KR20190003523A - 글루코세레브로시다제 연관 장애를 치료하기 위한 아리모클로몰 - Google Patents

글루코세레브로시다제 연관 장애를 치료하기 위한 아리모클로몰 Download PDF

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KR20190003523A
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Abstract

본 발명은 글루코세레브로시다제 연관 장애를 치료하는 방법에 사용하기 위한, N-[2-히드록시-3-(1-피페리디닐)-프로폭시]-피리딘-1-옥사이드-3-카르복시미도일 클로라이드, 그의 입체이성질체 및 그의 산부가염 (아리모클로몰)으로부터 선택되는 활성 약제학적 성분에 관한 것이다.

Description

글루코세레브로시다제 연관 장애를 치료하기 위한 아리모클로몰
본 발명은 GBA-연관 파킨슨병 (PD), GBA-연관 레비소체 치매 (dementia with Lewi bodies, DLB) 및 GBA-연관 다계통 위축증 (MSA)과 같은 GBA-연관 알파-시누클레인병증 (synucleinopathies)을 포함하는, 고셰병 (GD) 이외의 글루코세레브로시다제 (glucocerebrosidase, GBA)-연관 장애를 치료하는 방법에 사용하기 위한, N-[2-히드록시-3-(1-피페리디닐)-프로폭시]-피리딘-1-옥사이드-3-카르복시미도일 클로라이드, 그의 입체이성질체 및 그의 산부가염 (아리모클로몰)으로부터 선택되는 활성 약제학적 성분에 관한 것이다.
고셰병 (Gaucher's disease, GD)은 글루코세레브로시드의 축적을 특징으로 하는 가장 일반적인 리소좀 저장 질병이다. 이는 스핑고지질의 기능장애 대사를 포함하는 스핑고지질증 (sphingolipidosis)의 한 형태이다. 현재까지, GBA 유전자에서 최대 300개 돌연변이가 알려져 있고 고세병과 연관되어 있다. GBA 돌연변이는 경증 (GD 타입 I 유발, 무-신경계증상) 또는 중증 (GD 타입 II 및 III 유발)으로 분류될 수 있다. 동형접합 GBA 돌연변이뿐만 아니라 복합 이형접합 돌연변이는 GD를 유발한다. 소수의 공통의 돌연변이가 우세한데, GD 타입 I에 대해 가장 흔한 것은 아미노산 잔기 370에서 아스파라긴의 세린으로의 치환 (N370S)을 초래하는 과오 돌연변이이고, 타입 II 및 III에 대해 가장 흔한 것은 L444P이다 (코돈은 성숙한 단백질의 첫 번째 코돈, 즉 시그널 펩티드 없이 번호가 매겨진다).
이들 돌연변이의 다수는 파킨슨병 (PD) 환자에게서도 발견된다. GBA 돌연변이 보균자 (하나의 변이된 GBA 유전자를 가짐)에서 발견되는 바와 같은 이형접합 돌연변이가 파킨슨병의 발병에 기인하는 것으로 밝혀졌다 (Gan-Or et al., Neurology, 2015). GBA 내 돌연변이는 이제 파킨슨병에 대한 주요 유전적 위험 요소 중 하나로 간주된다. 파킨슨병 환자의 적어도 8%가 L444P 이형접합을 포함하는, GBA 유전자 내 돌연변이, 경증 및 중증 GBA 돌연변이 둘 다를 갖는 것으로 추정되고 있다. 또한 GBA 활성의 이차 결핍은 파킨슨병과 관련이 있을 수 있다.
GBA 결핍으로부터 파킨슨병에 이르는 주요 병리학은 규명되지 않았지만, 전-임상 실험은 α-시누클레인에 대한 반비례 관계를 시사한다. GBA 유전자 돌연변이의 보균자는 또한 레비소체 치매 (DLB) 및 가능하게는 다계통 위축증 (MSA)이 발병할 증가된 위험성을 갖는 것으로 보이고, 이는 GBA 결핍과 알파-시누클레인병증의 적어도 일부 사이의 연관성을 제공한다.
WO 2014/071282는 PD 및 관련 시누클레인병증 및 타우병증 (tauopathies)에 대한 글루코세레브로시다제 증강 요법을 지지하는 모델에서 인간 글루코세레브로시다제 (AAV-GBAl)를 인코딩하는 재조합 자가-상보적 아데노-연관 바이러스 벡터를 기술한다.
WO 2013/148333은 GBA 유전자 돌연변이를 갖는 환자에서 고셰병을 치료하고 고셰병 증상의 개시를 억제하고 파킨슨병을 치료하기 위한 글루코세레브로시다제 활성화제로서 살리실산 유도체를 기술한다.
WO 2009/155936은 고셰병을 비롯한 리소좀 저장 질병을 치료하기 위한 열 충격 단백질 70 및 이의 유도자를 기술한다.
WO 2005/041965는 파킨슨병을 비롯한 퇴행성 신경질환에서 신경세포를 보호하기 위한 열 충격 유도자 아리모클로몰의 사용을 기술한다.
아리모클로몰은 소아 리소좀 저장 장애 및 근위축성 축삭경화증 (ALS)의 치료에서 현재 평가 중인 열 충격 단백질 증폭제이다.
본 발명자들은 본원에서 아리모클로몰이 GBA 동형접합 (고셰병 및 현저히 감소된 GBA 활성으로 나타남)뿐만 아니라 변이체 GBA 이형접합 (보균자)에서, GBA 수준을 증가시키고 GBA 활성을 증가시킴을 확인하였다. 구체적으로, 아리모클로몰은 GBA 동형접합체 (고셰병 환자)에서 GBA 활성을 임상적으로 영향을 받지 않는 수준으로 증가시킨다. 나아가, 아리모클로몰은 GBA 이형접합 (임상적으로 영향을 받지 않음)에서 GBA 활성을 증가시키고, GBA 효소 양 (총 수준 및 변이된/ER-후 GBA)을 증가시킨다.
본 발명자들은 또한 본원에서 아리모클로몰이 변이된 GBA 대립형질을 갖는 파킨슨병 환자 (이형접합 또는 동형접합, 임상적으로 영향을 받지 않은 re 고셰병)에서 GBA 활성을 증가시킴을 보여준다.
일 측면은, 글루코세레브로시다제 (GBA)-연관 장애을 치료하는 방법에 사용하기 위한, N-[2-히드록시-3-(1-피페리디닐)-프로폭시]-피리딘-1-옥사이드-3-카르복시미도일 클로라이드 (아리모클로몰), 그의 입체이성질체 및 그의 산부가염으로부터 선택되는 활성 약제학적 성분을 제공한다.
일 구현예에서, 상기 GBA-연관 장애는 감소된 GBA 효소 수준 및/또는 감소된 GBA 효소 활성과 연관된다. 일 구현예에서, 상기 GBA-연관 장애는 이형접합 및 동형접합 GBA 유전자 돌연변이를 포함하는, 하나 이상의 GBA 유전자 돌연변이와 연관된다.
일 구현예에서, 상기 GBA-연관 장애는, 예컨대 GBA-연관 파킨슨병 (PD), GBA-연관 레비소체 치매 (DLB) 및 GBA-연관 다계통 위축증 (MSA)으로 구성된 군으로부터 선택되는, GBA-연관 알파-시누클레인병증이다.
일 구현예에서, 상기 GBA-연관 파킨슨병은 유전적으로 고-위험의 파킨슨병 GBA 유전형과 연관된다.
GBA 수준 및/또는 GBA 활성을 증가시키는 방법에 사용하기 위한, N-[2-히드록시-3-(1-피페리디닐)-프로폭시]-피리딘-1-옥사이드-3-카르복시미도일 클로라이드, 그의 입체이성질체 및 그의 산부가염으로부터 선택되는 활성 약제학적 성분이 또한 제공된다.
도 1: 시스 (cis)로 L444P,A456P,V460V 돌연변이를 함유하는 이형접합 GBA 대립형질을 갖는 개인 (보균자, 임상적으로 영향을 받지 않은 re. 고셰병)으로부터의 일차 세포 (인간 섬유아세포)에서 ER Hsp70 (BiP)의 아리모클로몰-유도성 용량-의존적 증가. 실시예 1 참조.
도 2: 시스 (cis)로 L444P,A456P,V460V 돌연변이를 함유하는 이형접합 GBA 대립형질을 갖는 개인 (고셰병의 영향을 받지 않음)으로부터의 일차 세포 (인간 섬유아세포)에서 GBA 효소 양의 아리모클로몰-유도성 용량-의존적 증가. 실시예 1 참조.
도 3: L444P/L444P,A456P,V460V 고셰병 TII 환자에서 GBA 활성의 아리모클로몰-유도성 용량-의존적 증가. 임상적으로 영향을 받지 않은 활성 수준까지 증가된 수준 (점선). 실시예 2 참조.
도 4: L444P,A456P,V460V 이형접합체 (보균자; 고셰병 환자의 임상적으로 영향을 받지 않은 부모, 유전적으로 고-위험의 파킨슨병 유전형)에서 GBA 활성의 아리모클로몰-유도성 용량-의존적 증가. 2배 이상 증가된 수준. 실시예 2 참조.　
도 5: 타입 I (N370S/V394L 및 N370S/1-BP ins 84G), 타입 II (E326K,L444P/E326K,L444P 및 G325R/C342G 및 P415R/L444P) 또는 타입 III (L444P/L444P)의 고셰병 환자로부터의 일차 세포에서 GBA 활성의 아리모클로몰-유도성 용량-의존적 증가. 실시예 3 참조.
도 6: N370S 돌연변이를 함유하는 이형접합 GBA 대립형질 (N370S/+)을 갖는 파킨슨병 환자로부터의 일차 세포에서 GBA 활성의 아리모클로몰-유도성 용량-의존적 증가. 실시예 4 참조.
도 7. GBA 돌연변이를 갖지 않는 (+/+) 비-증후성 건강한 개인으로부터의 인간 섬유아세포에서 GBA 활성의 아리모클로몰-유도성 용량-의존적 증가. 실시예 5 참조.
도 8: 타입 I (N370S/V394L), 타입 II (G325R/C342G) 및 타입 III (L444P/L444P)의 고셰병 환자로부터의 일차 세포에서 ME569에 의한 활성 GBA의 표지에서 아리모클로몰-유도성 증가. 실시예 6 참조.
도 9: 타입 I (N370S/V394L)의 고셰병 환자의 일차 세포에서 ER Hsp70 (BiP)의 아리모클로몰-유도성 용량-의존적 증가. 빈쿨린 (Vinculin)을 로우딩 대조군으로 사용하였다. 실시예 7 참조.
도 10: 타입 I (N370S/1-BP ins 84G)로의 고셰병 환자부터의 일차 세포에서 ER Hsp70 (BiP)의 아리모클로몰-유도성 용량-의존적 증가. RPA를 로우딩 대조군으로 사용하였다. 실시예 7 참조.
도 11: 타입 I (N370S/1-BP ins 84G)의 고셰병 환자로부터의 일차 세포에서 GBA 단백질 수준의 아리모클로몰-유도성 용량-의존적 증가. RPA를 로우딩 대조군으로 사용하였다. 실시예 7 참조.
도 12: 타입 II (L444P/P415R)의 고셰병 환자로부터의 일차 세포에서 ER Hsp70 (BiP)의 아리모클로몰-유도성 용량-의존적 증가. RPA를 로우딩 대조군으로 사용하였다. 실시예 8 참조.
도 13: 타입 II (G325R/C342G)의 고셰병 환자로부터의 일차 세포에서 ER Hsp70 (BiP)의 아리모클로몰-유도성 용량-의존적 증가. 빈쿨린을 로우딩 대조군으로 사용하였다. 실시예 8 참조.
도 14: 타입 II (L444P/P415R)의 고셰병 환자로부터의 일차 세포에서 GBA 단백질 수준의 아리모클로몰-유도성 용량-의존적 증가. 빈쿨린을 로우딩 대조군으로 사용하였다. 실시예 8 참조.
도 15: 타입 II (G325R/C342G)의 고셰병 환자로부터의 일차 세포에서 GBA 단백질 수준의 아리모클로몰-유도성 용량-의존적 증가. RPA를 로우딩 대조군으로 사용하였다. 실시예 8 참조.
도 16: 타입 III (L444P/L444P)의 고셰병 환자로부터의 일차 세포에서 ER Hsp70 (BiP)의 아리모클로몰-유도성 용량-의존적 증가. 빈쿨린을 로우딩 대조군으로 사용하였다. 실시예 9 참조.
도 17: 타입 III (L444P/L444P)의 고셰병 환자로부터의 일차 세포에서 GBA 단백질 수준의 아리모클로몰-유도성 용량-의존적 증가. RPA를 로우딩 대조군으로 사용하였다. 실시예 9 참조.
도 18: PD-GBA (N370S/N370S) 개인으로부터의 일차 세포에서 ER Hsp70 (BiP)의 아리모클로몰-유도성 용량-의존적 증가. 빈쿨린을 로우딩 대조군으로 사용하였다. 실시예 10 참조.
도 19: 아리모클로몰은 지시된 GBA 돌연변이를 갖는 GD 개인으로부터의 MASC의 신경세포 분화에 영향을 미치지 않는다. 세포를 모의 (mock) (PBS) 또는 400 μM 아리모클로몰 (Ari) 중 하나로 9일간 처리하였다. 신경세포 마커 튜불린 베타 3 (도 19A) 및 NeuN (도 19B)의 발현을 면역염색으로 평가하였다. 실시예 11 참조.
도 20: 지시된 GBA 돌연변이를 갖는 GD 개인으로부터의 일차 신경세포-유사 세포에서 GBA 활성의 아리모클로몰-유도성 증가. GDTIII (L444P/L444P)을 갖는 개인으로부터의 피뷰-유래 섬유아세포를 대조군으로 포함시켰다. 세포를 모의 (PBS) 또는 400 μM 아리모클로몰 (Ari) 중 하나로 처리하였다. 실시예 11 참조.
베타-글루코세레브로시다제 또는 글루코세레브로시다제 (UniProt entry P04062, GLCM_HUMAN, 글루코실세라미다제, 산 베타-글루코시다제, D-글루코실-N-아실스핑고신 글루코히드롤라제, GCase 또는 GBA로도 불림)는, 가수분해에 의해, 당지질 대사의 중간체인 글루코세레브로시드의 베타-글루코시드 연결을 절단하는 글루코실세라미다제 활성을 갖는 효소이다:
D-글루코실-N-아실스핑고신 + H2O = D-글루코스 + N-아실스핑고신.
GBA는 활성을 위해 사포신 (saposin) C 및 음이온성 인지질을 요구한다. 이는 리소좀 내에 위치한다. 이는 GBA 유전자 (공식 명칭: 글루코시다제, 베타, 산; Gene/Locus MIM 번호 606463; EC 3.2.1.45)에 의해 인코딩된다. 택일적 스플라이싱은 다수의 전사체 변형을 초래한다.
고셰병에서 결핍되는 리소좀 효소를 인코딩하는, GBA 유전자 내 돌연변이는 파킨슨병 및 관련 장애에 대한 중요한 공통의 위험 요인이다. 이러한 연관성은, 파킨슨 증후군이, 드물기는 하지만, 고셰병 환자 및 더욱 빈번하게는 절대 보균자인 친척 (임상적으로 영향을 받지 않지만 가족 병력의 분석에 기초한 유전자 돌연변이를 보유해야만 하는 개인)에서 나타나는, 임상에서 최초로 인식되었다. GBA 유전자 돌연변이는 LOVD CCHMC Molecular Genetics Laboratory 돌연변이 Database, 고셰병; 글루코시다제, 베타, 산 (GBA) (at https://research.cchmc.org/LOVD2/home.php?select_db=GBA)에 지속적으로 업데이트되고 있다.
결과적으로, 대규모 연구로부터의 결과는 파킨슨병을 갖고 레비소체 장애와 연관된 환자가 대조군 개인에 비해 증가된 빈도의 GBA 돌연변이를 갖는 것으로 나타났다. GBA-연관 파킨슨 증후군 환자는 다양한 파킨슨병 표현형을 나타내지만 GBA 돌연변이를 갖지 않는 파킨슨 증후군 환자보다 더 이른 발병 연령과 더 많은 연관된 인지 변화를 갖는 경향이 있다. 이러한 연관성을 설명하기 위해 제안된 가설은 α-시누클레인 응집을 촉진하는 글루코세레브로시다제 내 돌연변이로 인한 기능 획득 (gain-of-function); α-시누클레인 프로세싱 및 소거에 영향을 미치는 효소적 기능 상실 (loss-of-function)로 인한 기질 축적; 및 양방향 피드백 루프를 포함한다.
알파-시누클레인은 신경 조직에서 주로 발견되는 기능이 알려지지 않은 시누클레인 단백질이다. 이는 응집하여 레비소체를 특징으로 하는 병리학적 상태, 예컨대 파킨슨병, 레비소체 치매, 및 다계통 위축증에서 불용성 피브릴을 형성할 수 있다. 알파-시누클레인은 레비소체 피브릴의 주요 구조적 성분이다.
아리모클로몰은 Hsp70을 포함하는 열 충격 단백질의 소분자 유도제이다. 이는 현재 근위축성 축삭경화증 (ALS) 및 리소좀 저장 장애 니엔만-픽 (Niemann-Pick) 질환 타입 C의 치료에 대해 연구 중이다. Hsp70을 비롯한 열 충격 단백질의 유도는 리소좀 막을 보호하고 리소좀 기질의 분해를 담당하는 리소좀 효소의 활성을 증가시킨다.
본 발명자들은 본원에서 아리모클로몰이 고셰병 타입 III 환자 (예컨대, L444P/L444P)로부터의 세포에서 GBA 활성을 임상적으로 영향을 받지 않은 활성 수준 (일부 경우에는 GBA 돌연변이 보균자와 동일한 수준)으로 증가시킴을 보여준다. 또한 본원에서는 놀랍게도 아리모클로몰이 임상적으로 영향을 받지 않은 활성 수준의 2배 이상으로 GBA 돌연변이 보균자 (예컨대, L444P 이형접합)로부터의 세포에서 GBA 활성을 증가시킴을 나타난다. 나아가, 아리모클로몰은 PD 환자로부터의 세포에서 N370S GBA 활성을 증가시킨다. 따라서, GBA 활성 - 및 수준 -은 또한 변이체 GBA 이형접합체 (보균자)로부터의 세포, 및 임상적으로 영향을 받지 않은 re 고셰병인 변이체 GBA 동형접합체로부터의 세포에서 증가될 수 있다.
GBA 수준 및/또는 활성의 아리모클로몰-유도성 증가는 따라서 GBA 수준 및/또는 활성이 손상된 다양한 단백병증 (proteinopathic) 장애의 치료에 유용할 수 있다.
아리모클로몰은 본원에서 N-[2-히드록시-3-(1-피페리디닐)-프로폭시]-피리딘-1-옥사이드-3-카르복시미도일 클로라이드, 그의 입체이성질체 및 그의 산부가염으로부터 선택되는 활성 약제학적 성분으로서 정의된다.
GBA 결핍의 치료에 사용하기 위한 아리모클로몰이 본원에 제공된다. 일 구현예에서, 상기 GBA 결핍에는 고셰병 (GD) 그 자체는 포함되지 않는다.
고셰병 (GD) 이외의 글루코세레브로시다제 (GBA)-연관 장애의 치료에 사용하기 위한 아리모클로몰이 본원에 제공된다.
일 구현예에서, 상기 치료는 예방적, 치유적 또는 개선용이다. 일 특정 구현예에서, 상기 치료는 예방적이다. 다른 구현예에서, 상기 치료는 치유적이다. 추가 구현예에서, 상기 치료는 개선용이다.
고셰병 (GD) 이외의 글루코세레브로시다제 (GBA)-연관 장애의 치료를 위한 약제의 제조를 위한 아리모클로몰의 용도가 또한 본원에 제공된다.
고셰병 (GD) 이외의 글루코세레브로시다제 (GBA)-연관 장애를 치료하는 방법에 또한 본원에 제공되고, 상기 방법은 이를 필요로 하는 개인에게 유효량의 아리모클로몰을 투여하는 것을 포함한다.
용어 "개인" 또는 "개체"는 척추동물, 특히 포유류 종의 구성원, 바람직하게는 인간을 포함하는 영장류이다. 바람직한 구현예에서, 본원에 사용된 바와 같이 개인은 모든 연령대의 남성 또는 여성인 인간이다.
"이를 필요로 하는 개인"은 본 발명으로부터 이익을 얻을 수 있는 개인을 지칭한다. 일 구현예에서, 이를 필요로 하는 상기 개인은 질병이 있는 개인이고, 상기 질병은 GBA-연관 장애이다.
GBA -연관 장애
일 구현예에서, GBA-연관 장애의 치료에 사용하기 위한, (+)-R-N-[2-히드록시-3-(1-피페리디닐)-프로폭시]-피리딘-1-옥사이드-3-카르복시미도일 클로라이드 시트레이트; (-)-S-N-[2-히드록시-3-(1-피페리디닐)-프로폭시]-피리딘-1-옥사이드-3-카르복시미도일 클로라이드 시트레이트; (+)-R-N-[2-히드록시-3-(1-피페리디닐)-프로폭시]-피리딘-1-옥사이드-3-카르복시미도일 클로라이드 말리에이트; 및 (-)-S-N-[2-히드록시-3-(1-피페리디닐)-프로폭시]-피리딘-1-옥사이드-3-카르복시미도일 클로라이드 말리에이트로 구성된 군으로부터 선택되는 화합물이 제공된다.
본원에 정의된 바와 같이, GBA-연관 장애의 치료에 사용하기 위한, 아리모클로몰에 대한 언급은 하기 상태 중 어느 하나를 포함한다.
본원에 정의된 바와 같이 GBA-연관 장애는 GBA 수준 및/또는 GBA 활성과 관련이 있는 모든 장애를 지칭할 수 있다. 따라서, GBA의 감소된 수준 및/또는 감소된 활성은 본원에 정의된 바와 같은 GBA-연관 장애와 연관이 있다. 일 구현예에서, 연관된 것이라는 의미는 그러한 상태로 되기 쉽다 (또는 발병하거나; 또는 발현할 위험성 증가)는 것이다.
일 구현예에서, GBA-연관 장애는 고셰병이 아니다. 일 구현예에서, GBA-연관 장애는 고셰병 타입 I이 아니다. 일 구현예에서, GBA-연관 장애는 고셰병 타입 II가 아니다. 일 구현예에서, GBA-연관 장애는 고셰병 타입 III이 아니다. 일 구현예에서, GBA-연관 장애는 고셰병 타입 II 또는 III이 아니다.
일 구현예에서, GBA-연관 장애는 감소된 GBA 효소 수준과 연관이 있다.
일 구현예에서, GBA-연관 장애는 감소된 GBA 효소 활성과 연관이 있다.
감소된 GBA 효소 수준 및/또는 GBA 활성은 또한 손상된 GBA 효소 수준 및/또는 GBA 활성; 부족한 GBA 효소 수준 및/또는 GBA 활성; 또는 결핍된 GBA 효소 수준 및/또는 GBA 활성으로 정의될 수 있다.
일 구현예에서, GBA-연관 장애는 GBA-결핍으로서 언급된다.
일 구현예에서, GBA-연관 장애는 고셰병과 관련하여 임상적으로 영향을 받지 않은 상태 (즉, 고셰병을 갖지 않고 이로 진단되지 않음)를 유지하기에 여전히 충분한 정도로 감소된 GBA 활성 및/또는 효소 수준을 갖는다. 일 구현예에서, GBA-연관 장애는 아생형 활성 수준에 비해 감소된 GBA 활성 및/또는 효소 수준을 갖는다.
일 구현예에서, GBA-연관 장애는 하나 이상의 개별 GBA 유전자 돌연변이와 연관이 있다. 일 구현예에서, GBA-연관 장애는 임상적으로 영향을 받지 않은 re 고셰병 상태로 있는 하나 이상의 GBA 유전자 돌연변이를 갖는 개인이다.
일 구현예에서, GBA-연관 장애는 하나 이상의 경증 GBA 유전자 돌연변이 (GD 타입 I; TI와 연관됨)와 연관이 있다.
다른 구현예에서, GBA-연관 장애는 하나 이상의 중증 GBA 유전자 돌연변이 (GD 타입 II; TII, 및 GD 타입 III; TIII와 연관됨)와 연관이 있다.
일 구현예에서, GBA-연관 장애는 하나 이상의 이형접합 GBA 유전자 돌연변이와 연관이 있고, 상기 이형접합 GBA 유전자 돌연변이는 고셰병의 발병을 유발하거나 초래하지 않는다.
일 구현예에서, GBA-연관 장애는 임상적으로 영향을 받지 않은 re 고셰병 상태로 있는 하나 이상의 이형접합 GBA 유전자 돌연변이를 갖는 개인이다.
일 구현예에서, GBA-연관 장애는 하나 이상의 동형접합 GBA 유전자 돌연변이 및/또는 복합 이형접합 GBA 유전자 돌연변이와 연관이 있고, 상기 GBA 유전자 돌연변이는 고셰병의 발병을 유발하거나 초래하지 않는다.
일 구현예에서, GBA-연관 장애는 임상적으로 영향을 받지 않은 re 고셰병 상태로 있는 하나 이상의 동형접합 및/또는 복합 이형접합 GBA 유전자 돌연변이를 갖는 개인이다.
GBA 단백질의 활성에 영향을 미칠 수 있는 GBA 유전자 내 특정 돌연변이에는 L444P, D409H, D409V, E235A, E340A, E326K, N370S, N370S/1-BP ins 84G, V394L, A456P, V460V, C342G, G325R, P415R, Y133*, F213I, N188S 및 IVS2+1G>A/N188S가 포함된다.
일 구현예에서, GBA-연관 장애는 L444P, D409H, D409V, E235A, E340A, E326K, N370S, N370S/1-BP ins 84G, V394L, A456P, V460V, C342G, G325R, P415R Y133*, F213I, N188S 및 IVS2+1G>A/N188S로 구성된 군으로부터 선택되는 GBA 유전자 내 하나 이상의 돌연변이와 연관이 있다 (또는 포함하거나 이를 제시한다). GBA 유전자 내 상기 하나 이상의 돌연변이는 이형접합, 복합 이형접합 또는 동형접합 돌연변이일 수 있다.
일 구현예에서, GBA-연관 장애는 임상적으로 영향을 받지 않은 re 고셰병 상태로 있는 L444P, D409H, D409V, E235A, E340A, E326K, N370S, N370S/1-BP ins 84G, V394L, A456P, V460V, C342G, G325R, P415R Y133*, F213I, N188S 및 IVS2+1G>A/N188S로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 GBA 유전자 돌연변이를 갖는 개인이다. GBA 유전자 내 상기 하나 이상의 돌연변이는 이형접합, 복합 이형접합 또는 동형접합 돌연변이일 수 있다.
일 구현예에서, GBA-연관 장애는 L444P GBA 유전자 돌연변이 (L444P/, L444P/+ 또는 L444P/L444P)와 연관이 있다. L444P 돌연변이를 함유하는 이형접합 GBA 대립형질은 L444P/+로 언급될 수 있다.
일 구현예에서, GBA-연관 장애는 D409H GBA 유전자 돌연변이와 연관이 있다.
일 구현예에서, GBA-연관 장애는 D409V GBA 유전자 돌연변이와 연관이 있다.
일 구현예에서, GBA-연관 장애는 E235A GBA 유전자 돌연변이와 연관이 있다.
일 구현예에서, GBA-연관 장애는 E340A GBA 유전자 돌연변이와 연관이 있다.
일 구현예에서, GBA-연관 장애는 E326K GBA 유전자 돌연변이와 연관이 있다.
일 구현예에서, GBA-연관 장애는 N370S GBA 유전자 돌연변이와 연관이 있다. N370S 돌연변이를 함유하는 동형접합 GBA 대립형질은 N370S/N370S로서 언급될 수 있다. N370S 돌연변이를 함유하는 이형접합 GBA 대립형질은 N370S/+로서 언급될 수 있다.
일 구현예에서, GBA-연관 장애는 N370S/1-BP ins 84G GBA 유전자 돌연변이와 연관이 있다.
일 구현예에서, GBA-연관 장애는 V394L GBA 유전자 돌연변이와 연관이 있다.
일 구현예에서, GBA-연관 장애는 A456P GBA 유전자 돌연변이와 연관이 있다.
일 구현예에서, GBA-연관 장애는 V460V GBA 유전자 돌연변이와 연관이 있다.
일 구현예에서, GBA-연관 장애는 C342G GBA 유전자 돌연변이와 연관이 있다.
일 구현예에서, GBA-연관 장애는 G325R GBA 유전자 돌연변이와 연관이 있다.
일 구현예에서, GBA-연관 장애는 P415R GBA 유전자 돌연변이와 연관이 있다.
일 구현예에서, GBA-연관 장애는 Y133* GBA 유전자 돌연변이와 연관이 있다.
일 구현예에서, GBA-연관 장애는 F213I GBA 유전자 돌연변이와 연관이 있다.
일 구현예에서, GBA-연관 장애는 N188S 및/또는 IVS2+1G>A/N188S GBA 유전자 돌연변이와 연관이 있다.
일 구현예에서, GBA-연관 장애는 GBA 효소 활성의 감소를 수반하지 않으면서 하나 이상의 GBA 유전자 돌연변이와 연관이 있다.
일 구현예에서, GBA-연관 장애는 감소된 GBA 효소 활성과 관련이 있고 상기 GBA 유전자는 야생형이다. 일 구현예에서, GBA-연관 장애는 특발성 감소된 GBA 효소 활성과 관련이 있다. 아생형 GBA 대립형질은 (+/+) (GBA 돌연변이 부재)로서 언급될 수 있다.
일 구현예에서, GBA-연관 장애는 상기 단백질의 활성 억제에 기인한 감소된 GBA 활성과 연관이 있다.
일 구현예에서, GBA-연관 장애는 상기 유전자/단백질의 전사 또는 번역의 저해에 기인한 감소된 GBA 활성과 연관이 있다.
일 구현예에서, GBA-연관 장애는 감소된 GBA 활성과 연관이 있고 상기 GBA 유전자는 야생형이고, GBA 활성의 감소는 상기 단백질의 활성 억제 및/또는 상기 유전자/단백질의 전사 또는 번역의 저해에 기인한다.
일 구현예에서, GBA-연관 장애는 L444P, D409H, D409V, E235A, E340A, E326K, N370S, N370S/1-BP ins 84G, V394L, A456P, V460V, C342G, G325R, P415R, Y133*, F213I, N188S 및 IVS2+1G>A/N188S로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 돌연변이를 함유하는 이형접합 GBA 대립형질을 갖는 개인이다.
일 구현예에서, GBA-연관 장애는 시스 (cis)로 L444P,A456P,V460V 돌연변이를 함유하는 이형접합 GBA 대립형질을 갖는 개인이다.
일 구현예에서, GBA-연관 장애는 L444P,A456P,V460V 이형접합체이다.
일 구현예에서, GBA-연관 장애는 복합 GBA 대립형질 L444P,A456P,V460V에 대해 이형접합이다.
일 구현예에서, GBA-연관 장애는 GBA 돌연변이 보균자이다. 일 구현예에서, GBA-연관 장애는 절대 보균자이다. 일 구현예에서, GBA 돌연변이 보균자는 임상적으로 영향을 받지 않은 re. 고셰병이다.
일 구현예에서, GBA-연관 장애는 고셰병 환자의 임상적으로 영향을 받지 않은 조부모, 부모, 형제자매 또는 자녀이다.
일 구현예에서, GBA-연관 장애는 고셰병 환자의 임상적으로 영향을 받지 않은 부모 또는 형제자매이다.
일 구현예에서, GBA-연관 장애는 L444P, D409H, D409V, E235A, E340A, E326K, N370S, N370S/1-BP ins 84G, V394L, A456P, V460V, C342G, G325R, P415R, Y133*, F213I, N188S 및 IVS2+1G>A/N188S로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 돌연변이를 함유하는 동형접합 또는 복합 이형접합 GBA 대립형질을 갖는 개인이고, 상기 개인은 임상적으로 영향을 받지 않은 re 고셰병 상태로 있다.
일 구현예에서, GBA-연관 장애는 N370S/N370S 돌연변이를 함유하는 동형접합 GBA 대립형질을 갖는 개인이다.
일 구현예에서, 고셰병 (GD) 이외의 글루코세레브로시다제 (GBA)-연관 장애와 같은, 글루코세레브로시다제 (GBA)-연관 장애를 치료하는 방법에 사용하기 위한, N-[2-히드록시-3-(1-피페리디닐)-프로폭시]-피리딘-1-옥사이드-3-카르복시미도일 클로라이드, 그의 입체이성질체 및 그의 산부가염으로부터 선택되는 활성 약제학적 성분이 제공된다.
일 구현예에서, 글루코세레브로시다제 (GBA)-연관 장애는 GBA-연관 파킨슨 증후군이다.
일 구현예에서, GBA-연관 장애는 GBA-연관 레비소체 장애, 예컨대 GBA-연관 파킨슨병, GBA-연관 레비소체 치매, 및 GBA-연관 다계통 위축증으로 구성된 군으로부터 선택되는 GBA-연관 레비소체 장애이다.
일 구현예에서, GBA-연관 알파-시누클레인병증을 치료하는 방법에 사용하기 위한, N-[2-히드록시-3-(1-피페리디닐)-프로폭시]-피리딘-1-옥사이드-3-카르복시미도일 클로라이드, 그의 입체이성질체 및 그의 산부가염으로부터 선택되는 활성 약제학적 성분을 제공한다.
GBA-연관 알파-시누클레인병증은 본원에서 GBA 효소의 수준 및/또는 활성과 연관이 있는 알파-시누클레인병증으로서 정의될 수 있다. 일 구현예에서, 알파-시누클레인병증은 감소된 GBA 수준 및/또는 활성을 제시하고, 이는 알파-시누클레인의 증가와 연관이 있다. 일 구현예에서, 아리모클로몰을 이용한 치료는 알파-시누클레인 응집을 감소시킨다. 일 구현예에서, 아리모클로몰을 이용한 치료는 GBA 활성 및/또는 수준을 증가시킨다.
일 구현예에서, GBA-연관 파킨슨병 (PD), GBA-연관 레비소체 치매 (DLB) 및 GBA-연관 다계통 위축증 (MSA)으로 구성된 군으로부터 선택되는 GBA-연관 알파-시누클레인병증을 치료하는 방법에 사용하기 위한, N-[2-히드록시-3-(1-피페리디닐)-프로폭시]-피리딘-1-옥사이드-3-카르복시미도일 클로라이드, 그의 입체이성질체 및 그의 산부가염으로부터 선택되는 활성 약제학적 성분이 제공된다.
일 구현예에서, 파킨슨병, 특히 GBA-연관 파킨슨병을 치료하는 방법에 사용하기 위한, N-[2-히드록시-3-(1-피페리디닐)-프로폭시]-피리딘-1-옥사이드-3-카르복시미도일 클로라이드, 그의 입체이성질체 및 그의 산부가염으로부터 선택되는 활성 약제학적 성분이 제공된다.
일 구현예에서, GBA-연관 파킨슨병은 감소된 GBA 효소 수준 및/또는 활성과 연관된 파킨슨병이다.
일 구현예에서, GBA-연관 파킨슨병은 하나 이상의 GBA 유전자 돌연변이와 연관된 파킨슨병이다. 일 구현예에서, GBA-연관 파킨슨병을 갖는 개인은 임상적으로 영향을 받지 않은 re 고셰병 상태로 있다.
일 구현예에서, GBA-연관 파킨슨병은 이형접합 GBA 유전자 돌연변이와 연관된 파킨슨병이다. 일 구현예에서, GBA-연관 장애는 임상적으로 영향을 받지 않은 re 고셰병 상태로 있는 하나 이상의 이형접합 GBA 유전자 돌연변이를 갖는 개인이다.
일 구현예에서, GBA-연관 파킨슨병은 동형접합 GBA 유전자 돌연변이와 연관된 파킨슨병이다. 일 구현예에서, GBA-연관 장애는 임상적으로 영향을 받지 않은 re 고셰병 상태로 있는 하나 이상의 동형접합 및/또는 복합 이형접합 GBA 유전자 돌연변이를 갖는 개인이다.
일 구현예에서, GBA-연관 장애는 유전적으로 고-위험 파킨슨병 GBA 유전형이다. 일 구현예에서, GBA-연관 장애는 GBA-결핍 파킨슨병 (PD-GBA)이다. 일 구현예에서, GBA-연관 장애는 이형접합 GBA 대립형질을 갖는 파킨슨병 환자이다. 일 구현예에서, GBA-연관 장애는 동형접합 GBA 대립형질, 임상적으로 영향을 받지 않은 re 고셰병을 갖는 파킨슨병 환자이다.
일 구현예에서, GBA-연관 파킨슨병은 L444P, D409H, D409V, E235A, E340A, E326K, N370S, V394L, A456P, V460V, C342G, G325R, P415R, Y133*, F213I, N188S 및 IVS2+1G>A/N188S로 구성된 군으로부터 선택되는 GBA 유전자 돌연변이와 연관된 파킨슨병이다. GBA 유전자 내 상기 하나 이상의 돌연변이는 이형접합, 복합 이형접합 또는 동형접합 돌연변이일 수 있다. 일 구현예에서, GBA 유전자 돌연변이를 제시하는 개인은 임상적으로 영향을 받지 않은 re 고셰병이다.
일 구현예에서, GBA-연관 파킨슨병을 갖는 개인은 L444P, D409H, D409V, E235A, E340A, E326K, N370S, V394L, A456P, V460V, C342G, G325R, P415R, Y133*, F213I, N188S 및 IVS2+1G>A/N188S로 구성된 군으로부터 선택되는 GBA 유전자 돌연변이를 갖는다.
일 구현예에서, GBA-연관 파킨슨병은 N370S GBA 유전자 돌연변이와 연관된 파킨슨병이다.
일 구현예에서, GBA-연관 파킨슨병은 이형접합 N370S GBA 유전자 돌연변이 (N370S/+)와 연관된 파킨슨병이다.
일 구현예에서, GBA-연관 파킨슨병은 동형접합 N370S GBA 유전자 돌연변이 (N370S/N370S)와 연관된 파킨슨병이다.
일 구현예에서, GBA-연관 파킨슨병은 이형접합 L444P GBA 유전자 돌연변이와 연관된 파킨슨병이다.
일 구현예에서, GBA-연관 파킨슨병은 이형접합 A456P GBA 유전자 돌연변이와 연관된 파킨슨병이다.
일 구현예에서, GBA-연관 파킨슨병은 이형접합 V460V GBA 유전자 돌연변이와 연관된 파킨슨병이다.
일 구현예에서, GBA-연관 파킨슨병은 이형접합 E326K GBA 유전자 돌연변이와 연관된 파킨슨병이다.
일 구현예에서, GBA-연관 장애는 특발성 감소된 GBA 활성 및/또는 수준과 연관된 파킨슨병이다. 일 구현예에서, GBA-연관 장애는 특발성 감소된 GBA 활성 및/또는 수준을 갖는 파킨슨병이고, 어떠한 GBA 유전자 돌연변이도 확인되지 않는다.
하기 중 하나 이상의 방법에 사용하기 위한, N-[2-히드록시-3-(1-피페리디닐)-프로폭시]-피리딘-1-옥사이드-3-카르복시미도일 클로라이드, 그의 입체이성질체 및 그의 산부가염으로부터 선택되는 활성 약제학적 성분이 또한 제공된다:
- GBA 활성의 증가,
- GBA 수준 (또는 양)의 증가,
- 활성 변이체 GBA의 양의 증가,
- 활성 야생형 GBA의 양의 증가,
- ER-보유 변이체 GBA의 중첩 강화,
- 프로세싱된/변이된 GBA의 양의 증가,
- 변이된 (ER-후) GBA의 양의 증가, 및/또는
- 리소좀에 도달하는 변이된 GBA의 양의 증가.
일 구현예에서, 아리모클로몰은 GBA-연관 장애, 예컨대 GBA-연관 알파-시누클레인병증, 예컨대 GBA-연관 파킨슨병을 갖는 개인에서 GBA 수준 및/또는 활성을 증가하는 방법에 사용된다.
일 구현예에서, 상기 GBA 활성은 가상적 야생형 활성 수준의 50% 이상, 예컨대 가상적 야생형 활성 수준의 50-60%, 예컨대 60-70%, 예컨대 70-80%, 예컨대 80-90%, 예컨대 90-100%, 예컨대 100-110%, 예컨대 110-120%, 예컨대 120-130%, 예컨대 130-140%, 예컨대 140-150%로 증가된다.
일 구현예에서, 상기 GBA 활성은 가상적 야생형 활성 수준 이상으로 증가된다.
일 구현예에서, 상기 GBA 활성은 적어도 10%, 예컨대 적어도 20%, 예를 들어 적어도 30%, 예컨대 적어도 40%, 예를 들어 적어도 50%, 예컨대 적어도 60%, 예를 들어 적어도 70%, 예컨대 적어도 80%, 예를 들어 적어도 90%, 예컨대 적어도 100%, 예를 들어 적어도 110%, 예컨대 적어도 120%, 예를 들어 적어도 130%, 예컨대 적어도 140%, 예를 들어 적어도 150%, 예컨대 적어도 160%, 예를 들어 적어도 170%, 예컨대 적어도 180%, 예를 들어 적어도 190%, 예컨대 적어도 200%, 예를 들어 적어도 210%, 예컨대 적어도 220%, 예를 들어 적어도 230%, 예컨대 적어도 240%, 예를 들어 적어도 250%, 예컨대 적어도 260%, 예를 들어 적어도 200%, 예컨대 적어도 270%, 예를 들어 적어도 280%, 예컨대 적어도 290%, 예를 들어 적어도 300% 증가된다.
일 구현예에서, 상기 GBA 수준 (또는 양)은 가상적 야생형 수준의 50% 이상, 예컨대 가상적 야생형 수준의 50-60%, 예컨대 60-70%, 예컨대 70-80%, 예컨대 80-90%, 예컨대 90-100%, 예컨대 100-110%, 예컨대 110-120%, 예컨대 120-130%, 예컨대 130-140%, 예컨대 140-150%로 증가된다.
일 구현예에서, 상기 GBA 수준은 가상적 야생형 수준 이상으로 증가된다.
일 구현예에서, 상기 GBA 수준 및/또는 활성은 적어도 1.5-배, 예컨대 적어도 2-배, 예를 들어 적어도 2.5-배, 예컨대 적어도 3-배 증가된다.
일 구현예에서, 상기 GBA 수준 (또는 양)은 적어도 10%, 예컨대 적어도 20%, 예를 들어 적어도 30%, 예컨대 적어도 40%, 예를 들어 적어도 50%, 예컨대 적어도 60%, 예를 들어 적어도 70%, 예컨대 적어도 80%, 예를 들어 적어도 90%, 예컨대 적어도 100%, 예를 들어 적어도 110%, 예컨대 적어도 120%, 예를 들어 적어도 130%, 예컨대 적어도 140%, 예를 들어 적어도 150%, 예컨대 적어도 160%, 예를 들어 적어도 170%, 예컨대 적어도 180%, 예를 들어 적어도 190%, 예컨대 적어도 200%, 예를 들어 적어도 210%, 예컨대 적어도 220%, 예를 들어 적어도 230%, 예컨대 적어도 240%, 예를 들어 적어도 250%, 예컨대 적어도 260%, 예를 들어 적어도 200%, 예컨대 적어도 270%, 예를 들어 적어도 280%, 예컨대 적어도 290%, 예를 들어 적어도 300% 증가된다.
알파-시누클레인 응집을 감소시키는 방법에 사용하기 위한, N-[2-히드록시-3-(1-피페리디닐)-프로폭시]-피리딘-1-옥사이드-3-카르복시미도일 클로라이드, 그의 입체이성질체 및 그의 산부가염으로부터 선택되는 활성 약제학적 성분이 또한 제공된다.
예방적 용도
다른 측면에서, 개인에서 고셰병 이외의 글루코세레브로시다제 (GBA)-연관 장애가 발병할 위험성을 감소시키는 방법에 사용하기 위한, N-[2-히드록시-3-(1-피페리디닐)-프로폭시]-피리딘-1-옥사이드-3-카르복시미도일 클로라이드, 그의 입체이성질체 및 그의 산부가염으로부터 선택되는 활성 약제학적 성분이 제공되고, 상기 개인은 감소된 GBA 효소 수준 및/또는 활성을 갖는다.
일 구현예에서, 상기 개인은 가상적 야생형 수준보다 낮은 GBA 수준 및/또는 활성을 갖는다.
일 구현예에서, 상기 개인은 가상적 야생형 수준보다 낮은 GBA 수준 (또는 양)을 갖는다.
일 구현예에서, 상기 개인은 가상적 야생형 활성 수준보다 낮은 GBA 활성을 갖는다.
일 구현예에서, 상기 개인은 고셰병 환자에서 임상적으로 영향을 받은 수준 및/또는 활성보다 더 높은 GBA 수준 및/또는 활성을 갖는다.
일 구현예에서, 상기 개인은 고셰병 환자에서 임상적으로 영향을 받은 수준 및/또는 활성보다 더 높지만, 가상적 야생형 수준 및/또는 활성보다는 낮은 GBA 수준 및/또는 활성을 갖는다.
일 구현예에서, 상기 개인은 GBA 유전자 돌연변이 보균자 (이형접합 GBA 돌연변이), 예컨대 임상적으로 영향을 받지 않은 보균자, 예컨대 절대 보균자와 같은 정도로 감소된 GBA 활성을 갖는다.
일 구현예에서, 상기 개인은 GBA 유전자 돌연변이 보균자 (이형접합 GBA 돌연변이), 예컨대 임상적으로 영향을 받지 않은 보균자, 예컨대 절대 보균자와 같은 정도로 감소된 GBA 수준을 갖는다.
일 구현예에서, 감소된 GBA 수준 및/또는 활성을 갖는 상기 개인은 하나 이상의 이형접합 GBA 유전자 돌연변이를 갖는다.
일 구현예에서, 감소된 GBA 수준 및/또는 활성을 갖는 상기 개인은 하나 이상의 동형접합 또는 복합 이형접합 GBA 유전자 돌연변이를 갖는다.
일 구현예에서, 상기 개인은 가상적 야생형 수준의 일정 정도까지 감소된 GBA 활성 및/또는 수준을 갖는다.
일 구현예에서, 상기 개인은 가상적 야생형 수준의 약 5 내지 95% 또는 10 내지 90%, 예컨대 가상적 야생형 활성 및/또는 수준의 5 내지 10%, 예컨대 10 내지 20%, 예컨대 20 내지 30%, 예컨대 30 내지 40%, 예컨대 40 내지 50%, 예컨대 50 내지 60%, 예컨대 60 내지 70%, 예컨대 70 내지 80%, 예컨대 80 내지 90%, 예컨대 90 내지 95%의 GBA 활성 및/또는 수준을 갖는다.
일 구현예에서, 상기 개인은 가상적 야생형 수준의 약 25 내지 75%의 GBA 활성 및/또는 수준을 갖는다. 일 구현예에서, 상기 개인은 가상적 야생형 수준의 약 50%의 GBA 활성 및/또는 수준을 갖는다.
일 구현예에서, 상기 개인은 가상적 야생형 수준 및/또는 활성의 약 10, 예컨대 가상적 야생형 수준 및/또는 활성의 20%, 예컨대 30%, 예컨대 40%, 예컨대 50%, 예컨대 60%, 예컨대 70%, 예컨대 80%, 예컨대 90%의 GBA 활성 및/또는 수준을 갖는다.
일 구현예에서, 상기 GBA-연관 장애는 GBA-연관 알파-시누클레인병증, 예컨대 GBA-연관 파킨슨 장애 (PD), GBA-연관 레비소체 치매 (DLB) 및 GBA-연관 다계통 위축증 (MSA)으로 구성된 군으로부터 선택되는 GBA-연관 알파-시누클레인병증이다.
일 구현예에서, 개인에서 파킨슨병, 특히 GBA-연관 파킨슨병이 발병할 위험성을 감소시키는 방법에 사용하기 위한, N-[2-히드록시-3-(1-피페리디닐)-프로폭시]-피리딘-1-옥사이드-3-카르복시미도일 클로라이드, 그의 입체이성질체 및 그의 산부가염으로부터 선택되는 활성 약제학적 성분이 제공되고, 여기서 상기 개인은 감소된 GBA 효소 수준 및/또는 활성을 갖는다.
일 구현예에서, 상기 개인은 하나 이상의 이형접합 GBA 유전자 돌연변이를 갖는다. 일 구현예에서, 상기 개인은 L444P, D409H, D409V, E235A, E340A, E326K, N370S, N370S/1-BP ins 84G, V394L, A456P, V460V, C342G, G325R, P415R, Y133*, F213I, N188S 및 IVS2+1G>A/N188S로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 이형접합 GBA 유전자 돌연변이를 갖는다. 일 구현예에서, 상기 개인은 이형접합 L444P GBA 유전자 돌연변이를 갖는다. 일 구현예에서, 상기 개인은 이형접합 E326K GBA 유전자 돌연변이를 갖는다. 일 구현예에서, 상기 개인은 이형접합 N370S GBA 유전자 돌연변이를 갖는다.
일 구현예에서, 상기 개인은 하나 이상의 동형접합 GBA 유전자 돌연변이를 갖는다. 일 구현예에서, 상기 개인은 L444P, D409H, D409V, E235A, E340A, E326K, N370S, N370S/1-BP ins 84G, V394L, A456P, V460V, C342G, G325R, P415R, Y133*, F213I, N188S 및 IVS2+1G>A/N188S로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 동형접합 GBA 유전자 돌연변이를 갖는다. 일 구현예에서, 상기 개인은 동형접합 N370S GBA 유전자 돌연변이를 갖는다.
일 구현예에서, 개인에서 GBA-연관 파킨슨병이 발병할 위험성을 감소시키는 방법에 사용하기 위한, N-[2-히드록시-3-(1-피페리디닐)-프로폭시]-피리딘-1-옥사이드-3-카르복시미도일 클로라이드, 그의 입체이성질체 및 그의 산부가염으로부터 선택되는 활성 약제학적 성분이 제공되고, 여기서 상기 개인은 고셰병 환자, 예컨대 고셰병 타입 I, 타입 II 또는 타입 III 환자이다.
GBA 활성
글루코세레브로시다제 활성은 당해 분야에 공지된 방법에 의해 평가될 수 있다. 예를 들어, 글루코세레브로시다제 활성은 포유동물의 대뇌 척수로부터 측정될 수 있다. 일부 구현예에서, 포유동물은 GBA 유전자에 대해 야생형이다. 용어 "야생형"은 상기 단백질의 수준 및/또는 효소적 활성에 영향을 미치는 것으로 알려진 어떠한 검출가능한 돌연변이도 갖지 않는 유전자 또는 단백질을 지칭한다.
상기 유전자가 야생형인 것으로 확인되지만, 글루코세레브로시다제 활성의 감소가 관찰되는 경우, 활성의 감소는 단백질 활성의 억제 또는 유전자/단백질의 전사 또는 번역의 저해에 기인할 수 있다. 이러한 메커니즘은 당해 분야에 익히 알려져 있다. 예를 들어, 단백질의 생산은 비정상의 세포 메커니즘에 의해 억제될 수 있다. 대안적으로, 단백질은 효소적 활성의 감소 또는 손실을 초래하는 세포 내에서 변형될 수 있다.
아리모클로몰
본원에서 아리모클로몰에 대한 언급은 N-[2-히드록시-3-(1-피페리디닐)-프로폭시]-피리딘-1-옥사이드-3-카르복시미도일 클로라이드 (아리모클로몰), 그의 입체이성질체 및 그의 산부가염으로부터 선택되는 활성 약제학적 성분 (API)을 포함한다. 아리모클로몰은 예컨대, WO 00/50403에 상세히 기술된다.
아리모클로몰은 염기 복합 N-[2-히드록시-3-(1-피페리디닐)-프로폭시]-피리딘-1-옥사이드-3-카르복시미도일 클로라이드, 그의 광학 활성 (+) 또는 (-) 거울상이성질체, 임의의 비율의 거울상이성질체의 혼합물, 및 라세믹 화합물을 지칭하고, 나아가, 상기 화합물 중 임의의 것과 미네랄 또는 유기산으로부터 형성된 산부가염이 본 발명의 목적을 구성한다. N-[2-히드록시-3-(1-피페리디닐)-프로폭시]-피리딘-1-옥사이드-3-카르복시미도일 클로라이드의 모든 가능한 기하학적 이성질체 형태가 본 발명의 범위에 속한다. 용어 "N-[2-히드록시-3-(1-피페리디닐)-프로폭시]-피리딘-1-옥사이드-3-카르복시미도일 클로라이드의 입체이성질체"는 상기 화합물의 모든 가능한 광학 및 기하학적 이성질체를 지칭한다.
원한다면, N-[2-히드록시-3-(1-피페리디닐)-프로폭시]-피리딘-1-옥사이드-3-카르복시미도일 클로라이드 또는 그의 광학 활성 거울상이성질체 중 하나는 공지된 방법에 의해, 미네랄 또는 유기산과의 산부가염으로 전환될 수 있다.
일 구현예에서, 활성 약제학적 성분은 N-[2-히드록시-3-(1-피페리디닐)-프로폭시]-피리딘-1-옥사이드-3-카르복시미도일 클로라이드의 라세미체이다.
일 구현예에서, 활성 약제학적 성분은 N-[2-히드록시-3-(1-피페리디닐)-프로폭시]-피리딘-1-옥사이드-3-카르복시미도일 클로라이드의 광학적 활성 입체이성질체이다.
일 구현예에서, 활성 약제학적 성분은 N-[2-히드록시-3-(1-피페리디닐)-프로폭시]-피리딘-1-옥사이드-3-카르복시미도일 클로라이드의 거울상이성질체이다.
일 구현예에서, 활성 약제학적 성분은 (+)-R-N-[2-히드록시-3-(1-피페리디닐)-프로폭시]-피리딘-1-옥사이드-3-카르복시미도일 클로라이드 및 (-)-(S)-N-[2-히드록시-3-(1-피페리디닐)-프로폭시]-피리딘-1-옥사이드-3-카르복시미도일 클로라이드로 구성된 군으로부터 선택된다.
일 구현예에서, 활성 약제학적 성분은 N-[2-히드록시-3-(1-피페리디닐)-프로폭시]-피리딘-1-옥사이드-3-카르복시미도일 클로라이드의 산부가염이다.
일 구현예에서, 활성 약제학적 성분은 N-[2-히드록시-3-(1-피페리디닐)-프로폭시]-피리딘-1-옥사이드-3-카르복시미도일 클로라이드 시트레이트 (BRX-345로도 알려짐), 및 N-[2-히드록시-3-(1-피페리디닐)-프로폭시]-피리딘-1-옥사이드-3-카르복시미도일 클로라이드 말리에이트 (BRX-220으로도 알려짐)로 구성된 군으로부터 선택된다.
일 구현예에서, 활성 약제학적 성분은 (+)-R-N-[2-히드록시-3-(1-피페리디닐)-프로폭시]-피리딘-1-옥사이드-3-카르복시미도일 클로라이드 시트레이트; (-)-S-N-[2-히드록시-3-(1-피페리디닐)-프로폭시]-피리딘-1-옥사이드-3-카르복시미도일 클로라이드 시트레이트; (+)-R-N-[2-히드록시-3-(1-피페리디닐)-프로폭시]-피리딘-1-옥사이드-3-카르복시미도일 클로라이드 말리에이트; 및 (-)-S-N-[2-히드록시-3-(1-피페리디닐)-프로폭시]-피리딘-1-옥사이드-3-카르복시미도일 클로라이드 말리에이트로 구성된 군으로부터 선택된다.
조성물
활성 약제학적 성분을 미가공 화학물질로서 투여할 수 있지만, 일부 구현예에서는 이를 약제학적 제형의 형태로 제시하는 것이 바람직하다. 따라서, 본원에 정의된 바와 같은 활성 약제학적 성분을 포함하는 조성물, 예컨대 약제학적 조성물, 즉 약제학적으로 안전한 조성물이 또한 본원에 포함된다. 일 구현예에서, 조성물은 약제학적으로 및/또는 생리학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함한다.
본 발명의 생체활성 제제를 함유하는 약제학적 조성물은, 예컨대 문헌 [Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th Edition, Gennaro, Ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 2000]에 기술된 바와 같은 통상적인 기법에 의해 제조될 수 있다.
따라서 일 측면은 본원에 정의된 바와 같은 고셰병 (GD) 이외의 글루코세레브로시다제 (GBA)-연관 장애의 치료에 사용하기 위한, N-[2-히드록시-3-(1-피페리디닐)-프로폭시]-피리딘-1-옥사이드-3-카르복시미도일 클로라이드, 그의 입체이성질체 및 그의 산부가염 (아리모클로몰)으로부터 선택되는 활성 약제학적 성분을 포함하는 조성물, 예컨대 약제학적 조성물을 제공한다.
투여 및 투여량
일 구현예에서, 본원에 정의된 바와 같은 활성 약제학적 성분 또는 이를 포함하는 조성물은 약제학적으로 효과적인 투여량 또는 치료적으로 효과적인 양으로 이를 필요로 하는 개인에게 투여된다.
일 구현예에서, 활성 약제학적 성분의 치료적으로 효과적인 양은 소정의 질병 또는 장애 및 그의 합병증의 임상적 양상을 치료, 예방, 위험성의 감소, 완화 또는 부분적으로 억제하기에 충분한 양이다. 특정 치료 목적에 효과적인 양은 장애의 중증도 및 종류뿐만 아니라 개체의 체중 및 일반적인 상태에 좌우될 것이다. 이를 성취하기에 충분한 양이 "치료적으로 효과적인 양"으로 정의된다.
일 구현예에서, 조성물은 1 μg/일 내지 100 mg/일; 예컨대 1 μg/일 내지 10 μg/일, 예컨대 10 μg/일 내지 100 μg/일, 예컨대 100 μg/일 내지 250 μg/일, 예컨대 250 μg/일 내지 500 μg/일, 예컨대 500 μg/일 내지 750 μg/일, 예컨대 750 μg/일 내지 1 mg/일, 예컨대 1 mg/일 내지 2 mg/일, 예컨대 2 mg/일 내지 5 mg/일, 또는 예컨대 5 mg/일 내지 10 mg/일, 예컨대 10 mg/일 내지 20 mg/일, 예컨대 20 mg/일 내지 30 mg/일, 예컨대 30 mg/일 내지 40 mg/일, 예컨대 40 mg/일 내지 50 mg/일, 예컨대 50 mg/일 내지 75 mg/일, 예컨대 75 mg/일 내지 100 mg/일, 예컨대 100 mg/일 내지 150 mg/일, 예컨대 150 mg/일 내지 200 mg/일, 또는 예컨대 200 mg/일 내지 250 mg/일, 예컨대 250 mg/일 내지 300 mg/일, 예컨대 300 mg/일 내지 400 mg/일, 예컨대 400 mg/일 내지 500 mg/일, 예컨대 500 mg/일 내지 600 mg/일, 예컨대 600 mg/일 내지 700 mg/일, 예컨대 700 mg/일 내지 800 mg/일, 예컨대 800 mg/일 내지 900 mg/일, 예컨대 900 mg/일 내지 1000 mg/일의 투여량으로 투여된다.
일 구현예에서, 활성 약제학적 성분 또는 조성물은 1 μg/kg 체중 내지 100 mg/kg 체중; 예컨대 1 내지 10 μg/kg 체중, 예컨대 10 내지 100 μg/일, 예컨대 100 내지 250 μg/kg 체중, 예컨대 250 내지 500 μg/kg 체중, 예컨대 500 내지 750 μg/kg 체중, 예컨대 750 μg/kg 체중 내지 1 mg/kg 체중, 예컨대 1 mg/kg 체중 내지 2 mg/kg 체중, 예컨대 2 내지 5 mg/kg 체중, 예컨대 5 내지 10 mg/kg 체중, 예컨대 10 내지 20 mg/kg 체중, 예컨대 20 내지 30 mg/kg 체중, 예컨대 30 내지 40 mg/kg 체중, 예컨대 40 내지 50 mg/kg 체중, 예컨대 50 내지 75 mg/kg 체중, 또는 예컨대 75 내지 100 mg/kg 체중의 투여량으로 투여된다.
일 구현예에서, 용량은 하루에 1회 또는 수회, 예컨대 하루에 1 내지 6회, 예컨대 하루에 1 내지 5회, 예컨대 하루에 1 내지 4회, 예컨대 하루에 1 내지 3회, 예컨대 하루에 1 내지 2회, 예컨대 하루에 2 내지 4회, 예컨대 하루에 2 내지 3회로 투여된다. 일 구현예에서, 용량은 하루에 1회 미만, 예컨대 2일마다 1회 또는 주 1회 투여된다.
투여 경로
바람직한 투여 경로가 치료될 개체의 일반적인 상태 및 나이, 치료될 상태의 성질, 신체에서 치료될 조직의 위치 및 선택된 활성 성분에 좌우될 것임을 이해할 것이다.
전신 치료
일 구현예에서, 투여 경로는 생체활성 제제를 혈류 내로 도입시켜 궁극적으로 원하는 작용 부위에의 표적을 가능케 한다.
일 구현예에서, 투여 경로는 임의의 적합한 경로, 예컨대 장 경로 (경구, 직장, 비강, 폐, 협측, 설하, 경피, 수조내 (intracisternal) 및 복강내 투여 포함), 및/또는 비경구 경로 (피하, 근육내, 경막내, 정맥내 및 피내 투여 포함)이다.
이러한 투여에 적합한 투약 형태는 통상적인 기법에 의해 제조될 수 있다.
비경구 투여
비경구 투여는 구강/장 경로가 아니어서 생체활성 제제가 간에서의 1차 통과 분해를 회피하게 하는 임의의 투여 경로이다. 따라서, 비경구 투여에는 임의의 주사 및 주입, 예를 들어 볼루스 주사 또는 연속 주입, 예컨대 정맥내 투여, 근육내 투여 또는 피하 투여가 포함된다. 또한, 비경구 투여에는 흡입 및 국소 투여가 포함된다.
따라서, 일 구현에에서, 활성 약제학적 성분 또는 조성물은 동물의 임의의 점막, 예컨대 코, 질, 눈, 입, 생식계, 폐, 위장관 또는 직장, 예를 들어 코 또는 입의 점막을 가로 지르기 위해 국소 투여되고, 따라서, 비경구 투여는 또한 흡입 또는 삽입에 의한 폐 및 기관지 투여뿐만 아니라 협측, 설하, 비강, 직장, 질 및 복강내 투여를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 생체활성 제제는 피부를 가로 지르도록 국소적으로 투여된다.
일 구현예에서, 비경구 투여의 정맥내, 피하 및 근육내 형태가 이용된다.
국소 치료
일 구현예에서, 활성 약제학적 성분 또는 조성물은 국소 치료로서 사용되는데, 즉 작용 부위(들)에 직접적으로 도입된다. 따라서, 활성 약제학적 성분은 직접적으로 피부 또는 점막에 도포될 수 있거나, 작용 부위 내로, 예를 들어 이환된 조직 또는 이환된 조직으로 직접 연결되는 말단 동맥 내로 주입될 수 있다.
조합 치료
일 측면에서 다른 치료 용법과 함께, 고셰병 (GD) 이외의 글루코세레브로시다제 (GBA)-연관 장애를 치료하는 방법에 사용하기 위한, N-[2-히드록시-3-(1-피페리디닐)-프로폭시]-피리딘-1-옥사이드-3-카르복시미도일 클로라이드, 그의 입체이성질체 및 그의 산부가염 (아리모클로몰)으로부터 선택되는 활성 약제학적 성분이 또한 제공된다.
따라서, 일 구현예에서, 활성 약제학적 성분은 적어도 하나의 다른 치료 용법, 예컨대 GBA-연관 파킨슨병 (PD), GBA-연관 레비소체 치매 (DLB) 및 GBA-연관 다계통 위축증 (MSA)와 같은 GBA-연관 알파-시누클레인병증을 포함하는 (GBA)-연관 장애에 대한 통상적인 또는 공지의 치료 용법과 함께 이를 필요로 하는 개인에게 투여된다.
하나 이상의 치료 용법을 조합하여 투여하는 것은 동시에 또는 연속적으로 일어날 수 있다. 동시 투여는 동일한 조성물에 포함되거나 별도의 조성물 내에 포함되는 2개의 화합물일 수 있거나, 또는 본질적으로 동시에 수행되는 하나의 조성물 및 다른 하나의 치료 용법일 수 있다. 연속 투여는 하나 이상의 치료 용법이 상이한 시점에 투여되는 것, 예컨대 하나의 치료 용법을 먼저 투여하고 이어서 두 번째 치료 용법을 투여하는 것을 의미한다. 순차적으로 하나 이상의 치료 용법을 투여하기 위한 시간 프레임은 최적 효과를 달성하기 위해 당업자에 의해 결정될 수 있고, 일 구현예에서, 30분과 72시간 사이일 수 있다.
화학적 화합물 형태의 치료 용법은 함께 또는 개별적으로, 각각이 그의 가장 효과적인 투여량으로 투여될 수 있다. 하나 이상의 화합물을 투여하는 것은 시너지 효과를 가지며, 그로써 각 약물의 필요한 투여량을 효과적으로 감소시킬 수 있다
일 측면에서, GBA-연관 파킨슨병 (PD), GBA-연관 레비소체 치매 (DLB) 및 GBA-연관 다계통 위축증 (MSA)과 같은 GBA-연관 알파-시누클레인병증을 포함하는 (GBA)-연관 장애의 치료에 사용하기 위한, 개별적으로 또는 함께, i) N-[2-히드록시-3-(1-피페리디닐)-프로폭시]-피리딘-1-옥사이드-3-카르복시미도일 클로라이드, 그의 입체이성질체 및 그의 산부가염 (아리모클로몰)으로부터 선택되는 활성 약제학적 성분, 및 ii) 다른 치료 용법을 포함하는 조성물이 또한 제공된다.
일 구현예에서, 다른 치료 용법, 또는 통상적 또는 공지의 치료 용법은 추가 활성 성분으로서 언급된다.
일 구현예에서, N-[2-히드록시-3-(1-피페리디닐)-프로폭시]-피리딘-1-옥사이드-3-카르복시미도일 클로라이드, 그의 입체이성질체 및 그의 산부가염 (아리모클로몰)으로부터 선택되는 활성 약제학적 성분은 하나 이상의 추가 활성 성분과 함께 투여되고/되거나, 이와의 조합 산물로서 제제화된다.
일 구현예에서, 추가 활성 성분은 GBA-연관 파킨슨병 (PD), GBA-연관 레비소체 치매 (DLB) 및 GBA-연관 다계통 위축증 (MSA)과 같은 GBA-연관 알파-시누클레인병증을 포함하는 (GBA)-연관 장애의 치료에 공지되고/되거나 사용되는 하나 이상의 활성 성분으로부터 선택된다.
일 구현예에서, 추가 활성 성분은 파킨슨병의 치료에 사용되는 화합물이다. 일 구현예에서, 파킨슨병의 치료에 사용되는 상기 화합물은 도파민, L-DOPA, 레보파도, 도파민 수용체 작용제, 카르비도파 또는 벤세라지드와 같은 카르복실라제 저해제, 예를 들어 아마티딘 (Symmetrel), 카테콜-O-메틸 트랜스퍼라제 (COMT) 저해제, 예를 들어 톨카폰 및 엔타카폰과 같은 NMDA 길항제, 예를 들어 셀레길린 및 라사길린과 같은 MAO-B 저해제, 카르비도파-레보도파, 항콜린제 및 아만타딘으로 구성된 군으로부터 선택된다.
일 구현예에서, 추가 활성 성분은 고셰병의 치료에 사용되는 화합물이다. 일 구현예에서, 추가 활성 성분은 효소 대체 요법, 알로스테릭 샤페론, 약제학적 샤페론 및 기질 감소 요법으로부터 선택된다. 일 구현예에서, 상기 추가 활성 성분은 미굴스타트 (Zavesca), 이미글루세라제 (Cerezyme), 엘리글루스타트 (Cerdelga), VPRIV, 탈리글루세라제 알파 (Elelyso) 및 벨라글루라제 알파로 구성된 군으로부터 선택된다.
실시예
실시예 1: 고셰병 타입 II 이형접합 (파킨슨병 유전형)에서 용량-의존적 반응 - BiP 및 GBA 유도
재료 및 방법
세포 베양
일차 인간 섬유아세포 세포주를 비-필수 아미노산 (NEAA), 1% Pen-Strep 및 12% FCS가 보충된 DMEM에서 표준 세포 배양 조건 (37℃ 및 5% CO2)으로 배양하였다. 이들을 1:2 또는 1:3의 분할 비율로 1-2회/주 계대하였다. 세포를 복제 노화의 징후가 관찰되지 않는 (육안 검사) 대략 16-26 계대에서 실험에 사용하였다.
Figure pct00001
웨스턴 블롯팅
세포를 PBS에 수집하고 4℃에서 5분간 3500 rpm으로 원심분리하였다. 세포 펠렛을 포스파타제 저해제를 함유하는 1Х 추출 완충제 (Enzo Life Science) 중에서 용해시키고, 초음파 처리하고 4℃에서 10분간 13000 rpm으로 원심분리하여 제거하였다. 단백질 농도를 BCA 어세이로 측정하였다. 대략 10-20 μg 단백질을 함유하는 시료를 당단백질 분해 완충제 (New England Biolabs) 중에 희석하고 100℃에서 10분간 인큐베이션하여 분해시켰다. 시료를 37℃에서 1시간 동안 EndoH (New England Biolabs) 존재 또는 부재하에서 인큐베이션하고, Laemmli 시료 완충제를 첨가하고 시료를 TGX 겔 시스템 (Bio-Rad)을 사용하는 SDS-PAGE에 적용하였다. 니트로셀룰로스 막 (Trans-Blot Turbo, Bio-Rad)에 옮긴 후, 막을 Ponceau S로 간단히 염색하고, 이어서 PBS 중의 5% 탈지유 + 0.1% 트윈 (PBS-T) 중에서 차단하였다. 파라필름-코팅된 유리 플레이트 상에서 일차 항체 (1:500 내지 1:2000 희석)와의 인큐베이션을 4℃에서 밤새 수행하였다. PBS-T 중에서 세척 후, 막을 PBS-T 중의 5% 탈지유 중에서 1:10,000으로 희석된 이차 항체와 1시간 동안 인큐베이션하였다. 블롯을 SuperSignal™ West Dura Extended Duration Substrate (Life technologies)을 사용하여 발색시키고 G-박스 시스템 (Syngene)을 사용하여 가시화하였다.
결과
일차 세포에서 ER Hsp70 ( BiP )의 아리모클로몰 -유도성 용량-의존적 증가
아리모클로몰은 열-충격 단백질, 예컨대 열-충격 단백질 70 (HSP70)의 발현 수준을 증가시키는 것으로 보고된다 (Kieran et al., Nature Medicine, 2004).
일차 세포에서 ER Hsp70 (BiP) 발현 수준에 대한 아리모클로몰의 효과를 평가하기 위해, 시스로 L444P,A456P,V460V 돌연변이를 함유하는 이형접합 GBA 대립형질을 갖는 개인 (보균자, 임상적으로 영향을 받지 않은 re. 고셰병)으로부터의 인간 섬유아세포를 14일간 0, 10, 50 또는 200 μM 아리모클로몰로 처리하였다. 이어서 웨스턴 블롯 분석을 위해 세포를 수확하였다. 비처리 정상 인간 섬유아세포로부터의 용해액을 대조군으로 사용하였다.
본 발명의 결과는 아리모클로몰이 복합 GBA 대립형질 L444P,A456P,V460V에 대한 인간 섬유아세포 세포주 이형접합에서 BiP 발현 수준을 용량-의존적으로 증가시킴을 입증한다. 이는 아리모클로몰이 BiP-상향조절을 통해 ER-보유 변이체 GBA의 증강된 중첩을 초래할 수 있음을 시사한다.
일차 세포에서 GBA 효소 양의 아리모클로몰 -유도성 용량-의존적 증가
GBA 단백질 수준에 대한 아리모클로몰의 효과를 또한 복합 GBA 대립형질 L444P,A456P,V460V에 대해 이형접합인 인간 섬유아세포 세포주에서 평가하였다. ER 샤페론 BiP의 상형조절과 일치하게, GBA 총 수준의 용량-의존적 증가가 아리모클로몰-처리 세포에서 관찰된다.
실시예 2: 고셰 타입 II 동형접합 및 이형접합 ( GTII 및 고-위험성 파킨슨병 유전형)에서 GBA 활성에 대한 용량-의존적 반응.
재료 및 방법
세포 배양
일차 인간 섬유아세포 세포주를 비-필수 아미노산 (NEAA), 1% Pen-Strep 및 12% FCS가 보충된 DMEM에서 표준 세포 배양 조건 (37℃ 및 5% CO2)으로 배양하였다. 이들을 1:2 또는 1:3의 분할 비율로 1-2회/주 계대하였다. 세포를 복제 노화의 징후가 관찰되지 않는 (육안 검사) 대략 16-26 계대에서 실험에 사용하였다.
GBA 활성 어세이
GBA 활성을 4-메틸움벨리페릴베타-D-글루코피라노시드 (4-MUG) 기질을 사용하는 "온전한 세포" GBA 어세이를 이용하여 측정하였다 (Mu et al, Cell, 2008). 간략히는, 섬유아세포를 12웰 플레이트에 접종하고 4주간 아리모클로몰의 지시된 농도로 생물학적 3회 반복하여 처리하였다. 배지를 2-3일마다 신선한 화합물로 보충하고 세포를 실험 도중에 2회 분할하였다. 4주의 처리 후, 세포를 96웰 플레이트로 옮기고 GBA 활성을 pH 4.0에서 기질로 4-MUG를 사용하여 측정하였다. 방출된 4-MU 형광체 (fluorophore)를 형광 단위 (FLU)로 정량하고 평행 플레이트의 크리스탈 바이올렛 염색을 사용하여 세포 밀도를 표준화하였다. 표준화된 데이터를 임의 단위 (Arbitrary Unit) (평균±SD)로 기록한다.
결과
GBA 돌연변이를 갖는 일차 세포에서 GBA 활성에 대한 아리모클로몰의 효과를 유전형 L444P/L444P,A456P,V460V를 갖는 타입 II 고셰병 환자로부터의 섬유아세포에서 평가하였다. 본 발명자들은 아리모클로몰 처리가 용량-의존적 방식으로 GBA 활성을 증가시킴을 관찰하였다. 특히, 50 μM 아리모클로몰에 의해 유도된 GBA 활성의 증가는 비-증후성 개인으로부터의 L444P,A456P,V460V 대립형질에 대해 이형접합인 세포의 활성 수준에 상응한다 (도 3에서 회색 선으로 표시됨).
중요하게는, 아리모클로몰은 또한 L444P,A456P,V460V 대립형질에 대해 이형접합인 일차 섬유아세포에서 GBA 활성을 증가시킨다. 이 결과는 GBA 활성이 변이체 GBA 이형접합 (보균자)으로부터의 세포에서조차 증가될 수 있음을 입증한다.
실시예 3: 고셰병 타입 I, 타입 II 및 타입 II 동형접합에서 GBA 활성에 대한 용량-의존적 반응
재료 및 방법
세포 배양
일차 인간 섬유아세포 세포주를 비-필수 아미노산 (NEAA), 1% Pen-Strep 및 12% FCS가 보충된 DMEM에서 표준 세포 배양 조건 (37℃ 및 5% CO2)으로 배양하였다. 이들을 1:2 또는 1:3의 분할 비율로 1-2회/주 계대하였다. 세포를 복제 노화의 징후가 관찰되지 않는 (육안 검사) 대략 16-26 계대에서 실험에 사용하였다.
Figure pct00002
GBA 활성 어세이
GBA 활성을 4-메틸움벨리페릴베타-D-글루코피라노시드 (4-MUG) 기질을 사용하는 "온전한 세포" GBA 어세이를 이용하여 측정하였다 (Mu et al, Cell, 2008). 간략히는, 섬유아세포를 96웰 플레이트에 접종하고 5일간 아리모클로몰의 지시된 농도로 생물학적 3회 반복하여 처리하였다. 배지를 2-3일마다 신선한 화합물로 보충하였다. GBA 활성을 pH 4.0에서 기질로 4-MUG를 사용하여 측정하였다. 방출된 4-MU 형광체를 형광 단위 (FLU)로 정량하고 평행 플레이트의 크리스탈 바이올렛 염색을 사용하여 세포 밀도를 표준화하였다. 표준화된 데이터를 모의-처리된 대조군 세포에 대한 배수 변화 (평균±SD)로 기록한다.
결과
GBA의 추가 돌연변이를 갖는 일차 세포에서 GBA 활성에 대한 아리모클로몰의 효과를 지시된 유전형의 세포를 아리모클로몰로 처리하여 평가하였다. 본 발명의 결과는 아리모클로몰이 2개의 GD 타입 I 세포주: N370S/V394L 및 N370S/1-BP ins 84G에서 GBA 활성을 용량-의존적으로 증가시킴을 나타낸다. 중요하게는, 1-BP ins 84G이 무표지-대립형질 (null-allele)로 고려되기 때문에, 이러한 결과는 아리모클로몰이 N370S 돌연변이의 활성을 증가시킴을 입증한다.
아리모클로몰의 용량-의존적 효과는 또한 L444P (L444P/L444P)에 대해 동형접합 또는 GBA 돌연변이 G325R/C342G 또는 P415R/L444P에 대해 복합 이형접합 중 하나인 GD 타입 II/III 환자로부터의 일차 세포에서 GBA 활성에 대해 나타났다. GBA 활성의 덜 현저한 증가가 E326K,L444P 대립형질에 대해 동형접합인 아리모클로몰-처리된 타입 II GD 세포에서 확인된다.
실시예 4: N370S 돌연변이를 함유하는 이형접합 GBA 대립형질을 갖는 파킨슨병 환자로부터의 일차 세포에서 GBA 활성에 대한 용량-의존적 반응
재료 및 방법
세포 배양
일차 인간 섬유아세포 세포주를 비-필수 아미노산 (NEAA), 1% Pen-Strep 및 12% FCS가 보충된 DMEM에서 표준 세포 배양 조건 (37℃ 및 5% CO2)으로 배양하였다. 이들을 1:2의 분할 비율로 1회/주 계대하였다. 세포를 복제 노화의 징후가 관찰되지 않는 (육안 검사) 대략 16-26 계대에서 실험에 사용하였다.
Figure pct00003
GBA 활성 어세이
GBA 활성을 4-메틸움벨리페릴베타-D-글루코피라노시드 (4-MUG) 기질을 사용하는 "온전한 세포" GBA 어세이를 이용하여 측정하였다 (Mu et al, Cell, 2008). 간략히는, 섬유아세포를 96웰 플레이트에 접종하고 5일간 아리모클로몰의 지시된 농도로 생물학적 3회 반복하여 처리하였다. 배지를 2-3일마다 신선한 화합물로 보충하였다. GBA 활성을 pH 4.0에서 기질로 4-MUG를 사용하여 측정하였다. 방출된 4-MU 형광체를 형광 단위 (FLU)로 정량하고 평행 플레이트의 크리스탈 바이올렛 염색을 사용하여 세포 밀도를 표준화하였다. 표준화된 데이터를 모의-처리된 대조군 세포에 대한 배수 변화 (평균±SD)로 기록한다.
결과
파킨슨병에서 N370S 돌연변이에 대한 아리모클로몰의 효과를 조사하기 위해, N370S 돌연변이를 갖는 PD 환자로부터의 일차 세포를 아리모클로몰로 처리하였다. 본 발명의 데이터는 아리모클로몰이 PD 환자로부터의 세포에서 N370S GBA 활성을 용량-의존적으로 증가시킴을 나타낸다.
실시예 5: GBA 돌연변이 (+/+)를 갖지 않는 건강한 개인으로부터의 일차 세포에서 GBA 활성에 대한 용량-의존적 반응
재료 및 방법
세포 배양
일차 인간 섬유아세포 세포주를 비-필수 아미노산 (NEAA), 1% Pen-Strep 및 12% FCS가 보충된 DMEM에서 표준 세포 배양 조건 (37℃ 및 5% CO2)으로 배양하였다. 이들을 1:2 또는 1:3의 분할 비율로 1-2회/주 계대하였다. 세포를 복제 노화의 징후가 관찰되지 않는 (육안 검사) 대략 16-26 계대에서 실험에 사용하였다.
Figure pct00004
GBA 활성 어세이
GBA 활성을 4-메틸움벨리페릴베타-D-글루코피라노시드 (4-MUG) 기질을 사용하는 "온전한 세포" GBA 어세이를 이용하여 측정하였다 (Mu et al, Cell, 2008). 간략히는, 섬유아세포를 96웰 플레이트에 접종하고 5일간 아리모클로몰의 지시된 농도로 생물학적 3회 반복하여 처리하였다. 배지를 2-3일마다 신선한 화합물로 보충하였다. GBA 활성을 pH 4.0에서 기질로 4-MUG를 사용하여 측정하였다. 방출된 4-MU 형광체를 형광 단위 (FLU)로 정량하고 평행 플레이트의 크리스탈 바이올렛 염색을 사용하여 세포 밀도를 표준화하였다. 표준화된 데이터를 모의-처리된 대조군 세포에 대한 배수 변화 (평균±SD)로 기록한다.
결과
WT GBA 단백질에 대한 아리모클로몰의 효과를 조사하기 위해, GBA 돌연변이 (+/+)를 갖지 않는 건강한 개인으로부터의 일차 세포를 아리모클로몰로 처리하였다. 본 발명자들은, 비록 규모는 다르지만 아리모클로몰 처리가 모든 3종의 세포에서 용량-의존적 방식으로 WT GBA 활성을 증가시킴을 관찰하였다.
실시예 6: 고셰병 TI / TII / TIII에서 활성 GBA의 활성-기반 탐침 표지의 아리모클로몰 -유도성 증가
재료 및 방법
세포 배양
일차 인간 섬유아세포 세포주를 비-필수 아미노산 (NEAA), 1% Pen-Strep 및 12% FCS가 보충된 DMEM에서 표준 세포 배양 조건 (37℃ 및 5% CO2)으로 배양하였다. 이들을 1:2 또는 1:3의 분할 비율로 1-2회/주 계대하였다. 세포를 복제 노화의 징후가 관찰되지 않는 (육안 검사) 대략 16-26 계대에서 실험에 사용하였다.
Figure pct00005
ME569를 이용한 GBA 표지
활성 GBA는 형광 활성-기반 탐침 (ABP) ME569를 이용해 선택적으로 표지될 수 있다 (Witte et al, 2010). 간략히는, 섬유아세포를 접시에 접종하고 5일간 아리모클로몰의 지시된 농도로 생물학적 2회 반복하여 처리하였다. 배지를 2-3일마다 신선한 화합물로 보충하였다. 세포를 PBS 중에 수집하고, 단백질을 추출하고 농도를 BCA 어세이를 사용하여 측정하였다. 동량의 총 단백질을 30분간 37℃에서 ME569와 인큐베이션하였다. 로우딩 완충제를 첨가하고, 시료를 98℃에서 5분간 인큐베이션한 후 TGX 겔 시스템 (Bio-Rad)을 사용하는 SDS-PAGE에 적용하였다. 겔 전기영동 후에, 형광을 적색 LEDs/705M 필터 (G-box, Syngene)를 사용하여 검출하였다. 표지된 GBA의 양을 Syngene사의 소프트웨어 GeneTools v.4.03.01.0을 이용하여 정량하였다. 표준화된 데이터를 모의-처리된 대조군 세포 대비 배수 변화로 기록한다 (평균 ± SEM, n=3-4).
결과
형광 ABP로 표지된 GBA 양에 대한 아리모클로몰의 효과를 지시된 유전형을 갖는 GD 환자로부터의 일차 세포에서 평가하였다. 본 발명의 데이터는 아리모클로몰이 GD TI 세포주 (N370S/V394L) 및 GD TII 세포주 (G325R/C342G)에서 GBA 표지를 용량-의존적으로 증가시킴을 나타낸다. 아리모클로몰의 높은 용량만이 GD TII 세포주 (L444P에 대해 동형접합)에서 평가되었고, 또한 이 세포주에서, 아리모클로몰이 형광 ABP로 표지될 수 있는 GBA의 양을 증가시킨다.
종합하면, 이들 데이터는 아리모클로몰이 고셰병의 모든 3종의 타입 (TI 타입 1, TII 타입 II 및 TIII 타입 III)으로부터의 일차 세포에서 활성 변이체 GBA의 양을 증가시킴을 나타낸다.
실시예 7: 고셰병 타입 I에서 용량-의존적 반응 - BiP 및 GBA 유도
재료 및 방법
세포 배양
일차 인간 섬유아세포 세포주를 비-필수 아미노산 (NEAA), 1% Pen-Strep 및 12% FCS가 보충된 DMEM에서 표준 세포 배양 조건 (37℃ 및 5% CO2)으로 배양하였다. 이들을 1:2 또는 1:3의 분할 비율로 1-2회/주 계대하였다. 세포를 복제 노화의 징후가 관찰되지 않는 (육안 검사) 대략 16-26 계대에서 실험에 사용하였다.
Figure pct00006
웨스턴 블롯팅
세포를 PBS에 수집하고 4℃에서 5분간 3500 rpm으로 원심분리하였다. 세포 펠렛을 포스파타제 저해제를 함유하는 1Х 추출 완충제 (Enzo Life Science) 중에서 용해시키고, 초음파 처리하고 4℃에서 10분간 13000 rpm으로 원심분리하여 제거하였다. 단백질 농도를 BCA 어세이로 측정하였다. 대략 10-20 μg 단백질을 함유하는 시료를 당단백질 분해 완충제 (New England Biolabs) 중에 희석하고 100℃에서 10분간 인큐베이션하여 분해시켰다. 시료를 37℃에서 1시간 동안 EndoH (New England Biolabs) 존재 또는 부재하에서 인큐베이션하고, Laemmli 시료 완충제를 첨가하고 시료를 TGX 겔 시스템 (Bio-Rad)을 사용하는 SDS-PAGE에 적용하였다. 니트로셀룰로스 막 (Trans-Blot Turbo, Bio-Rad)에 옮긴 후, 막을 Ponceau S로 간단히 염색하고, 이어서 PBS 중의 5% 탈지유 + 0.1% 트윈 (PBS-T) 중에서 차단하였다. 파라필름-코팅된 유리 플레이트 상에서 일차 항체 (1:500 내지 1:2000 희석)와의 인큐베이션을 4℃에서 밤새 수행하였다. PBS-T 중에서 세척 후, 막을 PBS-T 중의 5% 탈지유 중에서 1:10,000으로 희석된 이차 항체와 1시간 동안 인큐베이션하였다. 블롯을 SuperSignal™ West Dura Extended Duration Substrate (Life technologies)을 사용하여 발색시키고 G-박스 시스템 (Syngene)을 사용하여 가시화하였다.
결과
타입 I GD 일차 세포에서 ER Hsp70 ( BiP )의 아리모클로몰 -유도성 용량-의존적 증가
아리모클로몰은 열-충격 단백질, 예컨대 열-충격 단백질 70 (HSP70)의 발현 수준을 증가시키는 것으로 보고된다 (Kieran et al., Nature Medicine, 2004). 일차 세포에서 ER Hsp70 (BiP) 발현 수준에 대한 아리모클로몰의 효과를 평가하기 위해, GD TI 환자로부터의 인간 섬유아세포를 5일간 0, 10, 50 또는 200 μM 아리모클로몰 (N370S/V394L) 또는 0, 100, 200 또는 400 μM 아리모클로몰 (N370S/1-BP ins 84G)로 처리하였다. 이어서 웨스턴 블롯 분석을 위해 세포를 수확하였다.
본 발명의 결과는 아리모클로몰이 타입 I 고셰병 개인으로부터의 인간 섬유아세포 세포주에서 BiP 발현 수준을 용량-의존적으로 증가시킴을 입증한다. 이는 아리모클로몰이 BiP-상향조절을 통해 ER-보유 변이체 GBA의 증강된 중첩을 초래할 수 있음을 시사한다.
타입 I GD 일차 세포에서 GBA 효소 양의 아리모클로몰 -유도성 용량-의존적 증가
GBA 단백질 수준에 대한 아리모클로몰의 효과를 또한 N370S/1-BP ins 84G 유전형을 갖는 타입 I 고셰병 환자로부터의 인간 섬유아세포 세포주에서 평가하였다. ER 샤페론 BiP의 상형조절과 일치하게, GBA 총 수준의 용량-의존적 증가가 이러한 개인으로부터의 아리모클로몰-처리 세포에서 관찰된다. 또한, EndoH-내성 분획에서의 증가는 아리모클로몰이 세포에서 프로세싱된/변이된 GBA 양을 증가시킴을 나타낸다.
실시예 8: 고셰병 타입 II에서 용량-의존적 반응 - BiP 및 GBA 유도
재료 및 방법
세포 배양
일차 인간 섬유아세포 세포주를 비-필수 아미노산 (NEAA), 1% Pen-Strep 및 12% FCS가 보충된 DMEM에서 표준 세포 배양 조건 (37℃ 및 5% CO2)으로 배양하였다. 이들을 1:2 또는 1:3의 분할 비율로 1-2회/주 계대하였다. 세포를 복제 노화의 징후가 관찰되지 않는 (육안 검사) 대략 16-26 계대에서 실험에 사용하였다.
Figure pct00007
웨스턴 블롯팅
세포를 PBS에 수집하고 4℃에서 5분간 3500 rpm으로 원심분리하였다. 세포 펠렛을 포스파타제 저해제를 함유하는 1Х 추출 완충제 (Enzo Life Science) 중에서 용해시키고, 초음파 처리하고 4℃에서 10분간 13000 rpm으로 원심분리하여 제거하였다. 단백질 농도를 BCA 어세이로 측정하였다. 대략 10-20 μg 단백질을 함유하는 시료를 당단백질 분해 완충제 (New England Biolabs) 중에 희석하고 100℃에서 10분간 인큐베이션하여 분해시켰다. 시료를 37℃에서 1시간 동안 EndoH (New England Biolabs) 존재 또는 부재하에서 인큐베이션하고, Laemmli 시료 완충제를 첨가하고 시료를 TGX 겔 시스템 (Bio-Rad)을 사용하는 SDS-PAGE에 적용하였다. 니트로셀룰로스 막 (Trans-Blot Turbo, Bio-Rad)에 옮긴 후, 막을 Ponceau S로 간단히 염색하고, 이어서 PBS 중의 5% 탈지유 + 0.1% 트윈 (PBS-T) 중에서 차단하였다. 파라필름-코팅된 유리 플레이트 상에서 일차 항체 (1:500 내지 1:2000 희석)와의 인큐베이션을 4℃에서 밤새 수행하였다. PBS-T 중에서 세척 후, 막을 PBS-T 중의 5% 탈지유 중에서 1:10,000으로 희석된 이차 항체와 1시간 동안 인큐베이션하였다. 블롯을 SuperSignal™ West Dura Extended Duration Substrate (Life technologies)을 사용하여 발색시키고 G-박스 시스템 (Syngene)을 사용하여 가시화하였다.
결과
타입 II GD 일차 세포에서 ER Hsp70 ( BiP )의 아리모클로몰 -유도성 용량-의존적 증가
일차 세포에서 ER Hsp70 (BiP) 발현 수준에 대한 아리모클로몰의 효과를 평가하기 위해, 타입 II 고셰병 환자로부터의 인간 섬유아세포를 5일간 아리모클로몰의 지시된 농도로 처리하였다. 그 후에 세포를 웨스턴 블롯 분석을 위해 수확하였다.
본 발명의 결과는 아리모클로몰이 L444P/P415R 또는 G325R/C342G 유전형을 갖는 GD TII 개인으로부터의 인간 섬유아세포 세포주에서 BiP 발현 수준을 용량-의존적으로 증가시킴을 입증한다. 이는 아리모클로몰이 BiP-상향조절을 통해 GD TII 세포에서 ER-보유 변이체 GBA의 증강된 중첩을 초래할 수 있음을 시사한다.
GD TII 일차 세포에서 GBA 효소 양의 아리모클로몰 -유도성 용량-의존적 증가
GBA 단백질 수준 및 성숙에 대한 아리모클로몰의 효과를 또한 GD TII 일차 세포주에서 평가하였다. ER 샤페론 BiP의 상향조절과 비슷하게, GBA 총 수준의 용량-의존적 증가가 이들 개인으로부터의 아리모클로몰-처리된 세포에서 관찰된다. 나아가, EndoH-내성 분획에서의 증가는 아리모클로몰이 GD 타입 II 세포에서 변이된 (ER-후) GBA의 양을 증가시킴을 나타낸다.
실시예 9: 고셰병 타입 III에서 용량-의존적 반응 - BiP 및 GBA 유도
재료 및 방법
세포 배양
일차 인간 섬유아세포 세포주를 비-필수 아미노산 (NEAA), 1% Pen-Strep 및 12% FCS가 보충된 DMEM에서 표준 세포 배양 조건 (37℃ 및 5% CO2)으로 배양하였다. 이들을 1:2 또는 1:3의 분할 비율로 1-2회/주 계대하였다. 세포를 복제 노화의 징후가 관찰되지 않는 (육안 검사) 대략 16-26 계대에서 실험에 사용하였다.
Figure pct00008
웨스턴 블롯팅
세포를 PBS에 수집하고 4℃에서 5분간 3500 rpm으로 원심분리하였다. 세포 펠렛을 포스파타제 저해제를 함유하는 1Х 추출 완충제 (Enzo Life Science) 중에서 용해시키고, 초음파 처리하고 4℃에서 10분간 13000 rpm으로 원심분리하여 제거하였다. 단백질 농도를 BCA 어세이로 측정하였다. 대략 10-20 μg 단백질을 함유하는 시료를 당단백질 분해 완충제 (New England Biolabs) 중에 희석하고 100℃에서 10분간 인큐베이션하여 분해시켰다. 시료를 37℃에서 1시간 동안 EndoH (New England Biolabs) 존재 또는 부재하에서 인큐베이션하고, Laemmli 시료 완충제를 첨가하고 시료를 TGX 겔 시스템 (Bio-Rad)을 사용하는 SDS-PAGE에 적용하였다. 니트로셀룰로스 막 (Trans-Blot Turbo, Bio-Rad)에 옮긴 후, 막을 Ponceau S로 간단히 염색하고, 이어서 PBS 중의 5% 탈지유 + 0.1% 트윈 (PBS-T) 중에서 차단하였다. 파라필름-코팅된 유리 플레이트 상에서 일차 항체 (1:500 내지 1:2000 희석)와의 인큐베이션을 4℃에서 밤새 수행하였다. PBS-T 중에서 세척 후, 막을 PBS-T 중의 5% 탈지유 중에서 1:10,000으로 희석된 이차 항체와 1시간 동안 인큐베이션하였다. 블롯을 SuperSignal™ West Dura Extended Duration Substrate (Life technologies)을 사용하여 발색시키고 G-박스 시스템 (Syngene)을 사용하여 가시화하였다.
결과
GD TIII 일차 세포에서 ER Hsp70 ( BiP )의 아리모클로몰 -유도성 용량-의존적 증가
일차 세포에서 ER Hsp70 (BiP) 발현 수준에 대한 아리모클로몰의 효과를 평가하기 위하여, 타입 III 고셰병 (L444P/L444P)을 갖는 개인으로부터의 인간 섬유아세포를 5일간 아리모클로몰의 지시된 농도로 처리하였다. 그 후에 세포를 웨스턴 블롯 분석을 위해 수확하였다.
본 발명의 결과는 아리모클로몰이 L444P에 대해 동형접합인 이 세포주에서 BiP 발현 수준을 용량-의존적으로 증가시킴을 입증한다. 이는 아리모클로몰이 BiP-상향조절을 통해 ER-보유 변이체 GBA의 증강된 중첩을 초래할 수 있음을 시사한다.
GD TIII 일차 세포에서 GBA 효소 양의 아리모클로몰 -유도성 용량-의존적 증가
GBA 단백질 수준 및 성숙에 대한 아리모클로몰의 효과를 또한 L444P/L444P GD TIII 일차 세포주에서 평가하였다. ER 샤페론 BiP의 상향조절과 비슷하게, GBA 총 수준의 용량-의존적 증가가 이들 개인으로부터의 아리모클로몰-처리된 세포에서 관찰된다. 나아가, GBA의 EndoH-내성 분획에서의 증가는 아리모클로몰이 GD TIII 세포에서 성숙된 GBA의 양을 증가시킴을 나타낸다.
종합하면, 이러한 결과는 GBA 활성이 리소좀에 도달하는 더 많은 성숙한 GBA로 인해 증가되는 것을 나타낸다.
실시예 10: GBA -결핍 파킨슨병에서 BiP 발현의 용량-의존적 반응
재료 및 방법
세포 배양
일차 인간 섬유아세포 세포를 비-필수 아미노산 (NEAA), 1% Pen-Strep 및 12% FCS가 보충된 DMEM에서 표준 세포 배양 조건 (37℃ 및 5% CO2)으로 배양하였다. 이들을 1:2 또는 1:3의 분할 비율로 1-2회/주 계대하였다. 세포를 복제 노화의 징후가 관찰되지 않는 (육안 검사) 대략 16-26 계대에서 실험에 사용하였다.
Figure pct00009
웨스턴 블롯팅
세포를 PBS에 수집하고 4℃에서 5분간 3500 rpm으로 원심분리하였다. 세포 펠렛을 포스파타제 저해제를 함유하는 1Х 추출 완충제 (Enzo Life Science) 중에서 용해시키고, 초음파 처리하고 4℃에서 10분간 13000 rpm으로 원심분리하여 제거하였다. 단백질 농도를 BCA 어세이로 측정하고 시료를 TGX 겔 시스템 (Bio-Rad)을 사용하는 SDS-PAGE에 적용하였다. 니트로셀룰로스 막 (Trans-Blot Turbo, Bio-Rad)에 옮긴 후, 막을 Ponceau S로 간단히 염색하고, 이어서 PBS 중의 5% 탈지유 + 0.1% 트윈 (PBS-T) 중에서 차단하였다. 파라필름-코팅된 유리 플레이트 상에서 일차 항체 (1:500 내지 1:2000 희석)와의 인큐베이션을 4℃에서 밤새 수행하였다. PBS-T 중에서 세척 후, 막을 PBS-T 중의 5% 탈지유 중에서 1:10,000으로 희석된 이차 항체와 1시간 동안 인큐베이션하였다. 블롯을 SuperSignal™ West Dura Extended Duration Substrate (Life technologies)을 사용하여 발색시키고 G-박스 시스템 (Syngene)을 사용하여 가시화하였다.
결과
PD- GBA 일차 세포에서 ER Hsp70 ( BiP )의 아리모클로몰 -유도성 용량-의존적 증가
GBA-결핍 파킨슨병 (PD-GBA)을 갖는 개인으로부터의 일차 세포에서 ER Hsp70 (BiP) 발현 수준에 대한 아리모클로몰의 효과를 평가하기 위하여, PD-GBA (N370S/N370S)를 갖는 개인으로부터의 인간 섬유아세포를 5일간 아리모클로몰의 지시된 농도로 처리하였다. 그 후에 세포를 웨스턴 블롯 분석을 위해 수확하였다.
본 발명의 결과는 아리모클로몰이 PD-GBA (N370S/N370S)를 갖는 개인으로부터의 일차 세포에서 BiP 발현 수준을 용량-의존적으로 증가시킴을 입증한다. 이는 아리모클로몰이 BiP-상향조절을 통해 ER-보유 변이체 GBA의 증강된 중첩을 초래할 수 있음을 시사한다.
실시예 11: GDTI 및 GDTIII 개인으로부터의 일차 신경세포-유사 세포에서 GBA 활성에 대한 아리모클로몰의 효과
재료 및 방법
세포 배양
인간 다능성 성체 줄기세포 (MASC)를 피부 생검을 통해 GD 개인으로부터 분리하였다. MASC의 유전형을 하기에 나타낸다. 세포를 문헌 [Bergamin et al. Orphanet Journal of Rare Diseases 2013]에 기술된 바와 같이 신경세포의 운명을 따라 분화하도록 유도하였다. 줄기세포의 표면 면역표현형을 FACS로 분석하였다. 줄기세포 및 신경세포 마커 발현을 면역형광으로 평가하였다.
Figure pct00010
별표는 프레임시프트 및 그 결과로서의 드 노보 (de novo) 정지 코돈을 나타낸다.
MASC는 0일째에 신경세포 계통을 따라 분화하도록 유도되었다. 1일째에, 세포를 모의 (PBS) 또는 400 μM 아리모클로몰로 처리하였다. 총 9일간의 분화에 걸쳐 처리를 지속하였다. 9일째에, 신경세포 마커의 면역형광에 의해 분화를 평가하였다. GBA 활성을 형광성 기질 4-MUG를 사용하여 측정하였다.
결과
아리모클로몰은 GD TI 및 GDTIII 개인으로부터의 피부-유래 인간 다능성 성체 줄기세포의 신경세포 분화에 영향을 미치지 않음
신경세포 분화에 대한 아리모클로몰의 효과를 측정하기 위하여, GD 개인으로부터의 MASC의 분화를 모의 또는 아리모클로몰로 처리하는 동안 유도하였다. 본 발명의 결과는 신경세포 마커 튜불린 베타 3 및 NeuN의 발현이 아리모클로몰에 의해 영향을 받지 않음을 나타낸다.
GD TI 및 GDTIII 개인으로부터의 신경세포에서 GBA 활성의 아리모클로몰 -유도성 증가
본 발명자들은 아리모클로몰이 GD 타입 I (N370S/Y133*)을 갖는 개인 및 GD 타입 III (F213I/L444P, L444P/L444P 또는 IVS2+1G>A/N188S)을 갖는 3명의 개인으로부터의 신경세포에서 변이체 GBA 활성을 증가시킴을 확인한다.
종합하면, 본 발명의 결과는 아리모클로몰이 신경세포 분화에 영향을 미치지 않으면서 GD TI 및 GD TIII 개인으로부터의 신경세포에서 변이체 GBA 활성을 증가시킴을 입증한다.
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Claims (45)

  1. 글루코세레브로시다제 (glucocerebrosidase, GBA)-연관 장애를 치료하는 방법에 사용하기 위한, N-[2-히드록시-3-(1-피페리디닐)-프로폭시]-피리딘-1-옥사이드-3-카르복시미도일 클로라이드, 그의 입체이성질체 및 그의 산부가염으로부터 선택되는 활성 약제학적 성분.
  2. 제1항에 있어서, 상기 GBA-연관 장애가 고셰병 (Gaucher's disease, GD)이 아닌 것인, 사용하기 위한 활성 약제학적 성분.
  3. 제1항에 있어서, 상기 GBA-연관 장애가 GBA-연관 알파-시누클레인병증 (alpha-synucleinopathy)인 것인, 사용하기 위한 활성 약제학적 성분.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 GBA-연관 알파-시누클레인병증이 GBA-연관 파킨슨병 (PD), GBA-연관 레비소체 치매 (DLB) 및 GBA-연관 다계통 위축증 (MSA)으로 구성된 군으로부터 선택되는, 사용하기 위한 활성 약제학적 성분.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 GBA-연관 장애가 GBA-연관 파킨슨 증후군인 것인, 사용하기 위한 활성 약제학적 성분.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 GBA-연관 장애가 GBA-연관 파킨슨병인 것인, 사용하기 위한 활성 약제학적 성분.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 GBA-연관 장애가 감소된 GBA 효소 수준과 연관이 있는 것인, 사용하기 위한 활성 약제학적 성분.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 GBA-연관 장애가 감소된 GBA 효소 활성과 연관이 있는 것인, 사용하기 위한 활성 약제학적 성분.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 GBA-연관 장애가 감소된 GBA 효소 활성 및/또는 수준과 연관이 있고 상기 GBA 유전자가 야생형이고, GBA 활성 감소가 단백질의 활성 억제 또는 유전자/단백질의 전사 또는 번역의 저해에 기인하거나 특발성인 것인, 사용하기 위한 활성 약제학적 성분.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 GBA-연관 장애가 하나 이상의 개별 GBA 유전자 돌연변이와 연관이 있는 것인, 사용하기 위한 활성 약제학적 성분.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, GBA-연관 장애를 갖는 개인이 임상적으로 영향을 받지 않은 re 고셰병의 상태로 있는 것인, 사용하기 위한 활성 약제학적 성분.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 GBA-연관 장애가 하나 이상의 이형접합 GBA 유전자 돌연변이와 연관이 있는 것인, 사용하기 위한 활성 약제학적 성분.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 GBA-연관 장애가 동형접합 GBA 유전자 돌연변이와 연관이 있고, 상기 GBA-연관 장애가 고셰병이 아닌 것인, 사용하기 위한 활성 약제학적 성분.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 개별 GBA 유전자 돌연변이가 경증 (GD 타입 I과 연관됨)인 것인, 사용하기 위한 활성 약제학적 성분.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 개별 GBA 유전자 돌연변이가 중증 (GD 타입 II 및 III와 연관됨)인 것인, 사용하기 위한 활성 약제학적 성분.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 GBA 유전자 돌연변이가 L444P, D409H, D409V, E235A, E340A, E326K, N370S, N370S/1-BP ins 84G, V394L, A456P, V460V, C342G, G325R, P415R, Y133*, F213I, N188S 및 IVS2+1G>A/N188S로 구성된 군으로부터 선택되는 것인, 사용하기 위한 활성 약제학적 성분.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 GBA 유전자 돌연변이가 L444P인 것인, 사용하기 위한 활성 약제학적 성분.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 GBA 유전자 돌연변이가 E326K인 것인, 사용하기 위한 활성 약제학적 성분.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 GBA 유전자 돌연변이가 N370S인 것인, 사용하기 위한 활성 약제학적 성분.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 GBA-연관 장애가 L444P, A456P, V460V 이형접합인 것인, 사용하기 위한 활성 약제학적 성분.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 GBA-연관 장애가 GBA 돌연변이 보균자, 예컨대 절대 (obligate) 보균자, 예컨대 임상적으로 영향을 받지 않은 re. 고셰병인 보균자인 것인, 사용하기 위한 활성 약제학적 성분.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 GBA-연관 장애가 고셰병 환자의 임상적으로 영향을 받지 않은 부모 또는 형제인 것인, 사용하기 위한 활성 약제학적 성분.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 GBA-연관 파킨슨병이 감소된 GBA 효소 수준 및/또는 감소된 GBA 효소 활성과 연관이 있는 것인, 사용하기 위한 활성 약제학적 성분.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 GBA-연관 파킨슨병이 하나 이상의 GBA 유전자 돌연변이와 연관이 있는 것인, 사용하기 위한 활성 약제학적 성분.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 GBA-연관 파킨슨병이 하나 이상의 이형접합 GBA 유전자 돌연변이와 연관이 있는 것인, 사용하기 위한 활성 약제학적 성분.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 GBA-연관 파킨슨병이 하나 이상의 동형접합 또는 복합 이형접합 GBA 유전자 돌연변이와 연관이 있는 것인, 사용하기 위한 활성 약제학적 성분.
  27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 GBA-연관 파킨슨병이 L444P, D409H, D409V, E235A, E340A, E326K, N370S, N370S/1-BP ins 84G, V394L, A456P, V460V, C342G, G325R 및 P415R로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 GBA 유전자 돌연변이와 연관이 있는 것인, 사용하기 위한 활성 약제학적 성분.
  28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 GBA-연관 파킨슨병이 이형접합 또는 동형접합 N370S/N370S GBA 유전자 돌연변이와 연관이 있는 것인, 사용하기 위한 활성 약제학적 성분.
  29. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 GBA-연관 파킨슨병이 유전적으로 고-위험 파킨슨병 GBA 유전형과 연관이 있는 것인, 사용하기 위한 활성 약제학적 성분.
  30. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 GBA-연관 파킨슨병이 확인된 GBA 유전자 돌연변이를 동반하지 않는 특발성의 감소된 GBA 효소 활성 및/또는 수준과 연관이 있는 것인, 사용하기 위한 활성 약제학적 성분.
  31. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 활성 약제학적 성분이 N-[2-히드록시-3-(1-피페리디닐)-프로폭시]-피리딘-1-옥사이드-3-카르복시미도일 클로라이드의 라세미체인 것인, 사용하기 위한 활성 약제학적 성분.
  32. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 활성 약제학적 성분이 N-[2-히드록시-3-(1-피페리디닐)-프로폭시]-피리딘-1-옥사이드-3-카르복시미도일 클로라이드의 광학적 활성 입체이성질체인 것인, 사용하기 위한 활성 약제학적 성분.
  33. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 활성 약제학적 성분이 N-[2-히드록시-3-(1-피페리디닐)-프로폭시]-피리딘-1-옥사이드-3-카르복시미도일 클로라이드의 거울상이성질체인 것인, 사용하기 위한 활성 약제학적 성분.
  34. 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 활성 약제학적 성분이
    (+)-R-N-[2-히드록시-3-(1-피페리디닐)-프로폭시]-피리딘-1-옥사이드-3-카르복시미도일 클로라이드, 및
    (-)-(S)-N-[2-히드록시-3-(1-피페리디닐)-프로폭시]-피리딘-1-옥사이드-3-카르복시미도일 클로라이드
    로 구성된 군으로부터 선택되는 것인, 사용하기 위한 활성 약제학적 성분.
  35. 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 활성 약제학적 성분이 N-[2-히드록시-3-(1-피페리디닐)-프로폭시]-피리딘-1-옥사이드-3-카르복시미도일 클로라이드의 산부가염인 것인, 사용하기 위한 활성 약제학적 성분.
  36. 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 활성 약제학적 성분이
    N-[2-히드록시-3-(1-피페리디닐)-프로폭시]-피리딘-1-옥사이드-3-카르복시미도일 클로라이드 시트레이트, 및
    N-[2-히드록시-3-(1-피페리디닐)-프로폭시]-피리딘-1-옥사이드-3-카르복시미도일 클로라이드 말리에이트
    로 구성된 군으로부터 선택되는 것인, 사용하기 위한 활성 약제학적 성분.
  37. 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 활성 약제학적 성분이
    (+)-R-N-[2-히드록시-3-(1-피페리디닐)-프로폭시]-피리딘-1-옥사이드-3-카르복시미도일 클로라이드 시트레이트;
    (-)-S-N-[2-히드록시-3-(1-피페리디닐)-프로폭시]-피리딘-1-옥사이드-3-카르복시미도일 클로라이드 시트레이트;
    (+)-R-N-[2-히드록시-3-(1-피페리디닐)-프로폭시]-피리딘-1-옥사이드-3-카르복시미도일 클로라이드 말리에이트; 및
    (-)-S-N-[2-히드록시-3-(1-피페리디닐)-프로폭시]-피리딘-1-옥사이드-3-카르복시미도일 클로라이드 말리에이트
    로 구성된 군으로부터 선택되는 것인, 사용하기 위한 활성 약제학적 성분.
  38. 제1항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 치료가 예방적, 치유적 또는 개선용인 것인, 사용하기 위한 활성 약제학적 성분.
  39. 개인에서 고셰병 이외의 글루코세레브로시다제 (GBA)-연관 장애를 발병할 위험성을 감소시키는 방법에 사용하기 위한, N-[2-히드록시-3-(1-피페리디닐)-프로폭시]-피리딘-1-옥사이드-3-카르복시미도일 클로라이드, 그의 입체이성질체 및 그의 산부가염으로부터 선택되는 활성 약제학적 성분으로서, 상기 개인이 감소된 GBA 수준 및/또는 감소된 GBA 활성을 갖는, 활성 약제학적 성분.
  40. 제39항에 있어서, 감소된 GBA 수준 및/또는 활성을 갖는 상기 개인이 하나 이상의 GBA 유전자 돌연변이, 예컨대 이형접합 GBA 유전자 돌연변이 또는 예컨대 동형접합 GBA 유전자 돌연변이를 갖는 것인, 사용하기 위한 활성 약제학적 성분.
  41. 제39항 또는 제40항에 있어서, 상기 GBA-연관 장애가 GBA-연관 알파-시누클레인병증, 예컨대 GBA-연관 파킨슨 증후군, GBA-연관 파킨슨병 (PD), GBA-연관 레비소체 치매 (DLB) 및 GBA-연관 다계통 위축증 (MSA)으로 구성된 군으로부터 선택되는 GBA-연관 알파-시누클레인병증인 것인, 사용하기 위한 활성 약제학적 성분.
  42. 제40항에 있어서, 상기 GBA-연관 장애가 GBA-연관 파킨슨병인 것인, 사용하기 위한 활성 약제학적 성분.
  43. 제39항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 개인이 가상적 야생형 활성 및/또는 수준의 약 5 내지 95%의 GBA 활성 및/또는 수준, 예컨대 가상적 야생형 활성 및/또는 수준의 5 내지 10%, 예컨대 10 내지 20%, 예컨대 20 내지 30%, 예컨대 30 내지 40%, 예컨대 40 내지 50%, 예컨대 50 내지 60%, 예컨대 60 내지 70%, 예컨대 70 내지 80%, 예컨대 80 내지 90%, 예컨대 90 내지 95%를 갖는 것인, 사용하기 위한 활성 약제학적 성분.
  44. 하기의 하나 이상의 방법에 사용하기 위한, N-[2-히드록시-3-(1-피페리디닐)-프로폭시]-피리딘-1-옥사이드-3-카르복시미도일 클로라이드, 그의 입체이성질체 및 그의 산부가염으로부터 선택되는 활성 약제학적 성분:
    a. GBA 활성의 증가,
    b. GBA 수준 (또는 양)의 증가,
    c. 활성 변이체 GBA의 양의 증가,
    d. 활성 야생형 GBA의 양의 증가,
    e. ER-보유 변이체 GBA의 중첩의 강화,
    f. 프로세싱된/변이된 GBA의 양의 증가,
    g. 변이된 (ER-후) GBA의 양의 증가,
    h. 리소좀에 도달하는 변이된 GBA의 양의 증가, 및/또는
    i. 알파-시누클레인 응집의 감소.
  45. GBA-연관 파킨슨병 (PD), GBA-연관 레비소체 치매 (DLB) 및 GBA-연관 다계통 위축증 (MSA)과 같은 GBA-연관 알파-시누클레인병증을 포함하는, 고셰병 (GD) 이외의 글루코세레브로시다제 (GBA)-연관 장애의 치료에 사용하기 위한, N-[2-히드록시-3-(1-피페리디닐)-프로폭시]-피리딘-1-옥사이드-3-카르복시미도일 클로라이드, 그의 입체이성질체 및 그의 산부가염 (아리모클로몰)으로부터 선택된 활성 약제학적 성분; 및 하나 이상의 추가 활성 성분을 - 개별적으로 또는 함께 - 포함하는, 약제학적 조성물과 같은, 조성물.
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