の重鎖可変領域；
（４６）配列番号４９に記載の軽鎖可変領域、及び配列番号９２に記載の重鎖可変領域；
（４７）配列番号５０に記載の軽鎖可変領域、及び配列番号９２に記載の重鎖可変領域；
（４８）配列番号４５に記載の軽鎖可変領域、及び配列番号９２に記載の重鎖可変領域；
（４９）配列番号４６に記載の軽鎖可変領域、及び配列番号９２に記載の重鎖可変領域；
（５０）配列番号４７に記載の軽鎖可変領域、及び配列番号９２に記載の重鎖可変領域；
（５１）配列番号５６に記載の軽鎖可変領域、及び配列番号９２に記載の重鎖可変領域；
（５２）配列番号５５に記載の軽鎖可変領域、及び配列番号９２に記載の重鎖可変領域；
（５３）配列番号５５に記載の軽鎖可変領域、及び配列番号６２に記載の重鎖可変領域；
（５４）配列番号５５に記載の軽鎖可変領域、及び配列番号６８に記載の重鎖可変領域；
（５５）配列番号５５に記載の軽鎖可変領域、及び配列番号７２に記載の重鎖可変領域；
（５６）配列番号５５に記載の軽鎖可変領域、及び配列番号８２に記載の重鎖可変領域；
（５７）配列番号５５に記載の軽鎖可変領域、及び配列番号８５に記載の重鎖可変領域；
（５８）配列番号５５に記載の軽鎖可変領域、及び配列番号９１に記載の重鎖可変領域；
（５９）配列番号５４に記載の軽鎖可変領域、及び配列番号９２に記載の重鎖可変領域；
（６０）配列番号５４に記載の軽鎖可変領域、及び配列番号６２に記載の重鎖可変領域；
（６１）配列番号５４に記載の軽鎖可変領域、及び配列番号６８に記載の重鎖可変領域；
（６２）配列番号５４に記載の軽鎖可変領域、及び配列番号７２に記載の重鎖可変領域；
（６３）配列番号５４に記載の軽鎖可変領域、及び配列番号８２に記載の重鎖可変領域；
（６４）配列番号５４に記載の軽鎖可変領域、及び配列番号８５に記載の重鎖可変領域；
（６５）配列番号５４に記載の軽鎖可変領域、及び配列番号９１に記載の重鎖可変領域；
（６６）配列番号５３に記載の軽鎖可変領域、及び配列番号９２に記載の重鎖可変領域；
（６７）配列番号５１に記載の軽鎖可変領域、及び配列番号９２に記載の重鎖可変領域；
（６８）配列番号５２に記載の軽鎖可変領域、及び配列番号９２に記載の重鎖可変領域；
（６９）配列番号５２に記載の軽鎖可変領域、及び配列番号６２に記載の重鎖可変領域；
（７０）配列番号５２に記載の軽鎖可変領域、及び配列番号９１に記載の重鎖可変領域；
（７１）配列番号５８に記載の軽鎖可変領域、及び配列番号９２に記載の重鎖可変領域；
（７２）配列番号５７に記載の軽鎖可変領域、及び配列番号９３に記載の重鎖可変領域；
（７３）配列番号４４に記載の軽鎖可変領域、及び配列番号９３に記載の重鎖可変領域；
（７４）配列番号５８に記載の軽鎖可変領域、及び配列番号９１に記載の重鎖可変領域；
（７５）配列番号５５に記載の軽鎖可変領域、及び配列番号９３に記載の重鎖可変領域；並びに
（７６）配列番号５１に記載の軽鎖可変領域、及び配列番号９３に記載の重鎖可変領域
からなる群から選択された軽鎖可変領域及び重鎖可変領域の組み合わせを含む。
本発明が提供する抗体は、ＩＬ‐４Ｒに結合でき、ＩＬ‐４Ｒのアンタゴニストとして機能する。好ましくは、上記抗体は、ＩＬ‐４Ｒα、好ましくは哺乳類ＩＬ‐４Ｒα、より好ましくはヒトＩＬ‐４Ｒα、更に好ましくはヒト可溶性ＩＬ‐４Ｒαに結合できる。
本発明が提供する抗体の、ＩＬ‐４Ｒαに対する結合親和性は、Ｂｉａｃｏｒｅ又はＥＬＩＳＡという方法で決定できる。上記抗体は、１００ｎＭ未満、１０ｎＭ未満、１ｎＭ未満、０．５ｎＭ未満、更には０．１ｎＭ未満の親和性でＩＬ‐４Ｒαに結合すると決定される。
同一条件下において、基準抗体の発現レベルに対する、本発明が提供する抗体の発現レベルの比は、０．１～３：１、好ましくは０．３～３：１、より好ましくは０．４～３：１、更に好ましくは０．５～３：１、また更に好ましくは０．６～３：１、一層好ましくは０．７～３：１、より一層好ましくは１～３：１である。
抗体のタイプについて、本発明が提供する抗体は、モノクローナル抗体、完全若しくは部分ヒト化抗体、又はキメラ抗体とすることができる。
あるいは好ましくは、上記抗体はイムノグロブリン、好ましくはＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ又はＩｇＭ、より好ましくはＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４サブタイプ、更に好ましくはＩｇＧ２又はＩｇＧ４サブタイプである。
更に別の態様では、本発明は、本発明の抗体を含む融合タンパク質又はコンジュゲートを提供する。上記融合タンパク質又はコンジュゲートは更に、化学的又は物理的手段によって本発明の抗体に結合された、細胞表面受容体、活性タンパク質又は活性ポリペプチド、アミノ酸及び糖類といった小分子化合物、上記抗体を化学的に修飾する少分子ポリマー又はその他の部分を含んでよい。
また別の態様では、本発明は、本発明が提供する抗体の重鎖可変領域及び／又は軽鎖可変領域をコードできる核酸配列を提供する。
好ましくは、上記核酸配列は、本発明が提供する抗体の重鎖及び／又は軽鎖をコードできる。
更に別の態様では、本発明は、本発明が提供する上記核酸配列を含むベクターも提供する。上記ベクターは、真核細胞発現ベクター、原核細胞発現ベクター、人工染色体、ファージベクター等であってよい。
上述のベクター又は核酸配列を用いて、保存又は抗体発現等を目的として宿主細胞を形質転換又はトランスフェクトできる。従って本発明は、上記核酸配列又は上記ベクターを用いて形質転換又はトランスフェクトされた宿主細胞も提供する。上記宿主細胞は、細菌若しくは昆虫、真菌、植物又は動物細胞といった、原核又は真核細胞とすることができる。
本発明が提供する抗体は、当該技術分野において公知のいずれの方法で得ることができる。例えば上記抗体の重鎖可変領域及び／若しくは軽鎖可変領域、又は上記抗体の重鎖及び／若しくは軽鎖を、まず本発明が提供する核酸配列から得ることができ、その後これらを、抗体の他のいずれのドメインを用いて抗体に組み込むことができ；あるいは本発明が提供する宿主細胞を、上記宿主細胞が上記抗体への組み込みのために上記抗体の重鎖可変領域及び／若しくは軽鎖可変領域又は上記抗体の重鎖及び／若しくは軽鎖を発現できる条件下で、培養する。
任意に、上記方法は、産生された抗体を回収するステップを更に含む。
本発明が提供する抗体、融合タンパク質若しくはコンジュゲート、核酸配列、ベクター又は宿主細胞、あるいは上述の方法によって産生される抗体は、医薬組成物中、より詳細には実際の需要に応じた様々な目的のための医薬製剤に含有させてよい。従って更なる態様では、本発明は、本発明の抗体、融合タンパク質若しくはコンジュゲート、核酸配列、ベクター、宿主細胞、及び／又は上述の方法によって産生される抗体を含む、医薬組成物も提供する。
任意に、上記医薬組成物は、医薬製剤とすることができる。上記医薬製剤は例えば注射液である。
上記医薬組成物又は医薬製剤は、その特定の剤形に応じて、薬学的に許容可能なキャリア又は賦形剤を更に含んでよい。
上記医薬組成物又は医薬製剤中には、以下の薬剤：アルブテロール等の抗喘息薬；ロラタジン等の抗ヒスタミン剤；タクロリムス及びピメクロリムス等の免疫抑制剤；臭化イパラトロピウム等のＭ受容体ブロッカー；モンテルカスト等のロイコトリエン受容体ブロッカー、テオフィリン等のホスホジエステラーゼ阻害剤；５‐アミノサリチル酸等の非ステロイド性抗炎症薬；ベクロメタゾン及びブデソニド等のホルモンのうちの少なくとも１つも含有されていてよく、即ち本発明が提供する抗体、融合タンパク質若しくはコンジュゲート、核酸配列、ベクター、宿主細胞、又は上述の方法によって産生される抗体は、必要に応じて他の薬剤と組み合わせて使用してよい。
また更に別の態様では、本発明は、炎症又はアレルギー性疾患の予防、治療又は寛解のための薬剤のための、抗体、融合タンパク質若しくはコンジュゲート、核酸配列、ベクター、宿主細胞、又は上述の方法で産生される抗体の使用も提供する。
好ましくは、上記炎症又はアレルギー性疾患としては、アレルギー性皮膚炎、喘息、好酸球性食道炎、湿疹、アレルギー性鼻炎、鼻ポリープ、リウマチ性関節炎等といった、自己免疫疾患が挙げられる。
また更に別の態様では、本発明は、炎症又はアレルギー性疾患の防止、治療又は寛解のための方法を提供し、上記方法は、上記方法を必要とする被験者に、本発明が提供する抗体、融合タンパク質若しくはコンジュゲート、核酸配列、ベクター、宿主細胞、及び／又は本発明の方法で産生される抗体を投与するステップを含む。
好ましくは、上記被験者は哺乳類であり、更に好ましくは、上記被験者はヒトである。
好ましくは、上記炎症又はアレルギー性疾患としては、アレルギー性皮膚炎、喘息、好酸球性食道炎、湿疹、アレルギー性鼻炎、鼻ポリープ、リウマチ性関節炎等といった自己免疫疾患が挙げられる。
炎症又はアレルギー性疾患の防止、治療又は寛解のために、他の薬剤を併用でき、例えば上記方法は、上記方法を必要とする被験者に：アルブテロール等の抗喘息薬；ロラタジン等の抗ヒスタミン剤；タクロリムス及びピメクロリムス等の免疫抑制剤；臭化イパラトロピウム等のＭ受容体ブロッカー；モンテルカスト等のロイコトリエン受容体ブロッカー、テオフィリン等のホスホジエステラーゼ阻害剤；５‐アミノサリチル酸等の非ステロイド性抗炎症薬；ベクロメタゾン及びブデソニド等のホルモンからなる群から選択された少なくとも１つの薬剤を投与するステップを更に含む。
好ましくは、上記薬剤は、本発明が提供する抗体、融合タンパク質若しくはコンジュゲート、核酸配列、ベクター、宿主細胞、及び／又は本発明の方法で産生される抗体と、同時に又は順次投与される。
また更に別の態様では、本発明はキットも提供し、上記キットは、本発明が提供する抗体、融合タンパク質若しくはコンジュゲート、核酸配列、ベクター、宿主細胞、及び／又は本発明の方法で産生される抗体を含む。
本発明の非限定的な実施形態及び付随する図面と組み合わせることにより、本発明を更に理解できる。
図１は、マウスにおける、本発明の抗体の薬物動態曲線を示す。 図２は、カニクイザルにおける、本発明の抗体の薬物動態曲線を示す。 図３は、ＦＡＣＳによって決定されるような、本発明の抗体の、ＩＬ‐４Ｒαを発現するＴＦ‐１細胞との特異的結合を示す、パネル３Ａ～３Ｃを含み、パネル３Ａは、本発明の抗体Ｌ１０１２Ｈ１０３１を添加しない場合の蛍光信号を示し；パネル３Ｂは、本発明の抗体Ｌ１０１２Ｈ１０３１を添加した場合の蛍光信号を示し；パネル３Ｃは、比較のためのパネル３Ａとパネル３Ｂとの信号の重畳を示す。 図４は、ＦＡＣＳによって決定されるように、本発明の抗体の、ＩＬ‐４Ｒαを発現するＴＦ‐１細胞との特異的結合が、系内に存在するｓＩＬ‐４Ｒαによってブロックされることを示す、パネル４Ａ～４Ｄを含み、パネル４Ａは、本発明の抗体Ｌ１０１２Ｈ１０３１を添加しない場合の蛍光信号を示し；パネル４Ｂは、本発明の抗体Ｌ１０１２Ｈ１０３１を添加した場合の蛍光信号を示し；パネル４Ｃは、本発明の抗体Ｌ１０１２Ｈ１０３１とｓＩＬ‐４Ｒαとを添加した場合の蛍光信号を示し；パネル４Ｄは、比較のためのパネル４Ａ～４Ｃの信号の重畳を示す。 図５は、ＥＬＩＳＡによって決定されるような、ＴＡＲＣ及びＭＤＣ放出の阻害に対する本発明の抗体の効果を示す、パネル５Ａ～５Ｂを含み、パネル５Ａは、本発明の抗体Ｌ１０２０Ｈ１０３１がＴＡＲＣ放出を阻害するという結果を示し、パネル５Ｂは、本発明の抗体Ｌ１０２０Ｈ１０３１がＭＤＣ放出を阻害するという結果を示す。
これより、特定の実施形態と組み合わせて、本発明を更に詳述する。提供される実施形態は本発明を説明するために使用されるだけのものであり、本発明の範囲をいずれの点でも制限しないことは、当業者には理解されるであろう。
以下の実施例における実験方法は、特段の言明がない限り全て従来の方法である。以下の実施例で使用した原材料は、特段の言明がない限り、従来の生化学試薬販売元から市販されているものである。
以下の実施例では、表１に示す抗体及びその効果を例示的に提供し、実証する。
Figure 0007025356000001
Figure 0007025356000002
Figure 0007025356000003
実施例１：本発明の抗体の調製、及び非還元ＳＤＳ‐ＰＡＧＥゲル電気泳動による発現レベルの決定
抗体の軽鎖可変領域のコード配列を、ＥｃｏＲＩ及びＢｓｉＷＩ制限部位を用いてベクターｐＦＵＳＥ２ｓｓ‐ＣＬＩｇ‐ｈＫ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ、カタログ番号：ｐｆｕｓｅ２ｓｓ‐ｈｃｌｋ）に挿入し、軽鎖発現ベクターを構築した。抗体の重鎖可変領域のコード配列を、ＥｃｏＲＩ及びＮｈｅＩ制限部位を用いてベクターｐＦＵＳＥｓｓ‐ＣＨＩｇ‐ｈＧ２（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ、カタログ番号：ｐｆｕｓｅｓｓ‐ｈｃｈｇ２）又はベクターｐＦＵＳＥｓｓ‐ＣＨＩｇ‐ｈＧ４（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ、カタログ番号：ｐｆｕｓｅｓｓ‐ｈｃｈｇ４）に挿入し、重鎖発現ベクターを構築した。
Ｅｘｐｉ２９３細胞の培養及びトランスフェクションを、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製のＥｘｐｉ２９３（商標）発現系キット（カタログ番号：Ａ１４６３５）のハンドブックに従って実施した。細胞の密度を、トランスフェクションのために２×１０6細胞／ｍｌに調整し０．６μｇの上述の軽鎖発現ベクターと、０．４μｇの上述の重鎖発現ベクターとを、細胞培養物１ｍｌ毎に添加し、培養物の上清を４日後に回収した。
培養物の上清を、添付文書８、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」第３版に記載のプロトコルに従って非還元ＳＤＳ‐ＰＡＧＥゲル電気泳動に供した。
ＢＥＩＪＩＮＧ ＪＵＮＹＩ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ Ｃｏ．， ＬＴＤ製のゲル走査撮像システムを用いて写真を撮影し、Ｇｅｌ‐ＰＲＯ ＡＮＡＬＹＺＥＲソフトウェアを用いてゲル内定量を実施して、一過性トランスフェクション後の抗体の発現レベルを決定した。結果は、対照抗体１の発現レベルに対して表現した（対照抗体１は米国特許第７，１８６，８０９号に従って構築され、米国特許第７，１８６，８０９号の配列番号１０に記載の軽鎖可変領域と、米国特許第７，１８６，８０９号の配列番号１２に記載の重鎖可変領域とを含み、以下でも同様である）（対照抗体２は米国特許第７，６３８，６０６号に従って構築され、米国特許第７，６３８，６０６号の配列番号６に記載の軽鎖可変領域と、米国特許第７，６３８，６０６号の配列番号４２に記載の重鎖可変領域とを含み、以下でも同様である）。結果に関しては、以下の表２ａ～２ｃを参照されたい。
Figure 0007025356000004
Figure 0007025356000005
Figure 0007025356000006
実施例２：ｈＩＬ‐４又はｈＩＬ‐１３によるＴＦ‐１細胞の増殖に対する本発明の抗体の阻害効果の検出
１．試薬の調製
ｈＩＬ‐４（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ、カタログ番号：ｒｈＩＬ‐４）溶液：ｈＩＬ‐４を、０．１％のＢＳＡを含有した１００μｌのＰＢＳ（Ｂｅｙｏｔｉｍｅ、カタログ番号：ＳＴ０２３）中に溶解させて、濃度１００μｇ／ｍｌの溶液を得、溶解させたｈＩＬ‐４を、１．５ｍｌ（Ｎｕｎｃ）遠心分離チューブに、チューブ１個あたり５μｌの体積で分注して、これらのチューブを－２０℃の冷凍庫内で保管した。
ＷＳＴ‐１（Ｂｅｙｏｔｉｍｅ、カタログ番号：Ｃ００３６）溶液：５ｍｌの電子結合剤（Ｃ００３６‐２）をＷＳＴ‐１粉体（Ｃ００３６‐１）に添加し、ＷＳＴ‐１粉体を完全に溶解させてＷＳＴ‐１溶液を得た後、１．５ｍｌ（Ｎｕｎｃ）遠心分離チューブに、チューブ１個あたり６２０μｌの体積で分注して、これらのチューブを－２０℃の冷凍庫内で保管した。
２．ＴＦ‐１細胞の培養
液体窒素中で冷凍させたＴＦ‐１細胞（ＡＴＣＣ：ＣＲＬ‐２００３（商標））を取り出し、３７℃の水浴中で振盪して迅速に溶解させた。溶解後の細胞懸濁液を１５ｍｌ遠心分離チューブに移した後、１６４０培地をこれに添加して１０ｍｌとした。チューブを８００ｒｐｍで５分間遠心分離し、チューブ中の上清を吸引し、細胞ペレットを保持して再び洗浄した。１０％のＦＢＳ及び２ｎｇ／ｍｌのＧＭ‐ＣＳＦ（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、カタログ番号：１００１５‐Ｈ０１Ｈ）を含有する、１０ｍｌの１６４０培地を、上記チューブに添加し、１×１０5～１×１０6細胞／ｍｌの細胞密度を得た。懸濁液をＴ７５細胞培養フラスコ（Ｎｕｎｃ）に移し、細胞を、３７℃、５％ＣＯ2のインキュベータ（Ｔｈｅｒｍｏ）内で静置培養した。２～３日毎に細胞懸濁液を取り出し、８００ｒｐｍで５分間遠心分離し、細胞を１０ｍｌの培地中に再懸濁した。その後、１×１０6個の細胞を計数し、新たなＴ７５細胞培養フラスコに移し、このフラスコに培地を加えて１０ｍｌとした。細胞を２～３回連続的に継代させて、増殖ブロッキング実験のために良好な状態に到達させた（細胞は明色であり、個々に懸濁させた場合にわずかに不規則な形状を有していた）。
３．抗体の調製及び精製
ａ）本発明の抗体の細胞培養物上清試料
Ｅｘｐｉ２９３細胞を、抗体の遺伝子の異なる群を担持したプラスミドでトランスフェクトし、２００μｌの細胞培養物上清をトランスフェクションの４日後に取り出し、８００ｒｐｍで５分間遠心分離した。この上清を、細孔サイズ０．２２μｍのフィルタでろ過し、増殖ブロッキング実験に使用した。
ｂ）本発明の精製済み抗体試料：本発明の各抗体に関して、上記抗体を発現する細胞の培養物上清を、０．２２μｍフィルタに通した後、精製システムＧＥ ＡＫＴＡ精製器１０内のＧＥ ＭａｂＳｅｌｅｃｔ Ｓｕｒｅ（カタログ番号：１１００３４９４）タンパク質Ａアフィニティクロマトグラフィカラムで精製した。精製された抗体を回収し、Ａｍｉｃｏｎ限外ろ過濃縮器（カタログ番号：ＵＦＣ９０３０９６）を用いて濃縮した後定量した。増殖ブロッキング実験のために、上記抗体をＰＢＳで０～１μｇ／ｍｌまで希釈した。
４．増殖ブロッキング実験
Ｔ７５細胞培養フラスコ内の十分に成長した細胞を取り出し、１５ｍｌ遠心分離チューブに移し、これを８００ｒｐｍで５分間遠心分離した。上清を廃棄し、細胞ペレットを１０ｍｌのＰＢＳで再懸濁し、８００ｒｐｍで５分間遠心分離した。上清を廃棄し、細胞ペレットを、１０％のＦＢＳを含有する１０ｍｌの１６４０培地（ＧＭ‐ＣＳＦを含まない）で再懸濁し、８００ｒｐｍで５分間遠心分離した。上清を廃棄し、細胞ペレットを、１０％のＦＢＳを含有する５ｍｌの１６４０培地（ＧＭ‐ＣＳＦを含まない）で再懸濁した。細胞を計数し、培地を補充することによって、５×１０5細胞／ｍｌの細胞密度に調整した。この細胞懸濁液を、９６ウェルプレートに、１ウェルあたり８０μｌの体積で添加した（揮発を防止するために、外側リング内のウェルは細胞を含まないままとした）。本発明の各抗体に関して、様々な濃度の１０μｌの精製済み抗体、又は１０μｌの対応する細胞培養物上清を、９６ウェルプレート内の細胞に添加した（同一のウェルを３個複製した）。次にｈＩＬ‐４を、１０％のＦＢＳを含有する１６４０培地で５０ｎｇ／ｍｌに希釈し、９６ウェルプレート内の対応するウェルに、１ウェルあたり１０μｌの体積で添加し、これにより最終細胞濃度が４×１０5細胞／ｍｌとなり、ｈＩＬ‐４の濃度が５ｎｇ／ｍｌとなり、９６ウェルプレート内の各ウェル内の体積が１００μｌとなった。ｈＩＬ‐４又は抗体が添加されず、同一数の細胞及び同一体積の培養培地のみが添加された、陰性対照群（同一のウェルを３個複製）を設定した。その一方で、同一濃度のｈＩＬ‐４及び同一体積の培地が添加された陽性対照群（同一のウェルを３個複製）を設定し、この群には抗体は添加されなかった。２００μｌのＰＢＳを、９６ウェル細胞プレートの外側リング内の各ウェルに添加することにより、内側リングにおける液体の揮発を防止した。静置培養のために、９６ウェル細胞プレートを、３７℃の５％ＣＯ2インキュベータ内に入れた。
上述の実験を、５００ｎｇ／ｍｌのｈＩＬ‐１３（細胞への添加後、その最終濃度は５０ｎｇ／ｍｌとなる）を用いて、同一の手順で繰り返した。
５．データ統計
９６ウェル細胞プレートを、５％ＣＯ2インキュベータ内で７２時間静置培養した後、１０μｌのＷＳＴ‐１溶液を、各ウェル中の細胞に添加した。更なる静置培養のために、９６ウェル細胞プレートを、３７℃の５％ＣＯ2インキュベータ内に入れた。２４時間後、９６ウェルプレートをｆｌｅｘｓｔａｔｉｏｎ ３（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）に入れ、ＯＤ４５０－ＯＤ６５０の値を読み取った。
本発明の抗体の培養物上清に関して、これらの並びに陽性対照群及び陰性対照群のＯＤ４５０－ＯＤ６５０の値（ＯＤ値）を用いて、阻害率を以下のように算出した：阻害率＝（トランスフェクト済み細胞の上清のＯＤ値－陽性対照群のＯＤ値）／（陰性対照群のＯＤ値－陽性対照群のＯＤ値）×１００％。ｈＩＬ‐４又はｈＩＬ‐１３によるＴＦ‐１細胞の増殖に対する、本発明の抗体のブロッキング効果の結果を、以下の表３ａ～３ｂに示す。
様々な濃度の本発明の精製済み抗体に関して、測定したＯＤ４５０－ＯＤ６５０データをｐｒｉｓｍ５ソフトウェアに入力し、陰性対照群の値を最低値に設定し、陽性対照群の値を最高値に設定して、抗体濃度の対数を取得した。ＯＤ４５０－ＯＤ６５０値に対する抗体濃度の対数の曲線を、ｐｒｉｓｍ５ソフトウェアでフィッティングした。算出されたＩＣ５０を以下の表４に示す。
Figure 0007025356000007
Figure 0007025356000008
Figure 0007025356000009
Figure 0007025356000010
Figure 0007025356000011
実施例３：ＥＬＩＳＡによる、ｓＩＬ‐４Ｒに対する本発明の抗体の結合能力の検出
１．試薬の調製
ｓＩＬ‐４Ｒα（ＰＥＰＲＯ ＴＥＣＨ、カタログ番号：２００‐０４Ｒ）溶液：ｓＩＬ‐４Ｒαを取り、これに１ｍｌのｄｄＨ2Ｏを添加し、上下に振って混合して、１００μｇ／ｍｌの溶液を得た。この溶液を分包した後、－２０℃の冷凍庫内で保管した。
試験用試料：本発明の各抗体に関して、一過性トランスフェクション後に上記抗体を発現するＥｘｐｉ２９３細胞の培養物上清（培地はＥｘｐｉ２９３発現培地、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号：Ａ１４３５１０２であり；懸濁培養を８％ＣＯ2インキュベータ中において１００ｒｐｍで４日間実施した）を、１０μｌ及び２μｌ、それぞれ９９０μｌ及び９９８μｌのＰＢＳに添加して、１：１００及び１：５００希釈の試験用抗体試料を調製した。
対照試料：陰性対照試料として、正常な細胞の培養物上清（未トランスフェクトＥｘｐｉ２９３細胞；培地はＥｘｐｉ２９３発現培地、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号：Ａ１４３５１０２であり；懸濁培養を８％ＣＯ2インキュベータ中において１００ｒｐｍで４日間実施した）も、１：１００及び１：５００で希釈した。
２．ＥＬＩＳＡによる検出
１００μｌの１００μｇ／ｍｌ ｓＩＬ‐４Ｒα溶液を、９．９０ｍｌのＰＢＳに添加し、上下に振って混合して、１．０μｇ／ｍｌの抗原コーティング緩衝液を得た。調製した抗原コーティング緩衝液を、９６ウェルＥＬＩＳＡプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に、１ウェルあたり１００μｌの体積で添加した。９６ウェルＥＬＩＳＡプレートを、４℃の冷蔵庫内で一晩インキュベートした。翌日、上記プレート内の溶液を廃棄し、２％のＢＳＡを含有するＰＢＳを、９６ウェルＥＬＩＳＡプレートに、１ウェルあたり３００μｌの体積で、１列ずつ添加した。９６ウェルＥＬＩＳＡプレートを、４℃の冷蔵庫内で２時間インキュベートした。次に、２％のＢＳＡを含有するＰＢＳを廃棄し、プレートをＰＢＳＴで３回洗浄した。希釈された試験用抗体を対応するウェルに順次添加し、その一方で、陰性対照試料としての正常細胞培養物上清も同様に添加した。各試料に関して、同一のウェルを３個複製し、１ウェルあたりの体積は１００μｌとした。ＥＬＩＳＡプレートに保存用フィルムを巻き付け（保存用フィルムで被覆し）、定温インキュベータ内において１０℃で１時間インキュベートした。続いて９６ウェルＥＬＩＳＡプレートを取り出し、中の溶液を廃棄した。ＰＢＳＴで３回洗浄した後、ＴＭＢ溶液（Ｓｏｌａｒｂｉｏ、カタログ番号：ＰＲ１２００）を９６ウェルＥＬＩＳＡプレートに、１ウェルあたり１００μｌの体積で、１列ずつ添加した。９６ウェルＥＬＩＳＡプレートを室温に５分間置き、２Ｍ Ｈ2ＳＯ4溶液を即座に添加して反応を終了させた。９６ウェルＥＬＩＳＡプレートをｆｌｅｘｓｔａｔｉｏｎ ３（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）に入れ、ＯＤ４５０の値を読み取り、データを収集、算出及び分析した。結果を、対照抗体１の親和性に対して表した。結果に関しては、以下の表５ａ～５ｃを参照されたい。
Figure 0007025356000012
Figure 0007025356000013
Figure 0007025356000014
Figure 0007025356000015
実施例４：マウスにおける本発明の抗体の薬物動態
抗体を更にスクリーニングするために、一連の薬物動態実験をマウスにおいて実施した。
６～８週齢のＳＰＦ Ｂａｌｂ／ｃマウスを選択し、抗体（本発明の抗体又は対照抗体２）を、５ｍｇ／ｋｇ（マウスの体重）の用量で皮下注射した。血液試料を、投与前（０時間）、及び投与後２、８、２４、４８、７２、１２０、１６８、２１６、２６４、３３６時間の時点で回収した。血液試料採取のために、イソフルランの吸入によって動物を麻酔し、血液試料を眼窩静脈叢から採取し、各動物に関する試料採取体積は約０．１ｍｌであり；投与の３３６時間後には、イソフルランの吸入によって動物を麻酔し、下大静脈から血液を採取した後、安楽死させた。
血液試料には抗凝血剤を添加せず、血液試料採取後２時間以内に、室温における１５００ｇで１０分間の遠心分離によって、各試料から血清を分離した。回収した上清を、新たに標識された遠心分離チューブに即座に移し、一時的保管のために－７０℃で保管した。マウスにおける抗体の濃度を、ＥＬＩＳＡで決定した。
１．試薬の調製
ｓＩＬ‐４Ｒα（ＰＥＰＲＯ ＴＥＣＨ、カタログ番号：２００‐０４Ｒ）溶液：ｓＩＬ‐４Ｒαを取り、これに１ｍｌのｄｄＨ2Ｏを添加し、上下に振って混合して、１００μｇ／ｍｌの溶液を得た。この溶液を分包した後、－２０℃の冷凍庫内で保管した。
試験用試料：異なる時点で回収した１μｌの血清を、１％のＢＳＡを含有する９９９μｌのＰＢＳに添加して、１：１０００希釈の試験用試料を調製した。
標準試料：試験用抗体を、１％のＢＳＡ及び０．１％の正常な動物の血清を含有するＰＢＳ（Ｂｅｙｏｔｉｍｅ、カタログ番号：ＳＴ０２３）で、０．１μｇ／ｍｌに希釈した。その後、１％のＢＳＡ及び０．１％の正常な動物の血清を含有する、２００、４００、６００、８００、９００、９５０、９９０、１０００μｌのＰＢＳを、それぞれ８００、６００、４００、２００、１００、５０、１０、０μｌの、０．１μｇ／ｍｌの試験用抗体に添加することにより、最終濃度がそれぞれ８０、６０、４０、２０、１０、５、１又は０ｎｇ／ｍｌの、本発明の抗体の標準試料を調製した。
２．ＥＬＩＳＡによる検出
２５０μｌの１００μｇ／ｍｌ ｓＩＬ‐４Ｒα溶液を、９．７５ｍｌのＰＢＳに添加し、上下に振って混合して、２．５μｇ／ｍｌの抗原コーティング緩衝液を得た。調製した抗原コーティング緩衝液を、９６ウェルＥＬＩＳＡプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に、１ウェルあたり１００μｌの体積で添加した。９６ウェルＥＬＩＳＡプレートを、保存用フィルムを巻き付けた（保存用フィルムで被覆した）後に、４℃の冷蔵庫内で一晩インキュベートした。翌日、上記プレート内の溶液を廃棄し、２％のＢＳＡを含有するＰＢＳを１ウェルあたり３００μｌの体積で添加した。９６ウェルＥＬＩＳＡプレートを、保存用フィルムを巻き付けた（保存用フィルムで被覆した）後に、４℃の冷蔵庫内で２時間インキュベートした。次に、９６ウェルＥＬＩＳＡプレートを取り出し、上記プレート内の溶液を廃棄し、プレートをＰＢＳＴで３回洗浄した。希釈された標準抗体及び検出用血清を、対応するウェルに順次添加し、各試料に関して、同一のウェルを３個複製し、１ウェルあたりの体積は１００μｌとした。ＥＬＩＳＡプレートに保存用フィルムを巻き付け（保存用フィルムで被覆し）、室温で１時間インキュベートした。続いて９６ウェルＥＬＩＳＡプレート内の溶液を廃棄し、プレートをＰＢＳＴで３回洗浄した。その後、ＴＭＢ溶液（Ｓｏｌａｒｂｉｏ、カタログ番号：ＰＲ１２００）を９６ウェルＥＬＩＳＡプレートに、１ウェルあたり１００μｌの体積で、１列ずつ添加した。９６ウェルＥＬＩＳＡプレート室温に５分間置き、２Ｍ Ｈ2ＳＯ4溶液を即座に添加して反応を終了させた。９６ウェルＥＬＩＳＡプレートをｆｌｅｘｓｔａｔｉｏｎ ３（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）に入れ、ＯＤ４５０の値を読み取り、データを収集し、結果をＷｉｎｎｏｎｌｉｎソフトウェアで算出した。薬物動態の結果を図１及び以下の表６に示した。
Figure 0007025356000016
実施例５：カニクイザルにおける本発明の抗体の薬物動態
抗体を更にスクリーニングするために、一連の薬物動態実験をカニクイザルにおいて実施した。
体重がそれぞれ２~５ｋｇの３～５歳のカニクイザルを選択し、抗体（本発明の抗体又は対照抗体２）を、５ｍｇ／ｋｇ（カニクイザルの体重）の用量で皮下注射した。投与されることになる抗体又は対照抗体２を、使い捨て無菌注射器を用いて正確に抽出し、動物の大腿の内側に多点皮下注射を行い、１地点あたりの注射体積は２ｍｌ以下とした。全血試料を、投与前（０時間）、及び投与後０．５、２、４、８、２４、４８、７２、１２０、１６８、２４０、３３６、４３２、５０４、６００、６７２時間の時点で、動物の後肢の皮下静脈から回収した。各動物から回収した血液の体積は、各時点において約０．１ｍｌであった。
血液試料には抗凝血剤を添加せず、血液試料採取後２時間以内に、室温における１５００ｇで１０分間の遠心分離によって、各試料から血清を分離した。回収した上清を、新たに標識された遠心分離チューブに即座に移し、一時的保管のために－７０℃で保管した。カニクイザルにおける抗体の濃度を、実施例４に記載の方法に従って決定した。薬物動態の結果を、図２及び以下の表７に示す。
Figure 0007025356000017
実施例６：ＦＡＣＳによる、ＴＦ‐１細胞への本発明の抗体の結合の検出
１．細胞培養
液体窒素中で冷凍させたＴＦ‐１細胞（ＡＴＣＣ：ＣＲＬ‐２００３（商標））を取り出し、３７℃の水浴中で穏やかに振盪して迅速に溶解させた。溶解後の細胞懸濁液を１５ｍｌ遠心分離チューブに移した後、１６４０培地（Ｈｙｃｌｏｎｅ、カタログ番号：ＳＨ３０８０９．０１Ｂ）をこれに添加して１０ｍｌとした。チューブを８００ｒｐｍで５分間遠心分離し、チューブ中の上清を吸引して除去し、細胞ペレットを保持して再び洗浄した。１０％のＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ、カタログ番号：ＳＶ３０１８４．０２）及び２ｎｇ／ｍｌのＧＭ‐ＣＳＦ（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、カタログ番号：１００１５‐Ｈ０１Ｈ）を含有する、１０ｍｌの１６４０培地を用いて、細胞密度を１×１０5～１×１０6細胞／ｍｌに調整した。懸濁液をＴ７５細胞培養フラスコ（Ｎｕｎｃ）に移し、細胞を、３７℃、５％ＣＯ2のインキュベータ（Ｔｈｅｒｍｏ）内で静置培養した。２～３日毎に細胞懸濁液を取り出し、８００ｒｐｍで５分間遠心分離し、細胞を１０ｍｌの培地中に再懸濁した。その後、１×１０6個の細胞を計数し、新たなＴ７５細胞培養フラスコに移し、このフラスコに培地を加えて１０ｍｌとした。細胞を２～３回連続的に継代させて、実験のために良好な状態に到達させた（細胞は明色であり、個々に懸濁させた場合にわずかに不規則な形状を有していた）。
２．細胞処理
ＴＦ‐１細胞を取り、顕微鏡下で計数した。細胞を３つの群に分け、３つの１．５ｍｌ遠心分離チューブにそれぞれ入れた。各群の細胞の数は、１×１０6であった。細胞を８００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、再度の洗浄のために、１％のＢＳＡを含有する１ｍｌの低温のＰＢＳ中に再懸濁した。続いて細胞を８００ｒｐｍで５分間遠心分離し、各遠心分離チューブに１％のＢＳＡを含有する４５μｌの低温ＰＢＳを添加して細胞を再懸濁し、５μｌ（５００μｇ／ｍｌ）の本発明の抗体Ｌ１０２１Ｈ１０３１、Ｌ１０２０Ｈ１０３１又はＬ１０１２Ｈ１０３１を第１の遠心分離チューブに添加し、また５μｌのＰＢＳを、陰性対照としての第２の遠心分離チューブに添加した。細胞を氷上で４５分間放置した後、８００ｒｐｍで５分間遠心分離した。その後細胞を、再度の洗浄のために、１％のＢＳＡを含有する１ｍｌの低温のＰＢＳ中に再懸濁し、８００ｒｐｍで５分間遠心分離した。１％のＢＳＡを含有する４９９μｌの低温のＰＢＳを各遠心分離チューブに添加して細胞を再懸濁した後、これに、１μｌのＦＩＴＣ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｂｅｙｏｔｉｍｅ、カタログ番号：Ａ０５５６）を添加した。氷上で４５分間放置した後、細胞を８００ｒｐｍで５分間遠心分離し、再度の洗浄のために、１％のＢＳＡを含有する１ｍｌの低温のＰＢＳ中に再懸濁した。このようにして、検出用の細胞を得た。
３．ＦＡＣＳによる検出
ＦＡＣＳ機器及びそのオペレーティングシステムを、正確なプロトコルに従って動作させた。性格なパラメータの設定後、細胞を検出チューブに添加して、ＦＬ１チャネルの蛍光信号を検出した。結果をＦｌｏｗＪｏ７．６ソフトウェアで分析し、結果を図３のパネル３Ａ～３Ｃに示す。本発明の抗体が、ＩＬ‐４Ｒαを発現するＴＦ‐１細胞に特異的に結合できることを確認できる。
実施例７：ＦＡＣＳによる、ＴＦ‐１細胞への抗体の結合に対する可溶性ｈＩＬ‐４Ｒα（ｓＩＬ‐４Ｒα）のブロッキング効果の検出
１．試薬の調製
ｈＩＬ‐４（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ、カタログ番号：ｒｈＩＬ‐４）溶液を、実施例２に記載されているとおりに調製した。
２．細胞培養
ＴＦ‐１細胞（ＡＴＣＣ：ＣＲＬ‐２００３（商標））を、実施例６に記載されているとおりに培養した。
３．ｓＩＬ‐４Ｒαと本発明の抗体との混合
１０μｌ（１００μｇ／ｍｌ）のｓＩＬ‐４Ｒαと、５μｌ（５００μｇ／ｍｌ）の本発明の抗体Ｌ１０２１Ｈ１０３１、Ｌ１０２０Ｈ１０３１又はＬ１０１２Ｈ１０３１とを、モル比２：１で、１．５ｍｌ遠心分離チューブ内で均一に混合した。１０μｌのＰＢＳと５μｌの本発明の抗体Ｌ１０２１Ｈ１０３１、Ｌ１０２０Ｈ１０３１又はＬ１０１２Ｈ１０３１との混合物を陽性対照として利用し、１５μｌのＰＢＳを陰性対照として利用した。遠心分離チューブを３７℃のインキュベータ内に１時間入れた。
４．細胞処理
ＴＦ‐１細胞を取り、顕微鏡下で計数した。細胞を４つの群に分け、４つの１．５ｍｌ遠心分離チューブにそれぞれ入れた。各群の細胞の数は、１×１０6であった。細胞を８００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、再度の洗浄のために、１％のＢＳＡを含有する１ｍｌの低温のＰＢＳ中に再懸濁した。続いて細胞を８００ｒｐｍで５分間遠心分離し、各遠心分離チューブに１％のＢＳＡを含有する３５μｌの低温ＰＢＳを添加して細胞を再懸濁し、１５μｌのの、ステップ３で調製した異なる複数の抗体混合物及び対照を、それぞれチューブに添加した。氷上で４５分間放置した後、細胞を８００ｒｐｍで５分間遠心分離し、再度の洗浄のために、１％のＢＳＡを含有する１ｍｌの低温のＰＢＳ中に再懸濁し、８００ｒｐｍで５分間遠心分離した。１％のＢＳＡを含有する４９９μｌの低温のＰＢＳを各遠心分離チューブに添加して細胞を再懸濁した後、これに、１μｌのＦＩＴＣ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｂｅｙｏｔｉｍｅ、カタログ番号：Ａ０５５６）を添加した。氷上で４５分間放置した後、細胞を８００ｒｐｍで５分間遠心分離し、再度の洗浄のために、１％のＢＳＡを含有する１ｍｌの低温のＰＢＳ中に再懸濁した。このようにして、検出用の細胞を得た。
５．ＦＡＣＳによる検出
ＦＡＣＳ機器及びそのオペレーティングシステムを、正確なプロトコルに従って動作させた。性格なパラメータの設定後、細胞を検出チューブに添加して、ＦＬ１チャネルの蛍光信号を検出した。結果をＦｌｏｗＪｏ７．６ソフトウェアで分析し、結果を図４のパネル４Ａ～４Ｄに示す。ｓＩＬ‐４Ｒαが、ＴＦ‐１細胞への本発明の抗体の特異的結合を、特異的かつ効果的にブロックできることを確認できる。
実施例８：Ｂｉａｃｏｒｅによる抗体親和性の決定
抗ヒトＦｃ（ＡＨＣ）抗体（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）をＣＭ５チップに結合させ、本発明の抗体をそれぞれＡＨＣでキャプチャした。続いて、様々な濃度のヒトｓＩＬ‐４Ｒαを、本発明の抗体をキャプチャしたチップの表面を通して流した。キャプチャ及び結合のために、本発明の抗体を２μｇ／ｍｌに希釈し、抗原ｓＩＬ‐４Ｒαを０．３９、０．７８、１．５６、３．１３、６．２５、１２．５、２５．０、５０．０、１００．０ｎＭに希釈した。そして、実験方法をＢｉａｃｏｒｅ Ｔ２００制御ソフトウェアにおいて確立した後、検出のために実験プログラムを実行した。結果を以下の表８に示す。
Figure 0007025356000018
実施例９：ＥＬＩＳＡによる、ＴＡＲＣ及びＭＤＣ放出に対する本発明の抗体の阻害効果の調査
ヘパリンを用いて抗凝血化された、（寄付された）１０ｍｌの新鮮な血液を、ＰＢＳと、室温で１：１の比で混合し、混合物を、事前に調製した２０ｍｌのヒトリンパ球分離溶液（Ｓｏｌａｒｂｉｏ、カタログ番号：Ｐ８６１０）に、注意深く添加した。室温において１５００ｒｐｍで３０分間遠心分離した後、ＰＢＭＣ層を注意深く吸引し、ＰＢＳで２回洗浄した。最後に細胞を、１０％のＦＢＳ及び２００ＩＵ／ｍｌのＩＬ‐２を含有する１６４０培地で希釈してから、２４ウェルプレートに、１ウェル当たり１×１０6細胞で添加した。その後、最終濃度１０００、３００、１００、３０又は１０ｎｇ／ｍｌの抗体Ｌ１０２０Ｈ１０３１を各ウェルに添加し、続いてこれに、最終濃度１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ‐４（又は最終濃度１００ｎｇ／ｍｌのＩＬ‐１３）を添加した。培養の７２時間後に、ヒトＴＡＲＣ ＥＬＩＳＡキット（Ａｂｃａｍ、カタログ番号：ａｂ１８３３６６）又はヒトＭＤＣ ＥＬＩＳＡキット（Ａｂｃａｍ、カタログ番号：ａｂ１７９８８５）によって提供される方法に従って、検出を実施した。
結果は図５のパネル５Ａ～５Ｂに示されており、これらは、本発明の抗体がＴＡＲＣ及びＭＤＣ放出を効果的に阻害できること、並びに放出に対する阻害効果が、抗体濃度の上昇と共に増大することを示している。
実施例１０：本発明の抗体の薬物動態及び発現レベルに対する、特定のアミノ酸の影響
この実施例では、本発明の抗体のインビボ薬物動態を更に検出及び比較することにより、動物中の抗体の薬物動態に対する、特定の位置の特定のアミノ酸の、可能性のある影響を調査する。具体的な実験方法は実施例４に記載されているものと同一であり、結果を以下の表９に示す。
Figure 0007025356000019
具体的な配列から、抗体の重鎖Ｈ１０３１（配列番号９１）の配列中の１０３位（ＣＤＲ３中）のアミノ酸はＡｓｐ（１０３Ａｓｐ）であり、１０４位のアミノ酸はＴｙｒ（１０４Ｔｙｒ）であることが分かる。１０３Ａｓｐ及び１０４Ｔｙｒを重鎖中に有しない抗体に比べて、１０３Ａｓｐ及び１０４Ｔｙｒを有する本発明の抗体は、薬物‐時間曲線の下側の面積が２～４倍大きく、また排除速度が約７０％低減されている。
また、本発明の抗体の発現レベルを検出及び比較することにより、抗体の発現に対する、特定の位置の特定のアミノ酸の、可能性のある影響を調査する。Ｅｘｐｉ２９３細胞の培養及びトランスフェクションを実施例１に従って実施し、回収した培養物上清を０．２２μｍフィルタに通し、精製システムＧＥ ＡＫＴＡ精製器１０内のＧＥ ＭａｂＳｅｌｅｃｔ Ｓｕｒｅ（カタログ番号：１１００３４９４）タンパク質Ａアフィニティクロマトグラフィカラムで精製した。精製された抗体を回収し、Ａｍｉｃｏｎ限外ろ過濃縮器（カタログ番号：ＵＦＣ９０３０９６）を用いて濃縮した。定量結果を以下の表１０に示す。
Figure 0007025356000020
具体的な配列から、抗体の軽鎖Ｌ１０１２（配列番号４４）、Ｌ１０２０（配列番号５５）又はＬ１０２３（配列番号５１）の配列中の３１位（ＣＤＲ１中）は、Ｓｅｒ（３１Ｓｅｒ）であることが分かる。３１Ｓｅｒを軽鎖中に有しない抗体に比べて、３１Ｓｅｒを有する本発明の抗体は、発現レベルが２～５倍高い。
本発明の実施形態に関する上述の説明は、本発明を限定することを意図したものではなく、当業者は本発明に従って様々な変更及び変形を実施でき、上記変更及び変形は、本発明の請求項の精神から逸脱することなく、本発明の請求項の保護範囲内となる。

Claims (48)

  1. インターロイキン‐４（ＩＬ‐４）受容体（ＩＬ‐４Ｒ）に結合できる抗体であって、
    以下のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３の組み合わせ：
    配列番号２に記載のＣＤＲ１、配列番号３に記載のＣＤＲ２、及び配列番号８に記載のＣＤＲ３；
    を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、
    また、以下のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３の組み合わせ：
    配列番号１４に記載のＣＤＲ１、配列番号１８に記載のＣＤＲ２、及び配列番号１９に記載のＣＤＲ３；
    を含む重鎖可変領域（ＶＨ）を含む、抗体。
  2. 前記抗体の軽鎖可変領域は、配列番号５５に示されるアミノ酸配列を含み、また、前記抗体の重鎖可変領域は、配列番号９１に示されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の抗体。
  3. 前記抗体は、インターロイキン‐４（ＩＬ‐４）受容体（ＩＬ‐４Ｒ）に結合できる、請求項１または２に記載の抗体。
  4. 前記抗体は、ＩＬ‐４Ｒαに結合できる、請求項１または２に記載の抗体。
  5. 前記抗体は、哺乳類ＩＬ‐４Ｒαに結合できる、請求項１または２に記載の抗体。
  6. 前記抗体は、ヒトＩＬ‐４Ｒαに結合できる、請求項１または２に記載の抗体。
  7. 前記抗体は、ヒト可溶性ＩＬ‐４Ｒαに結合できる、請求項１または２に記載の抗体。
  8. 前記抗体は、１００ｎＭ未満、１０ｎＭ未満、１ｎＭ未満、又は０．５ｎＭ未満の親和性でＩＬ‐４Ｒαに結合できる、請求項１または２に記載の抗体。
  9. 前記抗体は、モノクローナル抗体、完全若しくは部分ヒト化抗体、又はキメラ抗体である、請求項１または２に記載の抗体。
  10. 前記抗体は、イムノグロブリンである、請求項１または２に記載の抗体。
  11. 前記抗体は、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ又はＩｇＭである、請求項１または２に記載の抗体。
  12. 前記抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４サブタイプである、請求項１または２に記載の抗体。
  13. 前記抗体は、ヒトＩｇＧ４サブタイプである、請求項１または２に記載の抗体。
  14. 請求項１～１３のいずれか１項に記載の抗体を含む、融合タンパク質又はコンジュゲート。
  15. 請求項１３に記載の抗体を含む、融合タンパク質又はコンジュゲート。
  16. 請求項１～１３のいずれか１項に記載の抗体の重鎖可変領域及び／又は軽鎖可変領域をコードする、核酸分子。
  17. 請求項１３に記載の抗体の重鎖可変領域及び／又は軽鎖可変領域をコードする、核酸分子。
  18. 請求項１～１３のいずれか１項に記載の抗体の重鎖及び／又は軽鎖をコードする、請求項１６に記載の核酸分子。
  19. 請求項１３に記載の抗体の重鎖及び／又は軽鎖をコードする、請求項１７に記載の核酸分子。
  20. 請求項１６～１９のいずれか１項に記載の核酸分子を含むベクター。
  21. 請求項１６～１９のいずれか１項に記載の核酸分子又は請求項２０に記載のベクターを用いて形質転換又はトランスフェクトされた、宿主細胞。
  22. 前記方法は、請求項２１に記載の宿主細胞を、前記宿主細胞が前記抗体への組み込みのために前記抗体の前記重鎖可変領域及び／若しくは前記軽鎖可変領域又は前記抗体の前記重鎖及び／若しくは前記軽鎖を発現できる条件下で、培養するステップを含む、請求項１～１３のいずれか１項に記載の抗体を産生するための方法。
  23. 産生された前記抗体を回収するステップを更に含む、請求項２２に記載の方法。
  24. 請求項１～１３のいずれか１項に記載の抗体、請求項１４または１５に記載の融合タンパク質若しくはコンジュゲート、請求項１６～１９のいずれか１項に記載の核酸分子、請求項２０に記載のベクター、請求項２１に記載の宿主細胞、及び／又は請求項２２若しくは２３に記載の方法で産生される抗体を含む、医薬組成物。
  25. 前記医薬組成物は、医薬製剤である、請求項２４に記載の医薬組成物。
  26. 前記医薬製剤は、注射液である、請求項２５に記載の医薬組成物。
  27. 前記医薬組成物又は医薬製剤は、薬学的に許容可能なキャリア又は賦形剤を更に含む、請求項２４または２５に記載の医薬組成物。
  28. 前記医薬組成物又は医薬製剤は、以下の薬剤：抗喘息薬；抗ヒスタミン剤；免疫抑制剤；Ｍ受容体ブロッカー；ロイコトリエン受容体ブロッカー、ホスホジエステラーゼ阻害剤；非ステロイド性抗炎症薬；および、ホルモンのうちの少なくとも１つを更に含む、請求項２４または２５に記載の医薬組成物。
  29. 前記喘息薬は、アルブテロールである、請求項２８に記載の医薬組成物。
  30. 前記抗ヒスタミン剤は、ロラタジンである、請求項２８に記載の医薬組成物。
  31. 前記免疫抑制剤は、タクロリムスまたはピメクロリムスである、請求項２８に記載の医薬組成物。
  32. 前記Ｍ受容体ブロッカーは、臭化イパラトロピウムである、請求項２８に記載の医薬組成物。
  33. 前記ロイコトリエン受容体ブロッカーは、モンテルカストである、請求項２８に記載の医薬組成物。
  34. 前記ホスホジエステラーゼ阻害剤は、テオフィリンである、請求項２８に記載の医薬組成物。
  35. 前記非ステロイド性抗炎症薬は、５‐アミノサリチル酸である、請求項２８に記載の医薬組成物。
  36. 前記ホルモンは、ベクロメタゾンまたはブデソニドである、請求項２８に記載の医薬組成物。
  37. 請求項１、２または１３に記載の抗体を含む、医薬組成物。
  38. 前記医薬組成物は、医薬製剤である、請求項３７に記載の医薬組成物。
  39. 前記医薬製剤は、注射液である、請求項３８に記載の医薬組成物。
  40. 前記医薬組成物は、薬学的に許容可能なキャリア又は賦形剤を更に含む、請求項３７に記載の医薬組成物。
  41. 炎症又はアレルギー性疾患の予防、治療又は寛解のための薬剤の製造のための、請求項１～１３のいずれか１項に記載の抗体、請求項１４または１５に記載の融合タンパク質若しくはコンジュゲート、請求項１６～１９のいずれか１項に記載の核酸分子、請求項２０に記載のベクター、請求項２１に記載の宿主細胞、及び／又は請求項２２若しくは２３に記載の方法で産生される抗体の使用。
  42. 前記炎症又はアレルギー性疾患としては、自己免疫疾患が挙げられる、請求項４１に記載の使用。
  43. 前記炎症又はアレルギー性疾患は、アレルギー性皮膚炎、喘息、好酸球性食道炎、湿疹、アレルギー性鼻炎、鼻ポリープ、またはリウマチ性関節炎である、請求項４２に記載の使用。
  44. 前記炎症又はアレルギー性疾患は、アレルギー性皮膚炎、喘息、好酸球性食道炎、または鼻ポリープである、請求項４１または４２に記載の使用。
  45. 炎症又はアレルギー性疾患の予防、治療又は寛解のための薬剤の製造のための、請求項１、２または１３に記載の抗体の使用。
  46. 前記炎症又はアレルギー性疾患としては、自己免疫疾患が挙げられる、請求項４５に記載の使用。
  47. 前記炎症又はアレルギー性疾患は、アレルギー性皮膚炎、喘息、好酸球性食道炎、湿疹、アレルギー性鼻炎、鼻ポリープ、またはリウマチ性関節炎である、請求項４５に記載の使用。
  48. 前記炎症又はアレルギー性疾患は、アレルギー性皮膚炎、喘息、好酸球性食道炎、または鼻ポリープである、請求項４５に記載の使用。
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